ME00024B - Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama - Google Patents
Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinamaInfo
- Publication number
- ME00024B ME00024B MEP-2008-32A MEP200832A ME00024B ME 00024 B ME00024 B ME 00024B ME P200832 A MEP200832 A ME P200832A ME 00024 B ME00024 B ME 00024B
- Authority
- ME
- Montenegro
- Prior art keywords
- domain
- fusion polypeptide
- fltl
- vegf
- vegf receptor
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 98
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 101150048336 Flt1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 23
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 101
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 101
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 97
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 61
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 61
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 59
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 58
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 46
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 41
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 36
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 25
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 25
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 7
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 claims 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 165
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 150
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 149
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 97
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 84
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 84
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 79
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 28
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 28
- 101100372761 Mus musculus Flt1 gene Proteins 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 27
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 24
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 24
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 16
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 10
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 10
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 9
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 8
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 8
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 101100310691 Rattus norvegicus Spata6 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 4
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 4
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 208000032594 Vascular Remodeling Diseases 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 4
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 4
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001792 thromboblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 1-acetyloxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102400001270 Neuronostatin Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVGDAZBTIVRTGO-UONOGXRCSA-N 3-[(1r)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-[4-methoxy-6-[(2s)-2-methylpiperazin-1-yl]pyridin-3-yl]pyridin-2-amine Chemical compound C1([C@@H](C)OC=2C(N)=NC=C(C=2)C2=CN=C(C=C2OC)N2[C@H](CNCC2)C)=C(Cl)C=CC(F)=C1Cl BVGDAZBTIVRTGO-UONOGXRCSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUIVJWBDXPKTJB-UHFFFAOYSA-N 5-oxo-5-phenyl-5$l^{6}-thia-2,4-diazabicyclo[4.4.0]deca-1(10),4,6,8-tetraene-3-thione Chemical compound N=1C(=S)NC2=CC=CC=C2S=1(=O)C1=CC=CC=C1 JUIVJWBDXPKTJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241001279686 Allium moly Species 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005488 Capillary Leak Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000016989 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010000063 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- LRULVYSBRWUVGR-FCHUYYIVSA-N GSK2879552 Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1CN1CCC(CN[C@H]2[C@@H](C2)C=2C=CC=CC=2)CC1 LRULVYSBRWUVGR-FCHUYYIVSA-N 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N Ile-Asp-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000031932 Systemic capillary leak syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005574 cross-species transmission Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003785 decidua Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 201000002595 endometriosis of ovary Diseases 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N formoterol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(NC=O)=C1 BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002848 formoterol Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000938 luteal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010065781 myosin light chain 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 201000004228 ovarian endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000030747 ovarian endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009120 phenotypic response Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001361 thrombopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000015534 trkB Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064880 trkB Receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
Otkriveni su modifikovani himemi polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama. Specifično su otkriveni, modifikovani himemi polipeptidi sa Fltl receptorom, koji su modifikovani na takav način da bi se poboljšao njihov farmakokinetički profil. Takođe su otkriveni postupci dobijanja i korišćenja modifikovanih polipeptida uključujući ali se ne ograničavajući na upotrebu modifikovanih polipeptida da bi se smanjilo ili inhibiralo propuštanje plazme i/ili vaskulame permeabilnosti kod sisara. Otkriveni su modifikovani himemi polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama. Specifično su otkriveni, modifikovani himemi polipeptidi sa Fltl receptorom, koji su modifikovani na takav način da bi se poboljšao njihov farmakokinetički profil. Takođe su otkriveni postupci dobijanja i korišćenja modifikovanih polipeptida uključujući ali se ne ograničavajući na upotrebu modifikovanih polipeptida da bi se smanjilo ili inhibiralo propuštanje plazme i/ili vaskulame permeabilnosti kod sisara.
Description
Ova patentna prijava ima prioritet provizorne US prijave 60/138,133, podnete 8 juna 1999. U ovoj prijavi su date reference za različite publikacije. Otkrića u tim publikacijama u njihovoj celovitosti su ovde inkorporirani kao referenca u odnosu na ovu prijavu.
Oblast ovog pronalaska su modifikovani polipeptidi sa poboljšanom farmakokinetikom. Naročito, oblast ovog pronalaska odnosi se na Fltl receptor polipeptida koji su modifikovani tako da poboljšaju njihov farmakokinetički profil. Oblast ovog pronalaka takođe se odnosi na postupak pripremanja i upotrebu modifikovanih polipeptida uključujući ali se ne ograničavajući na upotrebu modifikovanih polipeptida da smanji li inhibira propuštanje plazme i/ili vaskulamu permeabilnost kod sisara.
Sposobnost polipeptidnih liganada da se veže za ćelije i na taj način izmami fenotipski odgovor kao što je rast ćelija, opstanak, sekrecija ćelijskih proizvoda ili diferencijacija je često posredovana transmembranskim receptorima na ćeliji. Ekstracelulami domeji takvih receptora (tj. taj deo receptora koji je izložen na površini ćelije) je u opšte najkarakterističniji deo molekula, koji obezbeđuje protein sa karakteristikama vezivanja liganda. Vezivanje liganda za ekstracelulami domen u opšte rezultuje pretvaranjem signala koji prenosi biološki signal do intracelulamog cilja. Cesto, ovo pretvaranje signala se dešava preko katalitičkih intracelulamih domena. Određeni raspored motiva sekvence katalitičkog intracelulamog domena određuje njegov prilaz potencijalnim kinaznim supstratima (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. U: 50685078; Fantl, et al., 1992, Cell 69:413-413). Primeri receptora koji pretvaraju signale preko katalitičkih intracelulamih domena uključuju receptor tirozin kinazu (RTKs) kao što je Trk familija receptora koji su generalno ograničeni na ćelije nervnog sistema, familiju receptora citokina koja uključuje trostruki CNTF receptorski kompleks (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466) koji je takođe u opšte ograničen na ćelije nervnog sistema, receptore kupiovane sa G-proteinom kao što je p2-adrenergični receptor nađen, na primer, na srčanim mišićnim ćelijama multimemi IgE receptor visokog afiniteta FcsRI koji su lokalizovani, za većinu delova, na mlečnim ćelijama i bazofilima (Sutton & Gould, 1993, Nature 336:421-428).
Svi do sada identifikovani receptori podležu dimerizaciji, multimerizaciji ili nekoj bliskoj konformacionoj promem koja prati vezivanje liganda (Schlessinger, J. , 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443-447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212; Schlessinger & Urlich, 1992, Neuron 9:383-391) i molekulskoj interakciji između dimemih intracelulamih domena koji dovode do aktivacije katalitičkih funkcija. U nekim slučajevima, kao što je faktor rasta iz krvnih pločica (PDGF), ligand je dimer koji vezuje dva molekula receptora (Hart, et al., 1988, Science, 240:1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912) dok, na primer, u slučaju epidermalnog faktora rasta (EFG), ligand je monomer (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:14631-14636). U slučaju FceRI receptora, ligand, IgE, izlazi vezan za FcsRI na monomemi način i jedino postaje aktiviran kada se antigen veže za IgE/FcsRI kompleks i unakrsnim vezama veže za IgE molekule (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421-428).
Često, raspoređenost na tkivu određenih receptora kod viših organizama obezbeđuje uvid u biološku funkciju receptora. RTK za neke faktore rasta i diferencijacije, kao što je faktor rasta fibroblasta (FGF), je široko rasprostranjen i zbog toga se čini da igra jedna opšta uloga u rastu tkiva i održavanju. Članovi Trk RTK familije (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3:262-268) receptora su uopšte ograničeni na ćelije nervnog sistema, i familija neravnih faktora rasta (Nerve Grouth Factor-NGF) se sastoji od nervnog faktora rasta (NGF), neurotrofičnog faktora iz mozga (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) i neurotrofina-4/5 (NT-4/5), koji se vezuju za receptore Trk RTK familije, potpomažući diferencijaciju različitih grupa neurona u mozgu i preriferiji (Linsday, R. M, 1993, u Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallcon, eds., str. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). FcsRI je lokalizovan na ograničeni tip ćelija kao što su mlečne ćelije i bazofile. Mlečne ćelije potiču iz linije roda pluripotentnih hematopoietskih ćelija koštane srži, ali su završile svoju mutaciju u tkivu koja je pratila migraciju iz krvnog toka (Videti Janeway & Travers, 1996, u Immunobiology, 2nd Edition, M. Robertson & E. Lawrence, eds, str. 13-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) i uključene su u alergični odgovor.
Mnoge studije su pokazale da ekstracelulami domeni receptora obezbeđuju specifične karakteristike vezivanja liganda. Osim toga, okruženje ćelije u kom se receptor ispoljava, može uticati na biološki odgovor koji se pokazuje posle vezanja liganda za receptor. Na primer, kada se neuronska ćelija sa Trk receptorom izloži neurotrofinu koji se vezuje za taj receptor, dolazi do opstanka neurona i diferencijacije. Kada se isti receptor koji ima fibroblast, izloži neurotrofinu, dolazi do proliferacije fibroblasta (Glass, et al, 1991, Cell 66:405-413).
Klasa dimemih mitogena, koja potiče iz ćelija sa selektivnošću za vaskulame endotelijalne ćelije, je identifikovana i označena kao vaskulami endotelijalni ćelijski faktor rasta (VEGF-Vascular Endothelial cell Growth Factor). VEGF je prečišćen iz kondicioniranog medijuma rasta ćelija glioma pacova [Conn et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, str. 2628-2632], i kondicioniraog medijuma rasta goveđih zvezdastih ćelija folikula hipofize [Ferrara and Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, str. 851-858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, str. 7311-7315] i humanog kondicioniranog medijuma rasta U937 ćelija [Connolly, D.T. et al (1989), Science, 246, str. 13091312], VEGF je dimer sa prividnom molekulskom masom od oko 46 kDa sa svakom podjedinicom koja ima prividnu molekulsku masu od oko 23 kDa. VEGF ima neke strukturne sličnosti sa faktorom rasta koji potiče iz krvnih pločica (PDGF), koji je mitogen za ćelije vezivnog tkiva ah nije mitogen za vaskulame endotelijalne ćelije iz velikih krvnih sudova.
Receptor tirozin kinaze vezan za membranui, poznat kao Flt, je pokazano daje VEGF receptor[DeVries, C. et. al., (1992), Science, 255, str 989-991], Flt receptor se specifično veže za VEGF što indukuje mitogenezu. Drugi oblik VEGF receptora, označen KDR, je takođe poznat po vezivanju VEGF i indukuje mitogenezu. Parcijalna cDNA sekvenca i takođe je poznata gotovo čitave dužine proteinska sekvence KDR-a [Terman, B.I. et al, (1991) Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B. I. et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, str. 1579-1586],
Istrajna angiogeneza može uzrokovati ili pogoršati izvesne bolesti kao što je psorijaza, reumatoidni artritis, hemangion, angiofibrom, dijabetičarsku retinopatiju i neovaskulami glaukom. Inhibitor VEGF aktivnosti može biti koristan u lečenju takvih bolesti i drugih VEGF-indukovanih patoloških angiogeneza i stanja vaskulame permeabilnosti kao što je vaskularizacija tumora. Ovaj pronalazak se odnosi na VEGF inhibitore koji su zasnovani na VEGF receptorima Fltl.
Propuštanje plazme, ključna komponenta zapaljenja, dešava se u određenom podsetu mikro krvnih sudova. Naročito, u većini organa propuštanje plazme specifično se dešava u venulama. Nasuprot arteriolama i kapilarima, venule počinju da propuštaju kao odgovor na brojne inflamatorne posrednike uključujući histamin, bradikinin i serotonin. Jedna karakteristika zapaljnja je propuštanje plazme kao rezultat intracelulamih pukotina koji nastaju u endotelijumu venula. Većina eksperimentalih modela zapaljenja ukazuje da ove intracelulame pukotine nastaju između endotelijalnih ćelija postkapilara i sakupljajućih venula (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998 152 1463-76). Pokazano je da se zvesni lecitini mogu koristiti da se otkriju karakteristike fokalnih mesta propuštanja plazme, endotelijalnih pukotina i "finger-like"postupaka na endotelijalnoj ćelijskoj granici kod venula u zapaljenju (Thurston, G et al, Am. J. Physiol, 1996, 271 H2547-62). Naročito, biljni lecitini su korišćeni za vizuelizaciju morfoloških promena na endotelijanim ćelijskim granicama kod venula u zapaljenju, na primer kod traheja pacova. Lecitini, kao što je konkavalin A i ricin, koji se vezuju fokalno za venule u zapaljenju otkrivaju regrone subendotelijalnih zidova sudova koji imaju pukotine koje odgovaraju mestima propuštanja plazme (Thurston, G., et al., Am J Physiol, 1996, 271 H2547-62).
Osobine mikro krvnih sudva su dinamične. Hronične bolesti zapaljenja, na primer, su u vezi sa remodelovanjem mikro krvnih sudova, uključujući angiogenska proširenja i proširenja mikro krvnih sudova. Mikro krvni sudovi takođe mogu biti remodelovani sticanjem abnormalnih fenotipskih osobina. Kod hroničnog zapaljenja disajnih puteva na modelu kod pacova i miševa, kapilari vazdušnih puteva stiču osobine od venula, uključujući proširenje prečnika krvnih sudova, povećanu imunoreaktivnost za von Willebrand-ov faktor i povećanu imunoreaktivnost na P-selektin. Dodatno, ovi remodelovani krvni sudovi propuštaju kao odgovor na inflamatorne posrednike, dokle isti krvni sudovi u vazdušnom putu kod normalnih miševa ne propuštaju.
Pokazano je da izvesne supstance smanjuju ili inhibiraju vaskulamu propustljivost i/ili propuštanje plazme. Na primer, mistiksini su sintetički polipeptidi za koje je ustanovljeno da inhibiraju propuštanje lazme bez blokiranja nastanka endotelijalnih pukotina (Baluk, P., et al, J. Pharmacol. Exp. Ther, 1998, 284: 693-9). Takođe, agonist beta 2-adrenegičnih receptora, formoterol redukuje mikrovaskulama propuštanja inhibiranjem nastanka endotelijalnih pukotina (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Physiol„ 1994, 266: L461-8).
Angiopoietini i članovi familije endotelijalnih faktora rasta (VEGF) su jedini faktori rasta koji su u velikoj meri specifični za vaskulame endotelijalne ćelije. Studije ciljne genske inaktivacije kod miševa pokazale su da VEFG je neophodan za rane stadijume vaskulamog razvoja i da Ang-1 je tražen u kasnijim stupnjevima vaskulamog remodelovanja.
US Patent No. 6,011,003, izdat 4 januara 2000, u ime Metris Therapeutics Limited, otkriva izmenjen, rastvomi oblik FLT polipeptida koji je sposoban za vezivanje VEFG-a pomoću toga vrši inhibitomi uticaj na njih, polipeptid se sastoj od pet ili manje kompletnih imunoglobulinskih domena.
US Patent No. 5.712,380 izdat 27 januara 1998 u ime Merck & Co., otkriva inhibitore vaskulamog endotelijalnog ćelijskog faktora rasta (VEGF) koji se javljaju u prirodi ili dobijeni rastvomi oblici rekombinantnom tehnikom sa ili bez C-terminalnog transmembranskog regiona receptora za VEGF.
Takođe u ime Merck & Co. je objavana PCT WO 98/13071, 2. aprila 1998, koja otkriva metodologiju genske terapije za inhibiciju primarnog rasta tumora i metastaza pomoću transfera gena nukleotidne sekvence koja kodira rastvomi proteinski receptor koji vezuje VEGF.
PCT objava Br WO 97/44453, objavljena 27 novembra, 1997 u ime Genentech, Ine. otkriva novi himemi proteinski VEGF receptor koji sadrži sekvence amino kiselina koje su izvedene iz receptora vaskulamog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) Fltl i KDR, uključujući i murinske homologe humanom KDR receptora FLK1, gde pomenuti himemi protein sa VEGF receptorom vezuje se za VEGF i antagonizira proliferaciju endotelijalnih ćelija i njihovu angiogenesku aktivnost.
PCT objava br. WO 97/13787 , objavljena 17 aprila 1997, na ime Toa Gosei Co., LTD., otkriva inhibitore VEGF niske molekulske mase upotrebljive u lečenju bolesti koje su u vezi sa neovaskularizacijom kao što su čvrsti tumori. Polipeptiđ sadrži prvi domen sličan imunoglobulinu i drugi domen sličan imunoglobulinu u ekstracelulamom regionu VEGF receptora FLT ali ne sadrži šesti domen sličan imunoglobulinu i njegov sedmi domen sličan imunoglobulinu i pokazuje VEGF inhibitorsku aktivnost.
Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42:242-249, otkrivaju da zato što su monoklonalna antitela (MAbs) osnovna, pozitivno naelektrisani proteini i ćelije sisara su negativno naelektrisane, elektrostatička interakcija između ta dva može kreirati viši nivo za vezivanje u pozadini koji rezultuje niskim odnosom tumor/normalan organ. Da bi se prevazišao ovaj efekat, istraživači su pokušali da poboljšaju MAb klirans, korišćenjem različitih metoda koa što je sekundarno sredstvo kao i hemijske promene i promene naelektrisanja samog MAb.
Jasen-Pippo, et al, 1996, Pharmaceutical Research 13:102-107, otkriva da projektovanje strukture terapeutskih proteina, faktora stimulacije rekombinantne humane kolonije granulocita (PEG-G-CSF), koja rezultuje porastom stabilnosti i retencijom in vivo bioaktivnosti kada su davana intraduodenalnim putem.
Tsutsumi, et al., 1997, Thromb Haemost. 77:168-73, otkrivaju eksperiment gde in vivo trombopoietska aktivnost polietilen glikol modifikovanog interleukina-6 (MPEG-IL-6), u kojem 54% od 14 lizinskih amino grupa IL-6 se kupluje sa PEG, je upoređivana sa prirodnim IL-6.
Yang et al., 1995, Cancer 76:687-94, otkrivaju da konjugacija polietilenglikola sa rekombinantnim humanim nterleukinom-2 (IL-2) rezultuje jedinjenjem, polietilen glikol modifikovanim IL-2 (PEG-IL-2) koje zadržava aktivnost IL-2 in vitro i in vivo, ali pokazuje značajno produžen polu život cirkulacije.
R. Duncan i F Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) prikazuju napore da se poboljša polu-život u plazmi asparaginaze u konjugaciji sa polietilen glikolom.
Međunarodna objava PCT Br. WO 99/03996 objavljena 28 januara 1999 u ime Regeneron Pharmaceuticals, Ine. i The Regents of The University of Califomia opisuju modifikovane humane polipeptide koji imaju izbrisane regione baznih amino kiselina. Modifikovani humani polipeptidi su opisani tako da zadržavaju biološku aktivnost dok imaju smanjen afinitet za heparin i superiornu farmakokinetiku u životinjskom serumu u poređenju sa nemodifikovanim humanim.
SUŠTINA PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na VEGF antagoniste sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama. Poželjno izvođenje je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid sposoban da veže VEFG polipeptid koji se sastoji od (a) nukleotiđne sekvence koja kodira VEGF receptorsku komponentu koja je operativno vezana za (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira multimerizacionu komponentu, gde ;e VEGF receptorska komponenta samo VEGF receptorska komponenta fuzionog polipeptida i gde nukleotidna sekvenca (a) se sastoji suštinski od nukleotiđne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvencu Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora i nukleotiđne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvancu Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
U daljem izvođenju, izolovana nukleinska kiselina prvog VEFG receptora je Fltl.
U daljem izvođenju, izolovana nukleinska kiselina drugog VEGF receptora je Flkl.
U još jednom izvođenju, izolovana nukleinska kiselina drugog VEGF receptora je Flt4
U drugom poželjnom izvođenju, nukleotidna sekvenca kodira Ig domen 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je ispred nukleotiđne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
U još jednom poželjnom izvođenju, nukleotidna sekvenca, kodira Ig domen 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je iza nukleotiđne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
U poželjnom izvođenju pronalaska, multimerizaciona komponenta se sastoji od imunoglobulinskog domena.
U još jednom izvođenju, imunoglobulinski domen je izabran od grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.
Poželjna izvođenja uključuju izolovani molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od nukleinske sekvence koja kodira modifikovani Fltl receptor fuzionog polipeptida, gde region nukleinske kiseline koji kodira je izabran iz grupe koju čine
(a) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 13A-13D;
(b) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 14A-14C;
(c) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 15A-15C;
(d) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 16A-16C;
(e) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 21A-21C;
(f) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 22A-22C;
(g) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 24A-24C; i
(h) nukleotidna sekvenca, kao rezultat degeneracije genetičkog koda, koja se razlikule od nukleotidnih sekvenca (a), (b), (c), (d), (e), (f) ili (g) i koja kodira molekul fuzionog polipeptida koji ima biološku aktivnost modifikovanog Fltl receptora fuzionog proteina.
U daljem izvođenju pronalaska, fuzioni polipeptid je kodiran gore opisanim izolovanim molekulom nukleinske kiseline.
Poželjno izvođenje je kompozicija sposobna da veže VEGF molekul da bi nastao nefunkcionalni kompleks koji sadrži multimer fuzionog polipeptida.
Takođe poželjna je kompozicija kada je multimer dimer.
U još jednom izvođenju, kompozicija je u nosaču.
Drugo izvođenje je vektor koji se sastoj od gore opisanih molekula nukleinske kiselina i uključuje ekspresioni vektor koji se sastoji od opisanih molekula nukleinske kiseline gde molekul nukleinske kiseline je operativno vezan za ekspresionu kontrolnu sekvencu.
Druga uključena ostvarenja su sistem domaćin-vektor za proizvodnju fuzionog polipeptida koji se sastoji od ekspresionog vektora, u pogodnoj ćeliji domaćinu; sistem domaćin-vektor u kojem je pogodna ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija sisara; sistem domaćin-vektor gde je E.Coli pogodna ćelija domaćin; sistem domaćin-vektor gde je COS ćelija pogodna ćelija domaćin; sistem domaćin-vektor gde je CHO ćelija pogodna ćelija domaćin.
Drugo izvođenje pronalaska je postupak dobijanja fuzionog polipeptida koji se sastoji od ćelija koje rastu sistema domaćin-vektor pod uslovima
Dodatna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid kodiran sekvencom nukleinske kiseline prikazane na slici 10A-10D ili slici 24A-24C, koja je modifikovana acetilacijom ili pegilacijom gde je acetilacija postignuta sa bar 100-strukim molamim viškom reagensa za acetilovanje i i kada je acetilacija postignuta sa molamim viškom reagensa za acetilaciju koji se kreće od 10-strukog molamog viška do oko 100-strukog molamog viška ili gde je pegilacija 10K ili 20K PEG.
Poželjno izvođenje uključuje postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara koji se sastoji iz davanja sisaru gore opisanog fuzionog proteina, uključujući izvođenja u kojima je sisar čovek, i kada je fuzioni polipeptid acetilovan ili je fuzioni protein podvrgnut pegilaciji.
Dalja izvođenja su fuzioni polipeptid koji se specifično veže za VEGF ligand VEGF receptora.
Poželjno izvođenje pronalaska je postupak blokiranja rasta krvnih sudova kod ljudi koji se sastoji u davanju efikasna količine gore opisanog polipeptida.
Takođe je poželjan postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisasra koja se sastoji iz davanja sisaru efikasna količine gore opisanog fuzionog polipeptida.
Poželjna izvođenja prema ovom postupku su ona kada je sisar čovek.
Dalja izvođenja prema ovom postupku uključuju smanjenje ili prevenciju rasta tumora kod ljudi; smanjenje ili prevenciju edema kod ljudi; naročito kada je edem, edem mozga; smanjenje ili prevenciju nastanka ascita kod ljudi, naročito kada je ascit, ascit u vezi sa kancerom jajnika.
Poželjna izvođenja pronalaska uključuju fuzioni polipeptid sposoban da veže VEGF polipeptid koji se sastoji od (a) VEFG receptorske komponenete operativno vezane za (b) multimerizacionu komponentu, gde je VEGF receptorska komponenta e samo VEGF receptorska komponenta u fuzionom polipeptidu i suštinski se sastoji od amino kiselinske sekvence Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora i amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
U još daljem izvođenju fuzionog polipeptida, drugi VEGF receptor je Flkl.
Još jedno izvođenje fuzionog polipeptida je ono u kome drugi VEGF receptor je Flt4.
Poželjna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid gde ammo kiselinske sekvence Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je ispred amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora i fuzioni polipeptid gde amino kiselinska sekvenca Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je iza aminokiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
U još jednom izvođenju, fuzioni polipeptid multimerizacionih komponenti se sastoji od imunoglobulinskog domena koji obuhvata izvođenje gde imunoglobulinski domen je izabran od grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.
Poželjna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid koji se sastoji od amino kiselinske sekvence modifikovanog Fltl receptora, gde je amino kiselinska sekvenca izabrana od grupe koju čine (a) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 13A-13D; (b) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 14A-14C; (c) amino kiselinska sekvenca prikazanea na slici 15A-15C; (d) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 16A-16D; (e) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (f) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 22A-22C; (g) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 24A-24B.
Drugo poželjno izvođenje je postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara koji se sastoji od davanja sisaru gore opisanog fuzionog polipeptida.
Alternativno poželjno izvođenje je postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisara koji se sastoji od davanja sisaru efikasne količine gore opisanog fuzionog polipeptida.
Kratak opis slika nacrta
Slika 1. IEF gel analiza nemodifikovanih i acetilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina. Nemodifikovan Fltl(l-3)-Fc protein ne može da uđe u gel zbog njegovog >9.3 pl, dok acetilovani Fltl(l-3)-Fc mogu da uđu u gel i postignu ravnotežu na pl 5.2.
Slika 2. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc acetilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina za ploče prevučene sa Matrigel®-om. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc proteini vezuju se obimno za komponente ekstracelulamog matriksa u Matrigel@-u, dok se acetilovani Fltl(l-3)-Fc ne vezuju.
Slika 3. Vezivanje nemodifikovanih Fltl(l-3)-Fc, acetilovanih Fltl(l-3)-Fc i pegilovanih Fltl(l-3)-Fc u Biacor testu. Acetilovane (kolone 13-16), pegilovane (kolone 17-20) i tretirane heparinom Fltl(l-3)-Fc (kolone 2124) su sve kompetitivne za Biacore čip -veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF vezivanje u poređenju sa kontrolom (kolone 1-4) i irelevantnim proteinom (kolone 5-8). Javlja se da nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (kolone 5-6) je samo delimično kompetitivn u Biacore čip-veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF vezivanju. Međutim, ispiranje vezanih uzoraka sa 0.5 M NaCl (kolone 7-8) rezultuje profilom vezivanja koji je sličan modifikovanim oblicima Fltl(l-3)-Fc, ukazuje da nemodifikovani protein pokazuje ne-spsecifično vezivanje za čip koje može biti eliminisano ispiranjem sa solima.
Slika 4. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(1-3)-Fc i pegilovanog Fltl(l-3)Fc za VEGF u ELISA testu. Oba proteina Fltl(l-3)-Fc, pegilovani i acetilovani vežu se za VEGF sa afinitetom koji se bliži onom nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc.
Slika 5. Farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc i pegilovanog Fltl(l-3)-Fc. Balb/c miševima (23-28g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg nemodifikovanog, acetilovanog i pegilovanog Fltl(l-3)Fc. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije proteina i serum je analiziran u standardnom ELISA testu napravljenom da bi se detektovao Fltl(l-3)Fc protein. Tmax za sve Fltl(l-3)Fc proteine je između vremenskih tačaka od 6 sati i 24 sata. Cmax za različite proteine je kao što sledi: Nemodifikovani: 0.06 μg/ml-0.15 p.g/ml; acetilovani: 1.5 μg/ml-4 0 μg/ml i pegilovani: približno 5μg/ml.
Slika 6A-6B. IEF gel analiza nemodifikovanih i delimično acilovanih Fltl(l-3)Fc proteina. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein je nesposoban da uđe u gel zbog njegovog >9.3 pl, dok je većina delimično acilovanih Fltl(l-3)-Fc uzoraka (30-100-struki višak uzoraka) bio u mogućnosti da migrira u gel i postine ravnotežu pl u opsegu između 4 55-8.43 u zavisnosti od stepena acilacije.
Slika 7. Vezivanje nemodifikovanih Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovanih Fltl (l-3)-Fc proteina za ploče prevučene sa Matrigel®-om. S obzirom da irelevantni kontroli protein, rTe2-Fc, delimično acilovani Fltl(l-3)-Fc (uzorci u 20 i 30-ostukom višku) ne pokazuju bilo kakvo vezivanje za ploče prevučene sa Matrigel-om, dok ne-acetilovani Fltl (1-3)-Fc protein pokazuje značajno vezivanje. 10-ostruki višak uzorka pokazuje redukovano vezivanje, ali stepen acetilacije nije dovoljan da kompletno blokira vezivanje za komponente ekstracelulamog matriksa.
Slika 8. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovaniog Fltl(l-3)-Fc u Biacore testu. Pri sub-stehiometrijskom odnosu (0 5 μg/ml ili nemodifikovanog Fltl(l-3) ili delimično acilovanog Fltl(l-3)-Fc nas. 0.2 μg/ml VEGF), nema dovoljno Fltl(l-3)-Fc (ili modifikovanog ili delimično acetilovanog) u rastvoru da se kompletno veže VEGF. Na 1.0 μg/ml koji je otprilike stehiometrijski odnos 1 1, oba i nemodifikovan i delimično modifikovan Fltl (l-3)-Fc su bolje kompetitivni u vezivanju VEGF, ali još uvek je nedovoljno Fltl(l-3)Fc proteina (ili nemodifikovanog ili delimično modifikovanog) da kompletno zasite dostupni VEGF. Međutin na 5.0 μg/ml, koji je nekoliko puta veći nego stehiometrijski odnos 1 1, oba i Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovani Fltl (1-3)-Fc proteini su sposobni da zasite VEGF bez obzira na stepen acilacije.
Slika 9. Farmakokinetiči profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc. Balb/c miševima (23-28g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog ili 10, 20, 40, 60 i 100-struki višak uzoraka delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc-a (3 miša za nemodifikovani, 10, 20 i 40- struki višak uzoraka i 2 miša za 60 i 100-struki višak uzoraka). Praćeno je propuštanje kod miševa na 1,2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije. Serum je analiziran ELISA testom kojim se otkriva Fltl(l-3)-Fc. Tmax za sve Fltl(l-3)-Fc proteine je bio na vremenskoj tačci od 6 sati, ali Cmax je bio kao što sledi: nemodifikovani Fltl(l-3)--Fc: 0.06 μg/ml; 10-struki višak uzorka:-0.7 μg/ml, 20-struki višak uzorka-2 μg/ml, 40-struki višak uzorka - 4μg/ml, 60-struki višak uzorka -2μg/ml, 100-struki višak uzorka - lμg/ml.
Slika 10A-10D. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Fltl(l-3)-Fc.
Slika 11. Šematski dijagram strukture Fltl.
Slika 12A i 12B. Analiza hidrofilnosti amino kiselinske sekvence Ig domena 2 i Ig domena 3 Fltl.
Slika 13A13D. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Muti: Fltl(1-3ab)-Fc.
Struktura 14A-14C. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Mut2: Fltl (2-3ab)-Fc.
Slika 15A-15C. Nukleinska kiselina izvedena amino kiselinska sekvenca Mut3: Fltl (2-3 )-Fc.
Slika 16A-16D. Nukleinska kiselina i izvedena ammo kiselinska sekvnca Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc.
Slika 17. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, mutantnog Fltl(l-3)-Fc sa izbrisanim osnovim regionom i Fltl(l-3)R->N mutantnog proteina u Biacore testu. Pri sub-stehiometrijskom odnosu (0.25 μg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovanog, acetilovaniog ili generalno modifikovanog uzorka nas. 0.1 μg/ml VEGF), postoji nedovoljno Fltl(l-3)-Fc proteina da bi se blokiralo vezivanje VEGF za Fltl(l-3)-Fc imobiliziran na Biacore čipu. Pri 0.5 μg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili generalno modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, stehiometrijski odnos je blizu 1:1 i postoji povećana sposobnost za blokiranje VEGF vezivanja za Biacore čip. Pri 1.0 μg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili generalno modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, koji su približno u stehiometrijskom odnosu 10:1, Fltl (l-3)-Fc proteini su u mogućnosti da blokiraju vezivanje VEFG za Biacore čip, ali nisu ekvivalentni. Nemodifikovani, acetilovani i Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc su suštinski jednaki u svojoj sposobnosti blokiranja VEGF vezivanja, dok Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc je manje efikasan u blokiranju vezivanja.
Slika 18. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina za ploče prevučene sa Matrigel®-om. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein veže se intenzivno za ta udubljenja, Mut3: Fltl(2-3)-Fc protein se veže nešto slabije, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc protein se veže još slabije i Mut2: Fltl(l-3ΔB)-Fc protein pokazuje najbolji profil, vezujući se slabije nego bilo koji drugi izmenjeni protein. Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc glikozilacijom izmenjeni protein pokazuje samo marginalne koristi na Matrigelovom testu.
Slika 19. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc, Mut2: Fltl (2-3 ab)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina u ELISA testu. Pri testiranim koncentracijama, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3ab)-Fc, Mut2: Fltl(l-3)-Fc i Fltl(2-3) izmenjeni proteini vezuju slično VEGF.
Slika 20. Farmakokinetički profili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina. Cm^ za ove reagense je kao što sledi: Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc - 0.15 μg/ml; 40 -ostruki molami višak acetilovanog Fltl(l-3)-Fc - 1.5 μg/ml; i Muti Fltl(l-3ΔB)-Fc-0.7pl/ml.
Slika 21A-21C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca
modifikovanog Fltl receptora označenog kao FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a).
Slika 22A-22C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca
modifikovanog Fltl receptora označenog kao FltlD2.VEGFR3D3 FcΔC1(a).
Slika 23. Test ekstracelulamog (ECM) matriksa. Rezultati ovog testa pokazuju da FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) proteini se znatno manje prijanjau na ECM-u u poređenju sa Fltl(l-3)-Fc proteinom.
Slika 24A-24C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca
modifikovanog Fltl receptora koji je označen kao VEGFRlR2-FcΔC1(a).
Slika 25A-25C. Test fosforilacije. Pri 1.5 molamom višku ili Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)Fc (A40) ili privremenog FlklD2FlklD3.FcΔC1(a) postoji kompletna blokada stimulacije receptora sa ova tri modifikovana Fltl receptora u poređenju sa kontrolnim medijumom. Nasuprot, privremeni FlklD2VEGFR3D3.FcΔC1(a) ne pokazuje značajnu blokadu pri ovom molamom višku, u poređenju sa VEGF pozitivnom kontrolom. Slični rezultati su viđeni na Slici 25B, gde su modifikovani Flt receptori u 3-ostrukom molamom višku u odnosu na VEGF 165 ligand. Na slici 25C, gde su modifikovani receptori Fltl u 6-strukom molamom višku u odnosu na VEGF 165 ligand, privremeni FlklD2VEGFR3D3.FcΔC1(a) može biti pokazano da delimično blokira VEGF 165 ;ndukovanu stimulaciju receptora na površini ćelije.
Slika 26A-26B. Test fosforilacije. Detekcijom Westem-ove mrlje tirozin fosforilovanog VEGFR2(Flkl) pomoću ligandne stimulacije VEGF165 pokazuje da receptori na površini ćelije nisu fosforilovani u odnosu na uzorke koji imaju VEGF165 prethodno inkubiran sa 1 i 2 strukom molarnim viškom (Slika 26A) ili 3 i 4-ostruki molarm višak (Slika 26B) ili privremenog FlklD2FlklD3.FcΔC1(a), stabilnog FlklD2FlklD3.FcΔC1(a) ili privremeni VEGFRlR2-FcΔC1(a). Pri svim ovde testiranim koncentracijama modifikovanog Fltl receptora, postoji kompletno vezivanje VEGF165 liganda u toku preinkubacije, što rezultuje u nedetektiblnoj stimulaciji receptora na površini ćelije ne vezivanjem VEGF165 u poređenju sa kontrolnim medijumom.
Slika 27. MG/R2 Test ćelijske proliferacije. Sledeći modifikovani Flt receptori Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i
FltlD2.VEGFR3De.FcΔC1(a), sa irelevantnim receptorom značen kao Tie2-Fc kao negativna kontrola, su titrovani sa 40 nM do 20μm i inkubirani na ćelijama u toku 1 sata na 37°C. Humani rekombinantni VEGF165 u definisanom mediju je zatim dodat u sve otvore u koncentraciji od 1.56 nM. Negativna kontrola, receptor Tie2-Fc ne blokira VEGF165-indukovanu proliferaciju ćelija pri bilo kojo koncentraciji s obzirom da FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) blokira 1.56 nM VEGF165 sa polovinom maksimalne doze 0.8 nM. Fltl(l-3)-Fc FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) su manje efikasni u blokiranju VEGF165 u ovom testu sa polovinom maksimalne doze od ~ 2 nM. Sam VEGF165 daje apsorbancu koja se očitava kao 1.2 jedinice i pozadina je 0.38 jedinica absorbance.
Slika 28. Biacore test stehiometrije vezivanja. Stehiometrija vezivanja je izračunata kao molami odnos vezanih VEGF165 u odnosu na imobilizirane Flt 1 D2Flk 1D3.FcAC 1 (a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a), korišćenjem faktora konverzije od 1000 RU ekvivalenata do 1 ng/ml. Rezultati ukazuju na steriohemiju vezivanja jednog VEGF165 dimemog molekula po jednom FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) molekulu.
Slika 29 i slika 30. Stereohemija ekskulzione hromatografije prema veličini. FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) pri koncentraciji od lnM (procenjeno da je 1000 puta viša nego KD za FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a)/VEGF165 interakcije) su pomešani sa različitim koncentracijama VEGF165. Posle inkubacije, merena je koncentracije slobodnog FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) u rastvoru. Podatci pokazuju da dodavanje 1 nM VEGF165 u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) rastvor potpuno blokira FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) vezivanjem za VEGF165 površinu. Ovaj rezultat sugeriše stehiometriju vezivanja jednog VEGF165 molekula na jedan FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) molekul.
Slika 31. Eksluziona hromatografija prema veličini (SEC) pri prirodnim uslovima. Maksimum #1 predstavlja FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) /VEG165 kompleks i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF165. Eluirane frakcije između 1.1 1.2 ml su sakupljene i guanidinijum hidrohlorid (GuHCl) je
dodat do krajnje koncentracije 4.5 M da bi kompleks disosovao.
Slika 32. Ekskluziona hromatografija prema veličini (SEC) pri uslovima disocijacije. Da bi se odvojile komonente kompleksa receptor-ligand i odredio njihov molami odnos, 50 pl disosovanog kompleksa je naneseno na Superose 12 PC 3.2/30 ekvilibrisanu sa 6M GuHCl i eluiranu. Maksimum #1 predstavlja FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i maksimum #2 predstavlja VEGF165.
Slika 33, slika 34 i slika 35. Ekskluziona hromatografija prema veličini (SEC) sa raseivačem svetla u sklopu sistema. Kolona za ekskluzionu hromatografiju prema veličini sa MiniDown raseivačem svetlosti u okviru sistema kao detektorom (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) i detektorima indeksa refrakcije (Schimadzu, Kyoto, Japan) je korišćena da bi se odredila molekulska masa (MT) kompleksa receptor-ligand. Kao što je prikazano na slici 33, eluacioni profil pokazuje dva maksimuma. Maksimum #1 predstavlja kompleks receptor-ligand i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF165. MT je izračunata iz LS i RI signala. Isti postupak je korišćen da se odredi MT individualnih komponenti kompleksa receptor ligand. Rezultati ovih određivanja su kao što sledi: MT za FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/VEGF165 kompleks ima poziciju maksimuma na 157 300 (Slika 33), MT VEGF165 ima poziciji maksimuma na 44 390 (Slika 34) i MT R1R2 na maksimumu je 113 300 (Slika35).
Slika 36. Mapiranje peptida test glikozilacije. Disulfidne strukture i glikozilaciona mesta u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) su određena postupkom mapiranja peptida. Postoji ukupno deset cisteina u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ; njih šest pripada Fc regionu. Cys 27 je disulfidno vezan za Cys76. Cysl21 je disulfidno vezan za Cys 182. Prva dva cisteina u Fc regionu (Cys211 i Cys214) grade intramolekulsku disulfidnu vezu sa ista dva cisteina u drugom Fc lancu. Međutim, ne može biti određeno da li se disulfidna veza javlja između istih cisteina (na primer, Cys211 za Cys211) ili između Cys211 i Cys214 Cys216 je disulfidno vezan za Cys306. Cys 352 je disulfidno vezan za Cys410.
Postoji pet mogućih N-vezanih glikozilacionih mesta u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i pronađeno je da su glikozilovani u različitom stepenu. Kompletna glikolizacija je primećena kod Asn33, Asnl93 i Asn282 Delimična glikozilacija je primećena kod Asn65 i Asnl20. Mesta glikozilacije su istaknuta podvlačenjem na slici.
Slika 37. Farmakokinetika Flt(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFRlR2-FcΔC1(a). Balb/c miševima je injektovano subkutanozno 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijenog
privremenom ekspresijom iz CHO, FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijen stabilnom ekspresijom iz CHO i VEGFRlR2-FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 6 dana posle injekcije. Serum je analiziran pomoću ELISA da bi se detektovali Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a). Tmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio na 6 sati dok Tmax za prolazni 7 stabilni FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i privremeni VEGFRlR2-FcΔC1(a) je bio 24 sata. Cmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio 8μg/ml, za oba privremena (FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFRlR2-FcΔC1(a)) Cmax je bio 18 μg/ml i Cmax za stabilni VEGFRlR2-FcΔC1(a) je bio30 μg/ml.
Slika 38. Farmakokinetika Flt(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFRlR2-FcΔC1(a). Balb/c miševima je injektovano subkutanozno 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijenog privremenom ekspresijom iz CHO i FltD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 i 20 dana posle injekcije. Serum je analiziran pomoću ELISA da bi se detektovali Fltl(l-3)-Fc (A40), Flt 1 D2Flk 1D3 .Fc AC 1 (a) i
FltlD2.VEGFR3D3.FcAO(a). Fltl(l-3)-Fc (A-40) ne može više biti detektovan u serumu posle 5 dana, a FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcAC3(a) su detektovani u toku 15 dana ili kasnije.
Slika 39. Sposobnost FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) da inhibira in vivo rast HT-1080 tumora fibrosarkoma. Svakog drugog dana ili 2 puta nedeljno tretirani su SCID miševi sa 25 mg/kg FlklD2.FlklD3.FcΔC1(a) značajno smanjujući rast subkutanoznog HT-1080 tumora fibrosarkoma.
Slika 40. Sposobnost FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) da inhibira in vivo rast C6 tumora glioma. Svakog drugog dana ili 2 puta nedeljno tretiranje miševa sa
FlkD2.FlklD3.FcΔC1(a) značajno smanjuje rast subkutanoznog C6 tumora glioma pri niskim dozama kao 2.5 mg/kg.
Slika 41. VEGF indukovana hiperpermeabilnost uterusa. PSMG e injektovan subkutanozno (5 IU) da bi izazvao ovulaciju kod predpubertetskih ženskih pacova što je rezultovalo dizanjem estradiola posle 2 dana koji je u navratu izazvao indukciju VEGF u materici. Ova indukcija rezultuje hiperpermeabilnošću materice i povećavanjem vlažnosti uterusa. Subkutanoznom injekcijom 25 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A-40), FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) 1 sat posle injekcije μmSG rezultuje inhibicijom oko 50% porasta težine vlažnosti uterusa.
Slika 42A-42B. Procena angiogeneze žutog tela pomoću progesterona kao obeleživača. μmSG je injektovan subkutanozno (5 IU) da bi se indukovala ovulacija kod predpubertetskih ženskih pacova, što rezultuje potpuno funkcionalnim žutim telom koje sadrži gustu mrežu krvnih sudova koji luče progesteron u krvotok da bi pripremili matericu za oplodnju. Indukovana angiogeneza žutog tela zahteva VEGF. Nivo mirovanja progesterona je oko 5 ng/ml i može biti indukovan do 25-40 ng/ml posle μmSG-a. Subkutanoznom injekcijom 25 mg/kg ili 5 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40) ili FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) na 1 sat posle μmSG injekcije rezultuje u kompletnoj inhibiciji indukcije progesterona u toku 4 dana.
Detaljni opis pronalaska
Postoji dugoročni probelm u stanju tehnike za proizvodnjom antagonista zasnovanog na VEGF receptorima koji ima farmakol netički profil koji je odgovarajući za uzimanje u obzir pri razmatranju antagonista kao terapeutskog kandidata. Prijavioci ovde opisuju, po prvi put, himemi polipeptidni molekul, sposoban da antagonizira VEGF aktivnost, koji pokazuje poboljšane farmakokinetičke osobine u poređenju sa drugim poznatim antagonistima zasnovanim na VEGF receptorima. Ovde opisani himemi polipeptidni molekuli tako obezbeđuje po prvi put odgovarajuće molekule za upotrebu u terapiji kod kojih antagonizam VEGF daje željeni rezultat.
Ovaj pronalazak obezbeđuje nove himeme molekule polipeptida nastale spajanjem modifikovanih ekstracelulamih domena za vezivanje liganada Fltl receptora do Fc regiona IgG.
Ekstracelulami domen vezivanja liganada je definisan kao deo receptora koji, u prirodnoj konformaciji u ćelijskoj membrani je orijentisan ekstracelulamo gde može kontaktirati sa svojim srodnim ligandom. Ekstracelulami domen za vezivanje liganda ne uključuje hidrofobne an:no kiseline u vezi sa transmembranskim domenom receptora ili bilo koje amino kiseline u vezi sa intracelulamim domenom receptora. U opšte, intracelulami ili citoplazmatičan domen receptora je uglavnom sastavljen od pozitivno naelektrisanih ili polarnih amino kiselina (tj. lizin, arginin, histidin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina). Prethodnih 15-30, pretežno hidrofobnih ili nepolamih amino kiselina (tj. leucin, valine, izoleucin i fenilalanin) čine transmembranski domen. Ekstracelulami domen se sastoji od amino kiselina koje prethode zastupljenim hidrofobnim transmembranskim amino kiselinama. Uglavnom transmembranski domen su zaobišle pozitivno naelektrisane ili polarne amino kiseline kao što su lizin i arginin. von Heijne je objavio detaljna pravila koja se obično koriste ljudi iz struke kada određuju koja amino kiselina datog receptora pripada ekstracelulamim, transmembranskim ili intracelulamim domenima (videti von Heijne, 1995, BioEssays 17:25-30). Alternativno, website na intemetu kao što je http://ulrec3.unil.ch/software/TNPRED form.htlm. je postao dostupan da obezbedi hemičarima, koji se bave proteinima, informacije o postavljanju predviđanja u vezi sa proteinskim domenima.
Ovaj pronalazak obezbeđuje konstrukciju molekula nukleinske kiseline koji kodiraju himeme polipeptidne molekule koji su umetnuti u vektor koji je sposoban da vrši ekspresiju molekula himemog polipeptida kada je uneti u odgovarajuću ćeliju domaćina. Odgovarajuća ćelija domaćina uključuje, ali nije ograničena na, bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara. Bilo koji od postupaka poznatih ljudima iz struke za umetanje DNA fragmenta u vektor može se koristiti da se konstruiše ekspresioni vektor koji kodira molekule himemih polipeptida pod kontrolom transkripciono/translatomog kontrolnog signala. Ovi postupci mogu uključivati m vitro rekombinantne DNA i sintetičke tehnike i m vivo rekombinacije (genetičke rekombinacije) (videti Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).
Ekspresija molekula nukleinske kiseline koji kodiraju molekule himemih polipeptida, može se regulisati drugom sekvencom nukleinske kiseline tako da dođe do ekspresije molekula himemog polipeptida u domaćinu transformisanom sa rekombinanatnim DNA molekulom. Na primer, ekspresija molekula himemog polipeptida ovde opisana može biti kontrolisana bilo kojim elementom promoter/produživač pozantaim u stanju tehnike. Promoteri koji mogu biti korišćeni u kontroli ekspresije molekula himemih polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, dugo terminalno ponavljanje kao što je opisano kod Squinto et al (1991., Cell 65 1-20); SV40 ran region promotera (Bemoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), CMV promoter, M-MuLV 5' terminalno ponavljanje promotera u 3' dugačkom terminalnom ponavljanju Rous sarcoma virus (Yamamoto,. et al, 1980, Cell 22: 787-797), promoter herpes timidin kinaze (Wagner et al., 1981, Pore. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulatomu sekvencu gena za metalotionin (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); prokariotski ekspresioni vektor kao što je promoter p-laktamaze (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) ili tac promoter (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, videti takođe "Useful proteins trom recombinant bacteria" u Scientific American, 1980, 242:74-94): elemente promotera iz kvasca ili druge gljive kao što je Gal 4 promoter, ADH (alkohol dehidrogenazni) promoter, PGK (fosfoglicerol kinaza) promoter, promoter alkalne fosfataze i sledeći životinjski regioni transkripcione kontrole, koji ispoljavaju specifičnosti tkiva korišćene su kod transgenskih životinja: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan kod zrnastih ćelija pankreasa (Swift et al, 1984, Cell 38: 639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontroli region gena za insulin koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122) region kontrole gena za imunoglobulin koji je aktivan kod limfnih ćelija (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), kontrolni region virusnog tumora mlečne žlezde kod misa, koji je aktivan u testisnim, grudnim, limfoidnim i mlečnim ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), kontrolni region gena za albumin koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), kontrolni region gena za alfa-fetoprotein, koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58): kontrolni region gena za alfa 1-antitripsin koji je aktivan u jetri (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1:161-171, kontrolni region gena za beta-globulin koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340: Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); kontrolni region gena za osnovni protein mijelina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), kontrolni region gena za miozinski laki lanac-2 koji je aktivan u skeletnim mišićima (Shani, 1985, Nature 314:283-286) i kontrolni region gena za lučenje gonadotropnog hormona koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Prema tome, prema pronalasku, ekspresioni vektori sposobni da se repliciraju u bakterijskom ili eukariotskom domaćinu koji sadrži molekul himemog polipeptida kodiran od strane ovde opisane nukleinske kiseline, se koriste da se transfektuje domaćin i zatim direktnom ekspresijom takve nukleinske kiseline da se dobiju molekuli himemog polipeptida, koji se mogu izolovati u biološki aktivnom obliku. Kao što je ovde korišćeno biološki aktivni oblik uključuje oblik koji je sposoban da se veže za VEGF.
Ekspresioni vektor sadrži ovde opisane molekule himeme nukleinske kiseline koji mogu biti identifikovane pomoću tri opšta prilaza: (a) DNA-DNA hibridizacija, (b) prisustvo ili nedostatak funkcija marker gena i (C) ekspresijom umetnutih sekvenci. U prvom prilazu, prisustvo stranog ubačenog gena u ekspresioni vektor može biti đetektovan DNA-DNA hibridizacijom, korišćenjem proba koje sadrže sekvence koje su homologe umetnutim sekvencama himemih polipeptida. U drugom prilazu, sistem rekombinanti vektor/domaćin može biti identifikovan i odabran na osnovu prisustva ili nedostatka izvesnih funkcija marker gena (na pr., aktivnosti timidin kinaze, otpornosti na antibiotike, transformacije fenotipa, okulzione telesne formacije kod bakulovirusa itd.) izazvan; umetanjem stranih gena u vektor. Na primer, ako DNA sekvenca himemog polipeptidnog molekula je umetnuta između sekvence marker gena vektora, rekombinanti sadrže umetak koji može biti identifikovan odsustvom funkcije marker gena. U trećem prilazu, rekombinantni ekspresioni vektor može biti identifikovan rekombinantnim testiranjem proizvoda ekspresije stranog gena. Takvi testovi mogu biti zasnovani, na primer, na fizičkim ili funkcionalnim osobinama molekula himemih polipeptida.
Ćelije prema ovom pronalasku mogu privremeno ili poželjno je konstitutivo i permanentno da vrše ekspresiju himemih polipeptidnih molekula.
Himemi polipeptidni molekuli mogu biti prečišćeni bilo kojom tehnikom koja omogućava posle toga nastanak stabilnog, biološki aktivnog himemog polipeptidnog molekula. Na primer, i ne samo kao ograničenja, faktori mogu biti izolovani iz ćelije ili kao rastvomi proteini ili kao inkluziona tela, iz kojih mogu biti ekstrahovani kvantitativno sa 8 M guanidinijum hidrohloridom i dializom (videti na primer, US Patent No. 5,663, 304). U cilju daljeg prečišćavanja faktora, mogu se koristiti konvencionalna jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija sa hidrofobnim interakcijama, hromatografija sa reversnom fazom ili gel filtracija.
U jednom izvođenju pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je ispred nukleotidne sekvence koja kodira drugu komponentu. U drugom izvođenu pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je iza nukleotidne sekvence koja kodira drugu komponentu. Dalja izvođenja prema pronalasku mogu se pripremiti na način da prva, druga i treća fuziona polipeptidna komponenta su razmeštene. Na primer, ako nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je obeležena sa 1, nukleotidna sekvenca koja kodira drugu komponentu je označena sa 2 i nukleotidna sekvenca treće komponente je obeležena sa 3, tada raspored komponenti na izolovanoj nukleinskoj kiselini prema pronalasku čitana od 5' do3' može biti bilo koja od sledećih šest kombinacija: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ili 3,2,1.
Prikazani pronalazak takođe ma dijagnostičke i terapeutske mogućnosti. U specifičnom izvođenju pronalaska, postupak detekcije odstupanja u funkciji ili ekspresiji molekla himemih proteina može biti korišćen u diagnozi poremećaja. U drugom izvođenju, manipulacija molekulima himemih polipeptida ili agonistima ili antagonistima koji se vezuju za molekule himemog proteina mogu biti korišćene u lečenju bolesti. U daljem izvođenju, molekuli himemih polipeptida koji se koriste kao sredstvo za blokiranje sredstva za vezivanje za njegov cilj.
Kroz niz primera, ali ne ograničenja, postupak prema pronalasku može biti korisan u lečenju kliničkih stanja koji se karakterišu vaskulamom permeabilnošću, edemom ili upalom kao što su edem na mozgu u vezi sa povredom, kapi ili tumorom; edem u vez sa bolestima upale kao što je psorijaza i artritis, uključujući reumatoidni artritis; asmu; u opšte edeme u vezi sa opekotinama; asciti i pleuralne perfuzije u vezi sa tumorima, upalama ili povredama; hronične upale vazdušnih puteva; sindrom propuštanja kapilara; sepsa; bolest bubrega u vezi sa povećanim propuštanjem proteina; poremećaji oka kao što su makulama degeneracija u vezi sa godinama i diabetska retinopatija.
Analiza amino kiselinske sekvence Fltl(l-3)-Fc otkriva prisustvo neuobičajeno velikog broja (46) baznih amino kiselinskih ostataka lizina. IEF analiza Fltl(l-3)-Fc pokazuje da ovaj protein ima pl veći od 9.3, potvrđujući predviđanje da je veoma bazan protein. Postavljena je hipoteza da bazna priroda Fltl(l-3)-Fc proteina uzrokuje njegovo vezivanje za komponente ekstracelulamog matriksa i da ova interakcija može biti uzrok ekstremno kratkog poluživota u serumu Fltl(l-3)-Fc kada se injektuje u miša. U cilju testiranja ove hipoteze, Fltl(l-3)-Fc protein je acetilovan na lizinskom ostatku da bi se smanjilo bazno naelektrisanje. Acetilovani Fltl(l-3)-Fc je zatim testiran u analizama opisanim infra.
Sledeći primeri su ponuđeni kao brojne ilustracije a ne kao ograničenja.
PRIMERI
Primer 1: Ekspresija Fltl(l-3)-Fc proteina u CHO K1 ćelijama
Korišćenjem standardnih tenhika molekulske biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Green Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), gen koji kodira Fltl(1 -3)-Fc je umetnut u ekspresioni vektor pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) na višestrukom mestu kloniranja iza CMV promotera. CHO Kl ćelije su transfektovane sa konstruisanim pEE14 l/Fltl(l-3)-Fc DNA pomoću lipofektamina (Gaithersburg, MD). Transfektovane CHO Kl ćelije su rasle u DMEM-u (JRH, Kansas City, MO) bez glutamina koji sadrži 25 μm metionin sulfoksimina (MSX) od Sigma Ine, St. Louis, MO i dobijeni su visoko rekombinantni proteinski ekspresori proveravanjem CHO Kl ćelijskog supematanta na oko 100 ručno uzetih kolonija izolovanih korišćenjem stanđardog imuno testa koji hvata i detektuje humani Fc. Izabrani ručno uzeti klonovi su amplifikovani u prisustvu 100 jjM MSX što je praćeno sa drugim postupkom proveravanja amplifikovanih klonova. Klon sa najvećom produkcijom rekombinantne Fltl(l-3)~Fc proteina ima specifičnu produktivnost 55 pg/ćeliji/dnevno.
Izabrani klon je raširen u 225 cm2 T-Balon (Corning, Acton, MA) a zatim u 8.5 1 valjkaste flaše (Corning, Acton, MA) korišćenjem medijuma za kultivaciju ćelija opisanog kao supra. Ćelije su uklonjenje iz valjkastih boca standardnom tripsinizacijom i stavljene su u medium od 3.5 1 suspenzije. Suspem oni medijum se sastoji od medijuma ISCHO bez glutamina (Irving Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 5% seruma goveđeg fetusa (FBS od Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μm MSX i GS dodatka (JRH Scientific, Kansas City, MO) u 5 ml Celligen bioreaktoru (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) pri gustini od 0.3 x IO6 ćelija/ml. Pošto ćelije dostignu gustinu 3.6 x IO6 /ml i kada su se adaptirale na suspenziju, premeštene su u 60 1 bioreaktor (ABEC, Allentown, PA) pri gustini od 0.5 x IO6 ćelija/ml u 20 1 medijuma ISCHO sa 5%serumom goveđeg fetusa. Posle dva dana dodato je još 20 1 ISCHO + 5% seruma goveđeg fetusa u bioreaktor. Omogućeno je da ćelije rastu još dva dana dok ne dostignu krajnju gustinu od 3.1 x IO6 ćelija/ml i krajnja koncentracija Fltl(l-3)-Fc pri sakupljanju bila je 95 mg/1. Pri sakupljanju ćelije su
uklonjene pomoću ceđenja sa tangencionalnim protokom sa 0.45 μm Prostak Filters (Millipore, Ine, Bedford, MA).
Primer 2: Prečišćavanje Fltl(l-3)-Fe proteina dobijenog iz CHO Kl ćelija
Fltl(l-3)-Fc protein je inicijalno prečišćen afinitetnom hromatografijom. Korišćena je proteinska A kolona da veže sa visokom specifičnošću, Fc deo molekula. Ovako afinitetno prečišćen protein je zatim koncentrovan i propušten kroz SEC kolonu. Zatim je protein eluiran u formulaciji pufera. Sledi opi ovog postupka do detalja.
Materijali i metodi
Sve hemikalije su dobijene od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ sa izuzetkom PBS, koji je nabavljen kao 10x koncentrat od Life Technologies, Gaithersburg, MD Preparativne smole protein A sa brzim protokom i Superdex 200 su nabavljene od Pharmacia-e, Piscataway, NJ. Oprema i membrane za koncentraciju proteina su nabavljene od Millipore-a, Bredford, MA.
Približno 401 proceđenog na 0 45 μm CHO kondicioniranog medijuma koji sadrži Fltl(l-3)-Fc protein je naneseno na 290 ml kolonu proteina A sa brzim protokom (10 cm-prečnik) koja je ekvilibrisana sa PBS Kolona je isprana sa PBS-om koji sadrži 350 mM NaCl i 0 02% CHAPS i vezani protein je eluiran sa 20 mM limunskom kiselinom koja sadrži 10 mM Na2HP04. Sakupljen je jedan maksimum pri eluiranju i pH je podignut do neutralnog sa IM NaOH. Frakcija eluata je koncentrovana do približno 9 mg/ml korišćenjem 10K membrana od regenerisane celuloze za ceđenje sa tangencijalnim protokom i mešanjem ćelijskog koncentrata. Da bi se uklonili agregati i druga onečišćenja, koncentrovani protein je nanesen na kolonu spakovanu sa smolom Superdex 200 preparativne čistoće (10 cm x 55 cm) u PBS-u koji sadrži 5% glicerola. Glavni maksimumi frakcija su objedinjeni, sterilnno proceđeni, napravljeni alikvoti i čuvani na -80°C.
Primer 3: Acefi.aciia Fltl(l-3)-Fc proteina
Dva miligrama Fltl(l-3)-Fc proteina je acetilovano kao što ,e opisano u uputstvu priručnika obezbeđenom uz kit sulfo-NHS-acetatnih modifikacija (Pierce, Chemical Co., Rockford, II, Cat #26777).
Primer 4: Karakte izaćiin acetilovanog Fltld-31-Fc proteina (a.) IEF analize: Fltl(l-3)-Fc i acetilovani Fltl(l-3)-Fc su analizirani standardnim IEF analizama. Kao što je prikazano na slici 1, Fltl(l-3)-Fc protein nije u stanju da migrira u gel i prema tome mora imati pl veći od 9.3, najveći pl u standardu. Međutim, acetilovani Fltl(l-3)-Fc može da migrira u gelu i postiže ravnotežu na pl približno 5.2. Ovaj rezultat pokazuje da acetilacija smanjuje ukupno pozitivno naelektrisanje proteina i zbog toga je njegov pl značajan.
(b) Vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa
U testu za vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa, Fltl(l-3)-Fc i acetilovani Fltl(l-3)-Fc su testirani u testu podražava interakciju sa komponentama ekstracelularnog matriksa. U ovom tetu, ploča sa 96 otvora sa kulturama tkiva je prevučena sa Matrigel-om (ploča sa 96 otvora sa Biocoat MATRIGEL® tankim slojem matriksa, Catalog #40607, Becon Dickinson Labvvare, Bedford, MA). Ploče su inkubirane sa različitim koncentracijama ili Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc ili rTie2-Fc (irelevantna kontrola) proteina dodatim u otvore. Ploče su inkubirane u toku 1-2 sata ili na sobnoj temperaturi ili na 37°C stepeni i zatim je detektovanje vezanih proteina postignuto dodavanjem sekundarne alkalne fosfataze u konjugatu sa anti-humanim Fc antitelom u otvore. Na kraju, dodat je substrat alkalne fosfataze u otvore i merena je optička gustina. Slika 2 pokazuje rezultate ovog testa. Kao irelevantni kontrolni protein rTie2-Fc, acetilovani Fltl(l-3) Fc ne pokazuje uopšte vezivanje za ploče prevučene Matrigelom, dok ne-acetilovani Fltl(l-3)-Fc protein pokazuje značajno vezivanje. Rezultati ukazuju da acetilacija baznih amino kiselinskih ostataka je efikasan način da se utiče na interakcije naelektrisanja koje postoje između pozitivno naelektrisanih proteina i negativno naelektrisanih komponenti matriksa koje su izložene in vivo.
Primer 5: Pegilncii a Fltl(l-3)-Fc proteina
Mada je pokazano da pegilacija (polietilen glikol-PEG) proteina povećava njihovu in vivo aktivnost unapređivanjem stabilnosti i biodostupnosti dok se mimmizira imunogenost (videti reference citirane supra), to je nasuprot intinuitivnosti da su pegilovani molekuli suviše veliki da se cede pomoću bubrežastih glomerula što će poboljšati njihove farmakokinetičke osobine. Bez obzira na teoriju, prijavioci su predpostavili da pegilacijom Fltl(l-3)-Fc molekula će se poboljšati farmakokinetičke osobine, moguće ne menjanjem pozitivnog naelektrisanja ili smanjem pl Fltl(l-3)-Fc, nego pre fizičkim zasenjenjem pozitivnih naelektrisanja za interakciju sa ekstracelulamim matriksom. Prijavioci su odlučili da poboljšaju farmakokinetičke osobine Fltl(l-3)-Fc molekula vezivanjem nizova 20K PEG kao što je opisano infra.
Materijali i metodi
Prečišćeni Fltl(l-3)-Fc koji potiče od CHO ćelija (videti supra) je korišćen u sledećim eksperimentima pegilacije. Funkcionalnizovani PEG su dobijeni od Sheanvater Polymers, Huntsville, AL; Bicine iz Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 za kolone iz Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS kao 10x koncentrat iz Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glicerol iz J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; i Bis-Tris pripremljani gelovi iz Novex, CA.
20K PEG nizovi funkcionalizovani sa amin specifičnim terminalnim delovima su korišćeni u studijama sa malom skalom koji su podešeni da procene različite reakcione uslove u kojima je PEG:protein stehiometrija varilala. Zasnovano na ovim reakcijama i analizama uzoraka na standardnom SDS-PAGE, Fltl(l-3)-Fc pri koncentraciji od 1.5 mg/ml je reagovao na pH 8.1 sa 20 K SPA-PEG (PEG sukcinimidil propionat) molekulima u molamom odnosu PEG-Fltl(l-3)-Fc monomer 1:6. Omogućeno je da se reakcija odvija na 8°C u toku noći. Za inicijalno prečišćavanje reakcioni proizvodi su naneseni na kolonu 10 mm x 30 cm Superose 6 ekvilibrisanu sa PBS koji sadrži 5% glicerola. Ispostavilo se da kolona odvaja pegilovane Fltl(l-3)-Fc molekule na osnovu stepena pegilacije. Sakupljene su frakcije koje odgovaraju primamo mono-pegilovanim i di-pegilovanim dimerima Fltl(l-3)-Fc, što je prosuđeno na osnovu sakupljenih uzoraka traka redukovanja i ne-redukovanja SDS-PAGE gela. Koncentracija proteina je određena merenjem absorbance na 280 nm. Pegilovani Fltl(l-3)-Fc protein je sterilno proceđen, podeljen u alikvote i čuvan na -40 °C.
Primer 6: Vezivanje nemodifikovanog,, acetilovanog i pegilovanog Fltl(l-3)-Fc u Biacore testu
Nemodifikovani, acetilovani i pegilovani Fltl (1-3)-Fc proteini su testirani u Biacore testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja za Fltl liganad, VEGF. U ovom testu, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Ine., Pisccataway, NJ, za standardni postupak) i uzorak koji sadrži 0.2 μg/ml VEGF i ili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc ili pegilovanog Fltl(l-3)-Fc (svaki 25 μg/ml) je propušten preko Fltl(l-3)-Fc prevučenog čipa. Da bi se minimizirali efekti nespecifičnog vezivanja, vezan uzorci su isprani sa 0.5 M NaCl. U jednom uzorku, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc je pomešan sa heparinom. Heparin je negativno naelektrisan molekul i Fltl(l-3)-Fc protein je pozitivno naelektisan molekul, tako da kada su dva molekula pomešana zajedno, oni mogu intereagovati sa njihovim odgovarajućim naelektrisanjima. Suštinski neutralizovano Fltl(l-3)-Fc nasleđe pozitivne šarže čini da se molekul ponaša kao da je hemijski ili genetski modifikovan tako da smanji njegovo naelektrisanje i tendenciju da se veže preko interakcije naelektrisanja. Kao što je prikazano na slici 3, acetilovani (kolone 13-16), pegilovani (kolone 17-20) i tretirani sa heparinom Fltl(l-3)-Fc (kolone 21-24) su sve u stanju da su kompletno kompetitivne u vezivanju Biacore čip veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF u poređenju sa kontrolnim (kolonel-4) i irelevantnim proteinom (kolone 5-8). Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (kolone 5-6) se javlja da je samo delimično kompetitivan u vezivanju Biacore čip veza Fltl (l-3)-Fc za VEGF. Međutim, ispiranje vezanih uzoraka sa 0.5 M NaCl (kolone 7-8) rezultuju u profilu vezivanja sličnom modifikovanim oblicima Fltl(1-3)-Fc ukazujući da nemodifikovani protein je pokazivao ne-specifična vezivanja za čip koja mogu biti eliminisan ispiranjem sa solju.
Primer 7: Vezivanje nemodifikovanog, acetilovanog i pegilovanog FltlO-3)-Fc ELISA testu
Nemodifikovani, acetilovani i pegilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su testirani u standardnom ELISA testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja Fltl receptora za ligand VEGF. Kao što je pokazano na slici 4, oba i pegilovani acetilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da vežu VEGF, pokazujući da modifikovanje proteina ili pegilacijom ili acetilacijom ne uništava njihovu sposobnost za vezivanje liganda.
Primer 8: Farmakokinetičke analize nemodifikovanog Fltin-3)-Fc. acetitovanog Fltl(1-3)-Fc i negilovanog Fltl(l-3)-Fc
In vivo eksperimenti su kreirani da bi se proeemo farmakokinetički profil nemodifikovanih Fltl(l-3)-Fc, acetilovanih Fltl(l-3)-Fc i pegilovanih Flt 1 (1 -3)-Fc proteina. Balb/c miševima (23-28g; 3 miša/grupa) je injektovan subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog, acetilovanog ili pegilovanog Fltl(l-3)-Fc. Kod miševa je praćeno propuštanje u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije proteina. Serum je analiziran standardnim ELISA testom koji je napravljen za detektovanje Fltl (1 -3)-Fc proteina. Na kratko, test uključuje prevlačenje ELISA ploče sa VEGF, vezivanje seruma koji sadrži nemodifikovani, acetilovani ili pegilovani Flt 1(1-3)-Fc i izazivanje sa anti-Fc antitelom vezanim za alkalnu fosfatazu. Kao sto je prikazano na slici 5, Tmax za sve Fltl(L-3)-Fc proteine je bio između vremenskih tačaka od 6 sati do 24 sata. Cmax za različite proteine je bio kao što sledi nemodifikovani: 0.06pAnl-0.15 p.g/ml; acetilovani: 1.5 p.g/ml-4.0 μg/ml i pegilovani: približno 5 μg/ml.
Primer 9: Dclimična acetilaciia Fltltl-31-Fc
Da bi se odredila minimalna količina acetilacije koja je neophodna da eliminiše vezivanje za komponente ekstracelulamog matriksa, konstruisan je eksperiment da se acetiluje Fltl (1 -3)-Fc protein u koracima korišćenjem povećavanja količine molarnog viška acetilacionog regensa u acetilacionoj reakcionoj smeši. Opseg molarnog viška je bio kao što sledi: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 mola acetilacionog reagensa po 1 molu Fll 1(1-3)-Fc monomera. Reakcije su izvedene do detal ja kao u priručnom uputstvu koje je obezbeđeno uz sulfo-NHS-acetatni kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, CatJ 26777).
Primer 10: Karakterizacija delimično acilovanih Fltlfl-31-Fc
(a) 1EF analize Nemodifikovani Flt 1 (l-3)-Fc i delimično acilovani Fltl(1 -3)-Fc proteini su analizirani u standardnim IEF analizama. Kao što je prikazano na slikama 6A-6B, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein nije bio sposoban da migrira u gel zbog ekstremno visokog pl (većeg od 9.3), Međutim, većina delimično acilovanih Fltl(1 -3)-Fc uzoraka (30-100 -struki molami višak uzoraka) su bili u stanju da migriraju u gel i postignu ravnotežni pl u opsegu od 4.55-8.43 u zavisnosti od stepena acetilacije proteina. Rezultati ukazuju da acetilacija može promeniti pozitivno
naelektrisanje proteina na kontrolisan način i da smanjenje pl može biti kontrolisano kontrolisanjem stepena acetilacije.
(bi Vezivanje delimično acetilovanog FltUl-31-Fc za komponente ekstracelularnoii matriksa
U testu vezivanja za komponente ekstracelulamog matruksa, Fltl(l-3)-Fc i delimično acetilovani Fltl (1-3 )-Fc su testirani u gore opisanom testu da bi se podražavala interakcija između komponenti ekstracelulamog matriksa. Različite koncentracije ili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, delimično acilovanog V (10, 20 i 30-ostrukom višku uzorka) ili rTie2-Fc (irelevantna kontrola) protein su dodati u otvore. Ploče su inkubirane u toku 1-2 sata na sobnoj temperaturi ili 37QC i zatim detekcijom vezanih proteina pomoću dodavanja konjugata sekundarne alkalne fosfataze sa anti-humanim Fc anti telom u otvore. Substrat alkalne fosfataze je zatim dodat u otvore i merena je optička gustina. Slika 7 prikazuje rezultate ovoga testa. Kao irelevantna kontrola protein rTie2-Fc, delimično acetilovani Fltl(l-3)-Fc (20 t 30 ostrukom molamom višku uzoraka) ne pokazuje bilo kakvo značajno vezivanje za ploče prevučene Metngeiom, dok ne-acetilovani Fltl(l-3)-Fc protein može pokazivati značajno vezivanje. Vezivanje je zasićeno, ukazujući da Flt 1 (l-3)-Fc protein može se vezati za specifična mesta, pre nego mnogo opšti je interakcije u kojima učestvuje naelektrisanje, koje neće biti zasićene 10-ostruki molarni višak uzorka pokazuje smanjeno
vezivanje, ali stepen acetilacijenije nije bio dovoljan da kompletno blokira vezivanje za komponente ekstracelulamog matriksa. 20-ostruki i viši molarni višak uzoraka pokazuje vezivanje koje se može detektovati, uprkos činjenici da 1EF analize (Slika 6A i 6B) manjeg molamog viška još imaju veliko ukupno pozitivno naelektrisanje. Ovi rezultati pokazuju da nije neophodno da se kompletno acetiluju sve dostupne bazne amino gnipe u cilju eliminisanja vezivanja za komponente ekstracelulamog matriksa (c.) Vezivanje delimično acetilovainh Fltl( l-3)-Fc u Biacore zasnovanom testu
Nemodifikovani i delimično acilovaui Fltl(l-3)-Fo proteini su testirani u Biacore zasnovanom testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja za Fltl ligand, VEGF. U ovom testu, nemodifikovani Fltl (1 -3)-Fc protein (0.5, 10 ili 5.0 p) je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Ine., Piscataway, NJ za standardne postupke) i rastvor koji sadrži 0.2 gg/inl VEGF ili nemodifikovanog Flt 1 (1 -3)-Fc (ili 0.5, 1.0 ili 5.0 pg/nil) ili 10 različitih delimično acilovanih Fltl(l-3)-Fc uzoraka (na 0.5, 1 0 ili 5.0 μg/ml) su propušteni kroz čip prevučen sa Fltl(l-3)-Fc. Kao što je prikazano na slici 8, u sub-stehiometrijskom odnosu (0.5 μg/ml ili nemodifikovanom Fltl(l-3) ili delimično acetilovanom Fltl (1 -3)-Fc 0.2 μg/ml VEGF), ne postoji dovoljno Fltl(l-3)-Fc (ili nemodifikovanom ili delimično acetilovanom) u rastvoru do potpunog vezivanja VEGF. Na 1.0 μg/ml sa približno 1:1 stehiometrijskom odnosu, oba i nemodifikovan i delimično acetilovan Fltl(l-3)-Fc su bolji u kompeticiji za vezivanje VEGF-a, ali je i dalje nedovoljno Fltl(l-3)-Fc proteina (ili nemodifikovanog ili đelimično-acilovanog) da se potpuno veže za dostupni VEGF. Međutim, 5.0 μg/ml, koji je nekoliko puta veći nego stehiometrijski odnos 1:1, oba i Fltl (1-3)-Fc i delimično acetilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da se vežu za VEGF, bez obzira na stepen acetilacije. Ovo jesno pokazuje da acetilacija ne menja Fltl(l-3)-Fc sposobnost vezivanja VEGF.
(d)Farmakokinetičke osobi ne delimično acetilovanih Fltl(l-3)-Fc
In vivo eksperimenti su konstruisani da bi se procenio farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(1 -3)-Fc i delimično acilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina. Balb/c miševima (23-28 g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog ili 10, 20, 40, 60 i 100 struki molami višak uzorka delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc (3 miša za nemodifikovan, 10, 20 i 40 ostruki molami višak uzorka 2 miša za 60 100 struki molami višak
uzorka). Pračćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije. Serum je analiziran u ELISA testu da bi se đetektovao Fltl(l-3)-Fc (opisan supra). Slika 9 detaljno daje rezultate ovog ispitivanja. Tmax je za sve Fltl(l-3)-Fc proteine testirane na vremenskoj tačci od 6 sati, ali je Cmax je bio kao što sledi: nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc: 0.06 μg/ml; 10 ostruki molami višak uzorka: -0.7 μg/ml, 20 -ostruki molami višak uzorka -2μg/ml, 40 struki molami višak uzorka - 4 μg/ml, 60-ostruki molami višak uzorka 2 μg/ml, 100 struki molami višak -1 μg/ml. Rezultati pokazuju da acetilacija ili pegilacija Fltl(l-3)-Fc značajno poboljšava njegov farmakokinetički profil.
Primcr 11: Konstruisanie mutanta sa izbrisanim Fltl(l-3)-Fc osnovnim regionom označenim kao Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc
Na osnovu posmatranja da acetilovani Fltl(l-3)-Fc, koji ima pl ispod 6, ima mnogo bolju farmakokinetiku nego visoko pozitivni nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (pl >9.3), postavlja se pitanje da li razlika u farmakokinetici može poticati od ukupnog naelektrisanja proteina, koji omogućava prijanjanje za negativno naelektrisane komponente ekstracelulamog matriksa, ili da li postoje specifične lokacije na površini Fltl(l-3)-Fc proteina koje čine specifično mesto vezivanja za komponente ekstracelulamog matriksa. Na primer, poznato je mnogo proteina koji imaju vezivno mesto kao heparin, koje se često sastoji od grupe baznih ostataka. Ponekad ovi ostatci su nađeni u grupi u primamo; sekvenci proteina; neka literatura identifikuje saglasne sekvence za takva mesta vezivanja heparina (videti na primer Hileman, et al., 1998, Bioessays 20(2): 156-67). U drugom slučaju, poznata kristalna struktura proteina otkriva grupu pozitivno naelektrisanih ostataka na površini proteina, ali ostatci dolaze iz različitih regiona primame sekvence i zajedno su onda kada se protein savilje u tercijarnu strukturu. Ovo je teško deducirati bez obzira da li izolovani amino kiselinski ostatci formiraju deo grupe baznih ostataka na površini proteina. Međutim, ukoliko posto i grupa pozitivno naelektrisanih amino kiselinskih ostataka u primarnoj sekvenci, nije neosnovano pretpostaviti da su ostatci prostorno bliski jedan drugom i zbog toga mogu biti deo vezivnog mesta za komponente ekstracelulamog matriksa. Fltl receptor je proučavan intenzivno i različiti domeni su opisani (videti primer Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res 88:867-876) u odnosu na nukleinsku kiselinu i amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 10A-10D ove prijave, neko može identifikovati signalnu sekvencu za sekreciju koja je locirana na početku sekvence i produžena je do koda za glicin za oko 76-78 nukleotida. Dospeo protein počinje sa Ser-Lys-Leu-Lys, polazeći od nukleotida 79 nukleinske sekvence. Fltl Ig doman 1 produžen sa nukleotidima 79 do 393, završava se sa amino kiselinom Ser-Asp-Thr. Fltl Ig domen 2 produžen za nukleotide 394 do 687 (kodira Gly-Arg-Pro do Asn-Thr-Ile) i Flt 1 Ig domena 3 produžen za nukleotide 688 do 996 (kodirane Ile-Asp-Val do Asp-Lys-Ala). Postoji amino kiselinska sekvenca koja premošćava, Gly-Pro-Gly, kodirana nukleotidima 997-1005, praćena nukleotidnom sekvencom humanog Fc (nukleotidi 1006-1701 ili amino kiseline Glu-Pro-Lys do Pro-Gly-Lys-stop).
Detaljnija analiza Fltl amino kiselinske sekvence otkriva da naime postoji grupa, amino kiselinskih ostataka 272-281 (KNKRASVRR) sa Slike 10A-10D, u kojoj 6 od 10 amino kiselinskih ostataka su bazne. Sekvenca je locirana na Fltl Ig domenu 3 receptora (videti sliku 11), koja nije po sebi bitna za vezivanje VEGF liganda, ali koja daje visoko afinitetno vezivanje za ligand. Poravnjanje sekvence Ig domena 3 sa onom Ig domena 2 pokazuje da u ovom regionu, postoji slabo poravnanje između dva Ig domena i postoji oko 10 dodatnih amino kiselina u Ig domenu 3. Analizom profila hidofilnosti (MacVector Computer sofhvare) ova dva domena jasno indikuje prisustvo hidrofilnog regiona u proteinu (Slkika 12A-12B). Ova zapažanja povećavaju mogućnost da sadašnja trodimenzionalna konformacija Fltl Ig domena 3 je dozvoljena za neke tipove izbočenja koja nisu u Fltl Ig domenu 2. Da bi se testirala ova hipoteza, 10 dodatnih amino kiselina su izbrisane i rezultujući protein je testiran da se vidi da li će ispuštanje uticati na farmakokinetičku favorizovanost bez ozbiljnog ugrožavanja afiniteta receptora za VEGF Ovako konstruisana DNA, koja je konstruisana korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et ak, Clod Spring Harbor Laboratory), Current Frotocols m Molecular Biology (Hds. Asubel, et al., Green Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) za ekspresione vektore μmT21 kod sisara (Genetics Institule, Ine., Cambridge, MA) na koju se poziva kao Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc. Muti: sintetizovan FIl 1(1 -3ađ)-Fc potiče od Fltl(l-3)-Fc brisanjem nukleotida 814-843 (prikazanih na slici 10A-10D), koji briše 10 visoko baznih amino kiselinskih ostataka sekvence Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg iz Fltl Ig domena 3.
Krajnja sintetisana DNA sekvenca je verifikovana korišćenjem AB1 373A DNA sekventora i Taq Dideoxy Terminator Cvcle Sequencing Kit-a (Applied Biosystems, Ine., Foster City, CA). Sekvenca MutJ: Fltl (1-3ab)-Fc je prikazana na slici 13A-13D.
Primci 12: Konstruisanie mutanta sa izbrisanim Fltl(l-3)-Fc osnovnim regionom označenim kao Mut 2: Fltlf 1-3abFFc
Druga konstrukcija mutanta brisanjem, označenog kao Mut2: Flt(2-3AR)-Fc izveden je iz Muti: Flt(l-3ΔB)-Fc konstruisanim brisanjem Flt 1 Ig domena I koji kodira nukleotide 79-393 (videti Sliku 10A-10D); zgodno je, nukleotide 73-78 (TCA GGT) promeniti u TCC GGA. Ovo uvodi restrikciono mesto (BspEl) bez menjanja amino kiselinske sekvence u vezi sa njom, Ser-Gly. Ovako konstrusani DNA, koji je konstruisan korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Frotocols in Molecular Biologv (Eds. Ausubel, et al., Green Publ.Assoc., Wiley-Interscience, NY) za eksspresioni vektor μmT21 kod sisara (Genetics Institute, ine., Cambridge, MA), takode je potvrđena sekvenca korišćenjem ABI 373 A DNA sekventora i Taq Dideoxy Terminator Cvele Sequencing Kit (Applied Biosystems, Ine., Foster City, CA). Sekvenca Mut2: Flt(2-3AB)-Fc je prikazana na slici 14A-14C.
Primer 13: Konstruisanje brisanjem FltI(l-3)-Fc mutanta označenog kao Mut: Fltl(2-31Fc
Treća konstrukcija mutanta brisanjem, označenog kao Mut 3: Fltl(2-3)-Fc, je konstruisana na isti način kao i Mut2: konstrukcijom Flt 1 (2-3AB), osim što je Flt 1 lg đomen 3 nije dirnut (bazni region amino kislina nije izbrisan}. Konstrukcija je izvršena korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije i sekvenca krajnjeg proizvoda je potvrđena supra. Sekvenca Mut3: FItl(2-3)-Fc je prikazana na Slici 15A-15C.
Primer 14: Konstruisanje mutanta Fl.tl(1 -3VKc sa ulikozilovanim baznim regtonom označenim kao Mut4: Fltl(l-3R->N)-Fc
Krajnji proizvod konstrukcije je napravljen uvođenjem N-glikozilacionog mesta u sredinu baznog regiona Flt 1 lg domena 3. Ovaj proizvod konstrukcije je označen kao Mut4 Fltl(l-3R_>N)-Fc i napravljen je promenom nukleotida 824-825 od GA do AC, zbog toga promenom kodiranog Arg ostatka (AGA) u Asn ostatak (AAC) (videti sliku 10A-10D). Rezultujuća amino kiselinska sekvanca je prema tome izmenjena od Arg-Ala-Ser u Asn-Ala-Ser, što se slaže sa kanonskim signalom(Asn-Xxx-Ser/Thr) za dodavanje N-glikozilacionog mesta na Asn ostatku. Sekvenca Mut4: Flt 1 (1-3r_>n)-Fc je prikazana na Slici 16A-16D.
Primer 15: Kamkterizaciia acetilovanog FltHl-31-Fc Muti: Fltlfl-3ar)-Fc i Mut4: Fltlf F3r.^n)-Fc mutanata
(a) Vezivanje za komonente ekstraceiularnog mntriksa
Da bi se odredilo da Ii tri modifikovana proteina su više ili manje imaju poboljšane farmakokinetičke osobine, ploče sa 96 otvora su prevučena sa Matrigeloin (kao što je opisano supra) i inkubirane su sa različitim koncentracijama imitiranih proteina i detektovane su anti/humanom Fc/alkalnom fosfatazom konjugovanom sa antitelima. Kao stoje prikazano na Slici 18, eksperiment je pokazao da dok nemodifikovani Fltl(21-3)-Fc protein može da se veže brzo za ove otvore, Mut3: Flt 1 (2-3)-Fc protein se veže nešto slabije, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc protein se vezuje još slabije a Mut2: Flt 1(2-3ab)-Fc protein pokazuje najbolji profil, i vezuje se slabije u odnosu na bilo koji drugi izmenjeni protein. Mut4: Fltl(1 -3r_>n)-Fc glikozilovani izmenjeni protein pokazuje samo marginalni doprinos u
Matrigelovom testu. Ovi rezultati potvrdu hipotezu da linearna sekvenca pozitivnih ammo kiselina može biti izbrisana iz primarna sekvence rezultujući opadanjem interakcija naelektrisanja sa komponentama ekstracelulamog matriksa.
(bi Vez >ar. e Muti: Fltl(l-3\R1-Fc i Mut4: Fltl(l-3R.^Nl-Fc u Biacore testu
Nemodifikovan i acetilovan Fltl(l-3)-Fc genetički modifikovani Muti Fltl(l-3ΔB)-Fc i Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc proteini su testiran u Biacore testu da se proceni njihova sposobnost vezivanja za Fltl ligand, VEFD. U ovom testu, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein (0.25, 0.5 ili 1 0 μg/ml) je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Ine., Piscataway, NJ, za standardni postupak) \ rastvor koji sadrži 0.1 μg/ml VEGF i ili prečišćeni ili COS ćelijski supematant koji sadrži nemodifikovane Fltl(l-3)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1.0 μg/ml), prečišćenog acetilovanog Fltl(l-3)-Fc(pri (0.25, 0.5 ili 1.0 μg/ml), COS ćelijski supematant koji sadrži Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1 0 μg/ml) ili COS ćelijski supematant koji sadrži Mut4: Fltl(l-3R. >n)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1.0 μg/ml) su propušteni preko Fltl(l-3)-Fc prevučenog čipa. Kao što je prikazano na Slici 17, pri sub-stehiometrijskom odnosu (0.25 μg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog uzorka vs. 0.1 μg/ml VEGF), ne postoji dovoljno Fltl (l-3)-Fc proteina da blokira vezivanje VEGF na Fltl(l-3)-Fc imobilizovanom Biacore čipu. Pri 0.5 μg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, u stehiometrijskom odnosu približno 1 1 postoji povećana mogućnost blokiranja VEGF vezivanja za Biacore čip. Pri 1.0 μg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, koji je približno u stehiometrijskom odnosu 10:1, Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da blokitraju vezivanje VEGF za Biacore čip, ali nisu ekvivalntni. Nemodifikovani, acetilovani Muti: Fltl(l-3)-Fc su suštinski jednaki u svojoj sposobnosti da blokiraju VEGF vezivanje, pošto Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc je nešto manje efikasan u blokiranju vezivanja. Ovi rezultati potvrđuju hipotezu da je moguće redukovati ne-specifično vezivanje pozitivno naelektrisanih molekula genetskim uklanjanjem linearne sekvence predominanto negativno naelektrisanih amino kiselina.
[cl Vezivanje Muti : Flflf I-3ar)-Fc. Mut2: Fltl(2-3AR1 Fc\ Mut3: FltHl-31-Fc » EIJSA testu
Da bi se odredilo da li tri izmenjena proteina mogu vezivati Fltl ligand VEGF, urađeni su eksperimenti vezivanja u kojima ploče sa 96 otvora su prevučene sa VEGF-om i različitim koncentracijama odgovarajućih izmenjenih proteina i posle ispiranja, vezana količina je detektovana inkubiranjem sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa anti humanim antitelima i kvantifikovana kolori metrijski dodavanjem odgovarajućeg substrata alkalne fosfataze. Kao što je prikazano na Slici 19, onaj eksperiment je pokazao da izmenjeni proteini se mogu slično vezati za VEGF u testiranim koncentracijama.
Pritner 16: Fannakokinetičke analize acetilovanunog Flt 1 (l-3)-Fc, Muti: Flt 1(1-3nr)-Fc i nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc
In vivo eksperimenti su napravljeni da procene farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc i 40-struki molami višak acetilovanog Fltl(l-3)-Fc proteina. Balb/c miševima (25-30g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i Muti: Fltl(l-3ΔB)-Fc proteina (4 miša svaki). Praćeno je propuštanje miševa na 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 5 dana posle injektovanja. Serum je analiziran EL1ZA -om napravljenom da bi se detektovao Fltl (1 -3)-Fc protein koji uključuje prevlačenje ELISA ploča sa VEGF-om, vezivanje Flt 1( 1 -3)-Fc i izazivanje sa anti -Fc antitelima vezanim za alkalnu fosfatazu. Kao što je prikazano na Slici 20, Cmax za ove reagense je kao što sledi nemodifikovani FItl(F3)-Fe - 0.15 μg/ml; 40-ostniki molami višak acetilovanog Flt 1(1-3)-Fc; i Muti: Flt 1 (1 -3ab)~Fc - 0.7 μg/ml.
Primer 17: Konstrukcija vektora motlilikovanog Fltl receptora
Obrazloženje za konstruisanje modifikovanih verzija Flt! reeeptora (takođe poznatih kao VEGFR1) je zasnovano na posmatranju da proteinska sekvenca Fltl je visoko bazna i zbog toga verovatno se veže za ekstraeelulami matriks (ECM). Visoko bazna priroda Fltl verovatno objašnjava zašto nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (opisani supra) imaju siromašnu farmakokinetiku koja otežava njihovu upotrebu kao terapeutskih sredstava. Kao što je opisano supra, kemijski modi liko vani oblici 40-ostnikog molamog viška acetilovanog Fltl(l-3)-Fc, dole označenog kao A40, pokazuje značajno poboljšani farmakokinetičkoi profil u odnosu na neacetilovan Fltl(1 -3)-Fc. Prema tome, učinjeni su pokušaji da se konstruišu DNA molekuli koji se mogu koristiti kao rekombinantni modifikovani ekspresioni oblici Fltl molekula receptora koji će imati poboljšani PK profil prikazan za A40 i dalje će zadržavati sposobnost da se jako vežu za VEGF.
Poznato je u literaturi da prvi Ig domen Fltl (koji ima ukupno naelektrisanje +5 na neutralnom pH) nije esencijalan za čvrsto vezivnje za VEGF, pa je ovaj domen izbrisan. Treći Ig domen (koji ima ukupno naelektrisanje +11) nije esencijalan za vezivanje, ali ima viši afinitet za VEGF nego drugi Ig domen, tako da umesto brisanja u potpunosti, zamenjen je sa ekvivalentnim domenima Fltl receptora srodnih Flkl (takođe poznatih kao VEGFR2) i Flt4 (takođe poznatih kao VEGFR3). Ovi himemi molekuli (označeni kao R1R2 (Fltl.D2.Flkl.D3. FcΔC1(a) i VEGERlR2-FcΔC1(a) i R1R3 (FltlD2.VEGFR3D3-FcΔC1(a) i VEGFRlR3-FcΔC1(a) respektivno, gde R1 i FltlD2 =Ig domen 2 Fltl (VEGFR1); R2 i FlklD3 = Ig domen 3 Flkl (VEGFR2); i R3 i VEGFR3D3 = Ig domen 3 od Flt4 (VEGFR 3)) dosta manje prijanjaju na ECM, kao što je procenjeno in vivo testom ECM vezivanja što je opisano infra i ima veoma poboljšan PK kao što je opisano infra. Dodatno, ovi molekuli su sposobni da vežu VEGF čvrsto kao što je opisano infra i blokiraju fosforilaciju prirodnog Flkl receptora koji se javlja u endotelijalnim ćelijama kao što je opisano infra.
(a) Konstruisanie ekspresionih plazmida pFltlD2.FlklD3. FcΔC1tal
Ekspresija plazmida μmT21.Fltl(l-3).Fc (6519bp) i μmT21.Flk-l(l-3).Fc (5230bp) su plazmidi koji kodiraju otpornost na ampicilin i Fc-obeležena verzija Ig 1-3 domena humanog Fltl i humanog Flkl, respektivno. Ovi plazmidi se koriste da bi se konstruisao DNA fragment koji se sastoj: od spajanja Ig domena 2 Fltl sa Ig domenom 3 Flkl, pomoću PCR amplifikacije odgovarajućih Ig domena praćeno daljim postpcima PCR-a da bi se postigla fuzija dva domena u edan fragment. Za Ig domen 2 Fltl, 5' i 3' amplifikovani prajmeri su kao što sledi:
5': bsp/fltlD2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAG ATG-3') 3': FltlD2-FlklD3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTAT TGGT-3')
5' amplificirani prajm©; kodiraju BspEl mesto rekristriktivnog enz na ispred Ig domena 2 Fltl, definisanog kao amrno kiselinska sekvenca GRPFVEM (koji odgovara amino-kiselinama 27-33 na slici 21A-21C). 3' prajmer kodira reverzno komplementarni 3' kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za 5' početkom Flkl Ig domena 3, sa tačkom spoja definisanom kao TUD Fltl (što odgovara amrno kiselinama 123-126 na slici 21A-21C) i nastavljanjem u VVLS (što odgovara amino-kiselinama 127-130 slika 21A-21C) Flkl-a.
Za Ig domen 3 Flkl, 5' i 3' amplifikacioni prajmeri su kao što sledi:
5' FltlD2-FlklD3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCT CATGG-3')
3’ FlklD3/apa/srf.as (5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCT GACAAATG-3') 5' Amplifikacioni prajmer kodira kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za početak Flkl Ig domena 3, kao što je ovde opisano. 3' amplifikacioni prajmer kodira kraj Flkl Ig domena 3, definisanog amrno kiselinama VRVHEK (odgovara amino kiselinama 223-228 Slika 21A-21C), praćenim sa sekvencom za premošćavanje koja uključuje sekvencu prepoznavanja za restrikcioni enz n Srfl i kodira amino kiseline GPG. Sekvenca koja premošćava odgovara amino kiselinama 229-231 slike 21A-21C.
Posle postupka PCR amplifikacije da bi se dobili individualni domeni, proizvodi su sakupljeni u epruvetu i podvrgnuti daljem postupku PCR sa prajmerima bsp/fltlD2 i FlklD3/apa/srf.as (opisanih supra) da bi dobili fuzioni proizvod. PCR proizvod je zatim podrgnut restrikcionim enzimima BspEl Smal i rezultujući 614bp fragment je podkloniran u BspEl do Srfl restrikciona mesta vektora μmT21/AB2.Fc, da bi se stvorio plazmid μmT21/FltD2.FlklD3.Fc. Nukleotidna sekvenca FltlD2-FlklD3 spajanja gena umetanjem je potvrđena standardnom analizom sekvence. Ovaj plazmid je zatim podvrgnut restrikcionim enzimima EcoRI i Srfl i rezultujući 702bp fragment je premešten u EcoRI do Srfl restrikciona mesta plazmida pFltl(l-3)B2-FcΔC1(a) da bi se dobio plazmid pFltlD2.FlklD3.FcΔC1(a). Kompletna DNA i dedukovana amino kiselinska sekvenca FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) himemog molekula je prikazana na Slici 21A-21C.
(al Konstrukcija ekspresionog plazmida pFltlD2VEGFR3D3FcΔC1(a)
Ekspresioni plazmid μmT21.Flt(l-3).Fc (6519bp) kodira otpornost na ampicilin i Fc obeleženu verziju Ig domena 1-3 humanog Fltl receptora. Ovaj plazmid je korišćen da proizvede DNA fragment koji sadrži Ig domen 2 Fltl od PCR. RNA iz ćelijske linije HEL921.7 je korišćen da se dobije Ig domen 3 Flkl, korišćenjem standardne RT-PCR metodologije. Dalji krug PCR amplifikacija je korišćen da se postigne spajanje dva Ig domena u jedan spojeni fragment. Za Ig domen 2 Fltl, 5' 3' amplifikacija "prajmera" je bila kao što sledi: 5': bsp/flt D2 (5 -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGA TG-3') 3': fLT 1 d2.VEGFR3D3.as (TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGA TTGTATTGGT) 5' amplifikacioni prajmer kodira BspEl restrikciono mesto iznad Ig domena 2 od Fltl, definisano aminokiselinskom sekvencom GRPFVEM (koja odgovara amino kiselinama 27-33 slike 22A-22C). 3' amplifikacioni prajmer kodira reverzn komplement kraja Fltl Ig domena 2 spojenog direktno na početak VEGFR3 Ig domena 3, sa tačkom spoja definisanom kao TIF Fltl (odgovara amino kiselinama 123-126 slike 22A-22C) i nastavlja u IQLL VEGFR3 (odgovara amino kiselinama 127-130 na slici 22A-22C).
Za Ig domen 3 VEGFR3, 5' i 3' prajmen korišćeni za RT-PCR su kao što sledi: 5’: R3D3.S (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGG TA)
3'R3D3 .as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAAT CG)
Oba 5' i 3' amplifikovana prajmera slažu se sa sekvencom VEGFR3. 296bp amplifikacioni proizvod RT-PCR reakcije je izolovan standardnim tehnikama i podvrgnut je daljem postupku PCR da bi se dodale pogodne sekvence da bi se omogućilo spajanje FltlD2 sa FlklD3 domenima i spajanje FlklD3 i Fc domena preko GPG mosta (videti dole). Amplifikovani "prajmeri" su kao što sledi: 5’ Flt 1D2.VEGFR3D3.s
(TCATAGATATCCAGGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG) 3’ VEGFR3D3/srf.as
(GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT) 5' amplifikacioni prajmer kodira 3' kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za početak (5' kraj) VEGFR3 Ig domena 3, kao što je gore opisano. 3' amplifikovan prajmer kodira 3' kraj VEGFR3 Ig domena 3, defmisanog amino kiselinama VIVHEN (koji odgovara amino kiselinama 221-226 Slike 22A-22C), koji prati sekvenca za premošćavanje koja uključuje sekvencu za prepoznavanje za Srfl i kodira ammo kiseline GPG. Sekvenca koja premošćava odgovara amino kiselinama 227-229 slike 22A-22C.
Posle jednog kruga (za Fltl Ig domen 2) ili dva kruga (za Flt 4 Ig domen 3) PCR da se dobije individualan Ig domen, PCR proizvodi su sakupljeni u epruvetu i podvrgnuti daljim postupcima PCR amplifikacije sa amplifikacionim prajmerima bsp/fltlD2 i VEGFR3D3/srf.as definisanih supra da bi se dobio fuzioni proizvod. Ovaj PCR proizvod je zatim podvrgnut restrikcionim ezimima BspEI i Smal i rezultujuća 652bp fragment je subkloniran u BspEI do Srfl restrikciona mesta vektora μmT21/FltlAB2. Fc (opisanih supra), da bi se kreirao plazmid μmT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. Sekvenca umetnutog spojenog gena FltD2-VEGFR3D3 je potvrđena standardnm analizom sekvence. Ovaj plazmid je zatim podvrgnut restrikcionim enzimima EcoRI i Srfl i rezultujući 693bp fragment je subkloniran u EcoRI do Srfl restrikciona mesta plazmida pFltl(l-3)AB2-FcΔC1(a) da bi se dobio plazmid označen kao pFltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Kompletna DNA deđukovana amino kiselinska sekvenca FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) himemog molekula je prikazana na slici 22A-22C.
ECM prevučene ploče (Becon Dickinson catalog # 35-4607) su bile rehidratisane sa toplim DME sa dodatkom glutamina (2 mM), 100U penicilina, 100U eritromicina i 10% BCS bar 1 sat pre dodavanja uzorka. Ploče su inkubirane u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa promenjivim koncentracijama FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) počevši na lOnM sa 2-strukim razblaženjem koje sledi u PBS-u sa 10%BCS. Zatim su ploče isprane 3 puta sa PBS sa 0.1% Triton-X i inkubirane sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa anti-humanim Fc antitelom (Promega, 1:4000 u PBS-u plus 10% BCS) u toku 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim su ploče isprane 4 puta sa PBS-om 0.1%. Triton-X alkalna fosfataza/pNPP rastvor (Sigma) je dodat za razvijanje boje. Ploče su čitane na I = 405-570 nm. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 23 i pokazuju da FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) proteini se značajno manje prijanjaju za EMC u poređenju sa Fltl(l-3) proteina.
Primer 19: Privremena ekspresija pFltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) u CHO-K1 (E1A) ćelijama
Velika količina (21) kulture E. coli DH10B ćelija koje nose pFltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) plazmid opisan supra u primeru 17(a) je narasla u toku noći u Terriffic Broth (TB) sa 100 jig/ml ampicilina. Sledećeg dana, plazmid DNA je ekstrahovan korišćenjem QIAgen Endoffee Megaprep kita sledeći protokol proizvodnje. Koncentracija prečišćenog plazmida DNA je određena standardnim tehnikama korišćenjem UV spektrofotometra i fluorometra. Plazmid DNA je potvrđen podvrgavanjem alikvota sandardnim restrikcionim enzimima a korišćeni su restrikcioni enzimi EcoRI sa Notl-om i Asel. Svi fragmenti posle restrikcionih enzima odgovaraju predviđenoj veličini kada su analizirani na 1% gelu agaroze.
Četrdeset petrijevih šolja od 15 cm je zasejano sa CHO-K1A ćelijama gustine 4 X 106 ćelija/šolji. Medijum u šoljama je bio Gibco Ham's F-12 sa dodatkom 10% Hyclone seruma goveđeg fetusa (FBS), 100Upenicilina/l00U streptomicina i glutamina (2mM). Sledećeg dana svaka šolja je transfektovana sa 6 pg pFltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) plazmidom DNA korišćenjem Gibco Optimem i Gibco Lipofectamine u zapremini od 12 ml, a sledeći manufakturni protokol. Četiri sata posle dodavanja transfekcione mešavine u ćelije, dodato je 12 ml/šolji Optimem
-a obogaćenog sa 10% FBS Sol je su inkubirane na 37°C u 5% CO2 inkubatoru u toku noći. Sledećeg dana medijumje uklonjen iz svake šolje 1 dodato je 25 ml ekspresionog medijuma (Gibco CHO-S-SFM II sa dodatkom glutamina (2mM) i lmM natrijum butirata). Šolje su inkubirane sa 37°C u toku 3 dana. Posle 3 dana inkubacije, medijum je ispario iz svake šolje i centrifugiran na 400 rμm u rotorom sa ljuljajućem nosačima do loptice ćelija. Supematant je dekantovan u sterilne 11 flaše 1 prečišćavanje proteina dobijenih ekspresijom je obavljeno kao stoje opisano infra.
Primer 20: Konstrukcija pVEGFRlR2,FcΔC1(aI ekspresionog vektora
pVEGFRlR2.FcΔC1(a) ekspresioni plazmid je konstruisan umetanjem DNA koja kodira amino kiseline SDT (odgovara amino kiselinama 27-29 na slici 24A-24C) između Fltld2-Flkld3-FcΔC1(a) amino kiselina 26 i 27 sa slike 21A-21C (GG) 1 uklanjanja DNA kodirajućih amino kislina GPG koje odgovaraju amino kiselinama 229-231 na slici. SDT amino kiselinska sekvenca je srodna Fltl receptom i dodata je nazad sa opadanjem verovatnoće u obradi heterogenog N-terminala. GPG (sekvenca za premošćavanje) je uklonjena tako da Fltl 1 Flkl Ig domeni su bili spojeni direktno jedan za drugi. Kompletna DNA 1 deduciranu amino kiselinska sekvenca pVEGFRlR2.FcΔC1(a) himernog molekula je prikazana na slici 24A-24C.
Primer 21; Postupak ćeliiske kulture korišeen da se dobiju modifikovani Fltl receptori
(a) Postupak ćeliiske kulture korišćeo m dob« janje FItlD2.FlklD3. FcACifa)
Postupak za proizvodnju FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) proteina korišćenjem ekspresionog plazmida pFltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) opisanog supra u primeru 1 uključuje suspendovanu kulturu rekombinantnih ćelija jajnika Kineskog hrčka (CHO K1/E1A) koje konstitutivno daju proteinski proizvod Ćelije su rasle u bioreaktrou 1 proteinski proizvod je izolovan i prečišćen afmitetnim i ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine. Postupak je dole opisan u više detalja.
Ćelijska ekspanzija
Dva konfluentna T-225 cm2 balona koja sadrže FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) ekspresione ćelijske linije su proširene stavljanjem ćelija u osam T-225 cm2 u medijumu (GMEM + 10% serum, GIBCO) i inkubirane su na 37°C i 5% CO2. Kada baloni postanu konfluentni (približno 3 do 4 dana) ćelije su odvojene koristeći tripsin. Dodat je svež medijum da štiti ćelije od daljeg izlaganja tripsinu. Ćelije su centrifugirane i resuspendovane u svežem medijumu a zatim prenesene u osam valjkastih boca od 850 cm2 i inkubirane na 37°C i 5% CO2 do konfluentnosti.
Suspendovana kultura u bioreaktoru
Ćelije narasle u valjkastim bocama su tretirane tripsinom da bi se odvoile od površine i isprale sa medijumom suspendovane kulture. Ćelije su aseptički premeštene u 51 bioreaktor (New Brunsvvick Celligen Plus) gde su ćelije narasle u 3.5 1 suspendovane kulture. Medijum suspendovane kulture je niže glukozna modifikacija IS-CHO (Irvine Scientific) bez glutamina kome je dodato 5% seruma goveđeg fetusa (Hyclone), GS dodatak (Life Technologies) i 25 μm metionin sulfoksamina (Sigma). pH je kontrolisan na 7.2 dodavanjem ugljen dioksida kroz otvor za gas ili dodavanjem tečnog rastvora natrijum karbonata u bioreaktor. Nivo rastvorenog kiseonika je održavan na 30% pomoću zasićenja dodavanjem ili kiseonika ili azota kroz otvor gasa i temperatura je kontrolisana na 37 °C. Kada se postigne gustina 4 x IO6 ćelija/ml, ćelije se premeste u bioreaktor od 40 1 koji sadrži isti medijum 1 set za kontrolu bioreaktora. Set za kontrolu temperature je redukovan na 34°C da bi usporio rast ćelija i povećao relativnu brzinu ekspresije proteina.
(b) Postupak za ćeliiske kulture korišćen pri dobiianiu FltlD2.VEGFR3D3. FcΔC1(a)
Ista metodologija, kao što je opisano supra za FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) je korišćena da se proizvede FltlD2.VEGFR3D3. FcΔC1(a)
Primer 22: Sakupljanje i prečišćavanje izmenjenih Fltl receptora
(al Sakupljanje i prečišćavanje FItlD2.FlklD3.FcΔC1(a)
Dobijeni proteini su pod aseptičkim uslovima sakupljeni iz bioreaktora dok su zadržane ćelije korišćenjem Milipore Prostaka modula za ceđenje sa tangencijalnim protokom i "low-shear"mehaničkom pumpom (Fristam). Sveži medijum je dodat u bioreaktor da zameni uklonjeni za vreme skupljanja ceđenjem. Približno 40 1 sakupljanog filtrata je zatim naneto na 400 ml kolonu koja sadrži Protein A Sepharosnu smolu (Amersham Pharmacia). Pošto je naneseno na smolu, smola je isprana sa puferom koji se sastoji od 10 mM natrijum fosfata, 500 nm natrijum hlorida, pH 7.2 da bi se uklonio ne vezani kontaminirajući proteini. FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) protein je eluiran sa pH 3.0 citratnim puferom. Eluirani protein je neutralizovan dodatkom Tris baze i zamrznut je na -20°C.
Nekoliko zamrznutih serija FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) proteina iz gornje faze sa Proteina A su otopljeni, spojeni i koncentrovani korišćenjem Millipore 30kD filtracionu membranu sa nominalnim molekulskim sitom na osnovu težine (NMWCO) i tangencijalnim protokom. Protein je prenesen u ćelijski koncentrator koji se mesa (Millipore) i dalje je koncentrovan do 30 mg/ml korišćenjem 30kD NMWCO membrane. Koncentrovani proteini su naneseni na kolonu za ekskluziju prema veličini spakovanu sa Superdex 200 smolom (Amersham Pharmacia) koja je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom soli sa 5% glicerolom. Isti pufer je korišćen pri eluiranju sa kolone. Frakcije koje odgovaraju FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) dimeru su sakupljene, sterilno ceđene kroz 0.22 mikronski filter, napravljeni su alikvoti i zamrznuti su.
(cl Sakupljanje i prečišćavanje FltlD2.VEGFR3D3. FcACHal
Ista metodologija kao što je opisano supra za FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) je korišćena pri sakupljanju i prečišćavanju FltlD2.VEGFR3D3. FcΔC1(a).
Primer 23: Fosforilacioni test za VEGFR2 dobiien privremenom ekspresijom
Osnovne humane endotelijalne ćelije pupčane vene (HUVEC), propuštene 4-6, su izgladnjene u toku 2 sata u DME visoko glukoznom mediju bez
seruma. Uzorci sadrže 40 ng/ml (1 nM) humanog VEGF165 koji je ligand za VEGF receptore Fltl, Flk 1 i Flk4(VEGFR3) koji su pripremljeni i prethodno inkubirani u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa različitim količinatma Fltl receptom Flt(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A 40), Flt 1 D2Flk 1D3.FcAC 1 (a) i FltlD2.VEGFR3D3. FcΔC1(a) u serumu bez DME visoko glukoznom medijumu koji sadrži 0 1% BSA. Ćelije su izazivane u toku 5 minuta sa gore pripremljenim uzorcima +/- VEGF 165, a zatim praćene sa potpunom lizom ćelija pomoću kompletnog pufera za ližu. Ćelijski lizat je zal 'm imunoprecipitiran sa antitelima protiv C-terminalnog VEGFR2 receptom. Imunoprecipitirani lizati su naneseni na 4-12% SDS-PAGE Novex gel i zatim preneseni na PVDF membrane korišćenjem standardnih metodologija transfera. Detekcija fosforilovanih VEGFR2 je urađena imounomrljama sa anti fosfo Tirozinom mAb koji se zove 4G10 (UBI) i razvijen je korišćenjem ECL reagensa (Amersham). Slike 25A-25C i 26A-26B pokazuju rezultate ovog eksperimenta. Slika 25A-25C otkriva da detekcija Westem mrlja tirozin fosforilovanog VEGFR2(Flkl) sa stimulacijom VEGF 165 ligandom pokazuje da ćelijska površina receptora je fosforilovana do različitih nivoa u zavisnosti od kojih modifikovanih Fltl receptora je korišćena u toku preinkubacije sa VEGF-om. Kao što se vidi na slici 25A, pri 1.5 molamim višku ili Flt(l-3)-Fc, Flt(l-3)-Fc (A40) ili privremenom FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) postoji kompletna blokada stimulacije receptora od strane ova tri modifikovamna Fltl receptora u poređenju sa kontrolnim medijumom. Na suprot tome, privremeni FltlD2 VEGFR3D3. FcΔC1(a) ne pokazuje značajno blokiranje pri ovom molamom višku u poređenju sa VEGF pozitivnom kontrolom. Slični rezultati su viđeni na Slici 25B, gde izmenjenii Flt receptori su 3-strukom molamom višku u odnosu na VEGF165 ligand. Na slici 25C, gde modifikovani Fltl receptori su u 6-ostrukom molamom višku u odnosu na VEGF1651igand, prelazni FltlD2.VEGFR3. FcΔC1(a) može sada biti pokazano da delimično blokira VEGF 165 indukovanu stimulaciju receptora na ćelijskoj površini.
Na slici 26A-26B, detekcijom Westem mrlja fosforilovanog tirozina VEGFR2(Flkl) sa VEGF165 stimulacijom liganada pokazuje da receptori sa površine ćelije nisu fosforilovani u odnosu na uzorke kojii maju VEGF165 preinkubiran sa 1 i 2-strukim molamim viškom (Slika 26A) ili 3 i 4 -ostrukim molamijm viškom (slika 26B) ili prolaznim FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a), stabilnim FltlD2.FlklD3. FcΔC1(a) ili prolaznim VEGFR1R2. FcΔC1(a). Na svim testimim koncentracijama modifikovanih Fltl receptora postoji kompletno vezivanje VEGF 165 liganda u toku preinkubacije, što rezultuje nedetektovanom stimulacijom receptora na ćelijskoj površini nevezanog VEGF165 u poređenju sa kontrolnim medijumom.
Primer 24: Biotest ćelijske proliferaciie
Testirana ćelijska populacija su MG87 ćelije koje su stabilno transfektovane sa ekspresionim plazmidom koji sadrži umetnut DNA koji kodira VEGFR2(Flkl) ekstracelulami domen spojen sa Trk intracelulamim kinaznim domenom, koji proizvodi himeri molekul. Razlog zbog koga je korišćen Trk intracelulami kinazni domen pre nego prirodni VEGFR2(Flkl) intracelulami kinazni domen, je da intracelulami kinazni domen VEGFR2(Flkl) ne uzrokuje jak proliferativni odgovor kada se stimuliše sa VEGF165 u ovim ćelijama. Poznato je da MG87 ćelije koje sadrže TrkB receptore potpune dužine daju snažan proliferativni odgovor kada su stimulisane sa BDNF-om, tako da TrkB intracelulami kinazni domen je konstruisan da zameni intracelulami kinazi domen VEGFR(Flkl) da bi nadvladao ovu proliferativnu sposobnost odgovora.
5 x IO3 ćelije/otvoru smeštene na ploču sa 96 otvora i omogućeno je da se ustale u toku 2 sata na 37 °C. Sledeći modifikovani Flt receptori Flt(l-3)-Fc, FltD2. FlklD3. FcΔC1(a) i FltlD2 VEGFR3D3.FcΔC1(a) sa jednim irelevantnim receptorom označenim kao Tie2-Fc kao negativnom kontrolom, su titrovane sa 40 nM do 20μm i inkubirane na ćelijama u toku 1 sata na 37 °C. Zatim je dodat ljudski rekombinantni VEGF165 u definisanom mediju su u sve otvore u koncentraciji od 1.56nM. Ploče su inkubirane u toku 72 sata na 37°C a zatim je dodat MTS (Owen's reagent, Promega) i ploče su inkubirane u toku još dodatnih 4 sata. Na kraju, ploče su čitane na spektrofotometru na 450/570 nm. Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 27. Kontrolni receptorr Tie-Fc ne blokira VEGF 165 indukovanu ćelijsku proliferaciju pri bilo kojim koncentracijama gde FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) blokira 1.56nM VEGF 165 pri polovini maksimalne doze 0.8 nM. Fltl(l-3)-Fc i FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) su manje efikasne u blokiranju VEGF 165 u ovom testu sa polovinom maksimalne doze od ~ 2nM. VEGF165 same daju očitavanje od 1.2 jedinica absorbance i pozadina od 0.38 absorpcionih jedinica.
Primer 25; Stehiometri a vezivanja izmenienih Flt receptora za VEGF165 (a)BIAcore analize
Stehiometrija FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFRlR2-FcAl(a) interakcije sa humanim VEGF165 je određena merenjem ili nivoa zasićenosti VEGF vezivanja za FltD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) površina ili merenjem koncentracije VEGF 165 potrebnog da se kompletno spreči vezivanje FltD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) za VEGF površinu BIAcore čipa.
Izmenjeni receptori FltD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFRlR2-FcΔC1(a) su zarobljeni sa anti-Fc specifičnim antitelima koja su prvo imobilizirana na Biacore čipu (BIACORE) pomoću hernije amino kuplovanja. Prazna površina antitela je korišćena kao negativna kontrola. VEGF 165 je injektovan pri koncentracijama od 1 nM, 10 nM i 50 nM preko FltD2FlklD3.FcAC 1 (a) i VEGFRlR2-FcΔC1(a) površina pri lOpl/min u toku jednog sata. Signal vezivanja u stvarnom vremenu je sniman i zasićenje vezivanja je postignuto pri kraju injektiranja. Stehiometrija vezivanja je izračunata kao molami odnos vezanih VEGF 165 u odnosu na imobilizirani FltD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a), korišćenjem konverzionog faktora od 1000RU ekvivalentnog lng/ml. Rezultati ukazuju na stehiometriju vezivanja jednog VEGF 165 dimemog molekula po jednom FltD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) molekulu (slika 28).
U rastvoru, FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) pri koncentrati;i od 1 nM (procenjenoj da će biti 100 puta veća od KD Flt 1 D2Flk 1D3.FcAC 1 (a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a)/VEGF165 interakcija) su pomešane sa različitim koncentracijama VEGF 165. Posle inkubacije od jednog sata, koncentracija slobodnog FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) u rastvoru je merena kao signal vezivanja za amino-kuplovane VEGF165 površine. Kalibraciona kriva je korišćena da konvertuje FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) BIAcore signal vez ^anja za njegovu molamu koncentraciju. Podatci pokazuju da dodavanje lnM VEGF165 u rastvor FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) kompletno blokira FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) vezivanje za VEGF165 površinu. Ovaj rezultat sugeriše da je stehiometrija vezivanja jednog VEGF165 molekula po jednom FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) molekulu (Slika 29 i slika 30). Kada je koncentracija FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) nanesena kao funkcija dodate koncentracije VEGF165, nagib linearnog dela je -1 06 za FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i -1,07 za VEGFRlR2-FcΔC1(a). Magnituda nagiba, veoma blizu negativnom je indikativna da jedan molekul VEGF165 veže se za jedan molekul ili FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFR1R2-FcΔC1(a).
(b) Ekskluziona hromatograliia na osnovu veličine
FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) je pomešan sa 3-strukim viškom VEGF165 i receptor-ligand koniplaks je prečišćen pomoću kolone za ekskluzionu hromatografiju na osnovu veličine na Pharmacia Superose 6. Receptor-ligand kompleks je zatim inkubiran u puferu koji sadrži 6M gvanidin hidrohlorid u cilju njegove đisocijacije u njegove proteinske komponente.
FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) je odvojen od VEGF165 pomoću kolone ekskluzine hromatografije Superose 6 u 6M guamdijum hloridu. U cilju određivanja stehiometrije kompleksa, nekoliko injektovanja FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGF165 je učinjeno i visina maksimuma ili integriran intenzitet maksimuma je nanesen kao funkcija koncentracije injektovanih proteina. Kalibracija je urađena pod uslovima koji su identični onima koji su korišćeni u odvajanju komponenti FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/ VEGF kompleksa. Kvantifikacija FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/VEGF kompleksne kompozicije je zasnovana na kalibracionim krivama. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na sli vi 28? koje pokazuju odnos VEGF165 u odnosu na Flt 1 D2Flkl D3.FcΔC1(a) u kompleksu daje 1:1.
Primer_26:_Određivanje_stehiometrije_vezivanja
FltlD2FlklD3.FcACHayVEGri.65 kompleksa mirnoću ekskluzuzine h ruma togra lije na osnovu veličine
Pobijanje FltlD2FlklD3,FcΔC1(a)/VEGF165 kompleksa
VEGF165 (koncentracija = 3.61 mg/ml) je pomešan sa CHO ćelijama koje privremeno daju FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) (koncentracija = 0 9 mg/ml) u molamom odnosu 3:1 (VEGF165: FltlD2FlklE>3 FcΔC1(a)) t inkubiran u toku noći na 4°C.
(a) Ekskluziona hromatografiia na osnovu veličine (SEC) nođ običnim uslovima
Da bi se odvojio kompleks od nevezanog VEGF165, 50 pl kompleksa je nanesen na Pharmacia Superode 12 PC 3.2/30 koja je ekvilibrisana sa PBS puferom. Uzorak je eluiran sa istim puferom sa brzinom protoka od 40pl/min na sobnoj temperaturi. Rezultat ovog SEC je prikazan na Slici 31. Maksimum #1 predstavlja kompleks i maksimum #2 predstavlja ne vezani VEGF165. Frakcije elutrane između 1.1 i 1.2 ml su sakupljene i dodat je
gvanidinijum hlorid (GuHCl) do finalne koncentracije 4.5 M da bi disocirao kompleks.
£b) Ekskluziona hromatografna. na osnovu veličine (SEO u uslovima disocijacije
Dn bi se odvojile komponente receptor-ligand kompleksa i odredio njihov molami odnos, 5Opi disosovanog kompleksa kao što je opisano supra, je naneseno na Superosu 12 PC 3.2/30 ekvilibrisanu sa 6M GuHCl i eluiranu sa istim rastvorom sa protokom od 40 pl/min. pri sobnoj temperaturi. Rezultat ove SEC je prikazan na slici 32. maksimum #1 predstavlja Flt 1 D2Flk 1 D3.FcΔC1(a) i maksimum #2 predstavlja VEGF165.
(c> Izračunavanje stehiometriie za FltlD2FlkjD3.FcΔC1fa):Y'EGF165 komnleks
Stehometrija kompleksa receptor ligand je određena iz površine maksimuma ili visine maksimuma komponenti. Koncentracije VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) koje odgovaraju visini maksimuma ili površini maksimuma, respektivno, su dobijene iz standardnih kriva za VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcΔC1(a). Da bi se dobila standardna kriva, četiri različite koncentracije (0.04 mg/ml-0.3 mg/ml) svake komponente koje su nanesene na Pharmacia Superose 12 PC 3 2/30 kolonu su ekvilibrisane sa 6M guanidijum hloridom i eluirane sa istim rastvorom pri brzim protoka 40 pl/min na sobnoj temperaturi. Standardna kriva je dobijena nanošenjem površine maksimuma naspram koncentracije proteina. Molami odnos VEGFI65: FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) određen prema površini maksimuma komponenti je 1.16. Molami odnos VEGF165: FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) je određen iz visine maksimuma komponenti je bio 1 10.
Primer_27;_Određivanje_stehiometriie
Fltl D2FIK1 D3.FcACHaFVEGF165_kompleksa_ekskluzionom
hromatografiiom na osnovu veličine sa rasipanjem svetla u sklopu sistema
Pobijanje kompleksa
VEGF165 je pomešan sa CHO koji privremeno vrše ekspresiju FltlD2F'klD3.FcΔC1(a) proteina u molamom odnosu 3:1 (VEGF165: FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)) i inkubiran u toku noći na 4°C.
(al Ekskluziona hromatografiia svetla u okvi i sistem a
na osnovu veličine sa rasipanjem
Kolona za ekskluzionu hromatografiju na osnovu veličine sa MiniDavvn detektorom u okviru sistema za rasipanje svetla (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) i sa detektorom za merenje refraktivnog indeksa (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) su korišćeni da se odredi molekulska težina (MT) receptor-ligand kompleksa. Uzorci su injektovani na Superose 12 HR 10/30 kolonu (Pharmacia) ekvilibrisanu u PBS puferu i eluiranu sa istim puferom sa brzinom proticanja 0 5 ml/min. na sobnoj temperaturi. Kao što je prikazano na slici 33, elucioni profil pokazuje dva maksimuma. Maksimum #1 predstavlja receptor-ligand kompleks i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF165. MT je izračunata iz LS i RJ signala. Isti postupak je korišćen da se odredi MT individualnih komponenti receptor-ligand kompleksa. Rezultati ovih određivanja su kao što sledi:MT FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/VEGF165 kompleksa na poziciji maksimuma je 157 300 (slika 33), MT VEGF165 je na poziciji maksimuma 44 390(slika 34) i MT R1R2 na maksimumu je 113 300 (slika35).
Podatci pokazuju da stehiometrija FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/VEGF kompleksa 1:1 odgovara sumi molekulskih težina za FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGF165. Važno je da ovaj metod ubedljivo dokazuje da FltlD2FlklD3.FcΔC1(a)/VEGF165 kompleks je stvarno bio sačinjen od samo jednog molekula VEGF165 liganda i samo jednog molekula FltlD2FlklD3.FcΔC1(a).
Primer 28: Peptidno mapiranje FltlD2FlklD3.FcΔC1(al
Disulfidne strukture i glikozilaciona mesta u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) su određena postupkom peptidnog mapiranja. U ovom metodu, protein se prvo čepa sa tripsinom. Triptinski fragmenti su analizirani i identifikovani sa FCPLC-om kuplovanim sa masenim spektrometrom, dodatno uz N-terminalnu tehniku sekvenciranja. Redukcija triptinskog tretiranja je korišćeno da bi se pomoglo identifikaciji fragmenata koji sadrže disulfidne veze. Tretiranje triptinskih fragmenata sa PNGazom F(Glyko, Novato, CA) je korišćeno da pomogne identifikaciji fragmenata sa N-vezanim glikozilacionim mestima. Rezultati su sakupljeni na slici 36
Ima ukupno 10 cisteina u FltlD2FlklD3.FcΔC1(a); šest njih pripada Fc regionu. Potvrđeno je daje Cys 27 disulfidno vezan sa Cys76. Potvrđeno je daje Cysl21 disulfidno vezan za Cysl82. Prva dva cisteina u Fc regionu (Cys211 i Cys214) grade intramolekulske disulfidne veze sa ista dva cisteina u drugom Fc lancu. Međutim, zbog toga što ta dva cisteina ne mogu biti odvojena enzimski jedan odrugog, ne može biti određeno da li se disulfidno vezivanje javlja između istih cisteina (na primer Cys211 za Cys211,) ili između Cys211 i Cys214. Potvrđeno je da je Cys216 disulfidno vezan za Cys306. Potvrđeno je daje Cys 352 vezan disulfidnom vezom za Cys410.
Postoji pet mogućih N-vezanih glikozilacionih mesta u FltlD2FlklD3 FcΔC1(a). Svih pet njih je nađeno da su glikozilovani u različitim stupnjevima. Kompletna glikozilacija je primećena kod Asn33 (amino kiselinska sekvenca NIT), Asnl93 (ammo kiselinska sekvenca NST) i Asn282 (amino kiselinska sekvenca NST). Dodatno, delimična glikozilacija je primećena kod Asn65 i Asnl20. Glikozilaciona mesta u istaknuta podvlačenjem na slici 36.
Primer 29: Farmakokinetike analize modifikovanih Flt receptora
(a)_Farmakokinetičke_analize_Fltl(l-3)-Fc_(A-40),
FltlD2.FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFRlR2-FcΔC1(a)
Balb/c miševima (25-30 g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspreijom iz CHO, FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijen stabilnom ekspresijom iz CHO i VEGFRlR2-FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje pri 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 6 dana posle injektiranja. Serum je analiziranu ELISA namenjenom da otkrije Fltl(l-3)-Fc (A40), Flt 1 D2Flk 1D3.FcAC 1 (a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a). ELISA uključuju prevlačenje ELISA ploča sa VEGF165, vezivanje detektovanog Flitl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcAC 1 (a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) i izaz vanje sa anti-Fc antitelom vezanim za peroksidazu iz rena. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 37. Tmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je 6 sati dok je Tmax za privremeni i stabilni FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i prolazni VEGFR1R2-FcAC 1 (a) je bilo 24 sati. Cmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio 8pg/ml. Za oba prolazna (FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2-
FcΔC1(a)), je bio 18μg/ml i za VEGFRlR2-FcΔC1(a je bio 30(j.g/ml.
(b)Farmnkokinetičke_analize_FItl(l-3)-Fc_(A40k
FltlD2FlklD3.FcΔC1ta, i VEGFRlR2-FcΔC1(a)
Balb/c miševima (25-30 g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO i sa VEGFRlR2-FcΔC1(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je oticanje pri 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 20 dana posle
injektiranja. Serum je analiziranu ELISA namenjenom da otkrije Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili FltlD2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). ELISA uključuju prevlačenje ELISA ploča sa 165, vezivanje detektovanog Fltl(l-3)-Fc (A40), Flt 1 D2Flk 1D3. FcAC 1 (a) ili FltlD2 VEGFR3D3-FcΔC1(a) i izazivanje sa anti-Fc antitelom vezanim za peroksidazu iz rena. Fltl(l-3)-Fc (A40) ne može biti više detektovan u serumu posle 5 dana, dok FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) i FltlD2.VEGFR3D3-FcΔC1(a) su se mogli detektovati u toku 15 dana ili više. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 38
Primer 30: Procena sposobnosti FltlD2FlklD3.FcΔC1(al da inhibira rast tumora ii vivo
Da bi se procenila sposobnost FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) da inhibira rast tumora na in vivo modelu u kojem je suspenzija ćelija tumora implantirani subkutanozno na desnu slabinu muškog miša koji je korišćen sa ozbiljno kombinovanom imunodeficijencijom (SCID). Dve ćelijske linije, Humane HT-1080 ćelije iz linije fibrosarkoma (ATCC dodatak br.CCL-121) i ćelijska linija glioma C6 pacova (ATTC dodatak br. CCL-107) od kojih svaka pokazuje osobito različitu morfologiju i karakteristike rasta su korišćene u testu. Prva doza FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) (pri 25mg/kg ili kako je pokazano na slici 39 i40) je data na dan kada je izvršena implantacija tumora. Životinje su posle toga primile subkutanozno injekciju Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili slepe probe ili svakog drugog dana (EOD) ili dva puta nedeljno (2X/ned) u periodu od 2 nedelje. Posle 2 nedelje, životinje su prelivene sa fiksativom, tumori su uklonjeni i uzorci su zatamljeni. Zapremina tumora je određena menijem dužine i širine vidljivih subkutanoznih tumora. Oba Fltl(l-3)-Fc (A40) i FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) značajno redukuju rast tumora nastalog od HT-1080 i C6 ćelija. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 39 i slici 40.
Primer 31; Efekat VEGF165 i izmenienih Flt receptora na ženski reproduktivni sistem
Stereotipni uzorak vaskulamog remodelovanja koji se dešava u materici i jajniku u toku reproduktivnog ciklusa dobro je karakterisan, čineći ova tkiva pogodnim za studiju mehanizma koji reguliše angiogenezu, vaskulamo remodelovanje i vaskulamu regresiju. U stvari, in situ hibridizacione studije u reproduktivnim tkivima obezbeđuju prvi jasan dokaz da VEGF deluje kao posrednik fiziološke angiogeneze kod zrelih glodara, kao i ljudi i ne-humanih primata (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al, 1992; Shvveiki et al, 1993; Kamat et al, 1995). S obzirom da su ciklična angiogeneza i vaskulamo remodelovanje istaknute karakteristike normalnih jajnika materice, nije iznenađujući rast abnormalnih krvnih sudova i/ili vaskulame disfunkcije koji je nađeno da karakteriše mnogo patoloških stanja koji utiču na ove organe. Osim toga, ove vaskulame patogene abnormalnosti se smatra da su izazvane ili ovekovečene neregulisanom ekspresijom jedne ili više angiogenetskih ili anti-angiogenetskih faktora, najistaknutijeg VEGF.
Na primer, abnormalna ang’»geneza je karakteristika policistične bolesti jajnika, endometroze i karcinoma endometrijuma i u svakom slučaju u napadnutim tkivima dolazi do preterane ekspresije VEGF (Kamat et al, 1995, Shiffen et al, 1996; Guidi et al, 1996; Donnez et al, 1998). Preterana ekspresija VEGF se takođe mislilo da igra patogenu ulogu u postavljanju sistemskih vaskulamih bolesti hiperpermeabilnosti kod sindroma hiperstimulacije jajnika (McClure et al, 1994; Levin et al, 1998) i preeklamsije (Baker et al, 1995; Sharkey et al, 1996). Dodatno VEGF je bio upleten kao faktor permeabilnost odgovoran za đobijanje ascita u vezi sa karcinomom jajnika drugim tumorima (Senger et al, 1983; Boocock et al, 1995). Sredstva koja efikasno neutrlalizuju biološko dejstvo VEGF mogu biti mogu se realno smatrati da su od koristi za lečenju gore nevedenim \ drugim stanjima.
Angiogeneza vaskulamo remodelovanje su takođe oznake implantacije blastocita razvoja placente (findalay, 1986). Postoji jaka ekspresija VEGF i kod decidue materice i kod embrionskih tromboblasta, gde se mislilo da prvo stimuliše ekspanziju i hiperpermeabilnost vaskulamog sistema materice u toku perioda peri-implantacije i zatim posreduje u nastanku obe i matemalne embrionske komponenta vaskulature placente (Shvveiki et al, 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al, 1995; Das et al, 1997). VEGF je takođe potreban za leutnu angiogenezu i vezi sa njom neophodnim lučenjem progesterona da se priprem materica za implantaciju (Ferra et al, 1988). Prema tome, sredstva koja inhibiraju biološku aktivnost VEGF mogu dokazati da su korisna kao kontraceptivna sredstva (sprečavajući implantaciju), ili kao sredstva za abortus u ranim stadijumima trudnoće. Sledeća prijava će možda naći naročitu upotrebu nehiruške intervencije za prekid ektopičnih trudnoća.
Dok je ekspresija VEGF receptora visoko ograničena vaskulamim endotelijumom kod reprodukcije normalnih tkiva, takođe ekspresija Fltl od strane tromboblasta u placenti kod ljudi i životinja (Clark et al, 1996; He et al, 1999) gde je bilo predloženo da igraju ulogu u invaziji tromboblasta. Interesantno, ekspresija oba Fltl i KDR (Flkl) od strane ćelijske linije BEWo horiokarcinoma (Chamock-jones et al, 1994) i VEGF je prikazano da potpomaže DNA sintezu i tirozin fosforilaciju MAP kinaze u ovim ćelijama. Dalje, primami i metastatički karcinomi jajnika ne samo vrše ekspresiju visokog nivoa VEGF, nego dodatno vaskulamom endotelijumu-ćelije tumora same vrše ekspresiju KDR i/ili Fltl (Book rat al, 1995). Ova otkrića sugerišu da VEGF ne mora biti sam kritički uključen u generaciju i održavanje tumome vaskulature, nego da bar u nekim tumorima reproduktivnog porekla VEGF mogu imati i autokrinu ulogu, direktno podržavajući opstanak i proliferaciju ćelija tumora. Prema tome sredstvo koje blokira dejstvo VEGF može imati naročito korisnu primenu u lečenju tumora reproduktivnog porekla.
Metodi i rezultati
(alProcena VEGF indukovane hiperpermeabilnosti materice
Semm gonadotropin trudne kobile (μmSG) je injektovan subkutanozno (5 IU) da se izazove ovulacija kod predpubertetskih ženskih pacova. Ovo rezultuje uzburkanim estradiolom posle 2 dana koji zauzvrat izaziva indukciju VEGF-a u materici. Zabeleženo je da ovi izazvani rezultati hiperpermeabilnosti materice i povećanja u težini vlažne materice posle 6 sati, što prema tome može potencijalno biti blokirano sa izmenjenim Flt receptorima Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2Flk.lD3.FcΔC1(a) ili VEGFR1R2-FcΔC1(a). U ovom in vivo modelu, normalna težina materice pacova je oko 50 mg a može biti izazvano do 300-350 mg μmSG. Osušena tkiva otkrivaju daje ovo sva vodena masa. Subkutanoznom injekcijom Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) ili VEGFRlR2-FcΔC1(a) 25 mg/kg posle 1 sata posle PSMG injekcije rezultuje u oko 50% inhibicije porasta težini vlažnnosti materice. Povećavanjem doze izmenjenih Flt receptora ne smanjuje dalje porast u težini vlage što sugeriše da postoji VEGF nezavisna komponenta u ovom modelu, rezultatui eksperimenta su prikazani na slici 41.
(a) Procena angiogeneze žutog ta pomoću progesterona kao obeleživača
Serum gonadotropin ždrebne kobile (μmSG) je injektovan subkutanozno (5IU) da izazove ovulaciju kod predpubertetskih ženskih pacova. Ovo rezultuje punom funkcijom žutog tela koje sadrži gustu mrežu krvnih sudova posle 4 dana što omogućava izlučivanje progestrona u krvotok u cilju pripremanja materice za implantaciju. Izazivanje angiogeneze u žutom telu zahteva VEGF; prema tome, blokiranje VEGF će rezultovati nedostatkom novih krvnih sudova i prema tome nedostatkom progesterona iz]učenog u krvotok. Na ovom in vivo modelu, u mirovanju je nivo progesterona oko 5nm/ml i može se izazvati nivo 25-40 ng/ml posle μmSG. Subkutanoznom injekcijom Fltl(l-3)-Fc (A40) ili FltlD2FlklD3.FcΔC1(a) pri 25 mg/kg ili 5mg/kg 1 sat posle PSMG injekcije rezultuje u kompletnoj inhibiciji indukcije progesterona do 4 dana. Rezultati ovog eksperimenta su pokazani na slici 42A-42B
Frimer 33: Farmakokinetičke analize FltlU-3)-Fc (A40) i pegilovanog Fltl (1-31-Fc
Fltl(l-3)-Fc je pegilovan sa ili lOkD PEG ii 20KD PEG i testiran je na balb/c miševima zbog njihovog faramkokinetičkog profila. Oba PEG-ilovana oblika je nađeno da imaju mnogo bol je PK prolile nego Flt(l-3)-Fc (A40), sa Tmax oko 24 sata za PEGilovane molekula nasuprot do 6 sati za Fltl(l-3)~Fc (A40).
Frimer 34: VEGF165 ELISA za testiranje afiniteta izmenienih Fltl varijanti reeeptora
10 μm VEGF 165 je inkubiran u toku noći na sobnoj temperaturi sa modifikovanim Fltl varijantama reeeptora u opsegu od 160 μm do 0.1M. Modifikovani Fltl varijante reeeptora korišćene u ovom eksperimentu su Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlDlFlklD3.FcΔC1(a) koji je dobijcn privremenom ekspresijom, Flt 1D2VEGFRD3-FcAC 1 (a), Flt 1 (1 -3NAS)-Fc, Fltl(l-3R.>C)-Fc i Tie2-Fc Fltl(l-3NAs)-Fc je modifikovan verzija Flt 1(1-3)-Fc u kojoj visoko bazne amino kiselinske sekvence KNKRASVRRR su zamenjene sa NASVNGSR, što rezultuje u inkorporaciji dva nova glikozidna mesta i smanjenju ukupnog +5 naelektrisanja, oba u cilju smanjenja nepovoljnih efekata ove sekvence na PK. Fltl(l-3R->C)-Fc je modifikacija u kojoj pojedini argininski (R) ostatak u okviru iste bazne amino kiselinske sekvence je promenjen u cistein (C) (KNKRASVRRR->KNKCASVRRR) da omogući pegilaciju na ostatku, koji će zatim zaštititi bazni region od vršenja njegovog nepovoljnog efekta na PK. Posle inkubacije rastvor je premešten na ploču koja sadrži zarobljena tela VEGF165 (R&D). Količina slobodnog VEGF165 je zatim određivana korišćenjem antitela da bi se registrovao slobodni VEGF165. Ovo pokazuje da modifikovana varijanta Fltl receptora sa visokim afinitetom za VEGF165 (određenim kao najniža količina slobodnog VEGF165) je FltlD2FlklD3.FcΔC1(a), a zatim sledi Fltl(l-3)-Fc i Fltl(l-3)-Fc(A40) i zatim Fltl (l-3R->C), Fltl (1-3NAS) i Flt 1D2VEFGFR3D3-FcACa(a). Tie2Fc nema afinitet za VEGF165.
Claims (51)
1. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira fuzioni polipeptid sposoban da veže VEGF polipeptid, i koji se sastoji od: (a) nukleotidne sekvence koja kodira VEGF receptorsku komponentu koja je operativno vezana za (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira multimerizacionu komponentu, gde je VEGF receptorska komponenta jedina VEGF receptorska komponenta fuzionog polipeptida i gde nukleotidna sekvenca (a) se sastoji u osnovi od nukleotidne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvencu Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora i nukleotidne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvancu Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
2. Izolovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što prvi VEGF receptor je Fltl.
3. Izolovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što drugi VEGF receptor je Flkl.
4. Izolovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što drugi VEGF receptor je Flt4.
5. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što nukleotidna sekvenca koja kodira Ig domen 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je ispred nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
6. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što nukleotidna sekvenca koja kodira Ig domen 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je iza nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
7. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentom zahtevu 1, naznačen time, što multimerizaciona kompnenta se sastoji od domena imunoglobulina.
8. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je domen imunoglobulina izabran iz grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.
9. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji se sastoj od nukleotidne sekvence koja kodira modifikovani Fltl receptor fuzionog polipeptida, u kome se region kodiranja molekula nukleinske kiseline sastoji od nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koju čine: (a) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 13A-13D; (b) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 14A-14C; (c) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 15A-15C; (d) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 16A-16C; (e) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (f) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 22A-22C; (g) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 24A-24C; i (h) nukleotidna sekvenca, koja kao rezultat degeneracije genetičkog koda, se razlikuje od nukleotidnih sekvenca (a), (b), (c), (d), (e), (f) ili (g) i koja kodira molekul fuzionog polipeptida koji ima biološku aktivnost modifikovanog Fltl receptora fuzionog proteina.
10. Fuzioni polipeptid kodiran izolovanim molekulom nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, 2, 3,4 ili 9.
11. Kompozicija sposobna da veže VEGF molekul da bi nastao nefunkcionalni kompleks koji sadrži multimer fuzionog polipeptida prema patentom zahtevu 10.
12. Kompozicija prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je multimer dimer.
13. Kompozicija prema patenom zahtevu 12, naznačena time, što je u nosaču.
14. Vektor koji se sastoji od gore opisanih molekula nukleinske kiselina prema patentnom zahtevu 1,2, 3, 4 ili 9.
15. Ekspresioni vektor koji se sastoji od molekula nukleinske kiselineprema patentom zahtevu 1, 2, 3, 4 9, naznačen time, što je molekul nukleinske kiseline operativno vezan za ekspresionu kontrolnu sekvencu.
16. Sistem domaćin-vektor za proizvodnju fuzionog polipeptida koji se sastoji od ekspresionog vektora prema patentnom zahtevu 15, u pogodnoj ćeliji domaćinu.
17. Sistem domaćin-vektor prema patentom zahtevu 16, naznačen time, što je pogodna ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija sisara.
18. Sistem domaćin-vektor prema patentnom zahtevu 16, naznačen time, štc je pogodna ćelija domaćin E.Coli.
19. Sistem domaćin-vektor prema patentom zahtevu 16, naznačen time, što je pogodna ćelija domaćin COS ćelija.
20. Sistem domaćin-vektor, naznačena time, što je pogodna ćelija domaćin CHO ćelija.
21. Postupak za dobijanje fuzionog polipeptida koji se sastoji od gajenja ćelija sistema domaćin-vektor prema patentnom zahtevu 16 pod uslovima koji dozvoljavaju dobijanje fuzionog polipeptida i izolovanje tako dobijenog fuzionog polipeptida.
22. Fuzioni polipeptid kodiran sekvencom nukleinske kiseline prikazanom na slici 10A-10B ili slici 24A-24C, koji je modifikovan acetilacijom ili pegilovanjem.
23. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 22, naznačen time, što je modifikacija acetilacija.
24. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 22, naznačen time, što je modifikacija pegilacija.
25. Fuzioni polipeptid prema patentom zahtevu 23, naznačen time, što je acetilacija ostvarena sa bar oko 100-strukim molamim viškom acetilacionog reagensa.
26. Fuzioni polipeptid iz patentnog zahteva 23, naznačen time, što je acetilacija ostvarena sa molamm viškom acetilacionog reagensa u opsegu od bar oko 10-ostrukog molamog viška do oko 100-strukog molamog viška.
27. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 24. naznačen time, što je pegilacija je 10K ili 20K PEG.
28. Postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara, naznačen time, što se sastoji od davanja sisaru fuzionog polipeptida prema patentnom zahtevu 10.
29. Postupak prema patentnom zahtevu 28, naznačen time, što je sisar čovek.
30. Postupak prema patentom zahtevu 29, naznačen time, što je fuzioni polipeptid acetilovan.
31. Postupak prema patentom zahtevu 29, naznačen time, što je fuzioni polipeptid pegilovan.
32. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 10 koji se specifično vežeVEGF receptor liganda VEGF.
33. Postupak za blokiranje rasta krvnih sudova kod ljudi, naznačen time, što se sastoji iz davanja efikasne količine fiizionog polipeptida prema patentom zahtevu 10.
34. Postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisara, naznačen time, što se sastoji iz davanja sisarima efikasne količine fuzionog polipeptida prema patenom zhatevu 10.
35. Postupak prema patenomzahtevu 34, naznačen time, što je sisar čovek.
36. Postupak prema patenom zahtevu 34, naznačen time, što se koristi da umanji ili spreči rast tumora kod ljudi.
37. Postupak prema patentom zahtevu 34, naznačen time, što se koristi da umanji ili spreči edem kod ljudi.
38. Postupak prema patentnom zahtevu 34, naznačen time, što se koristi da umanji ili spreči nastanak ascita kod ljudi.
39. Postupak prema patennom zahtevu 37, naznačen time, što edem je edem mozga.
40. Postupak prema patenom zahtevu 38, naznačen time, što ascit je ascit u vezi sa kancerom jajni ca.
41. Fuzioni polipeptid sposoban da se veže za VEGF polipeptid, koji čini: (a) VEGF receptorska komponenta operativno vezanu za (b) multimerizacionu komponentu gde je VEGF receptorska komponenta jedina VEGF receptorska komponenta u fuzionom polipeptidu i u osnovi se sastoji od amino kiselinske sekvence Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora i amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
42. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 41, naznačen time, što je prvi VEGF receptor Fltl.
43. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 41, naznačen time, stoje drugi VEGF receptor Flkl.
44. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 41, naznačen time, što je drugi VEGF receptor Flt41.
45. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 41, naznačen time, što amino kiselinska sekvenca Ig domena 2 ekstracelulamog domena prvog VEGF receptora je ispred amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
46. Fuzioni polipeptid prema patentnom zahtevu 41, naznačen time, što amino kiselinska sekvenaca Ig domena 2 ekstracelulmog domena prvogVEGF receptora je iza amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelulamog domena drugog VEGF receptora.
47. Fuzioni polipeptid prema patenom zahtevu 41, naznačen time, što je multimerizaciona komponenta sadrži imunoglobulinski domen.
48. Fuzioni polipeptid prema patenom zahtevu 41, naznačen time, što je imunoglobulinski domen izabran iz grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.
49. Fuzioni polipeptid koji se sastoji od amino kiselinske sekvence modifikovanog Fltl receptora, gde je amino kiselinska sekvenca izabrana od grupe koju čine (a) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 13A-13D; (b) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 14A-14C; (c) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 15A-15C; (d) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 16A-16D; (e) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (f) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 22A-22C; i (g) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 24A-24C.
50. Postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara, naznačen time, što se sastoji iz davanja sisaru fuzionog polipeptida prema zahtevu 41, 42, 43, 44 ili 49
51. Postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisara, naznačen time, što se sastoji iz davanja sisaru efikasne količine fuzionog polipeptida prema patentnom zahtevu 41, 42, 43, 44 ili 49.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13813399P | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
| PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ME00024B true ME00024B (me) | 2010-02-10 |
Family
ID=22480568
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MEP-32/08A MEP3208A (xx) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama |
| MEP-2008-32A ME00024B (me) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MEP-32/08A MEP3208A (xx) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1544299B1 (me) |
| JP (2) | JP4723140B2 (me) |
| KR (1) | KR100659477B1 (me) |
| CN (3) | CN103349781B (me) |
| AT (2) | ATE417928T1 (me) |
| AU (2) | AU779303B2 (me) |
| BE (1) | BE2013C029I2 (me) |
| BR (2) | BRPI0011407B8 (me) |
| CA (1) | CA2376379C (me) |
| CY (2) | CY1108883T1 (me) |
| CZ (2) | CZ303656B6 (me) |
| DE (2) | DE60041159D1 (me) |
| DK (2) | DK1183353T3 (me) |
| ES (2) | ES2237429T3 (me) |
| FR (1) | FR13C0028I2 (me) |
| HR (1) | HRP20010908B1 (me) |
| HU (3) | HU230159B1 (me) |
| IL (3) | IL146890A0 (me) |
| LT (1) | LTC1183353I2 (me) |
| LU (1) | LU92195I2 (me) |
| ME (2) | MEP3208A (me) |
| MX (1) | MXPA01012630A (me) |
| NO (4) | NO330775B1 (me) |
| NZ (1) | NZ515913A (me) |
| PL (1) | PL208247B1 (me) |
| PT (2) | PT1183353E (me) |
| RS (1) | RS50073B (me) |
| RU (1) | RU2265661C2 (me) |
| SK (1) | SK287332B6 (me) |
| UA (1) | UA74146C2 (me) |
| WO (1) | WO2000075319A1 (me) |
| ZA (1) | ZA200110068B (me) |
Families Citing this family (106)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6710174B2 (en) | 2001-09-13 | 2004-03-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression |
| US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
| US7070959B1 (en) | 1999-06-08 | 2006-07-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
| US7396664B2 (en) | 1999-06-08 | 2008-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
| US6833349B2 (en) * | 1999-06-08 | 2004-12-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating inflammatory skin diseases |
| US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
| JP4669984B2 (ja) | 2001-01-19 | 2011-04-13 | ベジェニクス リミテッド | 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法 |
| US6734017B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-05-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression |
| US8183350B2 (en) | 2002-05-04 | 2012-05-22 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth |
| JP4730909B2 (ja) | 2003-03-28 | 2011-07-20 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆ媒介性活性を遮断することにより糖尿病を処置する方法 |
| JP2007532094A (ja) | 2003-05-16 | 2007-11-15 | アコーダ セラピューティクス、インク． | Ｃｎｓ治療用のプロテオグリカン分解変異体 |
| US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
| JP5399612B2 (ja) * | 2003-05-16 | 2014-01-29 | アコーダ セラピューティクス、インク． | Ｃｎｓを治療するための融合タンパク質 |
| EP1626989A2 (en) * | 2003-05-28 | 2006-02-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists |
| US7186699B2 (en) | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
| CA2519875C (en) * | 2003-06-06 | 2014-01-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of tumor regression with vegf inhibitors |
| US7399612B2 (en) | 2003-06-30 | 2008-07-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
| AR046510A1 (es) * | 2003-07-25 | 2005-12-14 | Regeneron Pharma | Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo |
| US20050112061A1 (en) * | 2003-08-06 | 2005-05-26 | Jocelyn Holash | Use of a VEGF antagonist in combination with radiation therapy |
| MXPA06013345A (es) | 2004-05-18 | 2008-10-31 | Acorda Therapeutics Inc | Metodos para purificar condrointinasa y sus formulaciones estables. |
| KR100897379B1 (ko) * | 2004-06-08 | 2009-05-14 | 쳉두 캉홍 바이오테크놀로지스 코. 리미티드 | 혈관신생-저해 키메릭 단백질 및 그 사용 |
| WO2005123104A2 (en) | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitors for the treatment of human cancer |
| EP1755645A2 (en) * | 2004-06-18 | 2007-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion |
| AU2005267741A1 (en) | 2004-07-30 | 2006-02-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating type I diabetes by blocking VEGF-mediated activity |
| ES2407859T3 (es) * | 2004-09-13 | 2013-06-14 | Genzyme Corporation | Construcciones multiméricas. |
| FR2878749B1 (fr) * | 2004-12-03 | 2007-12-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives |
| WO2006088650A2 (en) * | 2005-02-02 | 2006-08-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating eye injury with local administration of a vegf inhibitor |
| EP1861116B1 (en) | 2005-03-25 | 2015-09-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf antagonist formulations |
| US7485295B2 (en) | 2005-09-26 | 2009-02-03 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase ABCI mutants |
| CA2630839C (en) † | 2005-12-16 | 2017-01-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists |
| FR2895258B1 (fr) | 2005-12-22 | 2008-03-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux |
| CN100502945C (zh) * | 2006-03-31 | 2009-06-24 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
| US8216575B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-10 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains |
| DK2364691T3 (da) | 2006-06-16 | 2013-07-01 | Regeneron Pharma | VEGF antagonist-formuleringer, der kan anvendes til intravitreal administration |
| JP5535633B2 (ja) | 2006-09-29 | 2014-07-02 | オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 癌の診断および処置のための組成物および方法 |
| CA2666536C (en) | 2006-10-10 | 2018-08-07 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants |
| FR2918279B1 (fr) * | 2007-07-05 | 2010-10-22 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan |
| CN101575379B (zh) * | 2008-05-09 | 2012-05-30 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途 |
| BRPI0921469B1 (pt) | 2008-11-03 | 2022-01-18 | Molecular Partners Ag | Proteínas de ligação que inibem a interação com o receptor de vegf-a, composição farmacêutica |
| CN101838329A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 嘉和生物药业有限公司 | 抗血管新生融合蛋白 |
| ES2700450T3 (es) | 2009-10-16 | 2019-02-15 | Oncomed Pharm Inc | Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensores |
| AR081361A1 (es) | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
| ES2652508T3 (es) | 2010-08-06 | 2018-02-02 | Genzyme Corporation | Composiciones de antagonistas de VEGF y sus usos |
| JP6043629B2 (ja) * | 2011-01-07 | 2016-12-14 | 中外製薬株式会社 | 抗体の物性を改善させる方法 |
| SG191334A1 (en) | 2011-01-13 | 2013-08-30 | Regeneron Pharma | Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders |
| JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
| KR101397088B1 (ko) | 2011-06-10 | 2014-05-19 | 강원대학교산학협력단 | 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물 |
| JO3370B1 (ar) * | 2011-11-10 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6 |
| CN110078831A (zh) * | 2011-12-01 | 2019-08-02 | 圆祥生命科技股份有限公司 | 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法 |
| CN103304668B (zh) * | 2012-03-12 | 2015-10-28 | 江苏健德生物药业有限公司 | Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 |
| ES2753135T3 (es) | 2012-05-07 | 2020-04-07 | Allergan Inc | Método de tratamiento de DMAE en pacientes resistentes a terapia anti-VEGF |
| WO2014006113A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sanofi | Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept |
| AR093445A1 (es) | 2012-11-14 | 2015-06-10 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4 |
| AU2014218318B2 (en) | 2013-02-18 | 2018-02-15 | Vegenics Pty Limited | Ligand binding molecules and uses thereof |
| AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
| CN104193828B (zh) * | 2013-09-12 | 2017-04-05 | 北京韩美药品有限公司 | 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白 |
| KR20160070164A (ko) | 2013-11-05 | 2016-06-17 | 알러간, 인코포레이티드 | 항-vegf darpin으로 눈의 병태를 치료하는 방법 |
| KR20170003973A (ko) | 2014-05-12 | 2017-01-10 | 포르미콘 아게 | Ｖｅｇｆ 안타고니스트를 포함하는 사전충전형 플라스틱제 주사기 |
| MX375557B (es) | 2014-07-18 | 2025-03-06 | Sanofi Sa | Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer. |
| JP2016036322A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 日本化薬株式会社 | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |
| PL3230316T3 (pl) | 2014-12-11 | 2022-05-02 | Bayer Healthcare Llc | Leczenie zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem z małą aktywną zmianą neowaskularyzacji naczyniówki |
| GB201503453D0 (en) | 2015-03-01 | 2015-04-15 | Jain Arjun | Endothelin-1"sponge" |
| TWI797060B (zh) | 2015-08-04 | 2023-04-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
| WO2017046140A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia |
| KR101936049B1 (ko) | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
| WO2017065559A1 (ko) | 2015-10-15 | 2017-04-20 | (주)알테오젠 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
| KR102854749B1 (ko) | 2015-11-18 | 2025-09-04 | 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 엘엘씨 | 안과 제제용 제약 패키지 |
| AU2016358111B2 (en) | 2015-11-18 | 2021-11-18 | Sio2 Medical Products, Llc | Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a VEGF-antagonist |
| WO2018218013A2 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Sio2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
| EP3377151A1 (en) | 2015-11-18 | 2018-09-26 | Formycon AG | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
| CN108697792A (zh) * | 2015-11-19 | 2018-10-23 | 珠海泰瑞尚生物医药科技有限公司 | 用于结合vegf的方法和组合物 |
| CA3137326C (en) | 2015-12-03 | 2024-01-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitor to treat macular degeneration in a patient population |
| US10576128B2 (en) | 2016-01-26 | 2020-03-03 | Formycon Ag | Liquid formulation of a VEGF antagonist |
| JPWO2018070390A1 (ja) | 2016-10-12 | 2019-08-22 | 第一三共株式会社 | 抗ｒｏｂｏ４抗体と他剤を含む組成物 |
| EP3541365A1 (en) | 2016-11-21 | 2019-09-25 | Just Biotherapeutics, Inc. | Aflibercept formulations and uses thereof |
| WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
| US20200237997A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-07-30 | Formycon Ag | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
| TW201904610A (zh) | 2017-06-14 | 2019-02-01 | 德商拜耳製藥公司 | 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑 |
| WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
| CN111344410B (zh) | 2017-08-17 | 2023-09-15 | 济世易为生物有限公司 | 从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法 |
| KR102732284B1 (ko) | 2017-11-20 | 2024-11-19 | 저스트-에보텍 바이오로직스, 아이엔씨. | 등장화제로서 라이신 염을 함유하는 아플리베르셉트 제제 및 그것의 용도 |
| CA3083472A1 (en) | 2017-11-27 | 2019-05-31 | 4D Molecular Therapeutics Inc. | Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis |
| MX2020005166A (es) | 2017-11-30 | 2020-09-03 | Regeneron Pharma | Uso de un antagonista de vegf para tratar trastornos oculares angiogenicos. |
| US11460452B2 (en) | 2017-12-13 | 2022-10-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Devices and systems for chromatography column bed support management and related methods |
| EP4495136A3 (en) | 2018-01-26 | 2025-04-23 | The Regents of the University of California | Methods and compositions for treatment of angiogenic disorders using anti-vegf agents |
| JP2021514656A (ja) | 2018-03-02 | 2021-06-17 | コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッドＫｏｄｉａｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． | Ｉｌ−６抗体ならびにその融合構築物およびコンジュゲート |
| TW202016125A (zh) * | 2018-05-10 | 2020-05-01 | 美商再生元醫藥公司 | 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法 |
| LT4364724T (lt) | 2018-05-10 | 2026-01-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Farmacinės formos, kurių sudėtyje yra didelės koncentracijos vegf receptoriaus sulietas baltymas |
| US11519020B2 (en) | 2018-05-25 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
| CN111378044B (zh) | 2018-12-28 | 2022-07-15 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗体融合蛋白、制备方法及其应用 |
| US20220204920A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-06-30 | Formycon Ag | Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins |
| MX2022002355A (es) | 2019-09-03 | 2022-04-06 | Amgen Inc | Dispositivo de inyeccion para suministro de farmacos y envase para el dispositivo de inyeccion. |
| AU2020348947B2 (en) | 2019-09-16 | 2025-11-27 | Amgen Inc. | Method for external sterilization of drug delivery device |
| EP4041312A4 (en) | 2019-10-10 | 2023-12-20 | Kodiak Sciences Inc. | METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER |
| JP2023502501A (ja) | 2019-11-25 | 2023-01-24 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 眼内血管新生のための長時間作用型ｖｅｇｆ阻害剤 |
| AU2020398125C1 (en) | 2019-12-06 | 2023-05-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same |
| JP2023505216A (ja) | 2019-12-06 | 2023-02-08 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆミニトラップおよびそれらの使用方法 |
| AU2021226754A1 (en) | 2020-02-24 | 2022-07-07 | Amgen Inc. | Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices |
| AU2021268026A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-01-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer |
| EP4329734A4 (en) | 2021-04-26 | 2025-04-02 | Celanese EVA Performance Polymers LLC | Implantable device for the delayed release of a macromolecular drug compound |
| EP4145456A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Bayer AG | Prediction of a change related to a macular fluid |
| US20250002557A1 (en) | 2021-11-24 | 2025-01-02 | Suzhou Light Ferry Biomed. Co., Ltd | Multi-specific ligand-binding molecules and applications thereof |
| KR102764987B1 (ko) * | 2022-08-02 | 2025-02-12 | 주식회사 파노로스바이오사이언스 | 변형된 융합 단백질 및 이의 용도 |
| WO2024056058A1 (zh) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 齐鲁制药有限公司 | 一种稳定的高浓度自缓冲药物组合物 |
| WO2025033876A1 (ko) * | 2023-08-04 | 2025-02-13 | 주식회사 파노로스바이오사이언스 | 변형된 융합 단백질과 scFv의 결합체 및 이의 용도 |
| WO2025213011A1 (en) | 2024-04-05 | 2025-10-09 | Amgen Inc. | Method of assessing stopper movement in a drug delivery device |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
| US6100071A (en) * | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
-
2000
- 2000-05-23 AT AT05001328T patent/ATE417928T1/de active
- 2000-05-23 DE DE60041159T patent/DE60041159D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AT AT00932721T patent/ATE293164T1/de active
- 2000-05-23 SK SK1752-2001A patent/SK287332B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 PT PT00932721T patent/PT1183353E/pt unknown
- 2000-05-23 ES ES00932721T patent/ES2237429T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ME MEP-32/08A patent/MEP3208A/xx unknown
- 2000-05-23 HU HU1300086A patent/HU230159B1/hu unknown
- 2000-05-23 UA UA2001128378A patent/UA74146C2/uk unknown
- 2000-05-23 JP JP2001502582A patent/JP4723140B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CA CA002376379A patent/CA2376379C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 KR KR1020017015839A patent/KR100659477B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 EP EP05001328A patent/EP1544299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 HR HR20010908A patent/HRP20010908B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 BR BRPI0011407A patent/BRPI0011407B8/pt unknown
- 2000-05-23 CN CN201310118971.1A patent/CN103349781B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 WO PCT/US2000/014142 patent/WO2000075319A1/en not_active Ceased
- 2000-05-23 DE DE60019415T patent/DE60019415T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CN CNB008115443A patent/CN100523187C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CZ CZ20100386A patent/CZ303656B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 PL PL352246A patent/PL208247B1/pl active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 MX MXPA01012630A patent/MXPA01012630A/es active IP Right Grant
- 2000-05-23 EP EP00932721A patent/EP1183353B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 HU HU0201515A patent/HU229156B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 PT PT05001328T patent/PT1544299E/pt unknown
- 2000-05-23 DK DK00932721T patent/DK1183353T3/da active
- 2000-05-23 ES ES05001328T patent/ES2319305T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CN CN2008101093559A patent/CN101433715B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CZ CZ20014387A patent/CZ302689B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 RU RU2002100071/13A patent/RU2265661C2/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 RS YUP-869/01A patent/RS50073B/sr unknown
- 2000-05-23 BR BR0011407-3A patent/BR0011407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 IL IL14689000A patent/IL146890A0/xx unknown
- 2000-05-23 AU AU50404/00A patent/AU779303B2/en not_active Expired
- 2000-05-23 DK DK05001328T patent/DK1544299T3/da active
- 2000-05-23 ME MEP-2008-32A patent/ME00024B/me unknown
- 2000-05-23 NZ NZ515913A patent/NZ515913A/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-03 IL IL146890A patent/IL146890A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-12-06 ZA ZA200110068A patent/ZA200110068B/xx unknown
- 2001-12-10 NO NO20016036A patent/NO330775B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2005
- 2005-03-31 AU AU2005201365A patent/AU2005201365B2/en not_active Expired
-
2008
- 2008-03-17 IL IL190234A patent/IL190234A0/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-16 CY CY20091100288T patent/CY1108883T1/el unknown
-
2010
- 2010-05-06 NO NO20100656A patent/NO332559B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-10-06 JP JP2010226970A patent/JP5273746B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-05-13 CY CY2013019C patent/CY2013019I1/el unknown
- 2013-05-13 BE BE2013C029C patent/BE2013C029I2/fr unknown
- 2013-05-14 FR FR13C0028C patent/FR13C0028I2/fr active Active
- 2013-05-14 LT LTPA2013009C patent/LTC1183353I2/lt unknown
- 2013-05-14 LU LU92195C patent/LU92195I2/fr unknown
- 2013-05-15 NO NO2013010C patent/NO2013010I1/no unknown
- 2013-09-17 HU HUS1300052C patent/HUS1300052I1/hu unknown
-
2022
- 2022-12-21 NO NO2022060C patent/NO2022060I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7704500B2 (en) | Methods of inhibiting ascites formation with modified chimeric VEGF polypeptides | |
| EP1544299B1 (en) | VEGF receptor chimeras for the treatment of eye disorders characterized by vascular permeability | |
| CA2588221C (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties | |
| HK1043388B (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |