MXPA06013345A - Metodos para purificar condrointinasa y sus formulaciones estables. - Google Patents

Abstract

Un aspecto de la presente invención se relaciona con formulaciones estables de condroitinasa y con métodos de purificación de condroitinasa. Los métodos de purificación de condroitinasa incluyen los pasos de extraer la enzima de una célula, separar la condroitinasa del extracto celular crudo usando cromatografía de intercambio catiónico, remover las impurezas a través de cromatografía de filtración en gel, y remover la endotoxina a través de la membrana de intercambio aniónico para producir una condroitinasa purificada.

Description

MÉTODOS PARA PURIFICAR CONDROITINASA Y SUS FORMULACIONES ESTABLES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/572, 030 presentada en mayo 18, 2004 con titulo "Process of Purification of Condroitinasa", y de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/621,882 con titulo "cABCI Characterization and Formulation" presentada en octubre 25, 2004, los contenidos de los cuales aqui se incorporan por referencia totalmente. CAMPO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se refiere a una formulación estable de condroitinasa . Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para purificar condroitinasa. ANTECEDENTES Los proteoglicanos, constituyentes principales de la matriz extracelular, se conoce que están presentes en grandes cantidades en tejido de cicatriz glial y que inhiben la recuperación después de lesiones de la médula espinal (Fawcett & Asher, 1999) . Enzimas que son capaces de digerir tejido de cicatriz glial son una diana importante para el desarrollo de productos terapéuticos para lesión de médula espinal (SCI = Spinal Cord Injury) . Condroitinasa ABCI (EC 4.2.2.4; cABCI) es una enzima bacteriana que cataliza la digestión de condroitina sulfatada y cadenas laterales dermatano de proteoglicanos . Se ha mostrado que esta enzima promueve recuperación funcional después de lesión de médula espinal (Bradbury et al., 2002; Caggiano et al.-, 2005). [0004.] La médula espinal está constituida por fibras de nervio. El daño al sistema nervioso central, incluyendo la médula espinal, resulta en una pérdida de función. Dependiendo del tipo de lesión al sistema nervioso central, la pérdida de función puede manifestarse en pérdida de función sensorial, motriz o autónoma o una combinación de las mismas. Las funciones sensoriales incluyen la capacidad por percibir sensaciones como el dolor. Las funciones motoras incluyen la capacidad de mover voluntariamente al cuerpo. Las funciones autónomas incluyen funciones corporales involuntarios, por ejemplo la capacidad por transpirar y respirar .

[0005] Los tipos más comunes de lesiones de médula espinal (SCI) incluyen contusiones (lesiones o magulladuras a la médula espinal) y lesiones de compresión (provocadas por presión prolongada en la médula espinal) . En lesiones de contusión, una cavidad u orificio a menudo se forma en el centro de. la médula espinal. A diferencia de las células nerviosas, o neuronas del sistema nervioso periférico (PNS = Peripheral Nervous System) , las neuronas del sistema nervioso central (CNS = Central Nervous System) no se regeneran después de la lesión. Lesión a la médula espinal puede caracterizarse por contusión del tejido neural, con una disminución o pérdida resultante de la capacidad del tejido nervioso a transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos . La causa usual se debe a una lesión de impacto de alguna naturaleza, pero también puede ocurrir durante la manipulación de la médula espinal en ciertos procedimientos quirúrgicos. Después de lesión de la médula espinal en el mamífero adulto, la incapacidad en regenerarse los axones puede llevar a pérdida de sensibilidad, pérdida de función motriz y/o pérdida de función autonómica, así como parálisis permanente. Una razón de que las neuronas fallan en regenerarse es su incapacidad por recorrer la cicatriz glial que se desarrolla después de una lesión de médula espinal. La lesión inducida desarrollará cicatrización glial, que contiene moléculas de matriz extracelular incluyendo condroitina sulfato proteoglicanos (CSPGs = Chondroitin Sulfate Proteoglycans ) . CSPG inhiben el crecimiento de tejido nervioso e in vitro y la regeneración de tejido nervioso en regiones ricas en CSPGs in vivo. Una cantidad de moléculas, y sus regiones especificadas, han estado implicadas en la capacidad por soportar el brote de neuritas de una célula neuronal, un proceso también referido como excrecencia de neurita. El término neurita se refiere tanto a estructuras de axones como dendritas. El proceso de brote de neuritas es esencial en el desarrollo y regeneración neural, especialmente después de lesión física o enfermedad que ha dañado las células neuronales. Las neuritas se alargan profusamente durante el desarrollo tanto en sistemas nerviosos centrales como en periféricos de todas las especies animales. Este fenómeno se refiere tanto a axones como dendritas .

[0008] Diversos polipéptidos , en especial moléculas de adhesión celular (CAMs = Cell Adhesión Molecules) , se han conocido que promueven el crecimiento de células neurales . Mientras que los primeros esfuerzos en esta área de investigación se concentraron en la adhesión-promoción de fibronectina de proteína matriz extracelular (FN) , otros polipéptidos también se han encontrado que promueven el crecimiento neural. Por ejemplo, la patente de los E.Ü.A. No. 5,792,743 describe novedosos polipéptidos y métodos para promover el crecimiento neural en el CNS de un mamífero, al administrar un CAM neural soluble, un fragmento del mismo, o su producto de fusión Fe. La patente de los E.Ü.A. No. 6,313,265 describe polipéptidos sintéticos que contienen las regiones farmacológicamente actiyas de CAMs que pueden emplearse para promover regeneración y reparación de nervios tanto en lesiones de nervios periféricos como lesiones en el CNS. Mientras que auxilian, el uso de proteínas regeneratxvas solo puede no ser suficiente para efectuar reparación de un sistema nervioso dañado-. Durante aproximadamente las últimas dos décadas, el conocimiento de adhesión y migración celular en matrices extracelulares (ECMs = ExtraCellular Matrices) al nivel molecular, se ha expandido rápidamente. La acción de enzimas y otros polipéptidos que degradan componentes de la matriz extracelular y las membranes básales puede facilitar los eventos de reparación neural por una variedad de mecanismos, incluyendo la liberación de citocinas ligadas y al aumentar la permeabilidad de la matriz, mejorando de esta manera la movilidad de moléculas mediadoras, factores de crecimiento y agentes quimiotácticos, asi como las células involucradas en el proceso de sanado. Por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 5,997,863 describe el uso de glicosaminoglicanos para manipular la proliferación celular y promover el sanado de heridas. Componentes de los CSPGs inhibitorios se han identificado como los glicosaminoglicanos, condroitina sulfato (CS) y dermatan sulfato (DS) . La remoción de estas moléculas inhibitorias permitirá que las neuritas se regeneren y reinerven un área después de lesión física o enfermedad, así como permitir la recuperación de funciones sensoriales, motrices y autonómicas. Estudios previos han encontrado que condroitinasas pueden lisar y degradar CSPGs incluyendo CS y DS. Un estudio encontró que condroitinasa ABC retira cadenas glicosaminoglicano (GAG) en y alrededor de áreas lesionadas del CNS de ratas in vivo. La degradación de GAGs promueve expresión de una proteína asociada con crecimiento, GAP-43, indicando un incremento en la capacidad de las células tratadas para regeneración. Sin embargo, esta proteína asociada con el crecimiento se asocial con regeneración en lesiones de nervios periféricos, pero no centrales. Los condroitina sulfatos (CS) son polisacáridos sulfatados en cadenas lineales de disacáridos repetidos. Están en el intervalo en peso molecular desde aproximadamente 10,000 a más de 100,000 Da. Substratos condroitina sulfato existen en diferentes isómeros designados por las letras agregadas A, B y C (Hoffman et al., 1958). Las unidades repetitivas están- compuestas por ácido urónico (GIcA o IdoA) y galactosamina y se denominan galactosaminoglicanos , y son un ejemplo de los glicosaminoglicanos, típicamente abreviados como GAG. Aunque estas especies de cadena GAG tienen diferentes regiones disacárido repetitivas, se ligan covalentemente a través de la así denominada secuencia tetrasacárido de región de enlace (ver a continuación) al residuo serina en la secuencia consenso de conexión GAG (Glu/Asp-X-Ser-Gly) de proteínas núcleo respectivas. Los sulfatos de condroitina A y C (ChS-A, ChS-C) son los GAGs más abundantes y se encuentran en cartílago, huesos y válvulas cardíacas. Condroitina B (ChS-B, o en forma alterna, dermatan sulfato) se expresa primordialmente en la piel, vasos sanguíneos, válvulas cardíacas.

Cuando las preparaciones bacterianas de condroitinasa se caracterizaron contra diferentes substratos de condroitina sulfato (ChS) , se descubrió una serie de condroitinasas distintas: condroitinasa AC que degrada primordialmente condroitina A (ChA) y condroitina C (ChC) (Yamagata et al., 1968), condroitinasa B que degrada condroitina (ChB) (Michelacci and Deitrich, 1976) , condroitinasa C, que actúa primordialmente en ChC (Michelacci YM & Dietrich CP, 1976) y condroitinasa ABC exhibe especificidad contra todos los tres substratos -ChS-A, ChS-B y ChS-C (Yamagata et al. , 1968, Michelacci et al. , 1987) . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención proporciona formulaciones estables que comprenden condroitinasa y un amortiguador, de preferencia un amortiguador de fosfato de sodio. En una modalidad, se proporciona una formulación que comprende condroitinasa ABCI y aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio. Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para purificar condroitinasa. En una modalidad, el método de purificar condroitinasa comprende extraer la condroitinasa de las células, separar la condroitinasa del extracto, de preferencia utilizando cromatografía de intercambio de cationes, retirar contaminantes e impurezas, de preferencia utilizando cromatografía de filtración en gel, y retirar endotoxina, de preferencia utilizando intercambio de aniones. El método además puede comprender diálisis. El método también además puede comprender secado. En una modalidad preferida, la condroitinasa es condroitinasa ABCI . En otra modalidad preferida, la condroitinasa es condroitinasa AC. En general, las células se suspenden en una solución amortiguadora que contiene un agente tensio-activo y sonican. La condroitinasa después se captura o se separa de la mezcla de extracto, de preferencia al pasar el extracto a través de una columna de intercambio de cationes. Contaminantes e impurezas se retiran de la condroitinasa capturada, de preferencia por filtración en gel. Las endotoxinas se retiran de la muestra de condroitinasa, de preferencia por una columna de intercambio de aniones. En una modalidad, la muestra de condroitinasa puede ser dializada, de preferencia utilizando un amortiguador volátil. La condroitinasa además puede procesarse por secado o liofilizació . En una modalidad, la condroitinasa es condroitinasa ABC. En una modalidad adicional, la condroitinasa es condroitinasa AC. En una modalidad adicional la condroitinasa es una condroitinasa recombinante. Otro aspecto de la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una condroitinasa ABCI con una secuencia de SEQ ID NO:l. Otra modalidad proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una condroitinasa ABCI con una secuencia de SEQ ID NO: 2. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En parte, otros aspectos, características, beneficios y ventajas de las modalidades de la presente invención serán aparentes con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y dibujos acompañantes, en donde: Figura 1. Intervalo lineal para velocidad de formación de producto en ensayos de actividad cABCI . Figura 2?. Purificación de perfil de condroitinasa ABCI A280 de columna S200. Las Figuras 2B y C: SDS-PAGE de fracciones de elución de condroitinasa ABCI. B - Tinción con plata. C - tinción con Azul de Coomassie Figura 3. Curvas de Michaelis-Menten para cABCI y substratos .

Figuras 4A-4E. Los perfiles de dispersión de luz SEC de cABCI sin-tratar (control) y tratado con tinción. Figura 4A Congelamiento/Descongelado: Rojo -control; Azul - 1 ciclo; Verde - 2 ciclos; Púrpura - 3 ciclos; Figura 4B Exposición a H202 : Rojo - control; Azul - 0.5 m ; Verde - 5 mM; Púrpura - 20 mM; Figura 4C torbellino continuo: Rojo - control; Azul - 5'min; Verde - 20 min; Púrpura - 60 min; Figura 4D exposición a ÜV: Rojo - control; Azul - 40 min; Verde - 1 hr; Púrpura - 2 hr; Figura 4E Tensión térmica (a 37 grados C) : Rojo -control; Azul - 1 hr; Verde - 4 hr; Púrpura - 20 hr. Figura 5. Análisis HPLC de intercambio de cationes de las muestras cABCI tratadas con ÜV. 5A. Muestra inicial; 5B. Después de 30 segundos exposición a ÜV; 5C. Después de 2 minutos de exposición a UV; 5D. Después de 5 minutos de exposición a ÜV. Figura 6. Comparación del área pico HPLC de ABCI con actividad unitaria. Figura 7. Estabilidad de ABCI a UV portátil. Figura 8. Estabilidad ABCI exposición a UV en campana . Figura 9. Correlación de datos de actividad cABCI con perfil HPLC de cABCI durante inactivación térmica. 9A. Histograma del por ciento de áreas pico iniciales en HPLC y el por ciento de actividad inicial por análisis espectrofotométrico . 9B. Regresión de áreas pico y actividades por espectrofotometria . Figura 10. Dependencia de estabilidad térmica de cABCI en concentración iónica en la presencia de amortiguador fosfato Na 50 mM. Figura 11. Dependencia de estabilidad térmica de cABCI en concentración en especies amortiguadoras en la presencia de NaCl 100 mM y acetato de Na 50 mM. Figura 12. Análisis SDS-PAGE de la condroitinasa AC purificada final. DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes que las presentes composiciones y métodos se describan, habrá de entenderse que esta invención no se limita a las particulares moléculas, composiciones, metodologías o protocolos descritos, ya que estos pueden variar. También habrá de entenderse que la terminología empleada en la descripción es con el propósito de describir las versiones o modalidades particulares solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que se limitará solo por las reivindicaciones anexas. También habrá de notarse que como se emplea aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo dicte de otra forma. De esta manera, por ejemplo referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y sus equivalentes que se conocen por aquellos con destreza en la técnica y asi en adelante. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica . Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden emplearse en la práctica o prueba de modalidades de la presente invención, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan por referencia. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión que la invención no tiene derecho a fecha previa de esta descripción en virtud de invención anterior. Como se emplea aquí, el término "aproximadamente" significa más o menos 10% del valor numérico del número con el cual se emplea. Por lo tanto, aproximadamente 50% significa en el intervalo de 45-55%. El término "proteína recombinante" se refiere a un polipéptido de la presente invención, que se produce por una técnica de ADN (DNA) recombinante, en donde en general, DNA que codifica un polipéptido se inserta en un vector de expresión conveniente que a su vez se emplea para transformar una célula anfitriona para producir la proteína. Aún más, la frase "derivado (a), de", con respecto a un gen recombinante, se pretende que incluya dentro del significado de "proteína recombinante" aquellas proteínas que tienen una secuencia de amino ácido de una proteína nativa, o una secuencia de amino ácidos similar a esta, que se genera por mutaciones incluyendo substituciones y eliminaciones (incluyendo truncado) de una forma de origen natural de la proteína. Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva", como se emplean aquí, pueden emplearse en forma intercambiable y se refieren a una cantidad de un componente de compuesto terapéutico de la presente invención. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico es una cantidad predeterminada que se calcula para lograr el efecto deseado, es decir tratar efectivamente una lesión al sistema nervioso central. Por ejemplo, un compuesto terapéutico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de condroitinasa que puede purificarse por un método de la presente invención y formularse para proporcionar una enzima activa, estable, es . suficiente para degradar el CSPGs del área lesionada de la médula espinal o una cantidad suficiente para restaurar, en todo o parcialmente la función motriz sensorial o autónoma del mamífero y puede resultar en una regeneración de neuronas en un sistema nervioso central, tal como el promover crecimiento axonal en un área lesionada. El término "vector" se refiere a un vehículo que puede transportar las moléculas de ácido nucleico. Las moléculas , de ácido nucleico que codifican el polipéptido condroitinasa, se enlazan covalentemente con el ácido nucleico vector. Con este aspecto de la invención, el vector puede ser un plásmido, fago de hebra sencilla o doble, un vector viral RNA o DNA de hebra sencilla doble, o cromosoma artificial, tal como BAC, PAC, YAC o MAC. Condroitinasa como se emplea aquí, incluye pero no está limitada a, condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B o enzimas de mamíferos con actividad tipo condroitinasa tales como Hyall, Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20. Puede obtenerse condroitinasa de un microorganismo que expresa naturalmente una condroitinasa; por ejemplo pero no limitado a E. coli, Proteus vulgaris o de la expresión de una proteina recombinante en una célula anfitriona. . La célula anfitriona puede ser una célula procariótica (tal como E. coli) o una célula eucariótica (tal como levadura, una célula de mamífero o una célula de insecto) .

[0039] En una modalidad de la invención, una condroitinasa ABCI recombinante de Proteus vulgaris se sobre-expresó en E. coli. La secuencia primaria de esta proeína se muestra a continuación: ATSNPAFDPKNLMQSEIYHFAQNNPLADFSSDKNSILT SDKRSIMGNQSL WKWKG GSSFTLHKKLIVPTDKEASKAWGRSSTPVFSFWLYNEKPIDGY TIDFGEKLISTSEAQ AGFKVKLDFTGWRTVGVSLNNDLENREMTLNATNTSSDGTQOSIGRS GAKVDSIRF APSNVSQGEIYIDRIMFSVDDARYQWSDYQVKTRLSEPEIQFHNVKPQLEVTPENLA AIDLIRQRLINEFVGGEKETNLALEENISKLKSDFDALNTHTLANGGTQGRHLITDKQI IIYQPENLNSQDKQLFDNYVILGNYTTLMFNISRAYVLEKDPTQKAQLKQMYLL TK HLLDQGFVKGSALVTTHHWGYSSRWWYISTLLMSDALKEANLQTQVYDSLLWYSR EFKSSFDMKVSADSSDLDYFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRINLVNTFSHYITGALTQV PPGGKDGLRPDGTAWRHEGNYPGYSFPAFKNASQLIYLLRDTPFSVGESGWNSLKK AMVSAWIYSNPEVGLPLAGRHPLNSPSLKSVAQGYYWLAMSAKSSPDKTLASIYLAISDKTQ NESTAIFGETITPASLPQGFYAFNGGAFGIHRWQDKMVTLKAYNTNVWSSEI YNKDNRYGRYQSHGVAQIVSNGSQLSQGYQQEGWDWNRMPGATTIHLPLKDLDSP KPHTL QRGERGFSGTSSLEGQYGMMAFDLIYPANLERFDPNFTAKKSVLAADNHLI FIGSNINSSDKNKNVETTLFQHAITPTLNTLWINGQKIENMPYQTTLQQGDWLIDSNG NGYLITQAEKVNVSRQHQVSAENKNRQPTEGNFSSAWIDHSTRPKDASYEYMVFLD ATPEKMGEMAQ FRENNGLYQVLR DKDVHIILDKLSNVTGYAFYQPASIEDKWI KVNKPAIV THRQKDTLIVSAVTPDLN TRQKAATPVTINVTINGK QSADKNSEV KYQVSGDNTELTFTSYFGIPQEI LSPLP (SEQ ID NO: I), en donde residuos con negritas y subrayados indican residuos que no se correlacionan con aquellos dentro de la. secuencias de GeneBank y residuos con itálicas indican una secuencia péptido que se reportó escindida de la enzima procesada (Khandke, 1996),. En otra modalidad, una condroitinasa recombinante puede producirse a partir de la secuencia amino ácido de la enzima procesada que tiene la secuencia: : QDSIGRSLGAKVDSIRFKAPSNVSQGEIYIDRIMFSVDDARYQWSDYQVKTRLSEPEI QFHNVKPQLPVTPENLAAIDLIRQRLINEFVGGEKETNLALEENISKLKSDFDALNTHT LANGGTQGRHLITDKQIIIYQPENLNSQDKQLFDNYVILGNYTTLMFNISRAYVLEKD PTQKAQLKQMYLLMTKHLLDQGFV GSALVTTHHWGYSSRWWYISTLLMSDALKE ANLQTQVYDSLLWYSREFKSSFDMKVSADSSDLDYFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRI NLVNTFSHYITGALTQVPPGGKDGLRPDGTAWRHEGNYPGYSFPAFKNASQLIYLLR DTPFSVGESGWNSLKKAMVSAWIYSNPEVGLPLAGRHPLNSPSLKSVAQGYYWLA MSAKSSPDKTLASIYLAISDKTQNESTAIFGETITPASLPQGFYAFNGGAFGIHRWQDK MVTLKAYNTNVWSSEIYNKDNRYGRYQSHGVAQIVSNGSQLSQGYQQEGWDWNR MPGATTIHLPLKDLDSPKPHTLMQRGERGFSGTSSLEGQYGMMAFDLIYPANLERFD PNFTAKKSVLAADNHLIFIGSNINSSDKNKNVETTLFQHAITPTLNTLWINGQKIENMP YQTTLQQGDWLIDSNGNGYLITQAEKVNVSRQHQVSAENKNRQPTEGNFSSAWIDH STRPKDASYEYMVFLDATPE MGEMAQKFRENNGLYQVLRKDKDVHIILDKLSNVT GYAFYQPASIEDKWIKKVN PAIVMTHRQ DTLIVSAVTPDLNMTRQ AATPVTINVTINGK WQSADKNSEVKYQVSGDNTELTFTSYFGIPQEI LSPLP (SEQID N0:2). la expresión de un gen de condroitinasa recombinante, puede producirse al ligar un ácido nucleico que codifica una proteina condroitinasa, o una porción de la misma en un vector conveniente para expresión en cualquiera de células procarióticas , células eucarióticas, o ambas. Procedimientos para ligación son bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Vectores de expresión para producir formas recombinantes de los polipéptidos condroitinasa presentes incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores convenientes para la expresión de un polipéptido condroitinasa incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para expresión en células procarióticas, tales como E. coli. Una cantidad de vectores existe para expresión de proteínas recombinantes en levaduras. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 y YRP17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae (ver por ejemplo Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83, incorporada aquí por referencia) . Estos vectores pueden replicar en E. coli debido a la presencia del origen de replicación pBR322 y en S. cerevisiae debido al determinante replicación del plásmido de 2 mieras de levadura. Además, marcadores de resistencia a drogas tales como ampicilina pueden emplearse. En otra modalidad, un polipéptido de condroitinasa se produce, utilizando -en forma recombinante un vector de expresión generado al subclonar la secuencia de codificación de una de las proteínas condroitinasa representadas en SEQ ID NO: 1 o · SEQ ID NO: 2. Vectores de expresión de mamífero pueden contenerse secuencias procarióticas , para facilitar la propagación del vector en bacterias, y una o más unidades de transcripción eucarióticas que se expresan en células eucarióticas . Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para transfección de células eucarióticas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para . facilitar replicación y selección de resistencia de drogas tanto en células procarióticas como eucarióticas . . En forma alterna, derivados de virus tales como el papiloma bovino (BPV-1) , o virus Epstein-Barr (pHEBo, pREP-derivado y p205) pueden emplearse para expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas. Los diversos métodos empleados en la preparación de plásmidos y transformación de organismos anfitriones son bien conocidos en la especialidad. Para otros sistemas de expresión convenientes tanto para células procarióticas como eucarióticas, así como procedimientos recombinantes en general, ver Molecular Cloning, 4 Laboratory Manual, 2a Edición, editado por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Capítulos 16 y 17, sus referencias, aquí se incorporan. En algunos casos, puede ser conveniente el expresar el polipéptido condroitinasa recombinante por el uso de un sistema de expresión de insecto tal como el sistema de expresión de baculovirus . Ejemplos de estos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVLl392, pVL1393 y pVL941) , vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWl) , y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene ?-gal) . Los vectores de expresión aqui citados se proporcionan a manera de ejemplo solamente y representan los vectores bien conocidos disponibles para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que pueden ser útiles para expresar las moléculas de ácido nucleico. La persona con destreza ordinaria en la especialidad estará consciente de otros vectores adecuados para propagación de mantenimiento o expresión de las moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Estos se encuentran por ejemplo en Sambrook, J. , Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, el texto de la cual aqui se incorpora por referencia. Cuando es conveniente expresar solo una porción de una proteina condroitinasa, tal como una forma que carece una porción del extremo N, es decir un imitante de truncado que carece del péptido de señal, puede ser necesario el agregar un codón de inicio (ATG, que codifica el amino ácido metionina) al fragmento oligonucleótido que contiene la secuencia deseada a expresar. Es bien conocido en la técnica que una metionina en la posición N-terminal puede escindirse enzimáticamente por el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). MAP se ha clonado de E., coli (Ben-Bassat et al. (1987) J: Bacteriol. 169:751-757) y Salmonella typhimurium y su actividad in vitro se ha demostrado en proteínas recombinantes (Miller et al. (1987) PNAS 84: 2718-1722). Por lo tanto, la remoción de una metionina N-terminal, si se desea, puede lograrse ya sea in vivo al expresar polipéptidos derivados de condroitinasa en un anfitrión que produce MAP (por ejemplo E. coli o CM89 o S. cerevisiae) , o in vitro por el uso de MAP purificada. Vectores de expresión que contienen regiones regulatorias de acción cis que se enlazan operativamente en el vector con el ácido nucleico condroitinasa tal que la transcripción de las moléculas de ácido nucleico se permita en una célula anfitriona. Las células anfitrionas recombinantes se preparan al introducir las construcciones de vector en las células, por técnicas fácilmente disponibles a la persona con destreza ordinaria en la especialidad. Estas incluyen, pero no están limitadas a, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección, lipofección, y otras técnicas tales como aquellas que se encuentran en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). Como se conoce en la técnica, los polipéptidos de condroitinasa pueden producirse por técnicas biológicas estándar o por síntesis químicas. Por ejemplo, una célula anfitrona transfectada con un vector de ácido nucleico que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica a los polipéptidos presentes, puede cultivarse bajo condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del péptido. El polipéptido condroitinasa puede secretarse y aislarse y de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido condroitinasa recombinante . Aspectos de la invención aquí descritos proporcionan métodos de purificación en donde la condroitinasa se aisla en una forma pura que es más estable y activa que aquellos métodos actualmente empleados . En forma alterna, el péptido puede ser retenido citoplásmicamente al retirar la secuencia péptido de señal a partir del gen condroitinasa recombinante y las células cosechadas, Usadas y. la proteína aislada por los métodos de purificación aquí descritos. De acuerdo con un aspecto de la invención, el proceso para purificar condroitinasa comprende las siguientes etapas: 1) extraer la enzima de una célula, 2) separar el extracto celular crudo utilizando cromatografía de intercambio de cationes, 3) separación adicional del extracto por cromatografía de filtración en gel, y 4) retirar endotoxina a través de una membrana de intercambio de aniones para producir una condroitinasa purificada, que exhibe alta actividad respecto a condroitinasa purificada por métodos convencionales. La extracción de condroitinasa de células puede ser más efectiva al utilizar una solución amortiguadora a la cual se agrega un surfactante. ün surfactante es un agente tensio activo que tiene tendencias solubilizantes y que contiene grupos de polaridad opuestas. Estos agentes pueden emplearse para interrumpir la integridad de una célula. De esta manera, puede emplearse un surfactante para extraer una enzima de una célula. Cualquier surfactante que pueda promover la extracción de condroitinasa de una célula, puede emplearse en la presente invención, de preferencia el surfactante es un surfactante no iónico.

Surfactantes no iónicos que pueden emplearse incluyen, pero no están limitados a, polioxietilen alquil éteres, polioxietilen p-t-octilfenil éteres, polisorbato y semejantes. Surfactantes tipo Emulgen, surfactantes tipo Liponox, surfactantes tipo Brij , y semejantes se dan como ejemplos específicos de polioxietilen alquil éteres. Surfactantes comercialmente disponibles entre estos son Emulgen 120, Emulgen 109P, Liponox DCH, Brij 35,78, 76,96, 56,58, 98, Nikkol BL-9EX, BL-21, BL-25, y semejantes. Dados como ejemplos específicos de polioxietilen p-t-octilfenil éteres son surfactantes tipo Tritón, surfactantes tipo Nonidet P40, surfactantes tipo Igepal/CA, Politergent G, surfactantes tipo Neutronyx, surfactantes tipo Conco, y semejantes. Entre estos tipos de surfactantes, Tritón X-100, X-45, X-114, X-102, X-165, X-305, X-405, Nonidet P-40, Igepal CA-630, Neutronyx 605, Conco NIX- 100, y semejantes están comercialmente disponibles. Surfactantes tipo Tween, surfactantes tipo Emasol, surfactantes tipo Sorbester, surfactantes tipo Crill, y semejantes, se dan como ejemplos específicos de polisorbatos . Derivados sorbitan mono-9-octadecanoato poli (oxi-1, 2-etandiílo) , comercialmente disponibles como Tween 80 se prefieren como polisorbato y semejantes.

De los surfactantes anteriores,, se prefieren surfactantes Tritón X, incluyendo pero no limitados a Tritón X-114. En general, el detergente tal como pero no limitado a, Tritón X, puede agregarse a la muestra de células a extraer. En una modalidad de la invención, la concentración del detergente puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% (v/v) , de preferencia en el intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% (v/v) , o más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 2%. En una modalidad de la invención, el proceso de extracción puede también involucrar sonicación. La sonicación involucra el uso de ondas de sonido para romper células frágiles (fragilizadas por ejemplo por exposición a un surfactante, tal como Tritón X) . Esto resultado en dispersión y ruptura de las células tal que la integridad de las células se destruya más, de esta manera provocando la liberación de componentes intracelulares . La sonicación puede involucrar cualquiera o ambos de una exposición pulsada o continúa a las ondas de sonido. Por ejemplo, para sonicar las células, puede emplearse una pequeña (micro) sonda. El sonicador puede ajustarse para pulsar (no continuo) . En otra modalidad, el sonicador puede ajustarse continuo.

En una modalidad adicional, la etapa de sonicación puede utilizar una combinación de sonicación pulsada y continua. En una modalidad, la suspensión celular puede sonicarse con 10 cortas ráfagas de 10 segundos seguido por intervalos de 30 segundos para enfriamiento. La suspensión celular puede mantenerse en hielo durante sonicación para evitar sobrecalentamiento de los constituyentes de la muestra. Después de sonicación, los desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Otros métodos . de sonicación pueden emplearse, como se determina fácilmente por aquellos con destreza en la técnica, dependiendo del tipo de célula que se rompe. En otra modalidad, la extracción enzimática también puede involucrar homogeneización polytron. Este proceso molerá mecánicamente las células tratadas con surfactante, rompiendo ahi la integridad celular, y liberando componentes celulares en una solución, para mayor purificación. En general, la muestra se mantiene en hielo para evitar o limitar cualquier calentamiento de la muestra. La muestra puede homogeneizarse por aproximadamente 30 segundos, o hasta que los grumos celulares se hayan dispersado. Métodos para realizar homogeneización polytron son bien conocidos en la técnica .

La condoitrinasa puede capturarse del extracto celular utilizando cromatografía de intercambio de iones. En cromatografía de intercambio de iones, sustancias cargadas se separan utilizando materiales de columna que transportan una carga opuesta. Dos tipos de intercambiador se diferencian: básico (cargado positivamente) y acídico (cargado negativamente) . Los tipos de intercambiador de iones pueden además dividirse en débilmente básico o acídico o fuertemente básico o acídico. Con materiales fuertemente básicos o acídicos, todos los grupos funcionales en general están presentes en la forma ionizada. Por ejemplo, los grupos amino-cuaternarios (R3N+) están cargados positivamente, mientras que los grupos de ácido sulfónico (S03~) están cargados negativamente.- Los tipos débilmente básicos y los tipos débilmente acídicos de columnas de intercambio de iones también existen. Los tipos débilmente básicos en general son grupos amino-funcionales secundarios y terciarios; los tipos débilmente acídicos en general son grupos funcionales carboxilo. Muchas proteínas pueden separarse como polianiones (pH > pl) o como policationes (pH < pl) . Los grupos de intercambio de iones más comunes incluyen pero no están limitados a dimetilamoniometilo (anión) dietilamonioetilo (anión) dimetilaminoetilo (anión) carboxi (catión) carboxialquilo (catión) , sulfoisobutilo (catión) , sulfoalquilo (catión) , sulfopropilo (catión) y sulfoetilo (catión) . Para capturar la enzima del extracto celular, el extracto obtenido puede someterse a cromatografía de intercambio de cationes. Utilizando una resina de intercambio de cationes, se produce una condroitinasa con actividad y pureza incrementadas en comparación con el lisado crudo. Resinas de intercambio de cationes débiles o fuertes pueden emplearse por ejemplo pero no limitadas a resinas de intercambio de cationes que tienen un grupo carboxialquilo o un grupo sulfoalquilo o sulfopropilo respectivamente. Otras resinas de intercambio ¦ de cationes son bien conocidas en la técnica (ver anteriormente) . De esta manera, en una modalidad de la invención, la enzima puede capturarse a partir del extracto celular al cargar la muestra en la cromatografía de intercambio de cationes, lavar el intercambiador de cationes, en donde los componentes celulares diferentes a condroitinasa son lavados por arrastre al incrementar la concentración iónica y/o por cambios de pH, es decir, bajo condiciones de cromatografía de intercambio de cationes; y elución de la muestra condroitinasa por un incremento adicional en la concentración iónica y/o por un cambio de pH.

Amortiguadores empleados en cromatografía de intercambio de cationes incluyen pero no están limitados a aquellos citados en la Tabla 1. Tabla 1. Amortiguadores de cromatografía de intercambio de cationes .

Remoción de agregados y contaminantes e impurezas de bajo peso molecular puede llevarse a cabo en diversos métodos de filtrado incluyendo por ejemplo filtración en gel o cromatografía de exclusión de tamaño. Ejemplos comercialmente disponibles de filtración de gel son Sephadex y Sephacryl. Cromatografía de filtración en gel es una separación con base en tamaño. También se denomina cromatografía de permeación en gel o exclusión molecular. En cromatografía de filtración en gel, la fase estacionaria consiste de perlas porosas con un intervalo bien definido de tamaño de poros. Se dice que la fase estacionaria para filtración en gel tiene un intervalo de fraccionación, lo que significa que moléculas dentro de ese intervalo de peso molecular pueden ser separadas. De esta manera, proteínas que son suficientemente pequeñas pueden caber dentro de todos los poros en las perlas y se dice que están incluidas. Estas pequeñas proteínas tienen acceso a la fase móvil dentro de las perlas, así como la fase móvil entre perlas y eluyen al último en una separación con filtración en gel. Proteínas que son muy grandes para caber dentro de cualquiera de los poros, se dice que son excluidas. Tienen acceso solo a la fase móvil entre las perlas y por lo tanto eluyen primero. Proteínas de tamaños intermedios se incluyen parcialmente- lo que significa que pueden pasar dentro de algunos pero no todos los poros en las perlas. Estas proteínas eluirán después entre las proteínas grandes ("excluidas") y pequeñas ("totalmente incluidas") . : Otro contaminante que puede estar presente en la preparación de lisado celular es endotoxina. La endotoxina es un contaminante tóxico común en sistemas biológicos. Es importante el retirar suficientemente endotoxina que es un componente de la pared celular de bacterias. La endotoxina es un lipopolisacárido en la pared celular de la mayoría de las bacterias gram negativas tales como E. coli. La endotoxina incluida en proteínas se conoce que provoca síntomas de alta fiebre, choque de endotoxina e inflamación, incluso en una muy pequeña cantidad. Ya que los extractos bacterianos pueden estar altamente contaminados con endotoxina, modalidades de la invención pueden incluir una etapa de remoción de endotoxina en un proceso de purificación. Diversos métodos pueden emplearse para retirar la endotoxina tales como, pero no limitados a cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de afinidad, ultra filtración y separación de fases utilizando un surfactante.

En una modalidad de la invención, la endotoxina se retira utilizando una columna de intercambio de aniones. Ejemplos de cromatografía de intercambio de aniones incluyen pero no están limitados a membrana Q, una amina cuaternaria; y resina dietanolamina (DEAE) . Amortiguadores empleados en cromatografía de intercambio de aniones incluyen pero no están limitados a aquellos ilustrados en la tabla 2. Tabla 2. Amortiguadores de cromatografía de intercambio de aniones .

Molécula pKa dpKa/grados C Contra-ión N-metil- 8.52 -0.02Í cloruro dietanolamina dietanolamina | 8.88 ¡-0.025 cloruro 1,3- 18.64 -0.031 cloruro diaminopropano etanolamina 9.50 -0.029 cloruro piperazma 9.73 -0.026 cloruro 1,3-, 110.47 -0.026 cloruro diaminopropano piperidina 11.12 •0.031 cloruro fosfato 12.33 -0.026 cloruro La separación puede ocurrir en diversas etapas del proceso, de preferencia durante purificación antes de filtración en gel. La filtración a través de membranas Q es otra alternativa para la etapa de limpieza de endotoxinas. En una modalidad filtración de membrana Q puede emplearse utilizando un pH de 5.5 en acetato de Na 20 mM y NaCl lOOmM. De acuerdo con K. C. Hou y R. Zanie ski, Biotech. Appl . Biochem. 12, 315-324, 1990, estas condiciones de pH y sal se espera que retiren en el intervalo, de aproximadamente 70 a 85% de endotoxina. En una modalidad, un proceso de filtración Q en un modo de recolección de flujo pasante da por resultado más de aproximadamente 95% de condroitinasa . Filtración de membrana Q puede realizarse en diversos tiempos durante el proceso, incluyendo por ejemplo al final de purificación después de filtración en gel. De esta manera, en una modalidad de la invención, la remoción de la endotoxina de la condroitinasa en la muestra puede incluir cargar la muestra en una cromatografía de intercambio de aniones, lavar el intercambiador de aniones en donde las impurezas son lavadas por arrastre al incrementar la concentración de iones y/o por cambios de pH, es decir, bajo condiciones de cromatografía de intercambio de aniones; y elución de la muestra de condroitinasa para un incremento adicional en la concentración iónica /o por un cambio de pH. Diálisis es uno de los métodos más comúnmente empleados para transferir una muestra biológica, usualmente basada en proteína de un medio a otro. Frecuentemente es necesario retirar sales o cambiar el amortiguador después de una etapa en la purificación para que la siguiente etapa funcione eficientemente. Esto puede lograrse por diálisis en donde la solución de proteínas se mantiene en una membrana semipermeable y coloca en el amortiguador, de manera tal que moléculas pequeñas por ejemplo sales puedan pasar libremente a través de la membrana mientras que se retengan más grandes moléculas por ejemplo proteínas. Una modalidad de la presente invención incluye una etapa de diálisis para purificar adicionalmente la condroitinasa . Un amortiguador volátil, tal como bicarbonato de amonio, pH 8.0, puede emplearse para la etapa de diálisis. Otros amortiguadores también pueden emplearse. La selección de amortiguador deberá ser aquella apropiada para la proteína que se dializa. Estos amortiguadores son bien conocidos en la técnica (por ejemplo pero no limitados a amortiguadores basados en Tris, amortiguadores fosfato, etc.):. El amortiguador empleado para diálisis puede ser cualquier amortiguador que sea capaz de mantener el pH apropiado en el que se estabilice la proteína aislada. Para almacenamiento y distribución de la condroitinasa purificada, el proceso de purificar la condroitinasa, además puede incluir la etapa de sacado. La etapa de secado puede involucrar secado con calentamiento convencional o más preferiblemente liofilización o secado por congelamiento. Se proporcionan adicionalmente modalidades de la invención que pueden incluir un método para supervisar los rendimientos de enzima y perfiles de pureza por HPLC de fase inversa. Esto puede realizarse siguiendo cualquier o todas las etapas en el proceso de purificación. En una modalidad de la invención, el rendimiento final de enzima puede ser hasta aproximadamente 50 mg de condroitinasa a partir de un L de células cultivadas. En una modalidad adicional, el rendimiento final de enzima puede estar en el intervalo de 'aproximadamente 75 a 85 mg de 1 L de células. La condroitinasa purificada de la presente invención, puede caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades: actividad de enzimas, el pl, la especificidad del sustrato, la velocidad de catálisis de sustrato, el efecto, inhibitorio de sales de metales divalentes, el pH de amortiguador de almacenamiento óptimo, los efectos de diversas condiciones de esfuerzo, la concentración iónica y amortiguador óptimos, estabilización de la enzima en diversos excipientes y el efecto de concentración de enzima en la estabilidad térmica . Una condroitinasa ABCI se emplea como un ejemplo de una condroitinasa que puede purificarse y formularse de acuerdo con las modalidades de la invención. La condroitinasa ABCI purificada liofilizada se reconstituye y ensaya por actividad que se compara con actividades de enzimas de condroitinasa ABCI disponibles de otras fuentes. La actividad de la enzima condroitinasa ABCI de la presente invención fue una preparación relativamente alta en enzimas . La actividad de la condroitinasa ABCI purificada es aproximadamente 160 U/mg. El pl de la condroitinasa ABCI purificada de la presente invención es de aproximadamente 7.8 a aproximadamente 8.0. La afinidad de la condroitinasa ABCI purificada es similar para condroitina A, condroitina B y condroitina C. la velocidad de catálisis de un sustrato para la condroitinasa purificada ABCI de la presente invención es mayor para condroitina A, después para condroitina C que es mayor que la velocidad de catálisis de condroitina B. Sales de metales divalentes pueden inhibir una actividad de condroitinasa. Por ejemplo, la condroitinasa ABCI purificada puede inhibirse por Zn, Ni y Co. Ca y Mg parecen ser menos inhibitorios. El pH del amortiguador de almacenamiento no afecta la actividad de la condroitinasa purificada. En modalidades preferidas, el amortiguador de almacenamiento tiene pH 7.4, pH fisiológico . Mientras que la condroitinasa en general puede ser afectada por diversas condiciones adversas, la condroitinasa purificada de la presente invención no parece ser afectada por congelamiento y descongelado repetidos . Diversas modalidades proporcionan una formulación estable de la enzima tanto para almacenamiento como para administración. En general, la condroitinasa de estas formulaciones estables exhibe al menos aproximadamente 50% de actividad a aproximadamente 24 horas, de preferencia al menos aproximadamente 75% de actividad, más preferiblemente al menos 85% de actividad. En otro aspecto de la invención, las formulaciones proporcionan consistentemente actividad de condroitinasa estable . En una modalidad, la condroitinasa se formula en un amortiguador fosfato, de preferencia un amortiguador fosfato de sodio, con una concentración en el intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 1 M. Una modalidad preferida es de aproximadamente 750 mM de fosfato de sodio. Otra modalidad preferida es aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio. En una modalidad adicional, la condroitinasa puede formularse en un amortiguador de fosfato de sodio que además comprende acetato de sodio. Acetato de sodio puede estar presente en el intervalo de 25 mM a aproximadamente 75 mM. En una modalidad preferida, la concentración de acetato de sodio es de aproximadamente 50 mM. En una modalidad, una formulación preferida para administración es una condroitinasa en un amortiguador con un pH de aproximadamente 7.4. Adicionales modalidades de formulaciones para almacenamiento y administración se proporcionan en los ejemplos descritos. En una modalidad adicional, se proporciona una formulación que comprende condroitinasa purificada y un amortiguador que comprende una concentración iónica incrementada. Modalidades en donde una formulación comprende una concentración iónica incrementada pueden aumentar la estabilidad de una formulación de enzima. Por ejemplo, una modalidad preferida proporciona una formulación con aproximadamente NaCl 1 M en fosfato de sodio. La concentración de fosfato de sodio puede ser aproximadamente 50 mM. En una modalidad preferida, la concentración de almacenamiento de condroitinasa es inferior a aproximadamente 0.4 mg/ml . En una modalidad, una formulación de condroitinasa ABC comprende aproximadamente 0.4 mg/ml de condroitinasa ABC en aproximadamente 100 mM de fosfato de Na a un pH aproximado de 7.4 con una especificidad de sustrato preferida para condroitina ' ABC aproximadamente igual. En otra modalidad, se proporciona una formulación que comprende una condroitinasa B con una condroitinasa ABC purificada.

En otra modalidad, se proporciona una purificación de condroitinasa AC que comprende las siguientes etapas: 1) extracción de la enzima de una célula, 2) separar el extracto celular crudo utilizando cromatografía de intercambio de cationes, 3) separar adicionalmente el extracto por una cromatografía de filtración en gel, y 4) retirar endotoxina a través de una membrana de intercambio de aniones para producir una condroitinasa AC purificada. En · una modalidad, una condroitinasa AC purificada se dializa en un amortiguador volátil, liofiliza y almacena a -80 grados C. El ejemplo 12 describe una modalidad de un método de purificación de una condroitinasa AC. En una modalidad, se proporcionan la reconstitución y almacenamiento a aproximadamente 4 grados C en un amortiguador en aproximadamente 0.1 M de fosfato de sodio, pH 7.4, 50 mM de acetato de sodio. En otra . modalidad, se proporciona un amortiguador de estabilización (para estudios a aproximadamente 37 grados C) a .aproximadamente 0.75 M de fosfato de sodio, pH 7.4, 50 mM de acetato de sodio. En otra modalidad, el almacenamiento de condroitinasa está en la forma liofilizada. La actividad de condroitinasa puede estabilizarse por la adición de excipientes o por liofilización. Estabilizantes incluyen carbohidratos,, amino ácidos, ácidos grasos, y surfactantes y se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Ejemplos incluyen carbohidratos tales como sacarosa, lactosa, manitol, y dextrano, proteínas tales como albúmina y protamina, amino ácidos tales como arginina, glicina y treonina, surfactantes tales como TWEEN® y PLURONIC®, sales tales como cloruro de calcio y fosfato de sodio, y lípidos tales como ácidos grasos, fosfolípidos, y sales biliares. Los estabilizantes en general se agregan a la proteína en una proporción de 1:10 a 4:1, carbohidrato a proteína, amino ácidos a proteína, estabilizante de proteína a proteína, y sales a proteína; 1:1000 a 1:20, surfactante a proteína; y 1:20 a 4:1, lípidos a proteína. Otros estabilizantes incluyen altas concentraciones de sulfato de amonio, acetato sodio o sulfato de sodio, con base · en estudios comparativos con actividad de heparinasa. Los agentes estabilizantes, de preferencia el sulfato de amonio u otra sal similar, se agregan a la enzima en una proporción de 0.1 a 4.0 mg sulfato de amonio/IU de enzima. Condroitinasa puede administrase en forma tópica, local o sistémicamente . La administración tópica o local de preferencia es para mayor control de aplicación. Las condroitinasas en forma singular o en combinación, pueden mezclarse con un portador apropiado farmacéutico antes de la administración. Ejemplos de portadores farmacéuticos y aditivos generalmente empleados son convencionales diluyentes, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes desintegrantes, agentes amortiguadores, ácidos grasos de isotonización, agentes de isotonización, conservadores, anestésicos, surfactantes y semejantes, y son conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Especificamente, portadores farmacéuticos que pueden emplearse son dextrano, sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa, trehalosa, manitol, xilitol, sorbitol, inositol, albúmina de suero, gelatina, creatinina, polietilen glicol, surfactantes no iónicos (por . ejemplo ésteres de ácido graso polioxietilen sorbitan, aceite de ricino endurecido-polioxietileno, ésteres de ácido graso sacarosa, polioxietilen polioxipropilen glicol) y compuestos similares. Portadores farmacéuticos también pueden emplearse en combinación, tales como polietilen glicol y/o sacarosa, o ésteres de ácido graso polioxietilen sorbitan, polioxietilen sorbitan monooleato (20 E.O.) se prefiere en particular. Un régimen de tratamiento de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo mediante la administración, solo o en combinación de la misma, condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamíferos con actividad tipo condroitinasa tales como Hyall, Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20 a las lesiones del área lesionada del CNS. El modo de administración, la sincronización de administración y la dosis se llevan a cabo de manera tal que la recuperación funcional de deterioro del CNS se mejora por la promoción de excrecencia de neuritas. Los tratamientos de la presente descripción suministran una cantidad efectiva de condroitinasa ABCI purificada de acuerdo con la presente invención, sola o en combinación con condroitinasa ABCII, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamífero con actividad tipo condroitinasa tal como Hyal 1, Hyal 2, Hyal 3, Hyal 4 y PH20 al sitio lesionado. La cantidad efectiva de condroitinasa puede administrarse en una sola dosis, dos dosis o una pluralidad de dosis. Aunque habrá de entenderse que la dosis' puede administrarse en cualquier tiempo, en una modalidad, la dosis se administra dentro de 12 horas después lesión, o tan pronto como sea factible. En otra modalidad, la dosis se administra a un mamífero lesionado en una, dos o una pluralidad de dosis; estas dosis dependerán de la severidad de la lesión y la cantidad de CSPGs presente en la cicatrización glial . Cuando una pluralidad de dosis se administra, puede suministrarse en una base diaria, semanal o bi-semanal. El suministro de la dosis puede ser mediante catéter o jeringa. En forma alterna, el tratamiento puede administrarse durante cirugía, para permitir aplicación directa a la cicatriz glial . Como un ejemplo de una formulación purificada de una condroitinasa, una ABCI (cABCI) recombinante se purificó y caracterizó utilizando los métodos de la presente invención utilizando los siguientes parámetros: estabilidad a temperatura, características de enzima, susceptibilidad de diversas condiciones de esfuerzo, productos de degradación; efectos de diferentes excipientes en estabilidad de enzima. Los siguientes métodos se emplean para ilustrar las diversas modalidades de la presente invención. Los métodos son métodos ejemplares y no se pretende que limiten la invención. Ensayo de actividad. La actividad enzimática de cABCI se ensayó de acuerdo con un versión modificada de Hamai et al. (1997) . 125 µ? de mezcla de reacción que contiene Tris 40mM, pH 8.0 mM, Acetato de Na 40mM, caseína 0.002%, se incubó a aproximadamente 37 grados C por al menos 3 minutos. Después de incubación, 1 mg/ml (concentración final) de sulfato de condroitina C y 0.05-0.5 jug de enzima cABCI se agregaron, y la mezcla se sometió a torbellino leve y después se supervisor la velocidad a formación de producto por la absorción a aproximadamente 232 nm por aproximadamente 45 a 90 seg. Cálculos para concentraciones de substrato y producto se basaron en MW de residuos hexuronato que igualan a 521 y el coeficiente de extinción molar {e?3?) para hexuronato-6-sulfato insaturado a 232 nm de 5,500. Cuando se emplean condroitina A y B como substratos en el ensayo, los cálculos para productos de hexuronato-4-sulfato insaturado se realizaron con MW que iguala 503 y una e232 de 5,100. Velocidades de actividad inicial se calcularon en rimóles de disacárido/min al ajusfar los datos recolectados a una función lineal. Actividad enzimática especifica se expresa en ü/mg, en donde la unidad (U) se define como /mol de producto formado en ün 1 minuto. El intervalo lineal para medir velocidad de degradación de condroitina fue amplio como se muestra en la Figura 1. Estimado de coeficiente de extinción. El coeficiente de extinción para diferentes lotes de cABCI se determinó. Dos lotes diferentes de condroitinasa ABCI purificada se reconstituyeron en acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, NaCl 100 mM. Algunas muestras contienen 0.3M de sacarosa en el amortiguador de reconstitución. Absorción a 280 nm y concentraciones proteina utilizando las mediciones de ensayo proteina Lowry modificado se tomaron para cada muestra. Estimado de coeficiente de extinción para cABCI se presenta en la Tabla 3 siguiente. Tabla 3. Coeficiente de Extinción Estimado de coeficiente de extinción para solución de cABCI 0.1% se deriva al dividir A280 por concentración (mg/ml) . El coeficiente de extinción promedio (1.66) se utiliza en adicionales experimentos para mediciones de concentración cABCI. Caracterización de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC = Size chromatogrphy) . SEC analítico se empleó para caracterizar agregación y conformación de la condroitinasa ABCI . SEC analítico se realizó utilizando un Shodex KW-803, que tiene un intervalo de separación de aproximadamente 50,000 a 150,000 Daltons (Da) y columnas Shodex KW-804, que tienen un intervalo de separación de aproximadamente 100,000 a 600,000 Daltons (Da). El amortiguador para la fase móvil fue fosfato de sodio 100 mM, NaCl 50 mM, betaína 0.5%, pH 7.3. El análisis se realizó a un gasto de flujo de 1 ml/min a temperaturas ambiente (aproximadamente 22 grados C) . Ensayo de Proteína. Para determinar la concentración de proteína, se utilizó un ensayo de proteína Lowry modificado (BioRad) y BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. SDS-PAGE. Se separaron proteínas en un mini gel pre-vaciado SDS-PAGE con gradiente 4-20% (BioRad) y se llevó a cabo electroforesis a 200V en un aparato de mini gel (BioRad) . Los geles luego se tiñeron ya sea con Coomassie o tinción de plata. IEF-PAGE . IEF-PAGE se llevó a cabo para determinar el valor pl para condroitinasa ABCI en un intervalo de pH 3 a 10, utilizando geles NOVEX IEF (Invitrogen) y realizado de acuerdo las instrucciones del fabricante utilizando un aparato de gel NOVEX. Los geles se tiñeron con azul Coomassie Coloidal. Técnica Western. Las proteínas se separaron en SDS-PAGE y después se electro transfirieron sobre membrana nitrocelulosa por el método de transferencia de tanque (BioRad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El amortiguador de transferencia contiene Tris 25 mM y Glicina 192 mM a pH 8.3, SDS al 1 % . Ensayo Oxyblot. Detección de grupos carbonilo que se introducen en las cadenas laterales de proteína por un mecanismo específico de sitio se proporciona por el equipo para detección de Oxidación de proteína OxyBlot Chemicon International. Específicamente, los grupos carbonilo en las cadenas laterales de proteína se derivatizaron por 2 , 4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) a 2,4-dinitrofenilhidrozona (DNP-hidrozona) . Las muestras después se transfirieron sobre . nitrocelulosa. La membrana se expuso a un anticuerpo primario específico de DNP. Después de incubación con el anticuerpo primario la membrana se incuba con un anticuerpo · secundario conjugado con HRP. La presencia del complejo anticuerpo se detecta por quimioluminicencia .

Ensayo HPLC de intercambio de cationes.

Productos de oxidación cABCI se analizaron utilizando la columna de intercambio de cationes Dionex ProPac WCX-10 conectada a un sistema cromatográfico Thermo Finnigan que consiste de un detector Surveyor PDA, bomba y automuestreador . La enzima se eluyó con un gradiente NaCl en amortiguador fosfato de Na 10 mM, pH 6.0. La longitud de onda del detector se ajustó a 215 nm. Cromatografía de exclusión de tamaño. Cromatografía de exclusión de tamaño analítica se realizo a través de una columna K -803 (Showdex Inc.), que tiene un intervalo de separación de aproximadamente 50 a 150,0-00, y una columna KW-804, que tiene un intervalo de separación de aproximadamente 100,000 a 600,000, utilizando HPLC (ESA Inc.) suministrado con dispersión de luz (Wyatt Technology) y detector UV (Waters Co.). Fosfato de Na 100 mM, pH 7.4 se utilizó como una fase móvil . Estudios de esfuerzo de cABCI. La enzima cABCI liofilizada se reconstituyó en un amortiguador de selección. La enzima se dejó que reconstituyera ya sea en hielo o a aproximadamente 4 grados C por varias horas y material insoluble, de haber, se retiró por centrifugación a 14,000g . Después, alícuotas de 100 µ? se sometieron a diferentes condiciones de esfuerzo, incluyendo pero no limitadas a temperatura, torbellino continuo, congelado-descongelado, luz UV, presencia peróxido de hidrógeno. Muestras sometidas a luz UV se mantuvieron en hielo durante exposición para minimizar. cualquier efecto de calentamiento en la enzima. El torbellino se realizó a 4 grados C aproximadamente. Oxidación por peróxido de hidrógeno se probo al incubar muestras con diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno durante la noche a 4 grados C. Ciclos de congelado-descongelado se ejecutaron en hielo seco. Muestras de post-tratamiento se ensayaron para concentración de proteina por lecturas de A280, actividad de enzima por espectrofotometria y se estimaron adicionalmente por SDS-PAGE reductor y no reductor, y IEF-PAGE desnaturalizado, SEC y HPLC de intercambio de cationes . Estudios de formulación para cABCI. Ya que cABCI puede ser susceptible a inactivación con calor, incubación a aproximadamente 37 grados C también se empleó como un agente de esfuerzo en estudios de formulación. Las muestras cABCI reconstituidas se incubaron durante la noche o más en un baño de agua a 37 grados C con diferentes aditivos y componentes amortiguadores. Después de incubación, las muestras se ensayaron por actividad enzimática.

EJEMPLO 1 Condroitinasa ABCI recombinante se sobreexpresa en E. coli y purifica de acuerdo con las siguientes etapas : (i) extracción de enzimas con Tritón X-114/PBS y sonicación a partir de precipitado de células bacterianas; (ii) cromatografía de intercambio de cationes SP en amortiguador acetato de sodio a pH 5.5; (iii) cromatografía de filtración en gel Sephacryl S200 en amortiguador acetato de sodio a pH 5.5; (iv) filtración a través de una membrana de intercambio de aniones Q para endotoxina y remoción de DNA; y (v) diálisis en un amortiguador volátil (bicarbonato de amonio a pH 8.0). Opcionalmente, esta etapa puede ser seguida por liofilización o por cualesquiera otros métodos de concentración y remoción de amortiguador (por ejemplo filtración estéril seguida por suspensión en una formulación apropiada) . Una condroitinasa ABCI recombinante se sobreexpresó en E. coli. Una gran porción de la enzima se liberó en solución con detergente no iónico y sonicación. Un SDS-PAGE, visualizado con tinción de plata, del extracto soluble en detergente y fracción de precipitado soluble en detergente de células bacterianas que sobreexpresan ABCI, reveló una sola gran banda que recorre entre marcadores de tamaño de aproximadamente 75 kDa y 100 kDa. Cromatografía de intercambio de cationes se emplea como una etapa de captura en purificaciones adicionales. Cromatografía CEX SP a aproximadamente pH 5.5 en amortiguador acetato, fue efectiva para capturar condroitinasa ABCI del extracto de células bacterianas. Se encontró que la enzima se liga cuantitativamente y eluye de la columna SP con relativamente altos pureza y rendimiento cuando Tritón X-114, concentración final en el intervalo de aproximadamente 0.2-1% de detergente se empleó en el amortiguador de extracción. Análisis SDS-PAGE de las fracciones de condroitinasa ABCI inicial, de flujo pasante y de elución (25%B) de la columna SP para el extracto Tritón X-114 reveló que la condroitinasa ABCI se eluyó. ün extracto que contiene Tritón X-100 parece alterar las características de carga de condroitinasa ABCI · que resultan en deficiente captura, deficientes rendimientos de elución y baja pureza de etapa. Remoción de endotoxina se logró por dos métodos, específicamente dividiendo en Tritón X-114 y filtración con membrana de intercambio de aniones Q.

Análisis SDS-PAGE de las fracciones de condroitinasa ABCI durante la etapa de remoción de endotoxina utilizando el método de separación de Tritón X-114 detectó una sola gran banda en la ausencia de bandas de fondo. Filtración a través de membranas Q se empleó para la etapa de remoción de endotoxina. Este método se probó a aproximadamente pH 5.5. Acetato de Na 20 mM, pH 5.5, NaCl 100 mM, se encuentra que es un amortiguador efectivo para enlace de endotoxina con membranas Q (de acuerdo con K. C. Hou and R. Zaniewski, Biotech. Appl. Biochem. 12, 315-324, 1990, estas condiciones de pH y sal se espera que retiren aproximadamente 75% de endotoxina) y para minimizar pérdidas de cABCI durante esta etapa. Más del 95% de cABCI se recolecta en un modo de flujo pasante. Esta etapa se realizó siguiendo filtración en gel al final de purificación como se describe a continuación. Filtración en gel se empleó como una etapa de pulido para condroitinasa ABCI. Ejemplos de filtración de gel que pueden utilizarse incluyen Sephacryl S200 y Sephacryl S300. Sephacryl S200 y Sephacryl S300 se probaron por su eficacia para separar agregados y contaminantes de bajo peso molecular. Dos diferentes amortiguadores de elución (amortiguador 1: Tris 20 mM a pH 8.0, NaCl 200 mM, betaina al 0.5% y amortiguador 2: acetato de sodio 20 mM a pH 5.5, NaCl 100 mM) para cada gel se probaron y encontró que trabajan igualmente bien. La condroitinasa ABCI se eluye con los tiempos de retención esperados sin pérdida sustancial en muestra. La Figura 2 ilustra purificación de condroitinasa ABCI por filtración en gel . La Figura 2A es un perfil de cromatografía para columna Sephacryl S300 26/60. La Figura 2B es un análisis SDS-PAGE de fracción de elución de condroitinasa ABCI a partir de columna Sephacryl S300 26/60 en Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 200 mM, betaína al 0.5%. La Figura 2C es un análisis SDS-PAGE de fracción de elución de condroitinasa ABCI de la columna Sephacryl S200 26/60 en acetato de Na 20 mM, pH 5.5, MNaCl lOOmM. Para liofilización, la enzima purificada se dializa en amortiguador volátil de NH4CO3 0.1 M, a aproximadamente pH 8.0. Se realizó un gradiente (4-20%) de SDS-PAGE, bajo condiciones de reducción en las muestras de la columna de intercambio de cationes de captura (extracto de inicio, flujo pasante, lavado y recolectado de elución de SP) y etapas de fijación de gel (conjunto de elución S200) . ?1 gel se tiñó con azul Coomassie. Análisis de gel mostró que las etapas de purificación retiraron relativamente todos los desechos celulares y contaminantes, dando por resultado una muestra de enzima relativamente pura . EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la actividad enzimática de la condroitinasa ABCI recombinante purificada del Ejemplo 1, en comparación con la enzima nativa. Actividad enzimática de condroitinasa ABCI se ensaya como se describe aqui en otra parte. La condroitinasa ABCI recombinante del Ejemplo 1 de la presente invención tiene la misma o superior actividad especifica que la enzima nativa y muy superior actividad que la condroitinasa ABCI expresada en forma recombinante como se muestra a continuación en la Tabla 4. Tabla 4. Actividad enzimática Fuente enzima Actividad especifica, U/mg Condroitinasa ABCI nativa 120 (Seikagaku) Condroitinasa recombinante 24 (Glyko) Condroitinasa recombinante 160 Fuente enzima Actividad especifica, ü/mg ABCI (Acorda) La caracterización SEC se realizó tanto en la condroitinasa ABCI del Ejemplo 1 como en la condroitinasa ABCI nativa, como se describió anteriormente. Los perfiles de elución de condroitinasa ABCI recombinante y su condroitinasa ABCI nativa fueron los mismos. La condroitinasa ABCI recombinante de la presente invención tuvo un tiempo de retención y peso molecular esperado para una condroitinasa ABCI. Determinación de punto isoeléctrico para condroitinasa ABCI recombinante, IEF-PAGE, como se describe en otra parte aqui, se emplea para determinar el valor pl para la condroitinasa ABCI recombinante del Ejemplo 1. La proteina recombinante del Ejemplo 1 exhibió tres formas isoméricas. con un pl de aproximadamente 7.8-8.0 para la isoforma mayor. Este valor es superior que el esperado para una enzima nativa. EJEMPLO 3 Condroitinasas ABCI, AC, y B se probaron en una serie de sustratos y en médula espinal de rata para especificidad y actividad utilizando un método HPLC de intercambio de aniones mejorados. Este método detecta productos de escisión CSPG de disacárido (Adi~4DS y ? di-6DS) con un limite de cuantificación de 25 ng. Mediciones de los productos de escisión disacáridos liberados revelaron óptimas concentraciones de enzima, combinaciones de enzima y características del sustrato en una médula espinal de rata. La actividad catalítica de condroitinasa ABCI y condroitinasa AC fue mejorada sinergísticamente con la adición de condroitinasa B. Digestiones ex vivo de médula espinal de rata dieron por resultado ? di-4DS y ? di-6DS en la proporción de aproximadamente 95:5. Estudios del curso de tiempo revelaron que máxima formación de producto ocurrió en 6 horas incluso cuando las enzimas son activas por mucho más tiempo. La inhibición de producto se descartó como una causa para esta observación. EJEMPLO 4 El siguiente ejemplo ilustra la especificidad de sustrato del cABCI recombinante purificado. cABCI (lote 7b) se reconstituyó en fosfato de sodio 0.1 M y NaCH3COO 50 mM a pH 7.4. Velocidades de formación de producto se midieron a diferentes concentraciones para condroitinas A, B y C. Los datos se trazaron y cuando fue apropiado, adaptaron directamente a la ecuación de Michaelis-Menten para cálculo de valores Km y Vmax. Las curvas para condroitinas A, B y C exhibieron saturación a altas concentraciones de sustrato que es típico para cinéticas de Michaelis-Menten . Los siguientes parámetros cinéticos cABCI se midieron (Figuras 1 y 3, Tablas 3-5) : Km = 0.033 mg/ml y Vmax = 283 ü/mg para condroitina A, Km = 0.021mg/ml y Vmax = 74 U/mg para condroitina B, Km = 0.025 mg/ml y Vmax = 188 U/mg para condroitina C. Considerando niveles de impurezas que están presentes en cada sustrato (aproximadamente 70%, para condroitina A, aproximadamente 85% para condroitina B y aproximadamente 90% para condroitina C) , cABCI parece tener afinidad similar para todas las condroitinas, pero las digiere a diferentes velocidades específicas (condroitina A > condroitina C > condroitina B) . La Tabla 5 proporciona los datos en bruto para curvas de dependencia de concentración de condroitina A, B y C. Tabla 5. Actividad Sustrato, mg/ml Velocidades Actividad medidas , promedio , U/mg nmoles/min Condroitina A 5.03; 5.54; 6.8 127.9 (70% de pureza) 0.032 0.048 6.85; 7.39; 157.6 Sustrato, mg/ml Velocidades Actividad medidas , promedio , U/mg nmoles/min 7.15 0.08 9.50; 8.25; 207.2 10.38 0.12 11.34; 9.78; 239.6 11.41 0.16 11.65; 12.24; 243.6 9.19 0.24 8.97; 14.65; 257.0 10.46; 12.44 0.32 10.95; 10.45; 238.4 10.98 0.48 11.81; 11.48; 255.1 11.34 Condroitina B 9.85; 10.49 47.1 (85% de pureza) 0.04 0.06 12.97; 10.67 54.7 0.08 12.46; 12.88 58.7 Sustrato, mg/ml Velocidades Actividad medidas , promedio, U/mg nmoles/min 0.16 14.47; 14.50 67.0 0.20 14.58/ 12.72 63.2 0.40 15.20; 15.31 70.6 0.60 15.21; 13.98; 69.8 16.03 0.80 16.10; 14.97 71.9 Condroitina C (90% de pureza) 0.03 5.26; 3.91; 91.6 4.26 0.053 6.57; 6.41; 131.2 6.23 0.107 8.00; 8.55; 170.7 8.46 Sustrato , mg/mi Velocidades Actividad medidas , promedio, U/mg nmoles/min 0.160 7.49; 7.98; 158.0 7.66 0.267 8.84; 8.49; 169.3 7.46 0.400 8.23; 9.23; 171.1 7.58 0.533 9.65; 8.33; 178.7 8.18 Las velocidades especificas promedio (U/mg) se trazaron como una función de concentración de sustrato (mg/ml) y los datos se ajustaron directamente en la ecuación de Michaelis-Menten para determinación de parámetros cinéticos cABCI . La Figura 3 muestra las curvas Michaelis-Menten para cABCI y sus sustratos: condroitina A, B y C. EJEMPLO 5 La inhibición de la enzima condroitinasa ABCI purificada en la presencia de diversas sales de metal di alente (1 mM) , se midió. La actividad cABCI se ensayó después de que se realizaron adiciones de metal. La capacidad de inhibición de los metales probados parece estar en el siguiente orden: Zn>>Ni»Co>Ca>Mg . En forma notable, los iones de calcio y magnesio parecen tener ciertos efectos inhibitorios medibles en cABCI . La Tabla 6 proporciona la inhibición de metal de cABCI recombinante . Tabla 6. Inhibición de metal Sales de Velocidades Actividad % de metal, 1 mM medidas , retenida, actividad rimóles/min U/mg retenida Ninguna 12.6; 13.9; 127 100 14.7 CoCl2. 6.5; 6.6 61 48 NiS04- 1.8; 1.9 17 14 ZnCl2 0.23; 0.29 2.4 2 CaCl2 7.6; 9.2 78 61 MgCl2 9.1; 9.2 85 67 FeCl2 interferidas ND ND con ensayo Cu(CH3COO)2 interferidas ND ND con ensayo EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra el efecto que tiene el pH del amortiguador de almacenamiento en la estabilidad de la cABCI recombinante purificada. La cABCI liofilizada se reconstituyó en acetato de Na 20 mM, pH 5.5, amortiguador NaCl 100 mM a 2.0 mg/ml de concentración (utilizando un ensayo de proteina BCA) . Diversas condiciones de pH se lograron al diluir la muestra reconstituida en proporciones aproximadas de 1:2 con amortiguadores Bis-Tris propano 50 mM con diversas condiciones de pH. La concentración de cABCI de las muestras finales fue aproximadamente 1 mg/ml. Las muestras se almacenaron a aproximadamente 4 grados C y su actividad se midió a 24 hrs, 48 hrs y 72 hrs. La Tabla 7 proporciona los datos de actividad medida para las muestras de cABCI recombinantes almacenadas bajo diferentes condiciones de pH. Tabla 7. Actividades medidas pH de Velocidades Velocidades después almacenamiento iniciales , de 24 hrs a 4o C, nmoles/min nmoles/min ¦ 4 1.63; 2.47 5.47; 5.28 5 2.55; 3.13 5.92; 4.09 6 3.93; 4.04 4.46; 3.74 pH de Velocidades Velocidades después almacenamiento iniciales , de 24 hrs a 4o C, nmoles/min nmoles/min 7 4.15; 5.55 4.41, 4.57 8 4.43, 3.49 3.62,4.21 9 4.47, 3.65 4.53,4.27 No se observaron diferencias significantes entre las muestras almacenadas a diferentes condiciones de pH. Se prefiere pH 7.4 para extra dentro del intervalo de pH fisiológico. EJEMPLO 7 La cABCI recombinante se somete a diferentes condiciones de esfuerzo. Los datos de actividad y concentración de proteina para las muestras cABCI recombinantes después de diversos tratamientos de esfuerzo se presentan en la Tabla 8. Tabla 8. Actividad después de condiciones de esfuerzo Mues ra Tratamiento Puntos de Concentración, # tratamiento mg/ml Control 4 grados C 0.976 i ¦ Congelamiento 1 ciclo : 0.952 2 Congelamiento 2 ciclos 0.952 3 Congelamiento 3 ciclos 0.932 4 H202 0.5 mM 0.952 5 H202 5 mM 0.964 6 ¾02 20 mM 0.982 7 Torbellino 5 min 0.765 8 Torbellino 20 min 0.432 9 Torbellino 60 min 0.066 10 ÜV 40 min 0.976 11 ÜV 1 hr 0.976 12 ÜV 2hrs 0.976 13 37 grados C 1 hr 0.922 14 37 grados C 4hrs 0.934 15 37 grados C 20 hrs 0.801 Muestra # Velocidades Actividad, ü/mg medidas , nmoles/min Control 31.7; 30.0 126.4 :1 30.1; 29.2 124.6 2 22.8; 27.8 108.6 Muestra # Velocidades Actividad, U/mg medidas , nmoles/min 3 27.3; 25.8 114 4 24.3; 22.7 98.8 5 4.3; 6.1 21.3 6 1.1; 1.4 5.15 7 18.4; 17.9 94.8 8 13.0; 12.3 117 9 0.7; 0.8 46 10 0.1; 0.3 0.8 11 0.1; 0.1 0.36 12 0.1; 0.1 0.33 13 18.9; 16.0 75.5 14 15.8; 17.0 70.1 15 14.6; 8.8 58.3 Las muestras tratadas con esfuerzo también se analizaron por SEC con un detector de dispersión de luz. Los perfiles de dispersión de luz SEC de las muestras cABCI sin tratar (control) y tratadas con esfuerzo, se ilustran en las Figuras 4?-4?. La cABCI recombinante, a aproximadamente 1 mg/ml, no parece ser afectada por 3 ciclos de congelado y descongelado. La enzima se precipitó e inactivo en una forma dependiente del tiempo cuando se empleó torbellino como el agente de esfuerzo. Exposición a peróxido de hidrógeno resultó en pérdida de actividad en una forma dependiente de concentración con los cambios notables en sus perfiles de isoforma en IEF-PAGE. Exposición a luz ÜV tuvo un efecto negativo en la actividad de cABCI . La enzima no parece ser estable a 37 grados C y su pérdida de actividad apareció dependiente del tiempo. Muestras térmicamente inactivadas tuvieron una disminución en concentración de proteina y mostraron cambios en el perfil de isoforma similares, pero en menor grado, a los observados para muestras tratadas con peróxido de hidrógeno. ün método HPLC de intercambio de cationes débil (CEX) fue desarrollado a fin de cuantificar productos de oxidación cABCI . Por lo tanto, se realizó otro estudio de esfuerzo a fin de identificar y correlacionar la presencia de productos de oxidación con la pérdida de actividad enzimática. Se repitieron algunos tratamientos de esfuerzo bajo condiciones más ligeras que las aquellas empleadas en el estudio previo (exposición a ÜV) . Las muestras cABCI reconstituidas (0.6 mg/ml) se expusieron a 2 diferentes fuentes de luz ÜV (exposición de larga distancia y corta distancia), por aproximadamente 0.5, 1, 3 y 5 minutos e inactivación térmica (aproximadamente 37 grados C) en Acetato de Na 20 mM, pH 5.5, amortiguador NaCl 100 mM. Las muestras se ensayaron por actividad y por IEF-PAGE, SDS- PAGE, oxyblot y CEX-HPLC. Los resultados se describen a continuación. [00128] Después del tratamiento de oxidación, un pico adicional emergió en CEX-HPLC y se supone que es la condroitinasa oxidada de la Figura 5. Este pico aumentó en un incremento en el tiempo de exposición de UV. Las áreas totales bajo la curva en los cromatogramas RP-HPLC permanecieron casi iguales. La Figura 5 muestra un análisis CEX-HPLC débil de las muestras cABCI tratadas con UV. Se ilustran cromatogramas de cABCI antes (Figura 5A) y después 0.5 (Figura 5B) , 3 (Figura 5C) y 5 minutos (Figura 5D) de exposición a UV cercana (fuente de luz portátil o manual) . [00130] La Tabla 9 proporciona los datos de actividad cABCI para muestras sin tratar (control) y tratadas con esfuerzo. Tabla 9. Actividad para Muestras Tratadas con Esfuerzo y de Control . Muestras Velocidades Actividad U/mg nmoles/min Control 49.3; 40.9; 146.7 40.9 Muestras Velocidades Actividad ü/mg nmoles/min Luz UV a larga distancia 53.5; 37.9; 46.3 0.5 min 154.0 46.304 45.87 1 min 34.0; 44.6; 137.1 44.0 3 min 37.62; 39.3; 122.2 32.4 5 min 20.4; 29.2; 82.04 23.9 Luz UV a corta distancia 41.0; 36.0; 35.2 125.5 0.5 min 1 min 16.3; 19.8; 19.2 61.9 3 min 8.6; 9.3; 7.8 28.7 5 min 1 día a 37 13.3; 18.0; 50.9 grados C 14.1 Después de exposición a UV y calor, se ensayaron muestras cABCI por actividad por el ensayo espectrofotométrico previamente descrito. Parece haber una correlación entre la disminución relativa en área de pico cABCI sin oxidar con la disminución relativa en actividad (U/mg) . La Tabla 10, mostrada a continuación, es la correlación de la disminución en cABCI no oxidada con actividad después de exposición a luz UV de corta distancia y larga distancia. Tabla 10. Actividad Después de Exposición a UV Tiempo Área Pico Área Pico % de Área % de min . de Control Inicial Actividad Inicial 0 19239 2739978 100.0 100.0 Luz UV a larga distancia 93587 2429091 88.7 85.6 0.5 1.0 171634 1225441 44.7 42.1 3.0 180745 292674 10.7 19.7 5.0 181961 216126 7.9 6.4 Luz UV a corta Tiempo Área Pico Área Pico % de Área % de min. de Control Inicial Actividad Inicial distancia 31900 2770293 101.1 105.0 0.5 1.0 28732 2670994 97.5 93.6 3.0 68466 2410100 88.0 83.3 5 .0 89149 1877997 68.5 55.8 Las Figuras 6-8 muestran la correlación de la presencia del producto oxidado cABCI con reducción en actividad enzimática. Algo de correlación entre la apariencia del producto oxidado y la- actividad enzimática también se observó para muestras térmicamente inactivadas . Muestras cABCI se expusieron a calor y ensayaron por actividad por espectrofotometrxa y para producto oxidado por CEX-HPLC como se describió anteriormente . La Tabla 11 muestra datos de mediciones de actividad cABCI después de incubación a 37 grados C por 0 a 24 horas. Una ampolleta de Lote cABCI 7b se reconstituyó en acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 100 mM. Se incubaron muestras a 37 grados C por 1, 2, 4, 6 y 24 horas. La concentración de la muestra de control (antes de cualesquiera incubaciones) fue determinada. El A280 de la muestra fue 0.88, y la concentración se calculó igual a aproximadamente 0.53 mg/mL. Tabla 11. Actividad Después de Incubación Tabla 12. Correlación de datos de actividad cABCI con perfil HPLC de cABCI durante inactivación térmica. Tabla 12. Actividad Después de Inactivación Térmica Tiempo Área Pico Área Pico % de Área % de de Control Inicial Actividad Inicial Inicial 49607 3342595 100 100.0 1 hr 60633 2926126 87.5 84.7 2 hr 77000 2728818 81.6 72.8 4 hr 88621 2068080 61.9 66.6 6 hr 134161 1375960 41.2 45.9 25 hr 311574 336266 10.1 14.7 Después de determinación de actividad y análisis CEX-HPLC débil, también se analizaron las muestras inactivadas con UV y térmicamente por SDS-PAGE, IEF-PAGE y Oxyblot. El estudio de incubación a 37 grados C se repitió para condiciones de amortiguador adicionales: Fosfato de Na 0.1M, 7.4, Acetato de Na 50 mM y Fosfato de Na 0.-75 M, Acetato de Na 50 mM, como se describe en el Ejemplo 8. EJEMPLO 8 En el siguiente estudio, se emplearon diferentes amortiguadores para determinar la estabilidad enzimática. cABCI recombinante se reconstituye en Acetato de Na 50 mM, pH 6.5, NaCl 100 mM y diluye 1:3 con soluciones 0.2 M de acetato de sodio, fosfato de sodio, Tris y HEPES. Después de incubación durante la noche a 37 grados C en los diferentes amortiguadores, se determinó la actividad de CABCI . Los datos se presentan en la Tabla 13. Tabla 13. Actividad Basada en Sistema Amortiguadora Sistema Velocidades Actividad U/mg amortiguadora medidas , nmoles/min Acetato, pH 6.5, 31.7; 30.0 126.4 después de incubación a 4 grados C Acetato, pH 6.5, 16.4; 20.8 82.4 después de incubación a 37 grados C Tris,- pH 8.1, 15.5; 18.9 76.1 después de incubación a 37 grados C Sistema Velocidades Actividad U/mg amortiguadora medidas , limóles/min Fosfato de Na pH 28.4; 28.0 124.8 7.4, después de incubación a 37 grados C HEPES, pH 6.8 24.2; 26.9 113 después de incubación a 37 grados C Este estudio relevó que el amortiguador fosfato proporcionó la mayor protección para cABCI contra inactivación térmica. EJEMPLO 9 Este ejemplo demuestra el efecto de diversos estabilizantes de proteina (amortiguadores) y excipientes en su capacidad para estabilizar el cABCI . Los resultados de esta evaluación de diferentes estabilizantes de proteina y condiciones amortiguadoras para formulación amortiguadora cABCI, se citan en la Tabla 14. Tabla 14. Actividad Basada en Estabilizantes de Proteina y Amortiguadores Trata VelocidaActiVelocidaActi% de miento des de vidad de des 72 hrs vidad Activipartida partida, 37 grados 72 dad nmoles/min ü/mg c, hrs , reteninmoles/min 37 da grados c, U/mg Control : 8.6; 9.8 91.6 2.6; 2.4 5.3 5.8 fosfato de Na 100 mM pH 7.4, Acetato de Na 50 mM, NaCl 50 mM NaCl 500 mM 7.9; 10.0 89.5 14.2; 17.7 19.7 12.3 Fosfato de Na 11.3; 117.9 11.3; 106.0 90.0 750mM 12.2 11.8 Hidroquinona 10.3; 102.9 0.03; 0 0 0.1 mM 10.2 0.09 Mannitol 1% 11.6; 9.2 104.5 4.6; 6.1 7.6 7.2 Sacarosa 0.3M 10.5; 8.9 87.3 13.0; 13.3 15.3 13.7 Glicerol 10% 9.6, 10.2 98.8 3.6; 3.1 3.5 3.6 Arginina 10.2; 109.2 0.06; 2.5 2.3 Trata VelocidaActiVelocidaActi% de miento des de vidad de des 72 hrs vidad Activipartida partida, 37 grados 72 dad rimóles/min ü/mg c, hrs, reteninmoles/min 37 da grados c, U/mg lOOmM 11.6 0.12 Trehalosa 8.7; 87.1 0.8; 0.8 1.2 1.4 0.3M 8.7 Fosfato de Na 3.0; 3.0 51.4 0.2; 0.3 3.3 6.4 50mM Fosfato de Na 4.5; 4.3 68.3 2.2; 3.0 11.3 16.5 50mM 0.01% Polietilimida * se ilustran ejemplos de dos pruebas La Tabla 15 proporciona una evaluación de EDTA como aditivo para la formulación amortiguadora de cABCI . Tabla 15. Actividad Después de Administración de EDTA TrataVelocidaActiviVelociActivi% de miento des dad de dad de dad de Activi¬ Inicio, Inicio, 36 horas 36 dad nmoles/min U/mg a 37 horas a Retenida grados 37 c, grados nmoles/- C , ü/mg min Fosfato 5.9; 6.1 83.3 23.9; 53.1 63.7 de Na 26.0 50 mM . Fosfato 6.0; 4.8 75.0 18.0; 65.2 86.9 de Na 21.1 50mM . ED A 1 mM Fosfato 12.0; 158.2 5.9; 151.1 95.5 de Na 10.8 6.2 750mM .

Fosfato 11.3; 8.2 135.8 5.9; 149.5 110.1 de Na 6.0 750mM EDTA 1 mM Ninguno de los excipientes o amortiguadores excepto fosfato de sodio a 750 mM, fue efectivo contra inactivación térmica cABCI. NaCl 500 mM también mostró algo de mejora en estabilidad térmica cABCI . Los resultados sugieren que la concentración iónica puede jugar un papel para proteger cABCI contra inactivación térmica. EJEMPLO 10 Este ejemplo demuestra los efectos que tienen diferentes sales y diferentes concentraciones de sal en la estabilidad de cABCI utilizando cloruro de sodio en el amortiguador de formulación de cABCI . cABC recombinante se reconstituyó en Fosfato de Na 50mM pH 7.4 a aproximadamente 2 mg/ml . Una lectura de actividad inicial se tomó para determinar el nivel base de actividad. Condroitinasa (1 mg/ml) se diluye en cloruro de sodio (NaCl) en Fosfato de Na 50 mM, pH 7.4 a concentraciones en el intervalo de 0 a 1M. Se dejó que las muestras incubaran a 37 grados C por 48 horas. Después de dos días, las muestras se ensayaron por actividad. Los datos se presentan a continuación en las Tablas 16-18 y Figuras 10 y 11. La Tabla 16 muestra que la estabilidad térmica de cABCI depende de la concentración iónica de NaCl en la presencia de amortiguador fosfato de Na 50 itiM. Tabla 16. Estabilidad Térmica y Concentración Iónica La Figura 10 es una representación gráfica de los datos mostrados en la Tabla 16. La Tabla 17 muestra los efectos de concentración amortiguador en la estabilidad térmica de cABCI depende de la concentración del amortiguador en la presencia de NaCl 100 mM y Acetato de Na 50 mM. Tabla 17. Estabilidad Térmica y Amortiguador La Figura 12 es una representación gráfica de los datos presentados en la Tabla 17. Los datos mostraron que el incremento en concentración iónica parece mejorar la estabilidad térmica cABCI . Fosfato de Na 750 mM también proporciona protección para cABCI . El siguiente juego de experimentos se realizó a fin de optimizar las condiciones de concentración iónica mientras que se mantiene la concentración más baja de sal posible en la formulación final. La estabilidad térmica de cABCI se determina en una solución de fosfato de sodio y sulfato de sodio. Sulfato de sodio se conoce por sus efectos estabilizantes de proteina. Las concentraciones de ambas sales se variaron y las velocidades catalíticas de cABCI se midieron después de incubaciones a 37 grados C por; 19 horas, 48 horas, 120 horas y 192 horas. La Tabla 18 ilustra optimización de las concentraciones de fosfato de sodio y sulfato de sodio para la formulación de amortiguador .cABCI. La cABCI se reconstituye en Na2HP04 0.1M, Acetato de Na 50 mM, pH 7.4. Todas las muestras tuvieron concentraciones de cABCI de 0.37 mg/ml, y la misma concentración de acetato (50 mM) , mismo. pH (7.4), pero diferentes concentraciones de fosfato y sulfato. Las muestras se mantuvieron en un baño de agua a 37 grados C por los tiempos indicados (19 hrs, 48 hrs, 120 hrs y 192 hrs) . Tabla 18. Formulaciones de Fosfato de Sodio y Sulfato de Sodio Mues ra Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Después de Después de Después de Después de 19 horas, 48 horas, 120 horas, 192 horas, nmoles/min nmoles/min nmoles/min nmoles/min (Actividad, (Actividad, (Actividad, (Actividad, U/mg) U/mg) U/mg) U/mg) Control, 33.701 N/A N/A N/A 4 grados 35.646 C 40.353 0.37 mg/ (197.66) mi Na2HP04 0.05 M #1 0.185 N/A N/A N/A 0.2766 (1.25) #2 0.984 N/A N/A N/A Na2S04 0.777 0.15M (4.8) #3 1.3588 N/A N/A N/A Na2S04 1.3924 0.22M (7.44) #4 1.9721 N/A N/A N/A Na2S04 1.8339 0.3M (10.29) Muestra Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Después de Después de Después de Después de 19 horas, 48 horas , 120 horas, 192 horas, nmoles/min nmoles/min nmoles/min nmoles/min (Actividad, (Actividad, (Actividad, (Actividad, U/mg) U/mg) U/mg) U/mg) Na2HP04 0.1M #5 1.1044 N/A N/A N/A 0.9543 (5.56) #6 1.6853 N/A N/A N/A Na2S04 1.4162 0.15M (8.38) #7 2.7917 N/A N/A N/A Na2S04 2.5572 0.22 (14.46) #8 3.3989 N/A N/A N/A Na2S04 3.8001 0.3M (19.46) Na2HP04 N/A N/A N/A 0.1M #9 3.9975 N/A N/A N/A 3.2614 Muestra Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Después de Después de Después de Después de 19 horas, 48 horas, 120 horas, 192 horas, nmoles/min nmoles/min nmoles/min nmoles/min (Actividad, (Actividad, (Actividad, (Actividad, U/mg) U/mg) U/mg) U/mg) (19.62) #10 7.7154 N/A N/A N/A Na2S04 5.48 0.15M (35.66) #11 5.1651 ?/? N/A N/A Na2S04 4.9371 0.22M (27.3) #12 8.4036 2.64 0.06 N/A Na2S04 8.6568 3.24 0.23 0.3M (46.1) (15.89) 0.1 0.02 (0.27) precip #13 11. 95 8.08 1.15 N/A 14.978 9.74 1.05 (72.9) 9.97 1.41 #14 20.921 17.2 5.29 N/A Muestra Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Después de Después de Después de Después de 19 horas, 48 horas, 120 horas, 192 horas, nmoles/min nmoles/min nmoles/min nmoles/min (Ac i idad, (Actividad, (Actividad, (Actividad, U/mg) U/mg) U/mg) U/mg) Na2S04 17.78 15.5 5.25 0.15M (104.6) (88.38) (1 .2) precip #15 20.066 14.5 7.48 N/A Na2S04 22.769 19.0 9.75 0.22M (115.77) 15.26 (23.3) precip 11.72 (81.7) #16 18.07 16.4 13.4 N/A Na2S04 16.462 18.1 12.4 0.3 M (93.32) 12.8 8.2 19.0 (30.5) recip (90.0) Na2HP04 N/A .75M #17 30.481 22.3 20.3 13.234 cABCI 27.388 28.7 7.0 13.749 28.128 30.9 9.1 (73) (154.95) 26.1 13.8 Los datos para las muestras de 19 horas se resumen en la Tabla 19 como por ciento de actividad restante . Tabla 19. Por ciento de Actividad Después de 19 Horas Na2HP04 0.05M 0.1M 0.2M 0.4M 0.75M Na2S04 0 0.6 2.8 9.9 37.0 78.7 0.15M 2.4 4.3 18.1 53.1 NA 0.22M 3.8 7.4 13.9 58.8 NA 0.3M 5.2 9.9 23.4 47.4 NA Aunque el sulfato de sodio parece mejorar la estabilidad de CABCI, la protección de fosfato parece ser más pronunciada. Amortiguador fosfato de sodio 0.75 M se elige para formulaciones cABCI,para utilizar a 37 grados C. Este amortiguador no se elige para formulaciones que pueden almacenarse a menores temperaturas debido a su propensión a precipitar. EJEMPLO 11 Este ejemplo ilustra el efecto de concentración enzimática en su estabilidad térmica. Muestras se suspendieron en fosfato 0.75 ?,?? 7.4, Acetato de Na 50 mM. Para determina el rango operativo de concentración cABCI, estabilidad térmica de cABCI a diferentes concentraciones enzimáticas se midió. Se observó que cABCI a bajas concentraciones fue tan estable como cABCI a altas concentraciones (ver Tabla 20) . También se encontró que cABCI a altas concentraciones tiende a precipitar después de prolongada exposición a 37 grados C. Para evitar este problema, por ejemplo concentraciones de cABCI pueden mantenerse inferiores a aproximadamente 0.4 mg/ml como se muestra en la Tabla 20. Tabla 20. Estabilidad a 37 grados C de muestras de cABCI a diferentes concentraciones enzimáticas en amortiguador Fosfato de Na a 0.75M cABCI 120 horas a 37 192 horas a 37 grados grados c, c, Velocidades Velocidades nmoles/min (actividad, raaoles/min U/mg) (actividad, ü/mg) 0.75 precipitado 2.7; 2.5 (14) 0.35 precipitado 13.2; 13.7 (73) 0.18 14.6; 20.6; 14.7; 15.3 24.4 (81) (107.4) 0.09 20.4; 18.0 11.0; 12.9 (103.8) (65) SDS-PAGE y Análisis de transferencia Western de la cABCI recombinante revelaron fragmentación parcial de cABCI después de almacenamiento prolongado a 4 grados C. La observación que los productos de degradación son los mismos tanto para proteínas recombinantes como nativas, sugiere que la fragmentación observada puede deberse a una propiedad intrínsica de CABCI. El extremo amino terminal de los productos de degradación fue secuenciado. Estos resultados revelaron que la mayoría de los productos de degradación fueron una mezcla de fragmentos de proteína. Banda #1: ATSNPAF (SEQ ID NO: 3); Banda #2: ATSNPAF mayor (SEQ ID NO: 4) ; NLNTSGD menor (SEQ ID NO: 5); Banda #3: ASNPAFD (SEQ ID NO: 6) más una mezcla de secuencias; Banda #4: XiX2NX3V-X4-X5 (SEQ ID NO: 7) mezcla en donde Xi puede ser A o N; X2 puede ser T o P; X3 puede ser T o E; X4 puede ser A o G; y X5 puede ser F o E; Banda #5: X1X2 X3X4X5 (SEQ ID NO: 8) mezcla en donde ?? puede ser A o N; X2 puede ser T o Y; X3 puede ser T o P; X4 puede ser A o E; X5 puede ser A o G; Banda #6: MQVNERD mayor (SEQ ID NO: 9); GPRGAGT menor (SEQ ID NO: 10); Banda #7: no se identificó secuencia; Banda #8: ATSNPAF (SEQ ID NO: 11). EJEMPLO 12 Este ejemplo muestra los resultados de un método de purificación para la purificación de condroitinasa AC. Las células que expresan condroitinasa AC se extrajeron utilizando un sonicador de punta cuadrada a velocidad máxima aproximada de 9. La sonicación se realizó por aproximadamente 30 segundos. Esto fue seguido inmediato por aproximadamente 10 segundos sin sonicación. Estas etapas de encendido/apagado se realizaron por un total de aproximadamente 10 ciclos. Cada precipitado se sónico por separado y después se recolectó. Las extracciones se oscilaron durante la noche a 4 grados C.

Después de extracción celular de la condroitinasa AC, la muestra sonicada se analizó en SS-PAGE, para analizar la solubilidad de la proteina condroitinasa AC. La enzima fue detectada primordialmente en el sobrenadante, implicando que la proteina es soluble. La purificación se continuó utilizando una columna de intercambio de cationes para capturar la enzima. Todo el extracto celular se cargó en una columna SP de 20 mi. El extracto se cargó en la columna a aproximadamente 0.5 ml/min. La columna SP se conectó al acta Explorer para ver picos de lavado y elución. La columna se lavó y se eluyó la condroitinasa AC. Las fracciones de columnas se analizaron en SS-PAGE para verificar pureza y análisis de gel reveló que la condroitinasa AC eluyó de aproximadamente NaCl 245 mM a aproximadamente NaCl 370 mM. El análisis SDS-PAGE reveló que las fracciones eluidas contienen relativamente pura condroitinasa AC y se recolectaron resultando en un volumen total de 190 mi. Los 190. mi de fracciones recolectadas se concentraron utilizando una membrana 10000 MWCO (Millipore) hasta un volumen total de 105 mi con una absorbancia (A280) de 1.47. La muestra concentrada se purificó adicionalmente utilizando una columna de filtración en gel.

Muestras de la etapa de intercambio de cationes se cargaron en una columna de filtración de gel S200. Las muestras se eluyeron utilizándose datos de sodio 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5.5. La primera corrida de purificación a través de la columna de filtración de gel se analizó en SS-PAGE para verificar la pureza. Las fracciones que revelaron una condroitinasa AC relativamente pura se recolectaron. Siguiendo la primera purificación a través de la columna, las muestras de fracciones de nuevo se verificaron en SS-PAGE para pureza. Las fracciones que revelan una condroitinasa AC relativamente pura de todas las 7 corridas se reunieron, para un volumen total de 250 mis con una absorción (A280) de 0.431. Los 250 mis se concentraron hasta un volumen total de 83 mis con absorción (A280) de 1.40. La remoción de endotoxina de la muestra de condroitinasa AC se logró por adicional purificación de la muestra aislada a partir de la etapa de filtración en gel. Las muestras se centrifugaron a través de una membrana de intercambio de aniones Q (como se describe en otra parte aquí) y se recolectó condroitinasa AC en un modo de flujo pasante. Este método se verificó a aproximadamente pH 5.5. Acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, NaCl 100 mM se encontró que es un amortiguador efectivo para enlace de endotoxina a membranas Q, estas condiciones de pH y sal se espera que retiren aproximadamente 75 % de endotoxinas. La absorción resultante (A280) fue 1.37. El producto final se analizó en SS-PAGE por pureza. Los resultados revelaron una condroitinasa AC pura con un peso molecular de aproximadamente 50 a 75kDa. La condroitinasa AC purificada se dializó en un amortiguador volátil de bicarbonato de amonio 0.1 M pH 8.0 durante la noche y tomaron alícuotas en pequeñas muestras (aproximadamente 1.0 mi) liofilizó y almacenó a "80 grados C. La Figura 12 muestra el SS-PAGE de la condroitinasa AC purificada final. Aunque la presente invención se ha descrito en detalle considerable con referencia a ciertas modalidades preferidas de la misma, son posibles otras versiones. Por lo tanto, el espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas no habrán de limitarse a la descripción y las versiones preferidas contenidas en esta especificación.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación que comprende condroitxnasa y amortiguador fosfato, en donde la formulación es estable por al menos a aproximadamente 24 horas. 2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa está purificada. 3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa tiene al menos aproximadamente 50 % del a actividad a aproximadamente 24 horas. . La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa se elige el grupo que consiste de condroitinasa, ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B o enzimas de mamífero con actividad tipo condroitinasa tales como Hyal 1, Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20. 5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa es condroitinasa ABCI. 6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa es condroitinasa AC. 7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el amortiguador fosfato es amortiguador fosfato de sodio. 8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el amortiguador fosfato de sodio está a una concentración de aproximadamente 100 mM. 9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque además comprende acetato de sodio. 10. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación está a un pH de aproximadamente 7.4. 11. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la condroitinasa ABCI es una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 12. Una formulación que consiste esencialmente de condroitinasa y un amortiguador. 13. Un método para purificar condroitinasa que comprende: extraer la condroitinasa de las células, separar condroitinasa del extracto, retirar contaminantes e impurezas; y retirar endotoxina. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la condroitinasa comprende una condroitinasa recombinante. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14 caracterizado porque la condroitinasa recombinante es una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la extracción incluye suspender células en una solución amortiguadora que contiene un agente tensioactivo. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente tensioactivo es Tritón X. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la extracción incluye sonicar las células. 19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la separación de la condroitinasa incluye utilizar una columna de intercambio de cationes. 20. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la remoción de contaminantes e impurezas incluye utilizar una columna de filtración en gel . 21. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la eliminación de endotoxina incluye utilizar una columna de intercambio de aniones . 22. El método de conformidad con la reivindicación 13, además comprende diálisis. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la diálisis incluye utilizar un amortiguador volátil. 24. El método de conformidad con la reivindicación 13, además comprende secado. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el secado es liofilización . 26. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la condroitinasa se elige el grupo que consiste de condroitinasa, ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B o enzimas de mamífero con actividad tipo condroitinasa tales como Hyall, Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20. 27. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la condroitinasa es condroitinasa ABCI. 28. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la condroitinasa es condroitinasa AC. 29. Una condroitinasa purificada en conformidad con la reivindicación 13. 30. Método para purificar condroitinasa, caracterizado porque comprende las etapas de: extraer la condroitinasa de la célula; cromatograf a de intercambio de cationes; cromatografía de filtración de gel; filtración de intercambio de aniones; y diálisis.