ME00973B - Humana antitjela prema humanom cd20 i postupak njihovog korišćenja - Google Patents

Abstract

Humano antitijelo ili antigen-vezujući fragment antitijela koji specifično vezuje humani CD20, u stanju je da indukuje citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) i može produžiti vrijeme preživljavanja bez simptoma između oko 2-puta do oko 9-puta ili više u  odnosu na životinje tretirane kontrolom. na mišjem modelu humanog limfoma. Antitijelo ili njihov fragment koji vezuje antigen, koristan je u terapeutskom postupku za liječenje bolesti ili stanja, posredovanih sa CD20, kao što je, primjera radi, non-Hodgkinov limfom,  reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, Crohnova bolest, hronična limfocitna leukemija i inflamatorne bolesti.

Description

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na humana antitela i fragmente antitela, koji su specifični za humani CD20. na njihove farmaceutske smeše i terapeutskc postupke.

Stanje srodnih oblasti

CD20 (poznat, takođe, kao diferencijacijski antigen ograničen humanim B limfocitima ili Bp35; B-limfocitni površinski antigen BI, Leu-16, BM5 i LF5) je hidrofobni transmembranski protein sa molekulskom težinom od ~35 kD, koji se ekspresuje na pre-B i zrelim B limfocitima (Valentine et al. (1989) J Biol Chcm 264: 11282; Finfield et al. (1988) EMBO J 7: 711-717). Aminokiselinska sekvenca humanog CD20 je prikazana u SEQ 1D NO: l (GenBank Accession No. NP 690605). Anti-CD20 antitela su opisana, primora radi, u US 5. 736, 137. WO 2004/056312 i US 2004/0167319.

Postupci proizvodnje antitela, koja su korisna kao humani terapeutski agensi, uključuju proizvodnju himeričnih antitela i humanizovanih antitela (vidi. na primer, US 6. 949, 245). Vidi takode. primora radi. WO 94/02602 i US 6. 596, 541, koji opisuju postupke proizvodnje genetski modifikovanih miševa, koji su u stanju da proizvode antitela, korisna za izradu humanih terapeutika.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje humana antitela, poželjno rekombinantna humana antitela, koja specifično vezuju humani CD20. Ova antitela su karakterisana specifičnim vezivanjem za humani CD20 i posredovanjem u uništavanju ćelija B-ćelijskog limfoma, koje ekspresuju CD20. Antitela mogu biti pune dužine (na primer, IgGl ili lgG4 antitelo) ili mogu sadržavati jedino antigen-vezujući deo (na primer. Fab. F(ab')2 ili scFv fragment), i mogu biti modilikovana kako bi ispoljila funkcionalnost, npr., da bi se uklonile ili pojačale funkcije rezidualnog elektora (Rcddy et al. (2000). 1. Immunol. 164: 1925-1933).

Antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment specifično vezuje humani CD20 i u stanju je da indukuje komplement zavisnu citotoksičnosl (CDC) ćelija koje ekspresuju CD20. u prisustvu komplementa, pri čemu antitelo u koncentraciji od oko 10 nM ili manje, indukuje 50% ližu Daudi i RL ćelija u prisustvu 5% normalnog humanog seruma sa komplementom. U poželjnim ostvarenjima, koncentracija antitela koja izaziva 50% ližu je oko 5 nM ili manja; oko 2 nM ili manja ili oko 1 nM ili manja. U jednom ostvarenju, antitelo ili njihov fragment pokazuje EC50 0. 2 nM ili manje, kao stoje mereno u Daudi ćelijama, ili EC50 od 0. 4 nM ili manje, kao što je mereno uz pomoć RL ćelija. U raznim ostvarenjima, antitelo ili fragment antitela u stanju su da produže vreme preživljavanja bez simptoma između oko 2-puta do oko 9-puta ili više, u odnosu na životinje tretirane kontrolom na mišjem modelu humanog limfoma.

Antitelo ili njihov fragment specifično vezuje humani CD20 i u stanju je da indukuje 0 antitelu zavisnu celularnu citotoksičnost (ADCC) ćelija koje ekspresuju CD20 u prisustvu mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), pri čemu antitelo pokazuje EC50 od oko 1 nM ili manje, kao što je mereno u Daudi ćelijama. U poželjnim ostvarenjima, antitelo pokazuje EC50 od oko 50 pM ili manje; oko 20 pM ili manje; oko 10 pM ili manje. U poželjnom ostvarenju, antitelo koje pokazuje povećanu ADCC aktivnost, može uključiti smanjene nivoe fukozilacije. na primer. oko 5% fukoze.

U jednom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući dco antitela pronalaska sadrži sckvencu varijabilnog regiona teškog lanca (11CVR). odabranu iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 3, 19. 23, 27. 43. 47, 51. 67, 71, 75. 91. 95. 99. 1 15. 119, 123, 139. 143, 147, 163, 167. 171. 187. 191, 195, 21 1. 215. 219, 235, 239. 243, 259, 263, 267, 283, 287, 291. 307. 311. 315, 331, 335, 339. 355. 359. 363. 379. 383. 387. 395 i 403, ili sekvenca suštinski slična njima. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment sadrži HCVR sekvcncu. odabranu iz grupe, koju čine SEQ ID NO; 339. 195 i 243.

U još specifičnijem ostvarenju, antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment dalje sadrži sckvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR). odabranu iz grupe, koju sačinjavaju SEQ 1DN0: 1 1. 21, 25, 35. 45. 49, 59. 69. 73, 83. 93. 97, 107. 1 17, 121, 131, 141. 145, 155, 165. 169. 179. 189, 193. 203, 213. 217, 227. 237. 241. 251. 261. 265, 275, 285. 289, 299. 309, 313, 323. 333. 337. 347, 357. 361, 371, 381 i 385. ili sekvenca

suštinski slična njima. U poželjnom ostvarenju, antitclo ili lragment sadrži LCVR, odabranu iz grupe, koju čine SEQ ID NO: 347. 203 i 251.

U specifičnim ostvarenjima, antitelo ili njihov tragment sadrži par HCVR/LCVR sekvenci. odabran iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 3/ll, 19/21. 23/25. 27/35, 43/45. 47/49, 51/59, 67/69, 71/73, 75/83, 91/93, 95/97, 99/107, 115/117, 119/121, 123/131. 139/141, 143/145, 147/155. 163/165, 167/169, 171/179, 187/189, 191/193, 195/203, 211/213, 215/217. 219/227. 235/237, 239/241, 243/251, 259/261, 263/265, 267/275. 283/285. 287/289, 291/299. 307/309, 31 1/313. 315/323. 331/333, 335/337, 339/347. 355/357, 359/361. 363/371. 379/381 i 383/385. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili njihov fragment sadrži par sekvenci MCVR/LCVR. odabran iz grupe, koju čine SEQ ID NO: 339/347. 195/203 i 243/251.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline, koji kodiraju antitelo ili njihov fragment. U specifičnim ostvarenjima, molekuli nukleinske kiseline kodiraju HCVR, pri čemu je nukleotidna sekvenca odabrana iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 2, 18, 22. 26. 42, 46, 50. 66. 70. 74. 90. 94, 98. 114, 118. 122. 138. 142, 146. 162. 166. 170, 186. 190, 194. 210, 214. 218, 234. 238. 242, 258, 262, 266. 282. 286. 290. 306. 310. 314. 330. 334, 338. 354. 358. 362. 378. 382. 386, 394 i 402. ili njima suštinski identična sekvenca. U srodnom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira LCVR, pri čemu je nukleotidna sekvenca odabrana iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 10, 20. 24, 34, 44. 48. 58, 68. 72. 82. 92. 96. 106. 116. 120. 130. 140. 144, 154. 164, 168. 178. 188. 192. 202. 212, 216, 226. 236, 240, 250. 260. 264. 274, 284. 288, 298. 308. 312, 322. 332, 336. 346, 356, 360, 370. 380 i 384. ili njima suštinski identična sekvenca. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela sadrži HCVR. koju kodira molekul nukleinske kiseline, odabran iz grupe, koju čine SEQ ID NO: 338, 194 i 242, i LCVR. koju kodira molekul nukleinske kiseline, koji je odabran iz grupe, koju čine SEQ ID NO: 346. 202, odnosno 250.

U trećem aspektu, pronalazak prikazuje antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, koji sadrži CDR3 teškog lanca (HCDR3). koja obuhvata aminokiselinsku sckvcncu, odabranu iz. grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 9. 33. 57. 81, 104, 129, 153, 177. 201, 225. 249, 273, 297, 321, 345. 369. 393. 401 i 409; i CDR3 lakog lanca (LCDR3). koji sadrži aminokiselinsku sckvcncu. odabranu iz grupe, koju sačinjavaju

SEQ ID NO: 17, 41. 65, 89. 113, 137. 161. 185. 209. 233. 257. 281, 305. 329. 353 i 377. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili njihov fragment sadrži HCDR3 i LCDR3 sekvencu, odabranu od parova HCDR3/LCDR3 sekvenci SEQ ID NO: 345/353. 201/209 i 249/257.

U još specifičnijem ostvarenju, antitelo ili njihov fragment, dalje sadrži sckvcncu CDR1 domena teškog lanca (HCDR1). koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 5, 29. 53, 77. 101. 125. 149, 173, 197. 221. 245. 269. 293, 317. 341. 365, 389, 397 i 405; sekvcncu domena teškog lanca CDR2 (HCDR2). odabranu iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 7. 31. 55. 79. 103, 127. 151. 175. 199, 223, 247. 271, 295. 319, 343. 367. 391. 399 i 407: sekvencu CDR1 domena lakog lanca (LCDR1), koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 13, 37. 61, 85. 109, 133, 157, 181. 205, 229, 253. 277. 301, 325, 349 i 373: i sekvencu CDR2 domena lakog lanca (LCDR2), koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 15, 39. 63, 87, 111, 135. 159, 183, 207. 231. 255. 279, 303. 327. 351 i 375. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili njihov fragment, sadrži sekvence CDR-a teškog i lakog lanca, odabrane iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 341. 343. 345, 349. 351 i 353; 197. 199, 201, 205. 207 i 209; i 245. 247. 249, 253. 255, odnosno 257.

U četvrtom aspektu, pronalazak prikazuje izolovane molekule nukleinske kiseline, koje kodiraju antitelo ili antigen-vezujueće fragmente pronalaska, pri čemu su molekuli nukleinske kiseline, koji kodiraju HCDR3 domen i LCDR3 domen. odabrani iz grupe, koja je sastavljena od SEQ ID NO: 9 i 16; 33 i 41; 57 i 65; 81 i 89; 104 i 113; 129 i 137; 153 i 161; 177 i 185; 201 i 209; 225 i 233; 249 i 257; 273 i 281; 297 i 305; 321 i 329; 345 i 353. odnosno 369 i 377.

U petom aspektu, pronalazak prikazuje antitelo ili antigen-vezujući fragment, koji sadrži HCDR3 domen i LCDR3 domen. pri čemu HCDR3 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa formulom: X1- X2- X3- X4- X5- X6- X7- X8- X9- X10- X11-X12- X13- X14- X15- X16- X17- X18- X19 (SEQ ID NO: 412), u kojoj je: X1-A, V ili T; X2 K; X3=D: X4= P, F ili G: X5=S ili II: X6= Y; X7= G: X8-S ili H; X9 G ili F: X10=S ili Y; X11 Y. N ili S; X12 Y. G ili H; X13-G, L ili S; X14-Y, M ili D; X15=Y. D ili V; X19 G. V ili odsutan; X17 M ili odsutan; X18 D ili odsutan; X19 V ili odsutan; a LCDR3 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa tormulom: X1- X2- X3- X4- X5- X6- X7- X8-

X9 (SEQ ID N0: 415). u kojoj je: X1=Q; X2=Q; X3=R ili S; X4 =N. Y ili F; X5=N, D ili Y; X6 W; X7 P: X8 L; X9 =T.

U još specifičnijem ostvarenju, antitclo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži CDR1 i CDR2 domene teškog i lakog lanca, pri čemu HCDR1 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa formulom: X1- X2- X3- X4- X5- X6- X7- X8 (SEQ ID N(): 410), u kojoj je: X1 G; X2-=F ili I: X3 1; X1 F; X -11, R ili Y; X6-D: X7=Y; X =T ili A; HCDR2 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa formulom: X1- X2- X3- X4-X5- X6- X7- X8 (SEQ ID NO: 411), u kojoj je: X1 =I; X2-S; X3-W; X4-N; X3=S; X6=G ili D; X7 S, Y ili T; X8 I ili L; LCDR1 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa formulom: X1- X2- X3- X4- X5- X6 (SEQ ID N(): 413). u kojoj je: X1 Q; X2=S; X3=V ili I; X4 S; X5 =S ili R: X6 Y ili N; a LCDR2 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu sa formulom: X1- X2- X3 (SEQ ID NO: 414). u kojoj je: X1 =H, G ili V; X2 -A; X =S.

U šestom aspektu, pronalazak obezbeduje rekombinantne ekspresione vektore, koji nose molekule nukleinske kiseline pronalaska, i ćelije domaćina u koje se takvi vektori uvode, kao i postupke izrade antitela ili njihovih fragmenata iz pronalaska, koji se dobijaju kultivacijom domaćinskih ćelija pronalaska. Ćelija domaćina može biti prokariotska ili eukariotska ćelija, poželjno je ćelija domaćina ćelija E. coli ili ćelija sisara. kao što je CHO ćelija. U poželjnom ostvarenju, može biti proizvedeno antitelo sa raznim obimima lukozilacije. Na primer, može biti odabran CHO ćelijski niz da bi se proizvelo antitelo ili fragment antitela sa rasponom fukozilacije od minimuma od oko 5% do maksimuma od oko 95%.

U sedmom aspektu, pronalazak prikazuje larmaceutsku smešu koja sadrži antitclo ili njihov fragment protiv humanog CD20 i larmaceutski prihvatljiv nosač.

U osmom aspektu, pronalazak opisuje potpuno humano antitelo ili lragment antitela. koji je u stanju da se vezuje na humani CD20. sa EC50 manjim od oko 10 nM, kao što je izmereno eksperimentima ćelijskog vezivanja (opisanim u nastavku). U poželjnom ostvarenju, antitelo pronalaska pokazuje EC50 od oko 108 do oko 10 M ili više. na primer. najmanje 10-8 M, najmanje 10-9 M. najmanje 10-10 M, najmanje 10 M ili najmanje 10-12 M. kada se meri vezivanjem za antigen, koji je prisutan na ćelijskoj površini.

Pronalazak obuhvata anti-CD20 antitcla. koja poscduju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim aplikacijama, može biti od koristi modifikacija za uklanjanje nepoželjnih glikozilacijskih položaja, ili antitclo bez fukoznog dela prisutnog na oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se pojačala funkcija celularne citotoksičnosti, zavisne od antitela (ADCC) (vidi Shield ct al. (2002) JBC 277: 26733). U drugim aplikacijama, može se izvesti modifikacija galaktozilacije, kako bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

U devetom aspektu, pronalazak prikazuje antitclo ili antigen-vezujući fragment antitela, kao što je prethodno opisano, da bi se koristili za slabljenje ili inhibiranje bolesti ili stanja, posredovanog sa CD20, kod čovelca. U poželjnom ostvarenju, lcčena bolest ili stanje je: nonHodgkinov limfom. reumatoidni artritis, sistemski lupus critematozus. Crohnova bolest, hronična limtocitna leukemija i inflamatorne bolesti. U srodnom ostvarenju, pronalazak obuhvata postupak umanjivanja ili inhibiranja bolesti ili stanja, posredovanog sa CD20, kod čoveka, koji uključuje primenu terapeutski delotvornc količine antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela. kao što je prethodno opisano. Nadalje, pronalazak obuhvata korišćenje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela iz. pronalaska u izradi leka koji bi se koristio za umanjivanje ili inhibiranje bolesti ili stanja, posredovanog sa C D20. kod čoveka.

Drugi ciljevi i prednosti postade jasni iz prikaza detaljnog opisa, koji sledi.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1. Kriva preživljavanja bez simptoma. Prikazani su rezultati za kontrolu humanih kc. kontrolna antitela I i II i antitela: 8(16-5. 9D4-7. 101-2-13 i 71: 1-13.

DETALJAN OPIS

Pre opisa ovih postupaka, treba prihvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na pojedine, opisane postupke i eksperimentalne uslovc. budući da takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takode treba razumeti da je terminologija ovde korišćena samo za potrebe opisivanja pojedinih ostvarenja, a nije određena s namerom ograničavanja, budući da će okvir ovog pronalaska biti ograničen jedino priključenim patentnim zahtevima.

Ukoliko nije drugačije definisano. svi tehnički i naučni izrazi, koji su ovde upotrebljeni, imaju isto značenje kao što to uobičajeno podrazumeva lice uobičajene stručnosti u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako u praktičnom izvođenju ili testiranju ovog pronalaska, može biti upotrebljen bilo koji od postupaka i materijala, koji su slični ili ekvivalentni ovde opisanim, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.

Definicije

Izraz "CD20" uključuje varijante i izoforme humanog CD20. koji se prirodno ekspresuju od strane ćelija. Vezivanje antitela pronalaska za CD20 antigen posreduje u uništavanju ćelija koje ekspresuju CD20 (na primer. tumorska ćelija). Uništavanje ćelija koje ekspresuju CD20 može se izvesti brojnim načinima, koji uključuju komplement zavisnu citotoksičnost (CDC) ćelija koje ekspresuju CD20. apoptozu ćelija koje ekspresuju CD20, elektor ćelijsku fagocitozu ćelija koje ekspresuju CD20 ili celularnu citotoksičnost (ADCC) ćelija, koje ekspresuju CD20, zavisnu od antitela elektor ćelije.

Izraz "antitelo", kao stoje ovde korišćen. određenje s namerom da se odnosi na imunoglobulinske molekule, koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde označen skraćenicom HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanea. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena. CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde označen skraćenicom LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). VH i VL regioni mogu biti dalje podcijeni u regione hipervarijabiliteta, koji su nazvani regionima koji određuje komplementarnost (CDR), koji su protkani regionima koji su očuvaniji, a koji se nazivaju regionima okvira (FR). Svaki VII i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, koji su raspoređeni od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redosledom: FRL CDR1, FR2. CDR2, FR3. CDR3, FR4.

Izraz "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela” ili "fragment antitela”). kao što je ovde korišćen. odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela. koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr.. hCD20). Pokazalo sc da fragmenti antitela pune dužine mogu izvršiti antigen-vezujuću funkciju antitela. Primeri vezujućih fragmenata sadržanih u okviru izraza "antigen-vezujući deo”

antitela uključuju: (i) Fab fragment, monovalentni fragment, sastavljen od VL, VH, CL1 i CH1 domena; (ii) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment, koji sadrži dva F(ab)’ fragmenta, povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd lragment, sastavljen od VII i CH1 domena: (iv) Fv fragment sastavljen od VL i VFI domena pojedinačnog kraka antitela; (v) dAb fragment (Ward el al. (1989) Nature 241: 544-546), koji se sastoji od VII domena i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VII. kodirana od strane zasebnih gena, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih postupaka, uz pomoć sintetske spojnice, koja im omogućuje da budu izrađeni u vidu pojedinačnog bliskog lanca, u kome se VL i VH regioni sparuju, da bi se obrazovali monovalentni molekuli (poznati kao pojedinačni lanac Fv (scFv): vidi npr.. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 i Iluston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takva jcdno-lančana antitela su, takođe, utvrđena s namerom da budu obuhvaćena unutar okvira izraza antigen-vezujući deo antitela. Drugi oblici jedno-lančanih antitela, kao što su diantitela, takođe su uključeni (vidi npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448).

“CDR" ili region koji određuje komplementarnost je region

hipervarijabiliteta, koji je protkan regionima koji su očuvaniji, a koji se nazivaju "regionima okvira" (FR). U raznim ostvarenjima anti-hCD20 antitela ili fragmenta pronalaska, FR-i mogu biti identični sckvencama humane germinativne linije, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani.

Izraz “površinska plazmon rezonanca", kao što je ovde korišćen. odnosi se na optički fenomen, koji omogućuje analize interakcija realnog vremena, otkrivanjem promena koncentracija proteina unutar malriksa biosenzora. na primer, koristeći BIACORETM sistem (Pharmaeia Biosensor AB).

Izraz "epitop" se odnosi na antigenu determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim antigen-vezujućim polož. ajem u varijabilnom regionu molekula antitela, koji je poznat kao paratop. Jedan antigen može posedovati više od jednog epitopa. Epitopi mouu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi prostornim nizanjem aminokiselina iz različitih segmenata jednog (ili više) linearnog polipeptidnog lanca (lanaca). Linearni epitop jeste epitop. koga proizvode susedni aminokiselinski

ostaci u polipeptidnom lancu. U određenom slučaju, epitop može uključiti druge delove, kao što su saharidi, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

Izraz "suštinska istovetnost" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njihov fragment, označava da. kada se optimalno poslože sa pogodnim nukleotidnim umecima ili deleeijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim strukom), postoji istovetnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 95% i poželjnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, kada se izmerc bilo kojim dobro poznatim algoritmom istovetnosti sekvence, kao što je FASTA, BLAST ili GAP. kao što je razmotreno u nastavku.

Kada se primeni na polipeptide. izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence. kada se optimalno poslože, kao, na primer, uz pomoć programa GAP ili BESTFIT, koristeći zadate težine pukotine, dele najmanje 95% istovetnosti sekvence. još poželjnije najmanje 98% ili 99% istovetnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka, koji nisu identični, razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. “Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom, koji poseduje bočni lanac (R grupa) sa sličnim kemijskim karakteristikama (npr., naboj ili hidrolbbičnost). Uopšteno. konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge po konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može se podesiti prema gore kako bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za izvođenje ovog podešanja dobro su poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Vidi. npr.. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim karakteristikama obuhvataju 1) alifatske bočne lance: glicin. alanin. valin, leucin i izoleucin; 2) alifatske-hidroksil bočne lance: scrin i trconin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin. tirozin i triptofan; 5) bazične bočne lance: lizin. arginin i histiđin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistcin i metionin. Poželjne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin. fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena

je bilo koja zamena koja ima pozitivnu vrednost u matriksu PAM250 log-vcrovatnoća, izloženom u Gonnct et al. (1992) Science 256: 1443-45. "Umereno konzervativna” zamena je bilo koja zamena koja ima ne-negativnu vrednost u PAM250 log-verovatnoća matriksu.

Sličnost sekvenei polipeptida se uobičajeno određuje korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina posloži slične sekvenee koristeći merenja sličnosti prenesena na razne supstitucije, delecije i druge modifikacije, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe, kao što su GAP i BKSTITT. koji se mogu koristiti sa zadatim parametrima, da bi se odredila homologija sekvenei ili istovetnost sekvenei između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njihovog mutanta. Vidi. npr.. GCG verzija 6. 1. Sekvence polipeptida se. takođe, mogu uporediti korišćenjem FASTA-e. sa zadatim ili preporučenim parametrima: program u GCG verziji 6. 1. FASTA-e (npr.. FASTA2 i FASTA3) pruža slaganja i procenat identičnosti sekvence regiona najboljeg preklapanja između ispitivanih i traženih sekvenei (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam, kada se upoređuje sekvcnca pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenei iz različitih organizama, je kompjuterski program BLAST. posebno BLASTP ili TBLASTN, uz korišćenje zadatih parametara. Vidi. npr.. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 i Altschul et al. (1997) Nuclcic Aeids Res. 25: 3389 402.

Izraz “efektivna količina" je koncentracija ili količina antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela. koja dovodi do postizavanja pojedinog navedenog cilja. "Hfektivna količina" anti-CD20 antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta antitela može se utvrditi empirijski. Nadalje, "terapeutski efektivna količina" je koncentracija ili količina anti-CD20 antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta, koja je delotvorna u postizavanju navedenog terapeutskog efekta. Ova količine se. takode, može odrediti empirijski.

Proizvodnja humanih antitela

Postupci za proizvodnju humanih antitela uključuju, primera radi, VeloeImmuneTM (Regeneron Pharmaceulicals). XenoMouseTM tehnologiju (Green et al.

(1994) Nature Geneties 7: 13-21; Abgenix). "minilokus" pristup i izloženost faga (i vidi, primera radi, US 5, 545, 807. US 6. 787. 637). VelocImmuneTM tehnologija (US 6, 596, 541) uključuje postupak proizvodnje potpuno humanog antitela visoke specifičnosti prema odabranom antigenu. Ova tehnologija obuhvata proizvodnju transgenskog miša, koji ima genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca, koji su operativno povezani sa endogenim lokusima konstantnog regiona miša. tako da miš proizvodi antitelo, koje sadrži humani varijabilni region i konstantni rcgion miša u odgovoru na antigenu stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela izolovana je i operativno povezana sa DNK. koja kodira konstantne regione humanog teškog i lakog lanca. DNK se. zatim, ekspresujc u ćeliji koja je u stanju da ekspresuje potpuno humano antitelo. U specifičnom ostvarenju, ćelija je CHO ćelija.

Antitela mogu biti terapeutski korisna u blokiranju interakcije ligand-receptor ili u inhibiranju interakcije receptorske komponente, prc nego u uništavanju ćelija posredstvom fiksacije komplementa (CDC) i participaciji u citotoksičnosti posredovanoj ćelijama u zavisnosti od antitela (ADCC). Konstantni region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u ćclijski zavisnoj citotoksičnosti. Stoga, izotip antitela može bit odabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.

Humani imunoglobulini mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa zglobnom heterogeničnošću. U jednom obliku, imunoglobulinski molekul sadrži stabilnu četvoro-lančanu konstrukciju od približno 150-160 kDa, u kojoj se dimeri drže zajedno pomoću interlačane disulfidne veze teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko interlančanih disullidnih veza. i obrazuje se molekul od oko 75-80 kDa. sastavljen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ovi oblici se veoma teško razdvajuju, čak nakon afmitetnog prečišćavanja. Učestalost pojavljivanja drugog oblika u raznim izotipovima intaktnog IgG jeste poslediea. ali bez ograničenja istima, strukturnih razlika, koje su povezane sa izotipom zglobnog regiona antitela. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu zgloba humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavljivanje drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) do nivoa koji se obično zapažaju kada se koristi zglob humanog IgG 1. Tekući pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3

rcgionu, što može biti poželjno, primora radi. u proizvodnji, da bi sc poboljšao prinos željenog oblika antitcla.

Antitela pronalaska se poželjno pripremaju korišćenjem Veloclmmune™ tehnologije. Transgenski miš u kome su varijabilni regioni teškog i lakog lanca endogenog imunoglobulina zamenjeni odgovarajućim humanim varijabilnim regionima je izazvan antigenom od značaja, a iz miša su povraćajem dobijene limfatične ćelije (kao što su B-ćelije). koje cksprcsuju antitela. I. imlatične ćelije mogu biti spojene sa ćelijskim nizom mijeloma, da bi se pripremili obesmrćeni ćelijski nizovi hibridoma, a takvi ćelijski nizovi hibridoma su skrinirani i odabrani, kako bi se identilikovali ćelijski nizovi hibridoma koji proizvode antitela, koja su specifična za antigen od značaja. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može biti izolovana i povezana na željene izotipske konstantne regione teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela može se proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerična antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može se izolovati direktno iz antigen-spccifičnih limlbcita.

Uopšteno, antitela tekućeg pronalaska poseduju veoma visoke afinitete, koji obično imaju Kd ili EC50 od oko 10-8 sve do oko 10-12 M ili više. primera radi. najmanje 10-8 M. najmanje 10-9 M, najmanje 10-10 M. najmanje 10-11 M ili najmanje 10-12 M, kada se meri vezivanjem za antigen, koji je prisutan na ćelijskoj površini.

U početku, izolovana su himerična antitela visokog afiniteta, koja imaju humani varijabilni region i konstantni region miša. Kao što je opisano u nastavku, antitela su okarakterisana i odabrana prema poželjnim karakteristikama, koje uključuju: afinitet, selektivnost, epitop itd. Konstantni regioni miša su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom, da bi se proizvelo potpuno humano antitelo pronalaska, na primer IgGl ili IgG4 divljeg tipa ili modifikovan (na primer. SEQ ID NO: 416, 417. 418). Budući da odabrani konstantni region može varirati u skladu sa specifičnom upotrebom, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti u odnosu na metu nalaze se u varijabilnom rcgionu.

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

Da bi se ispitala antitela koja se vezuju za pojedini epitop, može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je onaj koji je opisan u "Antibodies: A Laboratory ManuaF' 1988 Cold Spring Ilarbor Laboratory. Harlovv i Lane, eds.. Drugi postupci uključuju analize alaninskog snimanja mutanata, peptidnih mrlja (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) ili peptidnog cepanja. kao što je opisano u primerima ispod. Pored toga, mogu se koristiti postupci kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomcr (2000) Protein Science: 9: 487-496).

Da bi se utvrdile vezujuće karakteristike antitela. konstruisani su proteini mutant CD20, sastavljeni od odabranih aminokiselinskih supstitucija. Proteini mutant CD20 sadržavali su supstitucije određenih aminokiselina, koje se nalaze u humanom proteinu sa odgovarajućim aminokisclinama. koje se nalaze u proteinu miša. Ovaj pristup je pomogao da se utvrdi da su mutant proteini CD20 zadržali njihovu tercijarnu strukuru i. verovatno, bilo koje konformacione cpitopc. Vezivanje test antitela za ove mutant proteine CD20 upoređeno je sa vezivanjem kontrolnih (poznatih) CD20 antitela, kao što je izmereno pomoću FACS-a. Nijedno od antitela pronalaska nije pokazivalo profil vezivanja koji je bio identičan (u odnosu na svaki pojedini mutant) bilo kom od kontrolnih antitela.

Imunokonjugati

Pronalazak obuhvata humano anti-CD20 monoklonalno antitelo, koje je konjugovano na tcrapcutski deo ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresiv ili radioizotop. Citotoksični agensi uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primcri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje iinunokonjugata poznati su u struci, vidi, primera radi, WO 05/103081.

Bispccifičnosti

Antitela ovog pronalaska mogu biti monospccifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog

ciljnog polipeptida ili mogu sadržavati antigen-vezujuće domene, koji su specifični za više od jednog ciljnog polipeptida. Vidi. npr.. Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-69. Humana anti-CD20 antitela mogu biti povezana ili ko-ekspresovana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njihov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, ne-kovalentnim udruživanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela, kako bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja. Multispecifično antitelo pronalaska se može specifično vezivati i za ćeliju koja ekspresuje CD20 i za humanu efektor ćeliju koja ekspresuje polipeptid, kao što je humani Fc receptor, i/ili komponente kompleksa T ćelijskog receptora. U jednom ostvarenju, multispecifično antitelo pronalaska sadrži deo koji vezuje CD20 i citokin.

Terapeutska korišćenja

Humana antitela. antigen-vezujući fragmenti antitela. imunokonjugati i bispecifični molekuli pronalaska korisni su u terapeutskim postupcima za lečenje humanih bolesti, koje se sprečavaju ili ublažavaju inhibicijom rasta ćelija koje ekspresuju CD20 i/ili uništavanjem ćelije koje ekspresuju CD20. Mehanizam dejstva kojim su izvršena terapeutski postupci pronalaska uključuju uništavanje ćelija koje ekspresuju CD20 u prisustvu efektor ćelija, primera radi, pomoću CDC, apoptoze, ADCC, fagocitoze ili kombinacijom dva ili više ovih mehanizama. Mehanizam za ostvarivanje terapeutskog efekta molekula pronalaska može proizvesti direktno uništavanje ili inhibieiju ćelija koje ekspresuju CD20. ili indirektno, posredstvom inhibicije ćelija koje ne ekspresuju CD20, primera radi, ekspresovati strukturno srodni antigen na ćelijskoj površini (t. j., bez unakrsne neaktivnosti sa srodnim, ali funkcionalno različitim antigenima ćelijske površine). Ćelije koje ekspresuju CD20. a koje mogu biti inhibirane ili uništene korišćenjem humanih antitela pronalaska uključuju, na primer, tumorogene B ćelije.

Primeri bolesti ili stanja, koja se mogu lečiti ili ublažiti anti-CD20 antitelima i njihovim fragmentima, uključuju, ali bez ograničavanja istima, tumorogene bolesti, kao što su: B ćelijski limfom (NHL. prekursor B ćelijska limfoblastna leukemija/limfom,

neoplazme zrelih B ćelija. B eelijska hronična limfocitna leukemija/limfom malih limfocita, B ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom, limfom zaštitnih ćelija, folikularni limfom. limfom centra kožnog folikula, limfom B ćelija marginalne zone, leukemija vlasastih ćelija, limfom difuznih velikih B ćelija, Burkittov limfom, plazmacitom, mijelom plazma ćelija, post-transplantacioni limfoproliferativni poremećaj, Waldenstromova makroglobulinemija i anaplastični limfom velikih ćelija); imune bolesti, kao što su autoimune bolesti (psorijaza. psorijatični artritis, dermatitis. sistemska skleroderma i skleroza, inflamatorna bolest creva. Crohnova bolest, ulcerozni kolitis, respiratorni distres sindrom, meningitis, eneefalitis. uveitis, glomerulonefritis, ekcem, astma, ateroskleroza, deficijencija leukocitne adhezije. multipla skleroza, Raynaudov sindrom, Sjogrenov sindrom, dijabetes sa juvenilnim početkom, Reiterova bolest, Behcetova bolest, nefritis imunog kompleksa, IgA nelfopatija. IgM polineuropatije); imuno-posredovane trombocitopenijc. akutna idiopalska trombocitopenijska purpura i hronična idiopatska trombocitopenijska purpura, hemolitična anemija, mijastenija gravis, lupusni nefritis, sistemski lupus erilematozus. reumatoidni artritis, atopijski dermatitis, pemfigus, Gravesova bolest. Hashimotov tiroiditis, Wegenerova granulomatoza, Omennov sindrom, hronično bubrežno oštećenje, akutna infektivna mononukleoza, HIV i bolesti povezane sa herpes virusom; ozbiljni akutni respiratorni distres sindrom i horeoretinitis; bolesti i poremećaji, izazvani infekcijom B-ćclija virusom, kao što je Fpstein-Barr virus.

U specifičnom ostvarenju, ispitanik kome se daje antitelo dodatno je lečen hemoterapeutskim agensom, zračenjem ili agensom koji modulira (pojačava ili inhibira) ekspresiju ili aktivnost Fc receptora. kao što je citokin. Uobičajeno, citokini koji se primenjuju tokom tretmana uključuju: faktor koji stimuliše granulocitne kolonije (G-CSF), faktor koji stimuliše kolonije granuloeita-makrofaga (GM-CSF), gama-interferon (IFN-y) i tumor nekrozis faktor ( I NF). Uobičajeni terapeutski agensi uključuju, između ostalih, anti-neoplastične agense, kao što su: doksorubicin, cisplatin. bleomicin, karmustin, hlorambucil i eiklofosfamid.

Terapeutska primena i formulacije

Pronalazak obc/. bcđuje terapeutskc smeše koje sadrže antitela protiv humanog CD20 ili njihove antigen-vezujuće fragmente iz ovog pronalaska. Terapeutske smeše u skladu sa pronalaskom biće primenjenc sa pogodnim nosačima, ekscipijentima i drugim agensima, koji su uključeni u formulacije, da bi se obezbedio poboljšani prenos, oslobađanje, podnošljivost i slično. Uopšieno. nosači, ekscipijenti ili drugi agensi mogu uključiti, primera radi, ulja (npr.. kanole. pamučnog semena. kikirikija, šafranike, šušama, soje), masne kiseline i njihove soli i estre (npr., oleinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu), alkohole (npr.. ctanol, benzil alkohol), polialkohole (npr., glicerol, propilen glikole i polietilen glikole. npr.. PEG 3350), polisorbate (npr., polisorbat 20, polisorbat 80). želatin. albumin (npr.. humani serumski albumin), soli (npr., natrijum hlorid), sukcinsku kiselinu i njene soli (npr.. natrij um sukcinat), aminokiseline i njihove soli (npr., alanin. histidin, glicin. arginin. lizin), sirćetnu kiselinu ili njenu so ili estar (npr.. natrijum acetat. amonijum acetat), limunsku kiselinu i njene soli (npr., natrijum citrat). benzojevu kiselinu i njene soli, fosfornu kiselinu i njene soli (npr.. monobazni natrijum fosfat, dibazni natrijum fosfat), mlečnu kiselinu i njene soli, polimlečnu kiselinu, glutaminsku kiselinu i njene soli (npr., natrijum glutamat), kalcijum i njegove soli (npr., kalcijum hlorid. kalcijum acetat), fenol, šećere (npr., glukozu, saharozu, laktozu, maltozu. trehalozu). eritritol, arabitol. izomalt, laktitol, maltitol, manitol, sorbitol, ksilitol, nejonske surfaktante (npr., TWEEN® 20, TWEEN® 80), jonske surfaktante (npr., natrijum dodeeil sulfat), hlorobutanol, DMSO, natrijum hidroksid, glicerin, m-krezol. imidazol. protamin, cink i njegove soli (npr., cink sulfat), timerosal, metilparaben. propilparaben, karboksimetilcelulozu. hlorobutanol i heparin. Ostali ne-terapeutski agensi su opisani u US 7. 001, 892, posebno u Tabeli A. Mnoštvo pogodnih formulacija može sc naći u zbirci formula, poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, Pa). Ove formulacije obuhvataju. primera radi. praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je LIPOFECTIN1M), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcionc paste, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, karbovosak emulzije (polietilen glikole raznih molekulskih težina), polu-čvrste gelove i polu-čvrste mešavinc koje sadrže karbovosak. Bilo koja od prethodnih

mešavina može biti pogodna u lečcnjima i terapijama u skladu sa ovim pronalaskom, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji ni je inaktivisan formulacijom, a formulacija je u fiziološkoj kompatibilnosti i podnošljivosti sa putem primene. Vidi takođe Powell et al. PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 i navode u njima za dodatne informacije, koje se odnose na ekscipijente i nosače, koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.

Doza terapeutskih smeša može varirati u zavisnosti od starosti i veličine ispitanika kome se primenjuje. ciljne bolesti, stanja, puta primene i sličnog. Kada se antitelo ovog pronalaska koristi za lceenje raznih stanja i bolesti, koje su povezane sa aktivnošću CD20, uključujući non-Hodgkinov limfom, reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, Crohnovu bolest, hroničnu limfocitnu leukemiju, inflamatorne bolesti i slično kod odraslog pacijenta, pogodno je da se antitelo ovog pronalaska primenjuje intravenski, obično u pojedinačnoj dozi od oko 0. 01 do oko 20 mg/kg telesne težine, poželjno oko 0. 1 do oko 10 mg/kg telesne težine, još poželjnije oko 0. 1 do oko 5 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja ili bolesti, učestalost i trajanje lečenja može se prilagoditi. U drugoj parenteralnoj primeni i oralnoj primeni, antitelo se može primeniti u dozi, koja odgovara prethodno daloj dozi.

Poznati su razni sistemi oslobađanja koji se mogu primeniti na farmaceutske smeše pronalaska, npr.. inkapsuliranjc u liposomima. mikročestiee, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje su u stanju da ekspresuju mutant viruse, endocitoza posredovana receptorom (vidi, npr.. Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Postupci uvođenja uključuju, ali bez ograničavanja, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske. subkutane. intranazalne, epiduralnc i oralne puteve. Smeša se može primeniti bilo kojim pogodnim putem, na primer, putem infuzije ili bolus injekcije, apsorpcijom kroz. cpitelne ili mukokutane podloge (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza. itd. ). a može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Poželjno primena može biti sistemska ili lokalna.

Farmaceutska smeša može. isto tako. biti oslobođena u vezikuli, posebno liposomu (vidi Langcr (1990) Science 249: 1527-1533). U određenim situacijama, farmaceutska smeša može biti oslobođena u sistemu kontrolisanog oslobađanja. U jednom ostvarenju, može se koristiti pumpa (vidi Langcr, supra; Scfton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). U drugom ostvarenju, mogu biti korišćeni polimerni

materijali (vidi Medical Applications of ('ontrolled Release, Langer i Wise (eds. ), CRC Pres.. Boca Raton, Florida (1974); Controllcd Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Smolen i Bali (eds. ), Wiley. Ncw York (1984). U drugom jednom ostvarenju, sistem kontrolisanog oslobađanja može biti postavljen u blizini mete na koju dejstvuje smeša, zahtevajući tako samo Frakciju sistemske doze (vidi, npr.. Goodson, u Medical Applications of Controlled Release. supra, vol. 2, pp. 1 15-138, 1984).

Injekcioni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, kapajuće infuzije, itd. Ovi injekcioni preparati mogu biti pripremljeni opšte-poznatim postupcima. Na primer, injekcioni preparati mogu biti pripremljeni, npr.. rastvaranjem. suspendovanjem ili emulgovanjem, prethodno opisanog, antitela ili njegove soli, u sterilnom vodenom medij umu ili uljanom medijumu, koji se uobičajeno koriste za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, koristi se, primera radi, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor, koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koji se mogu kor; štiti u kombinaciji sa pogodnim agensom za rastvaranje, kao stoje alkohol (npr.. etanol), polialkohol (npr.. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr.. polisorbat 80, HCO-50 (polioksictilenski (50 mol) dovod hidrogenizovanog ricinusovog ulja)J, itd. Kao uljni medijum koristi se, npr., susamovo ulje, sojino ulje. itd.. koji sc mogu koristiti u kombinaciji sa agensom za rastvaranje, kao što je benzil benzoat. bmzil alkohol, itd. Tako pripremljena injekcija poželjno se puni u pogodnu ampulu.

Pogodno, ovde opisane farmaceutske smeše za oralno ili parenteralno korišćenje pripremaju sc u doznim oblicima u jedinici doze, prilagođenoj za podešavanje doze aktivnih sastojaka, kakvi oblici dozaže u jedinici doze uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule). supozi. orije, itd. Količina gore-pomenutog sadržanog antitela uopšteno jc oko 5 do 500 mg po obliku dozaže u jedinici doze; posebno u formi injekcije, poželjno je daje gore-pomenuto antitelo sadržano u oko 5 do 100 mg i u oko 10 do 250 mg za druge oblike dozaže.

PR1MERI

Sledeći primeri su prikazani tako da stručnim licima ove oblasti pruže potpuno izlaganje i opis kako sc pripremam i koriste postupci i smeše pronalaska, a nisu

dali s namerom da ograničavaju okvir onog što pronalazač smatra svojim pronalaskom. Preduzeti su napori da se obezbcdi tačnost u odnosu na upotrebljene brojčane iznose (npr., količine, temperatura, itd. ), ali bi se moglo računati sa nekim eksperimentalnim greškama i odstupanjima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je srednja molekulska težina, temperatura je u Celzijusovim stepenima, a pritisak je atmosferski ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Proizvodnja humanih ontitela prema humanom CD20.

Imunizacija glodara se može izvesti bilo kojim, u struci poznatim, postupkom (vidi. primera radi, Harlovv & Lane, eds. (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Nc\v York; Malik i Lillchoj, Antibody techniqucs: Academic Pess, 1994, San Diego). U jednom ostvarenju, ćelije koje ekspresuju CD20 primenjene su direktno miševima, koji imaju DNK lokuse, koji kodiraju i varijabilne regione teškog lanca humanog Ig i varijabilne regione Kappa lakog lanca (VelocImmuncTM, Regeneron Pharmaceuticals, Ine.; US 6, 596. 541). sa adjuvansom, kako bi se stimulisao imuni odgovor. Takav adjuvans može uključiti kompletni i nekompletni Freundov adjuvans, MPL+TDM adjuvantni sistem (Sigma) ili RIBI (muramil dipeptidi) (vidi O’Hagan, Vaccine Adjuvant, od Human Press, 2000, Totawa, NJ). Da bi se postigli visoki nivoi ekspresuje humanog CD20 na ćelijskoj površini, murini ćelijski nizovi, MG87 i/ili NS/0 ćelije su transfektovane sa plazmidom. koji kodira humani CD20. a ćelije koje ekspresuju visoke nivoe CD20, uvećane su korišćenjem FACS tehnologije. U jednom ostvarenju, CD20 se primenjuje indirektno kao plazmid DNK koja sadrži gen CD20, a CD20 je ekspresovan korišćenjem ekspresionog sistema proteina domaćina, da bi se proizveo protein antigena in vivo. FT oba pristupa, da bi se postigao optimalni imuni odgovor antitela, miševima su date dodatne injekcije svake 3~4 nedeljc. Imuni odgovor se prati imunim testom na ćelijskoj bazi, kao što je opisano u nastavku, pri čemu se imunim testom analiziraju uzorci seruma sa serijskim razblaženjima 1- do 3-puta. Serumski titar je defmisan kao razblaženje uzorka seruma, koje proizvodi test signal koji je dvostruko veći od pozadinskog signala. Kada životinje postignu svoj maksimalni imuni odgovor, B ćelije koje ekspresuju antitelo su prikupljene i spojene sa ćelijama mišjeg mijeloma, da bi se obrazovali hibridomi.

Primer 2. Skrining na antigen specifični hibridom

U primarnom skriningu. NS/0 ćelije (ATCC) su transfeklovane sa humanim genom CD20, a visoko-ekspresujuće ćelije (NS/0-hCD20 ćelije) su sjedinjene i držane u kulturi za korišćenje u kondicioniranim medijumima za skrining hibridoma, uopšteno oko 11 do 14 dana nakon spajanja. NS/0-hCD20 ćelije u RPMI 1640 sa 10% fetalnog telećeg seruma postavljene su na poli-D-lizin ploče sa 96 reakcionih čašica sa gustinom od 50. 000 ćelija po reakcionoj čašici. I libridoma-kondicionirani medij um je razblažen 5-pula i ostavljen da se, tokom 30 minuta, izvede vezivanje za ćelije. Ćelije su, zatim, fiksirane na ploče, sa dodatkom jednake zapremine 8% formaldehida tokom 20 minuta, nakon čega su sledila četiri uzastopna PBST ispiranja. Ploče su inkubirane sa 5% BSA, tokom 2 sata, na sobnoj temperaturi (RT). Nakon ispiranja, antitela. vezana na ploču, su inkubirana sa Fcγ-specifičnim poliklonalnim antitelima anti-mišjeg IgG koze, koji su konjugovani sa HRP, tokom 30 minuta, a ploče su razvijene korišćenjem supstrata 3. 3’, 5. 5'-tetrametil-benzidina (TMB) (BI) Pharmigen), nakon čega su sledila završna ispiranja. HRP reakcija je zaustavljena jednakom zapreminom IM fosforne kiseline. Signali vezivanja antitela su utvrđeni merenjem optičke gustine na 450 nm. Ćelije NS/0 porekla, koje ne poseduju detektibilnu ekspresiju CD20. korišćene su kao kontrola pozadinskog signala, da bi se isključili supernatanti hibridoma sa ne-specifičnim vezivanjem ćelijske površine. Rcakcioni položaji koji su pozitivni i na ćelije NS/0 porekla i na ćelije koje ekspresuju CD20, isključeni su.

Primer 3. Sekvencioniranje humanih antitela prema CD20

Pre sekvencioniranja. ćelije antigen-speciličnog hibridoma su podvrgnute sub-kloniranju pojedinačne ćelije koristeći MOFLOTM protočni citometar.

Sekvencioniranje varijabilnih regiona lakog i teškog lanca izvršeno je standardnim postupcima (vidi na primer, US 2004/0167319A1). Ukupna RNK je pripremljena iz svakog ćelijskog niza hibridoma sa RNEASYTM kompletom (Qiagen). cDNK je pripremljena korišćenjem ampliiikucionog kompleta cDNA SMART RACE™ (Clonetech). Sekvence DNK HCVR-a i ECVR su sekvencionirane, a predviđene aminokiselinske sekvence HCVR-a i LCVR-a dobijene su za odabrana antitela (HCVR/LCVR SEQ IDNO): 3B9-10N (3/11); 3B9-10GSP (19/21); 3B9-10FGL (23/25);

9C11-14N (27/35); 9C11-14GSP (43/45); 9C11-14FGL (47/49); 2B7-7N (51/59); 2B7-7GSP (67/69); 2B7-7FGL (71/73); 2C11-4N (75/83); 2C11-4GSP (91/93); 2C11-4FGL (95/97); 3H7-6N (99/107); 3I17-6GSP (115/117); 3H7-6FGL (119/121); 5H2-17N (123/131); 5H2-17GSP (139/141); 51I2-17FGL (143/145); 6B9-4N (147/155); 6B9-4GSP (163/165); 6B9-4FGL (167/169); 6F6-1N (171/179); 6F6-1GSP (187/189); 6F6-1FGL (191/193); 8G6-5N ("8G6-5") (195/203); 8G6-5GSP (211/213); 8G6-5FGL (215/217); 9C3-8N (219/227); 9C’3-8GSP (235/237); 9C3-8FGL (239/241); 9D4-7N ("9D4-7”) (243/251); 9D4-7GSP (250 261); 9D4-7FGE (263/265); 9E4-20N (267/275); 9E4-20GSP (283/285); 9E4-20FGI. (287/289); 9II4-12N (291/299); 9H4-12GSP (307/309); 9H4-12FGE (311/313); 10E3-17N (315/323); 10E3-17GSP (331/333); 10E3-17FGL (335/337); 10F2-13N ("10F2-13") (339/347); 10F2-13GSP (355/357); 10F2-13FGL (359/361); 7E1-13N (363/371); 7E1-13GSP (379/381); 7E1-13FGL (383/385).

Primer 4. Specifičnost vezivanja antigena anti-CD20 antitela

Nakon što su himerična antitela bila prevedena u puna humana IgG, svojstva specifičnog vezivanja antigena utvrđena su ELISA protokolom, koji je sličan prethodno opisanom protokolu, s izuzetkom šio je Fcγ-specifično poliklonalno antitelo anti-hlgG koze, koje je konjugovano sa HRP. korišćeno kao antitelo za detekciju, a Daudi ćelijski niz (koji ekspresuje endogeni CD20) je korišćen kao izvor antigena. Sva testirana antitela su se specifično vezivala za Daudi ćelije sa EC50 vrednostima u rasponu od oko 0. 4 nM do oko 20 nM.

Specifičnost vezivanja antigena potpuno humanih anti-CD20 antitela je potvrđena korišćenjem protočne citometrije, kao što je opisano u nastavku, sa humanim CD20-transfektovanim MG87 ćelijama. Ukratko, izvorne MG87 i humanim CD20-transfektovane MG87 ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4°C, sa svakim od 15 humanih antitela i sa dva kontrolna antitela, nakon čega je sledila inkubacija sa PE-konjugovanim anti-humanim IgG antitelom. Vezivanje je utvrđeno protočnom citometrijom. Intenziteti fluorescencije su uporedeni sa izvornim ćelijskim nizom i kontrolnim izotipski-složenim uzorkom. Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 1. Sva antitela vezana su za MG87 ćelije translektovane humanim CD20, budući da nije utvrđeno vezivanje za izvorne MG87 ćelije, što pokazuje da su antitela specifična za

CD20. Kontrola I: himerična (mišija/humana) anti-CD20 mAt, rituksimab, (RITUXAN®, IDEC Pharmaceuticals Corp. ); kontrola II: humana anti-CD20 mAt, 2F2, opisana u WO 2005/103081).

Tabela 1

Primer 5. Vezivanje humanog anti-CD20 antitela za humani mutant CD20

Humani mutanti CD20 su proizvedeni supstituisanjem aminokiselinskih sekvenci humanog CD20 odgovarajućim aminokiseiinama miša, koristeći komplet Strategene Mutagenesis (Tabela 2). Plazmid vektor, koji sadrži humani mutant CD20, CMV promoter i higromicin rezistentni marker gen-IRES-GFP je, zatim, transfektovan u

MG87 ćelije. Za svaki mutant humani CD20, sakupljen je pul ćelija, rezistentnih na higromicin, koje pokazuju visoku ekspresiju GFP i kreiranje stabilni niz za ispitivanje vezivanja antitela.

Tabela 2

Ukratko, približno 1 x 106 ćelija iz svakog stabilno transfektovanog ćelijskog niza, koje ekspresuju mutant humani CD20, sakupljeno je i inkubirano sa svakim anti-humanim antitelom, u koncentraciji od 10 pg/ml, na ledu, tokom 1 sata, nakon čega je sledila inkubacija sa anti-humanim IgG koze, konjugovanim sa APC (Jackson Immunolabs), u koncentraciji od 10 pg/ml. na ledu, tokom 45 minuta. Za svako antitelo, protočnom citomeirijom je utvrđeno vezivanje za svaki mutant humani CD20. Srednji nivo: intenziteta fluorescencije se utvrđuju dok se ulaz svodi na malu (približno 20%) populaciju ćelija, koje pokazuju medijanu nivoa ekspresije GFP, kako bi se minimizovali efekti zbog varijabilnih nivoa ekspresije mutanta CD20 sa svakim ćelijskim nizom. Za svaki mutant CD20, antitelo koje pokazuje najveći srednji intenzitet fluorescencije, označeno je kao 100% vezivanje. Tabela 3 pokazuje procenat vezivanja svakog anti-CD20 antitela za svaki humani mutant CD20.

Primcr 6. Jačina komplement zavisne citotoksičnosti (CDC)

Ispitana je sposobnost humanih antitela protiv humanog CD20 da potpomažu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), koristeći Daudi i RL ćelijske nizove humanog limfoma, kao ciljne ćelijske nizove. Antitela su serijski razblažena (raspon konačne koncentracije od 50 nM do 0. 85 pM plus puferska kontrola) u medijumima i đođata su ciljnim ćelijama, koje su zasejane u formatu ploče od 96 reakcionih čašica. Humani serum sa komponentama komplementa (Quidel) je dodat u svaku reakcionu čašicu, da bi se dobila konačna koncentracija seruma od 5%. Ćelije su inkubirane na 37°C, tokom 2 sata, sa ispitivanim antitelima i humanim serumom sa komponentama komplementa, a

zatim je ispitano ćelijsko preživljavanje, uz detekciju pomoću ALAMARBLUE™. Fluorescencija je izmerena korišćenjem talasne dužine ekscitacije od 560 nm i talasne dužine emisije od 590 nm (Tabela 4).

Tabela 4

Primer 7. Funkcionalna off-brzina humanih anti-CD20 antitela

Off-brzine anti-CD20 mAt-a su analizirane CDC testom. Eksperimenti su izvedeni u 3 zasebne grupe. U okviru svake grupe, procenat liziranja ćelija je utvrđen za 5 antitela u vreme 0, 1 i 6 sati, u odnosu na kontrole I i II. Antitelo se vezuje za ćelije inkubiranjem 2 pg svakog antitela sa 106 Daudi ćelija tokom 45 minuta (RT). U nultoj vremenskoj tački, ćelije su isprane i odmah resuspendovane u 100 pμ medijuma, koji

sadrži 20% normalnog humanog serumskog komplementa, a zatim su inkubirane tokom 45 minuta, na 37°C, sa 5% CO2. U vremenskim lačkama na 1 i 6 h, 106 ćelija je isprano, a zatim je sledilo vezivanje antitela, re-suspendovanje u 12 ml svežih medinima, u 15 ml Falcon epruveti, i inkubiranje, uz mehaničko obrtanje, tokom 1 h, odnosno 6 h. Ćelije su isprane na završetku odabranih vremenskih tačaka i inkubirane su u medijumu koji sadrži 20% normalnog humanog serumskog komplementa. pri čemu inkubiranje traje 45 minuta. Nakon inkubacije seruma, svakom uzorku je dodat 7-amino-aktinoniicin D (7AAD) i uzorci su inkubirani 15 minuta na RT, da bi se utvrdila ćelijska održivost. Procenat citotoksičnosti je određen u svakoj vremenskoj tački, postavljajući regione kao prednje rasipanje prema 7AAD u dvo-dimenzionalnoj krivi rasipanja, koja predstavlja 7AAD pozitivne i negativne ćelije, a krhotine su isključene iz oba regiona. Procenat citotoksičnosti je ucrtan za svaku vremensku tačku, kao 100 minus procenat 7AAD-negativnih ćelija (Tabela 5-7).

Tabela 5

Tabela 7

Primer 8. Biohemijska off-brzina humanih antFCD20 antitela

Određene su biohemijske off-brzine za odabrana ispitivana anti-CD20 antitela i upoređene su sa kontrolnim antitelima I i II. Dva odabrana humana antitela, kontrola I ili II (svaki u koncentraciji od 2 pg/ml) su inkubirani sa Raji ćelijama, koje ekspresuju CD20, u koncentraciji od 106/ml, tokom 2 sata, na RT. Ćelije su, zatim, isprane, višak antitela je uklonjen, re-suspendovane su u medij umu koji sadrži 1% seruma i inkubirane su na 37°C. U vremenu 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 i 180 min, alikvot od 1 ml ćelija je odstranjen, ispran, obojen sa anti-hFc antitelom, obeleženim sa PE, i provedena je FACS

analiza. Kao pokazatelj količine antitela, vezanog za ćelijsku površinu, korišćen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Biohemijske off-brzine su. izračunate postavljajući procenat vezivanja u nultom vremenu kao 100%. Eksperiment je ponovljen dodatnih 5 puta, a biohemijske off-brzine za 12 ispitivanih antitela određene su i upoređene sa kontrolom I i II (Tabele 8-13).

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 11

Tabela 13

Primer 9. Test citotoksičnosti posredovane ćelijama u zavisnosti od antitcla (ADCC)

ADCC, indukovana odabranim humanim anti-CD20 antitelima, utvrđena je korišćenjem Daudi ćelija (ćelije iz ćelijskog niza humanog limfoma, koji endogeno ekspresuje CD20). Ukratko, Daudi ćelije (10, 000 ćelija po reakcionom položaju u 50 pl) se, najpre, izmešaju sa jednakom zapreminom serijski razblaženih humanih anti-CD20

antitela, čime se dobija konačna koncentracija antitela u rasponu od 0. 169 pM do 10 nM, i inkubiraju se tokom 10 minuta, na RT, na pločama sa 96 rcakcionih položaja (kontrola = reakcioni položaji bez antitela). Odvojeno su pripremljene mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC-e, efektor ćelije), sledeći konvencionalnu proceduru uvećavanja centrifugiranjem sa Ficoll-Hypaque gradijentom. Uvećane PBMC-e su sakupljene, isprane i postavljene u RPMI 1640, koji sadrži 10% toplotom inaktivisanog FBS, 2 mM glutamin i 50 nM beta-merkaptoetanol. Ćelije su, zatim, stimulisane sa 5 ng/ml humanog IL-2, tokom tri dana, isprane su jednom u medijumima, a zatim su direktno korišćene u ADCC testu. Približno 300, 000 PBMC-a je dodato svakoj mešavini antitela i ciljnih ćelija, da bi se dobio konačni odnos efektor ćelija prema ciljnim ćelijama od približno 30: 1. Ploče sa 96 rcakcionih položaja su, nakon toga, inkubirane tokom 4 sata i centrifugirane su na 250 x g. Sakupljeni su supernatanti i ispitani na aktivnost laktat dehidrogenaze (LDFI), koristeći ne-radioaktivni sistem ispitivanja citotoksičnosti CYTOTOX 96® (Promega) (Tabela 14).

Tabela 14

Primer 10. Terapeutske aktivnosti anti-CD20 antitela sa modelom miša sa ksenograftom humanog limfoma.

Studije in vivo efikasnosti za odabrana anti-CD20 antitela su izvedene korišćenjem modela miša sa ksenografitom humanog B-ćelijskog non-Hodgkinovog limfoma. Nabavljene su ženke miševa sa ozbiljnom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) starosti od 6 nedelja. Nakon nedelju dana aklimatizacije. 2. 5 miliona sveže prikupljenih Raji ćelija (ćelije iz ćelijskog niza humanog non-Hodgkinovog limfoma B-ćelija) intravenski je injicirano svakom mišu. Svaki miš sa grafitom Raji ćelija je, zatim, tretiran humanim FC (hFC). kontrolom I. kontrolom II, 8G6-5. 9D4-7, 10F2-13 ili 7E1-

13. svaki u dozi od 10 mg/kg, putem intravenske injekcije kroz lateralni umetak 3, 6 i 9 dana nakon primanja grafita. Miševi su praćeni tokom perioda koji traje do 180 dana. Miševi koji pokazuju znake bolesti, koji uključuju paralizu stražnjih nogu, kaheksiju i povremenu veliku lokalnu tumorsku masu. podvrgnuti su eutanaziji izazivanjem asfiksije sa CO2. Krive preživljavanja bez simptoma su konstruisane korišćenjem Kaplan-Meier postupka (Slika 1). Rezultati se izražavaju u vidu procenta preživljavanja kao funkcije vremena preživljavanja bez simptoma. Ovi rezultati pokazuju da je antitelo 10F2-13 značajno povećalo vremena preživljavanja na životinjskom modelu, od oko 20 dana (životinje tretirane hFc kontrolom) do oko 180 dana (više od 9-puta povećanje opsega preživljavanja) (50% tretiranih životinja preživelo je oko 20 dana (kontrola hFc). oko 40 dana (kontrola I), oko 85 dana (kontrola 11) i više od 180 dana (10F2-13). Ova povećana vremena preživljavanja su najmanje 2-puta veća (u odnosu na kontrolu II), oko 4. 5-puta veća (u odnosu na kontrolu I) ili najmanje oko 9-puta ili više u odnosu na životinje koje su tretirane sa hFc.

Claims (15)

1.    Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji specifično vezuje humani CD20 i u stanju je da indukuje komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), sa koncentracijom antitela od oko 5 nM ili manje, i produži vreme preživljavanja bez simptoma između oko 2-puta do oko 9-puta ili više, u odnosu na životinje tretirane kontrolom na mišjem modelu humanog limfoma, pri čemu antitelo ili fragment antitela sadrži: -    region 1 teškog lanca koji određuje komplementarnost (HCDR1) i CDR1 lakog lanca (LCDR1), pri čemu su HCDR1 i LCDR1 SEQ ID NO: 341 i 349; -    region 2 teškog lanca koji određuje komplementarnost (HCDR2) i CDR2 lakog lanca (LCDR2), pri čemu su HCDR2 i LCDR2 SEQ ID NO: 343 i 351; i -    region 3 teškog lanca koji određuje komplementarnost (HCDR3) i CDR3 lakog lanca (LCDR3), pri čemu su HCDR3 i LCDR3 SEQ ID NO: 345 i 353.

2.    Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koje specifično vezuje humani CD20 i u stanju je da indukuje komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), sa koncentracijom antitela od oko 5 nM ili manje, pri čemu antitelo ili njihov fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), pri čemu su sekvence HCVR i LCVR odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 339 i 347.

3.    Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu je koncentracija antitela, koja se zahteva za indukovanje CDC, 1 nM ili manja.

4.    Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment, u skladu sa patentnim zahtevom 3, dalje naznačeno time što ispoljava EC50 0. 2 nM ili manju, kao što je mereno u Daudi ćelijama, ili EC50 od 0. 4 nM ili manje, kao što je mereno uz pomoć RL ćelija.

5.    Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeni time što ispoljavaju Kd ili EC50 od najmanje 10-11 M, kada se mere pomoću vezivanja za antigen, koji je prisutan na ćelijskoj površini.

6.    Molekul nukleinske kiseline, koji kodira humano antitelo ili fragment antitela u skladu sa patentnim zahtevom 5.

7.    Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa patentnim zahtevom 6.

8.    Postupak proizvodnje antitela protiv humanog CD20 ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, koji obuhvata korake uvođenja ekspresionog vektora, u skladu sa patentnim zahtevom 7, u izolovanu ćeliju domaćina, uzgajanja ćelije pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju antitela ili fragmenta antitela i dobijanje povraćajem antitela ili fragmenta antitela, proizvedenog na taj način.

9.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 8, u kome je ćelija domaćina ćelija E. coli, CHO ćelija ili COS ćelija.

10.    Farmaceutska smeša koja sadrži antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5.

11.    Antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, koje je za korišćenje kako bi se oslabila ili sprečila bolest ili stanje, koje je posredovano sa CD20, kod čoveka.

12.    Antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, u skladu sa patentnim zahtevom 11, pri čemu su lečena bolest ili stanje izdvojeni iz grupe koju sačinjavaju: non-Hodgkinov limfom, reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, Crohnova bolest, hronična limfocitna leukemija i inflamatorne bolesti.

13.    Postupak ublažavanja ili sprečavanja bolesti ili stanja, posredovanih sa CD20, kod čoveka, koji obuhvata primenu terapeutski delotvome količine antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5.

14.    Upotreba antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, u proizvodnji leka, koji je korišćen kako bi se oslabila ili sprečila bolest ili stanje, posredovano sa CD20, kod čoveka.

15. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 14, u kojoj je lečena bolest ili stanje: non-Hodgkinov limfom, reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, Crohnova bolest, hronična limfocitna leukemija i inflamatome bolesti.