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WO2025163760A1 - 弱毒性細菌株、弱毒生ワクチン、防除方法、及び生産方法 - Google Patents

弱毒性細菌株、弱毒生ワクチン、防除方法、及び生産方法

Info

Publication number
WO2025163760A1
WO2025163760A1 PCT/JP2024/002908 JP2024002908W WO2025163760A1 WO 2025163760 A1 WO2025163760 A1 WO 2025163760A1 JP 2024002908 W JP2024002908 W JP 2024002908W WO 2025163760 A1 WO2025163760 A1 WO 2025163760A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vaccine
fish
attenuated
bacterial strain
seriolae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/002908
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄太 松浦
倫一 高野
貴光 坂井
知正 松山
佳子 嶋原
剛佑 梅田
徹優 中川
友晃 ▲吉▼野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Fisheries Research and Education Agency
Original Assignee
Fisheries Research Agency
Japan Fisheries Research and Education Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fisheries Research Agency, Japan Fisheries Research and Education Agency filed Critical Fisheries Research Agency
Priority to PCT/JP2024/002908 priority Critical patent/WO2025163760A1/ja
Publication of WO2025163760A1 publication Critical patent/WO2025163760A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to attenuated bacterial strains, live attenuated vaccines, control methods, and production methods.
  • Nocardiosis is a serious fish disease that causes serious damage in yellowtail aquaculture.
  • Nocardiosis is an infectious disease of yellowtail, amberjack, amberjack, and other fish, caused by Nocardia seriolae, a type of actinomycete.
  • Nocardia seriolae a type of actinomycete.
  • In fish infected with nocardiosis ulcers on the body surface and nodules on the gills, kidneys, and spleen are observed from the mid-stage of infection onward. Therefore, even if fish survive, the commercial value of fish infected with nocardiosis and developing ulcers or nodules is significantly reduced.
  • Nocardia seriolae is sensitive to antibiotics such as erythromycin or spiramycin, or synthetic antibacterial agents such as sulfamonomethoxine or sulfisozole sodium, and these antibiotics or synthetic antibacterial agents are effective against it.
  • antibiotics such as erythromycin or spiramycin
  • synthetic antibacterial agents such as sulfamonomethoxine or sulfisozole sodium
  • these antibiotics or synthetic antibacterial agents are effective against it.
  • the extensive use of antibiotics or synthetic antibacterial agents leads to the emergence of drug-resistant strains, and therefore there is a strong demand for the development of a vaccine.
  • Patent Document 1 describes a vaccine against fish infectious diseases caused by Edwardsiella tarda, which contains an antigen derived from Edwardsiella tarda that is substantially non-pathogenic to the target fish species; a method for producing a vaccine against fish infectious diseases caused by Edwardsiella tarda, which is characterized by using Edwardsiella tarda that is substantially non-pathogenic to the target fish species; and a method for preventing fish infectious diseases caused by Edwardsiella tarda, which includes a step of administering the vaccine to fish.
  • Patent Document 2 describes a method for producing a pharmacological composition, which comprises a culturing step of culturing Nocardia seriolae in a medium containing a divalent cation chelating agent, a pharmacological composition obtained by the method, and a fish vaccine containing the pharmacological composition.
  • Patent Document 3 describes a combination vaccine for combating Nocardia infection in fish, characterized by containing bacteria of the species Lactococcus garviae, Pasteurella piscicida, Vibrio anguillarum, and Nocardia seriolae, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • N. soli, N. fluminea, or N. uniformis were injected into yellowtail (Seriola quinqueradiata).
  • a low-pathogenic strain of N. seriolae was also administered to model the concept of using a live vaccine.
  • Fish injected with live cells of N. soli and N. fluminea exhibited slight resistance to an artificial challenge with N. seriolae.
  • fish that survived N. seriolae infection exhibited complete resistance to N. seriolae challenge.
  • Nocardia seriolae a Gram-positive facultative intracellular pathogen
  • Nocardia seriolae a Gram-positive facultative intracellular pathogen
  • mutagenic N. seriolae strains S-250 and U-20 were obtained from the wild-type strain ZJ0503 by serial passage and UV irradiation.
  • the biological properties, virulence, stability, mediation of immune responses, and protective efficacy against hybrid snakehead fish were investigated.
  • Nocardia seriolae is the major pathogen of fish nocardiosis.
  • Our previous study identified alanine dehydrogenase as a potential virulence factor of N. seriolae. Based on this finding, we knocked out the alanine dehydrogenase gene (NsAld) of N. seriolae and established the ⁇ NsAld strain for vaccine development against fish nocardiosis.
  • the LD50 of the ⁇ NsAld strain was 3.90 ⁇ 105 CFU/fish, which was significantly higher than that of the wild-type strain (5.28 ⁇ 104 CFU/fish) (p ⁇ 0.05).
  • ⁇ NsAld strain was used as a live vaccine and injected intraperitoneally into hybrid snakehead snakeheads (Channa maculata (female) ⁇ Channa argus (male)) at 2.47 ⁇ 10 5 CFU/animal, nonspecific immune indices (LZM, CAT, AKP, ACP, SOD activity), specific antibody titers (IgM), and several immune-related genes (CD4, CD8 ⁇ , IL-1 ⁇ , MHC I ⁇ , MHC II ⁇ , TNF ⁇ ) were elevated in different tissues, indicating that this vaccine can induce humoral and cellular immune responses. Furthermore, the survival rate (RPS) of the ⁇ NsAld vaccine was 76.48%.
  • the present invention was made in consideration of the above circumstances, and aims to provide an attenuated bacterial strain and a live attenuated vaccine useful for producing a live attenuated vaccine for controlling nocardiosis in yellowtail.
  • nocardiosis in yellowtail can be effectively controlled by using, as an attenuated live vaccine, N. seriolae in which a mutation in part of the MtrA gene has occurred, and part of the amino acid sequence encoded by the MtrA gene has been mutated from V179 to G179 , and thus the present invention was completed.
  • N. seriolae in which a mutation in part of the MtrA gene has occurred, and part of the amino acid sequence encoded by the MtrA gene has been mutated from V179 to G179 , and thus the present invention was completed.
  • [4] The attenuated bacterial strain according to any one of [1] to [3], which is Nocardia seriolae FPC1073.
  • [5] The attenuated bacterial strain according to any one of [1] to [4], which is an isolated bacterial strain.
  • [6] A live attenuated vaccine comprising the attenuated bacterial strain according to any one of [1] to [5].
  • [7] Use of the attenuated bacterial strain according to any one of [1] to [5] as a live attenuated vaccine for controlling nocardiosis in fish of the genus Seriola.
  • [8] A method for controlling nocardiosis in fish of the genus Seriola, comprising administering the live attenuated vaccine according to [6] to Seriola.
  • [9] A method for producing fish of the genus Seriola, comprising administering the live attenuated vaccine according to [6] to Seriola.
  • the present invention provides an attenuated bacterial strain and a live attenuated vaccine useful for producing a live attenuated vaccine for controlling nocardiosis in yellowtail.
  • Figure 1 is a graph showing the infection prevention effect of N. seriolae FPC1073 in yellowtail (S. quinqueradiata) (Experimental Example 1).
  • Figure 2 shows the results of comparing a portion of the MtrA gene base sequence on the genome of the attenuated N. seriolae strain FPC1073 and the virulent N. seriolae strain 024013 (Experimental Example 2).
  • Figure 3 is a graph showing the infection prevention effect of N. seriolae FPC1073 in amberjack (S. dumerili) (Experimental Example 3).
  • Figure 4 is a graph showing the infection prevention effect of N. seriolae FPC1073 in yellowtail kingfish (S. lalandi) (Experimental Example 4).
  • Patent Documents 1 to 3 make no mention of the presence of a mutation in part of the MtrA gene of the N. seriolae FPC1073 strain, the substitution of the 179th amino acid in part of the amino acid sequence of the MtrA gene from Val to Gly, or the FPC1073 strain itself.
  • yellowtail and “yellowtail fish” include yellowtail (scientific name: Seriola quinqueradiata), amberjack (scientific name: Seriola lalandi), amberjack (scientific name: Seriola dumerili), and long-finned amberjack (scientific name: Seriola rivoliana).
  • yellowtail scientific name: Seriola quinqueradiata
  • amberjack scientific name: Seriola lalandi
  • amberjack scientific name: Seriola dumerili
  • long-finned amberjack scientific name: Seriola rivoliana
  • the attenuated bacterial strain of this embodiment is an attenuated bacterial strain of Nocardia seriolae having a mutation in at least a part of the MtrA gene, in which the 179th amino acid in at least a part of the amino acid sequence encoded by the MtrA gene is substituted from Val to Gly.
  • Whether there is at least a partial mutation in the MtrA gene, with the 179th amino acid in the encoded amino acid sequence being substituted from Val to Gly can be determined, for example, by determining the DNA base sequence of the strain's MtrA gene. It can also be determined by determining the base sequence of the transcription product (mRNA) or complementary DNA (cDNA) of the strain's MtrA gene.
  • mRNA transcription product
  • cDNA complementary DNA
  • a preferred embodiment of the attenuated bacterial strain of this embodiment is Nocardia seriolae FPC1073.
  • the attenuated bacterial strain of this embodiment may be a culture of Nocardia seriolae FPC1073.
  • the attenuated bacterial strain of this embodiment is preferably an isolated bacterial strain.
  • Nocardia seriolae FPC1073 has been deposited at the National Institute of Technology and Evaluation's Patent Microorganisms Depositary (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) under NITE BP-04013 (deposit date: November 15, 2023).
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation's Patent Microorganisms Depositary
  • the live attenuated vaccine of this embodiment is a live attenuated vaccine containing the above-mentioned attenuated bacterial strain.
  • the attenuated live vaccine of this embodiment may further contain a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier in addition to the attenuated bacterial strain described above.
  • Liquid carriers include water, phosphate buffered saline (PBS), and physiological saline.
  • Solid carriers include excipients such as talc and sucrose.
  • the form of the attenuated live vaccine of this embodiment is not particularly limited and may be an injectable, oral, or immersion formulation, but it is preferable to adopt an injectable formulation, which has long-lasting effects with a small dose.
  • the attenuated bacterial strain described above may be mixed with ordinary fish feed.
  • Injectable vaccines can be prepared by suspending live cells of the attenuated bacterial strains described above in sterilized fish-use saline or similar. In addition to the live cells and saline, these injectable vaccines can also contain suspending agents, stabilizers, emulsifiers, buffers, preservatives, solubilizers, or other appropriate additives commonly used in injectable preparations.
  • the live attenuated vaccine of this embodiment achieves sufficient immune effects without the need for such adjuvants.
  • the live attenuated vaccine of this embodiment does not impose any restrictions on the use of adjuvants, and an adjuvant can also be formulated in addition to the above components.
  • Adjuvants are generally substances that non-specifically enhance the host's immune response, and many different adjuvants are known in the art.
  • adjuvants include, but are not limited to: Minerals, vegetable and animal fats and oils, oil-soluble vitamins such as vitamin E, and surfactants for adding these, alum, aluminum compounds, bentonite, muramyl dipeptide derivatives, interleukins, and endotoxins.
  • the amount of live bacterial cells contained in the live attenuated vaccine of this embodiment is not particularly limited, but is preferably 1.0 x 10 to 1.0 x 10 CFU/100 ⁇ L, more preferably 1.0 x 10 to 1.0 x 10 CFU/100 ⁇ L.
  • the amount of the attenuated bacterial strain contained in the vaccine is preferably 0.1 to 1.0 ⁇ g in terms of wet bacterial cells per administration.
  • the effective amount can be adjusted as needed by increasing or decreasing the dose ( ⁇ L) of vaccine administered to the fish, so the content of the attenuated bacterial strain in the live attenuated vaccine of this embodiment is not limited to the amount stated above.
  • the desirable dosage when the vaccine of the present invention is administered intraperitoneally to fish varies depending on various factors, such as the season and water temperature, the species, age, and weight of the fish, and cannot be generally determined.
  • the vaccine of the present invention can be used for fish of the genus Seriola, for example, fish of the genus Seriola that normally weigh 30g or more, specifically 30g to 5kg, preferably 30g to 200g, and more preferably 50g to 200g.
  • it is preferably administered before the fish becomes infected with nocardiosis, for example, at the juvenile stage. It is particularly preferable to administer 0.05 to 0.5mL, more preferably 0.1 to 0.2mL, of the vaccine of the present invention intraperitoneally when the fish is 3 to 7 months old, preferably 4 to 5 months old.
  • the live attenuated vaccine of this embodiment has a duration of action lasting for more than one year with a single administration, and can provide long-term protection against nocardiosis infection.
  • the vaccine of the present invention can be administered once as long as its effect is sustained, but it can also be administered multiple times, for example, 2 to 5 times, at intervals of 1 to 30 days.
  • the fish to which the live attenuated vaccine of this embodiment can be administered are not limited to fish of the genus Seriola (yellowtail).
  • the vaccine of this embodiment is thought to be highly useful in yellowtail farming, as it can reduce the mortality rate due to nocardiosis during farming and increase yields.
  • Control method The control method of this embodiment is a method for controlling nocardiosis in fish of the genus Seriola, which comprises administering an attenuated live vaccine to Seriola.
  • the live attenuated vaccine administered is the live attenuated vaccine described above.
  • methods for administering the live attenuated vaccine to fish of the genus Yellowtail include injection, immersion, and oral administration. Examples of each administration method are described below.
  • (A) Injection method For fish weighing 30 g or more, 0.05 to 0.1 mL of an attenuated live vaccine solution prepared to a bacterial count of 1.0 x 10 to 1.0 x 10 CFU/100 ⁇ L is intraperitoneally inoculated into the body of the fish.
  • the injection solution may contain a pharmaceutically acceptable liquid carrier in addition to the attenuated bacterial strain.
  • liquid carriers include water, phosphate buffer solution (PBS), and physiological saline.
  • (B) Immersion method Fish weighing 30 g or more are immersed for 10 to 60 minutes in a solution containing attenuated bacterial cells of a bacterial strain adjusted to 1.0 x 10 to 1.0 x 10 CFU/L. Note that the immersion method is thought to be less effective in preventing infection than the above-mentioned injection method, so a booster immunization may be performed as necessary.
  • the various administration methods described above can be appropriately selected and adopted depending on the properties, morphology, etc. of the fish species to be treated, but in order to further enhance the infection prevention effect, it is preferable to adopt intraperitoneal injection as performed in the examples described below.
  • the control method of this embodiment makes it possible to more efficiently prevent nocardiosis in fish of the genus Seriola.
  • the production method of this embodiment is a method for producing fish of the genus Seriola, which comprises administering the above-mentioned live attenuated vaccine to Seriola.
  • the method for administering the live attenuated vaccine to yellowtail is the same as the method for controlling nocardiosis in yellowtail fish described above.
  • Example 1 ⁇ Examination of a live attenuated vaccine using Nocardia seriolae FPC1073 (FPC, Fisheries Technology National Institute) which has a mutation in part of the MtrA gene, resulting in a substitution of Val at position 179 with Gly in part of the encoded amino acid sequence>
  • a novel attenuated strain of N. seriolae FPC1073 with mutated pathogenicity was obtained by subculturing N. seriolae 024013, a highly virulent strain of nocardiosis provided by Oita Prefecture.
  • Yellowtail were inoculated into the body cavity with 10 CFU/100 ⁇ L of N. seriolae FPC1073 and reared in running seawater at 25°C for one month.
  • N. seriolae FPC1073 a highly virulent strain of the same bacterium, N. seriolae KGN1266 (KGN, Kagoshima Prefectural Fisheries Technology Research and Development Center) was added to the rearing water at 10 CFU/L and the fish were immersed for 10 minutes. After infection, the fish were reared in running seawater at 25°C and observed for 60 days. The survival rate was calculated, and the fish showed a high infection prevention effect, as shown in Figure 1.
  • JCM is an acronym for Japan Collection of Microorganisms (RIKEN BioResource Research Center, National Research and Development Agency, 3-1-1 Takanodai, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan).
  • ⁇ Results> 1 is a graph showing the protective effect of N. seriolae FPC1073 on yellowtail (S. quinqueradiata) against infection.
  • Example 1 N. seriolae FPC1073 Comparative Example 1-1: N. fluminea JCM11440 Comparative Example 1-2: N. salmonicida subsp. cummidelens JCM11441 Comparative example 1-3: N. uniformis JCM3224 Comparative Example 1-0: PBS-T: PBS (phosphate buffered saline) containing 0.5% Tween 80 *, p ⁇ 0.05; **, p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001; ****, p ⁇ 0.0001, Fisher's exact test, Holm's method.
  • FIG. 2 shows the base sequence of the MtrA gene including the mutated portion in the base sequence, as a waveform output from a DNA sequencer.
  • ⁇ Results> 3 is a graph showing the protective effect of N. seriolae FPC1073 on infection of amberjack (S. dumerili).
  • Example 3 N. seriolae FPC1073 Comparative
  • PBS-T PBS (phosphate buffered saline) containing 0.5% Tween 80 The survival rate was calculated in the same manner as in Experimental Example 1, and as shown in FIG. 3, a high infection prevention effect was observed.
  • ⁇ Results> 4 is a graph showing the protective effect of N. seriolae FPC1073 on yellowtail kingfish (S. lalandi).
  • Example 3 N. seriolae FPC1073 Comparative
  • PBS-T PBS (phosphate buffered saline) containing 0.5% Tween 80 **, p ⁇ 0.01 Fisher's exact test. The survival rate was calculated in the same manner as in Experimental Example 1, and as shown in FIG. 4, a high infection prevention effect was observed.
  • PCR was performed to amplify MtrA using the extracted genomic DNA of Nocardia seriolae strain FPC1073 or 024013 as a template. Subsequently, to decipher the nucleotide sequence of the resulting amplified product, DNA sequencing was performed by the Sanger method using the amplified product as a template.
  • the primers used were oligonucleotides designed against the reverse complementary sequence downstream of the open reading frame of the MtrA gene. The reverse complementary base sequence of the MtrA gene obtained by this sequencing was converted into a complementary sequence using sequence assembly software.
  • Table 2 shows the DNA sequence of the MtrA gene obtained.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of the obtained MtrA gene products. Note that these amino acid sequences were deduced from the DNA base sequence of the MtrA gene.
  • the attenuated bacterial strain of the present invention can be used as a live vaccine useful for controlling nocardiosis in fish of the genus Seriola. Because the live attenuated vaccine of the present invention is highly effective in controlling nocardiosis, it can prevent losses due to nocardiosis in farmed fish of the genus Seriola, and economic benefits can also be expected.
  • NPMD NITE BP-04013 NPMD is an acronym for the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan).

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Abstract

本発明により、ＭｔｒＡ遺伝子の少なくとも一部に変異があり、前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくとも一部において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されている、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ（ノカルジア・セリオレ）の弱毒性細菌株が提供される。

Description

弱毒性細菌株、弱毒生ワクチン、防除方法、及び生産方法
　本発明は、弱毒性細菌株、弱毒生ワクチン、防除方法、及び生産方法に関する。
　ブリ類養殖においてノカルジア症による魚病被害が深刻である。
　ノカルジア症は放線菌の一種であるノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）感染を原因とする、ブリ、カンパチ及びヒラマサ等のブリ類の感染症である。ノカルジア症に罹患した魚では、感染中期以降に体表の潰瘍、鰓、腎臓及び脾臓の結節形成が認められる。そのため、ノカルジア症に罹患して潰瘍や結節が形成された魚は生存した場合でも商品価値が大きく損なわれる。
　ノカルジア・セリオレは、エリスロマイシン若しくはスピラマイシン等の抗生物質又はスルファモノメトキシン若しくはスルフィソゾールナトリウム等の合成抗菌剤に感受性であり、これらの抗生物質又は合成抗菌剤が有効である。しかし、抗生物質又は合成抗菌剤を多用することは薬剤耐性株の出現につながることから、ワクチンの開発が強く求められている。
　特許文献１には、投与対象の魚種には実質的に病原性を示さないエドワジエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ）由来の抗原を含有してなる、エドワジエラ・タルダに起因する魚類感染症に対するワクチン、投与対象の魚種には実質的に病原性を示さないエドワジエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ）を用いることを特徴とする、エドワジエラ・タルダに起因する魚類感染症に対するワクチンの製造方法、及び前記ワクチンを魚に投与する工程を含む、エドワジエラ・タルダに起因する魚類感染症の予防方法が記載されている。
　特許文献２には、２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）を培養する培養工程を含むことを特徴とする薬理組成物の製造方法、前記薬理組成物の製造方法により得られることを特徴とする薬理組成物、及び前記薬理組成物を含有することを特徴とする魚類用ワクチンが記載されている。
　特許文献３には、ラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇａｒｖｉａｅ）、パスツレラ・ピスシシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）、ビブリオ・アンギララム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）及びノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）種の細菌と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、魚類におけるノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）感染に対抗するための混合ワクチンが記載されている。
　ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）に対するワクチンを開発する試みとして、近縁種のＮ．　ｓｏｌｉ、Ｎ．　ｆｌｕｍｉｎｅａ又はＮ．　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓをブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）に注射した。また、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅの低病原性株を投与し、生ワクチンの使用概念をモデル化した。Ｎ．　ｓｏｌｉ及びＮ．　ｆｌｕｍｉｎｅａの生細胞を注射した魚は、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅの人工的なチャレンジに対してわずかな抵抗性を示した。一方、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ感染を生き延びた魚は、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅチャレンジに対して完全な抵抗性を示した。これらの結果は、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅに対する防御免疫応答がブリに誘導されることを示唆している（非特許文献１）。
　グラム陽性の通性細胞内病原体であるノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）は、魚類ノカルジア症の原因菌として同定されており、幅広い魚種に多大な死亡率と罹患率をもたらしている。そのため、この病原体に対する有効なワクチンは、養殖業における大きな損失を抑制するために緊急に必要とされている。生ワクチンを開発するために、野生株ＺＪ０５０３から連続継代培養及び紫外線照射により変異原性を有するＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　Ｓ－２５０株及びＵ－２０株を得た。さらに，Ｓ－２５０株及びＵ－２０株の生物学的特性、毒性、安定性、免疫応答の媒介、雑種スネークヘッド（Ｃｈａｎｎａ　ｍａｃｕｌａｔａ♀×Ｃ．　ａｒｇｕｓ♂）に対する防御効果を検討した。その結果、Ｕ－２０株はＺＪ０５０３株と比較して形態学的特性が劇的に変化し、雑種スネークヘッドに対する病原性が著しく低下したのに対し、Ｓ－２５０株はＺＪ０５０３株と比較して明らかな差異は認められなかった。雑種スネークヘッドにＺＪ０５０３株、Ｓ－２５０株及びＵ－２０株をそれぞれの亜臨床用量で腹腔内注射したところ、非特異的免疫パラメータ（血清ＬＹＺ、ＰＯＤ、ＡＣＰ、ＡＫＰ及びＳＯＤ活性）、特異的抗体（ＩｇＭ）価産生、免疫関連遺伝子（ＣＣ１、ＣＣ２、ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＭＨＣＩα、ＭＨＣＩＩα、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＴＣＲα及びＴＣＲβ）の発現が上昇し、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘発できることが示された。さらに、ＺＪ０５０３株、Ｓ－２５０株及びＵ－２０株によるワクチン接種後の雑種スネークヘッドにおける相対生存率（ＲＰＳ）防御効果は、それぞれ２８．８５％、５６．８９％及び８９．６５％であった。以上より、Ｓ－２５０株及びＵ－２０株は、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅに対する強い免疫応答を誘発し、雑種スネークヘッドに防御効果を与えることができ、養殖魚のノカルジア症防除のための生ワクチンの候補となることが示唆された（非特許文献２）。
　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅは魚類のノカルジア症の主要な病原体である。我々の以前の研究で、アラニン脱水素酵素がＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅの潜在的な病原因子であることが同定された。この事実に基づき、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅのアラニン脱水素酵素遺伝子（ＮｓＡｌｄ）をノックアウトし、魚類ノカルジア症に対するワクチン開発のためのΔＮｓＡｌｄ株を樹立した。ΔＮｓＡｌｄ株のＬＤ５０は３．９０×１０５ＣＦＵ／匹であり、野生株（５．２８×１０４ＣＦＵ／匹）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。また，ΔＮｓＡｌｄ株を生ワクチンとし，ハイブリッドスネークヘッド（Ｃｈａｎｎａ　ｍａｃｕｌａｔａ♀×Ｃｈａｎｎａ　ａｒｇｕｓ♂）に２．４７×１０５ＣＦＵ／匹を腹腔内注射したところ、非特異的免疫指標（ＬＺＭ、ＣＡＴ、ＡＫＰ、ＡＣＰ、ＳＯＤ活性）、特異的抗体価（ＩｇＭ）、いくつかの免疫関連遺伝子（ＣＤ４、ＣＤ８α、ＩＬ－１β、ＭＨＣＩα、ＭＨＣＩＩα、ＴＮＦα）が異なる組織で上昇し、このワクチンが液性および細胞性免疫応答を誘導できることが示された。さらに、ΔＮｓＡｌｄワクチンの生存率（ＲＰＳ）は７６．４８％であった。これらの結果から、ΔＮｓＡｌｄ株は養殖魚のノカルジア症制御のための生ワクチン開発の潜在的候補となる可能性が示唆された（非特許文献３）。
特開２００７－２３８５０５号公報 特開２０１３－１８４９１６号公報 特表２０１１－５０２９７２号公報
Ｉｔａｎｏ，Ｔ．外３名、"Ｌｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｔｒｉａｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｎｏｃａｒｄｉｏｓｉｓ　ｉｎ　ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ　Ｓｅｒｉｏｌａ　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ"、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ、２００６年、第２６１巻、ｐ．１１７５－１１８０ Ｌｉ，Ｂ．外７名、"Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ａｓ　ｌｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｔｒｉａｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｆｉｓｈ　ｎｏｃａｒｄｉｏｓｉｓ"、Ｆｉｓｈ　ａｎｄ　Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０２２年、第１３１巻、ｐ．１０－２０ Ｌｉｕ，Ｙ．外６名、"Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｌａｎｉｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　ｆｏｒ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ｉｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｎａｋｅｈｅａｄ　（Ｃｈａｎｎａ　ｍａｃｕｌａｔａ　♀　×　Ｃｈａｎｎａ　ａｒｇｕｓ　♂）"、Ｆｉｓｈ　ａｎｄ　Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０２３年、第１３８巻、１０８８２７
　ホルマリン及び加熱処理により不活化したＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ菌体をブリに接種しても防御効果は得られず、ブリ類のノカルジア症防除効果の高いワクチンはまだ開発されていない。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ブリ類のノカルジア症防除のための弱毒生ワクチンの生産のために有用な弱毒性細菌株及び弱毒生ワクチンを提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＭｔｒＡ遺伝子の一部に変異がありそのコードするアミノ酸配列の一部がＶ１７９→Ｇ１７９に変異したＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅを弱毒生ワクチンとして使用すると、ブリ類のノカルジア症を効果的に防除できることを知得し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明の態様は以下である。
［１］　ＭｔｒＡ遺伝子の少なくとも一部に変異があり、前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくとも一部において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されている、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ（ノカルジア・セリオレ）の弱毒性細菌株。
［２］　前記ＭｔｒＡ遺伝子の一部に変異がある塩基配列が配列番号１で与えられる、［１］に記載の弱毒性細菌株。
［３］　前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号３で与えられる、［１］又は［２］に記載の弱毒性細菌株。
［４］　ノカルジア・セリオレ　ＦＰＣ１０７３である、［１］～［３］のいずれかに記載の弱毒性細菌株。
［５］　単離された細菌株である、［１］～［４］のいずれかに記載の弱毒性細菌株。
［６］　［１］～［５］のいずれかに記載の弱毒性細菌株を含む、弱毒生ワクチン。
［７］　ブリ属魚類におけるノカルジア症を防除するための、［１］～［５］のいずれかに記載の弱毒性細菌株の弱毒生ワクチンとしての使用。
［８］　［６］に記載の弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類のノカルジア症の防除方法。
［９］　［６］に記載の弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類の生産方法。
　本発明によれば、ブリ類のノカルジア症防除のための弱毒生ワクチンの生産のために有用な弱毒性細菌株及び弱毒生ワクチンを提供することができる。
図１は、ブリ（Ｓ．　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである（実験例１）。 図２は、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅの弱毒株ＦＰＣ１０７３と強毒株０２４０１３のゲノム上のＭｔｒＡ遺伝子塩基配列の一部を比較した結果を示す図である（実験例２）。 図３は、カンパチ（Ｓ．　ｄｕｍｅｒｉｌｉ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである（実験例３）。 図４は、ヒラマサ（Ｓ．　ｌａｌａｎｄｉ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである（実験例４）。
　特許文献１～３には、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３株のＭｔｒＡ遺伝子の一部に変異があること、ＭｔｒＡ遺伝子のアミノ酸配列の一部において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されていること、及びＦＰＣ１０７３株それ自体に関する記載はない。
　本発明において、「ブリ類」及び「ブリ属魚類」は、ブリ（学名：セリオラ・キンケラジアータ（Ｓｅｒｉｏｌａ　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ））、ヒラマサ（学名：セリオラ・ラランディ（Ｓｅｒｉｏｌａ　ｌａｌａｎｄｉ））、カンパチ（学名：セリオラ・ドゥメリリ（Ｓｅｒｉｏｌａ　ｄｕｍｅｒｉｌｉ））及びヒレナガカンパチ（学名：セリオラ・リヴォリアーナ（Ｓｅｒｉｏｌａ　ｒｉｖｏｌｉａｎａ）を含むものとする。但し、魚類の分類学的再編により学名が変更された場合は、変更前の学名が上記したものであれば、その種は「ブリ類」及び「ブリ属魚類」に含まれるものとする。例えば、Ｓｅｒｉｏｌａ　ｌａｌａｎｄｉがＳｅｒｉｏｌａ　ａｕｒｅｏｖｉｔｔａｔａ、Ｓｅｒｉｏｌａ　ｄｏｒｓａｌｉｓ、及びＳｅｒｉｏｌａ　ｌａｌａｎｄｉの３種に再編された場合、これら３種はいずれも「ブリ類」及び「ブリ属魚類」に含まれる。さらに、分子系統学的研究（Premachandra, H. K. A., et al. "Genomic DNA variation confirmed Seriola lalandi comprises three different populations in the Pacific, but with recent divergence."Scientific Reports 7.1 (2017): 9386.）により、ブリ（Ｓ．　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）、カンパチ（Ｓ．　ｄｕｍｅｒｉｌｉ）、及びヒレナガカンパチに近縁であることが示されている、Ｓ．　ｚｏｎａｔａ及びＳ．　ｆａｓｃｉａｔａも、「ブリ類」及び「ブリ属魚類」に含まれる。
　以下では本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は後述する実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り種々の変更が可能である。
［弱毒性細菌株］
　本実施形態の弱毒性細菌株は、ＭｔｒＡ遺伝子の少なくとも一部に変異があり、前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくとも一部において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されている、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ（ノカルジア・セリオレ）の弱毒性細菌株である。
　ＭｔｒＡ遺伝子の少なくとも一部変異があり、そのコードするアミノ酸配列において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されていることは、例えば、菌株のＭｔｒＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定することにより、判断することができる。また、菌株のＭｔｒＡ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）又は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列を決定することによっても、判断することができる。
　本実施形態の弱毒性細菌株の好ましい態様は、ノカルジア・セリオレ　ＦＰＣ１０７３である。本態様の弱毒性細菌株は、ノカルジア・セリオレ　ＦＰＣ１０７３を培養したものであってもよい。
　本実施形態の弱毒性細菌株は、単離された細菌株であることが好ましい。
　ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ）　ＦＰＣ１０７３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）にＮＩＴＥ　ＢＰ－０４０１３として寄託されている（受託日：２０２３年１１月１５日）。
［弱毒生ワクチン］
　本実施形態の弱毒生ワクチンは、上述した弱毒性細菌株を含む弱毒生ワクチンである。
　本実施形態の弱毒生ワクチンは、上述した弱毒性細菌株に加えて、薬学的に許容される液状又は固体状の担体をさらに含有してもよい。液状の担体としては水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水等が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。本実施形態の弱毒生ワクチンの形態は特に制限されず、注射剤、経口剤、浸漬剤のいずれであってもよいが、少量の投与で長期間にわたって効果の持続性がある注射剤の形態を採用することが好ましい。また、経口剤の形態である場合には、通常の魚類の飼料に上記弱毒性細菌株を混合してもよい。
　注射用ワクチンは、上記弱毒性細菌株の生菌体を滅菌した魚類用生理食塩水等に懸濁して調製することができる。なお、当該注射用ワクチンには、生菌体及び生理食塩水の他、当該注射剤に通常用いられる懸濁化剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤またはその他の適当な添加剤を配合することもできる。
　また、従来からワクチンの免疫効果等を向上させるためにアジュバントが用いられている。本実施形態の弱毒生ワクチンは、このようなアジュバントを使用するまでもなく、十分な免疫効果が得られるものである。しかしながら、本実施形態の弱毒生ワクチンはアジュバントの使用を何ら制限するものではなく、上記成分に加えてアジュバントを配合することもできる。
　アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
　鉱物、植物及び動物性油脂、ビタミンＥなどの油溶性ビタミン等、更にこれらを添加するための界面活性剤、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキン、内毒素。
　本実施形態の弱毒生ワクチンに含まれる生菌体の量は、特に制限はないが、好ましくは１．０×１０２～１.０×１０４ＣＦＵ／１００μＬ、より好ましくは１.０×１０３～１.０×１０４ＣＦＵ／１００μＬとする。ワクチンに含まれる上記弱毒性細菌株の量は、１回の投与につき、湿菌体として０．１～１.０μｇが好ましい。
　なお、魚に投与するワクチンの用量（μＬ）を増減することによって、有効量を適宜調節することができるので、本実施形態の弱毒生ワクチン中の上記弱毒性細菌株の含有量は、上記のものに限定されることはない。なお、調製した弱毒生ワクチンの使用に当たっては、例えば、動物用生物学的製剤検定基準のブリα溶血性レンサ球菌症不活化ワクチン（注射型）などに準拠してワクチンの安全性及び有効性を検定し、その品質を確認・保証することが望ましい。
　本発明のワクチンを魚に腹腔内注射する場合の望ましい投与量は、投与する季節及び水温、魚の種類、年齢及び体重などの種々の要因によって異なり、一概に規定することはできない。しかし、例えば湿菌体重量０．１g／mＬであるワクチンをさらに１０，０００倍希釈して調製したワクチンを用いて、体重３０～５００ｇの魚に対して通常５０～５００μＬ程度を体重に応じて腹腔内注射することが好ましい。
　本発明のワクチンは、ブリ属魚類であれば、例えば、通常体重３０ｇ以上、具体的には体重３０ｇ～５ｋｇ、好ましくは３０ｇ～２００ｇ、より好ましくは５０ｇ～２００ｇのブリ属魚類に用いることができる。ワクチンをより有効に利用するためには、ノカルジア症に罹患する前、例えば稚魚の段階で投与することが好ましい。特には、生後３～７か月、好ましくは生後４～５か月に本発明のワクチン０．０５～０．５ｍＬ、より好ましくは０．１～０．２mＬを腹腔内注射することが好ましい。
　本実施形態の弱毒生ワクチンは、１回の投与でその作用持続期間は１年以上持続し、長期にわたってノカルジア症の感染防御効果を奏することができる。本発明のワクチンの投与回数は、その作用が持続する限り１回でよいが、１～３０日間隔をあけて複数回、例えば２～５回投与してもよい。
　本実施形態の弱毒生ワクチンの投与対象魚類としては、ブリ属魚類（ブリ類）であれば制限されない。特にブリ類の養殖においては、養殖時にノカルジア症による死亡率を低下させることができ歩留まりを上昇させることができるため、本実施形態のワクチンの有用性は高いと考えられる。
［防除方法］
　本実施形態の防除方法は、弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類のノカルジア症の防除方法である。
　本実施形態の防除方法においては、投与される弱毒生ワクチンは叙述した弱毒生ワクチンである。
　本実施形態の防除方法において、弱毒生ワクチンをブリ属魚類に投与する方法としては、注射法、浸漬法、経口法などが挙げられる。それぞれの投与方法の一例について、以下に記載する。
（Ａ）注射法
　体重３０ｇ以上の魚に対して弱毒性細菌株の菌数を１.０×１０３～１.０×１０４ＣＦＵ／１００μＬに調製した弱毒生ワクチンの注射液を魚体あたり０.０５～０.１ｍＬ、腹腔内に接種する。なお、注射液には、弱毒性細菌株の菌体の他に薬学的に許容される液状の担体をさらに含有してもよい。液状の担体としては水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水等が挙げられる。
（Ｂ）浸漬法
　体重３０ｇ以上の魚に対して、弱毒性細菌株の菌数を１.０×１０７～１.０×１０８ＣＦＵ／Ｌに調製した菌体含有液に魚を１０～６０分間浸漬する。なお、浸漬法は、上記の注射法と比較して感染防御効果が低下すると考えられるため、必要に応じて追加免疫を行ってもよい。
（Ｃ）経口法
　経口法では、弱毒性細菌株の生菌体を混合した餌料を魚体あたり１.０×１０3～１.０×１０7ＣＦＵとなるように摂餌させる。本方法を採用する場合には、必要に応じて追加免疫を行ってもよい。
　本実施形態の防除方法では、投与対象の魚種の性質、形態などに応じて上述し
た様々な投与方法を適宜選択して採用することができるが、より感染予防効果を高めるためには、後述の実施例で行ったような腹腔内注射を採用することが好ましい。
　本実施形態の防除方法によれば、ブリ属魚類におけるノカルジア症をより効率的に予防することができる。
［生産方法］
　本実施形態の生産方法は、上述した弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類の生産方法である。
　弱毒生ワクチンをブリ類に投与する方法は、上述したブリ属魚類のノカルジア症の防除方法と同様である。
　以下では実験例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
＜ＭｔｒＡ遺伝子の一部に変異があり、そのコードするアミノ酸配列の一部において１７９番目のＶａｌがＧｌｙに置換されたノカルジア・セリオレ　ＦＰＣ１０７３（ＦＰＣ，水産技術研究所）を用いた弱毒生ワクチンの検討＞
　ノカルジア症の強毒株として大分県から分譲されたＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　０２４０１３を継代培養することにより、病原性の変異した新規弱毒株Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３を得た。
　１０４ＣＦＵ／１００μＬのＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３をブリ体腔内に接種し、１ケ月間２５℃の海水（流水）にて飼育した。本株接種ブリに対して人為感染を施すため、同菌の強毒性菌株であるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＫＧＮ１２６６（ＫＧＮ，鹿児島県水産技術研究開発センター）を飼育水に１０７ＣＦＵ／Ｌとなるよう添加し、１０分間浸漬した。感染後、２５℃の海水（流水）にて飼育し、６０日間観察した後生残率を算出したところ、図１に示すように高い感染防御効果を示した。
＜他のノカルジア属最近を用いた弱毒生ワクチンの評価＞
　１０８ＣＦＵ／１００μＬのＮ．　ｆｌｕｍｉｎｅａ　ＪＣＭ１１４４０、Ｎ．　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｕｍｍｉｄｅｌｅｎｓ　ＪＣＭ１１４４１、又はＮ．　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ　ＪＣＭ３２２４をブリ体腔内に接種し、１４日間２５℃の海水（流水）にて飼育した。菌株接種ブリに対して人為感染を施すため強毒株であるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　０２４０１３を飼育水に１０８ＣＦＵ／Ｌとなるように添加し、１０分間浸漬した。感染後、２４℃の海水（流水）にて飼育し、３７日間観察した後生残率を算出したところ、図１に示すように感染防御効果は認められなかった。
　なお、ＪＣＭはＪａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センター、茨城県つくば市高野台３－１－１）を示すアクロニムである。
＜結果＞
　図１は、ブリ（Ｓ．　ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである。
　実施例１：　Ｎ．　ｓｅｒｉｏａｅ　ＦＰＣ１０７３
　比較例１－１：　Ｎ．　ｆｌｕｍｉｎｅａ　ＪＣＭ１１４４０
　比較例１－２：　Ｎ．　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｕｍｍｉｄｅｌｅｎｓ　ＪＣＭ１１４４１
　比較例１―３：　Ｎ．　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ　ＪＣＭ３２２４
　比較例１－０：ＰＢＳ－Ｔ：０．５％ツイーン８０添加ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１，Ｆｉｓｈｅｒの正確検定，Ｈｏｌｍの方法。
［実験例２］
＜Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３と他のＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ株の比較による変異解析＞
　ノカルジア症の強毒株として大分県から分譲されたＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　０２４０１３と、継代培養により病原性の変異した新規弱毒株Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の全ゲノムを比較したところ、３ケ所のＳＮＰ（一塩基多型）のうち、病原性等に関与すると推定されるＭｔｒＡ（ｋｉｎａｓｅ（ＭｔｒＢ）と共役し種々のシグナルを伝える転写因子）遺伝子に生じた変異に着目したところ、アミノ酸レベルでも変異（ｐ．Ｖａｌ１７９Ｇｌｙ）していることが明らかになった。発明者らが保有する種々のＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ強毒株、並びに公開されたデータベースにあるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ及び近縁種のＭｔｒＡ遺伝子を比較したところ、ＦＰＣ１０７３以外においてアミノ酸配列の変異（ｐ．Ｖａｌ１７９Ｇｌｙ）は確認されなかった。
　図２に、ＭｔｒＡ遺伝子の塩基配列に変異が生じている部分を含む塩基配列をＤＮＡシーケンサーから出力された波形で示す。
　また、表１に、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ　７株、Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ以外のＮｏｃａｒｄｉａ属細菌（５種６株）、高ＧＣ含量グラム陽性細菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（２種４株）のＭａｔｒＡ遺伝子産物（タンパク質）のアミノ酸配列の部分アラインメントを示す。
　ＭｔｒＡの変異（ｐ．Ｖａｌ１７９Ｇｌｙ）が、高い生ワクチン効果を有するＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ弱毒株の特徴であることが示唆された。
［実験例３］
＜カンパチ（Ｓ．　ｄｕｍｅｒｉｌｉ）における感染防除効果の検討＞
　Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３をカンパチの腹腔内に接種した。実験方法はブリの場合と同様である。
＜結果＞
　図３は、カンパチ（Ｓ．　ｄｕｍｅｒｉｌｉ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである。
　実施例３：　Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３
　比較例３：　ＰＢＳ－Ｔ：０．５％ツイーン８０添加ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
　実験例１と同様にして生残率を算出したところ、図３に示すように高い感染防御効果を示した。
［実験例４］
＜ヒラマサ（Ｓ．　ｌａｌａｎｄｉ）における感染防除効果の検討＞
　Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３をヒラマサの浸漬法により接種した。実験方法はブリの場合と同様である。
＜結果＞
　図４は、ヒラマサ（Ｓ．　ｌａｌａｎｄｉ）におけるＮ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３の感染防御効果を示すグラフである。
　実施例３：　Ｎ．　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３
　比較例３：　ＰＢＳ－Ｔ：０．５％ツイーン８０添加ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
＊＊，ｐ＜０．０１　Ｆｉｓｈｅｒの正確検定
　実験例１と同様にして生残率を算出したところ、図４に示すように高い感染防御効果を示した。
［実験例５］
　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ　ＦＰＣ１０７３株又は０２４０１３株の抽出ゲノムＤＮＡを鋳型としＭｔｒＡを増幅するＰＣＲを行なった。続いて、得られた増幅産物の塩基配列を解読するため、本増幅産物を鋳型としたサンガー法によるＤＮＡシーケンスを行なった。
　プライマーには、ＭｔｒＡ遺伝子のオープンリーディングフレームより下流の逆相補鎖配列に対して設計したオリゴヌクレオチドを用いた。
　なお、本シーケンシングにより得られたＭｔｒＡ遺伝子の逆相補鎖塩基配列は、シーケンスアセンブリソフトウェアを用いて相補配列のものに変換している。
　表２に、得られたＭｔｒＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す。
　表３に、得られたＭｔｒＡ遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。但し、これらのアミノ酸配列はＭｔｒＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列から推定されたものである。
　本発明の弱毒性細菌株はブリ属魚類のノカルジア症の防除のために有用な生ワクチンとして利用できる。本発明の弱毒生ワクチンはノカルジア症の防除効果が高いので、養殖ブリ属魚類のノカルジア症による損失を防止することができ、経済的効果も期待できる。
　ＮＰＭＤ　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０４０１３
　なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）を示すアクロニムである。

Claims (9)

  1. 　ＭｔｒＡ遺伝子の少なくとも一部に変異があり、前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくとも一部において１７９番目のアミノ酸がＶａｌからＧｌｙに置換されている、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｅｒｉｏｌａｅ（ノカルジア・セリオレ）の弱毒性細菌株。
  2. 　前記ＭｔｒＡ遺伝子の一部に変異がある塩基配列が配列番号１で与えられる、請求項１に記載の弱毒性細菌株。
  3. 　前記ＭｔｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号３で与えられる、請求項１に記載の弱毒性細菌株。
  4. 　ノカルジア・セリオレ　ＦＰＣ１０７３である、請求項１に記載の弱毒性細菌株。
  5. 　単離された細菌株である、請求項１～４のいずれか１項に記載の弱毒性細菌株。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の弱毒性細菌株を含む、弱毒生ワクチン。
  7. 　ブリ属魚類におけるノカルジア症を防除するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の弱毒性細菌株の弱毒生ワクチンとしての使用。
  8. 　請求項６に記載の弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類のノカルジア症の防除方法。
  9. 　請求項６に記載の弱毒生ワクチンをブリ類に投与することを含む、ブリ属魚類の生産方法。
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