TW202546215A - 減毒性細菌株及其用途、減毒活疫苗、防治方法、以及生產方法 - Google Patents

Abstract

藉由本發明而提供一種Nocardia seriolae (鰤魚屬奴卡菌)之減毒性細菌株，該細菌株係在MtrA基因之至少一部分存在突變，前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列之至少一部分中第179號之胺基酸從Val(Valine；纈胺酸)置換成Gly(Glycine；甘胺酸)。

Description

減毒性細菌株及其用途、減毒活疫苗、防治方法、以及生產方法

本發明係關於減毒性細菌株、減毒活疫苗、防治方法、及生產方法。

在鰤類養殖中由奴卡菌症所造成的魚病損害非常嚴重。奴卡菌症係以屬於放射線菌之一的鰤魚屬奴卡菌(Nocardia seriolae)感染作為原因之五條鰤(Seriola quinqueradiata)、高體鰤(Seriola dumerili)及黃尾鰤(Seriola lalandi)等鰤類之感染症。在罹患奴卡菌症之魚中，在感染中期以後可確認體表之潰瘍、鰓、腎臟及脾臟之結節形成。因此，罹患奴卡菌症而形成潰瘍及／或結節之魚即便生存時其商品價值亦有巨大的損害。鰤魚屬奴卡菌係對紅黴素或是螺旋黴素等抗生素、或泰滅淨(sulfamonomethoxine)或是磺胺異噁唑鈉(Sulfisozole sodium)等合成抗菌劑敏感，此等抗生素或合成抗菌劑為有效的。然而，大量使用抗生素或合成抗菌劑會伴隨抗藥性菌株的出現，因此強烈要求疫苗的開發。

在專利文獻1中記載一種針對起因於愛德華氏菌之魚類感染症的疫苗，係含有源自對投予對象之魚種實質上未顯示病原性之愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的抗原而成；一種針對起因於愛德華氏菌之魚類感染症的疫苗之製造方法，係使用對投予對象之魚種實質上未顯示病原性之愛德華氏菌；以及一種起因於愛德華氏菌之魚類感染症的預防方法，係包含對魚投予前述疫苗之步驟。

在專利文獻2中記載一種藥理組成物之製造方法，係包含以含有2價陽離子螯合劑之培養基來培養鰤魚屬奴卡菌的培養步驟；一種藥理組成物，係藉由前述藥理組成物之製造方法而獲得；及一種魚類用疫苗，係含有前述藥理組成物。

在專利文獻3中記載一種用以對抗魚類中之奴卡菌屬(Nocardia)感染之混合疫苗，係包含乳酸球菌(Lactococcus garvieae)、巴斯德桿菌(Pasteurella piscicida)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)及鰤魚屬奴卡菌種之細菌以及醫藥上容許之載體。

就開發針對鰤魚屬奴卡菌之疫苗的嘗試而言，對五條鰤注射近緣種之N. soli(土壤奴卡菌)、N. fluminea(河流奴卡菌)或N. uniformis(均態奴卡菌)。再者，投予鰤魚屬奴卡菌(N. seriolae)之低病原性株，來將活疫苗之使用概念加以模式化。經注射N. soli及N. fluminea之活細胞的魚係對N. seriolae之人工挑戰顯示輕微的抵抗性。另一方面，從N. seriolae感染存活下來的魚係對N. seriolae挑戰顯示完全的抵抗性。由此等結果暗示了於五條鰤中誘導了針對N. seriolae的防禦免疫反應(非專利文獻1)。

屬於格蘭氏陽性之兼性細胞內病原體之鰤魚屬奴卡菌，已被鑑定為魚類奴卡菌症之病原菌，對廣泛的魚種造成極高的死亡率及罹患率。因此，對於此病原體的有效疫苗係為了抑制養殖業的重大損失而有迫切的需要。為了開發活疫苗，從野生株ZJ0503藉由連續繼代培養及紫外線照射獲得具有致突變性之N. seriolae S-250株及U-20株。進一步，探討S-250株及U-20株之生物學特性、毒性、穩定性、免疫反應媒介、對於雜種鱧魚(斑鱧(Channa maculata)♀×烏鱧(C. argus)♂)之防禦功效。其結果，U-20株與ZJ0503株相比較，係在形態學的特性上劇烈地變化，對雜種鱧魚之病原性顯著地降低，另一方面，S-250株與ZJ0503株相比較未觀察到明顯的差異。對雜種鱧魚分別以亞臨床用量以腹腔內注射ZJ0503株、S-250株及U-20株時，顯示非特異性免疫參數(血清LYZ、POD、ACP、AKP及SOD活性)、特異性抗體(IgM)價產生、免疫相關基因(CC1、CC2、IL-1β、IL-8、TNFα、IFNγ、MHCIα、MHCIIα、CD4、CD8α、TCRα及TCRβ)的表現上昇，可誘發體液性免疫反應及細胞性免疫反應。進一步，由ZJ0503株、S-250株及U-20株所致之疫苗接種後的雜種鱧魚中的相對存活率(RPS)防禦功效分別為28.85%、56.89%及89.65%。由以上可知，S-250株及U-20株係誘發針對鰤魚屬奴卡菌(N. seriolae)之強力的免疫反應，可對雜種鱧魚賦予防禦功效，暗示成為用以防治養殖魚之奴卡菌症的活疫苗之候選株(非專利文獻2)。

鰤魚屬奴卡菌(Nocardia seriolae)係魚類之奴卡菌症的主要病原體。在申請人之先前研究中，丙胺酸脫氫酶被鑑定為N. seriolae之潛在性病原因子。根據此事實，將N. seriolae之丙胺酸脫氫酶基因(NsAld)剔除(knock-out)，建立針對魚類奴卡菌症之疫苗開發用的ΔNsAld株。ΔNsAld株之LD₅₀係3.90×10⁵CFU/隻，顯著高於野生株(5.28×10⁴CFU/隻) (p＜0.05)。再者，將ΔNsAld株作成活疫苗，以2.47×10⁵CFU/隻對雜種鱧魚(斑鱧(Channa maculata)♀×烏鱧(Channa argus)♂)腹腔內注射時，非特異性免疫指標(LZM、CAT、AKP、ACP、SOD活性)、特異性抗體價(IgM)、一些免疫相關基因(CD4、CD8α、IL-1β、MHCIα、MHCIIα、TNFα)在不同的組織中上昇，顯示此疫苗可誘導體液性及細胞性免疫反應。進一步，ΔNsAld疫苗之存活率(RPS)係76.48%。由此等結果暗示了ΔNsAld株可成為養殖魚之奴卡菌症控制用的活疫苗開發之潛在候選株(非專利文獻3)。[先前技術文獻][專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2007-238505號公報。[專利文獻2]日本特開2013-184916號公報。[專利文獻3]日本特表2011-502972號公報。[非專利文獻]

[非專利文獻1] Itano, T. 其他3名，“Live vaccine trials against nocardiosis in yellowtail Seriola quinqueradiata”，Aquaculture，2006年，第261卷，p.1175-1180[非專利文獻2] Li, B. 其他7名，“Induction of attenuated Nocardia seriolae and their use as live vaccine trials against fish nocardiosis”，Fish and Shellfish Immunology，2022年，第131卷，p.10-20[非專利文獻3] Liu,Y. 其他6名，“Construction of an alanine dehydrogenase gene deletion strain for vaccine development against Nocardia seriolae in hybrid snaｋehead (Channa maculata ♀ × Channa argus ♂)”，Fish and Shellfish Immunology，2023年，第138卷，108827

[發明所欲解決之課題]即便對五條鰤接種藉由福馬林及加熱處理而失活之鰤魚屬奴卡菌菌體仍無法獲得防禦功效，尚未開發出鰤類之奴卡菌症防治功效高的疫苗。

本發明係有鑑於上述情事而完成，為了生產鰤類之奴卡菌症防治用之減毒活疫苗，以提供有用之減毒性細菌株及減毒活疫苗作為課題。[用以解決課題之手段]

本案發明人們為了解決上述課題經過反覆精心探討之結果，瞭解將MtrA基因之一部分存在突變，且該MtrA基因所編碼的胺基酸序列之一部分突變成V¹⁷⁹→G¹⁷⁹的鰤魚屬奴卡菌(N. seriolae)作為減毒活疫苗使用時，可有效地防治鰤類之奴卡菌症，進而完成本發明。因此，本發明之態樣係以下所列。

[1] 一種Nocardia seriolae(鰤魚屬奴卡菌)之減毒性細菌株，係在MtrA基因之至少一部分存在突變，前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列之至少一部分中第179號的胺基酸從Val(Valine；纈胺酸)置換成Gly(Glycine；甘胺酸)。[2] 如[1]所記載之減毒性細菌株，其中係以序列編號1給出在前述MtrA基因之一部分存在突變之鹼基序列。[3] 如[1]或[2]所記載之減毒性細菌株，其中係以序列編號3給出前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列。[4] 如[1]至[3]中任一項所記載之減毒性細菌株，係鰤魚屬奴卡菌 FPC1073。[5] 如[1]至[4]中任一項所記載之減毒性細菌株，係經單離之細菌株。[6] 一種減毒活疫苗，其包含如[1]至[5]中任一項所記載之減毒性細菌株。[7] 一種如[1]至[5]中任一項所記載之減毒性細菌株作為減毒活疫苗之用途，係用以防治鰤屬魚類中的奴卡菌症。[8] 一種鰤屬魚類之奴卡菌症之防治方法，係包含對鰤類投予如[6]所記載之減毒活疫苗。[9] 一種鰤屬魚類之生產方法，係包含對鰤類投予如[6]所記載之減毒活疫苗。[發明功效]

根據本發明，為了生產鰤類之奴卡菌症防治用的減毒活疫苗，可提供有用的減毒性細菌株及減毒活疫苗。

在專利文獻1至專利文獻3中，並未記載N. seriolae FPC1073株的MtrA基因之一部分存在突變、MtrA基因的胺基酸序列一部分中第179號的胺基酸從Val置換成Gly、以及與FPC1073株本身相關之記載。

在本發明中，「鰤類」及「鰤屬魚類」係設為包含五條鰤(學名：Seriola quinqueradiata)、黃尾鰤(學名：Seriola lalandi)、高體鰤(學名：Seriola dumerili)及長鰭鰤(學名：Seriola rivoliana)。但是，在根據魚類分類學上的重組而學名變更的情況中，只要變更前的學名為上述者，則該種設為包含於「鰤類」及「鰤屬魚類」。例如，Seriola lalandi重組為Seriola aureovittata、Seriola dorsalis及Seriola lalandi之3種的情況中，此等3種皆包含於「鰤類」及「鰤屬魚類」。進一步，根據分子系統學的研究(Premachandra, H. K. A., et al. "Genomic DNA variation confirmed Seriola lalandi comprises three different populations in the Pacific, but with recent divergence."Scientific Reports 7.1 (2017): 9386.)，顯示與五條鰤、高體鰤及長鰭鰤為近緣之S. zonata(環帶鰤)及S. fasciata(斑紋鰤)亦包含於「鰤類」及「鰤屬魚類」。

以下針對本發明之實施形態詳細地說明。惟，本發明並非限定為後述實施形態，只要不偏離本發明之要旨可有各種的變更。

[減毒性細菌株]本實施形態之減毒性細菌株係一種Nocardia seriolae(鰤魚屬奴卡菌)之減毒性細菌株，係在MtrA基因之至少一部分存在突變，前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列之至少一部分中第179號的胺基酸從Val置換成Gly。

MtrA基因之至少一部存在突變，該MtrA基因所編碼之胺基酸序列中第179號的胺基酸從Val置換成Gly，係例如可藉由確定菌株的MtrA基因之DNA鹼基序列而進行判斷。再者，亦可藉由確定菌株之MtrA基因的轉錄產物(mRNA)或互補DNA(cDNA)的鹼基序列而進行判斷。

本實施形態之減毒性細菌株的較佳態樣係鰤魚屬奴卡菌 FPC1073。本態樣之減毒性細菌株也可為鰤魚屬奴卡菌 FPC1073經培養者。

本實施形態之減毒性細菌株較佳為經單離之細菌株。

鰤魚屬奴卡菌 FPC1073，係於獨立行政法人製品評價技術基盤機構 特許微生物寄託中心(NPMD)(日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室)作為NITE BP-04013寄存(受託日：2023年11月15日)。

[減毒活疫苗]本實施形態之減毒活疫苗係包含上述減毒性細菌株之減毒活疫苗。

本實施形態之減毒活疫苗除了上述減毒性細菌株以外，亦可更含有藥學上容許之液狀或固體狀的載體。作為液狀載體可列舉：水、磷酸鹽緩衝液(PBS)、生理食鹽水等。作為固體狀載體者可列舉：滑石、蔗糖等賦形劑。本實施形態之減毒活疫苗的形態沒有特別的限制，可為注射劑、經口劑、浸漬劑之任一者，較佳為採用以少量投予而長期具有功效持續性之注射劑的形態。再者，在經口劑形態之情形中，亦可於通常的魚類飼料中混合上述減毒性細菌株。

注射用疫苗係可將上述減毒性細菌株之活菌體懸濁於經滅菌之魚類用生理食鹽水等而製備。此外，在該注射用疫苗中，除了活菌體及生理食鹽水以外，亦可調配該注射劑通常使用之懸浮劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、保存劑、助溶劑或其他的適當添加劑。

再者，佐劑係從過往為了使疫苗的免疫功效等提升而被使用。本實施形態之減毒活疫苗，係即使不使用如此之佐劑，仍可獲得充分的免疫功效者。然而，本實施形態之減毒活疫苗並非對佐劑的使用有任何限制，除了上述成分以外亦可調配佐劑。

一般而言，佐劑係非特異性增強宿主的免疫反應之物質，多數的各種佐劑在該技術領域中為習知。就佐劑之例而言可列舉下列佐劑，但不限定於此等佐劑：礦物、植物及動物性油脂、維生素E等油溶性維生素等、進一步添加此等用之界面活性劑、明礬、鋁化合物、膨潤土、胞壁醯二肽(muramyl dipeptide)衍生物、介白素、內毒素。

本實施形態之減毒活疫苗所含有的活菌體之量沒有特別的限制，但較佳設為1.0×10²CFU/100μL至1.0×10⁴CFU/100μL，更佳設為1.0×10³CFU/100μL至1.0×10⁴CFU/100μL。疫苗所含有之上述減毒性細菌株之量較佳為每1次投予，以濕菌體計為0.1μg至1.0μg。

此外，藉由增減對魚投予之疫苗的用量(μL)，而可適宜地調節有效量，因此，本實施形態之減毒活疫苗中的上述減毒性細菌株含量並非限定為上述之量。此外，在使用製備好的減毒活疫苗時，例如，較理想為依照動物用生物學的製劑檢定基準之五條鰤α溶血性鏈球菌症失活疫苗(注射型)等，來檢定疫苗之安全性及有效性，確認及保證其品質。

對魚進行腹腔內注射本發明之疫苗時的較理想的投予量，係根據進行投予之季節及水溫、魚的種類、年齡及體重等各種要因而異，無法籠統地規定。惟，例如使用將濕菌體重量0.1g/mL之疫苗進一步稀釋10,000倍而製備成的疫苗，相對於體重30至500g之魚，通常較佳為因應體重而腹腔內注射50μL至500μL左右。

本發明之疫苗只要為鰤屬魚類，則例如，通常能夠使用於體重30g以上，具體而言為體重30g至5kg，較佳30g至200g，較佳更佳50g至200g之鰤屬魚類。為了更有效地利用疫苗，較佳為在罹患奴卡菌症前，例如於幼魚階段進行投予。特別是，較佳的是在出生後3個月至7個月，較佳為出生後4個月至5個月腹腔內注射本發明之疫苗0.05mL至0.5mL，更佳為0.1mL至0.2mL。

本實施形態之減毒活疫苗藉由1次投予，該減毒活疫苗的作用持續期間係持續1年以上，可長期發揮奴卡菌症之感染防禦功效。本發明之疫苗的投予次數係只要持續該疫苗的作用則可為投予1次，但亦可為間隔1天至30天投予複數次，例如投予2次至5次。

本實施形態之減毒活疫苗的投予對象魚類只要為鰤屬魚類(鰤類)則沒有限制。特別是在鰤類的養殖中，由於可降低養殖時由奴卡菌症所致之死亡率並提升成品率，因此推論本實施形態之疫苗的有用性高。

[防治方法]本實施形態之防治方法係鰤屬魚類之奴卡菌症的防治方法，該防治方法係包含對鰤類投予減毒活疫苗。

本實施形態之防治方法中，被投予之減毒活疫苗係已敘述之減毒活疫苗。

在本實施形態之防治方法中，就對鰤屬魚類投予減毒活疫苗之方法而言，可列舉注射法、浸漬法、經口法等。於以下記載各個投予方法之一例。

(A)注射法將減毒活疫苗之注射液以每魚體為0.05mL至0.1mL之方式接種於腹腔內，該減毒活疫苗之注射液係相對於體重30g以上之魚，將減毒性細菌株之菌數製備成1.0×10³CFU/100μL至1.0×10⁴CFU/100μL。此外，注射液中，除了減毒性細菌株之菌體以外，可更含有藥學上容許之液狀載體。作為液狀載體可列舉水、磷酸鹽緩衝液(PBS)、生理食鹽水等。

(B)浸漬法在菌體含有液中將魚浸漬10分鐘至60分鐘，該菌體含有液係相對於體重30g以上之魚，將減毒性細菌株之菌數製備成1.0×10⁷CFU/L至1.0×10⁸CFU/L。此外，浸漬法係由於相較於上述注射法，認為感染防禦功效降低，因而亦可因應所需而進行追加免疫。

(C)經口法在經口法中，將混合了減毒性細菌株之活菌體的餌料，以成為每魚體1.0×10³CFU至1.0×10⁷CFU之方式使魚攝餌。採用本方法之情形中，因應所需亦可進行追加免疫。

在本實施形態之防治方法中，可因應投予對象之魚種性質、形態等而適宜地選擇並採用上述各種投予方法，惟為了更提升感染預防功效，較佳為採用如後述實施例所進行之腹腔內注射。

根據本實施形態之防治方法，可更有效率地預防鰤屬魚類的奴卡菌症。

[生產方法]本實施形態之生產方法係鰤屬魚類之生產方法，該生產方法係包含對鰤類投予上述之減毒活疫苗。對鰤類投予減毒活疫苗之方法，係與上述鰤屬魚類之奴卡菌症的防治方法相同。[實施例]

以下根據實驗例來更具體地說明本發明，但本發明並非限定為後述實施例。

[實驗例1]＜使用鰤魚屬奴卡菌 FPC1073(FPC，水產技術研究所)之減毒活疫苗的探討，該鰤魚屬奴卡菌 FPC1073係MtrA基因之一部分存在突變，該MtrA基因所編碼之胺基酸序列的一部分中第179號之Val置換成Gly ＞藉由將從大分縣分讓之N. seriolae 024013作為奴卡菌症強毒株進行繼代培養，而獲得病原性經突變之新穎的弱毒株N. seriolae FPC1073。

於五條鰤體腔內接種10⁴CFU/100μL之N. seriolae FPC1073，以1個月25℃的海水(流水)飼育。為了對於本株接種五條鰤施行人為感染，以使同菌的強毒性菌株之N. seriolae KGN1266(KGN，鹿兒島縣水產技術研究開發中心)成為10⁷CFU/L之方式添加於飼育水中，並浸漬10分鐘。感染後，以25℃的海水(流水)飼育，觀察60天後並計算存活率時，如圖1所示般，顯示較高的感染防禦功效。

＜使用其他奴卡菌屬細菌之減毒活疫苗的評估＞於五條鰤體腔內接種10⁸CFU/100μL之N. fluminea JCM11440、N. salmonicida subsp. cummidelens JCM11441、或N. uniformis JCM3224，以14天25℃的海水(流水)飼育。為了對於菌株接種鰤魚施行人為感染，以強毒株之N. seriolae 024013成為10⁸CFU/L之方式添加於飼育水中，並浸漬10分鐘。感染後，以24℃海水(流水)飼育，觀察37日後並計算存活率時，如圖1所示般，未確認到感染防禦功效。此外，JCM係表示Japan Collection of Microorganisms(日本微生物保藏中心)(國立研究開發法人理化學研究所生物資源研究中心，茨城縣筑波市高野台3-1-1)之縮寫字。

＜結果＞圖1係表示五條鰤中之N. seriolae FPC1073的感染防禦功效之圖表。實施例1：N. serioae FPC1073比較例1-1：N. fluminea JCM11440比較例1-2：N. salmonicida subsp. cummidelens JCM11441比較例1-3： N. uniformis JCM3224比較例1-0：PBS-T：添加0.5%Tween 80之PBS(磷酸鹽緩衝生理鹽水)*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001，Fisher之正確檢定，Holm之方法。

[實驗例2]＜N. seriolae FPC1073與其他N. seriolae株之比較所進行之突變解析＞將從大分縣分讓的N. seriolae 024013作為奴卡菌症之強毒株，與藉由繼代培養而病原性經突變之新穎弱毒株N. seriolae FPC1073的全基因體進行比較時，在3處的SNP(單核苷酸多型性)中，著眼於在推定參與病原性等的MtrA(與激酶(kinase)(MtrB)共軛並傳遞各種訊號之轉錄因子)基因所產生的突變時，發現在胺基酸層級也存在突變(p.Val179Gly)。將發明人們所保有之各種N. seriolae強毒株，以及在公開資料庫中之N. seriolae及近緣種的MtrA基因進行比較時，除了FPC1073以外未確認到胺基酸序列之突變(p.Val179Gly)。圖2中將包含於MtrA基因之鹼基序列產生突變之部分的鹼基序列以從DNA定序儀所輸出之波形來顯示。

再者，在表1中，顯示Nocardia seriolae 7株、N. seriolae以外之Nocardia屬細菌(5種6株)、高GC含量格蘭氏陽性細菌之Mycobacterium(分枝桿菌)屬細菌(2種4株)之MatrA基因產物(蛋白質)之胺基酸序列的部分比對。MtrA之突變(p.Val179Gly)暗示具有高活疫苗功效之N. seriolae弱毒株的特徵。

[表1]表1. MtrA基因產物之胺基酸序列之部分比對

細菌種 (Bacterial Species)	株編號 (Strain No.)	位置
172	173	174	175	176	177	178	179	180
Nocardia seriolae	FPC1073	R	E	V	L	L	E	Q	G	L
Nocardia seriolae	024013	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia seriolae	UTF1	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia seriolae	EM150506	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia seriolae	TL20	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia seriolae	NK201610020	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia seriolae	MH196537	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia brasiliensis	AUSMDU00024985	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia asteroides	FDAARGOS_1621	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia farcinica	IFM_10152	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia yunnanensis	CFH_S0054	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia yamanashiensis	FDAARGOS_1623	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Nocardia terpenica	NC_YFY_NT001	・	・	・	・	・	・	・	V	・
Mycobacterium tuberculosis	TRS15	・	D	・	・	・	・	・	V	・
Mycobacterium tuberculosis	SEA11020068P6C4	・	D	・	・	・	・	・	V	・
Mycobacterium marinum	CCUG20998	・	D	・	・	・	・	・	V	・
Mycobacterium marinum	E11	・	D	・	・	・	・	・	V	・

[實驗例3]＜高體鰤中之感染防治功效之探討＞於高體鰤之腹腔內接種N. seriolae FPC1073。實驗方法係與五條鰤之情形相同。

＜結果＞圖3係顯示高體鰤中之N. seriolae FPC1073的感染防禦功效之圖表。實施例3：N. seriolae FPC1073比較例3：PBS-T：添加0.5%Tween 80之PBS(磷酸鹽緩衝生理鹽水)與實驗例1同樣地施行並計算存活率時，如圖3所示般，顯示較高的感染防禦功效。

[實驗例4]＜黃尾鰤中之感染防治功效之探討＞將N. seriolae FPC1073藉由黃尾鰤之浸漬法進行接種。實驗方法係與五條鰤之情形相同。

＜結果＞圖4係顯示黃尾鰤中之N. seriolae FPC1073的感染防禦功效之圖表。實施例4：N. seriolae FPC1073比較例4：PBS-T：添加0.5% Tween 80之PBS(磷酸鹽緩衝生理鹽水)**，p＜0.01 Fisher之正確檢定與實驗例1同樣地施行並計算存活率時，如圖4所示般，顯示較高的感染防禦功效。

[實驗例5]將Nocardia seriolae FPC1073株或024013株之萃取基因體DNA作為模板進行將MtrA增幅之PCR。接著，為了解讀獲得之增幅產物的鹼基序列，進行以本增幅產物作為模板之桑格定序法所致之DNA定序。引子係使用針對MtrA基因之開放閱讀框(open reading frame)更下游之反向互補股序列所設計出的寡核苷酸。此外，藉由本定序所獲得之MtrA基因的反向互補股鹼基序列，係使用序列組裝軟體轉換成互補序列的序列。

表2中顯示獲得之MtrA基因的DNA鹼基序列。

[表2]

在表3中，顯示獲得之MtrA基因產物的胺基酸序列。惟，此等胺基酸序列係從MtrA基因之DNA鹼基序列所推定的序列。

[表3][產業可利用性]

本發明之減毒性細菌株係為了鰤屬魚類之奴卡菌症可作為有用的活疫苗來利用。本發明之減毒活疫苗係由於奴卡菌症之防治功效高，因此可防止養殖鰤屬魚類因奴卡菌症所致之損失，亦可期待經濟上的功效。[寄存編號]

NPMD NITE BP-04013此外，NPMD係表示獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室)之縮寫字。

[圖1] 圖1係顯示五條鰤中之鰤魚屬奴卡菌(N. seriolae) FPC1073的感染防禦功效之圖表(實驗例1)。[圖2] 圖2係顯示將N. seriolae之弱毒株FPC1073與強毒株024013的基因體上之MtrA基因鹼基序列的一部分比較之結果的圖(實驗例2)。[圖3] 圖3係顯示高體鰤中之N. seriolae FPC1073的感染防禦功效之圖表(實驗例3)。[圖4] 圖4係顯示黃尾鰤中之N. seriolae FPC1073的感染防禦功效之圖表(實驗例4)。

JP 日本 獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心 2023年11月15日 NITE BP-04013

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Claims (9)

1. 一種Nocardia seriolae(鰤魚屬奴卡菌)之減毒性細菌株，係在MtrA基因之至少一部分存在突變，前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列之至少一部分中第179號之胺基酸從纈胺酸(Val)置換成甘胺酸(Gly)。
2. 如請求項1所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株，其中係以序列編號1給出在前述MtrA基因之一部分存在突變之鹼基序列。
3. 如請求項1所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株，其中係以序列編號3給出前述MtrA基因所編碼之胺基酸序列。
4. 如請求項1所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株，其係鰤魚屬奴卡菌 FPC1073。
5. 如請求項1至4中任一項所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株，係經單離之細菌株。
6. 一種減毒活疫苗，係包含如請求項1至4中任一項所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株。
7. 一種如請求項1至4中任一項所記載之Nocardia seriolae之減毒性細菌株作為減毒活疫苗之用途，係用以防治鰤屬魚類中的奴卡菌症。
8. 一種鰤屬魚類之奴卡菌症之防治方法，係包含對鰤類投予如請求項6所記載之減毒活疫苗。
9. 一種鰤屬魚類之生產方法，係包含對鰤類投予如請求項6所記載之減毒活疫苗。