WO2025058090A1 - Mhc遺伝子群欠損動物 - Google Patents

Abstract

一の非ヒト哺乳動物（非ヒト哺乳動物１）の１対の染色体のうち一方の野生型染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群の全部又は一部が前記非ヒト哺乳動物１以外の他の哺乳動物（哺乳動物２）のＭＨＣ遺伝子群に置換された染色体をヘテロで有する細胞から、当該非ヒト哺乳動物１由来のＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群１）の全部又は一部を破壊又は欠損させる工程を含む、前記非ヒト哺乳動物１の染色体中に前記哺乳動物２のＭＨＣ遣伝子群（ＭＨＣ遺伝子群２）を有する染色体と、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する細胞の製造方法。

Description

ＭＨＣ遺伝子群欠損動物

　本発明は、ＭＨＣ遺伝子群を破壊又は欠失させた染色体、当該染色体を有する細胞等に関する。

　主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は細胞内の抗原をＴ細胞に提示する機能を持つ膜タンパク質である。ＭＨＣ遺伝子には、細胞内抗原をＣＤ８陽性Ｔ細胞に抗原提示するＭＨＣクラスＩ、細胞外から取り込んだ抗原をＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示するＭＨＣクラスＩＩ、抗原ペプチドの提示制御やＮＫ細胞の活性制御など抗原提示以外の生理機能を持つ分子も含まれる非古典的ＭＨＣが存在する。これらＭＨＣ遺伝子はマウスでは１７番染色体上に存在するＭＨＣ領域に存在しており、系統によっても異なるが、Ｃ５７ＢＬ／６系統では３９種類存在するとされている（非特許文献１）。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を利用した医薬品開発などでマウスをモデル動物として用いる場合、ヒト免疫応答を再現するためにはマウスＭＨＣを発現しない個体にヒトＭＨＣを発現させる必要がある。しかしマウスＭＨＣ遺伝子群は多数存在するため、ゲノム編集技術を用いてもＭＨＣ遺伝子を全て欠損させたマウスの作製は技術的に非常に困難であり、未だ作出されていない。このため、現在は抗原提示で主要な働きをする古典的ＭＨＣ遺伝子を削除したマウスを利用するか、ＭＨＣクラスＩと複合体を形成するβ２マクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子をノックアウトしたマウスを、ＭＨＣクラスＩ欠損マウスの代替として用いられている。しかし、前者では非古典的ＭＨＣが発現したままとなっており、後者ではマウスＭＨＣ遺伝子が破壊されていないためヒトＭＨＣはＢ２Ｍとの融合タンパク質として発現させる必要があるなど理想的なモデル系ではない。

Ｓｈｉｉｎａ，Ｔ．，Ｂｌａｎｃｈｅｒ，Ａ．，Ｉｎｏｋｏ，Ｈ．，ａｎｄＫｕｌｓｋｉ，Ｊ．Ｋ．（２０１７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ，ｍａｃａｑｕｅ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５０，１２７−１３８　１０．１１１１／ｉｍｍ．１２６２４

上記のことから、ＭＨＣ遺伝子群が欠損した動物の作出が望まれていた。ＭＨＣ遺伝子群欠損マウスが作出できればこれらの問題を解決することが可能である。またＭＨＣ遺伝子群欠損マウスを用いれば、ＭＨＣタンパク質の機能を個々に特異的に解析することも可能となる。

　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、マウスＭＨＣ遺伝子群を破壊又は欠失させたアリルを持つ細胞の作製に成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群の全部又は一部が欠損又は破壊された、非ヒト哺乳動物の染色体。
　［２］
　非ヒト哺乳動物がげっ歯類動物である［１］に記載の染色体。
　［３］
　げっ歯類動物がマウスである［２］に記載の染色体。
　［４］
　［１］に記載の染色体をホモ又はヘテロで含む細胞。
　［５］
　胚性幹細胞である［４］に記載の細胞。
　［６］
　［１］に記載の染色体を持つ非ヒト哺乳動物。
　［７］
　一の非ヒト哺乳動物（非ヒト哺乳動物１）の１対の染色体のうち一方の野生型染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群の全部又は一部が前記非ヒト哺乳動物１以外の他の哺乳動物（哺乳動物２）のＭＨＣ遺伝子群に置換された染色体をヘテロで有する細胞から、当該非ヒト哺乳動物１由来のＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群１）の全部又は一部を破壊又は欠損させる工程を含む、前記非ヒト哺乳動物１の染色体中に前記哺乳動物２のＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群２）を有する染色体と、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する細胞の製造方法。
　［８］
　細胞が胚性幹細胞である［７］に記載の方法。
　［９］
　前記ＭＨＣ遺伝子群１を破壊又は欠損させる工程が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術によるものである、［７］に記載の方法。
　［１０］
　非ヒト哺乳動物１がげっ歯類動物である［７］に記載の方法。
　［１１］
　げっ歯類動物がマウスである請求項［１０］に記載の方法。
　［１２］
前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部を破壊又は欠損させる工程が、Ｈ２−Ｍ１０．２、Ｈ２−Ｍ１０．１、Ｈ２−Ｍ１０．３、Ｈ２−Ｍ１０．４、Ｈ２−Ｍ１１、Ｈ２−Ｍ９、Ｈ２−Ｍ１、Ｈ２−Ｍ１０．５及びＨ２−Ｍ１０．６の遺伝子からなるｄ１遺伝子群、Ｈ２−Ｄ１、Ｈ２−Ｑ１、Ｈ２−Ｑ２、Ｈ２−Ｑ４、Ｈ２−Ｑ５、Ｈ２−Ｑ６、Ｈ２−Ｑ７及びＨ２−Ｑ１０の遺伝子からなるｄ２遺伝子群、Ｈ２−Ｔ２４、Ｈ２−Ｔ２３、Ｈ２−Ｔ２２、ＧＭ１１１２７、Ｈ２−Ｂｌ、Ｈ２−Ｔ１０、ＧＭ７０３０、ＧＭ８９０９及びＨ２−Ｔ３の遺伝子からなるｄ３遺伝子群、Ｈ２−Ｏｂ、Ｈ２−Ａｂ１、Ｈ２−Ａａ、Ｈ２−Ｅｂ１及びＨ２−Ｅｂ２の遺伝子からなるｄ４遺伝子群、Ｈ２−ＤＭａ、Ｈ２−ＤＭｂ２及びＨ２−ＤＭｂ１の遺伝子からなるｄ５遺伝子群、並びにＨ２−Ｋ１、Ｈ２−Ｏａ、Ｈ２−Ｍ５、Ｈ２−Ｍ３及びＨ２−Ｍ２の遺伝子からなるｄ６遺伝子群からなるマウスＭＨＣ遺伝子群を有する細胞から、前記ｄ１遺伝子群、ｄ２遺伝子群、ｄ３遺伝子群、ｄ４遺伝子群、ｄ５遺伝子群及びｄ６遺伝子群の全部又は一部の遺伝子群を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術により破壊又は欠損させる工程を含む、［１１］に記載の方法。
　［１３］
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術に用いられるゲノム編集ベクターが、配列番号５３~６７に示す塩基配列を有するｇＲＮＡからなるベクターの組み合わせである、［１２］に記載の方法。
　［１４］
　［７］に記載の方法により得られた細胞を用いて、前記非ヒト哺乳動物１の１対の染色体中、前記哺乳動物２のＭＨＣ遺伝子群２を有する染色体と、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する非ヒト哺乳動物１を作出し、当該非ヒト哺乳動物１を交配する工程を含む、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体を有する非ヒト哺乳動物１の作出方法。
　［１５］
　［１４］に記載の方法により作出された非ヒト哺乳動物１から、ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体を有する細胞を回収する工程を含む、当該細胞の製造方法。
　［１６］
　［１４］に記載の方法により作出された非ヒト哺乳動物１、又は請求項１５に記載の方法により製造された細胞から、ＭＨＣ遺伝子群１が破壊又は欠損された染色体を回収する工程を含む、当該染色体の製造方法。
　［１７］
［１３］に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術に用いられるゲノム編集ベクターであって、配列番号５３~６７に示す塩基配列を有するｇＲＮＡからなるベクターの組み合わせを含む、前記ゲノム編集ベクター。

　本発明により、ＭＨＣ遺伝子群欠損動物が提供される。

　［図１］本発明において非ヒトＭＨＣをヒトＭＨＣで置換するための組換えを示す模式図である。図は非ヒト動物がマウスである場合の模式図である。
　［図２］ヒト染色体におけるＭＨＣ領域を示す模式図である。
　［図３］ゲノム編集ターゲティングベクターを利用する場合の標的となる領域を示す図である。
　［図４］ＭＨＣ領域ヒト化マウス作製法の概略図である。
　［図５］ターゲティングベクターの構造を示す図である。
　（Ａ）ＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡの構造。（Ｂ）ＴＶ４−ｄＨ２の構造。（Ｃ）ＴＶ−Ｔｌ１／２−ＢＳの構造。ターゲティングベクターに用いたｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍのゲノム上の位置は図中に記載の通り。
　［図６］ヒト６番染色体を持つＡ９−ＭＲＣ５融合細胞クローンの単離を示す図である。
（Ａ）単離したＡ９−ＭＲＣ５融合細胞クローン（ｈＣｈＡ９＃１，　５，　１３，　１７）からゲノムＤＮＡを調製し、ヒト６番染色体上の配列が存在するかゲノムＰＣＲで解析。（Ｂ）ｈＣｈＡ９＃５にヒト６番染色体が存在することをＦＩＳＨで解析した。赤：ヒト６番染色体セントロメア特異的プローブ。
　［図７］ＴＶ３Ｒのターゲティングを示す図である。
（Ａ）Ａ９−ＭＲＣ５融合細胞クローンでＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡのターゲティングを行い、ハイグロマイシン耐性クローンを単離して組換え導入が起きているかゲノムＰＣＲで解析。＊はＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５（１２８）クローン。（Ｂ）ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５（１２８）からリクローニングを行いゲノムＰＣＲで解析。（Ｃ）ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５ａをＦＩＳＨ解析した。赤：ヒト６番染色体セントロメア特異的プローブ。
　［図８］ＴＶ４のターゲティングを示す図である。
（Ａ）ＴＶ４−ｄＨ２のターゲティングをゲノムＰＣＲで解析。＊はＴＶ４ＲＥＮＫＡ＃１７クローン。（Ｂ）ＤＡＰＩ染色によりＴＶ４ＲＥＮＫＡ＃１７の染色体数が４０本であることを確認した。
　［図９］ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡクローンの単離を示す図である。
改変ヒト６番染色体導入細胞ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ＃１７／５−４５ａ−３をＦＩＳＨ解析した。矢頭は導入した改変ヒト６番染色体。染色体数は４１本であることを確認した。赤：マウスＣｏｔ−１（マウスゲノム配列のプローブ）、紫：ＲＰ１１−５４Ｈ１３（ヒトＭＨＣ領域内のプローブ）
　［図１０］ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４クローンの単離を示す図である。
（Ａ）Ｃｒｅ／ｌｏｘＰによる組換え転座。（Ｂ）ゲノムＰＣＲによる転座の確認。＊はＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４＃１７−１。（Ｃ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４＃１７−１をＦＩＳＨ解析した。ＦＩＳＨ画像中の番号は模式図の転座染色体の番号と対応する。赤：ヒトＣｏｔ−１（ヒトゲノム配列のプローブ）、緑：マウスＣｏｔ−１（マウスゲノム配列のプローブ）（Ｄ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４＃１７−１をＦＩＳＨ解析した。ＦＩＳＨ画像中の番号は模式図の転座染色体の番号と対応する。赤：ＲＰ１１−５４Ｈ１３（ヒトＭＨＣ領域内のプローブ）、緑：ＲＰ２３−１４７Ｇ２３（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりセントロメア側のプローブ）、紫：ＲＰ２３−１１９Ｇ２４（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりテロメア側のプローブ）。
　［図１１］ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂクローンの単離を示す図である。
（Ａ）染色体転座をゲノムＰＣＲで解析。＊はＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂ＃３８クローン。（Ｂ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂ＃３８をＦＩＳＨ解析した。ＦＩＳＨ画像中の番号は模式図の転座染色体の番号と対応する。赤：ＲＰ２３−１４７Ｇ２３（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりセントロメア側のプローブ）、緑：ヒトＣｏｔ−１（ヒトゲノム配列のプローブ）、紫：ＲＰ２３−３０６Ｈ２０（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりテロメア側のプローブ）。
　［図１２］ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６クローンの単離を示す図である。
（Ａ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６のソーティング。（Ｂ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂ＃３８ｄｈ６＃３をＦＩＳＨ解析した。ＦＩＳＨ画像中の番号は模式図の転座染色体の番号と対応する。染色体数は４０本になっていることを確認した。赤：ＲＰ２３−１４７Ｇ２３（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりセントロメア側のプローブ）、緑：ヒトＣｏｔ−１（ヒトゲノム配列のプローブ）、紫：ＲＰ２３−３６１Ｃ１９（マウス１７番染色体ＭＨＣ領域よりテロメア側のプローブ）。（Ｃ）ホールゲノムシークエンスによりＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６＃３のＨＬＡハプロタイプを解析した結果。
　［図１３］ＭＨＣヒト化キメラマウスを示す図である。
（Ａ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６＃３由来キメラマウスの外観。（Ｂ）ＭＨＣヒト化マウス１７番染色体の構造。ＭＨＣ領域遠位側にＥＧＦＰ発現カセットが挿入されている。（Ｃ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６＃３由来キメラマウスの精巣細胞におけるＥＧＦＰの発現をフローサイトメトリーで解析。
　［図１４］ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスの作製を示す図である。
（Ａ）ＭＨＣヒト化（ヘテロ）細胞はＭＨＣ領域遠位側にＥＧＦＰ発現カセットが挿入されたＭＨＣヒト化マウス１７番染色体を持つ。（Ｂ）ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６＃３由来キメラマウスの精巣細胞を用いた顕微授精により生まれた個体。左：明視野像。右：ＥＧＦＰ蛍光を検出。（Ｃ）顕微授精により得られた産仔からゲノムを調製し、ヒトＭＨＣ領域内の配列が存在するかＰＣＲにより解析した。個体番号７と１２はＥＧＦＰ陰性であった産仔。
　［図１５］ＸＯ　ＥＳ細胞からのＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスの作製を示す図である。
（Ａ）ＴＶ３−４ＸＯＴｌｂｄｈ６＃１１−１−４−５７−３クローンから作製したキメラマウス。矢頭：１００％キメラマウス。（Ｂ）ＸＯキメラマウス（メス）とＣ５７ＢＬ／６（オス）の産仔。黒毛の個体はＸＯ　ＥＳ細胞が生殖系列伝播しない限り生まれない。（Ｃ）ＭＨＣ領域内に存在するＤＡＸＸ遺伝子座を標的としたゲノムタイピング法。１~３の３本のプライマーを用いてＭＨＣ領域がヒト由来かマウス由来かを判定する。赤矢印はヒトとマウスで配列が一致する部分に設計したプライマーの位置を示す。黒色はヒトまたはマウス特異的プライマー。（Ｄ）ＸＯキメラマウス（メス）とＣ５７ＢＬ／６（オス）の交配により得られた産仔のゲノムタイピング例。Ｗ：野生型マウス、Ｈ：ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウス。
　［図１６］ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスにおけるヒトＭＨＣタンパク質の発現解析結果を示す図である。
（Ａ）脾臓細胞におけるヒトＭＨＣタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析した。Ｗｔ，野生型マウス由来脾臓細胞；Ｈｅｔ，ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウス由来脾臓細胞。（Ｂ）脾臓細胞におけるヒトＭＨＣタンパク質の表面発現をフローサイトメトリーにより解析した。Ｗｔ，野生型マウス由来脾臓細胞；Ｈｅｔ，ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウス由来脾臓細胞。
　［図１７］ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を用いたマウスＭＨＣ遺伝子群欠損アリル作製の模式図。
　［図１８］ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞のＭＨＣ領域の構造、及びマウスＭＨＣ遺伝子群の分布を示す図。
上段はＭＨＣヒト化アリル、下段は野生型アリルを示す。マウスＭＨＣ遺伝子群をｄ１からｄ６の６つの遺伝子群に分類した。
　［図１９］マウスＭＨＣ欠損アリル作製手順を示す図。
　［図２０］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ１クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ１クラスターの模式図。ＣＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を示す。矢印は欠損の確認に用いたプライマーの位置を示す。（Ｂ）単離したクローンをゲノムＰＣＲにより解析した。矢頭は予想されるＰＣＲ増幅産物の位置を示す。（Ｃ）ゲノムＰＣＲ陽性であったクローンのＦＩＳＨ解析。赤色はマウス１７番染色体、紫色はヒトＭＨＣ領域、緑色はｄ１クラスターに対するプローブを用いた染色像を示す。
　［図２１］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ２クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ２クラスターの模式図。ＣＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を示す。矢印は欠損の確認に用いたプライマーの位置を示す。（Ｂ）単離したクローンをゲノムＰＣＲにより解析した。矢頭は予想されるＰＣＲ増幅産物の位置を示す。（Ｃ）ゲノムＰＣＲ陽性であったクローンのＦＩＳＨ解析。赤色はマウス１７番染色体、紫色はヒトＭＨＣ領域、緑色はｄ２クラスターに対するプローブを用いた染色像を示す。
　［図２２］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ３クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ３クラスターの模式図。ＣＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を示す。矢印は欠損の確認に用いたプライマーの位置を示す。（Ｂ）単離したクローンをゲノムＰＣＲにより解析した。矢頭は予想されるＰＣＲ増幅産物の位置を示す。（Ｃ）ゲノムＰＣＲ陽性であったクローンのＦＩＳＨ解析。赤色はマウス１７番染色体、紫色はヒトＭＨＣ領域、緑色はｄ３クラスターに対するプローブを用いた染色像を示す。
　［図２３］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ４クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ４クラスターの模式図。ＣＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を示す。矢印は欠損の確認に用いたプライマーの位置を示す。（Ｂ）単離したクローンをゲノムＰＣＲにより解析した。矢頭は予想されるＰＣＲ増幅産物の位置を示す。
　［図２４］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ５クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ５クラスターの模式図。ＣＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を示す。矢印は欠損の確認に用いたプライマーの位置を示す。（Ｂ）単離したクローンをゲノムＰＣＲにより解析した。矢頭は予想されるＰＣＲ増幅産物の位置を示す。（Ｃ）ゲノムＰＣＲ陽性クローンにおけるＨ２−Ｍ５の遺伝子破壊をシークエンス解析した。
　［図２５］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｄ６クローンの単離を示す図。
（Ａ）ｄ６遺伝子群の模式図。（Ｂ）単離したｄ６クローン＃１９８のシークエンス解析結果を示す。
　［図２６］Ｈ２−Ｍ２近傍のＳＮＰ解析を示す図。
（Ａ）Ｈ２−Ｍ２近傍のＳＮＰの位置を黒丸で示す。（Ｂ）ｄ６クローン＃１９８についてＨ２−Ｍ２の上流または下流に存在するＳＮＰ１，２（○印の数字で示す）について解析を行った。（Ｃ）ｄ６クローン＃１９８クローンの染色体数を解析。
　［図２７］ｄ５ホモマウスにおけるＴ細胞の分化を示す。
（Ａ）野生型またはｄ５ホモマウスから脾臓細胞または胸腺細胞を単離し、ＣＤ３陽性細胞内のＣＤ４またはＣＤ８の発現を解析した。（Ｂ，　Ｃ）野生型またはｄ５ホモマウスをＳＡＲＳ　ＣｏＶ−２　Ｓタンパク質で免疫し、血清中の抗Ｓ１　ＩｇＧ１（Ｂ）またはＩｇＧ２抗体（Ｃ）をＥＬＩＳＡにより解析した。
　［図２８］マウスＭＨＣ遺伝子群欠損マウスの作出を示す。
（Ａ）ｄ６ＥＳクローンから作出したキメラマウスと野生型マウスを交配して得た産仔をゲノムＰＣＲにより解析した結果。（Ｂ）生殖系列伝播したｄ６ヘテロマウス。（Ｃ）ｄ６ヘテロ♂とｄ６ヘテロ♀を交配して得た産仔をゲノムＰＣＲにより解析した結果。（Ｄ）交配により得られた個体番号３のｄ６ホモマウス。

　本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群が欠損又は破壊された非ヒト哺乳動物の染色体に関する。また本発明は、当該染色体をホモ又はヘテロで持つ細胞に関し、さらに当該細胞から作出され、ＭＨＣ遺伝子群が欠損又は破壊された染色体を持つ非ヒト哺乳動物等に関する。

　さらに本発明は、一の非ヒト哺乳動物（「非ヒト哺乳動物１」という）の１対の染色体のうち一方の染色体の野生型染色体のＭＨＣ遺伝子群（「ＭＨＣ遺伝子群１」ともいう）が、前記非ヒト哺乳動物１以外の他の哺乳動物のＭＨＣ遺伝子群（「ＭＨＣ遺伝子群２」ともいう）に置換された染色体をヘテロで有する細胞から、前記非ヒト哺乳動物１の染色体中に前記哺乳動物２のＭＨＣ遺伝子群２を有する染色体と、前記非ヒト哺乳動物１のＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する細胞を製造する方法を提供する。当該製造方法では、前記非ヒト哺乳動物１の他方の野生型染色体中のＭＨＣ遺伝子群１を破壊又は欠損させる工程を含む。

１．概要
常染色体上の配列は１対存在するため、ゲノム編集技術を用いた遺伝子破壊やゲノム配列の欠失はランダムにいずれかあるいは両方のアリルで生じる。しかし、ＭＨＣ欠損非ヒト哺乳動物を作製するには、一方のアリルで全てのＭＨＣ遺伝子を破壊又は欠損させなければならない。そして、非ヒト哺乳動物のＭＨＣ領域が一つのアリルにしかなければ、ＭＨＣ欠損アリルを作製することが可能である。そこで本発明者は、実施例としてマウスを用いて、マウスＭＨＣ領域が一つのアリルにしかないＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を作製した。このＥＳ細胞を用いて同一アリル上のマウスＭＨＣ遺伝子を破壊又は欠損させて、マウスＭＨＣ欠損アリルを作製する方法を考案し、マウスＭＨＣ欠損アリルを持つＥＳ細胞の樹立を行った。

　以下では、野生型の一の非ヒト哺乳動物の１対の染色体のうち一方の野生型染色体のＭＨＣ遺伝子群１が前記非ヒト哺乳動物１以外の他の哺乳動物（「哺乳動物２」という）のＭＨＣ遺伝子群２に置換された染色体をヘテロで有する細胞の作製について説明する。次に、当該ヘテロで有する細胞の染色体から、前記非ヒト哺乳動物１の他方の野生型染色体中のＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部を破壊又は欠損させる方法について説明する。

　非ヒト哺乳動物１は、自己のＭＨＣ領域が他の哺乳動物のＭＨＣ領域で置換される動物である。非ヒト哺乳動物１の種類は特に限定されるものではなく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、ニホンザル、コモンマーモセット等の霊長類などが挙げられる。非ヒト哺乳動物１は上記動物に限定されるものではない。
　哺乳動物２は、そのＭＨＣ領域を非ヒト哺乳動物１に置換させる動物である。哺乳動物２の種類は特に限定されるものではなく、上記非ヒト哺乳動物１のほか、ヒトを含む。

２．非ヒト哺乳動物１のＭＨＣが哺乳動物２のＭＨＣで置換された細胞、及び非ヒト哺乳動物の作出
（１）非ヒト哺乳動物１のＭＨＣ領域を哺乳動物２のＭＨＣ領域で置換するための方法
　非ヒト哺乳動物１のＭＨＣ領域を哺乳動物２のＭＨＣ領域で置換するための概要を図１に示す。図１では、説明の便宜上、哺乳動物２としてヒトを例に説明する。

　図１において、（ａ）は、置換前の哺乳動物２（ヒト）の第６番染色体、及び非ヒト哺乳動物１（非ヒト）の染色体の模式図であり、（ｃ）はＭＨＣ領域を置換した後の染色体の模式図である。ＭＨＣ領域の置換は、（ａ）から（ｂ１）への転座組換え、及び（ｂ１）から（ｃ）への転座組換えの２段階組換え（これを「２段階組換え１」という）、あるいは（ａ）から（ｂ２）への転座組換え、及び（ｂ２）から（ｃ）への転座組換えの２段階組換え（これを「２段階組換え２」という）を利用する。本発明においては組換えの順序は任意であり、２段階組換え１でも２段階組換え２でもよい。

　図１において、転座組換え（本明細書において「置換」又は単に「組換え」ともいう。）の対象となるＭＨＣ領域からみてテロメア側を遠位側、セントロメア側を近位側という。そして、ヒトＭＨＣ領域から遠位側、すなわちヒトＭＨＣ領域から遠位端までの間であって組換えの境界となる任意の位置をＰ１とし、非ヒトＭＨＣ領域から遠位側、すなわち非ヒトＭＨＣ領域から遠位端までの間であって、組換えの境界となり前記Ｐ１に対応する任意の位置をｐ１とする。また、図１において、組換えの対象となるヒトＭＨＣ領域から近位側、すなわちヒトＭＨＣ領域とセントロメアとの間であって、組換えの境界となる任意の位置をＰ２とし、非ヒトＭＨＣ領域から近位側、すなわち非ヒトＭＨＣ領域とセントロメアとの間であって、組換えの境界となり前記Ｐ２に対応する任意の位置をｐ２とする。

　そうすると、２段階組換え１においては、（ａ）から（ｂ１）への組換えは第一の組換えであり、Ｐ１から遠位端（テロメア）までの領域と、ｐ１から遠位端（テロメア）までの領域の組換えとなる。そして、（ｂ１）から（ｃ）への組換えは第二の組換えであり、Ｐ２から遠位端（テロメア）までの領域と、ｐ２から遠位端（テロメア）までの領域の組換えとなる。

　他方、２段階組換え２においては、図１において組換えの対象となるヒトＭＨＣ領域よりもセントロメア側（Ｐ２）から遠位端までの領域と、非ヒトＭＨＣ領域よりもセントロメア側（ｐ２）から遠位端までの領域との組換えが「第一の組換え」となる（図１（ｂ２））。この段階では、ヒト染色体のＰ１から遠位端までの領域と非ヒト染色体のｐ１から遠位端までの領域との組換えは起こっていない。その後、ヒト染色体のＰ１から遠位端までの領域と非ヒト染色体のｐ１から遠位端までの領域との組換えが「第二の組換え」となる。

　組換えが完了した後は、ＭＨＣがヒト化された細胞、例えばＥＳ細胞を作出し、これを非ヒト哺乳動物１の初期胚に移植してキメラ非ヒト動物を作出することができる。なお、組換えが完了した後は、当該細胞中に残存するヒト染色体を除去しておくことが好ましい。ヒト染色体は、選択薬剤非存在下で継代培養することにより脱落させて除去することができる。また、非ヒト哺乳動物における染色体は２倍体であるが、本発明において組換えが完了した後の非ヒト哺乳動物の染色体のうち、ＭＨＣ領域がヒト染色体のＭＨＣ領域で置換された染色体の態様は、ホモ（染色体の２本のいずれもＭＨＣ領域がヒト化）であっても、ヘテロ（染色体の１本のＭＨＣ領域がヒト化）であってもよい。但し、後述の非ヒト染色体中のＭＨＣ領域を欠損又は破壊するためには、ヘテロであることが好ましい。

　従って、その後、自然交配又は顕微授精等により、ＭＨＣヒト化ヘテロ動物を作出することができる。なお、さらに自然交配又は顕微授精等によりＭＨＣヒト化ホモ動物を作出することができる。

　ここで、ヒトのＭＨＣはＨＬＡと同じ分子であり、この分子を決定する遺伝子は第６番染色体の上に直列に配列している。非ヒト哺乳動物１のＭＨＣ領域は動物によって異なり、例えばマウスでは第１７番染色体、ラットでは第２０番染色体、ウサギでは第１２番染色体、ブタでは第７番染色体に位置する。そして、非ヒト哺乳動物１は上記動物に限定されるものではなく、その他ウマでは２０番染色体、ウシでは２３番染色体、イヌでは１２番染色体、コモンマーモセットでは４番染色体等が挙げられる。

　なお、遺伝子領域においてＭＨＣをコードする遺伝子を説明する場合には、「ＭＨＣ領域」と表現する場合もある。また、非ヒト哺乳動物１のうち、例えばマウスのＭＨＣ領域は長腕上に存在するため、例えば図１において非ヒト染色体としてマウス染色体を表すときは、マウスの長腕と短腕の向きは、ヒトの長腕と短腕の向きと逆向きとなる。

　組換えの対象となるＭＨＣ領域は、ＭＨＣ領域の全体であっても一部であってもよい。クラスＩにおいては古典的クラスＩ分子でも非古典的クラスＩ分子でもよい。古典的クラスＩ分子には、ヒトではＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの３種類が、非古典的クラスＩ分子にはＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢがある。

　ヒトのクラスＩＩ遺伝子はヒトＭＨＣクラスＩＩ領域に位置し、ＤＲ、ＤＱ及びＤＰの遺伝子座は当該領域の主要な産物をコードする。なお、マウスＭＨＣにはマウスＨ２−Ｍ２及びＨ２−Ｍ３も存在するが、本発明においては、これらのＭＨＣは置換の対象領域に含めなくてもよい。クラスＩＩＩ領域にはＭＨＣ以外の様々な遺伝子が含まれており、ヒトではＨＬＡ−ＤＲＡより遠位側で、ＭＩＣＢより近位側の領域である。

　例えば図２は、ヒトのＭＨＣ領域を表示した模式図である。置換の対象となるＭＨＣ領域は、クラスＩ領域のみでもクラスＩＩ領域のみでもよく、クラスＩＩＩ領域のみでもよく、あるいはこれらの領域の組み合わせ（すべての組み合わせを含む）でもよい。また、クラスＩ領域は古典的クラスＩＭＨＣ遺伝子を含む領域、非古典的クラスＩＭＨＣ遺伝子を含む領域、又はその両者の領域でもよい。従って、本発明においては各クラスを構成する領域、例えばクラスＩではＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢのいずれか１つ、あるいはこれらの２つ以上の組み合わせ（すべての組み合わせを含む）の領域でもよく、クラスＩＩでは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＭのいずれか１つ、あるいはこれらの２つ以上の組み合わせ（すべての組み合わせを含む）の領域でもよい。クラスＩＩＩ領域にはＭＨＣ以外の様々な遺伝子が含まれており、ヒトではＨＬＡ−ＤＲＡより遠位側であり、ＭＩＣＢより近位側にある領域である。

　ここで、組換えの対象となるＭＨＣ領域は、前記の通り全体でも一部の領域でもよい。従って、当該対象となるＭＨＣ領域の選択によっては、選択されなかったＭＨＣ領域に前記Ｐ１、ｐ１，Ｐ２、ｐ２が位置する場合もある。

　本発明においては、ヒトＭＨＣクラスＩ領域であればＭＩＣＢ~ＨＬＡ−Ｆの全体の領域（図２のＬ２で示す領域）、クラスＩＩ領域であればＨＬＡ−ＤＰ~ＨＬＡ−ＤＲの全体の領域（図２のＬ１で示す領域）を含むことが好ましい。またクラスＩＩＩ領域は、ＨＬＡ−ＤＲＡより遠位側であり、ＭＩＣＢより近位側にある領域である（図２のＬ３で示す領域）。本発明の一態様において、さらに好ましくは、図２に示すＭＨＣ領域全体（図２のＬ４で示す領域）を置換する。

（２）ターゲティングベクター
（２−１）２段階組換え１における第一の組換え及び２段階組換え２における第二の組換え
　本発明において、組換えを起こさせるために使用するベクターをターゲティングベクターという。ここで使用されるターゲティングベクターは、上記組換えを起こさせる限り限定されるものではなく、組換え酵素認識配列及び組換え酵素を利用するベクターであっても、ゲノム編集ツールを利用するベクターであってもよい。必要に応じて、前記Ｐ１及びｐ１の位置で切断するツールとして、ゲノム編集ツールを利用することもできる。ゲノム編集ツールを利用すると、目的の位置で染色体を切断できるため、その後の組換えを起こしやすくさせることが可能である。

＜組換え酵素を利用した組換え＞
　組換え酵素を利用した組換えは、例えば、ｌｏｘＰと呼ばれる組換え酵素認識配列、及びＣｒｅと呼ばれる組換え酵素が利用される。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰの特異的組み換えシステムは周知である。Ｃｒｅ酵素はＰ１ファージ由来の３４３個のアミノ酸からなるタンパク質であり、ｌｏｘＰ部位と呼ばれる３４ｂｐの特異的な塩基配列を認識し、部位特異的組換えを行うことができる。ｌｏｘＰ部位は１３塩基、８塩基、及び１３塩基の３つの部分に分けることができ、１３塩基の配列は相補的な逆反復配列構造となっている。一方、８塩基の配列は、ｌｏｘＰ部位の向きを決める役割を果たす。Ｌｏｘ５１１やｌｏｘ２２７２と呼ばれる変異型のｌｏｘＰも多く知られており、これらの組換え酵素認識配列を利用することも可能である。

　本発明の別の態様において、部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えシステムの他の例として、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム以外にも、酵母プラスミド２μ由来のＦｌｐ／ＦＲＴ系、バクテリオファージＰｈｉＣ３１由来のＰｈｉＣ３１インテグラーゼ系やバクテリオファージＢｘｂ１由来のＢｘｂ１インテグラーゼ系などを使用することができる。

　図１において、（ａ）から（ｂ１）への組換え、又は（ｂ２）から（ｃ）への組換えを行うためのターゲティングベクターは、以下のターゲティングベクター１とターゲティングベクター２との組み合わせ、あるいは以下のターゲティングベクター３である。ターゲティングベクター１とターゲティングベクター２との組み合わせは、組換え酵素認識配列及び組換え酵素を利用した組換えを起こさせるベクターであり、ターゲティングベクター３は、ゲノム編集ツールを利用した組換えを起こさせるベクターである。

　（ｉ）ターゲティングベクター１
　ターゲティングベクター１は、ヒト第６番染色体において、その短腕に存在し組換えの対象となるＭＨＣ（ヒトＭＨＣ）領域よりも遠位側の任意の位置Ｐ１に組み込まれる。ターゲティングベクター１は、前記Ｐ１から遠位端までの領域と、非ヒト哺乳動物染色体において、組換えの対象となる非ヒトＭＨＣ領域よりも遠位側であって前記Ｐ１に対応する位置ｐ１から遠位端までの領域との間で転座組換えを起こさせるものである。そして、ターゲティングベクター１は、組換え酵素認識配列、転座組換え時に再構成される薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子１の一の部分配列、及びターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子２を含む遺伝子カセット１を含む。

　遺伝子カセット１に含まれるコンストラクトは、例えば、組換え酵素認識配列をｌｏｘＰ、薬剤耐性遺伝子１をネオマイシン耐性遺伝子、そして薬剤耐性遺伝子２をハイグロマイシン耐性遺伝子とすることができる。

　ここで、「対応する」とは、組換えが行われる場所の位置関係を指す用語である。すなわち、上記Ｐ１、ｐ１、Ｐ２及びｐ２は、組換えの対象となるＭＨＣ領域から見て遠位側であるか近位側であるかの位置関係を表す目印の意味である。従って、Ｐ１とｐ１、あるいはＰ２とｐ２に隣接する遺伝子が同一であることを求めるものではない。哺乳動物の種類によっては、ＭＨＣ領域が、ヒトのＭＨＣ領域の向きと比較して逆位になっている場合がある。その場合において、ターゲティングベクターを組み込む場所（Ｐ１）の両側の遺伝子座は、ヒト遺伝子座がＭＯＧ遺伝子座とＧＡＢＢＲ１遺伝子座との間（実施例及び図５を参照）であるときは、ＭＨＣ領域が逆位になっている動物のｐ１は、例えばＫｉｆｃ１遺伝子座とＤａｘｘ遺伝子座との間とすることができる。

　図５は、本発明のターゲティングベクターの一態様の構造を示す模式図である。説明の便宜上、マウスＭＨＣ領域をヒトＭＨＣ領域で置換する場合のターゲティングベクターを例に説明する。

　図５Ａにおいて、「ＴＶ３Ｒ」は上記遺伝子カセット１を表している。組換え酵素認識配列は図中横向きの「▲」で示しており、ｌｏｘＰ配列などである。転座組換え時に再構成される薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子１の一の部分配列（ターゲティングベクター１に使用された薬剤耐性遺伝子１の所定の部分配列）は、本発明では「３’ｎｅｏ」を用いている。この場合の薬剤耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子２は、「Ｈｙｇ」と表記されており、この場合の薬剤耐性遺伝子はハイグロマイシン耐性遺伝子である。

　そして、本発明の実施例で作製した遺伝子カセット１は、次式（１）で示す配列を含む。
ＢＧＨｐＡ−３’Ｎｅｏ−ＳＡ−ｌｏｘＰ−ＥＦ１−Ｈｙｇ−Ｐ２Ａ−ｍＲｕｂｙ２−ＲＧｐＡ　（１）

　式（１）において、ＢＧＨｐＡはウシ成長ホルモン由来ポリＡ付加シグナル配列を表し、３’Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子の３’側の一部の配列を表し、ＳＡはスプライシングアクセプター配列を表し、ｌｏｘＰは組換え酵素認識配列を表し、ＥＦ１はヒト伸長因子１α由来プロモーター配列を表し、Ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子を表し、Ｐ２Ａはブタテシオウイルス由来２Ａ配列を表し、ｍＲｕｂｙ２は赤色蛍光遺伝子を表し、ＲＧｐＡはラビットβ−グロビン由来ポリＡ付加シグナル配列を表す。但し、本発明においては、上記（１）に示すカセット１に、Ｆｌｐ組換え酵素認識配列（ＦＲＴ）を付加することもできる。

　「ＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡ」はターゲティングベクター１であり、ＴＶ３Ｒの両側には、ＴＶ３Ｒが組み込まれる位置（Ｐ１）の両側の領域の配列の相同配列が連結されている。

　図５Ａにおいて、「ＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１」はゲノム編集用ベクターであり、ターゲティングベクター１の組換えを容易にするために、染色体の任意の位置Ｐ１を人工的に切断するベクターである。ゲノム編集用ベクターに利用されるゲノム編集ツールは、公知の任意のツールを使用することができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用するツール、テールヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用するツール、クリスパー・キャス９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を利用するツールなどが挙げられる。
　ＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を利用するベクターであり、例えばガイドＲＮＡ配列、Ｃａｓ９配列及び蛍光タンパク質アメトリンの遺伝子配列により構成されている。

　図１（ｄ）は、ＭＨＣ領域付近から遠位端までの領域の拡大図を示すが、本発明の実施例においては、ヒト染色体ではＭＯＧ遺伝子座とＧＡＢＢＲ１遺伝子座との間にＰ１を指定し、ここにターゲティングベクター１を組み込むように設計した（図５Ａ）。

　（ｉｉ）ターゲティングベクター２
　ターゲティングベクター２は、ＭＨＣ領域が存在する非ヒト哺乳動物の染色体において、組換えの対象となる非ヒトＭＨＣ領域よりも遠位側の前記Ｐ１に対応する位置ｐ１に組み込まれる。

　実施例のマウスではターゲティングベクター２は、前記ｐ１から遠位端までの領域と、ヒト染色体における前記Ｐ１から遠位端までの領域との間で転座組換えを起こさせるものである。そして、組換え酵素認識配列、転座組換え時に再構成される薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子１の他の部分配列（ターゲティングベクター１に使用された薬剤耐性遺伝子１の所定の部分配列以外の他の部分配列）、ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子３を含む遺伝子カセット２を含む。

　遺伝子カセット２に含まれるコンストラクトは、例えば、組換え酵素認識配列をｌｏｘＰ、薬剤耐性遺伝子１をネオマイシン耐性遺伝子、薬剤耐性遺伝子３をピューロマイシン耐性遺伝子とすることができる。
　前記の通り、動物種によってはＭＨＣ領域が逆位になっている動物が存在する。この場合でも、ターゲティングベクター２において、任意の位置Ｐ１に対応する位置ｐ１に組み込むことができる。

　図５Ｂにおいて、「ＴＶ４」は遺伝子カセット２を表している。組換え酵素認識配列は図中横向きの「▲」で示しており、ｌｏｘＰ配列などである。転座組換え時に再構成される薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子１の部分配列は、本発明では「５’ｎｅｏ」を用いている。この場合の薬剤耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子２は、「Ｐｕｒｏ」と表記されており、この場合の薬剤耐性遺伝子はピューロマイシン耐性遺伝子である。

　そして、本発明の実施例で作製した遺伝子カセット２は、次式（２）で示す配列を含む。
ＥＦ１−ＥＧＦＰ−Ｐ２Ａ−５’Ｎｅｏ−ＳＤ−ｌｏｘＰ−ＳＡ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ−ＲＧｐＡ　（２）

　式（２）において、ＥＦ１はヒト伸長因子１α由来プロモーター配列を表し、ＥＧＦＰは緑色蛍光遺伝子を表し、Ｐ２Ａはブタテシオウイルス由来２Ａ配列を表し、５’Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子の５’側の一部の配列を表し、ＳＤはスプライシングドナー配列を表し、ｌｏｘＰは組換え酵素認識配列を表し、ＳＡはスプライシングアクセプター配列を表し、Ｔ２ＡはＴｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａウイルス由来２Ａ配列を表し、Ｐｕｒｏはピューロマイシン耐性遺伝子を表し、ＲＧｐＡはラビットβ−グロビン由来ポリＡ付加シグナル配列を表す。本発明においては、上記式（２）に示すカセット２に、ＦＲＴを付加することもできる。

　ＴＶ４−ｄＨ２はターゲティングベクター２であり、ＴＶ４の両側には、ＴＶ４が組み込まれる位置（ｐ１）の両側の領域の配列の相同配列が連結されている。
　図５Ｂにおいて、「ＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１」はゲノム編集用ベクターであり、ターゲティングベクター２の組換えを容易にするために、染色体の任意の位置ｐ１を人工的に切断するベクターである。ゲノム編集用ベクターに利用されるゲノム編集ツールは前記と同様である。ＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を利用するベクターであり、例えばガイドＲＮＡ配列、Ｃａｓ９配列及び蛍光タンパク質アメトリンの遺伝子配列により構成されている。

　図１（ｄ）と同様に、本発明の実施例においては、非ヒト染色体ではＭｏｇ遺伝子座とＧａｂｂｒ１遺伝子座との間にターゲティングベクター２を組み込むように設計した。（図５Ｂ）

＜ゲノム編集用ベクターを利用した組換え＞
　（ｉｉｉ）ターゲティングベクター３
　本発明の別の態様においては、前記第一の組換えを行うために、組換え酵素を利用した組換えに代えて、ゲノム編集ツールを利用することができる。ターゲティングベクター３は、ヒト第６番染色体において、組換えの対象となるヒトＭＨＣ領域よりも遠位側であってゲノム編集ツールにより切断の標的となる任意の位置Ｐ１から遠位端までの領域と、ＭＨＣが存在する非ヒト哺乳動物の染色体において、非ヒトＭＨＣ領域よりも遠位側であって前記Ｐ１に対応する位置ｐ１から遠位端までの領域との間で転座組換えを起こさせる。

　この場合でも、ＭＨＣ領域の置換は、図１において（ａ）から（ｂ１）、及び（ｂ１）から（ｃ）への転座組換え（２段階組換え１）、あるいは（ａ）から（ｂ２）、及び（ｂ２）から（ｃ）への転座組換え（２段階組換え２）を利用することができる。

　ターゲティングベクター３は、前記Ｐ１と前記ヒトＭＨＣ領域との間の一部の領域（この領域を「Ｒ１ａ」という）の配列の相同配列、ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子４、及び前記ｐ１よりも遠位側の一部の領域（この領域を「Ｒ２ｂ」という）の配列の相同配列を含むか、あるいは、前記Ｐ１よりも遠位側の一部の領域（この領域を「Ｒ１ｂ」という）の配列の相同配列、ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子４、及び前記ｐ１と前記非ヒトＭＨＣ領域との間の一部の領域（この領域を「Ｒ２ａ」という）の配列の相同配列を含む。

　Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの位置関係を図３（ａ）に示す。なお、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの領域は、Ｐ１、ｐ１からみて任意の領域でよいが、Ｐ１、ｐ１の近傍の領域であることが好ましい。
　本発明において使用されるターゲティングベクター３は、例えばＲ２ａ配列、ＣＡＧプロモーター配列、ブラストサイジン耐性遺伝子、ラビットβ−グロビン由来ポリＡ付加シグナル配列及びＲ１ｂ配列により構成することができる。

（２−２）２段階組換え１における第二の組換え、又は２段階組換え２における第一の組換え
　本発明において、２段階組換え１における第二の組換え、及び２段階組換え２における第一の組換え、すなわち図１の（ｂ１）から（ｃ）への組換え、又は図１の（ａ）から（ｂ２）への組換えを起こすベクターをターゲティングベクター４という。

　本節における組換えは、前記と同様に組換え酵素を利用したターゲティングベクターを利用することも可能であるが、本発明者による予備実験により、組換え酵素を利用したターゲティングベクターよりもゲノム編集ツールを利用したターゲティングベクターを利用したほうが効率的に組換えが起こり、その後の非ヒト哺乳動物の作出も有効であることが分かった。
　そこで本発明においては、２段階組換え１における第二の組換え、又は２段階組換え２における第一の組換えはゲノム編集ツールを利用した組換えを行う。

　（ｉｖ）ターゲティングベクター４
　ターゲティングベクター４は、２段階組換え１の場合は、前記ターゲティングベクター１及び前記ターゲティングベクター２の作用、又は前記ターゲティングベクター３の作用による転座組換え後の染色体（図１（ｂ１））において、組換えの対象となるヒトＭＨＣ領域よりも近位側であってゲノム編集ツールにより切断の標的となる任意の位置Ｐ２から遠位端までの領域と、非ヒトＭＨＣが存在する非ヒト哺乳動物の染色体において、当該非ヒトＭＨＣ領域よりも近位側であって前記Ｐ２に対応する位置ｐ２から遠位端までの領域との間で転座組換えを起こさせる。

　また、ターゲティングベクター４の使用は、２段階組換え２の場合は、ターゲティングベクター４を先に使用してターゲティングベクター１~３を使用することもできる。要するに、図１（ａ）~（ｃ）に示す組換えは、先にＰ１及びｐ１から遠位端までの組換えを行った後、次にＰ２及びｐ２から遠位端までの組換えを行ってもよく（図１（ａ）、（ｂ１）、及び（ｃ）の順序）、先にＰ２及びｐ２から遠位端までの組換えを行った後、次にＰ１及びｐ１から遠位端までの組換えを行うこともできる（図１（ａ）、（ｂ２）、及び（ｃ）の順序）。

　ターゲティングベクター４は、前記Ｐ２よりも近位側（Ｐ２とセントロメアとの間）の一部の領域Ｒ３ａの配列の相同配列、ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子５（例えばブラストサイジン耐性遺伝子）、及び前記ｐ２と前記非ヒトＭＨＣ領域との間の一部の領域Ｒ４ｂの配列の相同配列を含むか、あるいは、前記Ｐ２とヒトＭＨＣ領域との間の一部の領域Ｒ３ｂの配列の相同配列、ターゲティング後の薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子５、及び前記ｐ２から近位側（ｐ２とセントロメアとの間）の一部の領域Ｒ４ａの配列の相同配列を含む。

　Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの位置関係を図３（ｂ）に示す。なお、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの領域は、Ｐ２、ｐ２からみて任意の領域でよいが、Ｐ２、ｐ２の近傍の領域であることが好ましい。
　本発明において使用されるターゲティングベクター４は、例えばＲ３ａ配列、ＣＡＧプロモーター配列、ブラストサイジン耐性遺伝子、ラビットβ−グロビン由来ポリＡ付加シグナル配列及びＲ４ｂ配列により構成することができる。

　図１（ｅ）は、ＭＨＣ領域付近から遠位端までの領域の拡大図を示すが、本発明の実施例においては、ヒト染色体ではＫＩＦＣ１遺伝子座とＤＡＸＸ遺伝子座との間、非ヒト染色体ではＫｉｆｃ１遺伝子座とＤａｘｘ遺伝子座との間で組換えが起こるようにターゲティングベクター４を設計した（図５Ｃ）。ターゲティングベクター４には、ブラストサイジン（ＢＳ）耐性遺伝子が含まれている。

　図５Ｃにおいて、「ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２」はゲノム編集用ベクターであり、ターゲティングベクター４を介した転座組換えを容易にするために、染色体の任意の位置Ｐ２を人工的に切断するベクターである。ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を利用するベクターであり、例えばガイドＲＮＡ配列、Ｃａｓ９配列及び蛍光タンパク質アメトリンの遺伝子配列により構成されている。

　ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２と同様に、「ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨ２ＣＲ１」はゲノム編集用ベクターであり、ターゲティングベクター４を介した転座組換えを容易にするために、染色体の任意の位置ｐ２を人工的に切断するベクターである。ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨ２ＣＲ１はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を利用するベクターであり、例えばガイドＲＮＡ配列、Ｃａｓ９配列及び蛍光タンパク質アメトリンの遺伝子配列により構成されている。

＜薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子＞
　本発明においては、前記の通り、ターゲティングベクターには、薬剤選抜用の薬剤耐性遺伝子１~５が使用される。薬剤耐性遺伝子１~５それぞれの遺伝子の組み合わせは任意であり、目的の薬剤選抜ができるように適宜選択される。
　薬剤耐性遺伝子１~５に使用される遺伝子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

＜組換え又は選抜確認用の蛍光遺伝子＞
　本発明においては、染色体導入の確認や導入染色体が維持されていることの確認、あるいは薬剤選抜が目的通りに行われたかを確認するために、ターゲティングベクターに所定の蛍光遺伝子を含めることができる。蛍光遺伝子の種類は、それぞれの工程において確認作業ができる限り任意に選択することができ、ベクターごとに蛍光遺伝子の種類を変えて使用することも可能である。
　蛍光遺伝子としては、例えば緑色蛍光遺伝子（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ等）、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子などが挙げられる。

（３）細胞
　ＭＨＣがヒト化された非ヒト哺乳動物を樹立するには、非ヒト哺乳動物の細胞において内在ＭＨＣ遺伝子をヒトＭＨＣ遺伝子で置換する必要がある。
本発明においては、上記の通り通常の相同組換え法又はゲノム編集技術を利用することができる。

　細胞としては動物細胞であれば特に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、精子幹細胞、線維芽細胞などが挙げられるが、ＥＳ細胞であることが好ましい。
　細胞の培養培地としては、例えばＧＭＥＭ培地（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられる。培養培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸、抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン等）、増殖因子／サイトカイン（上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病阻止因子等）など一般的に使用される動物細胞培養添加物を細胞種に応じて適宜加えることができる。

　細胞を所定期間培養後、トリプシンを含む培地でインキュベートすることにより細胞を回収する。回収された細胞は、必要によりフィーダー細胞の存在又は非存在下で複数回の継代培養を行うこともできる。培養された細胞が目的の細胞であることの確認は、それらのマーカー遺伝子を指標とすればよい。細胞がＥＳ細胞の場合は、例えばＯｃｔ３／４、アルカリホスファターゼ、Ｎａｎｏｇなどを指標とすればよく、ＲＴ−ＰＣＲやウエスタンブロッティング等の任意の手法により検出することができる。またＥＳ細胞は、コロニー形態で判断することもできる。

（４）非ヒト哺乳動物の作製
　非ヒト哺乳動物の作製は、ＥＳ細胞を用いたキメラ動物の作製のほか、体細胞核移植、精子幹細胞を用いた顕微授精等の標準的な方法で行うことができる。
　作製の対象となる非ヒト哺乳動物は特に限定されるものではなく、げっ歯類、家畜類、霊長類などが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが例示され、家畜類としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、霊長類としてはニホンザル、コモンマーモセットが例示される。その他にも、イヌ、ネコ、サル、ウサギなどの愛玩又は実験動物を使用することもできる。
　本発明においては、げっ歯類、中でもマウスであることが好ましい。

　キメラ動物の場合は、まず、上記樹立されたＥＳ細胞を、初期胚と凝集させるか、あるいは胚盤法に注入する。このようにして作製された胚をキメラ胚というが、このキメラ胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製する。
　ここで、「胚」とは、個体発生における受精から出生までの段階の個体を意味し、初期胚である２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞などを包含する。

　以下、説明の便宜上、細胞としてＥＳ細胞を例に説明する。
　ＥＳ細胞と胚を用いて集合体を作製する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。
　マイクロインジェクション法を採用する場合は、回収した胚に、ＥＳ細胞を注入して細胞の集合体を作製する。また、凝集法を採用する場合は、ＥＳ細胞を、透明帯を除去した正常胚と凝集させればよい。ここで使用されるＥＳ細胞としては特に限定されるものではなく、Ｃ５７ＢＬ／６由来ＲＥＮＫＡ、Ｃ５７ＢＬ／６　とＣＢＡのＦ１ハイブリッド由来ＴＴ２細胞のＹ染色体脱落株ＸＯ、Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／ｓＣｒＳｌｃのＦ１ハイブリッドから樹立したＥＳ細胞などが挙げられる。

　一方、仮親にするための偽妊娠雌動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠動物に対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内に移植し、その後出産させることによりキメラ動物を作製することができる。

　このようなキメラ動物の中から、ＥＳ細胞移植胚由来の動物を選択する。選択したキメラ動物を近交系系統の動物と交配させる。そして、誕生した子動物に、ＥＳ細胞に由来する動物の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラ動物の生殖系列へ導入されたことを確認することができる。
　誕生した子動物がヒト化ＭＨＣ遺伝子を持つかどうかは、ＤＮＡを制限酵素で切断し目的のサイズのＤＮＡ断片が検出されるかどうか、あるいはＰＣＲ法により解析することで同定できる。

３．ＭＨＣ遺伝子群が欠損又は破壊された、非ヒト哺乳動物の染色体、及び当該染色体をホモ又はヘテロで含む細胞の作製
　ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞では一方のアリルのＭＨＣ領域がヒト化されているため、非ヒト哺乳動物１としてマウスを例に説明すると、マウスＭＨＣ領域内の配列を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム配列の欠損誘導や遺伝子破壊は全てマウスＭＨＣ領域を持つアリル上に生じることになる（図１７）。したがって、ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞においてマウスＭＨＣ遺伝子群の破壊及び削除を実施することにより、マウスＭＨＣ遺伝子群欠損アリルを作出することができる。ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞からはＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスを作製できることから、マウスＭＨＣ遺伝子群欠損ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を作製すればマウスＭＨＣ遺伝子群欠損マウスの作製が可能である。

実施例においては、ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６　Ｆ１マウス由来ＸＯ　ＥＳ細胞のＤａｘｘからＭｏｇに至るＭＨＣ領域をヒト化したＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を用いて、マウスＭＨＣ遺伝子群欠損アリルの作製を行った。まずＭＨＣ遺伝子群のゲノム上での分布を見てみると、３９遺伝子のうち３４遺伝子は非ＭＨＣ遺伝子が混在しない５つのクラスターに存在することが分かった（図１８）。これらのクラスターをサイズの大きなものから順にｄ１，　ｄ２，　ｄ３，　ｄ４，　ｄ５と呼称する。

Ｈ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ５，　Ｈ２−Ｍ３及びＨ２−Ｍ２の５つは、クラスターを形成せず孤立して存在することがわかる。これら孤立して存在するＭＨＣ遺伝子をｄ６と分類する。
本発明においては、ＭＨＣ遺伝子を欠損又は破壊させるために、ｄ１からｄ５のＭＨＣ遺伝子はクラスター内の全てのＭＨＣ遺伝子の遺伝子座全体または一部を挟むように設計した２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて配列を欠損させ、ｄ６に分類される孤立して存在するＭＨＣ遺伝子は各ＭＨＣ遺伝子を破壊するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いることができる。例えばｄ１のＭＨＣ遺伝子群を欠損させるには、ｄ１のクラスターの両側、すなわち図１８においてｄ１クラスター内で最もセントロメア側に位置するＨ２−Ｍ１０．２遺伝子座からｄ３の間の領域、及びｄ１クラスター内で最もテロメア側に位置するＨ２−Ｍ１０．６遺伝子座とｄ６（Ｈ２−Ｍ５遺伝子）との間の領域を標的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を設計し、欠損を誘導する。他のクラスターも同様にしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を設計する。
　非ヒト哺乳動物１（例えばマウス）と哺乳動物２（例えばヒト）では、ＭＨＣの各クラスターの上流及び下流におけるゲノムの塩基配列が異なることが多いため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計においては、これらの異なる塩基配列を標的とする。これにより、ＭＨＣがヒト化されたヘテロ細胞からマウスのＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群１）のみを破壊又は欠損させることができる。

ｄ１からｄ５のクラスターは、上記のようにそれぞれのクラスターを挟むようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を設計する。またｄ１からｄ６の各遺伝子群を欠損又は破壊させる場合、一度に欠損又は破壊する遺伝子群は１つに限定されるものではなく、２つ以上を組み合わせることもできる。例えば、ｄ１とｄ３との組み合わせや、ｄ２とｄ３との組み合わせ（２つのクラスターの組み合わせ）、ｄ１、ｄ３及びｄ２の組み合わせ（３つのクラスターの組み合わせ）、ｄ５とｄ６に分類されるＭＨＣ遺伝子（１つのクラスターと孤立して存在するＭＨＣ遺伝子の組み合わせ）など、適宜組み合わせることができる。
ｄ１からｄ６をそれぞれの遺伝子群ごとに欠損又は破壊する場合は、どの遺伝子群から破壊又は欠損するのか、その順序は任意であり、ｄ１を欠損させた後にｄ２を欠損させ、ｄ２の欠損後にｄ３を欠損させるように、ｄ１からｄ６まで順番に欠損又は破壊させてもよく、順序は関係なく欠損させてもよい。欠損又は破壊するクラスターは一部であっても全部であってもよい。

あるいは、１つのクラスターをサブグループに分けて、複数回数の欠損又は削除工程を行うこともできる。例えば、図１８に示すクラスターのｄ１において、Ｈ２−Ｍ１０．２からＨ２−Ｍ１１までをｄ１ａ、Ｈ２−Ｍ９からＨ２−Ｍ１０．６までをｄ１ｂのようにサブグループに分け、それぞれのサブグループのクラスターを欠損又は削除することができる。

他方、ｄ６に分類される遺伝子群はクラスターを形成しないため、それぞれの遺伝子に対して遺伝子を破壊するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を設計する。ｄ６ＭＨＣ遺伝子群はサブグループに分けて、それぞれ別個に破壊することができる。
　ここで、哺乳動物２（例えばヒト）のＭＨＣ領域を有する染色体には、非ヒト哺乳動物１（例えばマウス）のＭＨＣ遺伝子の一部が残存する場合がある。その場合は、野生型アリルからＭＨＣ遺伝子群を全て破壊又は欠損させるとともに、哺乳動物２のＭＨＣ領域を有する染色体に残存する非ヒト哺乳動物１のＭＨＣ遺伝子を破壊する。図１８では、ヒトＭＨＣ領域のほかにマウス由来のＨ２−Ｍ３及びＨ２−Ｍ２遺伝子が残存しているので、これらの残存遺伝子も破壊又は欠損させる。

このようにして、ｄ１からｄ６のＭＨＣ遺伝子群を欠損又は破壊することにより、全てのマウスＭＨＣ遺伝子を欠損させることが可能である。本発明においては、ｄ１~ｄ６のクラスターを任意選択して、これらのクラスターの一部を欠損又は破壊させることもでき、あるいはｄ１~ｄ６の全てを欠損又は破壊させることもできる。

本発明の一態様では、図１９に示すようにｄ１からｄ６まで、それぞれのクラスターに含まれるＭＨＣ遺伝子を順次削除してｄ１からｄ６クローンの単離を実施する。ｄ１クローンはＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞のｄ１クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ２クローンはｄ１クローンからｄ２クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ３クローンはｄ２クローンからｄ３クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ４クローンはｄ３クローンからｄ４クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ５クローンはｄ４クローンからｄ５クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させ、さらにＨ２−Ｍ５遺伝子を同時に遺伝子破壊したクローン、ｄ６クローンは、ｄ５クローンのＨ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ３，　Ｈ２−Ｍ２を遺伝子破壊したクローンである。ｄ６クローンの作製において、４遺伝子の同時破壊は遺伝子破壊効率が低くなるため、場合によってはｄ５クローンのＨ２−Ｋ１とＨ２−Ｍ３のみを破壊したｄ６ａクローンを単離してから、Ｈ２−ＯａとＨ２−Ｍ２を破壊してｄ６クローンの単離を行った。

４．ＭＨＣ遺伝子群が欠損又は破壊された染色体を持つ非ヒト哺乳動物
　上記のようにしてＭＨＣ遺伝子群１が全て欠損又は破壊された染色体を持つＥＳ細胞を用いて非ヒト哺乳動物を作出することができる。例えば、ＭＨＣ遺伝子群１が全て欠損又は破壊された染色体を持つＥＳ細胞を初期胚に移植する、あるいはＭＨＣ遺伝子群１が全て欠損又は破壊された染色体を持つＥＳ細胞を体細胞核移植することにより非ヒト哺乳動物を作出することができる。
　また、ＭＨＣ遺伝子群１が欠損又は破壊された染色体は、上記細胞から微小核細胞融合法などにより他の細胞へ導入することができる。

　実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

１．ターゲティングベクターの作製
＜方法＞
方法

　ＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡの作製
ｐＥＦ−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　＃　１１１５４　；　ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１１１５４　；　ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１１１５４）をＥｃｏＲＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）とＮｏｔＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で制限酵素消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて付属のプロトコールに従いヒト伸長因子１α由来プロモーター配列の下流にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングしてｐＥＦ−Ｈｙｇ（配列番号１）を作製した。次にｐＥＦ−Ｈｙｇがコードするヒト伸長因子１α由来プロモーター配列の上流側を制限酵素ＳａｌＩで消化し、合成により作製したＤＮＡフラグメントＦＲＴ−ＢＧＨｐＡ−３’Ｎｅｏ−ＳＡ−ｌｏｘＰ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（配列番号２）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてＴＶ３を作製した。

次にターゲティングベクターＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡの５’側相同領域と３’側相同領域を含む配列を、ＭＲＣ５細胞のゲノムを鋳型として以下のプライマーセットを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）により付属のプロトコールに従い増幅した。

さらに以下のプライマーセットを用いてＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法により相同領域全体を増幅し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭＴｅ−ｄＨＬＡを作製した。

次にｐＧＥＭＴｅ−ｄＨＬＡを以下のプライマーセットを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅し、ＴＶ３をＳａｌＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で制限酵素消化して調製したＦＲＴ−ＢＧＨｐＡ−３’Ｎｅｏ−ＳＡ−ｌｏｘＰを含む断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてＴＶ３−ｄＨＬＡを作製した。

さらに合成により作製したＤＮＡフラグメントＰ２Ａ−ｍＲｕｂｙ２（配列番号９）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を以下のプライマーセットを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅し、増幅産物とＴＶ３−ｄＨＬＡを制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）により消化してから両者をＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ　ｇｅｎｅ）を用いてライゲーションしＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡを作製した。

ＴＶ４−ｄＨ２の作製
ｐＥＦ−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　＃　１１１５４　；　ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１１１５４　；　ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１１１５４）をＥｃｏＲＩ−ＨＦとＮｏｔＩ−ＨＦで制限酵素消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて付属のプロトコールに従いヒト伸長因子１α由来プロモーター配列の下流にＥＧＦＰ遺伝子をクローニングしてｐＥＦ−ＥＧＦＰ２（配列番号１２）を作製した。次にｐＥＦ−ＥＧＦＰ２をＢｓｒＧＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で制限酵素消化し、これに合成により２本のＤＮＡフラグメントとして作製した配列Ｐ２Ａ−５’Ｎｅｏ−ＳＤ−ｌｏｘＰ−ＳＡ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（配列番号１３）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてＴＶ４ｄＦを作製した。

　ＴＶ４ｄＦをＳａｌＩ−ＨＦで制限酵素消化し、これにアニーリングさせた下記オリゴＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔを用いてライゲーションし、ＴＶ４を作製した。

　次にターゲティングベクターＴＶ４−ｄＨ２の５’側相同領域と３’側相同領域を含む配列を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムを鋳型として以下のプライマーセットを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより付属のプロトコールに従い増幅した。

さらに以下のプライマーセットを用いてＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法により相同領域全体を増幅し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭＴｅ−ｄＨ２を作製した。

次にｐＧＥＭＴｅ−ｄＨ２を以下のプライマーセットを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅し、ＴＶ４をＳａｌＩ−ＨＦ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦで制限酵素消化して調製したＰ２Ａ−５’Ｎｅｏ−ＳＤ−ｌｏｘＰ−ＳＡ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏを含む断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてＴＶ４−ｄＨ２を作製した。

ＴＶ−ＴＩ１／２−ＢＳの作製
ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒをベクター骨格とし、ＴＶ−Ｔｌ１／２−ＢＳに用いる５’側相同領域と３’側相同領域を持つＨｐｒｔ発現ベクターＴＶ−Ｔｌ１／２−Ｈｐｒｔ（配列番号２２）を、ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）とＸｂａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）により制限酵素消化し、これに合成により作製したブラストサイジン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（ＩＤＴ）（配列番号２３）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングしてＴＶ−Ｔｌ１／２−ＢＳを作製した。

ゲノム編集ベクターの作製（１）
　ＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１およびＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１のｇＲＮＡは以下の配列に対して設計し、ｇＲＮＡとＣａｓ９の発現にはｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ（ＰＸ４５８）（Ａｄｄｇｅｎｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　＃４８１３８；　ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：４８１３８；　ＲＲＩＤ：　Ａｄｄｇｅｎｅ　４８１３８）を改変し、ＥＧＦＰ遺伝子を蛍光遺伝子アメトリンに置換して作製したＰＸ４５８ａを用いた（配列番号２４）。

ゲノム編集ベクターの作製（２）
　ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２およびＰＸ４５８．１ａ−ｐＨ２ＣＲ１のｇＲＮＡは以下の配列に対して設計し、ｇＲＮＡとＣａｓ９の発現にはＰＸ４５８ａのｇＲＮＡ　ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を改変したＰＸ４５８．１ａを用いた（配列番号２７）。

薬剤耐性マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の調製
　薬剤選択中もＥＳ細胞をフィーダー細胞上で培養するため、薬剤耐性ＭＥＦを作製した。まず胎生１４．５日胚からＭＥＦを調製し、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を２Ａ配列で繋いだ遺伝子（ＨＢＰＮ）を発現するレンチウイルスをＭＥＦに感染させた。ＭＥＦの増殖能を向上させるため５％酸素／５％ＣＯ２の低酸素条件でＨＢＰＮ発現ＭＥＦの培養を行い、これをマイトマイシンＣ処理して薬剤耐性ＭＥＦとして用いた。

ＭＲＣ５−Ａ９融合細胞ｈＣｈＡ９のクローニング
　レンチウイルスを用いてＮｅｏ耐性遺伝子を導入したＭＲＣ５細胞とＡ９細胞をＧｅｎｏｍ　ＯＮＥ−ＣＦ（石原産業）を用いて融合させ、Ｏｕａｂａｉｎ耐性／Ｇ４１８耐性細胞を融合細胞として単離した。ヒト細胞はＯｕａｂａｉｎ感受性、マウス細胞はＯｕａｂａｉｎ非感受性であり、Ｇ４１８とＯｕａｂａｉｎを培地中に添加することで融合細胞を選択することが可能である。ヒト６番染色体を持つ融合細胞はＫＩＦＣ１とＤＡＸＸの遺伝子間領域に設定した以下のプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲにより同定した。

またＦＩＳＨによるヒト６番染色体の検出にはＪａｂｓらの報告（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４１：３７４−３９０，　１９８７）を参考にヒト６番染色体セントロメアに特異的な配列を集めて人工合成したＤＮＡ断片をプローブの調製に用いた。

合成した配列は以下の通りである。

ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９のクローニング
　ＭＲＣ５−Ａ９融合細胞にＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡをターゲティングしたクローン（ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９）は、ＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１とターゲティングベクターＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡをＰＥＩ　ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｈＣｈＡ９にトランスフェクションして作製した。ＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１はターゲティングベクターの相同組換え効率を上げるために共導入した。トランスフェクション翌日にＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡ上の蛍光遺伝子ｍＲｕｂｙ２の発現を指標にベクター導入細胞をソーティングし、ｍＲｕｂｙ２陽性ハイグロマイシン耐性となったクローンを単離した。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより組換え導入されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。単離したクローンからリクローニングを実施した場合も同様に解析を行った。

ＴＶ４ＲＥＮＫＡのクローニング
　ＴＶ４ＲＥＮＫＡは、ＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１とターゲティングベクターＴＶ４−ｄＨ２をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＥＮＫＡにトランスフェクションして作製したＥＳ細胞クローンである。ＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１は、ターゲティングベクターの相同組換え効率を上げるために共導入した。ＥＧＦＰ陽性となったクローンを単離し、ゲノムＰＣＲにより組換え導入されたクローンを同定した。ＸＯ，ＢＤＦ１についても同様にしてクローン単離することが可能である。

ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡのクローニング
　ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡは、ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９からＴＶ４ＲＥＮＫＡへｒｅｔｒｏ−ＭＭＣＴ法（Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（２０１６）ＰｌｏＳ　Ｏｎｅ，１１（６）：　ｅ０１５７１８７．）を用いて改変ヒト６番染色体を導入して作製したＥＳ細胞クローンである。ｍＲｕｂｙ２陽性ハイグロマイシン耐性となった細胞をクローニングし、染色体数４１本となったクローンを単離した。ＦＩＳＨ解析ではＣｙ３ラベルしたｍｏｕｓｅ　Ｃｏｔ−１とＣｙ５ラベルしたＲＰ１１−５４Ｈ１３を用いて検出を行った。

ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４のクローニング
　ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてＣｒｅ発現ベクターを導入し、ｌｏｘＰ間で染色体転座を誘導した。染色体転座を起こしたクローンは、Ｇ４１８耐性を指標として単離し、「ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４」とした。組換えが生じていることをゲノムＰＣＲにより確認した後、ＦＩＳＨ解析でマウス１７番染色体とヒト６番染色体間で転座が起きていることを確認した。

ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

　ＦＩＳＨ解析では、Ｃｙ３ラベルしたＲＰ１１−５４Ｈ１３，　ＤＹ４９０ラベルしたＲＰ２３−１４７Ｇ２３とＣｙ５ラベルしたＲＰ２３−１１９Ｇ２４、またはＣｙ３ラベルしたヒトＣｏｔ−１とＤＹ４９０ラベルしたマウスＣｏｔ−１を用いて検出を行った。

ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂのクローニング
　ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂのクローニングでは、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌ３／４にＴＶ−Ｔｌ１／２−ＢＳとＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２とＰＸ４５８．１ａ−ｐＨ２ＣＲ１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いて共導入した。トランスフェクション翌日にアメトリン陽性細胞をソーティングし、ブラストサイジン耐性となったクローンを単離した。組換えが生じていることをゲノムＰＣＲにより確認した後、ＦＩＳＨ解析でＭＨＣ領域の置換が起きていることを確認した。

　ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

　ＦＩＳＨ解析では、Ｃｙ３ラベルしたＲＰ１１−１４７Ｇ２３，　ＤＹ４９０ラベルしたヒトＣｏｔ−１とＣｙ５ラベルしたＲＰ２３−３０６Ｈ２０を用いて検出を行った。

ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６のクローニング
　ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂから残存するヒト６番染色体が脱落したＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６を単離するため、ｍＲｕｂｙ２陰性細胞をソーティングし、フィーダー細胞上に播種してクローンの単離を行った。さらに、核型解析により染色体数が４０本であったクローン（ＸＯの場合は３９本）のＦＩＳＨ解析を行い、残存ヒト６番染色体が脱落していることを確認した。ＦＩＳＨ解析では、Ｃｙ３ラベルしたＲＰ１１−１４７Ｇ２３，　ＤＹ４９０ラベルしたヒトＣｏｔ−１とＣｙ５ラベルしたＲＰ２３−３６１Ｃ１９を用いて検出を行った。ＴＶ３−４ＸＯＴｌｂｄｈ６，ＴＶ３−４ＢＤＦ１Ｔｌｂｄｈ６の単離もＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂｄｈ６と同じ手順で実施した。

２．ＭＨＣヒト化マウスの作製
　ＭＨＣヒト化キメラマウスは、ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞とＩＣＲ由来胚を用いて集合キメラ法により作製した。ＭＨＣヒト化マウスは、ＲＥＮＫＡ由来ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞を用いて作製したキメラマウスの場合は、精巣より精子細胞を単離し、Ｂ６／ＤＢＡ　Ｆ１マウスまたはＩＣＲマウスの卵に顕微授精を行って樹立した。また、ＸＯ　ＥＳ細胞由来ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞を用いて作製したメスのキメラマウスの場合は、Ｃ５７ＢＬ／６のオスマウスと交配を行ってＭＨＣヒト化キメラマウス（ＭＨＣヒト化ヘテロマウス）を樹立した。ＭＨＣヒト化マウスの樹立は産仔のＥＧＦＰ蛍光及びゲノムＰＣＲ法により確認した。

　ゲノムＰＣＲに用いたプライマーセットは下記の通りである。
ＤＡＸＸ：

ＭＩＣＡ：

ＭＯＧ：

Ｓ７６：

ＤＡＸＸ（３プライマーによる確認）：

３．結果と考察
ＭＨＣ領域を置換するためのベクターの構築
　まず、一連の組換え操作に必要なベクターの構築を行った。転座置換による周辺遺伝子の発現への影響を考慮し、ヒトまたはマウスのＭＨＣ領域遠位側で遺伝子間配列が比較的大きいＭＯＧとＧＡＢＢＲ１遺伝子座との間にＴＶ３Ｒ配列またはＴＶ４配列を組換え導入するためのターゲティングベクターＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡ，　ＴＶ４−ｄＨ２を設計した（図５Ａ，Ｂ）。また、相同組換え効率を上げるため、それぞれの標的部位にＤＮＡ二重鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲベクターＰＸ４５８ａ−ｄＨＬＡＣＲ１、ＰＸ４５８ａ−ｄＨ２ＣＲ１を作製した。

　ＴＶ３Ｒには、転座誘導に必要なｌｏｘＰ配列と転座組換え時にＧ４１８耐性となるようにするためのＮｅｏ耐性遺伝子の３’側配列、転座誘導後ターゲティングベクター内の配列を除去するためのＦＲＴ配列、ターゲティング時に薬剤選択するためのハイグロマイシン耐性遺伝子とターゲティングされた染色体が存在することを検出するための赤色蛍光遺伝子ｍＲｕｂｙ２がコードされている。

　一方、ＴＶ４には、転座誘導に必要なｌｏｘＰ配列、転座組換え時にＧ４１８耐性となるようにするためのＮｅｏ耐性遺伝子の５’側配列、転座誘導後ターゲティングベクター内の配列を除去するためのＦＲＴ配列、ターゲティング時に薬剤選択するためのピューロマイシン耐性遺伝子、及びターゲティングされた染色体の存在を検出するための緑色蛍光遺伝子ＥＧＦＰがコードされている。ＴＶ３Ｒ配列とＴＶ４配列は、転座誘導後のマウス１７番染色体にＥＧＦＰ発現ユニットと再構成されたＮｅｏ耐性遺伝子が残るように設計されており、ＭＨＣヒト化マウス１７番染色体保持細胞を薬剤と蛍光により選別することが可能である。

　次に、ヒト及びマウスのＭＨＣ領域近位側で遺伝子間配列が比較的大きいＤＡＸＸとＫＩＦＣ１遺伝子座との間の転座組換えを誘導するためのターゲティングベクターＴＶ−Ｔｌ　１／２−ＢＳと、それぞれの標的部位を切断し組換え効率を上げるためのＣＲＩＳＰＲベクターＰＸ４５８．１ａ−ｐＨＬＡＣＲ２、ＰＸ４５８．１ａ−ｐＨ２ＣＲ１を作製した（図５Ｃ）。ＴＶ−Ｔｌ　１／２−ＢＳには、ブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットが入っているため、組換え導入された細胞はブラストサイジン耐性で選択することができるよう設計した。またブラストサイジン耐性遺伝子は、最終的にＥＳ細胞から除去される残存ヒト６番染色体上に組換え導入されるようベクター設計を行った。これにより、ＭＨＣヒト化マウス１７番染色体のＭＨＣ領域近位側には外来の遺伝子発現カセットが導入されないため、ヒト化ＭＨＣ領域周辺の遺伝子発現への影響は最小限に留めることができると考えられる。

Ａ９−ＭＲＣ５融合細胞の作製
　ヒト正常線維芽細胞ＭＲＣ５細胞のヒト６番染色体をマウスＥＳ細胞（以下ＥＳ細胞）に導入するため、ＭＲＣ５細胞と染色体供与能の高いマウス線維芽細胞Ａ９細胞の融合細胞を作製する必要がある。そこで、まず融合細胞を薬剤選択するため、レンチウイルスを用いてＭＲＣ５細胞にネオマイシン耐性遺伝子を導入した（図４、ステップ１（丸印の１番。以降、ステップ１以降も、ステップ１と同様に各ステップのナンバリングは丸印の番号を付与する。））。次に、ネオマイシン耐性ＭＲＣ５細胞をＡ９細胞と細胞融合させ、ヒト細胞を選択的に死滅させる薬剤ウアバインとＧ４１８の両方に耐性となった融合細胞株ｈＣｈＡ９を単離した（図４、ステップ２）。

　単離したクローンにヒトＨＬＡ領域内の配列が存在するか否かゲノムＰＣＲで確認したところ、クローン＃１，５，１３でシグナルが検出された（図６Ａ）。さらに、ｈＣｈＡ９＃５にヒト６番染色体が存在することを確かめるため、ヒト６番染色体セントロメア配列特異的プローブを用いてＦＩＳＨ法により解析を行ったところ、この融合細胞クローンにはヒト６番染色体が２本存在することが確認できた（図６Ｂ）。

ＴＶ３Ｒのターゲティング
　ｈＣｈＡ９＃５のヒト６番染色体ＭＨＣ領域遠位側にターゲティングベクターＴＶ３Ｒ−ｄＨＬＡを組換え導入し、ＭＨＣ領域の置換に必要な配列を導入した（図４、ステップ３）。
　その結果、ハイグロマイシン耐性となったクローンを単離してゲノムＰＣＲによる解析を行い、複数のターゲティングされた細胞ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９が単離できた（図７Ａ）。クローンが混じっている可能性を排除するため、ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５（１２８）からリクローニングを行いＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５ａ（１２８）を単離した（図７Ｂ）。ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５ａ（１２８）をＦＩＳＨ解析したところ、過半数の細胞がヒト６番染色体を１本保持していることを確認できた（図７Ｃ）。そこで、ＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５ａ（１２８）を改変ヒト６番染色体供与細胞として用いた。

ＴＶ４のターゲティング
　Ｂ６由来マウスＥＳ細胞ＲＥＮＫＡの１７番染色体上に存在するＭＨＣ領域の遠位側にＴＶ４−ｄＨ２をターゲティングし、ＭＨＣ領域のスワッピングに必要な配列を導入した（図４、ステップ４）。

　ＥＧＦＰ陽性クローンをゲノムＰＣＲにより解析したところ、組換え導入されたクローンが多数確認できた（図８Ａ）。ＴＶ４配列内にあるＥＧＦＰは、ＭＨＣヒト化アリルのみに存在すれば生殖系列伝播の確認に利用できるため、片アリルのみがターゲティングされている染色体数４０本のクローンＴＶ４ＲＥＮＫＡ＃１７を以降の実験に使用した（図８）。

改変ヒト６番染色体の導入
　ＴＶ４ＲＥＮＫＡ＃１７にＴＶ３ＲｈＣｈＡ９＃５−４５ａ（１２８）の改変ヒト６番染色体を導入した（図４、ステップ５）。通常、ＥＳ細胞は染色体導入効率が低く、また融合細胞はＡ９細胞に比べて染色体供与能が低い傾向にあるため、ポリエチレングリコールを用いた従来の染色体導入法（ＰＥＧ−ＭＭＣＴ法）では染色体導入できない可能性が考えられる。そこで、マウス白血病ウイルス由来のエコトロピックエンベロープタンパク質を利用した高効率染色体導入法（ｒｅｔｒｏ−ＭＭＣＴ法）を用いて改変ヒト６番染色体の導入を行った。

　ハイグロマイシン耐性・ｍＲｕｂｙ２陽性となったＥＳ細胞をクローニングし、染色体標本を作製して核型解析を行った。マウス正常細胞は染色体数が４０本（ＸＯは３９本）であるが、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ＃１７／５−４５ａ−３は染色体数が４１本（ＸＯは４０本）となっていることが確認できた。また、ヒト６番染色体の特徴であるサブメタセントリック染色体を保持していることが確認できたため、さらにＦＩＳＨ解析を行ったところ、この染色体はヒトＭＨＣ領域を含んでいた。従って、改変ヒト６番染色体の導入に成功したと考えられた（図９）。

Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを用いた染色体転座の誘導
　組換え酵素Ｃｒｅは、独立した染色体上にあるｌｏｘＰ配列間で転座を誘導することが可能である。そこで、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ＃１７／５−４５ａ−３が保持する改変ヒト６番染色体と改変マウス１７番染色体のＭＨＣ領域遠位側の間で転座を誘導するため、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ＃１７／５−４５ａ−３で組換え酵素Ｃｒｅを一過的に発現させた（図４、ステップ６）。ＴＶ３配列とＴＶ４配列に存在するｌｏｘＰ間で転座組換えが誘導されると、Ｎｅｏ耐性遺伝子が再構築されるため（図１０Ａ）、Ｇ４１８耐性となったクローンの単離を行った。これらクローンのうち、染色体数が４１本（ＸＯでは４０本）で転座組換えが起きていることを、ゲノムＰＣＲ及びＦＩＳＨ法により確認できた。このクローンを「ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌ３／４＃１７−１」とし、以降の実験に用いた（図１０Ｂ−Ｄ）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた染色体転座の誘導
　ＭＨＣ領域近位側の転座は、遠位側と同様に組換え酵素Ｄｒｅを用いて転座誘導する予定であったため、当初は近位側にＤｒｅの認識配列ｒｏｘを組換え導入したＥＳ細胞を準備していた。しかし、Ｄｒｅによる転座は効率が低く、また選択マーカーとして用いる予定であったＨＰＲＴ遺伝子の発現は、ＥＳ細胞において要求性が高かったため、組換え転座により再構築されるＨＰＲＴ遺伝子の発現ではＨＡＴによる選択培養に耐えられないことがわかった。このため、マウス１７番染色体の改変はＴＶ４の導入のみに変更し、ＥＳ細胞のＨｐｒｔ遺伝子破壊は中止してＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌ３／４＃１７−１を作製している。

　そこで、ＭＨＣ領域近位側はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて転座誘導することとした。具体的には、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌ３／４＃１７−１にマウス１７番染色体とヒト６番染色体それぞれのＫＩＦＣ１からＤＡＸＸの遺伝子間領域を切断するＣＲＩＳＰＲベクターと転座誘導ターゲティングベクターＴＶ−Ｔｌ１／２−ＢＳを導入し、ブラストサイジン耐性となったクローンを単離した（図４、ステップ７）。このうち、クローンＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂ＃３８は染色体数が４１本（ＸＯでは４０本）であり、転座組換えが起きていることをゲノムＰＣＲにより確認できた。またＦＩＳＨ法により解析したところ、改変ヒト６番染色体は野生型１７番染色体ではなく改変１７番染色体との間で転座していることが分かったことから、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂ＃３８を以降の実験に用いた（図１１）。

ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞の単離
　ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞の未分化性を担保するため、当初はここまでで作製できたＭＨＣヒト化マウス１７番染色体を継代数の少ないＥＳ細胞に導入し、内在マウス１７番染色体を欠損させてＭＨＣヒト化ＥＳ細胞を作製する計画を立てた（図４、ステップ８’）。しかし、この操作を行うにはＥＳ−Ａ９融合細胞の作製とＥＳ細胞へのＭＨＣヒト化染色体の導入が必要となり、その過程で高頻度で染色体異常が起きることが分かり、操作に制限が生じた。そこで、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂ＃３８からヒト染色体を自然脱落させてＭＨＣヒト化ＥＳクローンを多数単離して、キメラマウスの作製を試みた（図４、ステップ８）。

　ヒト染色体は、マウス細胞内で脱落しやすいことが報告されている。このため、ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂ＃３８を選択薬剤非存在下で数日間培養を行い、残存ヒト６番染色体の脱落を誘導した。残存ヒト６番染色体脱落クローンの単離には、当初ＨＰＲＴ遺伝子欠損細胞を選択可能な６−チオグアニンを選択薬剤として利用する予定であったが、先述のようにＥＳ細胞においてＨｐｒｔ遺伝子は選択マーカーとして用いるのが難しいことが分かった。

　そこで、残存ヒト６番染色体上に残るよう設計した蛍光遺伝子ｍＲｕｂｙ２の発現を指標に、ｍＲｕｂｙ２陰性細胞をソートしてクローンを単離することにした。その結果、残存ヒト６番染色体が脱落したＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂ＃３８ｄｈ６クローンの単離に成功した（図１２）。このうち、染色体数が４０本（ＸＯでは３９本）で、ＦＩＳＨ法によりＭＨＣヒト化マウス１７番染色体が確認できたＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂｄｈ６＃３を以降の実験に用いた。また、マウスゲノム配列とヒトＭＨＣ領域内の配列をリファレンスとしてＴＶ３−４ＲＥＮＫＡ　Ｔｌｂｄｈ６＃３のホールゲノムシークエンス解析を実施し、導入したヒトＭＨＣ遺伝子群のハプロタイプを同定した（図１２Ｃ）。

ＭＨＣヒト化マウスの樹立
　ＴＶ３−４ＲＥＮＫＡＴｌｂ＃３８ｄｈ６＃３からキメラマウスの作製を実施し、毛色のキメラ率が５０％~６０％のマウスを３匹得た（図１３Ａ）（図４、ステップ９）。

　ＭＨＣヒト化染色体を持つＥＳ由来の細胞は、ＥＧＦＰを発現するよう設計されている（図１３Ｂ）。そこで、精巣におけるＭＨＣヒト化ＥＳ細胞の寄与率をＥＧＦＰの発現を指標に解析したところ、ほぼ１００％がＥＧＦＰ陽性であったことが分かった（図１３Ｃ）。このことから、精巣細胞を顕微授精（ＩＣＳＩ／ＲＯＳＩ）すれば産仔を得られる可能性が高いと考えられた。そこで、キメラマウスの精巣細胞を用いて顕微授精を実施した（図４、ステップ１０）。

　その結果、ＭＨＣヒト化ＥＳ細胞が生殖系列伝播して全身が緑色に光るＭＨＣヒト化マウスを得ることに成功した（図１４Ａ，　Ｂ）。さらに、ゲノムＰＣＲによりＥＧＦＰ陽性個体がヒトＭＨＣ領域の配列を持つことも確認された（図１４Ｃ）。これらの結果から、ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスを樹立することに成功したことが分かった。

キメラマウスの自然交配によるＭＨＣヒト化マウスの作製
　これまでの結果から、Ｂ６由来ＥＳ細胞から作製したＭＨＣヒト化キメラマウスは生殖能力が低いことが分かった。そこで、メスとして発生するＸＯ　ＥＳ細胞（Ｂ６／ＣＢＡ　Ｆ１）のＭＨＣヒト化も同様に実施してキメラマウスを作製し（図１５Ａ）（図４、ステップ９）、野生型マウスと交配した。
　その結果、自然交配によりＭＨＣヒト化ヘテロマウスを得ることに成功した（図１５Ｂ−Ｄ）（図４、ステップ１０）。

４．ＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスにおけるヒトＭＨＣ遺伝子の発現解析
＜方法＞
ヒトＭＨＣ（ＨＬＡともいう）タンパク質の発現解析
　脾臓細胞の調製では、まず摘出した脾臓をナイフで細かく刻んだ後、スライドガラスのフロスト処理部を用いて組織片をすりつぶした。次に細胞を０．８３％塩化アンモニウムで溶血処理し、ナイロンメッシュを通して脾臓細胞を調製した。フローサイトメトリー解析ではＰａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ標識　抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（Ａｂｃａｍ）を用いてＡＰＣ標識した抗ＨＬＡ　ｃｌａｓｓ　Ｉ抗体（ＭＢＬ）あるいはＡＰＣ標識抗ＨＬＡ−ＤＲ，　ＤＰ，　ＤＱ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色し、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を用いて解析を行った。ウエスタンブロット法による解析では抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体（ＭＢＬ）、抗ＨＬＡ−Ａ抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ＨＬＡ−ＤＲＡ抗体（Ａｂｃａｍ）またはＨＲＰ標識抗ＡＣＴＢ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて検出を行った。

　肺由来線維芽細胞の調製では、まず摘出した肺組織をナイフで細かく刻んだ後０．１％コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）で１時間処理し、ピペッティングにより細胞を遊離させた後、ナイロンメッシュを通して肺由来線維芽細胞を調製した。肺由来線維芽細胞は１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで培養した。

結果
　脾臓細胞におけるヒトＭＨＣ遺伝子の発現をタンパク質レベルで解析した。まず野生型（Ｗｔ）及びＸＯ　ＥＳ細胞から樹立したＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウス（Ｈｅｔ）より脾臓細胞を調製し、抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体、抗ＨＬＡ−Ａ抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＲＡ抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりヒトＭＨＣタンパク質の発現を解析した。その結果、Ｈｅｔ由来脾臓細胞においてヒトＭＨＣの発現が特異的に検出された（図１６Ａ）。

　次にＨＬＡタンパク質の細胞表面への発現を解析した。脾臓細胞は主にＢ細胞とＴ細胞から構成されており、ＭＨＣクラスＩは全ての細胞、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩはＢ細胞に発現が確認されるはずである。そこでＢ細胞マーカーであるＣＤ１９に対する抗体、ヒトＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉを認識する抗ＨＬＡ　ｃｌａｓｓ　Ｉ抗体及びヒトＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩを認識する抗ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析したところ、ＨＬＡ　ｃｌａｓｓ　Ｉは全てのＨｅｔ由来脾臓細胞で検出され、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲはＨｅｔ由来Ｂ細胞で特異的に発現が確認できた（図１６Ｂ）。
［実施例２］
ＭＨＣ領域を削除及び欠損した染色体を有する細胞及び動物の作出

ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞では一方のアリルのＭＨＣ領域がヒト化されているため、マウスＭＨＣ領域内の配列を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム配列の欠損誘導や遺伝子破壊は全てマウスＭＨＣ領域を持つアリル上に生じることになる（図１７）。したがって、ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞でマウスＭＨＣ遺伝子群の破壊・削除を実施すればマウスＭＨＣ遺伝子群欠損アリルを作出することができる。ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞からはＭＨＣヒト化（ヘテロ）マウスを作製できることから、マウスＭＨＣ遺伝子群欠損ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を作製すればマウスＭＨＣ遺伝子群欠損マウスの作製が可能である。

＜本実施例の概要＞
本実施例では、ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／６　Ｆ１マウス由来ＸＯ　ＥＳ細胞のＤａｘｘからＭｏｇに至るＭＨＣ領域をヒト化したＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞を用いてマウスＭＨＣ遺伝子群欠損アリルの作製を行った。まずＭＨＣ遺伝子群のゲノム上での分布を見てみると、３９遺伝子のうち３５遺伝子は非ＭＨＣ遺伝子が混在しない５つのクラスターに存在することが分かった（図１８）。これらのクラスターをサイズの大きなものから順にｄ１，　ｄ２，　ｄ３，　ｄ４，　ｄ５と呼称する。Ｈ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ５，　Ｈ２−Ｍ３，　Ｈ２−Ｍ２の５つはクラスターを形成せず孤立して存在することがわかる。これら孤立して存在するＭＨＣ遺伝子をｄ６と分類し、クラスター内に存在するＭＨＣ遺伝子はクラスターを挟むように設計した２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて削除し、孤立して存在するＭＨＣ遺伝子は各ＭＨＣ遺伝子のタンパク質コード配列を破壊するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて遺伝子破壊を行った。

具体的には、図１９に示すようにＭＨＣ遺伝子を順次削除してｄ１からｄ６クローンの単離を実施した。ｄ１クローンはＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞のｄ１クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ２クローンはｄ１クローンからｄ２クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ３クローンはｄ２クローンからｄ３クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ４クローンはｄ３クローンからｄ４クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させたクローン、ｄ５クローンはｄ４クローンからｄ５クラスター内ＭＨＣ遺伝子を欠損させ、さらにＨ２−Ｍ５遺伝子を同時に遺伝子破壊したクローン、ｄ６クローンは、ｄ５クローンのＨ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ３，　Ｈ２−Ｍ２を遺伝子破壊したクローンである。ｄ６クローンの作製において、４遺伝子の同時破壊は遺伝子破壊効率が低くなるため、場合によってはｄ５クローンのＨ２−Ｋ１とＨ２−Ｍ３のみを破壊したｄ６ａクローンを単離してから、Ｈ２−ＯａとＨ２−Ｍ２を破壊してｄ６クローンの単離を行った。

＜方法＞
ゲノム編集ベクターの作製
ｇＲＮＡとＣａｓ９の発現にはｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ（ＰＸ４５８）（Ａｄｄｇｅｎｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　＃４８１３８；　ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：４８１３８；　ＲＲＩＤ：　Ａｄｄｇｅｎｅ　４８１３８）を改変し、マーカー蛍光遺伝子をアメトリンに置換したＰＸ４５８．１ａを用いた。

ｄ１クラスターの削除には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ２クラスターの削除には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ３クラスターの削除には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ４クラスターの削除には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ５クラスターの削除及びＨ２−Ｍ５の破壊には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ６に含まれるＨ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ３，　Ｈ２−Ｍ２の破壊には下記のベクターを用いた。ｇＲＮＡの配列は以下の通りである。

ｄ１クローンの単離
ｄ１に含まれるマウスＭＨＣ遺伝子を削除したｄ１クローンの作製では、ＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞にＰＸ４５８．１ａ−Ｍ１０．２ｕｐＣＲ１とＰＸ４５８．１ａ−Ｍ１０．６ｄｏｗｎＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｄ１クラスターが削除されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＰＣＲ陽性クローンのうち染色体数が正常であったクローンについてＦＩＳＨ解析を実施しｄ１クラスターが削除されていることを確認した。ＦＩＳＨ解析ではマウス１７番染色体の検出にＣｙ３ラベルしたＲＰ２３−１４７Ｇ２３，　ｄ１クラスターの検出にＤＹ４９０ラベルしたＲＰ２３−３５５Ｍ１４、ヒトＭＨＣ領域の検出にＣｙ５ラベルしたＲＰ１１−５４Ｈ１３を用いた。

ｄ２クローンの単離
ｄ１，　ｄ２に含まれるマウスＭＨＣ遺伝子を削除したｄ２クローンの作製では、ｄ１クローンにＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２Ｄ１ｕｐＣＲ１とＰＸ４５８．１ａ−Ｑ１０ｄｏｗｎＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｄ２クラスターが削除されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＰＣＲ陽性クローンのうち染色体数が正常であったクローンについてＦＩＳＨ解析を実施しｄ２クラスターが削除されていることを確認した。ＦＩＳＨ解析ではマウス１７番染色体の検出にＣｙ３ラベルしたＲＰ２３−１４７Ｇ２３，　ｄ２クラスターの検出にＤＹ４９０ラベルしたＲＰ２３−１０１Ｊ１６、ヒトＭＨＣ領域の検出にＣｙ５ラベルしたＲＰ１１−５４Ｈ１３を用いた。

ｄ３クローンの単離
ｄ１，　ｄ２，　ｄ３に含まれるマウスＭＨＣ遺伝子を削除したｄ３クローンの作製では、ｄ２クローンにＰＸ４５８．１ａ−Ｔ２４ｕｐＣＲ１とＰＸ４５８．１ａ−Ｔ３ｄｏｗｎＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｄ３クラスターが削除されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＰＣＲ陽性クローンのうち染色体数が正常であったクローンについてＦＩＳＨ解析を実施しｄ３クラスターが削除されていることを確認した。ＦＩＳＨ解析ではマウス１７番染色体の検出にＣｙ３ラベルしたＲＰ２３−１４７Ｇ２３，　ｄ３クラスターの検出にＤＹ４９０ラベルしたＲＰ２３−２６８Ｐ１９、ヒトＭＨＣ領域の検出にＣｙ５ラベルしたＲＰ１１−５４Ｈ１３を用いた。

ｄ４クローンの単離
ｄ１，　ｄ２，　ｄ３，　ｄ４に含まれるマウスＭＨＣ遺伝子を削除したｄ４クローンの作製では、ｄ３クローンにＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２０ｂｕｐＣＲ１とＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２Ｅｂ２ＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｄ４クラスターが削除されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＰＣＲ陽性クローンは染色体数が正常であることを確認した後、ｄ５クローンの作製に用いた。

ｄ５クローンの単離
ｄ１，　ｄ２，　ｄ３，　ｄ４，　ｄ５に含まれるマウスＭＨＣ遺伝子を削除し、Ｈ２−Ｍ５を破壊したｄ５クローンの作製では、ｄ４クローンにＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２ＤＭａｕｐＣＲ１、ＰＸ４５８．１ａ−ＤＭｂ１ｄｏｗｎＣＲ１およびＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２−Ｍ５ＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｄ５クラスターが削除されたクローンを同定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。

ＰＣＲ陽性であったクローンは、さらにＨ２−Ｍ５の遺伝子破壊について解析を行った。まず各クローンのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２−Ｍ５ＣＲ１の標的部位を含む配列を下記のプライマーを用いて増幅した。

ＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｃｙｔｉｖａ）またはＦａｖｏｒＰｒｅｐ　ＧＥＬ／ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｆａｖｏｒｇｅｎ）を用いて精製し、下記プライマーを用いてシークエンス解析により標的遺伝子が破壊されているか確認した。

ｄ５クラスターの欠損とＨ２−Ｍ５の破壊が確認されたクローンは染色体数が正常であることを確認した後、ｄ６クローンの作製に用いた。

ｄ６クローンの単離
ｄ１からｄ６に含まれる全てのマウスＭＨＣ遺伝子を削除または破壊したｄ６クローンの作製では、ｄ５クローンにＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２Ｍ２ＣＲ１，　ＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２Ｍ３ＣＲ１，　ＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２０ａＣＲ１，　ＰＸ４５８．１ａ−Ｈ２Ｋ１ＣＲ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００を用いてトランスフェクションし、翌日に蛍光遺伝子アメトリンの発現を指標にベクター導入細胞をソーティングした。ソート後２日または３日目に細胞を再播種してクローン単離を行った。上記４遺伝子の遺伝子破壊を同時に行うと、ｄ６クローンを単離できる効率が低くなるため、場合によってはｄ５クローンのＨ２−Ｋ１とＨ２−Ｍ３を遺伝子破壊したｄ６ａクローンを単離してから、Ｈ２−ＯａとＨ２−Ｍ２を遺伝子破壊してｄ６クローンの作製を実施した。

単離したクローンからゲノムＤＮＡを調製し、各ＭＨＣ遺伝子に対して設計したｇＲＮＡの標的部位を含む配列を下記のプライマーを用いて増幅した。
Ｈ２Ｋ１

Ｈ２−Ｍ３

Ｈ２−Ｍ２

Ｈ２−Ｏａ

各ＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０またはＦａｖｏｒＰｒｅｐ　ＧＥＬ／ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いて精製し、下記のプライマーを用いてシークエンス解析により標的遺伝子が破壊されているか確認した。

Ｈ２Ｋ１

Ｈ２−Ｍ３

Ｈ２−Ｍ２

Ｈ２−Ｏａ

Ｈ２−Ｍ２のｇＲＮＡ標的部位の上流および下流のＳＮＰ解析では、ＳＮＰ部位を含むゲノム配列を増幅し、シークエンス解析により確認を行った。各ＰＣＲ産物はＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０またはＦａｖｏｒＰｒｅｐ　ＧＥＬ／ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　を用いて精製した。ゲノム配列の増幅、シークエンス解析に用いたプライマー配列は下記の通りである。

Ｈ２−Ｍ２　ｇＲＮＡ標的部位の上流にあるＳＮＰ部位（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０，　ｃｈｒ１７：３７４６６７２７）を含むゲノム配列の増幅

シークエンス解析

当該ＳＮＰ配列はＣＢＡではＡ、Ｃ５７ＢＬ／６ではＣである。

Ｈ２−Ｍ２　ｇＲＮＡ標的部位の下流にあるＳＮＰ部位（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０，　ｃｈｒ１７：　３７４９１０００　，　３７４９１００７）を含むゲノム配列の増幅

シークエンス解析

ＳＮＰ配列は、３７４９１０００はＣＢＡではＣ、Ｃ５７ＢＬ／６ではＴであり、３７４９１００７はＣＢＡではＣ、Ｃ５７ＢＬ／６ではＡである。

遺伝子破壊およびＳＮＰの維持が確認されたクローンは染色体数が正常であることを確認した。
ｄ５ホモマウスの解析
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の解析では、野生型またはｄ５ホモマウスの脾臓細胞または胸腺細胞を調製し、抗ＣＤ３，　ＣＤ４，　ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＣＤ３陽性細胞についてＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の割合をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。

クラススイッチの解析では、１１から１５週齢の野生型（ｎ＝３）またはｄ５ホモマウス（ｎ＝１）を１０μｇリコンビナントＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　Ｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１＋Ｓ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で皮下免疫し、３週後さらに１０μｇリコンビナントＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　Ｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１＋Ｓ２と５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）で追加免疫を行った。追加免疫１週間後に血清を回収し、ＥＬＩＳＡにより抗Ｓ１　ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を解析した。

ｄ６キメラマウスの解析
ＭＨＣ遺伝子群欠損染色体の解析は下記のプライマーを用いてｄ５クラスターの欠損により同定した。ＰＣＲ産物のサイズは野生型では４４７ｂｐ、ｄ５欠損ではｄ６マウスの作製に用いたＥＳクローンの場合６３３ｂｐとなる。

＜結果＞
ｄ１クローンの単離
Ｈ２−Ｍ１０．２遺伝子座の上流部分とＨ２−Ｍ１０．６遺伝子座のタンパク質コード配列内にｇＲＮＡを設計し、これら２つのｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりＭＨＣヒト化（ヘテロ）ＥＳ細胞のｄ１クラスターに欠損を誘導してｄ１クローンの単離を行った（図２０）。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列に挟まれたゲノム配列が欠損した場合にＰＣＲ増幅産物が生じるように設計したプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲを実施したところ複数のＰＣＲ陽性クローンが得られた。ＰＣＲ陽性クローンの中で染色体数が正常（ＸＯ　ＥＳ細胞の場合は３９本）であることが確認できたｄ１クローン＃２６を、ｄ１クラスターを認識するプローブを用いてＦＩＳＨ解析したところｄ１クラスターの欠損が確認された。

ｄ２クローンの単離
Ｈ２−Ｄ１遺伝子座の上流部分とＨ２−Ｑ１０遺伝子座のタンパク質コード配列内にｇＲＮＡを設計し、これら２つのｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｄ１クローン＃２６のｄ２クラスターに欠損を誘導してｄ２クローンの単離を行った（図２１）。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列に挟まれたゲノム配列が欠損した場合にＰＣＲ増幅産物が生じるように設計したプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲを実施したところ複数のＰＣＲ陽性クローンが得られた。ＰＣＲ陽性クローンの中で染色体数が正常であることが確認できたｄ２クローン＃８５を、ｄ２クラスターを認識するプローブを用いてＦＩＳＨ解析したところｄ２クラスターの欠損が確認された。

ｄ３クローンの単離
Ｈ２−Ｔ２４遺伝子座の上流部分とＨ２−Ｔ３遺伝子座の下流部分にｇＲＮＡを設計し、これら２つのｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｄ２クローン＃８５のｄ３クラスターに欠損を誘導してｄ３クローンの単離を行った（図２２）。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列に挟まれたゲノム配列が欠損した場合にＰＣＲ増幅産物が生じるように設計したプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲを実施したところ複数のＰＣＲ陽性クローンが得られた。ＰＣＲ陽性クローンの中で染色体数が正常であることが確認できたｄ３クローン＃２６を、ｄ３クラスターを認識するプローブを用いてＦＩＳＨ解析したところｄ３クラスターの欠損が確認された。

ｄ４クローンの単離
Ｈ２−Ｏｂ遺伝子座の上流部分とＨ２−Ｅｂ２遺伝子座のタンパク質コード配列内にｇＲＮＡを設計し、これら２つのｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｄ３クローン＃２６のｄ４クラスターに欠損を誘導してｄ４クローンの単離を行った（図２３）。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列に挟まれたゲノム配列が欠損した場合にＰＣＲ増幅産物が生じるように設計したプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲを実施したところ複数のＰＣＲ陽性クローンが得られた。さらにＰＣＲ陽性であったｄ４クローン＃７２は染色体数正常であることが確認された。

ｄ５クローンの単離
Ｈ２−ＤＭａ遺伝子座のタンパク質コード配列内とＨ２−ＤＭｂ１遺伝子座の下流部分にｇＲＮＡを設計し、これら２つのｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｄ４クローン＃７２のｄ５クラスターに欠損を誘導した。また同時にＨ２−Ｍ５のタンパク質コード領域内に設計したｇＲＮＡを用いてＨ２−Ｍ５の遺伝子破壊を実施し、ｄ５クローンの単離を行った（図２４）。上記２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列に挟まれたゲノム配列が欠損した場合にＰＣＲ増幅産物が生じるように設計したプライマーセットを用いてゲノムＰＣＲを実施したところ複数のＰＣＲ陽性クローンが得られた。次にＰＣＲ陽性クローンについてＨ２−Ｍ５が遺伝子破壊されているかシークエンス解析を行った。その結果ｄ５クローン＃２２では１３塩基の欠損が確認された。Ｈ２−Ｍ５の遺伝子破壊が確認されたクローンについてさらに染色体数解析を行い、ｄ５クローン＃２２は染色体数正常であることが確認できた。

ｄ６クローンの単離
Ｈ２−Ｋ１，　Ｈ２−Ｏａ，　Ｈ２−Ｍ２，　Ｈ２−Ｍ３各々のタンパク質コード配列内に設計したｇＲＮＡを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｄ５クローン＃２２の遺伝子破壊を実施しｄ６クローンの単離を行った（図２５）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により各遺伝子が破壊されているか否か確認するためシークエンス解析を行い、４つ全てが遺伝子破壊されたクローンを同定した。Ｈ２−Ｍ２とＨ２−Ｍ３についてはＭＨＣヒト化領域の外側に位置するため、遺伝子はゲノムに２コピー存在する。変異はそれぞれのアリルに別々に入るため、シークエンス解析すると配列が２種類検出される可能性が考えられる。本実施例で用いているＥＳ細胞はＣＢＡとＣ５７ＢＬ／６のＦ１由来であり、ヒトＭＨＣ領域はＣＢＡ由来染色体に存在する。そこで、Ｈ２−Ｍ３に関してはＳＮＰを利用してＣ５７ＢＬ／６アリルを特異的に検出できるシークエンスプライマーを用いて遺伝子破壊を確認した。Ｈ２−Ｍ２に関しては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位近傍にＳＮＰが存在せず、アリル特異的なシークエンス解析は困難であった。そこで両アリルを検出するプライマーを用いてシークエンス解析を実施したところ、図２５に示したｄ６クローン＃１９８では配列は１種類しか検出されなかった。これは、両方のアリルで同一の変異が入っている可能性と、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を導入したことで隣接するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列間で大きな欠失が誘導され、ＰＣＲで増幅できるアリルが一つしか残っていないという可能性が考えられる。

そこでＨ２−Ｍ２近傍のＳＮＰが検出できるか解析して大きな欠失が生じていないか、確認を行った（図２６）。その結果、クローン＃１９８では、Ｈ２−Ｍ２の上流、下流にあるＳＮＰが検出されたことから大きな欠失は誘導されていないことが確認できた。＃１９８は染色体数も正常であったことから３９種類あるマウスＭＨＣ遺伝子を全て破壊したアリルを持つＥＳ細胞の作製に成功したと考えられる。

ｄ５クローン由来マウスの作製
マウスＭＨＣを欠損させる過程で単離したｄ５　ＥＳクローンはマウスＭＨＣ遺伝子３９種のうち３５種が破壊・欠損しており、抗原提示に機能するマウスＭＨＣクラスＩＩを持たない。そこでｄ５　ＥＳクローンを用いてｄ５ホモマウスを作出し、実際にマウスＭＨＣクラスＩＩの機能が失われているか解析を行った。
まず野生型及びｄ５ホモマウスにおけるＴ細胞の分化を解析した。ｄ５ホモマウスはＭＨＣクラスＩＩによる抗原提示ができないため、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は分化してこないと考えられる。そこでｄ５ホモマウスの脾臓及び胸腺におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を解析したところ、その割合は著しく減少していることがわかった（図２７）。またｄ５ホモマウスにおける抗体のクラススイッチを解析するためｄ５ホモマウスをＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質で免疫して、血清中の抗Ｓ１　ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を解析したところ、ｄ５ホモマウスではスパイクタンパクを認識するＩｇＧ１，　ＩｇＧ２が極めて少ないまたは存在しないことが分かった。これらの結果からｄ５ホモマウスでは抗原提示に機能するマウスＭＨＣクラスＩＩが発現していないため、機能的なＣＤ４陽性Ｔ細胞は著しく減少または消失していると考えられる。

マウスＭＨＣ遺伝子群欠損マウスの作出
　全てのマウスＭＨＣ遺伝子を破壊または欠損したマウスを樹立するため、ｄ６ＥＳクローンからキメラマウスを作製し、生殖系列伝播させてｄ６ヘテロマウスを作出した（図２８Ａ，　Ｂ）。次にこのｄ６ヘテロマウス同士を交配して得られた産仔をゲノムＰＣＲにより解析したところ、ＭＨＣ欠損染色体をホモで持つマウスＭＨＣ遺伝子群欠損マウスが確認された（図２８Ｃ，　Ｄ）。

Claims (17)

1. 主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群の全部又は一部が欠損又は破壊された、非ヒト哺乳動物の染色体。
2. 非ヒト哺乳動物がげっ歯類動物である請求項１に記載の染色体。
3. げっ歯類動物がマウスである請求項２に記載の染色体。
4. 請求項１に記載の染色体をホモ又はヘテロで含む細胞。
5. 胚性幹細胞である請求項４に記載の細胞。
6. 請求項１に記載の染色体を持つ非ヒト哺乳動物。
7. 一の非ヒト哺乳動物（非ヒト哺乳動物１）の１対の染色体のうち一方の野生型染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子群の全部又は一部が前記非ヒト哺乳動物１以外の他の哺乳動物（哺乳動物２）のＭＨＣ遺伝子群に置換された染色体をヘテロで有する細胞から、当該非ヒト哺乳動物１由来のＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群１）の全部又は一部を破壊又は欠損させる工程を含む、前記非ヒト哺乳動物１の染色体中に前記哺乳動物２のＭＨＣ遺伝子群（ＭＨＣ遺伝子群２）を有する染色体と、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する細胞の製造方法。
8. 細胞が胚性幹細胞である請求項７に記載の方法。
9. 前記ＭＨＣ遺伝子群１を破壊又は欠損させる工程が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術によるものである、請求項７に記載の方法。
10. 非ヒト哺乳動物１がげっ歯類動物である請求項７に記載の方法。
11. げっ歯類動物がマウスである請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部を破壊又は欠損させる工程が、Ｈ２−Ｍ１０．２、Ｈ２−Ｍ１０．１、Ｈ２−Ｍ１０．３、Ｈ２−Ｍ１０．４、Ｈ２−Ｍ１１、Ｈ２−Ｍ９、Ｈ２−Ｍ１、Ｈ２−Ｍ１０．５及びＨ２−Ｍ１０．６の遺伝子からなるｄ１遺伝子群、Ｈ２−Ｄ１、Ｈ２−Ｑ１、Ｈ２−Ｑ２、Ｈ２−Ｑ４、Ｈ２−Ｑ５、Ｈ２−Ｑ６、Ｈ２−Ｑ７及びＨ２−Ｑ１０の遺伝子からなるｄ２遺伝子群、Ｈ２−Ｔ２４、Ｈ２−Ｔ２３、Ｈ２−Ｔ２２、ＧＭ１１１２７、Ｈ２−ＢＩ、Ｈ２−Ｔ１０、ＧＭ７０３０、ＧＭ８９０９及びＨ２−Ｔ３の遺伝子からなるｄ３遺伝子群、Ｈ２−Ｏｂ、Ｈ２−Ａｂ１、Ｈ２−Ａａ、Ｈ２−Ｅｂ１及びＨ２−Ｅｂ２の遺伝子からなるｄ４遺伝子群、Ｈ２−ＤＭａ、Ｈ２−ＤＭｂ２及びＨ２−ＤＭｂ１の遺伝子からなるｄ５遺伝子群、並びにＨ２−Ｋ１、Ｈ２−Ｏａ、Ｈ２−Ｍ５、Ｈ２−Ｍ３及びＨ２−Ｍ２の遺伝子からなるｄ６遺伝子群からなるマウスＭＨＣ遺伝子群を有する細胞から、前記ｄ１遺伝子群、ｄ２遺伝子群、ｄ３遺伝子群、ｄ４遺伝子群、ｄ５遺伝子群及びｄ６遺伝子群の全部又は一部の遺伝子群を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術により破壊又は欠損させる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
13. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術に用いられるゲノム編集ベクターが、配列番号５３~６７に示す塩基配列を有するｇＲＮＡからなるベクターの組み合わせである、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項７に記載の方法により得られた細胞を用いて、前記非ヒト哺乳動物１の１対の染色体中、前記哺乳動物２のＭＨＣ遺伝子群２を有する染色体と、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体とを有する非ヒト哺乳動物１を作出し、当該非ヒト哺乳動物１を交配する工程を含む、前記ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体を有する非ヒト哺乳動物１の作出方法。
15. 請求項１４に記載の方法により作出された非ヒト哺乳動物１から、ＭＨＣ遺伝子群１の全部又は一部が破壊又は欠損された染色体を有する細胞を回収する工程を含む、当該細胞の製造方法。
16. 請求項１４に記載の方法により作出された非ヒト哺乳動物１、又は請求項１５に記載の方法により製造された細胞から、ＭＨＣ遺伝子群１が破壊又は欠損された染色体を回収する工程を含む、当該染色体の製造方法。
17. 請求項１３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集技術に用いられるゲノム編集ベクターであって、配列番号５３~６７に示す塩基配列を有するｇＲＮＡからなるベクターの組み合わせを含む、前記ゲノム編集ベクター。