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WO2024248109A1 - 心筋細胞群、医薬組成物、心筋細胞群の製造方法、及び心筋球 - Google Patents

心筋細胞群、医薬組成物、心筋細胞群の製造方法、及び心筋球 Download PDF

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Publication number
WO2024248109A1
WO2024248109A1 PCT/JP2024/019949 JP2024019949W WO2024248109A1 WO 2024248109 A1 WO2024248109 A1 WO 2024248109A1 JP 2024019949 W JP2024019949 W JP 2024019949W WO 2024248109 A1 WO2024248109 A1 WO 2024248109A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cardiomyocytes
cells
cardiomyocyte
group
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/019949
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
周吾 遠山
恵一 福田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Heartseed Inc
Original Assignee
Keio University
Heartseed Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University, Heartseed Inc filed Critical Keio University
Publication of WO2024248109A1 publication Critical patent/WO2024248109A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a cardiomyocyte population, a pharmaceutical composition, a method for producing a cardiomyocyte population, and cardiospheres.
  • hPSC-CM human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • Non-Patent Document 1 a test in which cardiomyocytes differentiated from human ES cells using activin A and BMP4 were transplanted into rats with induced myocardial infarction
  • Non-Patent Document 2 a test in which cardiomyocytes differentiated from human iPS cells were transplanted into the infarcted heart of an immunodeficient mouse
  • Non-Patent Documents 5, 6, 7, and 8 new problems have been reported, such as a limited engraftment rate of transplanted pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, and the induction of transplant-associated arrhythmias in the recipient's heart by transplanted pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • a method of reducing arrhythmia using antiarrhythmic drugs see Non-Patent Document 9 has been disclosed, but these methods have problems such as burdening the recipient.
  • hPSC-CMs in which genes such as ion channels have been deleted by genome editing technology (see Non-Patent Document 10) have also been reported, but using gene-edited cells as transplant cells is not preferable because gene editing may cause changes in unintended locations, which may cause undesirable mutations and lead to unpredictable effects, or the manufacturing process and quality control process may become complicated.
  • the human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reported so far have not fully met all of the requirements for clinical application: (i) easy production of highly pure cardiomyocytes, (ii) safe transplantation into humans, (iii) regeneration of damaged parts of the recipient's heart by electrically integrating with the recipient's cardiomyocytes and engrafting for a long time while maintaining maturity, and (iv) low incidence of severe ventricular arrhythmias that last for a certain period of time in the recipient. Furthermore, the structural and functional characteristics that human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes that meet the above conditions must have have not been elucidated based on their mechanism of action, etc.
  • the current situation is that the only way to confirm and evaluate whether human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes obtained by various production methods meet the above conditions is to transplant the cardiomyocytes obtained by various production methods into the myocardial tissue of primates that are close to humans.
  • the present invention aims to provide a group of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells that can meet the conditions necessary for clinical application, cardiomyospheroids formed by spheroidizing the group of cardiomyocytes, a pharmaceutical composition containing the group of cardiomyocytes and/or the cardiomyospheroids as active ingredients, a method for producing the group of cardiomyocytes, and a method for producing the group of cardiomyocytes.
  • a cardiomyocyte group comprising ventricular muscle cells differentiated from human pluripotent stem cells, the cardiomyocyte group having the following characteristics (1), (2), and (3): (1) Cardiac troponin T positive cells account for 90% or more of all live cells; (2) the spontaneous pulsation is 0-60 beats per minute, and (3) differentiation has commenced within 30 days. [2] The cardiomyocyte group described in [1], having a spontaneous pulsation of 0 to 50 beats per minute.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of the cardiomyocyte group described in [1] or [2] and cardiomyocyte spheroids formed by spheroidizing the cardiomyocyte group, and a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition described in [3] wherein the ratio of live cells to the total cells of the cardiomyocyte group is 80% or more.
  • the pharmaceutical composition according to [3], wherein the ratio of cells constituting cardiomyocytes to all cells contained in the pharmaceutical composition is 60% or more.
  • [7] (a) expanding human pluripotent stem cells; (b) culturing the expanded human pluripotent stem cells under conditions for differentiating them into cardiomyocytes to produce a cell population containing 60% or more cardiomyocytes; (c) removing human pluripotent stem cells and non-cardiomyocytes from the cell population;
  • a method for producing cardiomyocytes comprising a step of suspending a group of cardiomyocytes according to [1] or [2] in a medium and then statically culturing the same in an incubator having microwells on the bottom surface.
  • the present invention provides cardiomyocyte groups derived from human pluripotent stem cells, cardiomyospheroids formed by spheroidizing the cardiomyocyte groups, pharmaceutical compositions containing the cardiomyocyte groups and/or the cardiomyospheroids as active ingredients, methods for producing the cardiomyocyte groups, and methods for producing the cardiomyospheroids, all of which can meet the conditions necessary for clinical application.
  • FIG. 1 shows the spontaneous beat rate (beat rate), maximum diastolic potential (MDP), and action potential duration at 90% repolarization (APD90) obtained by electrophysiological analysis using the patch clamp method on the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared in Example 1(1).
  • FIG. 1 shows the waveforms of action potentials obtained by analyzing the drug responsiveness of the human iPS cell-derived cardiomyocytes prepared in Example 1(1) to isoproterenol, amiodarone, and ivabradine.
  • 1 shows the spontaneous beat rate per minute of the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared in Example 1(1) as a result of analyzing the drug responsiveness to isoproterenol, amiodarone, and ivabradine.
  • 1 shows the results of immunocytochemical analysis of the cardiomyocytes derived from human iPS cells prepared in Example 1(1).
  • Example 1 shows the survival rate of cells contained in the cardiospheres produced in Example 2(1).
  • Example 3 the results of measuring the sarcomere length of host cardiomyocytes and transplanted cardiomyocytes in cynomolgus monkeys transplanted with the cardiomyospheroids produced in Example 2(1) are shown.
  • Example 2(2) the results of long-term culture of the cardiospheres produced in Example 2(1) and immunohistochemical staining are shown.
  • Day 28 28 days after the start of culture; Day 56: 56 days after the start of culture; Day 84: 84 days after the start of culture.
  • Example 2(2) dispersed cardiomyocyte groups derived from human iPS cells expressing modified luciferase (Dispersed hiPSC-CMs) and cardiomyospheric cells expressing modified luciferase (hiPSC-CSs) were transplanted into mature male NOG mice, and bioluminescence signals were detected in the transplanted mice.
  • FIG. 2C is a graph showing the bioluminescence signals detected in FIG. 2D.
  • Example 3 the results of measuring the trough level of cyclosporine in the peripheral blood of cynomolgus monkeys transplanted with the cardiospheres (corresponding to 2 x 107 cardiomyocytes) produced in Example 2 (1) are shown.
  • the shaded area indicates the trough level of cyclosporine for suppressing acute rejection in heart transplantation.
  • Example 3 the results of measuring the trough level of cyclosporine in the peripheral blood of cynomolgus monkeys transplanted with the cardiospheres (corresponding to 6 x 107 cardiomyocytes) produced in Example 2 (1) are shown.
  • the shaded area indicates the trough level of cyclosporine for suppressing acute rejection in heart transplantation.
  • Example 3 the left ventricular fractional shortening (FS) was measured by echocardiography in cynomolgus monkeys transplanted with the cardiospheres prepared in Example 2(1) or the vehicle before transplantation, 4 weeks after transplantation (4w post-transplantation), and 12 weeks after transplantation (12w post-transplantation).
  • FS left ventricular fractional shortening
  • Example 3 a Holter electrocardiogram of a cynomolgus monkey transplanted with the myocardial sphere prepared in Example 2(1) is shown, which showed transient ventricular tachycardia.
  • Example 3 Holter electrocardiograms of cynomolgus monkeys implanted with the myocardial spheres prepared in Example 2(1) or the vehicle are shown.
  • Example 3 the results of histological examination of cynomolgus monkeys implanted with the cardiomyospheroids prepared in Example 2(1) are shown. In Example 3, the results of histological examination of cynomolgus monkeys implanted with the cardiomyospheroids prepared in Example 2(1) are shown. In Example 3, echocardiograms are shown for cynomolgus monkeys implanted with the cardiospheres prepared in Example 2(1) or vehicle before implantation, 4 weeks after implantation (4w post-implantation), and 12 weeks after implantation (12w post-implantation). The scale bar indicates 5 cm.
  • Example 3 the measured values of LVEF and FS are shown for cynomolgus monkeys transplanted with the cardiospheres (corresponding to 6 x 107 cardiomyocytes) prepared in Example 2(1) or vehicle before transplantation, 4 weeks after transplantation (4w post-transplantation), and 12 weeks after transplantation (12w post-transplantation).
  • Example 3 Holter electrocardiograms of cynomolgus monkeys implanted with the myocardial spheres prepared in Example 2(1) or the vehicle are shown.
  • the results of measuring the left ventricular shunt fraction (FS) by echocardiography in cynomolgus monkeys transplanted with human iPS cell-derived cardiomyocytes or a vehicle in Experimental Example 3 are shown.
  • hiPSC-CSs (purified): cardiomyocytes produced in Example 2(1); hiPSC-CSs (non-purified): cardiomyocytes produced from a group of unpurified human iPS cell-derived cardiomyocytes.
  • cardiac troponin T (cTnT) and brain natriuretic peptide (BNP) were measured in serum of cynomolgus monkeys transplanted with the cardiospheres prepared in Example 2(1) or vehicle.
  • Example 3 shows the duration of arrhythmia in individual cynomolgus monkeys that had transient arrhythmia after transplantation of the cardiomyospheroids produced in Example 2(1). *p ⁇ 0.05 versus pre-Tx; #p ⁇ 0.05 between vehicle and hiPSC-CSs.
  • Example 3 the results of histological examination of the heart (A), lungs (B, F), liver (C, G), kidneys (D, H), and spleen (E, I) in cynomolgus monkeys transplanted with the cardiomyospheres produced in Example 2(1) are shown.
  • the scale bars in A to D indicate 1 cm.
  • the scale bar in E indicates 5 mm.
  • the scale bar in I indicates 200 ⁇ m.
  • a numerical range expressed using " ⁇ ” means that the range includes the numbers written before and after " ⁇ " as the lower and upper limits.
  • the term “comprises” means that it may contain components other than the target component.
  • the term “consists of” means that it does not contain components other than the target component.
  • the term “consists essentially of” means that it does not contain components other than the target component in a form that exerts a special function (such as a form that completely loses the effect of the invention). In this specification, when “comprises,” it includes forms that "consist of” and forms that “consist essentially of.”
  • the proteins, peptides, polynucleotides (DNA, RNA), vectors, cells, cell groups, and cardiomyosphers described herein may be isolated.
  • isolated means in a natural state or separated from other components.
  • isolated may be substantially free of other components.
  • substantially free of other components means that the content of other components contained in the isolated component is negligible.
  • the content of other components contained in the isolated component may be, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • proteins, peptides, polynucleotides DNA, RNA
  • vectors, cells, cell groups, and cardiomyosphers described herein may be isolated proteins, isolated peptides, isolated polynucleotides (isolated DNA, isolated RNA), isolated vectors, isolated cells, isolated cell groups, and isolated cardiomyosphers, respectively.
  • a first aspect of the present disclosure is a population of cardiomyocytes comprising ventricular muscle cells differentiated from human pluripotent stem cells.
  • the population of cardiomyocytes has the following characteristics (1), (2), and (3): (1) Cardiac troponin T positive cells account for 90% or more of all live cells. (2) Spontaneous heartbeat is 0 to 60 beats per minute. (3) Within 30 days after the initiation of differentiation.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment has the above characteristics (1), (2), and (3), and is therefore a cardiomyocyte group that can satisfy the following conditions (i) to (iv) required for clinical application.
  • They are a group of highly pure cardiomyocytes that can be easily produced.
  • It can be safely transplanted into humans.
  • the cells can be electrically integrated with the myocardial cells of the recipient and can survive for a long time while maintaining their maturity, thereby regenerating damaged parts of the recipient's heart.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment preferably satisfies one or more of the above (i) to (iv), more preferably satisfies two or more, even more preferably satisfies three or more, and particularly preferably satisfies all four.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment satisfies the above conditions (i) to (iv), and can therefore be said to be a cardiomyocyte group suitable for clinical application.
  • pluripotent stem cells are cells that have self-proliferation and pluripotency. Specific examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ cells (EG cells), and germline stem cells (GS cells), as well as cells induced from these pluripotent stem cells with pluripotency. "Pluripotent stem cells” are not particularly limited as long as they are cells that have self-proliferation and pluripotency, and also include unknown cells that have properties equivalent to those of the ES cells and iPS cells exemplified above.
  • Whether a cell is a pluripotent stem cell can be determined from the presence or absence of properties specific to pluripotent stem cells and the expression of various markers specific to pluripotent stem cells.
  • properties specific to pluripotent stem cells include the ability to self-replicate and to differentiate into other types of cells with properties different from those of pluripotent stem cells.
  • Other properties specific to pluripotent stem cells include the ability to form teratomas and chimeric mice.
  • pluripotent stem cell markers are factors that are specifically expressed in pluripotent stem cells, and examples thereof include Oct3/4, Nanog, Sox2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, Lin28, Fbx15, SSEA-5, GDF3, KLF4, and CLDN6.
  • the cell can be determined to be a pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell markers may be used alone or in combination of two or more types.
  • a cell expressing Oct3/4 may be determined to be a pluripotent stem cell.
  • the expression of pluripotent stem cell markers in a cell can be confirmed using known methods such as RT-PCR and microarrays.
  • the human pluripotent stem cells may be human ES cells, human iPS cells, human EG cells, or human GS cells, with human ES cells or human iPS cells being preferred, and human iPS cells being more preferred.
  • Human iPS cells are pluripotent stem cells artificially generated from non-pluripotent cells such as adult somatic cells, and methods for producing human iPS cells are well known in the art. Specifically, human iPS cells are produced by introducing one or more reprogramming factors into any somatic cell such as fibroblasts, hematopoietic cells, epidermal cells, etc. Examples of reprogramming factors include Oct3/4, Sox2, c-Myc, l-Myc, Klf4, Nanog, and LIN28.
  • Pluripotent stem cells can be confirmed using the expression of genes and/or proteins specific to the stem cells as indicators, and these can be selected.
  • Human iPS cells are provided by the Kyoto University iPS Cell Research Foundation (53, Shogoin Kawaramachi, Sakyo-ku, Kyoto City, Kyoto Prefecture, Japan). These human iPS cell lines may be used as human pluripotent stem cells.
  • human iPS cell lines provided by the Kyoto University iPS Cell Research Foundation include the Ff-I01 strain, the Ff-I14 strain, the Ff-I01s01 strain, the Ff-I14s03 strain, the Ff-I14s04 strain, the QHJI-I14s04 strain, the Ff-MH09s01 strain, and the Ff-MH15s02 strain. Of these cells, the Ff-I14 strain, the Ff-I14s04 strain, and the QHJI-I14s04 strain are preferably used. All of the above iPS cells are HLA haplotype homozygous human iPS cells. For clinical applications, it is preferable to use a clinical grade cell line. Human iPS cells may be provided from a cell bank such as the American Type Culture Collection (ATCC). Commercially available human iPS cells may also be used.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the cardiomyocyte group of this embodiment includes, among cardiomyocytes (hPSC-CM) differentiated from human pluripotent stem cells, particularly mature ventricular myocytes.
  • Cardiomyocytes refer to cells positive for at least one of sarcomeric ⁇ -actinin, cardiac troponin T (cTnT), and troponin I type 1 (TNNI1)
  • ventricular myocytes refer to cells positive for cardiac troponin T and/or myosin light chain 2v (MLC2v).
  • Cardiomyocytes are typically myocardial cells that have the ability to beat spontaneously.
  • Ventricular myocytes are a type of cardiomyocytes that can constitute ventricular muscle.
  • Myocardial progenitor cells refer to precursor cells of the cardiomyocytes that are positive for at least one of Nkx2.5, GATA4, MEF2C, and MESP1.
  • non-cardiomyocytes refers to cells that do not fall into the category of either cardiac myocytes or cardiac progenitor cells, and specific examples of such cells include smooth muscle cells and endothelial cells.
  • the cardiomyocyte population of this embodiment satisfies all of the following criteria: (1) cardiac troponin T positive cells account for 90% or more of all live cells, (2) spontaneous pulsation is 0-60 beats per minute, and (3) differentiation has commenced within 30 days.
  • the term "cell group” refers to a cell population consisting of two or more cells of the same or different types.
  • the term "cardiomyocyte group” refers to a cell group containing cardiomyocytes, and may be composed only of cardiomyocytes, or may contain cells other than cardiomyocytes (e.g., non-cardiomyocytes, etc.). At least a portion of the cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte group of this embodiment are ventricular muscle cells.
  • the cardiomyocyte group may contain, in addition to ventricular muscle cells, cardiomyocytes other than ventricular muscle cells (e.g., myocardial progenitor cells, atrial muscle cells, etc.).
  • the cardiomyocyte group of the present invention can be produced from human pluripotent stem cells by the method described below.
  • Cardiac muscle troponin T (cTnT) is a protein that constitutes myofibrils in cardiac muscle and is known as a cardiac muscle cell marker. Cardiac troponin T positive cells can be said to be cardiac muscle cells.
  • Human cardiac troponin T is a protein encoded by the TNNT2 gene (Gene ID: 7139).
  • positive cells means that the target protein or gene is expressed in an amount that can be detected by a method known in the art. Protein detection can be performed using an immunological assay using an antibody, for example, ELISA, immunostaining, or flow cytometry.
  • a reporter protein is expressed together with the protein, and the reporter protein is detected to detect the target protein.
  • Gene detection can be performed using, for example, a nucleic acid amplification method and a nucleic acid detection method such as RT-PCR, microarray, and RNAseq.
  • the expression of the target protein or gene can be determined by a general method. For example, when using flow cytometry, if the expression level of a target protein in a target cell is relatively high compared to the expression level in a control group in which expression of the protein is negative, the target cell can be determined to be positive for the target protein.
  • negative means that the expression level of the target protein or gene is below the lower limit of detection by all or any of the above-mentioned known techniques.
  • the lower limit of detection of the expression of the target protein or gene may vary depending on the technique, but can be determined by a general technique.
  • the proportion of cardiac troponin T positive cells in the cardiomyocyte group is not particularly limited as long as it is 90% or more relative to the total number of live cells in the cardiomyocyte group.
  • the proportion of cardiac troponin T positive cells in the cardiomyocyte group is preferably 90% or more relative to the total number of live cells in the cardiomyocyte group, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more or 99.5% or more.
  • the proportion of cardiac troponin T positive cells in the total number of live cells in the cardiomyocyte group may be 90 to 100%, 95 to 100%, 96 to 100%, 97 to 100%, 98 to 100%, 99 to 100%, or 99.5 to 100% relative to the total number of live cells in the cardiomyocyte group.
  • the ratio of cardiac troponin T positive cells to all live cells in a cardiomyocyte group can be determined by measuring the number of cardiac troponin T positive cells by any of the above methods, detecting the number of all live cells by a commonly used method (e.g., gating of flow cytometry, etc.), and calculating the ratio.
  • the number of cardiac troponin T positive cells can be confirmed preferably by flow cytometry analysis using an antibody against cardiac troponin T.
  • a commercially available anti-cardiac troponin T antibody for flow cytometry analysis can be used.
  • the ratio of cardiac troponin T positive cells to all live cells may be calculated by selecting live cells in a cardiomyocyte group by flow cytometry or the like, and measuring the number of cardiac troponin T positive cells in the selected live cell group.
  • a live cell group may be selected by gating, and the ratio of cardiac troponin T positive cells in the live cell group may be obtained based on the expression level of cardiac troponin T.
  • Live cells in the cardiomyocyte group can be selected, for example, by forward scattering, side scattering, or staining with a dye for determining viability (nucleic acid-binding dye, protein-binding dye, etc.).
  • the spontaneous pulsation of the cardiomyocyte group of this embodiment is 0 to 60 times/minute, preferably 0 to 50 times/minute, more preferably 0 to 45 times/minute, even more preferably 0 to 40 times/minute, and particularly preferably 0 to 35 times/minute.
  • the spontaneous pulsation of the cardiomyocyte group may be 10 to 60 times/minute, 10 to 50 times/minute, 10 to 45 times/minute, 10 to 40 times/minute, or 10 to 35 times/minute.
  • the spontaneous pulsation of the cardiomyocyte group may be 20 to 60 times/minute, 20 to 50 times/minute, 20 to 45 times/minute, 20 to 40 times/minute, or 20 to 35 times/minute.
  • the spontaneous pulsation rate (the number of spontaneous pulsations per certain time) of the cardiomyocyte group can be measured by a known method.
  • the spontaneous pulsation rate of the cardiomyocyte group may be measured by any method that can analyze the movement of cells. Examples of the measurement method include a method of acquiring an image such as a video of the cardiomyocyte group under a microscope and analyzing it using a motion vector, and a method of recording a potential pattern (spontaneous action potential) that changes with the pulsation of the cells.
  • Specific examples include a method of measuring by recording the action potential duration (APD90) or spontaneous action potential at 90% repolarization of the cardiomyocyte group using a patch clamp amplifier, a method of measuring by a multi-electrode system, calcium imaging, impedance, etc. It is preferable to measure the spontaneous pulsation rate with a number of cells suitable for the above method, but it can also be a value obtained by performing measurements multiple times and statistically processing the results.
  • a patch clamp amplifier is used to record the action potential duration at 90% repolarization (APD90) and spontaneous action potentials of a group of cardiomyocytes.
  • the composition of the intracellular solution for measuring the action potential includes potassium gluconate (130 mmol/L), KCl (10 mmol/L), NaCl (5 mmol/L), MgCl 2 (1 mmol/L), glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA: 0.1 mmol/L), magnesium-bound adenosine triphosphate (0.1 mmol/L), and (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES: 10 mmol/L).
  • the composition of the extracellular solution includes NaCl (136.5 mmol/L), KCl (5.4 mmol/L), CaCl 2 (1.8 mmol/L), MgCl 2 (0.53 mmol/L), HEPES (85.5 mmol/L), and glucose (5.5 mmol/L).
  • the cardiomyocyte population of this embodiment can be produced by (A) a step of inducing differentiation from pluripotent stem cells to cardiomyocytes, and (B) a step of removing pluripotent stem cells and non-cardiomyocytes.
  • the cardiomyocyte population of this embodiment is produced by completing the step (B) within 30 days from the start of the step (A).
  • cells cultured for about 30 days after the start of differentiation induction from human pluripotent stem cells to cardiomyocytes correspond to the fetal to neonatal stages in terms of human cardiomyocytes, and are smaller in size than human mature cardiomyocytes and have a low degree of maturity.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment has the above characteristics (1) and (2) and contains mature ventricular myocytes at a high purity, even if the culture period is within 30 days after the start of culture for differentiation induction into cardiomyocytes. Therefore, it is a cardiomyocyte group suitable for clinical application.
  • the cryopreservation period is excluded from the period "within 30 days from the start of differentiation.” In other words, the period from the start of the freezing process of the cardiomyocyte group to the completion of the thawing process of the frozen cardiomyocyte group is excluded from the period "within 30 days from the start of differentiation.”
  • the above-mentioned characteristic (2) of the cardiomyocyte group of the present embodiment represents the maturity of the cardiomyocytes, and "spontaneous pulsation of 0 to 60 times/min" indicates that the cardiomyocyte group contains many ventricular myocytes.
  • the pulsation speed increases, so the above characteristic (2) also indicates that the content of these cells is low.
  • the cardiomyocyte group of the present embodiment can also be specified by the property that the cardiomyocyte group contains many myosin light chain 2v (MLC2v)-positive cells, which are markers of ventricular myocytes.
  • the ratio of MLC2v-positive cells is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more at the time when the cardiomyocyte group of the present embodiment is transplanted into the recipient myocardial tissue.
  • cardiomyocyte groups When used in clinical applications, cardiomyocyte groups are usually cryopreserved and then thawed before use.
  • a known cell cryopreservation solution can be used to cryopreserve cardiomyocyte groups.
  • Various cell cryopreservation solutions are commercially available.
  • STEM-CELLBANKER registered trademark
  • GMP grade manufactured by Zenogen Pharma.
  • Cryopreservation can be performed by suspending cardiomyocyte groups in a cell cryopreservation solution and freezing the cell suspension.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment may be responsive to antiarrhythmic drugs.
  • antiarrhythmic drugs include adrenergic receptor agonists (such as isoproterenol), HCN channel blockers (such as ivabradine), and potassium channel blockers (such as amiodarone).
  • the cardiomyocyte group of this embodiment has all of the above characteristics (1) to (3), and therefore can be clinically applied as transplantable cardiomyocytes.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment has the characteristics (1) to (3), and therefore is a cardiomyocyte group containing highly pure cardiomyocytes, particularly mature ventricular myocytes, and as shown in the examples described below, it can regenerate damaged parts of the recipient's heart by electrically integrating with the recipient's cardiomyocytes and engrafting for a long time while maturing.
  • a transplant cell group that has a low incidence of severe ventricular arrhythmia that lasts for a long time can be obtained in the recipient.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment is induced to differentiate from human pluripotent stem cells and highly purified, it can be safely transplanted into humans, and as described below, it can be produced easily and industrially. Therefore, the cardiomyocyte group of this embodiment is a cardiomyocyte group that is highly useful as transplant cardiomyocytes.
  • the cardiomyocyte group of this embodiment can also be used for transplantation purposes as spheroidized cardiomyocyte spheres (sometimes simply referred to as "cardiomyocyte spheres" in this specification).
  • the "spheroidized cardiomyocyte spheres" of the second aspect of the present disclosure are cell masses formed by aggregation of cells contained in the cardiomyocyte group, and can be formed by the method described below.
  • the diameter of the cardiomyospheric sphere is not particularly limited as long as the cells near the center of the cardiomyospheric sphere do not undergo cell death or the cardiomyoctes near the center do not undergo significant blastogenesis compared to the cardiomyoctes in other locations, but may be 50 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • a more preferred range of the diameter of the cardiomyospheric sphere is 100 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less, and an even more preferred range is 150 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the cardiomyospheric sphere is preferably spherical, but may be any shape as long as it is an aggregate of cells and the survival rate of the cardiomyoctes in the cell aggregate is maintained. Therefore, the "diameter of the cardiomyospheric sphere" means any length from one end to the other of the cell aggregate passing through the center point. For example, if the cell aggregate is elliptical, the shortest length from one end to the other (minimum diameter) may be within the lower limit of the above range, and the longest length (maximum diameter) may be within the upper limit of the above range.
  • the above-mentioned preferred range of the diameter of the myocardial spheres does not exclude the inclusion of myocardial spheres of other sizes, and it is sufficient that 60% or more, preferably 70% or more, and more preferably 80% or more of the total number of myocardial spheres in the group of myocardial spheres have a diameter within the above range.
  • the diameter and distribution of the cardiomyospheric spheres can be measured by known methods. Examples of the measurement method include a method of measuring the diameter of the cardiomyospheric spheres from an image of the cardiomyospheric spheres using image analysis software, a method of measuring the diameter using a particle size distribution measurement device, etc.
  • the cardiomyospheric spheres of this embodiment are aggregates of cardiomyocytes according to the first aspect described above, but do not necessarily have to be composed of cells only, and may be, for example, a microcarrier-like substance (e.g., extracellular matrix particles) suitable for transplantation in vivo in which cells are aggregated around the substance.
  • the cardiomyospheric spheres of this embodiment are the active ingredient of the pharmaceutical composition described below.
  • the ratio of the cells constituting the cardiomyospheric spheres to the total cells contained in the pharmaceutical composition is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more.
  • the method for measuring the number of cells contained in the cardiomyospheric spheres may be any method that can measure this.
  • Examples of the measurement method include a method in which the relationship between the diameter of the cardiomyospheric spheres and the number of cells contained in the cardiomyospheric spheres is obtained in advance, and the relationship is calculated from the diameter of the cardiomyospheric spheres and the number of cardiomyospheric spheres contained in the pharmaceutical composition to be measured.
  • the relationship between the diameter of the cardiomyospheric spheres and the number of cells contained in the cardiomyospheric spheres can be obtained, for example, by measuring the diameters of multiple cardiomyospheric spheres, dissolving the cardiomyospheric spheres into free cardiomyospheric cells, and counting the number of cardiomyospheric cells.
  • the diameter of the cardiomyospheric spheres used to measure the number of cells in the cardiomyospheric spheres can be, for example, the maximum diameter of the cardiomyospheric spheres.
  • the cardiomyospheroids of this embodiment may be produced from the cardiomyospheroids according to the first aspect, and the cardiomyospheroids themselves do not need to be produced within 30 days after the start of differentiation. It is sufficient that the production of the cardiomyospheroids according to the first aspect for producing cardiomyospheroids is completed within 30 days after the start of differentiation.
  • the inventors have found that when the cardiomyocytes of the present embodiment are formed, the survival rate of the cardiomyocytes constituting the cardiomyocytes is maintained at a high level. Therefore, by forming a group of cardiomyocytes into cardiomyocytes and recovering the cardiomyocytes, a group of cardiomyocytes with a high ratio of live cells can be obtained.
  • the cardiomyocytes (group of cardiomyocytes) produced from the group of cardiomyocytes according to the first aspect contain mature cardiomyocytes with a high purity and a high ratio of live cells, so that when transplanted into a recipient, they are easily engrafted into the recipient's myocardial tissue and have a low incidence of severe ventricular arrhythmias that continue for a certain period of time or more. Therefore, they are suitable for clinical applications.
  • the third aspect of the present disclosure is a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of the cardiomyocyte group according to the first aspect and the cardiomyospheroids according to the second aspect, and a pharma- ceutical composition comprising a pharma- ceutical carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment contains at least one selected from the group consisting of the cardiomyocyte group and the cardiomyospheroids of the cardiomyocyte group as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment preferably has a live cell ratio of 60% or more, more preferably 70% or more, in the total cells contained in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is stored or transported as a pharmaceutical composition, it is preferable to maintain the above live cell ratio throughout the storage period and/or transport time, and further it is preferable to maintain the above live cell ratio until just before the composition is actually administered to the recipient.
  • the number of live cells can be measured by a known method. For example, live cells and dead cells may be distinguished by trypan blue staining, the number of live cells and the number of dead cells may be counted, and the live cell ratio may be calculated from the ratio of the number of live cells to the total number of cells.
  • the cardiomyospheric cells contained in the pharmaceutical composition of this embodiment preferably constitute 60% or more of the total cells contained in the pharmaceutical composition, more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more.
  • the ratio of cells constituting the cardiomyospheric cells is preferably maintained throughout the storage period and/or transport time, and further preferably until immediately before administration to a recipient.
  • the cardiomyocyte population and cardiomyospheroids are cardiomyocyte population according to the first aspect and cardiomyospheroids according to the second aspect.
  • compositions of this embodiment refers to a carrier that does not inhibit the physiological activity of an active ingredient and does not show substantial toxicity to the subject of administration.
  • “Not substantially toxic” refers to a carrier that does not show toxicity to the subject of administration at a dose that is normally used.
  • the pharma- ceutical acceptable carrier is a carrier that does not damage the cardiomyocyte group according to the first aspect and does not show substantial toxicity to the subject of administration.
  • the pharma- ceutical acceptable carrier includes any known pharma- ceutical acceptable ingredient that is typically considered to be an inactive ingredient.
  • the pharma- ceutical acceptable carrier is not particularly limited, but examples thereof include solvents, diluents, vehicles, excipients, flow enhancers, binders, granulating agents, dispersing agents, suspending agents, wetting agents, lubricants, disintegrating agents, solubilizing agents, stabilizers, emulsifiers, fillers, and the like.
  • the pharma- ceutical acceptable carrier may be used alone or in combination of two or more kinds.
  • the pharma- ceutically acceptable carrier may be a buffer solution, such as saline, or a common buffering agent (e.g., phosphate, citric acid, and other organic acids).
  • a buffer solution such as saline
  • a common buffering agent e.g., phosphate, citric acid, and other organic acids.
  • the pharmaceutical composition may contain other ingredients in addition to the above ingredients.
  • the other ingredients are not particularly limited, and any ingredient commonly used in the pharmaceutical field may be used without any particular restriction.
  • examples of the other ingredients include pharmaceutical additives other than those mentioned above.
  • pharmaceutical additives include, but are not limited to, preservatives (e.g., antioxidants), chelating agents, flavoring agents, sweeteners, thickeners, buffers, colorants, etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be a dosage form generally used as a pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is usually a parenteral preparation, and may be in a dosage form suitable for the specific example of the administration method shown below, such as an injection, a myocardial sheet, etc.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be optionally frozen for storage and transportation. When the pharmaceutical composition of this embodiment is frozen, the cells may be thawed before use, and further diluted with a sterile carrier corresponding to the target cell type before use.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is sealed, for example, in a vial for administration to a patient, but may also be sealed, for example, in a syringe, depending on the administration method.
  • an immunosuppressant that is generally used itself may be administered to the patient who has received the administration.
  • the immunosuppressant may be appropriately selected according to the patient, and may be, for example, a drug that acts on immunophilin (cyclosporine, tacrolimus hydrate, etc.).
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be combined with these immunosuppressants.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of this embodiment is usually preferably parenteral administration.
  • the administration route for parenteral administration may be any method known per se for administering cells to a patient, for example, as long as it is a method that can administer cells to the patient's heart in a minimally invasive manner. Specifically, as a local administration to the heart (particularly the ventricle and myocardial tissue), administration to the ventricular myocardial tissue from the epicardial side using a transplant needle or the like, or administration from the endocardial side or pericardial cavity using a catheter or the like is preferred.
  • the pharmaceutical composition can be administered in a therapeutically effective amount of the cardiomyocyte group according to the first aspect and/or the cardiomyocyte sphere according to the second aspect.
  • therapeutically effective amount means an amount of a drug effective for treating or preventing a target disease.
  • the therapeutically effective amount of the cardiomyocyte group and/or the cardiomyocyte sphere can be an amount effective for cardiac repair of a recipient.
  • the therapeutically effective amount may be appropriately determined depending on the symptoms, weight, age, and sex of a patient, the dosage form of the pharmaceutical composition, and the administration method.
  • the pharmaceutical composition can be administered in a single dose of the cardiomyocyte group and/or the cardiomyocyte sphere, with the number of cardiomyocytes being 10 5 to 10 10 , preferably 10 7 to 10 9 .
  • the pharmaceutical composition may be administered once or multiple times. For example, after administering the pharmaceutical composition to a patient, the patient's cardiac function and the engraftment of transplanted cardiomyocytes may be monitored, and the pharmaceutical composition may be administered again if necessary.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition of this embodiment is a human.
  • the pharmaceutical composition can be used to treat heart diseases such as heart failure.
  • Heart failure is a disease in which the function of the heart is reduced. Examples of causes of heart failure include myocardial infarction, angina pectoris, hypertension, valvular disease, cardiomyopathy, arrhythmia, congenital disease, etc.
  • the heart failure to be treated may be caused by any of these causes.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be suitably applied to the treatment of heart failure caused by damage to myocardial tissue due to the above-mentioned causes.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment By administering the pharmaceutical composition of this embodiment (transplantation of cardiomyocyte groups and/or cardiomyospheric cells) to a subject suffering from heart failure, the damaged myocardial tissue can be regenerated and the function of the heart can be improved.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment has the following functions: (1) the transplanted contractile cardiomyocytes are engrafted on the damaged myocardium, directly enhancing the contractile force of the damaged site of the recipient heart, and/or (2) the function of releasing paracrine factors having angiogenic, cardioprotective, anti-inflammatory, anti-fibrotic effects, etc.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for producing a cardiomyocyte group.
  • the method for producing a cardiomyocyte group of this aspect comprises the following steps (a) to (c) in this order: (a) expanding human pluripotent stem cells; (b) culturing the expanded human pluripotent stem cells under conditions for differentiating them into cardiomyocytes, to produce a cell population containing cardiomyocytes at a sufficient ratio, specifically 60% or more, to result in 90% or more cTnT positive cells after step (c); and (c) removing the human pluripotent stem cells and non-cardiomyocytes from the cell population.
  • ⁇ Step (a)> The expansion culture of human pluripotent stem cells can be carried out by known methods. For example, the methods described in Thomson et al., Science (1998) 282 (5391): 1145-7, Hovatta et al., EE, Ludwig et al., Nat Methods (2006) 3: 637-46, Kennedy et al., Blood (2007) 109: 2679-87 et al., Nat Methods (2011) 8: 424-9, Wang et al., Stem Cell Res. (2013) 11 (3): 1103-16, and International Publication No. 2018/181342 can be used.
  • the medium may be prepared using a medium that is typically used for culturing mammalian cells as the basal medium.
  • basal media include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, and Fischer's medium, as well as mixtures thereof.
  • a commercially available basal medium for stem cell culture may be used.
  • basal media include StemFit AS103C medium (Ajinomoto Co., Inc.), StemFit (registered trademark) AK medium (e.g., StemFit AK03N, StemFit AK02N) (Ajinomoto Co., Inc.), Essential 8 medium (Life Technologies, Inc.), mTeSR1 medium (STEMCELL Technologies, Inc.), and TeSR2 medium (STEMCELL Technologies, Inc.).
  • hESF-GRO medium StemCells, Inc.
  • TeSRTM-E6 STEMCELL Technologies
  • hESF-GRO medium Nipro Corporation
  • HESF-DIF medium Nipro Corporation
  • CSTI-7 Cell Science Institute Co., Ltd.
  • Essential 6 medium Life Technologies
  • the medium is preferably a chemically defined medium (CDM) whose components are chemically defined, and more preferably a serum-free medium.
  • CDM chemically defined medium
  • serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned serum or unpurified serum.
  • Media containing purified blood-derived components and/or purified animal tissue-derived components (e.g., growth factors such as bFGF) are also included in serum-free media.
  • the serum-free medium may contain a serum substitute.
  • serum substitutes include serum albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, and 3'-thiol glycerol.
  • Commercially available serum substitutes may be used. Examples of commercially available serum substitutes include, but are not limited to, Knockout TM Serum Replacement (Life Technologies), Chemically-defined Lipid Concentrated (Life Technologies), GlutamaxTM (Life Technologies), B27 (Life Technologies), and N2 (Life Technologies).
  • the medium may contain some or all of the essential amino acids other than L-tryptophan (L-leucine, L-lysine, L-phenylalanine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-methionine, and L-valine).
  • L-leucine, L-lysine, L-phenylalanine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-methionine, and L-valine L-leucine, L-lysine, L-phenylalanine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-methionine, and L-valine.
  • the medium may contain some or all of the non-essential amino acids (L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-cysteine, L-serine, L-tyrosine, L-proline).
  • non-essential amino acids L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-cysteine, L-serine, L-tyrosine, L-proline).
  • the medium may also contain natural amino acids such as L-cystine.
  • the medium may further contain medium additives.
  • medium additives include, but are not limited to, ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) inhibitors such as Y-27632, antibiotics such as penicillin-streptomycin, vitamins, L-ascorbic acid, L-magnesium ascorbyl phosphate, sodium pyruvate, 2-aminoethanol, glucose, sodium bicarbonate, HEPES, insulin, progesterone, sodium selenate, putrescine, etc. It is preferable that the additives are contained within a concentration range known per se.
  • the medium may contain fatty acids.
  • fatty acids include, but are not limited to, oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, butyric acid, acetic acid, palmitoleic acid, valeric acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, margaric acid, cusenic acid, eleostearic acid, arachidic acid, 8,11-eicosadienoic acid, 5,8,11-eicosatrienoic acid, behenic acid, lignoceric acid, nervonic acid, cerotic acid, montanic acid, and melissic acid.
  • the medium may be a basal medium containing L-ascorbic acid, selenium, transferrin, insulin, FGF2, and TGF ⁇ 1, to which L-tryptophan or an L-tryptophan derivative has been added.
  • the pH of the medium is preferably about 6.0 to about 8.5, and more preferably about 7.0 to about 7.5.
  • the medium is preferably sterilized by filtration sterilization using a membrane filter or the like.
  • Human pluripotent stem cells can be cultured by known methods. Human pluripotent stem cells may be cultured using feeder cells such as fibroblasts, or may be cultured in a feeder cell-free environment.
  • the incubator used for cell culture is not particularly limited as long as it is capable of culturing cells, but examples include flasks, flasks for tissue culture, dishes, Petri dishes, dishes for tissue culture, multi-dishes, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the culture vessel used for culturing cells may be cell-adhesive or cell-non-adhesive.
  • the cell-adhesive culture vessel may be coated with any cell-supporting substrate or an artificial substance that mimics the function thereof, such as Matrigel (Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261,2011), gelatin, collagen, elastin, or other fibrous protein; hyaluronic acid, chondroitin sulfate, or other glycosaminoglycan; proteoglycan; fibronectin; vitronectin; laminin, for the purpose of improving adhesion of the surface of the culture vessel to cells.
  • the culture is preferably performed by adhesion culture using a culture vessel coated with the above-mentioned cell support substrate.
  • the culture temperature is about 30 to 40° C., preferably about 37° C.
  • the CO2 concentration is about 1 to 10%, preferably about 2 to 5%.
  • the oxygen concentration is usually 1 to 40%, but is appropriately selected depending on the culture conditions, etc.
  • the method of inducing differentiation from human pluripotent stem cells to cardiomyocytes may be any method that can obtain the cardiomyocyte group of this embodiment.
  • the differentiation induction method for example, (i) a method of activating Wnt/catenin signaling in human pluripotent stem cells to obtain a first cell population (culture in a first differentiation medium), (ii) a method of inhibiting Wnt/ ⁇ -catenin signaling in the first cell population to obtain a second cell population containing cardiomyocyte precursor cells (culture in a second differentiation medium), etc. are used.
  • the cardiomyocyte precursor cells can be further cultured for 1 to 5 days in a medium such as RPMI medium, DMEM medium, or StemPro-34 to obtain a cardiomyocyte group containing mature ventricular muscle cells.
  • a medium such as RPMI medium, DMEM medium, or StemPro-34 to obtain a cardiomyocyte group containing mature ventricular muscle cells.
  • the activation of the Wnt/catenin signal is carried out by contacting the human pluripotent stem cells with a Wnt signal agonist, activin A, BMP4, bFGF, or the like.
  • the Wnt signal agonist may be an inhibitor of glycogen synthase kinase-3 ⁇ (GSK-3 ⁇ ), or the like.
  • the inhibitor of GSK-3 ⁇ may be at least one selected from the group consisting of low molecular weight chemical compounds, such as CHIR-99021, TWS119, SB216763, SB415286, and CHIR-98014. These compounds and their concentrations may be selected as concentrations at which cardiomyocytes having the characteristics of the cardiomyocyte group of this embodiment are cultured.
  • the expanded human pluripotent stem cells are cultured for 1 to 6 days in the first differentiation medium.
  • the first differentiation medium may be replaced with a second differentiation medium.
  • the second differentiation medium contains a Wnt signal antagonist, VEGF, and the like.
  • the Wnt signal antagonist may be any one that generates the cardiomyocyte group of this embodiment, and examples thereof include IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWR-1, PNU-74654, XAV939, KY02111, and the like.
  • the type and concentration of these agents can be selected as concentrations at which cardiomyocytes having the characteristics of the cardiomyocyte group of this embodiment are cultured.
  • the cells are cultured in the second differentiation medium for 1 to 7 days.
  • the culture periods in the above steps (i) and (ii) are adjusted to be within 30 days, including a further 1 to 5 day culture period in a medium such as RPMI medium, DMEM medium, or StemPro-34 medium, etc., to obtain a group of cardiomyocytes including mature ventricular myocytes, and a culture period in the step (c) described below.
  • the culture vessels, culture conditions, etc. used in this step can be the same as those described in the expansion culture step of human pluripotent stem cells.
  • the differentiation induction into cardiomyocytes in this embodiment is preferably performed by the method described in Toyama S. et al., Stem Cell Reports. 2017; 9: 1406-1414.
  • a four-layer culture plate commercially available from Thermo Tifer Scientific or the like is preferably used as the culture vessel, and StemFit AS301 medium or StemFit AS501 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) is preferably used as the culture medium.
  • the proportion of cardiomyocytes in the cell population obtained by this step may be a proportion sufficient to ensure that the proportion of cTnT positive cells is 90% or more after step (c). Specifically, when purifying the cells by culturing for about 4 days in step (c) described below, it is preferable that the proportion of cardiomyocytes is 60% or more at the end of step (b). If the purification of cardiomyocytes is carried out over a longer period in step (c), the proportion may be lower.
  • the proportion of cardiomyocytes can be calculated, for example, by measuring the proportion of cells positive for a cardiomyocyte marker such as cardiac troponin T by flow cytometry analysis.
  • Step (c)> The method for removing human pluripotent stem cells and non-cardiomyocytes from the cell group after step (b) can be performed by a known method.
  • a known method for example, the methods described in International Publication No. 2018/074457, Tanosaki S. et al., iScience. 2020;23:101535, and Tanosaki S. et al., STAR Protoc. 2022;3:101360, Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74, and Tohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37, etc. can be used.
  • one example of such a method is to induce cell death in the remaining undifferentiated cells and non-cardiomyocytes by culturing the cell population obtained in step (b) in a medium containing at least one inhibitor selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor.
  • fatty acid synthesis inhibitor one that inhibits fatty acid synthesis by targeting at least one factor selected from the group consisting of ATP citrate lyase, fatty acid synthase, acetyl-CoA carboxylase, and malonyl-CoA decarboxylase is preferred, and one that inhibits fatty acid synthesis by targeting at least one factor selected from the group consisting of ATP citrate lyase and fatty acid synthase is preferred.
  • fatty acid synthesis inhibitors that target fatty acid synthase and inhibit fatty acid synthesis include orlistat, C75, flavonoids, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), etc., with orlistat and C75 being preferred, and orlistat being more preferred.
  • Examples of fatty acid synthesis inhibitors that inhibit fatty acid synthesis by targeting ATP citrate lyase include LY294002 and SB204990.
  • Examples of fatty acid synthesis inhibitors that target acetyl-CoA carboxylase and inhibit fatty acid synthesis include soraphen A, TOFA, A769662, metformin, AICAR, etc., with TOFA and A769662 being preferred.
  • fatty acid utilization inhibitor one that targets carnitine palmitoyltransferase 1 and inhibits fatty acid utilization is preferred.
  • fatty acid decomposition inhibitors that target carnitine palmitoyltransferase 1 and inhibit fatty acid decomposition include etomoxir, perhexiline, ranolazine, etc., with etomoxir and perhexiline being preferred.
  • the cholesterol synthesis inhibitor is preferably one which inhibits cholesterol synthesis by targeting at least one factor selected from the group consisting of acetyl-CoA acetyltransferase, HMG-CoA synthase, and HMG-CoA reductase, and more preferably one which inhibits cholesterol synthesis by targeting HMG-CoA reductase.
  • Examples of cholesterol synthesis inhibitors which inhibit cholesterol synthesis by targeting HMG-CoA reductase include pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, cerivastatin, lovastatin, mevastatin and the like, with pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pitavastatin, and rosuvastatin being preferred, and simvastatin being more preferred.
  • orlistat it is preferable to use one or more selected from the group consisting of orlistat, C75, LY294002, SB204990, etomoxir, perhexiline, and simvastatin, and salts thereof, and it is more preferable to use orlistat.
  • the concentrations of the fatty acid synthesis inhibitor, fatty acid utilization inhibitor, and cholesterol synthesis inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the inhibitor.
  • the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor or fatty acid utilization inhibitor is 0.1 to 500 ⁇ M.
  • the concentration of the cholesterol synthesis inhibitor may be 0.01 to 50 ⁇ M.
  • the medium used in this step can be prepared by adding at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor to the above-mentioned basal medium.
  • the medium may contain at least one compound selected from the group consisting of glucose, glutamine, and methionine. By including glucose, glutamine, and/or methionine, it is expected that cell growth will be improved.
  • the cell culture in step (c) can be carried out under conditions generally used for cell culture.
  • the culture temperature can be about 30 to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO2 concentration can be about 1 to 10%, preferably about 2 to 5%.
  • the oxygen concentration is usually 1 to 40%, but is appropriately selected depending on the culture conditions, etc.
  • the culture time is not particularly limited, but is preferably 24 hours or more, more preferably 48 hours or more, and a specific example is 1 to 5 days. If necessary, the cells may be subcultured.
  • human pluripotent stem cells and non-cardiomyocytes can be removed from the cell population obtained in step (b).
  • the cells can be further cultured using a medium that does not contain glucose, glutamine, and glutamic acid in the composition of a medium used in normal cell culture, but contains lactic acid, thereby selectively proliferating cardiomyocytes and inducing cell death in non-cardiomyocytes. By culturing in such a medium, cardiomyocytes can be further highly purified.
  • the feature "(3) within 30 days from the start of differentiation” means that the period from the start of culture in a cardiomyocyte differentiation-inducing medium (a medium containing a substance that induces differentiation into cardiomyocytes; for example, the first differentiation medium) in the above step (b) to the end of step (c) is within 30 days.
  • a cardiomyocyte differentiation-inducing medium a medium containing a substance that induces differentiation into cardiomyocytes; for example, the first differentiation medium
  • the manufacturing method of this embodiment may include, after the above steps (a) to (c), a step (selection step) of selecting a group of cardiomyocytes having the above characteristics (1), (2), and (3).
  • the selection step can be performed by the method described in the above section (Group of cardiomyocytes). Specifically, for example, it can be carried out as follows. Among the cell groups obtained in step (c), a cell group that has been differentiated within 30 days since the start of differentiation (start of step (b)) is selected (d1). Next, a cardiomyocyte group in which cardiac troponin T positive cells account for 90% or more of all living cells is selected.
  • a flow cytometry analysis of the cell group obtained in step (c) is performed using an antibody against cardiac troponin T, and a cell group in which the ratio of troponin T positive cells to all living cells is 90% or more is selected (d2).
  • a cardiomyocyte group with a spontaneous pulsation of 0 to 60 times/min is selected.
  • a patch clamp amplifier is used to record the action potential duration (APD90) and spontaneous action potential at 90% repolarization of the cardiomyocyte group, and a cell group with a spontaneous pulsation rate of 0 to 60 times/min is selected (d3).
  • the order of the steps (d1) to (d3) is not limited to the above-mentioned order, and the order may be changed arbitrarily.
  • the manufacturing method of this embodiment may include a step of freezing the cardiomyocyte population after the above steps (a) to (c), and optionally after the selection step.
  • the cardiomyocyte group obtained by the above-mentioned method is preferably removed from the culture plate by a method known per se, washed as necessary, and then suspended in a cell cryopreservation solution that is usually used for cryopreservation of cells.
  • a cell cryopreservation solution is STEM-CELLBANKER (registered trademark) GMP grade (Zenogen Pharma).
  • the concentration of the cardiomyocyte group in the cell suspension to be cryopreserved may be any concentration at which cell death does not occur due to freezing and thawing, specifically, any concentration at which the viable cell rate after freezing and thawing is 50% or more of the viable cell rate before freezing.
  • the concentration of the cardiomyocyte group in the cell suspension is, specifically, for example, 1 x 10 5 to 1 x 10 8 cells/mL, preferably 1 x 10 6 to 1 x 10 7 cells/mL.
  • a container for freezing a vial or bag used for freezing cells, etc. can be used. Freezing and cryopreservation can be performed by known methods.
  • a method is used in which the cardiomyocyte group is frozen in a freezer at -60°C to -80°C, and then transferred to a container filled with liquid nitrogen or a deep freezer at -150°C or less for long-term storage. It is also preferable to freeze the cells while controlling the temperature using a programmable freezer, for example, by cooling to -40 to 60°C at a rate of 1 to 10°C/min, waiting at -40 to -60°C for 10 to 1 hour, cooling to -80°C at a rate of 1 to 10°C/min, and cooling at -80°C for several days.
  • the frozen cardiomyocytes can be thawed by a known method. For example, the frozen cells can be removed from a liquid nitrogen storage container or a deep freezer, and thawed in a water bath at 37°C.
  • a fifth aspect of the present disclosure is a method for producing cardiomyocytes.
  • the method of the fifth aspect includes a step of statically culturing the cardiomyocytes according to the first aspect in a culture medium in a culture vessel having a microwell on the bottom surface.
  • the cardiomyocytes according to the second aspect can be produced by the production method according to the fifth aspect.
  • cardiomyospheres can be carried out by suspending the cardiomyosocyte group according to the first embodiment in a medium and statically culturing them in a culture vessel having a microwell on the bottom surface.
  • the cardiomyosocyte group according to the first embodiment used here does not form spheroids.
  • a cardiomyosocyte group produced by the production method according to the fourth embodiment can be used as the cardiomyosocyte group according to the first embodiment.
  • the medium may be the basal medium described above. It is preferable to use a serum-free medium. It is preferable that the medium contains at least one selected from the group consisting of insulin (0.1 to 10 mg/L), transferrin (0.1 to 10 ⁇ g/L), selenium (0.1 to 10 ⁇ g/L), basic fibroblast growth factor (bFGF; 1 ng/ml to 100 ng/ml), epidermal growth factor (1 ng/ml to 1000 ng/ml), platelet-derived growth factor (1 ng/ml to 1000 ng/ml), and endothelin-1 (ET-1) (1 ⁇ 10 ⁇ 8 to 1 ⁇ 10 ⁇ 6 M).
  • insulin 0.1 to 10 mg/L
  • transferrin 0.1 to 10 ⁇ g/L
  • selenium 0.1 to 10 ⁇ g/L
  • basic fibroblast growth factor bFGF; 1 ng/ml to 100 ng/ml
  • epidermal growth factor (1 ng/ml to 1000 ng/ml
  • Culture vessels having microwells on the bottom surface may be commercially available as spheroid-forming culture vessels. Microwells are wells with openings on the order of micrometers (e.g., 100 to 1000 ⁇ m, preferably 100 to 800 ⁇ m, more preferably 200 to 500 ⁇ m, and even more preferably 300 to 500 ⁇ m). Culture vessels with low adhesive culture surfaces are preferred. Culture vessels coated with a biological material adhesion inhibitor such as Prevelex (registered trademark) (manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd.) may be used. A specific example of a culture vessel is a 6-well plate coated with Prevelex (Elplasia RB 500 400 NA 6, manufactured by Corning).
  • Prevelex registered trademark
  • cardiomyospheroids may be performed by referring to methods described in known literature (e.g., International Publication No. 2009/017524; Kawaguchi S. et al., JACC Basic Transl Sci. 2021;6:239-254; Tabei R. et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2019;38:203-214).
  • a sixth aspect of the present disclosure is a method for treating heart failure, comprising administering at least one selected from the group consisting of the cardiomyocytes according to the first aspect and the cardiomyosphers according to the second aspect to a subject in need of treatment for heart failure.
  • the administered cardiomyocyte population and/or cardiomyospheroids may be in the form of a pharmaceutical composition according to the third aspect.
  • the cardiomyocyte group and/or cardiomyospheroids can be administered to a subject, for example, by injecting them directly into the myocardial tissue.
  • Any instrument can be used for administration as long as it can inject the cardiomyocyte group and/or cardiomyospheroids into the transplant target tissue, and for example, the instruments described in International Publication No. 2020-013125 can be used.
  • An injection needle with a gauge of 24 to 30 can be used.
  • a catheter or the like can also be used.
  • the cardiomyocyte group and/or cardiomyospheroids can be administered in a "therapeutically effective amount" to a patient in need of treatment for heart failure.
  • the therapeutically effective amount may be determined appropriately, for example, depending on the degree of damage to the myocardial tissue in the patient.
  • the amount of cardiomyocyte group and/or cardiomyospheroids administered at one time may be 10 5 to 10 10 cardiomyocytes, preferably 10 7 to 10 9 cardiomyocytes.
  • the amount of cells administered is counted as the number of cardiomyocytes that have become cardiomyospheroids.
  • the subject of the treatment method of this embodiment is a human.
  • Heart failure is a disease that presents a state of impaired cardiac function. Examples of causes of heart failure include myocardial infarction, angina pectoris, hypertension, valvular disease, cardiomyopathy, arrhythmia, congenital disease, etc.
  • the subject of heart failure may be caused by any of these.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be suitably applied to the treatment of heart failure caused by damage to myocardial tissue due to the above-mentioned causes. By administering the pharmaceutical composition of this embodiment (transplantation of cardiomyocytes and/or cardiomyospheric cells) to a subject suffering from heart failure, the damaged myocardial tissue can be regenerated and the cardiac function can be improved.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment has the following functions: (1) transplanted contractile cardiomyocytes take root in the damaged myocardium, directly enhancing the contractile force of the damaged site of the recipient heart, and/or (2) release paracrine factors that have angiogenic, cardioprotective, anti-inflammatory, anti-fibrotic effects, etc.
  • Another aspect of the present disclosure is the use of at least one selected from the group consisting of cardiomyocytes according to the first aspect and cardiomyosphers according to the second aspect in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of heart failure.
  • Another aspect of the present disclosure is at least one selected from the group consisting of the cardiomyocytes according to the first aspect and the cardiomyospheres according to the second aspect for use in treating heart failure.
  • Another aspect of the present disclosure is the use of at least one selected from the group consisting of cardiomyocytes according to the first aspect and cardiospheres according to the second aspect in the treatment of heart failure.
  • Example 1 Production and analysis of human iPS cell-derived cardiomyocytes (1) Preparation of purified human iPSC-derived cardiomyocytes Human iPS cells (FfI14s04 line) (provided by the Kyoto University Foundation for iPS Cell Research) were maintained on an iMatrix511 (Nippi Corporation) coated culture plate using StemFit AS103C media (Ajinomoto Co., Inc.). Differentiation into cardiomyocytes was performed on a four-layer culture plate (Thermo Fisher Scientific) using StemFit AS301 medium (Ajinomoto Co., Inc.) as described in Tohyama S. et al., Stem Cell Reports. 2017;9:1406-1414.
  • the remaining human iPS cells in the cell group obtained after differentiation induction were removed using orlistat, a fatty acid synthesis inhibitor, according to the method described in Tanosaki S. et al., iScience. 2020;23:101535, and Tanosaki S. et al., STAR Protoc. 2022;3:101360.
  • cardiomyocytes were purified using StemFit AS501 (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) according to the method described in Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74., and Tohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37.
  • the purified cardiomyocyte group was cryopreserved using STEM-CELLBANKER (registered trademark) GMP grade (manufactured by Zenogen Pharma).
  • the culture for differentiation induction was carried out for 7 to 15 days, while the culture for removal of remaining human iPS cells was carried out for 5 to 10 days.
  • the cardiac troponin T (cTnT) positivity rate of the cardiomyocyte group prepared in (1) after thawing was 99.8% ( Figure 1A(b)).
  • the cardiac troponin T (cTnT) positivity rate of the cell group before the above purification was 81.0% (FIG. 1A(a)).
  • the thawed cardiomyocyte group was electrophysiologically analyzed by the patch clamp method according to the method described in Ichimura H. et al., Sci Rep. 2020;10:11883. Specifically, the human iPS cell-derived cardiomyocyte group cryopreserved in (1) was thawed, and the thawed cardiomyocyte group was cultured for 4 days. To examine the spontaneous beating rate, the action potential duration at 90% repolarization (APD90) and spontaneous action potential were recorded using a patch clamp amplifier (Axopatch 200B, Molecular Devices).
  • Action potentials were measured using intracellular solution (potassium gluconate (130 mmol/L), KCl (10 mmol/L), NaCl (5 mmol/L), MgCl2 (1 mmol/L), EGTA (0.1 mmol/L), magnesium-bound adenosine triphosphate (0.1 mmol/L), and 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (10 mmol/L)) and extracellular solution (NaCl (136.5 mmol/L), KCl (5.4 mmol/L), CaCl2 (1.8 mmol/L), MgCl2 (0.53 mmol/L), HEPES (85.5 mmol/L), and glucose (5.5 mmol/L).
  • FIGS. 1B and 1C The results of 65 analyses (for 65 cells) are shown in Figures 1B and 1C.
  • the cells contained in the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared in (1) showed a ventricular-like action potential pattern after freezing and thawing.
  • Beat rate the spontaneous beat rate was 34 ⁇ 13 beats/min.
  • MDP maximum diastolic potential
  • the action potential duration at 90% repolarization (APD90) was 465 ⁇ 25 ms.
  • the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared and cryopreserved in (1) was thawed and cultured for about one week in MEM ⁇ (Thermo Fisher, cat. 4061029) containing 2.5% FBS (MERC) and sodium pyruvate (MERCK, cat. S8636). After completion of the culture, the cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour in HBSS (Thermo Fisher, cat. 14025092) containing probenecid (AAT Bioquest, cat. 20062) and 5 mM Cal520AA (AAT Bioquest, cat. 21131) using a culture vessel coated with Pluronic (registered trademark) F-127 (AAT Bioquest, cat. 20053).
  • the adrenergic receptor agonist isoproterenol (MERCK, cat. I6504) was added to the culture medium containing the cultured cell groups at 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, or 1 ⁇ M, and calcium transients were measured using FDSS/ ⁇ CELL (Hamamatsu Photonics).
  • the HCN channel blocker ivabradine (MERCK, cat. SML02c81) was added to the culture medium containing the cultured cell groups at 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, or 1 ⁇ M, and calcium transients were measured in the same manner.
  • amiodarone (MERCK, cat A8423), a potassium channel blocker, was added to the medium containing the cultured cell groups at concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, or 10 ⁇ M, and calcium transients were measured in the same manner.
  • the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared and frozen in (1) was thawed according to the method described in Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74 and Tohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37.
  • the thawed cardiomyocyte group was immunostained using anti-actinin antibody, anti-vimentin antibody, and anti-DAPI antibody by a commonly used method. The results are shown in FIG. 1F(a). Most of the cells contained in the human iPS cell-derived cardiomyocyte group prepared in (1) were actinin positive and vimentin negative.
  • Example 2 Preparation and analysis of cardiomyospheric cells (1) Preparation of cardiomyocytes from human iPS cell-derived cardiomyocytes The human iPS cell-derived cardiomyocytes cryopreserved in Example 1 (1) were suspended in StemFit AS301 medium and seeded on a 6-well plate (Elplasia RB 500 400 NA 6, Corning) coated with Prevelex (registered trademark) (manufactured by Nissan Chemical Co., Ltd.) in the same manner as described in Kawaguchi S. et al., JACC Basic Transl Sci. 2021;6:239-254, or Tabei R. et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation.
  • Prevelex registered trademark
  • the size of the cardiomyospheric spheres contained in the obtained cardiomyospheric spheres was measured using a particle size distribution analyzer (manufactured by Beckman Coulter). As a result, the diameter of the cardiomyospheric spheres contained in the cardiomyospheric spheres was about 150 ⁇ m on average.
  • a part of the cardiomyospheric spheres was treated in a 3:1 solution of trypsin/EDTA and Accumax at 37°C for 10 to 15 minutes immediately after harvesting from the culture plate and 4 hours after harvesting from the culture plate, thereby decomposing the cardiomyospheric spheres into single cells and staining with trypan blue.
  • FIG. 2A The survival rate of cells contained in each cardiomyospheric cell by this analysis is shown in FIG. 2A.
  • "253G4" shows the result of preparing cardiomyospheric cells by the method described in this Example from a group of cardiomyospheric cells differentiated, purified, and frozen from 253G4 (provided by Kyoto University), a human iPS cell line for research, by the method described in Example 1 (1).
  • the number of cardiomyospheric cells with a diameter of 50 ⁇ m or more under a certain field of view of the solution containing the collected cardiomyospheric cells was counted, and the number of cardiomyospheric cells constituting the cardiomyospheric cell line (number of cardiomyospheric cells) was calculated.
  • the ratio of the number of cardiosphere cells to the total number of cells was calculated by the following formula and was found to be 74-86%.
  • Percentage of cardiomyocyte count (%) (number of cardiomyocytes)/[(number of cardiomyocytes)+(number of non-cardiomyocytes)] ⁇ 100
  • OCT compound Tissue-Tek OCT Compound, Sakura Corporation
  • FIG. 2C Sections were immunohistochemically analyzed using anti-DAPI antibody, primary antibody against human specific cardiac troponin I (cTnI, ab52862; Abcam), and biotin-conjugated secondary antibody (Vector Laboratories). These results are shown in FIG. 2C. As shown in A, D, and G of FIG. 2C, CytoRed solution and the like were observed to permeate through the center of the cardiomyocytes from the external culture medium, indicating that the cardiomyocytes in the cardiomyocytes can receive nutrients directly from the external culture medium. In addition, as shown in B, E, and H of FIG. 2C, the cardiomyocytes maintained the purity of cardiomyocytes even after 12 weeks of culture.
  • the transplanted mice were anesthetized 7, 14, and 28 days after transplantation, and Akalumine n-Hydrochloride (Fujifilm Corporation, 20 nmol/g body weight) was administered intraperitoneally. 10 minutes after administration, images were taken using an imaging system (NEWTON7.0 FT500, Vilber) at 20 cm x 20 cm and exposure time of 1 minute, and images were analyzed using Kuant software. These results are shown in Figures 2D and 2E. As is clear from Figures 2D and 2E, it was confirmed that the transplanted cardiomyospheric spheres survived more effectively in the animal's heart than the transplanted cardiomyocytes.
  • Example 3 Cardiosphere transplantation into cynomolgus monkeys (1) Induction of cardiac ischemia-reperfusion injury in cynomolgus monkeys Based on Japanese domestic regulations and guidelines, all experimental procedures were reviewed by the Animal Experiment Committee and finally approved by the President of Shinshu University (No. 300023), Keio University (No. A2022-180), and Ina Research (No. 18088). Two weeks before cardiac sphere transplantation, myocardial infarction was induced in a total of 10 cynomolgus monkeys (also known as macaca fascicularis), four males and six females, by the following method. Surgery was performed as described in Ichimura H. et al., Sci Rep.
  • cynomolgus monkeys were anesthetized with intramuscular injection of ketamine and xylazine, intubated with a tracheal tube (diameter 3.5 mm), and artificially ventilated with 2% isoflurane.
  • Buprenorphine was routinely administered subcutaneously to reduce postoperative pain. Blood pressure, oxygen saturation, and electrocardiogram (ECG) were monitored during surgery. Phenylephrine was administered intravenously to maintain adequate blood pressure.
  • a 4-0 silk suture was passed through the myocardium of the central left anterior descending (LAD) coronary artery and through the polyethylene tube.
  • a silicone tube was placed over the polyethylene tube and tied off with a suture.
  • 1 mg/kg lidocaine and 200 U/kg heparin were administered intravenously. The same amount of heparin was then administered every hour until reperfusion. After 180 minutes of mid-LAD occlusion, the tube was removed and the heart was allowed to reperfuse.
  • Example 2(1) Preparation and transportation of myocardial spheres for transplantation
  • the myocardial spheres produced in Example 2(1) were collected on the day of transplantation, diluted with physiological saline, packaged in Eppendorf tubes, and transported to a transplantation facility under an environment of 4° C. Immediately after arriving at the transplantation facility, they were transplanted into cynomolgus monkeys by the method described below.
  • 10 cynomolgus monkeys (four males and six females) were similarly induced with myocardial infarction, and divided into two groups.
  • One group was transplanted with the cardiomyospheric spheroids (equivalent to 6 x 107 cardiomyocytes) described in (2) above, and the other group was transplanted with a vehicle.
  • the specific transplantation method is as follows. On the 14th day after induction of myocardial infarction (MI), a second sternotomy was performed on the animals to expose the heart.
  • the cardiac spheres (2) above suspended in saline or the saline vehicle were injected 5 to 6 times at 100 ⁇ L each using a 27-gauge needle, and administered intramyocardially to the infarcted and border areas.
  • Immunosuppression was achieved by intravenous injection of methylprednisolone and abatacept (Bristol Myers Squibb) and subcutaneous injection of cyclosporine (Novartis International AG).
  • Methylprednisolone (Bristol Myers Squibb) was administered at a daily dose of 50 mg/kg for 3 days starting 1 day before transplantation. Thereafter, 2 mg/kg of methylprednisolone (Bristol Myers Squibb) was administered once a day. Abatacept (Bristol Myers Squibb) was administered at a dose of 12.5 mg/kg every two weeks starting one day before transplantation. The daily dose of cyclosporine (Novartis International AG) was 5-10 mg/kg, and the dose was adjusted based on the peripheral blood trough level from the fifth day of transplantation until the end of the experiment.
  • cyclosporine Novartis International AG
  • Computed tomography was performed 2 days before transplantation, 28 days after transplantation, and 84 days after transplantation.
  • the CT method used was described in Shiba Y. et al., Nature. 2016;538:388-391. Specifically, anesthetized animals were intubated and mechanically ventilated with 2% isoflurane. The heart was imaged with an R_mCT AX (Rigaku Corporation) while a radiocontrast agent (Iopamidol) was injected at 8 ml/min. The systolic and ventilatory cycles were automatically synchronized.
  • LVEDV left ventricular end-diastolic volume
  • LVESV left ventricular end-systolic volume
  • LVEF left ventricular ejection fraction
  • BNP brain natriuretic peptide
  • cTnT cardiac troponin T
  • Sections were analyzed immunohistochemically using a primary antibody against human-specific cardiac troponin I (cTnI, ab52862; Abcam) and a biotin-conjugated secondary antibody (Vector Laboratories).
  • cTnI human-specific cardiac troponin I
  • Abcam Ab52862
  • biotin-conjugated secondary antibody Vector Laboratories
  • HRP-conjugated streptavidin ABC kit Vector Laboratories
  • DAB substrate kit Vector Laboratories
  • the sections were treated with anti-myosin light chain 2A primary antibody (MLC-2A; S58-205, Becton, Dickinso) in the same manner as above. n and Company), anti-myosin light chain 2V primary antibody (MLC-2V; ab92721, manufactured by Abcam), anti- ⁇ - Actinin primary antibody (ab137346, manufactured by Abcam), anti-vimentin primary antibody (Merck & Co.), anti-connexin 43 primary antibody (Cx43, ab11370; manufactured by Abcam), anti-N-cadelin primary antibody (Thermo Fisher Sc) Antibody (clone: CH-I, manufactured by Abcam), anti-cTnT primary antibody (clone: 13-11), anti-CD45 primary antibody (clone: 2B11&PD), anti-Ki67 primary antibody (ab16667, manufactured by Abcam), anti-pan-cadherin primary antibody (clone: CH- 19) and were analyzed immunohistochemically using anti-lycopersic
  • the brain, lungs, liver, kidneys, and spleen were also harvested and fixed in 4% PFA. Unless macroscopic abnormal findings were detected, several sections were randomly selected and immunostained with antibodies against HE and human-specific cTnI to detect ectopic cardiomyocyte engraftment. The stained sections were imaged using a NanoZoomer 2.0-RS (Hamamatsu Photonics) or a BZ-X700 microscope (KEYENCE).
  • Echocardiograms, computed tomography (CT), BNP levels, graft area, and outcomes were analyzed by analysis of variance (ANOVA), followed by post-hoc comparisons between time points with Tukey's multiple comparison test, and unpaired t-test analysis for group comparisons at each time point.
  • cTnT rates were analyzed by ANOVA followed by post-hoc Tukey's multiple comparison test. All summarized data are presented as mean ⁇ standard error of the mean. All statistical analyses were performed using GraphPad Prism (GraphPad Software) with a significance threshold of P ⁇ 0.05.
  • the cardiomyocytes of the transplanted animals also showed a streaky pattern similar to that of the host cardiomyocytes, with comparable cTnT expression and sarcomere length (FIG. 2B), indicating that they had matured in the myocardial tissue of the transplanted animals at approximately the same level as the host cardiomyocytes by 12 weeks after transplantation.
  • the transplanted cardiomyocytes were well vascularized ( Figures 4A(J), 4A(M)) and abundantly expressed connexin43 and cadherin ( Figures 4A(H), (I), (K), (L)). These results indicated that the transplanted cardiomyocytes survived at a maturity close to that of the host cardiomyocytes.
  • Example 3 (3) the left ventricular shunt fraction (FS) was measured by echocardiographic analysis before transplantation, 4 weeks after transplantation, and 12 weeks after transplantation for animals that received human iPS cell-derived cardiomyocytes (equivalent to 2 x 107 cardiomyocytes) and the vehicle.
  • the results are shown in Figure 3A.
  • the contractile function was significantly improved 4 weeks after transplantation in the animals that received cardiomyocyte transplants.
  • the echocardiograms of the animals that received cardiomyocyte transplants equivalent to 6 x 107 cardiomyocytes before transplantation, 4 weeks after transplantation, and 12 weeks after transplantation are shown in Figure 5A, and the LVEF measurement value is shown in Figure 5B.
  • cardiomyocyte-transplanted animals showed a higher fractional shortening than the vehicle-transplanted animals, and this advantage continued until 12 weeks after transplantation.
  • a test was also conducted in which cardiomyocytes were prepared using a group of human iPS cell-derived cardiomyocytes that had only been subjected to cardiomyocyte differentiation and not the purification process in the process of Example 1 (1), and transplanted into cynomolgus monkeys in the same manner as in Example 3 (3).
  • the left ventricular shunt fraction (FS) was measured by echocardiographic analysis before transplantation, 4 weeks after transplantation, and 12 weeks after transplantation for the non-purified cardiomyocyte-transplanted animals and the vehicle-transplanted animals. The results are shown in FIG.
  • FIG. 5D together with the results for the animals transplanted with cardiomyocytes produced from purified human iPS cell-derived cardiomyocytes.
  • the contractile function was significantly improved 4 weeks after transplantation in the animals transplanted with cardiomyocytes produced from purified human iPS cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CSs (purified)) compared with the animals transplanted with cardiomyocytes produced from unpurified human iPS cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CSs (non-purified)).
  • CT scan Computed tomography
  • LVEF left ventricular ejection fraction
  • Example 3 animals that received human iPS cell-derived cardiomyospheric implants and vehicle-implanted animals were recorded by Holter electrocardiogram before implantation, on days 4, 7, and 14 after implantation, and every other week thereafter. Vehicle recipients showed no substantial ventricular arrhythmias (Fig. 3C(a) and 3C(c)). Four of the five animals that received human iPS cell-derived cardiomyospheric implants also showed no or almost no ventricular arrhythmias during the experimental period (Fig. 3C(b) and 3C(d)). One of the implanted animals (ID: C067 in Fig.
  • the transient ventricular arrhythmias that occurred in some of the animals that received human iPS cell-derived cardiomyosphers in Example 3 were much shorter in duration and less frequent than in previous studies (Shiba Y. et al., Nature. 2016;538:388-391).
  • the short duration and low frequency of arrhythmias may be explained by differences in the transplanted human iPS cell-derived cardiomyocytes. Specifically, the difference in iPS cell-derived cardiomyocytes is thought to be a combination of the high purity and maturity of the cardiomyocytes in the cardiomyocyte group produced in Example 1, or the high ratio of live cells in the cardiomyocyte group transplanted into cynomolgus monkeys in Example 3.
  • the present inventors have performed a method of directly transplanting human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CM) into the myocardium as performed in Example 3.
  • PSC-CM pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • This method involves potential risks associated with needle injection, such as tissue damage, bleeding, thrombosis, and cardiac edema
  • the transplanted PSC-CM has been shown to contract in synchronization with the adjacent recipient's cardiomyocytes, and is referred to as cardiac regeneration therapy.
  • the cardiomyosphers produced in Example 2 have several advantages and can be an ideal active ingredient for cardiac regeneration therapy. First, the preparation of cardiomyosphers is easy, and it is only necessary to seed a group of cardiomyocytes dispersed in a specific culture plate and allow them to naturally form cell aggregates.
  • Example 3 The post-transplant arrhythmia observed in Example 3 showed similar characteristics to those in a previous study (Shiba Y, et al., Nature. 2016;538:388-391, cardiomyocyte purity was 63%), i.e., delayed onset, non-lethal, and transient occurrence; however, in Example 3, the duration of arrhythmia was much shorter and the frequency was lower than in the previous study ( Figure 5F). The low frequency of post-transplant arrhythmia may be explained by the different origin of the transplanted cardiomyocytes. In the previous study, CM was derived from allogeneic monkeys, whereas in Example 3, CM was derived from xenogeneic human.
  • Example 3 From these points, it was shown for the first time that in order to achieve a low frequency and onset time of ventricular arrhythmia after transplantation in Example 3, it is necessary to satisfy at least two conditions: the purity of the cardiomyocytes of the cardiospheres transplanted in Example 3 is 99.8% and the spontaneous beat rate is 34 ⁇ 13 beats/min.
  • the human iPS cell-derived cardiomyocytes produced in Example 1 took a maximum of 25 days for the differentiation process and purification process combined, which is different from the production of cardiomyocytes matured by long-term culture.
  • the human iPS cell-derived cardiomyocyte group produced in Example 1 showed properties such as cardiac troponin T positive cells at 90% or more ( Figure 1A (b)) and spontaneous pulsation of 0 to 60 beats per minute ( Figure 1C).
  • the cardiomyocyte spheres produced in Example 2 were produced using cardiomyocyte groups within 30 days (excluding the frozen storage period) from the start of differentiation in Example 1.
  • Cardiomyocyte groups with these characteristics are thought to be able to regenerate the damaged parts of the recipient heart by electrically integrating with the recipient cardiomyocytes and engrafting for a long time while maintaining their maturity ( Figures 2B, 3A, 4A, 4B, 5A, 5B). Furthermore, among the transplanted animals, some did not show ventricular arrhythmia, and the arrhythmias that did occur in some were overwhelmingly less frequent than in existing tests, were transient, and were manageable (Figures 3C, 5C, and 5D). Based on these properties, the cardiomyocyte group produced in Example 1 and the cardiomyospheric cells produced in Example 2 can be used as cell preparations suitable for clinical applications.
  • the present invention provides cardiomyocyte groups and cardiomyospheroids derived from human pluripotent stem cells that can meet the conditions necessary for clinical application, as well as pharmaceutical compositions containing the cardiomyocyte groups and/or cardiomyospheroids as active ingredients, methods for producing the cardiomyocyte groups, and methods for producing the cardiomyospheroids.

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Abstract

以下の（１）、（２）及び（３）の特徴を有する、ヒト多能性幹細胞から分化した心筋細胞を含む心筋細胞群：（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が９０％以上である、（２）自発拍動が０～６０回／分である、及び（３）分化を開始してから３０日以内である。また、前記心筋細胞群及び／又は前記心筋細胞群がスフェロイド化した心筋球と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。（ａ）ヒト多能性幹細胞を拡大培養する工程と、（ｂ）前記拡大培養されたヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化する条件下で培養し、心筋細胞を６０％以上含む細胞群を製造する工程と、（ｃ）前記細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去する工程と、を含む、前記心筋細胞群の製造方法。

Description

心筋細胞群、医薬組成物、心筋細胞群の製造方法、及び心筋球
　本発明は、心筋細胞群、医薬組成物、心筋細胞群の製造方法、及び心筋球に関する。
　本願は、２０２３年５月３０日に、日本に出願された特願２０２３－０８８９５４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　心臓発作によって心筋細胞が大量に失われると、やがて心筋組織は収縮しない線維組織に置き換わり、生涯にわたって心不全となる。現在、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の心臓修復への臨床応用が検討されている。ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞（以下、「ｈＰＳＣ－ＣＭ」と称することがある）を心筋組織に移植することにより、心筋組織を再生させることが期待される。上記ｈＰＳＣ－ＣＭを用いた再生医療は、理論的にはｉｎ　ｖｉｔｒｏで大量のｈＰＳＣ－ＣＭを生産できるため、有望であると考えられている。
　これまで、本発明者らによる研究をはじめとした多くの研究により、高純度のヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を大量に作製する方法が開示されている（特許文献１～３を参照）。これらの心筋細胞を動物モデルに移植することによる概念実証試験としては、例えば、アクチビンＡとＢＭＰ４を用いてヒトＥＳ細胞から分化させた心筋細胞群を心筋梗塞誘発ラットへ移植した試験（非特許文献１）、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞群を免疫不全マウスの梗塞心臓へ移植した試験（例えば、非特許文献２を参照）等が行われている。これらの試験では、レシピエント心臓への一定期間に渡る移植心筋細胞群の生着が確認されている。さらに、レシピエント心筋組織への心筋細胞群の生着率を向上させるために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）との共移植、細胞増殖を促進するためのＰＳＣ－ＣＭの遺伝子改変等、いくつかの戦略が検証されている。これらの技術は、心筋細胞群の生着率向上等に有効であることが示されたが、現時点ではそのほとんどが臨床的に受け入れがたいものである。
　また、レシピエント心臓に移植されたｈＰＳＣ－ＣＭが生着するだけでは、心筋再生医療目的としては十分ではない。心筋再生医療のためには、損傷したレシピエントの心臓において、移植された心筋細胞とレシピエントの心筋細胞との電気的な統合が求められる。
　損傷したレシピエントの心臓におけるレシピエント心筋細胞と移植された心筋細胞との電気的な統合については、ヒトＥＳ細胞由来の心筋細胞をモルモットの損傷心臓に移植した試験で確認されている（例えば、非特許文献３、４、特許文献４を参照）。
　しかしながら、これらの試験により得られた知見は、使用された試験動物モデルが生理的に適切な動物モデルでないことからも、本技術の臨床応用を鑑みるに、そのレシピエント心臓における生着、電気的統合、及び傷害を受けた心臓への治療効果のいずれにおいても、臨床規模の心筋細胞の移植を、安全、かつ心筋再生を実現するように行えるかどうかを確認できるものではなかった。
　霊長類やブタ等の、ヒトへの外挿性に比較的適したモデル動物における試験も行われている。しかしながら、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞は、通常胎児又は新生児のフェノタイプを示す。そのため、ヒト心臓の心筋細胞と多能性幹細胞由来の心筋細胞とでは、成熟度の点等からその電気的特性には大きな違いが指摘されている。そのため、移植された多能性幹細胞由来の心筋細胞の生着率が限定的であること、及び多能性幹細胞由来の移植心筋細胞がレシピエントの心臓に移植関連不整脈を誘発すること等の新たな問題（例えば、非特許文献５、６、７、８を参照）が報告されている。
　移植関連不整脈を抑制するためには、例えば、抗不整脈薬によって不整脈を軽減する方法（非特許文献９を参照）等が開示されているが、それらの方法はレシピエントには負担となる等の問題がある。また、イオンチャネル等の遺伝子をゲノム編集技術により欠損させたｈＰＳＣ―ＣＭ等（非特許文献１０を参照）も報告されているが、遺伝子を編集した細胞を移植細胞とすることは、遺伝子編集により意図しない場所に変更を加える可能性があり、望ましくない変異を引き起こして予測できない影響をもたらす可能性があったり、製造工程や品質管理工程が複雑似なる等の理由で好ましくない。
国際公開第２００７／０８８８７４号 国際公開第２０１６／０１０１６５号 国際公開第２０１８／０７４４５７号 米国特許出願公開第２０２０／０４０７６８７号明細書
Laflamme MA. et al., Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. (2007) Na Biotechnol., 25, 1015-1024. Funakoshi S. et al., Enhanced engraftment, proliferation and therapeutic potential in heart using optimized human iPSC-derived cardiomyocytes . (2016) Sci Rep., 6, 19111. Shiba Y., et al., Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. (2012) Nature, 489, 322-5. Dhahri W. et al., In Vitro Matured Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Form Grafts With Enhanced Structure and Function in Injured Hearts. (2022) Circulation, 145, 1412-1426. Liw YW. et al., Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. (2018) Nat Biotechnol., 36, 597-605. Chong JJ. et al., Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. (2014) Nature, 510, 273-7. Shiba Y. et al., Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. (2016) Nature, 538, 388-391. Romagnuolo R. et al., Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Regenerate the Infarcted Pig Heart but Induce Ventricular Tachyarrhythmias. (2019) Stem Cell Reports., 12, 967-981. Nakamura K. et al., Pharmacologic therapy for engraftment arrhythmia induced by transplantation of human cardiomyocytes. (2021) Stem Cell Reports., 16, 2473-2487. Marchiano S. et al.,Gene editing to prevent ventricular arththmias associated with cardiomyocyte cell therapy.(2023)Cell Stem Cell.,30, 396-414.
　これまでに報告されたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞群は、臨床応用に必要とされる、（ｉ）高純度の心筋細胞群が簡便に製造できること、（ｉｉ）ヒトに安全に移植できること、（ｉｉｉ）移植先の心筋細胞と電気的に統合し、成熟度を保ったまま長く生着することによりレシピエントの心臓の障害部分を再生できること、及び（ｉｖ）レシピエントにおいて一定時間継続する重篤な心室性不整脈の発現頻度が低いこと、の全てを十分に満たすものではなかった。また、上記条件を満たすヒト多能性幹細胞由来心筋細胞群が、どのような構造的特徴、及び機能的特徴を有する必要があるのかは、その作用機序等からの解明はなされていない。そのため、様々な製造方法により得られるヒト多能性幹細胞由来心筋細胞群を、ヒトに近い霊長類等の心筋組織へ移植してみることでしか、当該ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞群が上記条件を満たすものであるかの確認評価ができないという現状があった。
　そこで、本発明は、臨床応用に必要な条件を満たし得る、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞群、前記心筋細胞群をスフェロイド化した心筋球、前記心筋細胞群及び／又は前記心筋球を有効成分とする医薬組成物、前記心筋細胞群の製造方法、及び前記心筋細胞群の製造方法を提供することを目的とする。
　本開示は以下の態様を含む。
［１］ヒト多能性幹細胞から分化した心室筋細胞を含む心筋細胞群であって、以下の（１）、（２）及び（３）の特徴を有する心筋細胞群：
　（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上である、
　（２）自発拍動が０～６０回／分である、及び
　（３）分化を開始してから３０日以内である。
［２］自発拍動が０～５０回／分である、［１］に記載の心筋細胞群。
［３］［１］又は［２］に記載の心筋細胞群、及び前記心筋細胞群をスフェロイド化させた心筋球からなる群より選択される少なくとも１種、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［４］前記心筋細胞群の全細胞中の生細胞の比率が８０％以上である、［３］に記載の医薬組成物。
［５］前記医薬組成物中に含まれる全細胞中の心筋球を構成する細胞の比率が６０％以上である、［３］に記載の医薬組成物。
［６］心不全の治療に使用される、［３］～［５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７］（ａ）ヒト多能性幹細胞を拡大培養する工程と、
　（ｂ）前記拡大培養されたヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化する条件下で培養し、心筋細胞を６０％以上含む細胞群を製造する工程と、
　（ｃ）前記細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去する工程と、
を含む、［１］又は［２］に記載の心筋細胞群の製造方法。
［８］［１］又は［２］に記載の心筋細胞群をスフェロイド化させた心筋球。
［９］前記心筋球の直径が５０～３００μｍである、［８］に記載の心筋球。
［１０］［１］又は［２］に記載の心筋細胞群を培地に懸濁した後、底面に微細ウェルを有する培養器で静置培養する工程を含む、心筋球の製造方法。
　本発明によれば、臨床応用に必要な条件を満たし得る、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞群、前記心筋細胞群をスフェロイド化した心筋球、及びその前記心筋細胞群及び／又は前記心筋球を有効成分とする医薬組成物、前記心筋細胞群の製造方法、及び前記心筋球の製造方法が提供される。
実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群の心筋トロポニンＴ陽性率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（ｂ）。（ａ）は、純化を行う前の細胞群の心筋トロポニンＴ陽性率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群について、パッチクランプ法で電気生理学的分析を行った結果の活動電位パターンを示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群についてパッチクランプ法で電気生理学的分析を行った結果の自発拍動数（Ｂｅａｔ　ｒａｔｅ）、最大拡張電位（ＭＤＰ）、及び９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）を示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群について、イソプロテレノール、アミオダロン、及びイバブラジンに対する薬物応答性を解析した結果の活動電位の波形を示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群について、イソプロテレノール、アミオダロン、及びイバブラジンに対する薬物応答性を解析した結果の１分間当たりの自発拍動数を示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群について、免疫細胞化学的解析を行った結果を示す。 実施例１の（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群（純化後ｈｉＰＳＣ－ＣＭｓ）と、純化を行う前の細胞群（純化前ｈｉＰＳＣ－ＣＭｓ）について、自発拍動数を測定した結果を示す。 実施例２（１）で製造された心筋球中に含まれる細胞の生存率を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルにおいて、ホスト心筋細胞と移植心筋細胞のサルコメア長を測定した結果を示す。 実施例２（２）において、実施例２（１）で製造された心筋球を長期培養し、免疫組織化学的染色を行った結果を示す。Ｄａｙ２８：培養開始から２８日後；Ｄａｙ５６：培養開始から５６日後；Ｄａｙ８４：培養開始から８４日後。Ａ，Ｄ，Ｇ：ＣｙｔｏＲｅｄ及びＤＡＰＩで染色；Ｂ，Ｅ，Ｈ：心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及びＤＡＰＩで染色；Ｃ，Ｆ，Ｉ：ＣｙｔｏＲｅｄ、ｃＴｎＴ及びＤＡＰＩで染色。 実施例２（２）において、改変型ルシフェラーゼを発現させたヒトｉＰＳ細胞由来の分散した心筋細胞群（Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ　ｈｉＰＳＣ－ＣＭｓ）及び改変型ルシフェラーゼを発現させた心筋球（ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ）を成熟雄ＮＯＧマウスに移植し、移植後のマウスにおいて生物発光シグナルを検出した結果を示す。 図２Ｄで検出された生物発光シグナルをグラフ化した図である。 実施例３において、実施例２（１）で製造された心筋球（心筋細胞２×１０７個相当）を移植したカニクイザルの末梢血のシクロスポリンのトラフレベルを測定した結果を示す。網掛け範囲は、心臓移植で急性拒絶反応を抑制するためのシクロスポリンのトラフレベルを示す。 実施例３において、実施例２（１）で製造された心筋球（心筋細胞６×１０７個相当）を移植したカニクイザルの末梢血のシクロスポリンのトラフレベルを測定した結果を示す。網掛け範囲は、心臓移植で急性拒絶反応を抑制するためのシクロスポリンのトラフレベルを示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルにおいて、心エコー解析により、移植前、移植後４週間後（４ｗ移植後）、及び移植後１２週間後（１２ｗ移植後）の左室内径短縮率（ＦＳ）を計測した結果を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルにおいて、一過性の心室性頻拍を示した動物のホルター心電図を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルのホルター心電図を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルにおいて、組織学的検査を行った結果を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルにおいて、組織学的検査を行った結果を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルにおける、移植前、移植４週間後（４ｗ移植後）、及び移植１２週間後（１２ｗ移植後）の心エコー図を示す。スケールバーは５ｃｍを示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球（心筋細胞６×１０７個相当）又はビヒクルを移植されたカニクイザルにおける、移植前、移植４週間後（４ｗ移植後）、及び移植１２週間後（１２ｗ移植後）のＬＶＥＦ及びＦＳの測定値を示す。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルのホルター心電図を示す。 実験例３で、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルにおいて、心エコー解析により左室内径短絡率（ＦＳ）を計測した結果を示す。ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ（純化）：実施例２（１）で製造された心筋球；ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ（非純化）：純化を行っていないヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群から製造された心筋球。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球又はビヒクルを移植されたカニクイザルの血清中において心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を測定した結果を示す。Ａ，Ｂ：心筋細胞２×１０７個相当を移植；Ｃ，Ｄ：心筋細胞６×１０７個相当を移植。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルの一過性不整脈が出た個体の不整脈の持続時間等を示す。＊ｐ＜０．０５　ｖｅｒｓｕｓ　ｐｒｅ　Ｔｘ；＃ｐ＜０．０５　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｖｅｈｉｃｌｅ　ａｎｄ　ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ。 実施例３で、実施例２（１）で製造された心筋球を移植されたカニクイザルにおいて、心臓（Ａ）、肺（Ｂ、Ｆ）、肝臓（Ｃ、Ｇ）、腎臓（Ｄ、Ｈ）、及び脾臓（Ｅ、Ｉ）の組織学的検査の結果を示す。Ａ～Ｄのスケールバーは１ｃｍを示す。Ｅのスケールバーは５ｍｍを示す。Ｉのスケールバーは２００μｍを示す。
　「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、細胞、細胞群、及び心筋球は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、細胞、細胞群、及び心筋球は、それぞれ、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、単離されたポリヌクレオチド（単離されたＤＮＡ、単離されたＲＮＡ）、単離されたベクター、単離された細胞、単離された細胞群、及び単離された心筋球であり得る。
　本明細書において、細胞集団中の特定の細胞の比率（割合）は、当該細胞集団中の全細胞数に対する特定の細胞の細胞数の比率を意味し、以下式により算出される。
　特定細胞の比率（％）＝特定細胞の細胞数／細胞集団中の全細胞数×１００
（心筋細胞群）
　本開示の第１の態様は、ヒト多能性幹細胞から分化した心室筋細胞を含む心筋細胞群である。前記心筋細胞群は、以下の（１）、（２）及び（３）の特徴を有する。
　（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上である。
　（２）自発拍動が０～６０回／分である。
　（３）分化を開始してから３０日以内である。
　本実施形態の心筋細胞群は、上記（１）、（２）及び（３）の特徴を有することにより、臨床応用に必要とされる以下の（ｉ）～（ｉｖ）の条件を満たし得る心筋細胞群となる。
　（ｉ）高純度の心筋細胞群であり、且つ簡便に製造できること。
　（ｉｉ）ヒトに安全に移植できること。
　（ｉｉｉ）移植先の心筋細胞と電気的に統合し、成熟度を保ったまま長く生着することによりレシピエントの心臓の障害部分を再生できること。
　（ｉｖ）レシピエントにおいて一定時間継続する重篤な心室性不整脈の発現頻度が低いこと。
　本実施形態の心筋細胞群は、上記（ｉ）～（ｉｖ）の１つ以上を満たすことが好ましく、２つ以上を満たすことがより好ましく、３つ以上を満たすことがさらに好ましく、４つ全てを満たすことが特に好ましい。
　本実施形態の心筋細胞群は、上記（ｉ）～（ｉｖ）の条件を満たすことにより、臨床応用可能な心筋細胞群であるといえる。
＜ヒト多能性幹細胞＞
　「多能性幹細胞」は、自己増殖能及び多分化能を有する細胞である。多能性幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、及び生殖幹細胞（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ　Ｓｔｅｍ：ＧＳ細胞）、並びにこれらの多能性幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞を含み得る。「多能性幹細胞」は、自己増殖能及び分化多能性を有する細胞であれば特に限定されず、上記例示したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同等の性質を有する未知の細胞も包含する。
　細胞が多能性幹細胞であることは、多能性幹細胞に特異的な性質の有無や、多能性幹細胞に特異的な各種マーカーの発現等から判断することができる。例えば、多能性幹細胞に特異的な性質としては、自己複製能を有し、多能性幹細胞とは異なる性質を有する別種の細胞へと分化可能である性質が挙げられる。また、テラトーマ形成能やキメラマウス形成能等も多能性幹細胞に特異的な性質として挙げられる。
　多能性幹細胞に特異的な各種マーカー（以下、「多能性幹細胞マーカー」という）とは、多能性幹細胞に特異的に発現する因子であり、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＳＳＥＡ－５、ＧＤＦ３、ＫＬＦ４、ＣＬＤＮ６等を例示することができる。これら多能性幹細胞マーカーの少なくとも１つの発現が観察された場合には、当該細胞を多能性幹細胞と判断することができる。多能性幹細胞マーカーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態として、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞を多能性幹細胞と判断してもよい。細胞における多能性幹細胞マーカーの発現は、ＲＴ－ＰＣＲやマイクロアレイ等の公知の方法を用いて確認することができる。
　ヒト多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞でもよく、ヒトｉＰＳ細胞でもよく、ヒトＥＧ細胞でもよく、ヒトＧＳ細胞でもよいが、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞が好ましく、ヒトｉＰＳ細胞がより好ましい。
　「ヒトｉＰＳ細胞」は、例えば、成人の体細胞等の非多能性細胞から人工的に生成された多能性幹細胞であり、ヒトｉＰＳ細胞を製造する方法は当該技術分野で周知である。具体的には、繊維芽細胞、造血系細胞、表皮細胞等の任意の体細胞に対して、１つ又は複数の初期化因子を導入することにより製造される。初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬＩＮ２８等が挙げられる。多能性幹細胞であることは、上述の当該幹細胞に特異的な遺伝子及び／又はタンパク質の発現等を指標として確認することができ、これらを選別することができる。
　ヒトｉＰＳ細胞は、公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（日本国京都府京都市左京区聖護院川原町５３番地）から複数種類の細胞株が提供されている。ヒト多能性幹細胞として、それらのヒトｉＰＳ細胞株を用いてもよい。公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団から提供されるヒトｉＰＳ細胞株の具体例としては、Ｆｆ－Ｉ０１株、Ｆｆ－Ｉ１４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ－Ｉ１４ｓ０４株、Ｆｆ－ＭＨ０９ｓ０１株、Ｆｆ－ＭＨ１５ｓ０２株等が挙げられる。これらの細胞のうち、Ｆｆ－Ｉ１４株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ－Ｉ１４ｓ０４株が好ましく用いられる。上記のｉＰＳ細胞は、全てＨＬＡハプロタイプホモ接合体ヒトｉＰＳ細胞である。臨床応用のためには、臨床グレードの細胞株を用いることか好ましい。ヒトｉＰＳ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の細胞バンクから提供されるものであってもよい。ヒトｉＰＳ細胞は、市販のものを用いてもよい。
＜心筋細胞群＞
　本実施形態の心筋細胞群は、ヒト多能性幹細胞から分化した心筋細胞（ｈＰＳＣ－ＣＭ）のうち、特に成熟した心室筋細胞を含む。心筋細胞は、サルコメアα－アクチニン（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、トロポニンＩタイプ１（ＴＮＮＩ１）の内の少なくとも１つが陽性の細胞を意味し、心室筋細胞は、心筋トロポニンＴ、及び／又はミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）陽性細胞をいう。また、心筋細胞は、典型的には自己拍動能を有する心筋の細胞である。心室筋細胞は、心筋細胞の１種であり、心室筋を構成し得る心筋細胞である。また、「心筋前駆細胞」とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ及びＭＥＳＰ１の内の少なくとも１つが陽性の細胞を意味する。本明細書中の「非心筋細胞」とは、心筋細胞及び心筋前駆細胞のどちらにも該当しない細胞を意味し、具体的な細胞としては、例えば、平滑筋細胞、内皮細胞等が挙げられる。
　本実施形態の心筋細胞群は、（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上であること、（２）自発拍動が０～６０回／分であること、（３）分化を開始してから３０日以内であることのいずれをも充足するものである。
　「細胞群」とは、同じ種類又は異なる種類の２以上の細胞からなる細胞集団を意味する。「心筋細胞群」とは、心筋細胞を含む細胞群であり、心筋細胞のみから構成されてもよく、心筋細胞以外の細胞（例えば、非心筋細胞等）を含んでもよい。本実施形態の心筋細胞群が含む心筋細胞の少なくとも一部は、心室筋細胞である。心筋細胞群は、心室筋細胞に加えて、心室筋細胞以外の心筋細胞（例えば、心筋前駆細胞、心房筋細胞等）を含んでもよい。ヒト多能性幹細胞からの本発明の心筋細胞群の製造は、後述の方法により行うことができる。
＜（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上であること＞
　心筋トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ　ｍｕｓｃｌｅ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ：ｃＴｎＴ）は、心筋の筋原線維を構成するタンパク質であり、心筋細胞マーカーとして知られている。心筋トロポニンＴ陽性細胞は、心筋細胞であるといえる。ヒト心筋トロポニンＴはＴＮＮＴ２遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　７１３９）にコードされるタンパク質である。本明細書中で「陽性細胞」とは、対象タンパク質又は遺伝子が当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子又はそのサブユニット等）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡｓｅｑ等の核酸増幅方法及び核酸検出方法等を利用して行うことができる。対象タンパク質又は遺伝子の発現は、一般的な手法で判断することができる。例えば、フローサイトメトリーを利用する場合には、対象細胞における対象タンパク質の発現量が、前記タンパク質の発現が陰性である対照群での発現量と比較して、相対的に高い場合に、前記対象細胞は前記対象タンパク質が陽性であると判断できる。
　本明細書において、「陰性」とは、対象タンパク質又は遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。対象タンパク質又は遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なり得るが、一般的な手法で判断できる。
　心筋細胞群における心筋トロポニンＴ陽性細胞の割合は、心筋細胞群中の全生細胞数に対して、９０％以上であれば、特に限定されない。心筋細胞群における心筋トロポニンＴ陽性細胞の割合は、心筋細胞群中の全生細胞数に対して、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらにより好ましく、９８％以上がさらにより好ましく、９９％以上又は９９．５％以上が特に好ましい。心筋細胞群中の全生細胞における心筋トロポニンＴ陽性細胞の割合としては、心筋細胞群中の全生細胞数に対して、９０～１００％、９５～１００％、９６～１００％、９７～１００％、９８～１００％、９９～１００％、又は９９．５～１００％が挙げられる。
　心筋細胞群中の全生細胞における心筋トロポニンＴ陽性細胞の割合は、上記の方法のいずれかで、心筋トロポニンＴ陽性細胞の数を測定し、全生細胞の数を一般的に用いられる方法（例えば、フローサイトメトリーのゲーティング等）により検出して、その比を算出して求めることができる。心筋トロポニンＴ陽性細胞数は、好ましくは心筋トロポニンＴに対する抗体を用いたフローサイトメトリー解析により確認することができる。フローサイトメトリー解析用の抗心筋トロポニンＴ抗体は、市販のものを用いることができる。例えば、心筋細胞群中の生細胞を、フローサイトメトリー等により選別し、選別された生細胞群において、心筋トロポニンＴ陽性細胞数を測定することにより、全生細胞中の心筋トロポニンＴ陽性細胞の比率を算出してもよい。例えば、心筋細胞群のフローサイトメトリー解析により得られたデータにおいて、生細胞群をゲーティングにより選択し、当該生細胞群において、心筋トロポニンＴの発現量に基づき、心筋トロポニンＴ陽性細胞の比率を取得してもよい。心筋細胞群における生細胞の選択は、例えば、前方散乱、側方散乱、生死判定用色素（核酸結合色素、タンパク質結合色素等）による染色等を用いることができる。
＜（２）自発拍動が０～６０回／分であること＞
　本実施形態の心筋細胞群の自発拍動は、０～６０回／分であり、０～５０回／分であることが好ましく、０～４５回／分であることがより好ましく、０～４０回／分であることがさらに好ましく、０～３５回／分であることが特に好ましい。心筋細胞群の自発拍動は、１０～６０回／分であってもよく、１０～５０回／分であってもよく、１０～４５回／分であってもよく、１０～４０回／分であってもよく、１０～３５回／分であってもよい。心筋細胞群の自発拍動は、２０～６０回／分であってもよく、２０～５０回／分であってもよく、２０～４５回／分であってもよく、２０～４０回／分であってもよく、２０～３５回／分であってもよい。
　心筋細胞群の自発拍動速度（一定時間あたりの自発拍動数）は、公知の方法により測定することができる。心筋細胞群の自発拍動速度の測定は、細胞の動きを解析し得る方法であればいかなる方法であってもよい。測定方法としては、例えば、心筋細胞群の顕微鏡下の動画等の画像を取得してモーションベクター等を用いて分析する方法、細胞の拍動に伴い変化する電位パターン（自発活動電位）を記録する方法等が挙げられる。具体例としては、例えば、パッチクランプ増幅器を用いて、心筋細胞群の９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）や自発活動電位を記録することにより測定する方法、多電極システム、カルシウムイメージング又はインピーダンス等により測定する方法等が挙げられる。上記の自発拍動速度は、上記の方法に適した細胞数で測定することが好ましいが、複数回測定を行って、それらの結果を統計的に処理した値とすることもできる。
　具体的には、パッチクランプ増幅器を用いて、心筋細胞群の９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）及び自発活動電位を記録する方法が挙げられる。活動電位を測定するための細胞内溶液の組成としては、グルコン酸カリウム（１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、マグネシウム結合アデノシン三リン酸（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、及び（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ）が挙げられる。細胞外溶液の組成としては、ＮａＣｌ（１３６．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（５．４ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＨＥＰＥＳ（８５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、及びグルコース（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）が挙げられる。
＜（３）分化を開始してから３０日以内であること＞
　「分化の開始」とは、心筋細胞への分化誘導用培地（心筋細胞への分化を惹起する物質を含有する培地）で、ヒト多能性幹細胞の培養を開始した時点をいう。「分化を開始してから３０日以内」とは、心筋細胞への分化誘導用培地で、ヒト多能性幹細胞の培養を開始した時点から、３０日以内であることをいう。
　後述するように、本実施形態の心筋細胞群は、（Ａ）多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導工程、及び（Ｂ）多能性幹細胞及び非心筋細胞の除去工程により、製造することができる。本実施形態の心筋細胞群は、前記（Ａ）の工程の開始から３０日以内に、前記（Ｂ）の工程を完了しているものである。
　従来、ヒト多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を開始してから３０日程度の培養期間の細胞は、ヒトの心筋細胞で言えば胎児期から新生児期に相当し、大きさがヒトの成熟した心筋細胞よりも小さく、成熟度が低い。一方で、長期間、例えば分化誘導開始してから４０日以上培養を継続すると、心筋細胞としての成熟度は増すことが知られている（Dhahri W. et al., (2022) Circulation, 145, 1412-1426.）。しかしながら、長期間の培養はコストがかかり、実用化に不向きであること、長期間の培養では非心筋細胞が増えやすいこと、あるいは細胞の接着力が低下すること等の問題があり、臨床応用には不向きである。本実施態様の心筋細胞群は、心筋細胞への分化誘導の培養を開始してから３０日以内の培養期間であっても、上記（１）及び（２）の特徴を有し、成熟した心室筋細胞を高純度に含む。したがって、臨床応用に適した心筋細胞群である。後述する心筋細胞群の製造方法のように、心筋細胞への分化を開始してから純化完了するまでの培養日数を３０日以内として、ある程度成熟した高純度の心筋細胞を作製する方法は臨床応用には非常に有利な方法である。
　本実施形態の心筋細胞群が、前記（Ａ）及び（Ｂ）の工程により製造された後、凍結保存されたものである場合、凍結保存期間は、「分化を開始してから３０日以内」の期間から除外される。すなわち、心筋細胞群の凍結処理を開始した時点から、凍結した心筋細胞群の融解処理を完了した時点までの期間は、「分化を開始してから３０日以内」の期間から除外される。
＜他の特徴＞
　上述した本実施形態の心筋細胞群の特徴（２）は心筋細胞の成熟度を表しているもので、「自発拍動が０～６０回／分である」ことは、その心筋細胞群に心室筋細胞が多く含まれていることを示すものである。また、心筋細胞群にペースメーカー細胞及び／又は心房筋細胞が含まれていると拍動速度が速くなるため、上記特徴（２）は、これらの細胞の含有率が低いことを示すものでもある。本実施形態の心筋細胞群は、特徴（２）の代わりに、あるいは特徴（２）に加えて、例えば、心室筋細胞のマーカーであるミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）陽性細胞が、心筋細胞群中に多く含まれるという性質でも特定することができる。ＭＬＣ２ｖ陽性細胞比率は、本実施形態の心筋細胞群がレシピエント心筋組織に移植される時点で７０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましい。
　心筋細胞群は、臨床用途で用いる場合、通常、凍結保存した後、融解処理したものを用いることが多い。心筋細胞群の凍結保存には、公知の細胞用凍結保存溶液を用いることができる。細胞用凍結保存溶液は、各種市販されている。一例として、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（Ｚｅｎｏｇｅｎ　Ｐｈａｒｍａ社製）等が挙げられる。凍結保存は、細胞用凍結保存溶液に心筋細胞群を懸濁し、当該細胞懸濁液を凍結することで、行うことができる。
　本実施形態の心筋細胞群は、抗不整脈薬に対する応答性を有してもよい。抗不整脈薬としては、例えば、アドレナリン受容体アゴニスト（イソプロテレノール等）、ＨＣＮチャネルブロッカー（イバブラジン等）、及びカリウムチャンネルブロッカーで（アミオダロン等）が挙げられる。
　本実施形態の心筋細胞群は、上記（１）～（３）の全ての特徴を有することにより、移植用心筋細胞として、臨床応用することが可能である。
　本実施形態の心筋細胞群は、（１）～（３）の特徴を有することから、高純度に心筋細胞、特に成熟した心室筋細胞を含む心筋細胞群であり、後述の実施例で示すように、移植先の心筋細胞と電気的に統合し、成熟しながら長く生着することによりレシピエントの心臓の障害部分を再生することができる。さらに、後述の実施例で示すように、本実施形態の心筋細胞群から、レシピエントに、持続時間が長い重篤な心室性不整脈の発現頻度が低い移植用細胞群を得ることができる。また、本実施形態の心筋細胞群は、ヒト多能性幹細胞から分化誘導され、高度に純化精製されているため、ヒトに安全に移植することができ、さらに後述するように、簡便に、工業的にも優位に製造することができる。
　したがって、本実施形態の心筋細胞群は、移植用心筋細胞としての有用性が高い心筋細胞群である。
（心筋球：Ｃａｒｄｉａｃ　Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）
　本実施形態の心筋細胞群は、これをスフェロイド化した心筋球（本明細書中ではこれを単に「心筋球」と称することがある。）として移植細胞用途で用いることもできる。本開示の第２の態様である「スフェロイド化した心筋球」とは、上記心筋細胞群に含まれる細胞同士が凝集して細胞塊となったものであり、後述の方法により形成することができる。
　上記心筋球の直径としては、心筋球の中心付近の細胞が細胞死を起こすか、あるいは中心付近の心筋細胞だけが他部位の心筋細胞に比べて著しく幼若化することのないようなものであれば特に制限はないが、５０μｍ以上３００μｍ以下が挙げられる。心筋球の直径のより好ましい範囲は、１００μｍ以上２５０μｍ以下、さらに好ましい範囲は１５０μｍ以上２００μｍ以下である。心筋球は球状であることが好ましいが、細胞の凝集体であればよく、当該細胞凝集体中の心筋細胞群の生存率が保持されるものであればいかなる形であってもよい。そのため、「心筋球の直径」は、細胞凝集体の中心点を通る端から端までの長さのいずれのものも意味する。例えば、細胞凝集体が楕円形であれば、その端から端までの長さで最も短い長さ（最小径）が、上記範囲の下限値に入っていればよく、最も長い長さ（最大径）が、上記範囲の上限値に入っていればよい。また、複数の心筋球を含む心筋球群である場合、上述の心筋球の直径の好ましい範囲は、それ以外のサイズの心筋球が含まれることを許さないものではなく、心筋球群中の全心筋球数の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の心筋球が上記範囲の直径を有していればよい。
　心筋球の直径及びその分布は、公知の方法により測定することができる。測定方法としては、例えば、心筋球を撮像した画像から、画像解析ソフト等を用いて心筋球の直径を測定する方法、粒子径分布測定装置を用いることにより測定する方法等が挙げられる。本実施形態の心筋球は、上述の第１の態様に係る心筋細胞群の凝集体であるが、細胞のみで構成されている必要は必ずしもなく、例えば生体移植に適したマイクロキャリア様のもの（例えば、細胞外マトリクス粒子）の周囲に細胞が凝集したようなものであってもよい。
　また、本実施形態の心筋球は、後述の医薬組成物の有効成分となる。この場合、当該医薬組成物中に含まれる全細胞に対する心筋球を構成する細胞の比率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましい。心筋球に含まれる細胞数の測定方法は、これを測定できる方法であればいかなる方法でもよい。測定方法としては、例えば、心筋球の直径とその心筋球に含まれる細胞数の関係をあらかじめ取得しておき、測定対象の医薬組成物に含まれる心筋球の直径と心筋球の数から算出する方法等が挙げられる。心筋球の直径とその心筋球に含まれる細胞数の関係は、例えば、複数の心筋球について、その直径を測定した後、心筋球を分解して遊離の心筋細胞とし、心筋細胞数を計数することにより、取得することができる。心筋球中の細胞数の測定に用いる心筋球の直径としては、例えば、心筋球の最大径を用いることができる。
　本実施形態の心筋球は、第１の態様に係る心筋細群から製造されたものであればよく、心筋球自体は、分化を開始してから３０日以内である必要はない。心筋球を製造するための、第１の態様に係る心筋細胞群が、分化を開始してから３０日以内にその製造が完了したものであればよい。
　本発明者らは、本実施形態の心筋球を形成させると、それを構成する心筋細胞の生存率が高く保たれることを見いだした。そのため、心筋細胞群を心筋球とし、当該心筋球を回収することで、生細胞の比率の高い心筋細胞群を得ることができる。第１の態様に係る心筋細胞群から製造された心筋球（心筋球群）は、成熟した心筋細胞を高純度に含み、且つ生細胞の比率が高いため、レシピエントに移植した場合にレシピエントの心筋組織に生着しやすく、一定時間以上継続する重篤な心室性不整脈の発現頻度が低い。そのため、臨床応用に適している。
（医薬組成物）
　本開示の第３の態様は、前記第１の態様に係る心筋細胞群及び前記第２の態様に係る心筋球からなる群より選択される少なくとも１種と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本実施形態の医薬組成物は、前記心筋細胞群及び心筋細胞群がスフェロイド化した心筋球からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。本実施形態の医薬組成物は、その医薬組成物に含まれる全細胞中の生細胞比率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましい。上記生細胞比率は、医薬組成物として保管又は輸送される場合はその保管期間及び／又は輸送時間を通して上記の生細胞比率を維持することが好ましく、さらに実際にレシピエントに投与される直前まで上記の生細胞比率を維持することが好ましい。生細胞数は公知の方法により測定することができる。例えば、トリパンブルー染色により生細胞と死細胞とを判別して生細胞数と死細胞数をそれぞれ計数し、生細胞数と全細胞数の比率から、生細胞比率を算出してもよい。
　また、本実施形態の医薬組成物に含まれる心筋球は、当該医薬組成物中に含まれる全細胞中の心筋球を構成する細胞の比率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上がさらに好ましく、８０％以上がさらに好ましい。上記心筋球を構成する細胞の比率は、医薬組成物として保管及び／又は輸送される場合はその保管期間及び／又は輸送時間を通して維持されることが好ましく、さらに実際にレシピエントに投与される直前まで維持されることが好ましい。
＜心筋細胞群及び心筋球＞
　心筋細胞群及び心筋球は、第１の態様に係る心筋細胞群、及び第２の態様に係る心筋球である。
＜薬学的に許容される担体＞
　「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態の医薬組成物においては、薬学的に許容される担体は、第１の態様にかかる心筋細胞群を損傷させず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　薬学的に許容される担体は、緩衝液であってもよい。緩衝液としては、例えば、生理食塩水、一般的な緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸）を含む等が挙げられる。
　医薬組成物は、上記成分に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されず、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。他の成分としては、例えば、上記以外の医薬品添加剤が挙げられる。医薬品添加剤としては、例えば、保存剤（例えば、酸化防止剤）、キレート剤、矯味矯臭剤、甘味剤、増粘剤、緩衝剤、着色剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
　医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本実施形態の医薬組成物は、通常、非経口製剤であり、以下に示す投与方法の具体例に適した剤型とすることができ、例えば注射剤、心筋シート等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物は、保存及び輸送のために、任意に、凍結保存され得る。本実施形態の医薬組成物を凍結した場合には、使用前に、細胞を解凍し、目的の細胞タイプに対応する無菌担体でさらに希釈して用いることもできる。本実施形態の医薬組成物は、患者への投与に供するために、例えば、バイアルに封入されるが、投与方法に応じて、例えばシリンジに封入されること等もある。また、本実施形態の医薬組成物の投与後、前記投与を受けた患者に、それ自体通常用いられる免疫抑制剤を投与することがある。免疫抑制剤は、当該患者に合わせて適宜選択することができるが、例えば、イムノフィリンに作用する薬剤（シクロスポリン、タクロリムス水和物等）等が用いられる。本実施形態の医薬組成物は、これらの免疫抑制剤との合剤としてもよい。
　本実施形態の医薬組成物の投与経路は、通常、非経口投与が好ましい。非経口投与の投与経路としては、細胞を患者に投与するそれ自体公知の方法、例えば。低侵襲で患者の心臓に細胞を投与し得る方法であれば、いずれの方法でもよい。具体的には、心臓（特に心室、心筋組織）に対する局所投与として、心室心筋組織への心外膜側からの移植針等による投与、或いはカテーテル等を用いた心内膜側又は心嚢からの投与等が好ましい。
　医薬組成物は、第１の態様に係る心筋細胞群及び／又は第２の態様に係る心筋球の治療的有効量を投与することができる。「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。例えば、前記心筋細胞群及び／又は心筋球の治療的有効量は、レシピエントの心臓修復に有効な量であり得る。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。例えば、医薬組成物は、心筋細胞群及び／又は心筋球の１回の投与量として、心筋細胞数として１０５～１０１０個、好ましくは１０７～１０９個のものが挙げられる。
　医薬組成物は、単回投与であってもよく、複数回投与であってもよい。例えば、患者に医薬組成物を投与した後、患者の心臓の機能や移植心筋細胞の生着等をモニタリングし、必要に応じて再度医薬組成物の投与を行ってもよい。
　本実施形態の医薬組成物の投与対象はヒトである。医薬組成物は、心不全等の心臓疾患の治療に使用することができる。心不全は、心臓の機能が低下した状態を呈する疾患である。心不全の原因としては、例えば、心筋梗塞、狭心症、高血圧、弁膜症、心筋症、不整脈、先天性疾患等が挙げられる。治療対象の心不全は、これらのいずれの原因によるものであってもよい。本実施形態の医薬組成物は、前記のような原因により、心筋組織が損傷して生じる心不全の治療に、好適に適用することができる。心不全に罹患している対象に対して、本実施形態の医薬組成物を投与（心筋細胞群及び／又は心筋球の移植）することにより、損傷した心筋組織を再生させることができ、心臓の機能を改善することができる。本実施形態の医薬組成物は、具体的には（１）損傷した心筋に、移植した収縮性心筋細胞が生着し、直接的にレシピエント心臓の損傷部位の収縮力を増強させる機能、及び／又は（２）血管新生、心臓保護作用、抗炎症作用、抗繊維化作用等を有するパラクライン因子を放出する機能等がある。
（心筋細胞群の製造方法）
　本発明の第４の態様は、心筋細胞群の製造方法である。本態様の心筋細胞群の製造方法は、以下の（ａ）～（ｃ）の工程をこの順で含む。
　（ａ）ヒト多能性幹細胞を拡大培養する工程、
　（ｂ）前記拡大培養されたヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化する条件下で培養し、心筋細胞を、工程（ｃ）の後にｃＴｎＴ陽性細胞が９０％以上となるのに十分な比率、具体的には６０％以上含む細胞群を製造する工程、及び
　（ｃ）前記細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去する工程。
＜工程（ａ）＞
　ヒト多能性幹細胞の拡大培養は、公知の方法により行うことができる。例えば、Thomson et al., Science（1998）282（5391）：1145-7 Hovatta et al., EE、Ludwig et al.,　Nat Methods (2006) 3:637-46、Kennedy et al., Blood (2007) 109:2679-87 et al., Nat Methods (2011) 8:424-9、Wang et al., Stem Cell Res. (2013) 11(3):1103-16、及び国際公開第２０１８／１８１３４２号に記載の方法等を用いることができる。
　培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、並びにこれらの混合培地等が挙げられる。あるいは、市販の幹細胞培養用の基礎培地を用いてもよい。市販の基礎培地としては、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ１０３Ｃ培地（味の素株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（例：ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ）（味の素株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．社）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ－ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ－７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　６培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。
　培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）であることが好ましく、無血清培地であることがより好ましい。「無血清培地」とは、無調整の血清又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分、及び／又は精製された動物組織由来成分（例えば、ｂＦＧＦ等の増殖因子）を含む培地も、無血清培地に包含される。
　無血清培地は、血清代替物を含有してもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール等が挙げられる。血清代替物は、市販のものを用いてもよい。市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　培地は、Ｌ－トリプトファンに加えて、Ｌ－トリプトファン以外の必須アミノ酸（Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、及びＬ－バリン）の一部又は全部を含んでもよい。
　培地は、非必須アミノ酸（Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、グリシン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－セリン、Ｌ－チロシン、Ｌ－プロリン）の一部又は全部を含んでもよい。
　培地は、上述の２０種のアミノ酸に加えて、Ｌ－シスチン等の天然アミノ酸を含んでいてもよい。
　培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、Ｙ－２７６３２等のＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤、ペニシリン－ストレプトマイシン等の抗生物質、ビタミン類、Ｌ－アスコルビン酸、リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２－アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　培地は、脂肪酸を含んでもよい。脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１－エイコサジエン酸、５，８，１１－エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。脂肪酸は、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
　培地は、Ｌ－アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン、インスリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を含む基礎培地に、Ｌ－トリプトファン又はＬ－トリプトファン誘導体を添加したものであってもよい。
　培地のｐＨは、約６．０～約８．５であることが好ましく、約７．０～約７．５であることがより好ましい。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌等の滅菌処理を行うことが好ましい。
　ヒト多能性幹細胞の培養は、公知の方法により行うことができる。ヒト多能性幹細胞は、例えば、線維芽細胞等のフィーダー細胞を用いて培養してもよく、フィーダー細胞フリーで培養してもよい。
　細胞の培養に用いられる培養器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトル等が挙げられる。
　細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよい。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、マトリゲル（Niwa A,et al. PLoS One.6(7):e22261,2011）、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカン；プロテオグリカン；フィブロネクチン；ビトロネクチン；ラミニン等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであってもよい。
　培養は、上記細胞支持用基質でコーティングされた培養容器を用いて、接着培養することが好ましい。
　培養温度としては、約３０～４０℃が挙げられ、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度としては、約１～１０％が挙げられ、好ましくは約２～５％である。酸素濃度は、通常１～４０％であるが、培養条件等により適宜選択される。
＜工程（ｂ）＞
　ヒト多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導法は、本実施形態の心筋細胞群を得られる方法であればいかなる方法でもよい。分化誘導法としては、例えば、（ｉ）ヒト多能性幹細胞においてＷｎｔ／カテニンシグナルを活性化して第１の細胞集団を得る（第１の分化培地における培養）、（ｉｉ）第１の細胞集団においてＷｎｔ／β－カテニンシグナルを阻害して心筋細胞前駆細胞を含む第２の細胞集団を得る（第２の分化培地における培養）方法等が用いられる。一般に、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル阻害を終了した後、心筋細胞前駆細胞は、成熟した心室筋細胞を含む心筋細胞群を得るために、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地又はＳｔｅｍＰｒｏ－３４等の培地中でさらに１～５日培養され得る。これらの工程により、当該培地中で、全細胞（死細胞は除く）中の６０％以上が心筋細胞に分化した細胞集団を得ることができる。
　Ｗｎｔ／カテニンシグナルの活性化は、ヒト多能性幹細胞を、Ｗｎｔシグナルアゴニスト、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ等と接触させることにより行われる。例えば、Ｗｎｔシグナルアゴニストは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）のインヒビター等が用いられる。ＧＳＫ－３βの阻害剤は、低分子化学化合物、例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、及びＣＨＩＲ－９８０１４等からなる群より選択される少なくとも１種が用いられる。これらの化合物及びその濃度は、本実施形態の心筋細胞群の特徴を持つ心筋細胞が培養される濃度として選択することができる。拡大培養されたヒト多能性幹細胞は、上記第１の分化培地中で、１～６日間培養される。ここで、中胚葉系の細胞が得られたか否かをモニタリングしてもよく、その場合、中胚葉マーカー遺伝子、具体的には、例えば、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等の発現によりモニタリングすることができる。
　次に、前記第１の分化培地を、第２の分化培地に交換する。第２の分化培地は、Ｗｎｔシグナルアンタゴニスト、ＶＥＧＦ等を含む。Ｗｎｔシグナルアンタゴニストは、本実施形態の心筋細胞群が生成されるものであればいかなるものであってもよいが、例えば、ＩＷＰ－２，ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＲ－１、ＰＮＵ－７４６５４、ＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１等が挙げられる。これらの薬剤の種類及び濃度は、本実施形態の心筋細胞群の特徴を持つ心筋細胞が培養される濃度として選択することができる。第２の分化培地中で細胞は１～７日培養される。
　上記工程（ｉ）と（ｉｉ）の培養期間は、この後、成熟した心室筋細胞を含む心筋細胞群を得るために、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地又はＳｔｅｍＰｒｏ－３４等の培地中でさらに１～５日培養される期間、及び後述する工程（ｃ）の培養期間も含めて３０日以内となるように調整される。
　本工程における培養容器、培養条件等は、ヒト多能性幹細胞を拡大培養工程に記載したものと同様のものを用いることができる。
　本実施形態の心筋細胞群への分化誘導は、具体的には、Ｔｏｈｙａｍａ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７；９：１４０６－１４１４に記載の方法により行うことが好ましい。培養容器は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｔｉｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ等から市販されている４層培養プレートが好ましく用いられ、培地としては、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ３０１培地、又はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ５０１培地（味の素株式会社製）を用いることが好ましい。
　本工程により得られる細胞群中の心筋細胞の割合は、工程（ｃ）の後にｃＴｎＴ陽性細胞比率が９０％以上となるのに十分な比率であればよい。具体的には、下述の工程（ｃ）で約４日間の培養で細胞を純化する場合、工程（ｂ）の最後では、心筋細胞が６０％以上であることが好ましい。工程（ｃ）でさらに時間をかけて心筋細胞の純化を行う場合には、それ以下の比率であってもよい。上記心筋細胞の比率は、例えば心筋トロポニンＴ等の心筋細胞マーカー陽性細胞の比率をフローサイトメトリー解析により測定することにより算出することができる。
＜工程（ｃ）＞
　工程（ｂ）後の細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去する方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、国際公開第２０１８／０７４４５７号、Tanosaki S. et al., iScience. 2020;23:101535、及びTanosaki S. et al., STAR Protoc. 2022;3:101360、Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74、及びTohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37等に記載の方法等を用いることができる。
　具体的には、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する培地で、工程（ｂ）で得られた細胞群を培養することにより、残存していた未分化細胞及び非心筋細胞の細胞死を誘導する方法が挙げられる。
　脂肪酸合成阻害剤としては、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、及びマロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものが好ましく、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、及び脂肪酸合成酵素からなる群より選択される少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものが好ましい。
　脂肪酸合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）、Ｃ７５、フラボノイズ、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）等が挙げられ、オルリスタット、Ｃ７５が好ましく、オルリスタットがより好ましい。
　ＡＴＰクエン酸リアーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、ＬＹ２９４００２及びＳＢ２０４９９０が挙げられる。
　アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、ソラフェンＡ（Ｓｏｒａｐｈｅｎ　Ａ）、ＴＯＦＡ、Ａ７６９６６２、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ＡＩＣＡＲ等が挙げられ、ＴＯＦＡ、Ａ７６９６６２が好ましい。
　脂肪酸利用阻害剤としては、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として脂肪酸利用を阻害するものが好ましい。
　カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として、脂肪酸分解を阻害する脂肪酸分解阻害剤としては、エトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）、ペルヘキシリン（Ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ）、ラノラジン（Ｒａｎｏｌａｚｉｎｅ）等が挙げられ、エトモキシル、ペルヘキシリンが好ましい。
　コレステロール合成阻害剤としては、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものが好ましく、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ標的としてコレステロール合成を阻害するものがより好ましい。
　ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するコレステロール合成阻害剤として、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）、セリバスタチン（Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）等が挙げられ、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンが好ましく、シンバスタチンがより好ましい。
　中でも、オルリスタット、Ｃ７５、ＬＹ２９４００２、ＳＢ２０４９９０、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、オルリスタットを用いることがより好ましい。
　脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤の培地中の濃度は、これらの種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、前記脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の濃度としては、０．１～５００μＭが挙げられる。
　コレステロール合成阻害剤の濃度としては、０．０１～５０μＭが挙げられる。
　例えば、上記のような基礎培地に、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を添加することにより、本工程で用いる培地を調製することができる。培地は、グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでもよい。グルコース、グルタミン、及び／又はメチオニンを含むことにより、細胞の生育が良好となることが期待される。
　工程（ｃ）における細胞の培養は、細胞培養に一般的に用いられる条件で行うことができる。培養温度としては、約３０～４０℃が挙げられ、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度としては、約１～１０％が挙げられ、好ましくは約２～５％である。酸素濃度は、通常１～４０％であるが、培養条件等により適宜選択される。
　培養時間は、特に限定されないが、好ましくは２４時間以上、より好ましくは４８時間以上であり、具体例としては１～５日が挙げられる。必要に応じて、細胞は継代培養されてもよい。
　脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する培地で、工程（ｂ）で得られた細胞群を培養することにより、工程（ｂ）で得られた細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去することができる。さらに、上記工程に加えて、通常の細胞培養に用いられる培地の組成においてグルコース、グルタミン、及びグルタミン酸を含まず、且つ乳酸を含む培地を用いて、細胞をさらに培養することにより、心筋細胞を選択的に増殖させ、非心筋細胞に細胞死を誘導することができる。前記のような培地での培養により、さらに心筋細胞を高度に純化することができる。本方法は、具体的には、国際公開第２００７／０８８８７４、国際公開第２０１６／０１０１６５に記載されている。
　なお、第１の態様の心筋細胞群における、「（３）分化を開始してから３０日以内である」、との特徴は、上記工程（ｂ）における心筋細胞分化誘導用培地（心筋細胞への分化を惹起する物質を含有する培地；例えば、第１の分化培地）での培養開始日を起算日とし、工程（ｃ）の終了日までが３０日以内であることを意味する。
＜任意工程＞
（選択工程）
　本実施形態の製造方法は、上記工程（ａ）～（ｃ）の後、上記（１）、（２）、及び（３）の特徴を有する心筋細胞群を選択する工程（選択工程）を有してもよい。選択工程は、上記（心筋細胞群）の項で記載した方法により行うことができる。
　具体的には、例えば、以下のように行うことができる。
　工程（ｃ）で得られた細胞群のうち、分化を開始（工程（ｂ）を開始）してから３０日以内である細胞群を選択する（ｄ１）。次いで、心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上である心筋細胞群を選択する。例えば、心筋トロポニンＴに対する抗体を用いて、工程（ｃ）で得られた細胞群のフローサイトメトリー解析を行い、全生細胞中のトロポニンＴ陽性細胞の比率が９０％以上である細胞群を選択する（ｄ２）。次いで、前記で選択された細胞群について、自発拍動が０～６０回／分である心筋細胞群を選択する。例えば、パッチクランプ増幅器を用いて、心筋細胞群の９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）及び自発活動電位を記録し、自発拍動速度が０～６０回／分である細胞群を選択する（ｄ３）。このようにして、選択工程を行うことができる。前記（ｄ１）～（ｄ３）は、前述の順番に限定されず、任意に順番を変更してもよい。
（心筋細胞群の凍結工程）
　本実施形態の製造方法は、上記工程（ａ）～（ｃ）の後、及び任意に選択工程の後、心筋細胞群を凍結する工程を有してもよい。
　上述の方法で得られた心筋細胞群は、好ましくは最終培地を除去した後、培養プレートからそれ自体公知の方法で剥離した後、必要に応じて洗浄後、通常細胞の凍結保存に用いられる細胞用凍結保存溶液に懸濁する。細胞用凍結保存溶液としては、一例として、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（Ｚｅｎｏｇｅｎ　Ｐｈａｒｍａ社製）等が挙げられる。ここで、凍結保存される細胞懸濁液中の心筋細胞群の濃度は、凍結融解が原因で細胞死が起きない濃度、具体的には凍結融解した後の生細胞率が、凍結前の生細胞の５０％以上となる濃度であればいずれのものでもよい。細胞懸濁液中の心筋細胞群の濃度は、具体的には、例えば、１×１０５個～１×１０８個／ｍＬ、好ましくは１×１０6個～１×１０７個／ｍＬである。凍結用の容器としては、細胞等の凍結に用いられるバイアルや、バッグ等を用いることができる。
　凍結及び凍結保存は、公知の方法で行うことができる。例えば、心筋細胞群を－６０℃～－８０℃のフリーザー内で凍結した後、液体窒素が充填された容器内か、あるいは－１５０℃以下のディープフリーザーに移して長期保存する方法等が用いられる。また、プログラムフリーザーを用いて、温度調整しながら細胞凍結することも好ましく、例えば、―４０～６０℃まで１～１０℃／分の速度で冷却し、－４０～－６０℃で１０～１時間待機した後、－８０℃まで１～１０℃／分の速度で冷却し、－８０℃で数日冷却する方法等が挙げられる。
　凍結された心筋細胞の融解処理は、公知の方法で行うことができる。例えば、凍結細胞を、液体窒素保存容器、またはディープフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中にて、融解処理を行うことができる。
（心筋球の製造方法）
　本開示の第５の態様は、心筋球の製造方法である。第５の態様の方法は、第１の態様にかかる心筋細胞群を培養液に懸濁した状態で、底面に微細ウェルを有する培養器で静置培養する工程を含む。第２の態様にかかる心筋球は、第５の態様にかかる製造方法により、製造することができる。
　心筋球の形成は、第１の態様にかかる心筋細胞群を培地に懸濁し、底面に微細ウェルを有する培養容器で静置培養することにより、行うことができる。なお、ここで用いる第１の態様にかかる心筋細胞群は、スフェロイドを形成していないものである。第１の態様にかかる心筋細胞群としては、上記第４の態様にかかる製造方法により製造された心筋細胞群を用いることができる。
　培地としては、上述の基礎培地が挙げられる。培地は、無血清培地を用いることが好ましい。培地は、インスリン（０．１～１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．１～１０μｇ／Ｌ）、セレニウム（０．１～１０μｇ／Ｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ）、上皮細胞増殖因子（１ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ）、血小板由来成長因子（１ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ）、及びエンドセリン－１（ＥＴ－１）（１×１０－８～１×１０－６Ｍ）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。培地の具体例としては、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ３０１培地（味の素株式会社製）が挙げられる。
　底面に微細ウェルを有する培養容器としては、スフェロイド形成用培養容器として市販されているものを用いることができる。微細ウェルとは、例えば、ウェルの開口径がマイクロメートルオーダー（例えば、１００～１０００μｍ、好ましくは１００～８００μｍ、より好ましくは２００～５００μｍ、さらに好ましくは３００～５００μｍ）であるウェルである。培養容器は、培養面が低接着性であるものが好ましい。培養容器は、Ｐｒｅｖｅｌｅｘ（登録商標）（日産化学株式会社製）等の生体物質付着防止剤でコーティングされたものを用いてもよい。培養容器の具体例としては、Ｐｒｅｖｅｌｅｘコートした６ウェルプレート（Ｅｌｐｌａｓｉａ　ＲＢ　５００　４００　ＮＡ　６、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）が挙げられる。
　心筋球の製造は、公知の文献（例えば、国際公開第２００９／０１７５２４号、Kawaguchi S. et al., JACC Basic Transl Sci. 2021;6:239-254、Tabei R. et al, The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2019;38:203-214）に記載の方法等を参照して行ってもよい。
（心不全の治療方法）
　本開示の第６の態様は、第１の態様に係る心筋細胞群及びは第２の態様に係る心筋球からなる群より選択される少なくとも１種を、心不全の治療が必要な対象に投与することを含む、心不全の治療方法である。
　投与される心筋細胞群及び／又は心筋球は、第３の態様にかかる医薬組成物の形態であってもよい。
　心筋細胞群及び／又は心筋球は、例えば、注射により心筋組織中に直接注入することにより、対象に投与することができる。投与に用いる器具は、心筋細胞群及び／又は心筋球を移植対象組織に注入できるものであればいずれのものでもよいが、例えば国際公開第２０２０－０１３１２５号等に記載のものを用いることができる。注射針は、２４～３０ゲージのものが用いられる。また、カテーテル等も用いることができる。
　心筋細胞群及び／又は心筋球は、「治療的有効量」を、心不全の治療が必要な患者に投与することができる。治療的有効量は、例えば、患者における心筋組織の損傷の程度に応じて、適宜決定してもよい。例えば、心筋細胞群及び／又は心筋球の１回の投与量は、心筋細胞数として１０５～１０１０個が挙げられ、１０７～１０９個が好ましい。ここで、心筋球を投与する場合、投与する細胞量は、心筋球となっている心筋細胞群の細胞数としてカウントされる。
　本実施形態の治療方法の適用対象はヒトである。心不全は、心臓の機能が低下した状態を呈する疾患である。心不全の原因としては、例えば、心筋梗塞、狭心症、高血圧、弁膜症、心筋症、不整脈、先天性疾患等が挙げられる。治療対象の心不全は、これらのいずれの原因によるものであってもよい。本実施形態の医薬組成物は、前記のような原因により、心筋組織が損傷して生じる心不全の治療に、好適に適用することができる。心不全に罹患している対象に対して、本実施形態の医薬組成物を投与（心筋細胞群及び／又は心筋球の移植）することにより、損傷した心筋組織を再生させることができ、心臓の機能を改善することができる。本実施形態の医薬組成物は、具体的には（１）損傷した心筋に、移植した収縮性心筋細胞が生着し、直接的にレシピエント心臓の損傷部位の収縮力を増強させる機能、及び／又は（２）血管新生、心臓保護作用、抗炎症作用、抗繊維化作用等を有するパラクライン因子を放出する機能等がある。
＜他の態様＞
　本開示の他の態様は、心不全の治療のための医薬組成物の製造における、第１の態様にかかる心筋細胞群及び第２の態様にかかる心筋球からなる群より選択される少なくとも１種の使用である。
　本開示の他の態様は、心不全の治療に用いるための、第１の態様にかかる心筋細胞群及び第２の態様にかかる心筋球からなる群より選択される少なくとも１種である。
　本開示の他の態様は、心不全の治療における第１の態様にかかる心筋細胞群及び第２の態様にかかる心筋球からなる群より選択される少なくとも１種の使用である。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１：ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群の製造及び解析）
（１）純化されたヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞群の作製
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦｆＩ１４ｓ０４株）（公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団より提供）は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（ニッピ株式会社製）コート培養プレートで、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ１０３Ｃメディア（味の素株式会社製）を使用して維持した。心筋細胞への分化誘導は、４層培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上でＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ３０１培地（味の素株式会社製）を用いて、Tohyama S. et al., Stem Cell Reports. 2017;9:1406-1414に記載の方法で実施した。分化誘導後、脂肪酸合成阻害剤であるオルリスタットを用いて、分化誘導後に得られた細胞群中の残存ヒトｉＰＳ細胞をTanosaki S. et al., iScience. 2020;23:101535、及びTanosaki S. et al., STAR Protoc. 2022;3:101360に記載の方法に従って除去した。次に、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ５０１（味の素株式会社製）を用いて、Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74.、及びTohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37に記載の方法に従って、心筋細胞を純化した。純化後の心筋細胞群は、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ　（Ｚｅｎｏｇｅｎ　Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて凍結保存した。分化誘導のための培養は、７～１５日間行った。残存ヒトｉＰＳ細胞の除去のための培養は、５～１０日間行った。
（２）得られたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群のフローサイトメトリー及び電気生理学的解析
　（１）で作製し凍結したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群を、Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74、及びTohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37に記載の方法に従って解凍し、当該心筋細胞群を解析した。その結果を図１Ａ～図１Ｆに示す。図１Ａ（ｂ）は、解凍後の心筋細胞群の心筋トロポニンＴ陽性率をフローサイトメトリーで解析した結果を示している。ゲーティングにより死細胞を除外し、生細胞中の心筋トロポニンＴ陽性率を求めた。（１）で作製した心筋細胞群は、解凍後の心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性率が９９．８％（図１Ａ（ｂ））であった。なお、上記純化を行う前の細胞群の心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性率は、８１．０％（図１Ａ（ａ））であった。
　また、解凍後の心筋細胞群を、Ichimura H. et al., Sci Rep. 2020;10:11883に記載の方法により、パッチクランプ法で電気生理学的に分析した。具体的には、（１）において凍結保存したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群を解凍し、解凍後の心筋細胞群を４日間培養した。自発拍動速度を調べるため、９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）、及び自発活動電位を、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ　２００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて記録した。活動電位は，細胞内溶液（グルコン酸カリウム（１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ：０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ）、マグネシウム結合アデノシン三リン酸（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ））、及び細胞外溶液（ＮａＣｌ（１３６．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（５．４ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＨＥＰＥＳ（８５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルコース（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ））を用いて測定した。
　６５回（６５細胞について）解析した結果を、図１Ｂ及び１Ｃに示す。図１Ｂに示すとおり、（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群に含まれる細胞は、凍結融解後で解析した結果、心室様活動電位パターンを示した。また、図１Ｃの左図（Ｂｅａｔ　ｒａｔｅ）に示すとおり、自発拍動数は３４±１３回／分であった。図１Ｃの中図（ＭＤＰ）に示すとおり、最大拡張電位（ＭＤＰ）は－５８．４±０．６４ｍＶであった。図１Ｃの右図（ＡＰＤ９０）に示すとおり、９０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）は４６５±２５ｍｓであった。一方、上記（１）の方法で心筋細胞分化工程のみを行い、純化工程を行なわなかった細胞群（ｎ＝７）についても自発拍動数を分析した結果を図１Ｇに示す。図１Ｇから明らかなように純化を行ったヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群では、平均３８回／分程度であるが、純化を行っていない細胞群では平均６０回／分程度と１分あたりの自発拍動数が多かった。
（３）得られたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群の薬物応答性解析
　（１）で作製し凍結保存したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群を解凍し、２．５％ＦＢＳ（ＭＥＲＣ社製）及びピルビン酸ナトリウム（ＭＥＲＣＫ社製、ｃａｔ．Ｓ８６３６）を含有するＭＥＭα（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、ｃａｔ．４０６１０２９）中で１週間程度培養した。培養終了後、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製、ｃａｔ．２００５３）でコーティングした培養容器を用いて、プロベネシド（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製、ｃａｔ．２００６２）及び５ｍＭ　Ｃａｌ５２０ＡＡ　（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製、ｃａｔ．　２１１３１）を含有するＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、ｃａｔ．１４０２５０９２）にて、３７℃で１時間培養した。
　培養後の細胞群を含む培地に、アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール（ＭＥＲＣＫ社製、ｃａｔ．Ｉ６５０４）を０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１μＭとなるようにそれぞれ添加して、カルシウム過渡現象をＦＤＳＳ／μＣＥＬＬ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）によって測定した。また、培養後の細胞群を含む培地に、ＨＣＮチャネルブロッカーであるイバブラジン（ＭＥＲＣＫ社製、ｃａｔ．ＳＭＬ０２ｃ８１）を、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、又は１μＭとなるようにそれぞれ添加した後、同様にカルシウム過渡現象を測定した。さらに、培養後の細胞群を含む培地に、カリウムチャンネルブロッカーであるアミオダロン（ＭＥＲＣＫ社製、　ｃａｔ　Ａ８４２３）を、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、又は１０μＭとなるようにそれぞれ添加した後、同様にカルシウム過渡現象を測定した。
　結果を図１Ｄ及び１Ｅに示す。いずれも（１）に記載の方法で作製した異なる３ロットの細胞群を対象に解析を行っている。図１Ｄ及び１Ｅから明らかなように、（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群は、アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール、ＨＣＮチャネルブロッカーであるイバブラジン、及びカリウムチャンネルブロッカーであるアミオダロンに対して濃度依存的に反応した。
（４）得られたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群の免疫細胞化学的解析
　（１）で作製し凍結したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞群を、Tohyama S. et al., Cell Metab. 2016;23:663-74、及びTohyama S. et al., Cell Stem Cell. 2013;12:127-37に記載の方法に従って解凍した。解凍後の心筋細胞群を、通常行われる方法で、抗アクチニン抗体、抗ビメンチン抗体、及び抗ＤＡＰＩ抗体を用いて免疫染色した。この結果を図１Ｆ（ａ）に示す。（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群に含まれる細胞のほとんどはアクチニン陽性、ビメンチン陰性であった。
　また、同じ細胞群について、抗ＭＬＣ２ｖ抗体、抗ＭＬＣ２ａ抗体及び抗ＤＡＰＩ抗体を用いて免疫染色した結果を、図１Ｆ（ｂ）及び１Ｆ（ｅ）に示す。（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群の８５％はＭＬＣ２ｖ単独陽性の成熟心室筋細胞であったが、７％はＭＬＣ２ａ単独陽性の未熟心筋細胞又はＭＬＣ２ｖ及びＭＬＣ２ａともに陽性の細胞であった（図１Ｆ（ｂ）、１Ｆ（ｅ））。また、同様にしてコネキシン４３とＮ－カドヘリンの発現を解析したところ、いずれも豊富に発現していた（図１Ｆ（ｃ）及び１Ｆ（ｄ））。
　これらの所見を総合すると、（１）で作製したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群は、成体心筋細胞に近い成熟度を持つ、ほぼ純粋な心室筋細胞で構成されていることがわかった。
（実施例２：心筋球の製造及び解析）
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群から心筋球の製造
　実施例１（１）で凍結保存したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群を、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＳ３０１培地に懸濁し、Kawaguchi S. et al., JACC Basic Transl Sci. 2021;6:239-254、又はTabei R. et al, The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2019;38:203-214に記載の方法と同様に、Ｐｒｅｖｅｌｅｘ（登録商標）（日産化学株式会社製）コートした６ウェルプレート（Ｅｌｐｌａｓｉａ　ＲＢ　５００　４００　ＮＡ　６、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に播種し、２日間培養した。ここで培地の半分を２日ごとに交換しながら合計７日間培養した後、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞球（心筋球：ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ）を採取した。
　得られた心筋球群に含まれる心筋球のサイズを、粒子径分布測定装置（ベックマン・コールター社製）を用いて測定した。その結果、当該心筋球群に含まれる心筋球の直径は、平均で約１５０μｍであった。また、この心筋球群の一部を、培養プレートから収穫した直後、及び培養プレートから収穫してから４時間後に、トリプシン／ＥＤＴＡとＡｃｃｕｍａｘの３：１溶液中で、３７℃で１０～１５分処理することにより、心筋球を単独細胞に分解して、トリパンブルー染色した。
　本解析による個々の心筋球中に含まれる細胞の生存率を図２Ａに示す。図２Ａ中、「２５３Ｇ４」は、実施例１（１）に記載の方法で研究用ヒトｉＰＳ細胞株である２５３Ｇ４（京都大学より提供）から分化、純化、及び凍結した心筋細胞群を、本実施例に記載の方法で心筋球作製したものの結果を示す。図２Ａから明らかなように、回収直後（０ｈ）及び４時間後（４ｈ）のトリパンブルー染色による心筋球中の細胞は、２５３Ｇ４株由来とＦｆｌ１４ｓ０４株由来のいずれも９０％以上であり、Ｆｆｌ１４ｓ０４株由来のものは９５．８±２．２％と判定された（Ｎ＝３）。　また、回収された心筋球を含む溶液の一定視野下にある直径５０μｍ以上の心筋球の個数をカウントし、心筋球を構成している心筋細胞数（心筋球細胞数）を算出した。同じ視野下の直径５０μｍ以下の心筋球及びシングルセルの個数（非心筋球細胞数）をカウントして、これらの細胞数を算出した。全細胞数中の心筋球細胞数の比率を以下の式により算出したところ、７４～８６％であった。
　心筋球細胞数の割合（％）＝（心筋球細胞数）／［（心筋球細胞数）＋（非心筋球細胞数）］×１００
（２）ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞球の長期培養
　上記（１）で得られた心筋球をさらに同じ培地で長期間培養を行った。培養開始から２８日後、５６日後、又は８４日後の心筋球を、ＣｙｔｏＲｅｄ溶液（分子量＝３１３．３１、富士フィルム和光純薬株式会社製）を用いて１時間培養した。また、この心筋球をＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ　Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、ＳＡＫＵＲＡ社製）に包埋し、クライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ、Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて１０μｍの厚さの凍結切片とした。切片は、抗ＤＡＰＩ抗体、ヒト特異的心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ、ａｂ５２８６２；Ａｂｃａｍ社製）に対する一次抗体、及びビオチン結合二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて免疫組織学的に解析した。これらの結果を図２Ｃに示す。図２ＣのＡ、Ｄ及びＧに示されるとおり、外部培養液からＣｙｔｏＲｅｄ溶液等が心筋球の中心部を通って浸透していることが観察され、心筋球中の心筋細胞が外部培養液から直接栄養を受けることができることが示された。また、図２ＣのＢ、Ｅ及びＨに示されるように、心筋球は１２週間の培養後も心筋細胞の純度を維持していた。
（３）ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞球の成熟雄ＮＯＧマウスへの移植
　成熟雄ＮＯＧマウス（インビボサイエンス社製）を低用量のイソフランで麻酔し、齧歯類用人工呼吸器で人工呼吸した。第４肋間に左胸郭切開を行い、上記（１）と同様にして製造した改変型ルシフェラーゼ（Ａｋａｌｕｃ）発現ヒトｉＰＳ細胞由来心筋球または改変型ルシフェラーゼ（Ａｋａｌｕｃ）発現ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（１×１０６個）を６０μＬのＰＢＳとともに心筋へ注入した。この移植マウスについて、移植後７日、１４日、２８日後に麻酔し、Ａｋａｌｕｍｉｎｅ　ｎ－Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（富士フィルム株式会社製、２０ｎｍｏｌ／ｇ体重）を腹腔内投与し、投与１０分後にイメージングシステム（ＮＥＷＴＯＮ７．０　ＦＴ５００、Ｖｉｌｂｅｒ社製）を用いて２０ｃｍ×２０ｃｍ、露光時間１分で撮影し、Ｋｕａｎｔソフトウェアを用いて画像解析した。これらの結果を図２Ｄ及び２Ｅに示す。図２Ｄ及び２Ｅから明らかないように、心筋球を移植した方が、心筋細胞を移植したものより動物の心臓で効果的に生存することを確認した。
（実施例３：カニクイザルへの心筋球移植）
（１）カニクイザルにおける心臓の虚血再灌流傷害の誘発
　日本の国内規制とガイドラインに基づき、すべての実験手順は動物実験委員会で検討され、最終的に信州大学学長（第３０００２３号）、慶應義塾大学（Ａ２０２２－１８０号）、及び伊奈リサーチ（第１８０８８号）の承認を得た。心筋球移植の２週間前に、雄４頭、雌６頭の計１０頭のカニクイザル（別名：ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をについて、以下の方法により心筋梗塞を誘発した。手術は、Ichimura H. et al., Sci Rep. 2020;10:11883、又はKobayashi H. et al., Methods Mol Biol. 2021;2320:295-3023に記載された方法で行った。具体的には、カニクイザルをケタミンとキシラジンの筋肉内注射で麻酔し、気管チューブ（直径３．５ｍｍ）を挿管し、２％イソフルランで人工呼吸した。術後疼痛軽減のため、ブプレノルフィンを定常的に皮下投与した。手術中は、血圧、酸素飽和度、及び心電図（ＥＣＧ）をモニターした。適切な血圧を維持するためにフェニレフリンを静脈内投与した。胸骨正中切開後、４－０シルク縫合糸を左前下行（ＬＡＤ）冠動脈中央部の心筋に通し、ポリエチレンチューブに通した。シリコンチューブをポリエチレンチューブの上に置き、縫合糸で縛った。虚血導入前に、１ｍｇ／ｋｇのリドカインと２００Ｕ／ｋｇのヘパリンとを静脈内投与した。その後、再灌流まで１時間ごとに同量のヘパリンを投与した。ＬＡＤ中間部閉塞の１８０分後、チューブを外して心臓を再灌流させた。
（２）移植用心筋球の準備及び輸送
　実施例２（１）により製造された心筋球について、移植当日に採取後生理食塩水で希釈し、エッペンドルフチューブに包装して４℃環境下で移植施設まで輸送した。移植施設到着後直ちに、下述の方法によりカニクイザルに移植した。
（３）心筋球の移植
　上述のように心筋梗塞を誘発した雄４頭、雌６頭のカニクイザルについて、雄雌比が同じになるように２群に分け、片方には上記（２）の心筋球（心筋細胞２×１０７相当）を移植し、もう１群には以下の方法でビヒクルを移植した。移植後１２週目に安楽死させ、組織学的解析を行った。観察期間中は心機能及び不整脈をモニターした。さらに、同様に心筋梗塞を誘導した１０匹（雄４頭、雌６頭）のカニクイザルについて、２群に分けた片方に上記（２）の心筋球（心筋細胞６×１０７個相当）を移植し、もう１群にビヒクルを移植した試験を行った。
　具体的移植法は、次の通りである。心筋梗塞（ＭＩ）誘発後１４日目に、動物に第２胸骨切開を施し、心臓を露出させた。生理食塩水に懸濁した上記（２）の心筋球、又は生理食塩水ビヒクルを、２７ゲージの注射針を用いて１００μＬずつ５回から６回注入し、梗塞部及び境界部に心筋内投与した。免疫抑制は、メチルプレドニゾロンとアバタセプト（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ社製）の静脈内注射と、シクロスポリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＡＧ社製）の皮下注射とによって達成した。移植の１日前から３日間、１日量５０ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロン（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ社製）を投与した。その後、２ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロン（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ社製）を１日１回投与した。アバタセプト（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ社製）は、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で移植の１日前から２週間おきに投与した。シクロスポリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＡＧ社製）の１日投与量は５～１０ｍｇ／ｋｇとし、移植５日目から実験終了まで、末梢血トラフレベルで投与量を調整した。シクロスポリンのトラフレベルを図２Ｆ（心筋細胞２×１０７個相当の心筋球を移植）及び図２Ｇ（心筋細胞６×１０７個相当の心筋球を移植）に示す。
（４）心筋球移植後の動物の解析手段と方法
（心筋梗塞モデルの確認）
　一過性の心電図のＳＴ上昇、及び血清ｃＴｎＴ値の上昇により心筋梗塞の発症が確認された。
（心エコー図検査）
　移植後０日目、２８日目、及び８４日目に、ＶＩＶＩＤ　７システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて心エコー図検査を実施した。ケタミン及びキシラジンを筋肉内注射した後、心臓を傍胸骨空間からの短軸像で観察した。左室拡張末期寸法（ＬＶＥＤＤ）及び左室収縮末期寸法（ＬＶＥＳＤ）をＭモードで測定し、次式により左室内径短絡率（ＦＳ）を算出した。
　ＦＳ（％）＝１００×［（ＬＶＥＤＤ－ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ］
（コンピュータ断層撮影）
　移植２日前、移植後２８日目、及び８４日目に、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を実施した。ＣＴ撮影の方法は、Shiba Y. et al., Nature. 2016;538:388-391に記載されている方法を用いた。具体的には、麻酔をかけた動物を挿管し、２％イソフルランで機械的に換気した。放射線造影剤（Ｉｏｐａｍｉｄｏｌ）を８ｍｌ／ｍｉｎで注入しながら、Ｒ＿ｍＣＴ　ＡＸ（株式会社リガク社製）で心臓を撮像した。心収縮と換気の運動周期は自動的に同期させた。左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）及び左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）は、Ｚｉｏｓｔａｔｉｏｎ２ソフトウェア（Ａｍｉｎ社製）を用いて測定した。左室駆出率（ＬＶＥＦ）は、以下の式により算出した。
　ＬＶＥＦ（％）＝１００×［（ＬＶＥＤＶ－ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＳＶ］
（ホルター心電図）
　ホルター心電図記録は、移植４日前、移植後４、７、１４、２８、４２、５６、７０、及び８３日目に実施した。電極は２リードの心前系に設置し、ホルターレコーダーに接続した。ＥＣＧシステムを保護するために動物にジャケットを着用させ、２４時間のＥＣＧが記録された。心室頻拍は、心室速度が１５０ｂｐｍより速い早発性心室複合体が４回以上連続するものと定義した。持続性心室頻拍は、３０秒以上持続する心室頻拍と定義した。すべての解析は、試験群について盲検化されたオペレーターによって行われた。
（血液検査）
　末梢血を採取し、血漿を分離してＢｒａｉｎ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ（ＢＮＰ）レベルを測定した。末梢血中の心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルは、移植１２日前（心筋梗塞誘発後４８時間）及び移植１０日前（心筋梗塞誘発後９６時間）に測定された。全血を使用して、電気化学発光免疫測定法により、シクロスポリンのトラフレベルを測定した。
（組織学的検査）
　移植後８４日目に、心筋球を移植した動物を安楽死させ、完全な剖検を行った。心臓を採取し、５ｍｍ厚の横切りにし、４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）及びピクロシリウス・レッド（ＰＳＲ）でルーチンに染色し、瘢痕領域を決定した。瘢痕領域は、移植片が瘢痕内にある場合、すべての線維領域（ＰＳＲ染色により赤色で示される）から移植片領域を差し引くことで算出した。
　切片は、ヒト特異的心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ、ａｂ５２８６２；Ａｂｃａｍ社製）に対する一次抗体、及びビオチン結合二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、免疫組織学的に分析した。発色検出には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に続き、ＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。
　切片は、上記と同様に、抗ミオシン軽鎖２Ａ一次抗体（ＭＬＣ－２Ａ；Ｓ５８－２０５、Ｂｅｃｔｏｎ，　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）、抗ミオシン軽鎖２Ｖ一次抗体（ＭＬＣ－２Ｖ；ａｂ９２７２１、Ａｂｃａｍ社製）、抗α－アクチニン一次抗体（ａｂ１３７３４６，Ａｂｃａｍ社製）、抗ビメンチン一次抗体（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ社製）、抗コネキシン４３一次抗体（Ｃｘ４３，ａｂ１１３７０；Ａｂｃａｍ社製）、抗Ｎ－カデリン一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製．）、抗ｃＴｎＴ一次抗体（クローン：１３－１１）、抗ＣＤ４５一次抗体（クローン：２Ｂ１１＆ＰＤ）、抗Ｋｉ６７一次抗体（ａｂ１６６６７，Ａｂｃａｍ社製）、抗パンカドヘリン一次抗体（クローン：ＣＨ－１９）、抗リコパーシック・レクチン一次抗体（トマトレクチン、ダイライト５９４ラベルトマトレクチン；Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と、種特異的蛍光（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とを用いて免疫組織学的に分析した。
　脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓も採取し、４％ＰＦＡで固定した。巨視的な異常所見が検出されない限り、いくつかの切片を無作為に選択し、異所性心筋細胞の生着を検出するためにＨＥ及びヒト特異的ｃＴｎＩに対する抗体を用いて免疫染色を行った。染色した切片は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ　２．０－ＲＳ（浜松ホトニクス株式会社製）又はＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて画像化した。
（統計解析）
　心エコー図、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＢＮＰレベル、グラフト面積及び転帰は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析し、次いでＴｕｋｅｙの多重比較試験による時点間のポストホック比較、及び各時点でのグループ比較のための対応のないｔ検定分析により解析した。ｃＴｎＴの割合は、ＡＮＯＶＡに続いて、ポストホックのＴｕｋｅｙの多重比較テストによって分析した。すべての要約されたデータは、平均±平均の標準誤差として表示される。すべての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて行い、有意性の閾値はＰ＜０．０５とした。
（５）心筋球移植後の動物の解析結果
（組織学的検査）
　実施例３（３）でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（２×１０７個心筋細胞相当）の移植を受けた動物から移植後８４日目（１２週目）に採取した心臓をピクロシリウスレッド染色した。その結果、ビヒクル移植動物と心筋球移植動物との間で有意差はなかった（左心室総面積の９．１２±１．７４％　ｖｓ　５．２４±０．４９％、ｐ＝０．１５）。６×１０７個心筋細胞相当の心筋球を移植した動物と２×１０７個心筋細胞相当の心筋球を移植した動物との比較においても、瘢痕面積は両群間で差がなかった（図４Ｂ（ａ））。移植面積は、２×１０７個心筋細胞相当の心筋球を移植された動物と比べると、６×１０７個心筋細胞相当の心筋球を移植した動物では移植面積が１３倍増加した（図４Ｂ（ｂ）、４Ｂ（ｃ））。この移植片は、瘢痕面積の１１．０±１．６％を占める相当なサイズのものである。また、ヒト特異的心臓トロポニンＩ抗体により移植心筋細胞が同定されるが、移植を受けた５匹中４匹の動物の心臓では、本質的に移植片拒絶反応の兆候はなかった。また、移植動物の心筋細胞は、宿主心筋細胞と同様の筋状パターンを示し、ｃＴｎＴの発現とサルコメア長も同等であったことから（図２Ｂ）、移植後１２週目には宿主心筋細胞とほぼ同じレベルで移植動物の心筋組織中で成熟していることが明らかとなった。
　実施例３（３）でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（６×１０７個心筋細胞相当）の移植を受けた動物の心臓以外の肺、肝臓、腎臓、脾臓では、異所性心筋細胞の移植の兆候は見られなかった（図６Ａ～Ｉ）。移植細胞はすべてｃＴｎＴ陽性心筋細胞であった。ほとんどの心筋細胞がＭＬＣ２ｖ陽性成熟心室サブタイプであったが、ＭＬＣ２ａを発現する心筋細胞はごくわずかであった（図４Ａ（Ｆ））。移植部にはＫｉ６７陽性細胞もあったが、ほとんどはｃＴｎＴ陰性の非心臓細胞であり、移植後１２週目にはＫｉ６７陽性ＣＭはごくわずかであった（図４Ａ（Ｇ））。移植心筋細胞には十分に血管が通っており（図４Ａ（Ｊ）、４Ａ（Ｍ））、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３とｃａｄｈｅｒｉｎを豊富に発現していた（図４Ａ（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｋ）、（Ｌ））。これらの結果は、移植された心筋球が宿主心筋細胞に近い成熟度で生存していることを示すものであった。
（心エコー図検査）
　実施例３（３）でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（２×１０７個心筋細胞相当）の移植を受けた動物及びビヒクルについて、移植前、移植後４週間後、及び１２週間後の心エコー解析による左室内径短絡率（ＦＳ）の計測を行った。その結果を図３Ａに示す。図３Ａから明らかなように、心筋球の移植を受けた動物では移植後４週目に収縮機能が有意に改善された。また、６×１０７個心筋細胞相当の心筋球移植を受けた動物の移植前、移植の４週間後、１２週間後の心エコー図を図５Ａに示し、ＬＶＥＦ測定値を図５Ｂに示す。心エコー図では、心筋球移植動物ではビヒクル移植動物よりも高い分画短縮を示し、この利点は移植後１２週まで持続した。一方、実施例１（１）の工程のうち、心筋細胞分化のみを行い純化工程を行っていないヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群を用いて心筋球を作製し、実施例３（３）と同様の方法でカニクイザルに移植する試験も行った。この非純化心筋球移植動物及びビヒクル移植動物について、移植前、移植後４週間後、及び１２週間後の心エコー解析による左室内径短絡率（ＦＳ）の計測を行った。その結果を、純化したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群から製造した心筋球の移植動物における結果と共に、図５Ｄに示す。図５Ｄから明らかなように、純化したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群から製造した心筋球の移植を受けた動物（ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ（純化））では、純化していないヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群から製造した心筋球の移植を受けた動物（ｈｉＰＳＣ－ＣＳｓ（非純化））に比べ、移植後４週目に収縮機能が有意に改善された。
（ＣＴ検査）
　実施例３でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（６×１０７個心筋細胞相当）の移植を受けた動物及びビヒクル移植動物について、移植２日前、移植後２８日目、及び移植後８４日目にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）を実施した。その結果から算出した左室駆出率（ＬＶＥＦ）を図５Ｂ（ａ）に示す。移植の４週間後及び１２週間後において、心筋球移植動物の左室駆出率はビヒクル移植動物よりも有意に高かった。
（血液検査）
　実施例３（３）でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（２×１０７個心筋細胞相当（図５Ｅ－Ａ及びＢ）、６×１０７個心筋細胞相当（図５Ｅ－Ｃ及びＤ））の移植を受けた動物及びビヒクル移植動物において、移植２日後、移植４日後に末梢血を採取し、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルを測定した。また、移植１４日後に末梢血を採取して血清中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）レベルを測定した。これらの結果を図５Ｅに示す。図５Ｅ－Ａ、Ｃから明らかなように、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋球の移植を受けた動物もビヒクル移植動物も血清ｃＴｎＴ値が上昇しており、虚血状態であることが確認された（図５Ｅ－Ａ及びＣ）。また、血清ＢＮＰ値も、ビヒクル移植動物及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋球の移植を受けた動物で同等であることが確認された。
（ホルター心電図）
　実施例３でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球の移植を受けた動物及びビヒクル移植動物で、移植前、移植後４日目、７日目、及び１４日目、並びにその後隔週でホルター心電図により記録した。ビヒクルのレシピエントでは実質的な心室性不整脈は見られなかった（図３Ｃ（ａ）及び３Ｃ（ｃ））。また、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋球の移植を受けた動物５匹のうち４匹でも、実験期間中、心室性不整脈を全く、あるいはほとんど示さなかった（図３Ｃ（ｂ）及び３Ｃ（ｄ））。なお、移植を受けた動物のうち１匹（図５Ｄ中のＩＤ：Ｃ０６７）は、移植後２週間目まで一過性の心室性頻拍（１日の中で９分１４秒間）を示した（図５Ｄ）が、その後、心室性不整脈は観察されなかった（図３Ｂ、３Ｃ（ｂ）、３Ｃ（ｄ））。
　また、実施例３でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球（６×１０７個心筋細胞相当）の移植を受けた動物及びビヒクル移植動物についても同様の解析を行った。その結果を図５Ｃに示す。図５Ｃから明らかなように、心筋球移植を受けた動物では、４匹中２匹（図５中のＩＤ：Ｃ０９６及びＣ１００）で持続的な心室性不整脈を示したが、１４日目以降は持続的な心室性不整脈は観察されなかった（図５Ｃ（ｂ）、（ｄ））。この心室性不整脈は、最大拍動数１７６ｂｐｍであり、わずかそれぞれ１１分６秒間と１６分３秒間表れただけであった（図５Ｄ）。
　実施例３でヒトｉＰＳ細胞由来心筋球の移植を受けた動物の一部に発生した一過性心室性不整脈は、過去の研究（Shiba Y. et al., Nature. 2016;538:388-391）に比べて不整脈の持続時間が非常に短く、発生頻度も低かった。この不整脈の持続時間の短さや頻度が低いことの説明として、移植したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞が異なることが考えられる。ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の違いとは、具体的には、実施例１で製造した心筋細胞群の心筋細胞の純度の高さや成熟度の高さ、あるいは実施例３でカニクイザルに移植した心筋細胞群中の生細胞比率の高さ等が複合したものであると考えられる。
　本発明者らは、実施例３で行ったようなヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭ）を心筋層に直接移植する方法を行ってきた。この方法は、組織損傷、出血、血栓症、心浮腫等、針注射に関連する潜在的なリスクを伴うが、移植されたＰＳＣ－ＣＭは、隣接するレシピエントの心筋細胞と同調して収縮することが示され、心臓再生療法と呼ばれている。実施例２で製造した心筋球はいくつかの利点があり、心臓再生治療のための理想的な有効成分となりうる。まず、心筋球の作製が容易であり、特定の培養プレートに分散した心筋細胞群を播種し、自然に細胞凝集体を形成させるだけである。この簡便さは、ヒトの心臓再生治療のように、大量の心筋細胞群を準備する場合に特に重要である。第二に、心筋球は通常の生理食塩水中で４℃で少なくとも２４時間生存率を維持するため、この医薬組成物はＣＰＣから複数の医療機関に輸送することができ、移植前に細胞処理をする必要がない。最後に、実施例２で製造した心筋球は添加物を使用せずに効果的にレシピエント心筋組織に生着する。実施例３で行った６×１０７個の心筋細胞を含む心筋球を移植した動物は、移植後１２週間後でも有意な収縮回復を伴う、瘢痕面積の１１．０±１．６％を占める相当なサイズのＣＭグラフトを認めた。
　実施例３で観察された移植後不整脈は、過去の研究（Shiba Y, et al., Nature. 2016;538:388-391、心筋細胞の純度は６３％）と同様の特徴、すなわち、遅効性、非致死性、一過性の出現を示したが、実施例３では、過去の研究に比べて不整脈の持続時間が非常に短く、発生頻度も低かった（図５Ｆ）。移植後の不整脈の頻度が低いことの説明として、移植心筋細胞の由来が異なることが考えられる。過去の研究では同種サル由来ＣＭであり、実施例３では異種ヒト由来ＣＭである。しかし、他の異種移植研究（Liu YW, et al., Nat Biotechnol. 2018;36:597-605.; Chong JJ, et al., Nature. 2014;510:273-7.; Romagnuolo R, et al., Stem Cell Reports. 2019;12:967-981.；Wahiba D. et al.,Circulation.2022;145;1412-1426(US20200407687）では、移植後の持続性心室性不整脈の頻度が高い。
　上記の他の異種移植研究で、例えばLiu YW, et al., Nat Biotechnol. 2018;36:597-605.においては、移植した心筋細胞の純度は８６－９９％であったが、持続性心室性不整脈の頻度及び発現時間が高かった。また、Chong JJ, et al., Nature. 2014;510:273-7.では移植した心筋細胞の純度は７３±１２％であったが、やはり持続性心室性不整脈の頻度及び発現時間が高かった。さらに、Romagnuolo R, et al., Stem Cell Reports. 2019;12:967-981.では、移植した心筋細胞の純度は平均８１．９％±３．９％で、生細胞の比率が８０．７％±２．４％であったが、やはり心室性不整脈の頻度及び発現時間が高かった。Wahiba D. et al.,Circulation.2022;145;1412-1426においては、移植された心筋細胞の自発拍動数が培養２０日目で４５ｂｐｍ、培養４０日目で約３０ｂｐｍであったが心室性不整脈が観察された。
　これらの点から、実施例３で移植後の心室性不整脈の頻度及び発現時間が低いことにおいて、実施例３で移植した心筋球の心筋細胞の純度が９９．８％であること、及び自発拍動数が３４±１３回／分であることの少なくとも２つの条件を満たすことが必要であることが、はじめて示されたものである。また、実施例１で製造されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞は分化工程、純化工程合わせて最大２５日間であり、長期間培養により成熟化させた心筋製造とは異なるものである。
　以上をまとめると、臨床グレードのｉＰＳＣ－ＣＭ製剤を霊長類の梗塞心臓に移植したところ、一過性の非致死性不整脈の発生はあるものの、長期の移植片生存率と収縮力の向上が確認でき、これは許容範囲で管理可能であると考えられる。実施例１で作製されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞群は、心筋トロポニンＴ陽性細胞が９０％以上であり（図１Ａ（ｂ））、自発拍動が０～６０回／分である（図１Ｃ）という性質を示した。また、実施例２で製造された心筋球は、実施例１での分化の開始から３０日以内（凍結保存期間を除く）の心筋細胞群を用いて製造された。これらの特徴を有する心筋細胞群は、移植先の心筋細胞と電気的に統合し、成熟度を保ったまま長く生着することによりレシピエントの心臓の障害部分を再生できると考えられる（図２Ｂ、３Ａ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ）。また、移植を受けた動物の中で、心室性不整脈を示さないものがあり、一部で起こった不整脈も既存の試験より圧倒的にその頻度は低く、また一過性で、対処可能なものであった（図３Ｃ、５Ｃ、５Ｄ）。これらの性質から、実施例１で作製された心筋細胞群及び実施例２で製造された心筋球は、臨床応用に適した細胞製剤をして使用し得る。
　本発明によれば、臨床応用に必要な条件を満たし得る、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞群及び心筋球、並びに前記心筋細胞群及び／又は心筋球を有効成分とする医薬組成物、前記心筋細胞群の製造方法、及び前記心筋球の製造方法が提供される。
　以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。

Claims (10)

  1. 　ヒト多能性幹細胞から分化した心室筋細胞を含む心筋細胞群であって、以下の（１）、（２）及び（３）の特徴を有する心筋細胞群：
    　（１）心筋トロポニンＴ陽性細胞が全生細胞中の９０％以上である、
    　（２）自発拍動が０～６０回／分である、及び
    　（３）分化を開始してから３０日以内である。
  2. 　自発拍動が０～５０回／分である、請求項１に記載の心筋細胞群。
  3. 　請求項１又は２に記載の心筋細胞群、及び前記心筋細胞群をスフェロイド化させた心筋球からなる群より選択される少なくとも１種、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  4. 　前記心筋細胞群の全細胞中の生細胞の比率が８０％以上である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　前記医薬組成物中に含まれる全細胞中の心筋球を構成する細胞の比率が６０％以上である、請求項３に記載の医薬組成物。
  6. 　心不全の治療に使用される、請求項３に記載の医薬組成物。
  7. 　（ａ）ヒト多能性幹細胞を拡大培養する工程と、
    　（ｂ）前記拡大培養されたヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化する条件下で培養し、心筋細胞を６０％以上含む細胞群を製造する工程と、
    　（ｃ）前記細胞群からヒト多能性幹細胞及び非心筋細胞を除去する工程と、
    　を含む、請求項１又は２に記載の心筋細胞群の製造方法。
  8. 　請求項１又は２に記載の心筋細胞群をスフェロイド化させた心筋球。
  9. 　前記心筋球の直径が５０～３００μｍである、請求項８に記載の心筋球。
  10. 　請求項１又は２に記載の心筋細胞群を培地に懸濁した後、底面に微細ウェルを有する培養器で静置培養する工程を含む、心筋球の製造方法。
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