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WO2023281787A1 - スペルミジンを菌体外に生産する乳酸菌 - Google Patents

スペルミジンを菌体外に生産する乳酸菌 Download PDF

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WO2023281787A1
WO2023281787A1 PCT/JP2022/004877 JP2022004877W WO2023281787A1 WO 2023281787 A1 WO2023281787 A1 WO 2023281787A1 JP 2022004877 W JP2022004877 W JP 2022004877W WO 2023281787 A1 WO2023281787 A1 WO 2023281787A1
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WO
WIPO (PCT)
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spermidine
lactic acid
produced
outside
acid bacteria
Prior art date
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Application number
PCT/JP2022/004877
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀之 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto Institute of Technology NUC
Original Assignee
Kyoto Institute of Technology NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto Institute of Technology NUC filed Critical Kyoto Institute of Technology NUC
Priority to JP2023533054A priority Critical patent/JPWO2023281787A1/ja
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to lactic acid bacteria that extracellularly produce spermidine.
  • Non-Patent Document 1 Polyamines are one of the physiologically active substances present in large amounts in cells, and extend healthy life expectancy (Non-Patent Document 1), suppress inflammation (Non-Patent Document 2), enhance intestinal barrier function, and are strong anti-mutagens. functions such as protection from sex and oxygen stress, suppression of age-associated memory decline by intake of a polyamine-rich diet (Non-Patent Document 3), and promotion of longevity by induction of autophagy by spermidine (Non-Patent Document 4). It is In particular, spermidine has been found to extend the healthy life span of humans (Non-Patent Document 5).
  • spermidine can be ingested through foods that are consumed on a daily basis, or if spermidine synthesized by intestinal bacteria can be ingested, the polyamine concentration in the body can be maintained or increased, which is useful.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine outside the bacterium and a method for producing spermidine using such lactic acid bacterium.
  • the present invention includes the embodiments described below.
  • Section 1 A method of using a lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the bacterium to produce spermidine.
  • Section 2 A method of producing spermidine, comprising: A method comprising the steps of culturing lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells, and releasing spermidine into the medium.
  • Item 3 A method for manufacturing pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics or foods, A method comprising the steps of: culturing lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine outside the cells; and adding the extracellularly released spermidine to pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, or foods.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the lactic acid bacterium is Bacillus coagulans.
  • Item 5 The method according to any one of paragraphs 1 to 4, wherein the lactic acid bacterium is Bacillus coagulans with accession number NITE ABP-03479 or Bacillus coagulans DSM1.
  • Item 6 A composition for enhancing spermidine production containing, as an active ingredient, a lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the bacterium.
  • Item 7 A lactic acid bacterium that is Bacillus coagulans with receipt number NITE ABP-03479.
  • Item 8 A composition containing the lactic acid bacterium according to Item 7.
  • Item 9 A composition containing lactic acid bacteria that releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells, for enhancing the production of spermidine in the intestine of a subject.
  • Item 10 The composition according to Item 6, 8 or 9, which is a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic or food.
  • Item 11 A method of enhancing spermidine production in the intestine of a subject, comprising administering to the subject lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells (excluding medical practice).
  • spermidine can be easily produced or produced from lactic acid bacteria. Moreover, according to the present invention, spermidine is released outside the lactic acid bacteria, so extracellular spermidine can be used by the growth of the lactic acid bacteria. Furthermore, recovery of spermidine is easier than the method of disrupting bacterial cells to obtain spermidine, and high-purity spermidine can be obtained more easily and quickly.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the metabolism of polyamines in the human body.
  • Schematic diagram showing the polyamine biosynthetic pathway of known microorganisms and the polyamine synthetic pathway of lactic acid bacterium YF1 (black arrow).
  • YF1 and the type strain DSM1 of Bacillus coagulans obtained from several strain collection institutions were placed on a polyamine-free medium containing no glutamic acid, serine, leucine, arginine, alanine, adenine, and uracil (polyamine-free medium A).
  • a method of using lactic acid bacteria for producing spermidine which releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells.
  • lactic acid bacterium refers to a bacterium that produces lactic acid through metabolism and that satisfies the two conditions of 1) being a Gram-positive bacterium and 2) having a rod-like or spherical shape. Point. Lactic acid bacteria include Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Bifidobacterium, and spore-bearing lactic acid bacteria (Bacillus coagulans, Bacillus coagulans).
  • Lactic acid bacteria that form spores that are highly resistant to external stimuli such as acids and release spermidine produced inside the bacteria outside the bacteria belong to the spore-bearing lactic acid bacteria (Bacillus coagulans).
  • the lactic acid bacterium releases intracellularly-produced spermidine outside the bacterium, that is, whether the lactic acid bacterium biosynthesizes spermidine inside the bacterium and releases the biosynthesized spermidine outside the bacterium.
  • it can be confirmed by culturing lactic acid bacteria in a medium containing no spermidine and checking the presence or absence of spermidine in the medium.
  • the culture conditions may be, for example, those described in the examples below, and a person skilled in the art can confirm whether or not the lactic acid bacterium releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the bacterial cell using ordinary skills.
  • the lactic acid bacterium that releases intracellularly produced spermidine to the outside of the bacterium is a lactic acid bacterium belonging to Bacillus coagulans.
  • the lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine extracellularly is a Bacillus coagulans with a domestic deposit number of NITE P-03479 and an international deposit number of NITE ABP-03479 ( hereinafter referred to as lactic acid bacteria YF1).
  • the present inventor isolated the lactic acid bacterium YF1 for the first time from pickled rape blossoms, which is a traditional fermented food from Matsugasaki, Sakyo-ku, Kyoto.
  • Lactic acid bacterium YF1 was domestically deposited on June 2, 2021 at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818), and Received January 28, 2022 and is readily available.
  • Lactic acid bacterium YF1 can also be isolated by the isolation method shown in the examples below, or by a method modified appropriately according to the starting material and growth conditions.
  • YF1 is an enzyme that catalyzes the conversion of arginine to agmatine (arginine decarboxylase, SpeA), the enzyme that mediates the conversion of agmatine to putrescine (agmatinase, SpeB), and the enzyme that converts putrescine to carboxyspermidine.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is Bacillus coagulans DSM1 (hereinafter referred to as lactic acid bacterium DSM1). Lactobacillus DSM1 is deposited at the DSMZ and is readily available.
  • Lactobacillus YF1 and lactic acid bacterium DSM1 are naturally derived lactic acid bacteria, which has the advantage of being highly safe. These lactic acid bacteria can synthesize spermidine from arginine or ornithine.
  • extracellularly produced refers to the release of intracellularly produced spermidine outside the bacterial cell.
  • a method for producing spermidine which comprises the step of culturing lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells, and releasing spermidine into the medium. be done.
  • a known medium for culturing lactic acid bacteria may be used, or such a known medium may be modified as appropriate. can be done.
  • a polyamine-free medium shown in the present application and a medium known as a medium for E. coli can also be used. Examples of media include MRS medium, Nutrient agar No.2 (Sigma-Aldrich, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Medium No.802 (NBRC), LB (Miller) medium (Difco, Thermo Fisher Scientific), and the like. but not limited to these.
  • the medium may be a culture medium.
  • arginine, ornithine, glutamic acid or a salt thereof, or a combination thereof may be added to the medium in order to promote production of the target spermidine.
  • serine, leucine, arginine, alanine, adenine, and uracil may or may not be added to the medium to drive spermidine production.
  • the culture temperature is, for example, 15°C to 60°C, preferably 37°C to 50°C, for good growth of bacteria.
  • the pH of the medium or culture solution is, for example, 4.8-6.8, preferably 6.0-6.5.
  • the culture time may be determined in consideration of the desired spermidine yield, culture conditions, culture scale, etc., and is, for example, 20 hours to 3 days. Lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine outside the cells can be cultured under anaerobic or aerobic conditions.
  • spermidine is produced in the cells of lactic acid bacteria that release intracellularly produced spermidine to the outside of the cells, and spermidine is released outside the cells.
  • Spermidine released outside the cells may be purified and collected as necessary, or may be used as a culture medium.
  • the method for producing spermidine according to the above embodiment is performed after the step of culturing the lactic acid bacteria that releases intracellularly produced spermidine extracellularly.
  • recovering spermidine recovery of spermidine from a medium or a culture solution can be performed by, for example, filtering or centrifuging the culture supernatant to remove unnecessary substances such as bacterial cells, and then performing known methods such as membrane concentration, isoelectric precipitation, and various types of chromatography. can be carried out after separating and purifying the separation and purification methods alone or in combination.
  • High-purity spermidine can be obtained by performing processing such as recovery.
  • the culture containing both the lactic acid bacteria to be released to the outside may be used as is, or separated, concentrated, and/or dried for various uses.
  • the above production method is an in vivo production method.
  • the production method may be performed on a laboratory scale or on an industrial scale.
  • lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine outside the cells are cultured in a culture medium. good. According to such a method, a food product with an increased spermidine content or a processed product of the food product can be obtained.
  • the food raw material is not particularly limited as long as the lactic acid bacteria that release spermidine produced inside the cells in the medium of the present invention can grow.
  • food ingredients include milk (raw milk, processed milk, yogurt, etc.), vegetables (tomatoes, green peppers, carrots, cabbage, lettuce, radish, spinach, etc.), mushrooms (shiitake mushrooms, shimeji mushrooms, enoki mushrooms, etc.), and fruits.
  • Food is a concept that broadly encompasses anything that can be taken orally, and is explained in detail below.
  • spermidine can be easily produced from lactic acid bacteria.
  • spermidine since spermidine is released outside the cells of lactic acid bacteria, it is not necessary to disrupt the cells to extract spermidine, making it easy to use spermidine and allowing spermidine to be obtained more easily and quickly.
  • a method for producing a drug, a quasi-drug, a cosmetic, or a food comprising the steps of culturing lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells, and Provided is a method comprising the step of adding extracellularly released spermidine to a drug, quasi-drug, cosmetic or food.
  • the process of culturing lactic acid bacteria that releases intracellularly-produced spermidine outside the bacterial cells is as described above for the method of producing spermidine.
  • the spermidine released outside the cells may be recovered as necessary, or may be used as it is in the culture solution.
  • the method for producing the drug, quasi-drug, cosmetic, or food according to the above aspect includes culturing a lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine outside the bacterial cell. After the step of recovering spermidine released outside the cells, and recovering spermidine, the recovered spermidine is added to pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics or foods.
  • Preferred lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cell include, but are not limited to, lactic acid bacterium YF1 and lactic acid bacterium DSM1.
  • the drug, quasi-drug, cosmetic or food added with spermidine extracellularly released according to the above aspect of the present invention is an active ingredient or a drug or drug containing spermidine as an active ingredient. It is a quasi-product, cosmetics or food.
  • the content of spermidine in pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics or foods is not particularly limited, but it is 0.001 to 30 in terms of dry solid content based on the total weight of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics or foods. % by weight is preferred, 0.01 to 10% by weight is more preferred, and 0.1 to 5% by weight is more preferred, but is not limited thereto.
  • a drug, quasi-drug, cosmetic or food according to one embodiment of the present invention is applied to subjects such as humans or non-human animals.
  • Non-human animals include mammals other than humans, birds, fish, and the like. Mammals other than humans include, but are not limited to, rats, mice, guinea pigs, monkeys, rabbits, dogs, cats, horses, pigs, cows, and the like. Birds include, but are not limited to, chickens. Examples of fish include, but are not limited to, scallops, oysters, yellowtail, red sea bream, amberjack, tuna, salmon, horse mackerel, flounder, shrimp, eel, sweetfish, rainbow trout, and carp.
  • the route of administration may be oral or parenteral, eg, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, topical, and the like.
  • spermidine recovered according to the above aspect of the present invention when incorporated into pharmaceuticals, it can be mixed with pharmaceutically acceptable additives and formulated into various formulations suitable for application to the affected area.
  • Pharmaceutically acceptable additives include formulation bases and carriers, excipients, diluents, binders, lubricants, coating agents, disintegrants or Disintegrating agent, stabilizer, preservative, preservative, bulking agent, dispersing agent, wetting agent, buffering agent, solubilizer or solubilizing agent, tonicity agent, pH adjuster, propellant, coloring agent, sweetener Agents, corrigents, flavoring agents, etc. may be appropriately added, and various formulations that can be administered systemically or locally via oral or parenteral administration may be prepared by various known methods.
  • the form of the pharmaceutical of the present invention is not particularly limited, but examples include tablets, sugar-coated tablets, capsules, lozenges, granules, powders, liquids, pills, emulsions, syrups, suspensions, and elixirs.
  • oral agents e.g., subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), drips, suppositories, ointments, lotions, eye drops, sprays, oral Examples include parenteral agents such as skin absorbers, transmucosal absorbers, and patches.
  • ointments When pharmaceuticals are preparations for external use, examples include ointments, creams, gels, liquids, patches (plasters, plasters), foams, sprays, nebulizers, and the like.
  • An ointment refers to a homogeneous semi-solid preparation for external use, including oleaginous ointment, emulsion ointment, and water-soluble ointment.
  • a gel is an external preparation in which a water-insoluble hydrate compound is suspended in an aqueous solution.
  • Liquid preparations refer to liquid preparations for external use, and include lotions, suspensions, emulsions, liniments and the like.
  • a step of adding the spermidine recovered according to the above-described aspect of the present invention to various ingredients normally used in the quasi-drug is included.
  • the form of the quasi-drug may be liquid, emulsion, cream, gel, paste, spray, or the like.
  • the form of the quasi-drug of the present invention is not particularly limited, but examples include tablets, sugar-coated tablets, capsules, troches, granules, powders, liquids, pills, emulsions, syrups, suspension oral agents such as elixirs, injections (e.g., subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), drips, suppositories, ointments, lotions, eye drops, sprays agents, transdermal absorbable agents, transmucosal absorbable agents, and parenteral agents such as patches.
  • injections e.g., subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections
  • drips e.g., suppositories, ointments, lotions, eye drops
  • sprays agents e.g., transdermal absorbable agents, transmucosal absorbable agents, and parenteral agents such as patches.
  • types of quasi-drugs include, for example, ointments, plasters, poultices, milky lotions, creams, gels, lotions, essences, facial cleansers, soaps, bath agents, hair shampoos, hair conditioners, and hair growth agents. include, but are not limited to.
  • the manufacturing process of the cosmetic includes a step of adding the spermidine recovered according to the above aspect of the present invention to ingredients normally used in the cosmetic. can do.
  • Types of cosmetics include ointments, plasters, poultices, milky lotions, creams, gels, lotions, essences, face packs, cleansers, foundations, lipsticks, soaps, bath agents, shampoos, hair conditioners, and hair restorers. but not limited to these.
  • the spermidine produced according to the above aspect of the present invention is added to food, it can be produced by including a step of adding the spermidine produced according to the above aspect of the present invention to the ingredients of the food in the manufacturing process of the food. .
  • food is a concept that broadly encompasses anything that can be taken orally, including beverages.
  • Foods include general foods including health foods, enteral nutritional foods, foods for special dietary uses, foods with health claims including foods for specified health uses, foods with nutrient claims, foods with function claims, pet foods, and the like.
  • Health foods include foods provided under the names of dietary supplements, health supplements, supplements, and the like.
  • the food is a supplement.
  • the spermidine recovered according to the above embodiment can be formulated by a general method together with a food-acceptable carrier.
  • carriers include liquid carriers such as water, ethanol, propylene glycol, glycerin, and solid carriers such as glucose, sucrose, dextrin, cyclodextrin, gum arabic.
  • the food is a food with function claims.
  • the form of food may be any form suitable for eating, such as solid, liquid, granule, grain, powder, capsule, cream, or paste.
  • health foods including supplements, for example, tablets, rounds, capsules, powders, granules, fine granules, lozenges, and liquids (including syrups, emulsions, and suspensions) ) and so on are preferable.
  • Types of food include bread, noodles, confectionery, dairy products, marine and livestock processed foods, oils and fats processed foods, seasonings, various beverages (soft drinks, carbonated drinks, beauty drinks, nutritional drinks, fruit drinks, milk beverages, etc.) and concentrate concentrates and powders for preparation of said beverages, but are not limited to these.
  • the food may contain additives that are normally used depending on the type. Any additive that is acceptable under the Food Sanitation Act can be used as long as it does not cause unfavorable interaction with spermidine, but examples include glucose, sucrose, fructose, and isomerized liquid.
  • Sweeteners such as sugar, aspartame, stevia; Acidulants such as citric acid, malic acid, tartaric acid; Excipients such as dextrin, starch; Vitamins, binders, diluents, flavors, colorings, buffers, thickeners agents, gelling agents, stabilizers, preservatives, emulsifiers, dispersing agents, suspending agents, preservatives and the like.
  • compositions can be used interchangeably with pharmaceutical compositions, quasi-drug compositions, food compositions, or cosmetic compositions, respectively.
  • spermidine-containing pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, or foods can be easily produced.
  • composition for enhancing spermidine production containing, as an active ingredient, lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells.
  • a spermidine production-enhancing composition containing, as an active ingredient, a lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the bacterium is used in an environment where the lactic acid bacterium can grow.
  • the amount of spermidine produced in the environment can be increased compared to when the composition is not used.
  • the lactic acid bacterium that releases intracellularly produced spermidine to the outside of the bacterium is a lactic acid bacterium belonging to Bacillus coagulans.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is lactic acid bacterium YF1 or lactic acid bacterium DSM1.
  • the composition for enhancing spermidine production is a drug, quasi-drug, cosmetic or food.
  • the details of the drug, quasi-drug, cosmetics, or food are as described with respect to the aspect of the method for producing the drug, quasi-drug, cosmetics, or food. If the composition for enhancing spermidine production is in the form of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, or foods, it can be easily applied to subjects, such as humans or non-human animals (ingestion, external use, ingestion, etc. from the subject's perspective). can be done.
  • lactic acid bacterium YF1 is provided.
  • Lactic acid bacterium YF1 is a novel isolated bacterium that can release intracellularly produced spermidine outside the bacterium, making it easy to recover spermidine produced by culturing.
  • a composition containing lactic acid bacterium YF1 is provided.
  • such a composition is a culture obtained after culturing the lactic acid bacterium YF1 in a medium or food material.
  • the medium or food material is as described for the method for producing spermidine of one embodiment of the present invention.
  • the composition containing lactic acid bacteria YF1 is a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic or food.
  • the details of the drug, quasi-drug, cosmetics, or food are as described with respect to the aspect of the method for producing the drug, quasi-drug, cosmetics, or food.
  • a composition containing lactic acid bacteria that releases intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells for enhancing spermidine production in the intestine of a subject is provided.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is a lactic acid bacterium belonging to Bacillus coagulans.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is lactic acid bacterium YF1 or lactic acid bacterium DSM1.
  • the composition for enhancing spermidine production in the intestine of the subject is a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic, or food.
  • the details of the drug, quasi-drug, cosmetics, or food are as described with respect to the aspect of the method for producing the drug, quasi-drug, cosmetics, or food.
  • a method for enhancing spermidine production in the intestine of a subject comprising administering to the subject lactic acid bacteria that release intracellularly-produced spermidine to the outside of the cells.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is a lactic acid bacterium belonging to Bacillus coagulans.
  • the lactic acid bacterium that extracellularly releases intracellularly produced spermidine is lactic acid bacterium YF1 or lactic acid bacterium DSM1.
  • the method of enhancing spermidine production in the intestine of the subject excludes medical intervention.
  • Medical practice includes methods of treating humans.
  • the subject in a preferred embodiment, in the above method, is human, and the method excludes medical procedures. In preferred embodiments, in the above methods, the subject is a human, and the method is a method excluding methods of treating humans.
  • the subject is a non-human animal.
  • the lactic acid bacterium that releases intracellularly-produced spermidine outside the bacterium can be administered in the form of a drug, quasi-drug, cosmetic, or food containing the lactic acid bacterium as an active ingredient.
  • the details of the drug, quasi-drug, cosmetics, or food are as described with respect to the aspect of the method for producing the drug, quasi-drug, cosmetics, or food.
  • Example 1 Isolation and identification of novel lactic acid bacteria1.
  • Isolation method of lactic acid bacteria (1) Preparation of sample 1 g of a sample of pickled rape blossoms was suspended in 10 mL of sterilized physiological saline. This was further serially diluted 10-fold. (2) Culture method An agar plate was prepared by the pour method. 20 mL of MRS agar medium containing 1% CaCO 3 and 1 mL of diluent were stirred until well mixed, and then poured into a petri dish and solidified.
  • the culture temperature was 30° C., and the cells were cultured for 2 to 3 days using Anaeropack Anaerobic for anaerobic culture (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) and an anaerobic jar. Lactic acid dissolves CaCO 3 , thus forming a clear zone around the lactic acid bacteria colonies. Colonies that formed clear zones were picked and streaked twice on MRS plates. Isolated colonies were inoculated into 5 mL MRS medium and cultured for 2-3 days. 1.5 mL of culture was mixed in a vial containing 0.9 mL of sterile 50% glycerol and stored at -80°C.
  • Catalase test Bacterial cells forming colonies were scooped up from the agar medium, suspended in 3% H 2 O 2 and observed. Catalase-positive if foaming is observed, catalase-negative if no foaming is observed. Since most of the lactic acid bacteria are catalase-negative bacteria, foaming is not observed, but some species have pseudocatalase that shows a false positive reaction.
  • Bacillus subtilis strain 168, Escherichia coli K-12 strain, and Bacillus coagulans DSM1 were used as positive controls, and Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei subsp. sakei were used as negative controls.
  • the LC solution [Shimadzu Corporation] was used to control the equipment and collect data.
  • the AUX range is 1.0 AU/V
  • injecting 1 ⁇ L of 10 mM lactate standard solution as a standard gives the optimum peak output.
  • the sample was boiled in advance to denature the protein, and after centrifugation, the supernatant was filtered using Millex-LH (Millipore) and subjected to HPLC.
  • Millex-LH Millex-LH (Millipore)
  • 16S rDNA sequence 5-1 Purification of genomic DNA 1 mL of overnight bacterial culture was centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed. The cell pellet was suspended in 480 ⁇ L of 50 mM EDTA (pH 8). 60 ⁇ L of Lysozyme (10 mg/mL) dissolved in sterile water was added, gently pipetted to mix, and then incubated at 37° C. for 60 minutes. This operation digests the cell wall and efficiently lyses the cells. It was centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes and the supernatant was removed. Thereafter, genomic DNA was purified using the Wizard Genomic DNA Purification Kit protocol (manufactured by Promega).
  • the purified PCR reaction mixture of amplified 16S rDNA was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes) in a TAE buffer system. After electrophoresis, the gel was immersed in TAE buffer containing 0.5 ⁇ g/mL ethidium bromide for about 30 minutes to stain DNA. The position of the DNA was confirmed under ultraviolet irradiation with a wavelength of 365 nm, and the gel portion containing the approximately 1.5 kb DNA fragment was excised. DNA was extracted from the gel using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (manufactured by Promega).
  • the isolate was effervescent and positive for catalase according to the catalase test. Also, according to Gram staining, the isolated bacteria were stained blue and were bacilli. Spore staining of the isolate stained green and vegetative cells pink. Organic acid analysis by HPLC confirmed that the isolated bacteria were producing lactic acid bacteria. Therefore, the isolated bacterium was identified as a kind of lactic acid bacteria. This isolate was named YF1.
  • the 16S rDNA universal primers 27F and 1525R of 16S rDNA were used as primers (Table 5) to amplify the 16S rDNA of the YF1 strain.
  • Table 5 the 16S rDNA universal primers 27F and 1525R of 16S rDNA were used as primers (Table 5) to amplify the 16S rDNA of the YF1 strain.
  • 1,461 of the 1,537 bases were able to read both of the two strands, and 1,509 bases were included, including the portions where only one of the strands could be read.
  • a Blast search of these sequences gave 99% identity with the 16S rDNA of Bacillus coagulans DSM 1.
  • Example 2 Cultivation of Lactic Acid Bacteria on Polyamine-free Medium and Production of Polyamine Bacillus coagulans formed colonies on MRS agar medium at 45° C. under anaerobic conditions. All four strains shown here (YF1, NBRC12583, JCM2257, DSM1) are Bacillus coagulans. The YF1 strain is the strain isolated this time. The other 3 strains are the type strains of Bacillus coagulans that are considered to be the same as the DSM 1 strain preserved in the strain collection.
  • NBRC12583 is NBRC 12583 preserved by the National Institute of Technology and Evaluation, which was ordered in 2021, JCM2257 is JCM 2257 preserved by the Institute of Physical and Chemical Research, and DSM1 is DSM 1 preserved by DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen).
  • the cells were inoculated in medium B and cultured with shaking at 45°C and 120 rpm for 31 hours.
  • the strain was inoculated into the medium prepared and cultured with shaking at 45°C and 120 rpm. After 20 hours and 37 hours, 1 mL each was sampled, the samples were centrifuged, and the supernatant was used for polyamine measurement.
  • Figures 3A-F show the results of aerobic culture
  • Figure 3G shows the results of anaerobic culture.
  • spermidine was observed outside the cells only in the medium in which YF1 was cultured (Fig. 3A-C).
  • the concentration of extracellular spermidine in YF1 increased compared to that after 20 hours of culture, and spermidine was also released outside the cells in DSM1.
  • production of extracellular spermidine was observed in the medium in which YF1 was cultured after 20 hours of culture, but the extracellular spermidine concentration was lower than that in the aerobic culture. No extracellular spermidine production was observed in DSM1 (Fig. 3G).
  • Example 3 Effect of Addition of Glutamic Acid to Medium in Culture of Lactic Acid Bacillus Bacillus coagulans was allowed to form colonies on MRS agar medium at 45° C. under anaerobic conditions (one bottle of Anaeropack anaerobic was placed in a 2.5 L anaerobic jar). Colonies were suspended in 0.5 mL of sterile saline and streaked onto 1.5% agar-solidified polyamine-free medium A (left) and 1.5% agar-solidified polyamine-free medium B (right). . Anaerobically cultured at 45°C and photographed 48 hours later (Fig. 4).
  • Example 4 Cultivation of E. coli in M9 galactose medium containing no polyamine and production of polyamine
  • pre-culture was performed by preparing 10 mL of M9 0.2% galactose medium in a 100 mL Erlenmeyer flask and culturing at 37°C for 20 minutes. Shaking culture was carried out at 120 rpm for hours.
  • compositions of Media and Solutions Tables 6 to 11 show the compositions of the polyamine-free medium A, LB medium, M9 galactose medium, 1 ⁇ M9 solution, MRS medium, and TAE buffer used in Examples. Composition of medium (1.5% agar is added for solid medium)

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Abstract

スペルミジンを生産するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌の使用方法。

Description

スペルミジンを菌体外に生産する乳酸菌
　本発明は、スペルミジンを菌体外に生産する乳酸菌に関する。
　ポリアミンは、細胞内に多量に存在する生理活性物質の１つであって、健康寿命の伸長（非特許文献１）、炎症抑制（非特許文献２）、腸管バリア機能の充実、強い抗変異原性、酸素ストレスからの保護、高ポリアミン食の摂取による加齢に伴う記憶力低下の抑制（非特許文献３）、スペルミジンによるオートファジーの誘発による長寿の促進（非特許文献４）などの機能が知られている。特にスペルミジンは、人の健康寿命を伸長させることが分かってきた（非特許文献５）。
　図１に示すように、ヒトは自分の体内でオルニチンから、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンといったポリアミンを生合成することができるが、加齢と共にこれらポリアミンの生合成能が低下する（非特許文献６及び７）。
　日常的に消費される食品を通じてスペルミジンを摂取するか、又は腸内細菌により合成されたスペルミジンを摂取できれば、体内におけるポリアミン濃度を維持又は増大でき、有用である。
Sci Rep. 4:4548 (2014) Biomol. Ther. 21:1 (2013) Nat. Neurosci. 16:1453 (2013) Nat. Cell Biol. 11:1305 (2009) Alzheimers Res. Ther. 11:36 (2019). Acta Physiol. Scand. 62:352 (1964). J Biochem . 2006 Jan;139(1):81-90
　本発明が解決すべき課題は、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌及びかかる乳酸菌を用いてスペルミジンを生産する方法を提供することにある。
　従来、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は知られていなかったが、本発明者らは、特定の乳酸菌が菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下に記載の実施形態を包含する。
　項１．スペルミジンを生産するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌の使用方法。
　項２．スペルミジンを生産する方法であって、
　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養し、培地中にスペルミジンを放出させる工程を含む方法。
　項３．医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法であって、
　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程、及び
　菌体外に放出されたスペルミジンを医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に添加する工程を含む方法。
　項４．前記乳酸菌がバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）である項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　項５．前記乳酸菌が受領番号がNITE ABP-03479のバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）又はバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）DSM1である項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　項６．菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を有効成分として含有するスペルミジン生産増強用組成物。
　項７．受領番号がNITE ABP-03479のバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）である乳酸菌。
　項８．項７に記載された乳酸菌を含有する組成物。
　項９．対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を含有する組成物。
　項１０．医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である項６，８又は９に記載の組成物。
　項１１．対象に、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を投与することを含む、対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強する方法（医療行為は除く）。
　本発明によれば、乳酸菌からスペルミジンを容易に製造又は生産することができる。また、本発明によれば、スペルミジンは乳酸菌の菌体外に放出されるため、乳酸菌の生育により菌体外のスペルミジンが利用可能となる。さらに、菌体を破砕してスペルミジンを取得する方法に比べて、スペルミジンの回収が容易であり、高純度なスペルミジンをより簡便かつ迅速に得ることができる。
ヒト体内ポリアミンの代謝の模式図。 公知の微生物のポリアミン生合成経路と乳酸菌YF1（黒矢印）のポリアミン合成経路を示す模式図。 YF1といくつかの菌株保存機関から取り寄せたBacillus coagulansの基準株DSM1と同じとされる菌株をグルタミン酸、セリン、ロイシン、アルギニン、アラニン、アデニン、及びウラシルを含まないポリアミン無含有培地（ポリアミンフリー培地Aと称する、表６）に0.5mg/mLのグルタミン酸1Na・1H2Oを添加したポリアミンフリー培地Bで培養したときの菌体外スペルミジン濃度のグラフ。（A）-（F）好気条件下の培養、（G）嫌気条件下の培養。（A）ポリアミンフリー培地B、20時間インキュベーション、（B）ポリアミンフリー培地Bに１ｍＭ濃度となるようアルギニン添加、20時間インキュベーション、（C）ポリアミンフリー培地Bに１ｍＭ濃度となるようオルニチン添加、20時間インキュベーション、（D）ポリアミンフリー培地B、37時間インキュベーション、（E）ポリアミンフリー培地Bに１ｍＭ濃度となるようアルギニン添加、37時間インキュベーション、（F）ポリアミンフリー培地Bに１ｍＭ濃度となるようオルニチン添加、37時間インキュベーション、（G）ポリアミンフリー培地B、20時間インキュベーション。 Bacillus coagulans YF1株とDSM1株を嫌気条件下で培養したときの培養皿の写真。（左）ポリアミンフリー培地Aで培養したときの培養皿の写真、（右）ポリアミンフリー培地Bで培養したときの培養皿の写真。 大腸菌MG1655株の菌体外ポリアミン濃度のグラフ。Put：プトレッシン、Cad：カダベリン、Spd：スペルミジン
　本発明の一態様によれば、スペルミジンを生産するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌の使用方法が提供される。
　本明細書において、「乳酸菌」とは、代謝により乳酸を産生する細菌であって、１）グラム陽性細菌である、及び２）菌の形状が桿状又は球状であるという２つの条件を満たす細菌を指す。乳酸菌には、ラクトバシラス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレイプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、有胞子性乳酸菌（Bacillus coagulans, バチルス　コアグランス）が含まれる。
　酸等の外部刺激に対する抵抗性が強い芽胞を形成し、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は有胞子性乳酸菌（バチルス　コアグランス）に属する。
　乳酸菌が菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌か否か、すなわち乳酸菌が、スペルミジンを菌体内で生合成し、その生合成したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌か否かは、スペルミジンを含まない培地中で乳酸菌を培養し、培地中のスペルミジンの有無により確認することができる。培養条件は例えば後述の実施例に記載されたものであってよく、当業者には菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌か否かを通常の技能より確認することができる。
　一つの実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、バチルス　コアグランスに属する乳酸菌である。
　一つの好ましい実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は国内寄託の受託番号がNITE P-03479、かつ国際寄託の受領番号がNITE ABP-03479のバチルス　コアグランスである（以下、乳酸菌YF1と称する）。乳酸菌YF1は、京都市左京区松ヶ崎の伝統的発酵食品である菜の花漬けから本発明者が初めて単離した。乳酸菌YF1は独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に2021年6月2日に国内寄託され、かつ2022年1月28日に受領されており、容易に入手可能である。
　乳酸菌YF1は、後述の実施例に示す単離方法により、又は出発材料や生育状態に応じて適宜修正を加えた方法により単離することもできる。
　乳酸菌YF1の遺伝子解析の結果、公知のバチルス　コアグランス(Bacillus coagulans) DSM1（DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）に保存）と16S rDNAの塩基配列が99%の相同性を有していた。また図2に示すように、YF1はアルギニンからアグマチンへの変換を触媒する酵素（アルギニンデカルボキシラーゼ、SpeA）、アグマチンからプトレッシンへの変換を媒介する酵素（アグマチナーゼ、SpeB）、プトレッシンからカルボキシスペルミジンへの変換を媒介する酵素（カルボキシスペルミジンデヒドロゲナーゼ，CASDH）、カルボキシスペルミジンからスペルミジンへの変換を媒介する酵素（カルボキシスペルミジンデカルボキシナーゼ，CASDC）のそれぞれをコードする遺伝子を有しており、アルギニンからスペルミジンを合成できることが判明した。GenBankに登録されているDSM 1のSpeAタンパク質のaccession numberはAJH79563.1であり、SpeBタンパク質のaccession numberはAJH80029.1であり、サッカロピンデヒドロゲナーゼファミリータンパク質として登録されているCASDHタンパク質のaccession numberはAJH78404.1であり、カルボキシノルスペルミジンデカルボキシラーゼとして登録されているCASDCのタンパク質のaccession numberはAJH78164.1であった。乳酸菌DSM1と乳酸菌YF1のSpeA、SpeB、CASDH、CASDCのアミノ酸配列の同一性はそれぞれ98%、100%、98%、97%であった（データ非図示）。
　別の好ましい実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌はバチルス　コアグランスであるDSM1（以下、乳酸菌DSM1と称する）である。乳酸菌DSM1は、DSMZに保存されており、容易に入手可能である。
　乳酸菌YF1及び乳酸菌DSM1は天然由来の乳酸菌であり、安全性が高い点でも有利である。これらの乳酸菌はアルギニン又はオルニチンからスペルミジンを合成することができる。
　本明細書において、「菌体外に生産」するとは、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出することを指す。
　本発明の別の態様によれば、スペルミジンを製造する方法であって、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養し、培地中にスペルミジンを放出させる工程を含む方法が提供される。
　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養するための培地としては、乳酸菌の培養用の公知の培地を使用したり、そのような公知の培地を適宜改変して使用することができる。また、本願に示すポリアミン無含有培地や、さらには大腸菌用の培地として知られる培地も使用することができる。培地の例としては、MRS培地、Nutrient agar No.2（Sigma-Aldrich、フジフィルム和光純薬株式会社）Medium No.802（NBRC）、LB(Miller)培地（Difco、Thermo Fisher Scientific）などが挙げられるがこれらに限定されない。培地は培養液であってもよい。
　一実施形態において、目的物であるスペルミジンの生産を促すために、培地中にアルギニン、オルニチン、グルタミン酸もしくはその塩、又はそれらの組み合わせを添加してもよい。別の実施形態において、スペルミジンの生産させるために、セリン、ロイシン、アルギニン、アラニン、アデニン、及びウラシルを培地に添加してもよく、添加しなくてもよい。
　培養温度は、良好な菌の生育のため、例えば15℃～60℃であり、好ましくは37～50℃である。培地又は培養液のｐＨは例えば4.8～6.8であり、好ましくは6.0～6.5である。培養時間は、目的とするスペルミジンの収量、培養条件、培養スケールなどを考慮して決定すればよく、例えば20時間～3日である。菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、嫌気条件で培養することもできるし、好気条件で培養することもできる。
　以上の培養により、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌の菌体内にスペルミジンが生産されるとともに、菌体外にスペルミジンが放出される。菌体外に放出されたスペルミジンは、必要に応じて精製および回収されてもよく、培養液のまま使用してもよい。
　菌体外に放出されたスペルミジンを回収する場合、上記態様のスペルミジンを生産する方法は、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程の後に、菌体外に放出されたスペルミジンを回収する工程を含む。培地又は培養液からのスペルミジンの回収は、例えば培養上清をろ過、遠心分離等することにより菌体等の不要物を除去した後、膜による濃縮、等電点沈殿、各種クロマトグラフィーなどの公知の分離、精製方法を単独で又は組み合わせて分離、精製した後に実施することができる。
　回収等の処理を行うことにより、高純度のスペルミジンを得ることができる。なお、培養により得られた、スペルミジンを含む培養液、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を含む培養物、又は、スペルミジンを含む培養液と菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌との両方を含む培養物をそのまま、又は或いは分離、濃縮、及び／又は乾燥させて、各種利用に供してもよい。
　上記生産方法は生体外（in vivo）における生産方法である。上記生産方法は、実験室のスケールで行われてもよいし、工業的規模のスケールで行われてもよい。
　なお、上記生産方法では、培地で菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養することを説明したが、培地の代わりに、食品原料又は食品中で該乳酸菌を培養してもよい。そのような方法によれば、スペルミジンの含量が増大した食品又は該食品の加工品を得ることができる。
　食品原料は、本発明における培地で菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌が生育可能な限り特に限定されない。食品原料としては、例えば乳類（生乳、加工乳、ヨーグルト等）、野菜類（トマト、ピーマン、人参、キャベツ、レタス、大根、ほうれん草など）、キノコ類（椎茸、シメジ、エノキダケなど） 、果実類（リンゴ、オレンジ、グレープフルーツ、ブドウ、パイナップルなど） 、穀類（米、小麦、大麦、ライ麦など） 、芋類（ジャガイモ、サツマイモ、ナガイモなど） 、豆類（大豆、エンドウ、小豆など） 、肉類（牛肉、豚肉、鶏肉、羊肉等） 、魚介類（アジ、鯖、サンマ、マグロ、アサリ、シジミなど）などが挙げられるがこれらに限定されない。これらの食品原料は、必要に応じて、洗浄、粉砕、圧搾、加熱、混合等の前処理に供される。二種類以上の食品原料を組み合わせて用いることにしてもよい。
　食品は、経口摂取し得るものを広く包含する概念であり、以下に詳しく説明する。
　本発明の上記態様のスペルミジンを生産する方法によれば、乳酸菌からスペルミジンを容易に生産することができる。また、スペルミジンは乳酸菌の菌体外に放出されるため、菌体を破砕してスペルミジンを取り出す必要はなく、スペルミジンの利用が容易であり、スペルミジンをより簡便かつ迅速に得ることができる。
　本発明の別の態様によれば、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法であって、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程、及び菌体外に放出されたスペルミジンを医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に添加する工程を含む方法が提供される。
　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程については、上記のスペルミジンを生産する方法に関して説明した通りである。
　菌体外に放出されたスペルミジンは、必要に応じて回収されてもよく、培養液のまま使用してもよい。菌体外に放出されたスペルミジンを回収する場合、上記態様の医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法は、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程の後に、菌体外に放出されたスペルミジンを回収する工程、及び回収したスペルミジンを含み、回収したスペルミジンが医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に添加される。
　好ましい菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌としては、乳酸菌YF1及び乳酸菌DSM1が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の一実施形態において、本発明の上記態様により菌体外に放出されたスペルミジンを添加した医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品は、スペルミジンを有効成分又は活性成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である。
　医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品中のスペルミジンの含有量は特に限定されないが、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の全重量に対して、乾燥固形分に換算して、0.001～30重量％が好ましく、0.01～10重量％がより好ましく、0.1～5重量％がより好ましいが、これらに限定されない。
　本発明の一実施形態の医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品は、対象、例えばヒト又は非ヒト動物に適用される。非ヒト動物には、ヒトを除く哺乳類、鳥類、魚類等が挙げられる。ヒトを除く哺乳類としてはラット、マウス、モルモット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ等が含まれるがこれらに限定されない。鳥類としてはニワトリが挙げられるがこれに限定されない。魚類としてはホタテ、カキ、ブリ、マダイ、カンパチ、マグロ、サケ、アジ、ヒラメ、エビ、ウナギ、アユ、ニジマス、コイ等が含まれるがこれらに限定されない。投与経路は経口であってもよいし、非経口、例えば静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内、経皮、塗布などあってもよい。
　本発明の上記態様により回収したスペルミジンを医薬品に配合する場合は、薬学的に許容される添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬学的に許容される添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料などを適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。
　本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤） 、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、点眼剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。
　医薬品が外用製剤である場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤（パップ剤、プラスター剤） 、フォーム剤、スプレー剤、噴霧剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤などを含む。
　本発明の上記態様により回収したスペルミジンを医薬部外品に配合する場合は、医薬部外品において通常使用されている各種成分に本発明の上記態様により回収したスペルミジンを添加する工程を含めることによって製造することができる。医薬部外品の形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状などのいずれであってもよい。
　本発明の医薬部外品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤） 、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、点眼剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。
　代わりに、医薬部外品の種類としては、例えば、軟膏、プラスター剤、パップ剤、乳液、クリーム、ジェル、ローション、エッセンス、洗顔料、石鹸、浴用剤、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の上記態様により回収したスペルミジンを化粧品に配合する場合は、その化粧品の製造工程において、化粧品に通常使用される成分に本発明の上記態様により回収したスペルミジンを添加する工程を含めることによって製造することができる。
　化粧品の種類としては、軟膏、プラスター剤、パップ剤、乳液、クリーム、ジェル、ローション、エッセンス、フェイスパック、洗浄剤、ファンデーション、口紅、石鹸、浴用剤、シャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の上記態様により生産したスペルミジンを食品に配合する場合は、その食品の製造工程において、本発明の上記態様により生産したスペルミジンを食品の成分に添加する工程を含めることによって製造することができる。
　本明細書において「食品」とは、経口摂取し得るものを広く包含する概念であり、飲料も含まれる。食品には、健康食品を含む一般食品の他、経腸栄養食品、特別用途食品、特定保健用食品を含む保健機能食品、栄養機能食品、機能性表示食品、ペットフードなどが包含される。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメントなどの名称で提供される食品が含まれる。
　一つの特定の実施形態では、食品はサプリメントである。サプリメントを製造する場合、上記態様により回収したスペルミジンを、食品として許容される担体と共に一般的な方法により製剤化することができる。担体の例としては、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどの液体担体、グルコース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、アラビアガムなどの固体担体を挙げることができる。別の特定の実施形態では、食品は機能性表示食品である。
　食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、サプリメントを含む健康食品などの場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（ シロップ状、乳状、懸濁状を含む） などが好ましい。
　食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（ 清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など） 及び該飲料の濃縮原液及び調整用粉末などが挙げられるが、これらに限定はされない。
　食品には、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、スペルミジンの配合に対して好ましくない相互作用を生じない限り、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビアなどの甘味料； クエン酸、リンゴ酸、酒石酸などの酸味料； デキストリン、デンプンなどの賦形剤； ビタミン類、結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
　医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品はそれぞれ、医薬組成物、医薬部外品組成物、食品組成物又は化粧品組成物と互換的に使用することができる。
　本発明の上記態様の医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法によれば、スペルミジンを含有する医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を容易に生産することができる。
　本発明の別の態様によれば、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を有効成分として含有するスペルミジン生産増強用組成物が提供される。
　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、かかる乳酸菌が生育可能な環境に配置されると、スペルミジンを菌体外に放出する。このため、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を有効成分として含有するスペルミジン生産増強用組成物は、該乳酸菌が生育可能なある環境において、当該スペルミジン生産増強用組成物を使用しない場合に比べて、スペルミジン生産増強用組成物を使用した場合に、該環境におけるスペルミジンの生産量を増大させることができる。
　一つの実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、バチルス　コアグランスに属する乳酸菌である。好ましい実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は乳酸菌YF1又は乳酸菌DSM1である。
　好ましい実施形態では、スペルミジン生産増強用組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である。医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の詳細については、上記医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法の態様に関して説明した通りである。スペルミジン生産増強用組成物を医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の形態にすれば、対象、例えばヒト又は非ヒト動物に簡便に適用（対象側から見ると服用、外用、摂取等）することができる。
　本発明の別の態様によれば、乳酸菌YF1が提供される。
　乳酸菌YF1は新規な単離菌であって、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出できるため、培養により生産されたスペルミジンの回収が容易である。
　本発明の別の態様によれば、乳酸菌YF1を含有する組成物が提供される。本発明の一実施形態では、かかる組成物は、乳酸菌YF1を培地又は食品原料で培養した後に得られた培養物である。培地又は食品原料については、上記本発明の一態様のスペルミジンを製造する方法に関して説明した通りである。
　好ましい実施形態では、乳酸菌YF1を含有する組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である。医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の詳細については、上記医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法の態様に関して説明した通りである。
　本発明の別の態様によれば、対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を含有する組成物が提供される。一つの実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、バチルス　コアグランスに属する乳酸菌である。好ましい実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は乳酸菌YF1又は乳酸菌DSM1である。
　好ましい実施形態では、上記対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強するための組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である。医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の詳細については、上記医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法の態様に関して説明した通りである。
　本発明の別の態様によれば、対象に菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を投与することを含む、対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強する方法が提供される。一つの実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、バチルス　コアグランスに属する乳酸菌である。好ましい実施形態では、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は乳酸菌YF1又は乳酸菌DSM1である。
　好ましい実施形態では、上記対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強する方法は、医療行為を除く。医療行為には、人間を治療する方法が含まれる。
　好ましい実施形態では、上記方法において、対象はヒトであり、かつ上記方法は医療行為を除く方法である。
　好ましい実施形態では、上記方法において、対象はヒトであり、かつ上記方法はヒトを治療する方法を除く方法である。
　好ましい実施形態では、上記方法において、対象は非ヒト動物である。
　好ましい実施形態では、上記菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌は、当該乳酸菌を有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の形態で投与され得る。医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の詳細については、上記医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法の態様に関して説明した通りである。
　本明細書中に引用されているすべての特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１　新規な乳酸菌の単離及び同定
１．乳酸菌の単離法
（１）試料の作成
　菜の花漬けの試料1 gを10 mLの滅菌済み生理食塩水に懸濁した。これを、さらに10倍ずつ段階希釈した。
（２）培養方法
　混釈法による寒天平板作成を行った。1% CaCO3入りMRS寒天培地20 mLと希釈液1 mLをよく混ざり合うまで撹拌したのち、シャーレに流し込み固化させた。培養温度は30℃で、嫌気培養用アネロパック嫌気（三菱ガス化学株式会社）と嫌気ジャーを用いて2～3日間培養した。乳酸はCaCO3を溶かすため、乳酸菌コロニーの周りにはクリアゾーンが形成される。クリアゾーンを形成したコロニーを拾い上げ、MRSプレートで2回画線した。単離できたコロニーを5 mL MRS培地に接種し、2～3日間培養した。培養液1.5 mLを滅菌した50%グリセロール0.9 mLを入れたバイアル中で混ぜ合わせ、-80℃で保存した。
２．乳酸菌の同定法
（１）カタラーゼ試験
　寒天培地からコロニーを形成している菌体をすくい上げ、3％ H2O2に懸濁し観察した。発泡がみられればカタラーゼ陽性、発泡がなければカタラーゼ陰性である。乳酸菌の多くはカタラーゼ陰性菌であるため発泡は見られないが、擬陽性反応を示すシュードカタラーゼをもつ種もある。ポジティブコントロールとしてBacillus subtilis 168株、Escherichia coli K-12株、Bacillus coagulans DSM1を、ネガティブコントロールとしてLactobacillus curvatusとLactobacillus sakei subsp. sakeiを用いた。
（２）グラム染色
　スライドガラスに菌を塗抹し乾燥させた後、火炎固定を行った。
　0.2%ビクトリアブルー溶液〔フェイバーG「ニッスイ」染色液Ａビクトリアブルー；05872〕を検体上に滴下し1分間放置した。
　水洗した後、2%ピクリン酸アルコール溶液〔フェイバーG「ニッスイ」脱色液：05871〕を注ぎ脱色した。
　試料を裏面より水洗し、0.25% サフラニン溶液〔フェイバーG「ニッスイ」染色液Ｂサフラニン；05869〕を滴下し1分間放置した。
　水洗し、乾燥後、1,000～1,500倍で検鏡した。
　グラム陽性菌はビクトリアブルーにより青色に染まり、グラム陰性菌はサフラニンにより赤色に後染色される。乳酸菌はグラム陽性菌であるため、青色に染まる。
（３）芽胞染色
　スライドガラスに菌を塗抹し乾燥させた後、火炎固定を行った。
　5% マラカイトグリーン溶液を検体に滴下し、ガスバーナーで加熱しながら3～4分間染色した。
　試料を裏面より水洗し、0.25% サフラニン溶液を滴下し1分間放置した。
　水洗し、乾燥後、1,000～1,500倍で検鏡した。芽胞は緑色に、栄養菌体はピンク色に染まる。
（４）HPLCによる有機酸分析
　分離した菌が乳酸を生産しているかどうかを調べるためにHPLCを用いて培養上清の有機酸分析を行った。乳酸の分析には、島津高速液体クロマトグラフシステムを採用し、有機酸分析カラムであるAminex HPX87-H（Bio-Rad）(300×7.8 mm) を用いた。HPLC使用条件とHPLCシステムの詳細をそれぞれ表１及び表２に示す。
　検出された化合物の保持時間を、あらかじめ調製した標準液の保持時間と比較することにより各化合物を同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　機器の制御やデータの採取は、LC solution〔島津製作所〕を用いた。AUXレンジ1.0AU/Vのとき、スタンダードとして10 mM の乳酸標準液を1μL注入すると最適なピークの出力が得られる。
　サンプルはあらかじめ煮沸処理によってタンパク質を変性させ、遠心分離後、上清をMillex-LH (Millipore) を用いてフィルトレーションした上でHPLCに供した。
（５）16S rDNA シーケンス
　５－１．ゲノムのDNAの精製
　一晩培養した細菌の培養液1 mLを15,000 rpmで2分間遠心し、上清を除去した。　50 mM EDTA(pH 8) 480μLで菌体ペレットを懸濁した。
　滅菌水に溶かしたLysozyme (10 mg/mL) 60μLを加え、穏やかにピペッティングし混合した後、37℃で60分間インキュベートした。この操作で、細胞壁が消化され、効率良く細胞が溶解される。
　15,000 rpmで2分間、遠心分離し、上清を除去した。
　その後、Wizard Genomic DNA Purification Kitプロトコール（Promega製）を用いてゲノムDNAを精製した。
　５－２．PCRによる16S rDNAの増幅
　16S rDNA遺伝子を増幅するために、KOD-Plus-（東洋紡製）を用いて、マニュアルに従ってPCRを行った。使用したプライマーは27F/1525Rである（配列はDNAシーケンスの所に示す。PCR反応液の組成とPCR反応条件をそれぞれ表３及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　５－３．増幅した16S rDNAの精製
　PCR反応液をTAE緩衝液系の0.8％のアガロースゲル電気泳動（100V, 30分間）に供した。
　電気泳動後のゲルは、0.5μg/mLのエチジウムブロマイドを含むTAE bufferに30分間程度浸漬し、DNAの染色を行った。
　波長を365 nmの紫外線照射下でDNAの位置を確認し、約1.5 kbのDNA断片を含むゲル部分を切り出した。
　Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega製）を用いて、ゲルからDNAを抽出した。
　５－４．DNAシークエンス解析
　DNAの塩基配列の決定は、精製した18μLのDNAサンプルと3.3 pmole/μLのプライマー3μLを混ぜた後、ユーロフィンジェノミクス社に委託した。
　シーケンスに用いたプライマーの配列を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（結果）
　カタラーゼ試験によると、単離株は発泡し、カタラーゼ陽性であった。また、グラム染色によると、単離菌は青色に染まり、桿菌であった。芽胞染色によると、単離菌の芽胞は緑色に、栄養菌体はピンク色に染まった。HPLCによる有機酸分析により、単離菌が乳酸菌を生産していることが確認された。このため、単離菌は乳酸菌の一種であることが同定された。この単離株をYF1と名付けた。
　DNAシークエンス解析では、16S rDNAのユニバーサルプライマーである27Fと1525Rをプライマー（表５）として、YF1株の16S rDNAを増幅し、これらを使ってシーケンスを行っているため、これらのプライマーがアニーリングする塩基はもちろん、そこから少し進んだところからしかDNA配列を読み始められない。2本鎖両方を読めたのは1537塩基中1461塩基、いずれか一方だけの鎖を読めた箇所も含めると1509塩基であった。これらの配列をBlast検索にかけるとBacillus coagulans DSM 1の16S rDNAと99%一致した。
実施例２　ポリアミンフリー培地での乳酸菌の培養及びポリアミンの生産
　Bacillus coagulansは、MRS寒天培地に45℃、嫌気条件でコロニーを形成させた。ここに示した4株（YF1, NBRC12583, JCM2257, DSM1）はいずれもBacillus coagulansである。YF1株は今回分離した株である。他の3株は菌株保存機関に保存されているDSM 1株と同じとされるBacillus coagulansの基準株である。NBRC12583は2021年に取り寄せた製品評価技術基盤機構保存のNBRC 12583、JCM2257は理化学研究所生物材料開発室保存のJCM 2257、DSM1はDSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)保存のDSM 1 である。
（好気培養の場合）前々培養として、100 mL容三角フラスコにLB培地10 mLを調製し、培養温度45℃で20時間、120 rpmで振盪培養した。前々培養液を遠心して集菌し、1×M9溶液10 mLで洗菌した後、再度1×M9溶液10 mLに懸濁した。OD600を測定し、初期濁度がOD600 = 0.1になるように、100 mL容三角フラスコに準備した、ポリアミンフリー培地Aに0.5 mg/mLのグルタミン酸１ナトリウム・H2Oを添加したポリアミンフリー培地Bに植菌し、45℃、120 rpmで31時間振とう培養した。本培養は、前培養液を初期濁度がOD600 = 0.1になるように、100 mL容三角フラスコに準備したポリアミンフリー培地B、同培地Bにそれぞれ1 mMのアルギニンと1 mMのオルニチンを添加した培地に植菌し、45℃、120 rpmで振とう培養した。20時間後と37時間後に1 mLずつサンプリングし、サンプルは遠心後、上清をポリアミン測定に用いた。
（嫌気培養の場合）前培養として、100 mL容三角フラスコにMRS培地5 mLを調製し、培養温度45℃で24時間、120 rpmで振盪培養した。1×M9溶液5 mLで洗菌した後、再度1×M9溶液5 mLに懸濁した。OD600を測定し、初期濁度がOD600 = 0.1になるように、スターラーバーを入れた100 mL容三角フラスコに準備したポリアミンフリー培地B 30 mLに植菌し、45℃、回転速度200 rpmで撹拌しながら24時間嫌気培養した。7 Lの嫌気ジャーにアネロパック嫌気を3コを入れて、1 mLずつサンプリングし、サンプルは遠心後、上清をポリアミン測定に用いた。
（結果）
　図3A-Fに好気培養の結果、図3Gに嫌気培養の結果を示す。
　好気培養の場合、培養20時間後では、YF1を培養した培地でのみ菌体外にスペルミジンが観察された（図3A-C）。
　培養37時間後では、培養20時間に比べてYF1における菌体外スペルミジンの濃度が増大するとともに、DSM1でも菌体外へのスペルミジンの放出が観察された。
　嫌気培養の場合、培養20時間後にYF1 を培養した培地では菌体外スペルミジンの生産が観察されるが、好気培養よりも菌体外スペルミジン濃度が低かった。DSM1 での菌体外スペルミジンの生産は観察されなかった（図3G）。
実施例３　乳酸菌の培養における培地へのグルタミン酸添加の影響
　Bacillus coagulansをMRS寒天培地上に45℃、嫌気条件（2.5 L嫌気ジャーにアネロパック嫌気を１コ入れ）でコロニーを形成させた。コロニーを0.5 mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、ポリアミンフリー培地Aを1.5%の寒天で固めた培地（左）及びポリアミンフリー培地Bを1.5%の寒天で固めた培地（右）に画線した。45℃で嫌気培養し、48時間後に写真撮影した（図4）。
（結果）
　この培養条件下において、YF1はポリアミンフリー培地A,Bのいずれでも生育した。DSM1株もポリアミンフリー培地A,Bのいずれでも生育したものの、生育は悪かった。
実施例４　ポリアミンを含まないM9ガラクトース培地での大腸菌の培養及びポリアミンの生産
　大腸菌MG1655について、前培養は、100 mL容三角フラスコにM9 0.2%ガラクトース培地10 mLを調製し、培養温度37℃で20時間、120 rpmで振盪培養した。本培養は、M9 0.2%ガラクトース培地に1 mM アルギニンを添加、無添加の培地、それぞれ10 mLに、前培養液を用いて初期濁度OD600=0.1になるように植菌し、培養温度37℃で30時間、120 rpmで振盪培養した。培養終了後、遠心分離し、上清をサンプルとした。MG1655の培養後の培地中のプトレッシン、カダベリン、スペルミジンの濃度を測定した。
（結果）
　図5に示すように、大腸菌は、菌体外にプトレッシンのみを蓄積し、スペルミジン、カダベリンは観察されなかった。培地中にアルギニンを添加しても結果は変わらなかった。
培地及び溶液の組成
　実施例で用いたポリアミンフリー培地A、LB培地、M9ガラクトース培地、1×M9溶液、MRS培地、TAE緩衝液の組成を表６～１１に示す。培地の組成（固体培地する場合は、寒天を1.5%添加）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011

Claims (11)

  1. 　スペルミジンを生産するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌の使用方法。
  2. 　スペルミジンを生産する方法であって、
    　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養し、培地中にスペルミジンを放出させる工程を含む方法。
  3. 　医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造するための方法であって、
    　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を培養する工程、及び
    　菌体外に放出されたスペルミジンを医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に添加する工程を含む方法。
  4.   前記乳酸菌がバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記乳酸菌が受領番号がNITE ABP-03479のバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）又はバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）DSM1である請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を有効成分として含有するスペルミジン生産増強用組成物。
  7. 　受領番号がNITE ABP-03479のバチルス　コアグランス（Bacillus coagulans）である乳酸菌。
  8. 　請求項７に記載された乳酸菌を含有する組成物。
  9. 　対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強するための、菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を含有する組成物。
  10. 　医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品である請求項６，８又は９に記載の組成物。
  11. 　対象に菌体内で生産したスペルミジンを菌体外に放出する乳酸菌を投与することを含む、対象の腸内におけるスペルミジンの生産を増強する方法（医療行為は除く）。
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