JP5888701B2 - 高タンパク質分解活性を有するラクトバチルス・ヘルベティカス菌 - Google Patents

Description

本発明は、新規なラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌に関する。また本発明は、該乳酸菌を発酵させて得られる発酵乳、並びに該乳酸菌を含む組成物及び飲食品に関する。さらに本発明は、該乳酸菌を用いるアミノ酸及び／又はペプチドの製造方法に関する。

乳タンパク質や食品タンパク質には機能性ペプチドが潜在することが知られ、乳タンパク質又は食品タンパク質を酵素分解や発酵により加工することで利用しようと試みが行われている。例えば、そのような機能性ペプチドとして、トリペプチドVPP及びIPPがアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害作用を有し、血圧降下作用を示すことが報告されている（特許文献１〜４及び非特許文献１）。

VPP及びIPP以外の乳由来の機能性ペプチドとして、ジペプチドであるYPが、血圧降下作用及び抗不安効果を有するものとして報告されている（特許文献５）。また、ジペプチドであるIP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及びGPは難分解性でACE阻害活性を有するペプチド群であると報告されている（例えば特許文献６）。

一方、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L.ヘルベティカス）は、従来より乳製品の製造に用いられており、タンパク質分解活性が高いことが知られている。より摂取しやすく、加工しやすい発酵乳を提供する目的で、タンパク質分解活性が高く、ペプチド産生に優れるL.ヘルベティカス株がいくつか報告されている（特許文献１〜４及び７、非特許文献１）。

タンパク質は、アミノ酸より構成されるため、より分解を進めることでアミノ酸の供給源にもなりうる。アミノ酸には、栄養、風味以外にさまざまな機能があることが知られている。例えば分岐鎖アミノ酸（BCAA）は、筋肉を構成するタンパク質に含まれ、運動時などに筋肉中のBCAAが消費されてエネルギーとして使われることから、BCAAの補給が重要であることが知られている。またアラニン（Ala）は、肝臓のエネルギー源として知られる糖原性アミノ酸である。アルコールが分解される際に産生されるNADHを消費するため、Alaの存在により肝臓での分解反応が進むと考えられている。また、Alaは味覚の面で旨味を引き出し、塩なれ、酢なれ効果やエグ味などのマスキング効果も知られている。リジン（Lys）は、必須アミノ酸の中で最も不足しやすいアミノ酸と言われている。抗体やホルモン、酵素などの素材として摂取する必要がある。また、Lysは、カルシウム吸収、コラーゲン形成、骨組織の生産にも関連していることが報告されている。セリン（Ser）は、ホスファチジルセリンや、他のアミノ酸など生体内の様々な重要物質の前駆体として重要である。また、血中コレステロールの低下、脳内におけるニューロンの活性化など脳細胞死亡を抑制することで脳の老化防止や肌の保湿成分となることが知られている。

このようなアミノ酸生成のために微生物の利用が積極的に行われている。しかしながら、微生物による発酵物そのものとして摂取することができるアミノ酸については多くの例はない。乳酸菌では、漬物の風味への影響の目的でアミノ酸への分解が優れる乳酸菌スクリーニングがなされるものの、発酵乳そのもので機能性アミノ酸及び機能性ペプチドを摂食するための検討する例は知られていない。

欧州特許第1016709B号 国際公開WO 01/32836号 国際公開WO 2007/096510号 欧州特許第1820850号 欧州特許第0821968号 欧州特許第1661909号 特開平7-274949号公報

Nakamura, Y. et al., J. Dairy Sci. 第78巻第1253-1257頁, 1995年

従って、本発明は、高タンパク質分解活性を有し、ペプチド生成能及び／又はアミノ酸生成能に優れた乳酸菌を提供することを目的とする。また本発明は、アミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含み、かつ風味が良好な発酵乳を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌株の中から、乳タンパク質からのアミノ酸生成能及び機能性ペプチド生成能に優れ、従来の乳酸菌と比べて高いタンパク質分解活性を有する菌株を取得することに成功した。また、当該菌株を使用して、アミノ酸及び／又はペプチドの含有量の多い発酵乳及び組成物が得られ、アミノ酸及び／又はペプチドを製造することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は以下を包含する。
［1］以下の（a）〜（d）のうち少なくとも1つの性質を有することを特徴とするラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌。
（a）獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上生成する
（b）獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上生成する
（c）獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で260μg/ml以上生成する
（d）獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0mg／g以上である
［2］遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、［1］に記載の乳酸菌。
［3］遊離アミノ酸がアラニン、リジン及びセリンから選択される少なくとも１種を含む、［1］又は［2］に記載の乳酸菌。
［4］YPペプチドを60μg/ml以上生成する、［1］〜［3］のいずれかに記載の乳酸菌。
［5］ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株（受託番号 FERM BP-6060）の変異株である、［1］〜［4］のいずれかに記載の乳酸菌。
［6］ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株（受託番号 FERM BP-11271）又はその変異株である、［1］〜［5］のいずれかに記載の乳酸菌。
［7］ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株（受託番号 FERM BP-11271）。

［8］少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を含有することを特徴とする、獣乳からアミノ酸及び／又はペプチドを生成するための組成物。
［9］獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上生成する、［8］に記載の組成物。
［10］遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、［9］に記載の組成物。
［11］遊離アミノ酸がアラニン、リジン及びセリンから選択される少なくとも１種を含む、［9］又は［10］に記載の組成物。
［12］獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上生成する、［8］〜［11］のいずれかに記載の組成物。
［13］獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で260μg/ml以上生成する、［8］〜［12］のいずれかに記載の組成物。
［14］獣乳を発酵させることによりYPペプチドを60μg/ml以上生成する、［8］〜［13］のいずれかに記載の組成物。
［15］獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量が6.0 mg/g以上である、［8］〜［14］のいずれかに記載の組成物。
［16］乳酸菌が［1］〜［7］のいずれかに記載の乳酸菌である、［8］〜［15］のいずれかに記載の組成物。

［17］獣乳を少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を用いて発酵させることにより得られ、以下の（a）〜（d）のうち少なくとも1つの成分を含むことを特徴とする発酵乳。
（a）25μmol/ml以上の遊離アミノ酸
（b）8.5mg/ml以上のペプチド
（c）総量で260μg/ml以上のXPペプチド及び／又はXPPペプチド
（d）6.0mg／g以上であるIPPペプチド及びVPPペプチドの酸度当たりのVPP換算量
［18］少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を含有するものである、［17］に記載の発酵乳。
［19］［1］〜［7］のいずれかに記載の少なくとも1種の乳酸菌を含有するものである、［17］又は［18］に記載の発酵乳。
［20］遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、［17］〜［19］のいずれかに記載の発酵乳。
［21］遊離アミノ酸がアラニン、リジン及びセリンから選択される少なくとも１種を含む、［17］〜［20］のいずれかに記載の発酵乳。
［22］60μg/ml以上のYPペプチドを含む、［17］〜［21］のいずれかに記載の発酵乳。
［23］発酵が30℃以上34℃以下の温度で行われる、［17］〜［22］のいずれかに記載の発酵乳。
［24］血圧降下剤、脳機能改善剤、自律神経調節剤、副交感神経調節剤、交感神経調節剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤、筋肉分解・損傷抑制剤、筋肉増強剤、疲労感の軽減剤、持久力の向上剤、風味改善剤、又はアルコール代謝剤として使用するための、［17］〜［23］のいずれかに記載の発酵乳。
［25］［1］〜［7］のいずれかに記載の少なくとも1種の乳酸菌及び／又はその処理物、並びに／あるいは［17］〜［24］のいずれかに記載の発酵乳及び／又はその処理物を含有することを特徴とする飲食品。

［26］［1］〜［7］のいずれかに記載の少なくとも1種の乳酸菌又は［8］〜［16］のいずれかに記載の組成物を用いて獣乳又は乳タンパク質を発酵させ、得られる発酵物からアミノ酸及び／又はペプチドを採取することを特徴とするアミノ酸及び／又はペプチドの製造方法。
［27］アミノ酸が分岐鎖アミノ酸である、［26］に記載の方法。
［28］アミノ酸がアラニン、リジン及びセリンから選択される少なくとも１種を含む、［26］又は［27］に記載の方法。
［29］ペプチドがXPペプチド及びXPPペプチドからなる群より選択される少なくとも1種である、［26］〜［28］のいずれかに記載の方法。
［30］発酵を30℃以上34℃以下の温度で行う、［26］〜［29］のいずれかに記載の方法。

［31］タンパク質分解活性を有するラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を取得する方法であって、以下の工程：
（a）ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株（受託番号 FERM BP-6060）又はラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株（受託番号 FERM BP-11271）の変異株を調製する工程、及び
（b）該変異株から、以下の（a）〜（d）のうち少なくとも1つの性質を有する菌株を選抜する工程：
（a）獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上生成する
（b）獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上生成する
（c）獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で260μg/ml以上生成する
（d）獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0mg／g以上である、
を含む方法。

［32］［1］〜［7］のいずれかに記載の少なくとも1種の乳酸菌及び／又はその処理物、並びに／あるいは［17］〜［24］のいずれかに記載の発酵乳及び／又はその処理物を調製する工程と、該乳酸菌及び／又はその処理物並びに／あるいは発酵乳及び／又はその処理物を飲食品に配合する工程とを含む、機能性飲食品の製造方法。

本発明により、高タンパク質分解活性を有し、ペプチド生成能及び／又はアミノ酸生成能に優れたラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌が提供される。本乳酸菌が生成するアミノ酸及び／又はペプチドは種々の機能を有するものであり、例えばIPP、VPP、YPなどのペプチドは血圧降下作用を有する。また、本乳酸菌を発酵に使用することで、そのような種々の機能を有する多様なアミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含む発酵乳が得られる。得られる発酵乳の酸度当たりのIPP及びVPPペプチドの量が高いため、従来の発酵の進行に伴って生成される乳酸に起因する高い酸度による問題点がない。すなわち、生成乳酸量に対してアミノ酸及び／又はペプチドを多く含む発酵乳を製造することができるため、少量の発酵乳を使用して、機能性を維持したまま風味が良好で飲食しやすい形態の製品を簡便に製造し消費者へ提供することが可能である。

各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる各アミノ酸量（nmol/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる遊離アミノ酸総量（μmol/ml）（Ａ）及び分岐鎖アミノ酸量（μmol/ml）（Ｂ）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清中のペプチド量（mg/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる機能性ペプチド量（μg/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれるXPペプチド及びXPPペプチドの量（μg/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる各アミノ酸量（nmol/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる遊離アミノ酸総量（μmol/ml）（Ａ）及び分岐鎖アミノ酸量（μmol/ml）（Ｂ）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清中のペプチド量（mg/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる機能性ペプチド量（μg/ml）を示すグラフである。 各乳酸菌を32℃（Ａ）又は37℃（Ｂ）にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれるXPペプチド及びXPPペプチドの量（μg/ml）を示すグラフである。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により各種乳酸菌株由来のゲノムDNAを増幅した断片の電気泳動パターンを示す。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により各種乳酸菌株由来のゲノムDNAを増幅した断片の電気泳動パターンを示す。

以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2010年11月9日に出願された日本国特許出願第2010-250754号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

本発明に係るラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌は、発酵によって糖類から乳酸を産生する乳酸菌の1種であり、本明細書において「本発明の乳酸菌」ともいう。本発明の乳酸菌は、高タンパク質分解活性を有し、アミノ酸生成能及び／又は機能性ペプチド生成能に優れていることを特徴とする。具体的には、下記の（a）〜（d）の性質のうち少なくとも1つを有するものである：
（a）獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上、好ましくは30μmol/ml以上生成する
（b）獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上、好ましくは10mg/ml以上生成する
（c）獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で、260μg/ml以上、好ましくは280μg/ml以上、さらに好ましくは300μg/ml以上生成する
（d）獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0mg／g以上である。

上記（a）〜（d）の性質は、当技術分野で公知の方法により、例えば後述する実施例に記載のように判定することができる。簡単に説明すると、まずラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を、乳タンパク質（例えば獣乳）を基質として30〜45℃、好ましくは30〜34℃において、10〜30時間発酵させ、得られる乳タンパク質発酵物中に含まれる遊離アミノ酸又はペプチドの量、酸度などを測定することにより、上記（a）〜（d）の性質を判定することができる。

（a）に関して、アミノ酸の量は、公知のアミノ酸分析装置、例えば高速液体クロマトグラフィーを使用して測定することができる。本発明の乳酸菌は、獣乳の発酵により遊離アミノ酸を25μmol/ml以上、好ましくは30μmol/ml以上生成するものである。また、5μmol/ml以上、より好ましくは6μmol/ml又は7μmol/ml以上の分岐鎖アミノ酸が生成され、生成される遊離アミノ酸のうち、15％以上、より好ましくは19％又は20％以上が分岐鎖アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）であることが好ましい。また、遊離アミノ酸は、アラニン、リジン及びセリンから選択される少なくとも1種を2000μg/ml以上含むことが好ましく、さらに、少なくとも2種以上のアミノ酸をそれぞれ1500μg/ml含むことが好ましい。

（b）に関して、ペプチドの量は、当技術分野で公知の方法、例えばOPA法（Churchら、J. Dairy Sci. 1983. 66:1219-1227）を用いて測定することができる。本発明の乳酸菌は、獣乳の発酵によりペプチドを8.5mg/ml以上、好ましくは10mg/ml以上生成するものである。

（c）に関して、XPペプチドとは、Xaa-Pro（Xaaは任意のアミノ酸）から構成されるペプチドを意味し、XPペプチドには、例えばYP（Tyr-Pro）、VP（Val-Pro）、IP（Ile-Pro）、AP（Ala-Pro）、EP（Glu-Pro）、RP（Arg-Pro）、QP（Gln-Pro）、TP（Thr-Pro）、MP（Met-Pro）及びGP（Gly-Pro）が含まれる。またXPPペプチドとは、Xaa-Pro-Pro（Xaaは任意のアミノ酸）から構成されるペプチドを意味し、XPPペプチドには、例えばVPP（Val-Pro-Pro）、IPP（Ile-Pro-Pro）及びLPP（Leu-Pro-Pro）が含まれる。なお、本明細書においては、これらのXPペプチド及びXPPペプチドをそれぞれジペプチド及びトリペプチドとも称し、またまとめて「機能性ペプチド」とも称する。XPペプチド及び／又はXPPペプチドの量は、公知のLC/MS装置を使用して測定することができる。本発明の乳酸菌は、獣乳の発酵によりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で、260μg/ml以上、好ましくは280μg/ml以上、より好ましくは300μg/ml以上生成するものである。特にYPペプチドを60μg/ml以上、より好ましくは65μg/ml以上、さらに好ましくは70μg/ml以上生成することが好ましい。

（d）に関して、酸度（発酵乳中の酸濃度）は、公知の中和滴定法により、例えば公知の自動滴定装置を使用して測定することができる。また、IPPペプチド及びVPPペプチドは、（c）に関して記載した方法により測定することができる。本発明の乳酸菌は、獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で5.5mg/ml以上、好ましくは6.0mg/ml以上となるものである。なお、上記量は発酵乳比重1.02として算出している。また、本明細書中で記載するIPPペプチド及びVPPペプチドの量は、ACE阻害活性を基にしたVPP換算量であり、下記式により求めることができる：
（VPP換算量μg/ml）＝IPP量（μg/ml）×1.7＋VPP量（μg/ml）

本発明の乳酸菌は、上記（a）〜（d）のうち少なくとも1つの性質を有するものであるが、上記性質のうち2つ、3つ又は全てを示す乳酸菌が好ましい。例えば、本発明の乳酸菌は、（a）、（b）、（c）又は（d）の性質を有し、あるいは（a）と（b）、（a）と（c）、（a）と（d）、（b）と（c）、（b）と（d）、又は（c）と（d）の性質を有し、あるいは（a）と（b）と（c）、（a）と（b）と（d）、（a）と（c）と（d）、（b）と（c）と（d）の性質を有し、あるいは（a）〜（d）の性質を有するものである。

本発明においては、上述した性質のうち少なくとも1つを示すラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌であれば、本発明の乳酸菌に含まれる。そのような性質を有する好ましいラクトバチルス・ヘルベティカス菌としては、本発明者がラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株（受託番号 FERM BP-6060、特許文献１）を親株として得られる変異株から独自に選抜したラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株が挙げられる。なお、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株及びCP3232株は、本出願人により、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基づく国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6 郵便番号305-8566）に、それぞれ平成9年（1997年）8月15日及び平成22年（2010年）8月4日付でFERM BP-6060及びFERM BP-11271として寄託されている。ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株は、実施例において記載されているように、上記（a）〜（d）の性質を全て有することが確認されている。

また、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株は、上述したように親株であるラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株に由来する変異株である。従って、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株及びラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株の変異株も、上記（a）〜（d）のいずれかの性質を有している蓋然性が高い。そのようなラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株又はラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株に由来する変異株も、上記性質を有する限り本発明に包含される。

本発明において、「変異株」とは、親株から得られた任意の株を意味する。具体的には、親株から自然突然変異や化学的若しくは物理的変異原による誘発変異によって人工的に突然変異の頻度を高める方法、又は特異的な突然変異誘発技術（例えば、遺伝子組換え）により得られる株を意味する。こうした方法により生じた微生物個体を、選別、分離を繰り返し、有用な微生物個体を育種することにより、目的の性質を有する変異株を得ることができる。

ここでいう変異株とは、CM4株、CP3232株又はその変異株を親株として得られる株を含む。すなわち、CM4株に数度の変異処理を行い選択されてきた変異株も、CM4株の変異株に含まれる。

例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株に由来する変異株、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株及びその変異株は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法による乳酸菌のゲノムDNAの増幅断片の分子量分布により、他の乳酸菌株と容易に識別することができる。簡単に説明すると、目的とする乳酸菌について、DNA試料を調製し、例えば配列番号１及び２に示される配列を有するプライマーを用いたPCR法により遺伝子増幅を行い、得られた断片の電気泳動パターンを分析することにより、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株又はラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株に由来する変異株であるか否かを判定することができる。ただし、変異株であるか否かを確認する方法はこの方法に限定されるものではなく、上記のPCR断片が検出されない場合であっても、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株に由来する変異株、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株の変異株であることもあり、他の遺伝子断片についての検出や、菌学的性質などの当技術分野で公知の手法により変異株であるかどうかを確認することができる。

このような変異株を、上述した（a）〜（d）の性質を有するか否かを判定することによって、本発明の乳酸菌として使用することができる菌株を取得することができる。

本発明の乳酸菌は、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を使用して、適当な条件下で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはラクトース、グルコース、ガラクトース、廃糖蜜などを使用することができ、窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばMRS液体培地、GAM培地、BL培地、Briggs Liver Broth、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。好ましくは、滅菌した脱脂粉乳を含む乳培地を使用する。

また本発明の乳酸菌の培養は、20℃から50℃、好ましくは25℃から42℃、より好ましくは28℃から37℃において、嫌気条件下で行う。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。また、嫌気条件下とは、乳酸菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックス又は脱酸素剤を入れた密閉容器若しくは袋などを使用することにより、あるいは単に培養容器を密閉することにより、嫌気条件とすることができる。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などである。また、培養時間は3時間から96時間とすることができる。培養開始時の培地のpHは4.0〜8.0に維持することが好ましい。

本発明の乳酸菌の具体的な調製例を簡単に説明する。例えばラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株を用いる場合には、滅菌した乳培地（9.00％(w/w)還元脱脂粉乳を含む乳培地など）に乳酸菌を約5％の割合で植菌し、28〜37℃で一晩（約18〜28時間）かけて培養を行う。この培養操作を繰り返し行うことが好ましい。

培養後、得られる培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製及び／又は濾過等による固液分離や滅菌操作を行ってもよい。

また、目的とする性質を有する限り、本発明の乳酸菌に処理を行って得られる乳酸菌の処理物を用いてもよいし、また乳酸菌の処理物にさらなる処理を行ってもよい。そのような処理の例を以下に記載する。

乳酸菌の菌体及び／又は処理物を用いて生乳、脱脂乳又は豆乳を発酵することにより、発酵物を調製することができる。例えば、乳酸菌又は他の処理を行った乳酸菌を、生乳、脱脂乳又は豆乳などに接種し、当技術分野で公知の乳酸菌発酵条件（上述した乳酸菌培養の条件とほぼ同じである）にて発酵を行う。得られる発酵物は、そのまま使用してもよいし、又は濾過、滅菌、希釈、濃縮などの他の処理を行ってもよい。

乳酸菌の菌体及び／又は処理物を適当な溶媒に懸濁又は希釈することによって、懸濁物又は希釈物として調製することができる。使用することができる溶媒としては、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。

乳酸菌の菌体及び／又は処理物を滅菌処理によって、滅菌処理物として調製することができる。乳酸菌の菌体及び／又は処理物を滅菌処理するには、例えば、濾過滅菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加圧式殺菌などの公知の滅菌処理を行うことができる。

また、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を加熱処理することにより、加熱処理物として調製することができる。加熱処理物を調製するには、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を、一定時間、例えば約10分〜1時間（例えば約10〜20分）にわたり、高温処理（例えば80〜150℃）する。

乳酸菌の菌体及び／又は処理物を破砕、細砕又は磨砕することによって、破砕物、無細胞抽出物を調製することができる。例えばそのような破砕は、物理的破砕（撹拌、フィルター濾過など）、酵素溶解処理、薬品処理、あるいは自己溶解処理などによって行うことができる。

乳酸菌の菌体及び／又は処理物を、適当な水性溶媒又は有機溶媒を用いて抽出することによって、抽出物を得ることができる。抽出方法としては、水性溶媒又は有機溶媒を抽出溶媒として用いる抽出方法であれば特に制限されないが、上記の乳酸菌又は乳酸菌に他の処理を行った処理物を、水性又は有機溶媒（例えば水、メタノール、エタノールなど）中に浸漬、攪拌又は還流する方法など公知の方法を挙げることができる。

また、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を乾燥して粉状物（粉末）又は粒状物とすることができる。具体的な乾燥方法としては、特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて採用できる。その際、必要に応じて通常用いられる賦形剤を添加してもよい。
なお、本発明の乳酸菌は、湿潤菌体であっても又は乾燥菌体であってもよい。

上述した処理は、単一の処理を行ってもよいし、あるいは複数を適宜組み合わせて行ってもよい。本発明においては、このような処理物も乳酸菌と同様に用いることができる。

上記で得られた乳酸菌及び／又は処理物は、単独で又は他の成分と共に、獣乳からアミノ酸及び／又はペプチドの生成のための組成物として用いることができる。すなわち本発明は、少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を含有する、アミノ酸及び／又はペプチドを生成するための組成物を提供する。

本発明の組成物は、獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上、好ましくは30μmol/ml以上生成することができるものである。好ましくは、生成される遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である。あるいは又はさらに、本発明の組成物は、獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上、好ましくは10mg/ml以上生成することができるものである。あるいは又はさらに、本発明の組成物は、獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で、260μg/ml以上、好ましくは280μg/ml、より好ましくは300μg/ml以上生成することができるものである。あるいは又はさらに、本発明の組成物は、獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0mg／g以上となるものである。

本発明の組成物は、有効成分として上述した乳酸菌及び／又は処理物を含むものであるが、1種の乳酸菌及び／又は処理物を含んでもよいし、複数の異なる乳酸菌及び／又は処理物、さらには異なる処理を行った複数の乳酸菌処理物を組み合わせて含んでもよい。なお、本発明の組成物には乳酸菌の菌体が1×10⁷個/ml以上含まれることが好ましい。

また本発明の組成物には、有効成分である乳酸菌に加えて、目的とする作用を阻害しない限り、当技術分野で公知の添加剤及び賦形剤を単独で又は複数組み合わせて添加してもよい。また、本発明の組成物は、乳酸菌の発酵を促進するような添加物（例えばグルタミン酸や、グルコースなどの糖）を含んでもよい。本発明の組成物の形態は特に制限されないが、懸濁液、顆粒、粉末、カプセルなどとすることができる。本発明の組成物中の有効成分（乳酸菌）の含有量は、その形態により異なるが、乳酸菌の量として、通常は、0.0001〜99質量％、好ましくは0.001〜80質量％、より好ましくは0.001〜75質量％の範囲である。また、本発明の組成物に含まれる乳酸菌は、約10⁷個/g〜約10¹²個/gである。

本発明の乳酸菌又は組成物を用いて、獣乳を発酵することにより、アミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含む発酵乳組成物が得られる。従って、本発明は、獣乳を少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を用いて発酵させることにより得られ、以下の（a）〜（d）のうち少なくとも1つの成分を含むことを特徴とする発酵乳を提供する：
（a）25μmol/ml以上、好ましくは30μmol/mlの遊離アミノ酸（そのうち15％以上が分岐鎖アミノ酸であることが好ましい）
（b）8.5mg/ml以上、好ましくは10mg/ml以上のペプチド
（c）総量で260μg/ml以上、好ましくは280μg/ml以上、より好ましくは300μg/ml以上のXPペプチド及び／又はXPPペプチド
（d）6.0mg／g以上であるIPPペプチド及びVPPペプチドの酸度当たりのVPP換算量。

本発明の発酵乳は、本発明の乳酸菌又は組成物を使用して当技術分野で公知の方法に従って発酵処理を行うことにより調製することができる。発酵処理は、獣乳に少なくとも1種の乳酸菌を添加し、適当な条件下で培養することにより行うことができる。獣乳としては、牛乳、山羊乳、馬乳などの哺乳動物由来の乳汁、又はこれらの脱脂乳、還元乳、コンデンスミルクなどの加工乳を用いることができ、1種の乳汁を使用してもよいし、複数種の乳汁や加工乳を組み合わせて使用してもよい。乳の固形分濃度は特に限定されないが、例えば、脱脂乳を用いる場合の無脂乳固形分濃度は、3〜15質量％程度、好ましくは6〜15質量％である。獣乳は、発酵処理の前に殺菌処理を行ってもよい。獣乳には、乳酸菌の発酵を促進するような添加物（例えばグルタミン酸、又はグルコースなどの糖）を加えてもよい。あるいは、獣乳から乳タンパク質成分を単離し、そのような乳タンパク質成分を基質として発酵を行うことも可能である。

獣乳に添加する乳酸菌は、前培養を行った乳酸菌をスターターとして用いることが好ましい。また添加する乳酸菌量は、限定されるものではないが、通常乾燥乳酸菌体換算で0.005〜10質量％であり、好ましくは0.05〜5質量％である。使用する乳酸菌は、乳酸菌培養物のままであってもよいし、培養した乳酸菌を濾過や遠心分離により培地から分離したものであってもよいし、培地から分離後に凍結又は凍結乾燥して保存しておいたものであってもよい。

発酵処理の条件は、上述した乳酸菌の培養条件とほぼ同じであり、20℃から50℃、好ましくは25℃から42℃、より好ましくは28℃から37℃において、嫌気条件下で行う。なお、後述する実施例において、本発明の乳酸菌は30〜34℃（約32℃）において、分岐鎖アミノ酸及び機能性ペプチドを特に多く生成した。そのため、30〜34℃において発酵処理を行うことが特に好ましい。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。発酵処理は、静置培養、振とう培養、タンク培養などの形式により行うことができる。また、発酵時間は、3時間から96時間、好ましくは12〜36時間とすることができる。発酵槽のpH及び酸度を測定しながら発酵を行うことが好ましく、pHは4.0〜8.0に維持することが好ましい。

上述のようにして得られる発酵乳は、所望の成分を含む限り、発酵乳に処理を行ってもよいし、また発酵乳の処理物にさらなる処理を行ってもよい。そのような処理の例を以下に記載する。

発酵乳及び／又は発酵乳処理物を適当な溶媒に懸濁又は希釈することによって、懸濁物又は希釈物として調製することができる。使用することができる溶媒としては、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。

発酵乳及び／又は発酵乳処理物を滅菌処理することによって、滅菌処理物として調製することができる。発酵乳及び／又は発酵乳処理物を滅菌処理するには、例えば、濾過滅菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加圧式殺菌などの公知の滅菌処理を行うことができる。

発酵乳及び／又は発酵乳処理物を加熱処理することにより、加熱処理物として調製することができる。加熱処理物を調製するには、一定時間、例えば約10分〜1時間（例えば約10〜20分）にわたり、高温処理（例えば80〜150℃）する。

また、発酵乳及び／又は発酵乳処理物を濾過又は遠心分離することにより、その上清（ホエー）を調製することができる。

さらに発酵乳及び／又は発酵乳処理物を乾燥して粉状物（粉末）又は粒状物とすることができる。具体的な乾燥方法としては、特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて採用できる。その際、必要に応じて通常用いられる賦形剤を添加してもよい。

上述した処理は、単一の処理を行ってもよいし、あるいは複数を適宜組み合わせて行ってもよい。本発明には、このような発酵乳処理物も包含される。

本発明の発酵乳又は処理物は、各種アミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含むものであるため、そのアミノ酸及び／又はペプチドの性質を利用した用途に用いることができる。例えばアミノ酸は、風味、エネルギー源、精神安定作用、成長促進作用などに関わっているため、本発明の発酵乳を風味改善剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤として用いることができる。また、バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む分岐鎖アミノ酸（BCAA）は必須アミノ酸であり、筋肉増強や肉体疲労予防のために用いることができる。また、アラニン（Ala）の存在により肝臓での分解反応が進むと考えられている。またAlaは、味覚の面で旨味を引き出し、塩なれ、酢なれ効果やエグ味などのマスキング効果も知られている。リジン（Lys）は、必須アミノ酸の中で最も不足しやすいアミノ酸と言われており、抗体やホルモン、酵素などの素材として摂取する必要がある。またLysは、カルシウム吸収、コラーゲン形成、骨組織の生産にも関連していることが報告されている。セリン（Ser）は、ホスファチジルセリンや、他のアミノ酸など生体内の様々な重要物質の前駆体として重要である。また、血中コレステロールの低下、脳内におけるニューロンの活性化など脳細胞死亡を抑制することで脳の老化防止や肌の保湿成分となることが知られている。そのため、本発明の発酵乳又は処理物は、風味改善剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤、脳機能改善剤、自律神経調節剤、副交感神経調節剤、交感神経調節剤、筋肉分解・損傷抑制剤、筋肉増強剤、疲労感の軽減剤、持久力の向上剤、アルコール代謝剤などとして用いることができる。さらにVPPペプチド及びIPPペプチドはACE阻害活性及びリラックス効果を有し、LPPペプチドはACE阻害活性を有し、YPペプチドは血圧降下作用及び抗不安作用を有し、VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及びGPペプチドは生体内非分解性であり、ACE阻害活性を有することから、本発明の発酵乳又は処理物は血圧降下剤及びストレス緩和剤として用いることができる。

また、得られる発酵乳又はその処理物から、公知の分離・精製法を用いて、各種アミノ酸及び／又はペプチド成分、あるいはそれらの成分を含む画分を精製してもよい。

本発明の発酵乳又はその処理物は、上述した（a）〜（d）の成分のうち少なくとも1つの成分（例えばアミノ酸、ペプチド）を含むものであるが、複数の成分を組み合わせて含んでもよい。また、発酵乳又はその処理物中には、発酵処理に使用した乳酸菌が含まれていてもよい。

また本発明の発酵乳には、目的とする作用を阻害しない限り、後述する添加剤、他の公知の血圧降下剤、ストレス緩和剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤、筋肉増強剤、風味改善剤などを単独又は複数組み合わせて添加してもよい。

本発明の発酵乳の形態は特に制限されないが、例えば、発酵処理後に得られる発酵乳のままの懸濁液の形態、並びに当技術分野で公知の手法により処理して得られる錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤などの形態とすることができる。発酵乳は、経口的に投与又は摂取することが容易な形態とするのが好ましい。なお、懸濁液などの液体は、投与又は摂取直前に水又は他の適当な媒体に懸濁する形であってもよく、また錠剤、顆粒剤の場合には周知の方法でその表面をコーティングしてもよい。

上述した形態の発酵乳は、発酵処理により得られる発酵乳に、通常用いられる賦形剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、滑沢剤、保存剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤、芳香剤、酸味料、着色剤などの添加剤を配合し、常法に従って製造することができる。例えば、発酵乳を医薬又は健康増進目的で使用する場合には、薬学的に許容される担体又は添加剤を配合することができる。そのような薬学的に許容される担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。

さらに、本発明の発酵乳には、医薬、飲食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤やその他種々の物質を共存させてもよい。このような物質や添加剤としては、各種油脂（例えば、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油などの植物油、牛脂、イワシ油などの動物油脂）、生薬（例えばロイヤルゼリー、人参など）、アミノ酸（例えばグルタミン、システイン、ロイシン、アルギニンなど）、多価アルコール（例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール、例としてソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトールなど）、天然高分子（例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテン又はグルテン加水分解物、レシチン、澱粉、デキストリンなど）、ビタミン（例えばビタミンC、ビタミンB群など）、ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄など）、食物繊維（例えばマンナン、ペクチン、ヘミセルロースなど）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなど）、精製水、賦形剤（例えばブドウ糖、コーンスターチ、乳糖、デキストリンなど）、安定剤、pH調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料及び香料などが挙げられる。

また、本発明の発酵乳には、上記有効成分以外の機能性成分又は添加剤として、例えば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムQ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、トウガラシエキス、ショウガエキス、カカオエキス、ガラナエキス、ガルシニアエキス、テアニン、γ-アミノ酪酸、カプサイシン、カプシエイト、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドンなどを配合することができる。これら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められる。

本発明の発酵乳を投与する又は摂取させる対象は、脊椎動物、具体的には、哺乳動物、例えばヒト、霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トリなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、さらには爬虫類及び鳥類である。特に、アミノ酸及び／又はペプチドの摂取が望まれる対象、例えば高血圧患者、ストレスによる症状を示すヒト、運動前後のヒトなどが対象として好ましい。

本発明の発酵乳の投与又は摂取量は、対象の年齢及び体重、投与・摂取経路、投与・摂取回数、投与目的などにより異なり、目的とする作用を達成できるように当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。発酵乳に含まれる有効成分の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すればよい。本発明の発酵乳は安全性の高いものであるため、摂取量をさらに増やすこともできる。1日当たりの摂取量は、1回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。また、その投与又は摂取の頻度も、特に限定されず、投与・摂取経路、対象の年齢及び体重、目的とする効果の種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。

本発明の発酵乳の投与・摂取経路は特に限定されないが、経口投与又は経口摂取することが好ましい。例えば、飲食品又は飼料中に配合して、あるいは錠剤や顆粒剤などとして、経口的に投与又は摂取することが可能である。

本発明の発酵乳は、他の医薬、治療又は予防法等と併用してもよい。このような他の医薬は、本発明の発酵乳と共に一製剤を成していてもよいし、また、別々の製剤であって同時に又は間隔を空けて投与してもよい。

上述したように、本発明の発酵乳は、血圧降下剤、脳機能改善剤、自律神経調節剤、副交感神経調節剤、交感神経調節剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤、筋肉分解・損傷抑制剤、筋肉増強剤、疲労感の軽減剤、持久力の向上剤、風味改善剤、又はアルコール代謝剤などとして用いることができる。

本発明の乳酸菌及び発酵乳は、安全性が高く長期間の継続的摂取が容易であるため、飲食品及び飼料にも使用できる。本発明の乳酸菌は、様々な機能を有するアミノ酸及び／又はペプチドを多く生成するものであり、また本発明の発酵乳はそのようなアミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含むものである。さらに、本発明の乳酸菌は酸度に対する機能性ペプチドの生成量が高く、酸味を抑えることができ、様々な飲食品に添加しても飲食品自体の風味を阻害しない。そのため、本発明の乳酸菌及び発酵乳は、種々の飲食品に添加して継続的に摂取することができ、様々な効果が期待される。

従って、本発明の飲食品は、本発明の少なくとも1種の乳酸菌及び／又はその処理物、並びに／あるいは本発明の発酵乳及び／又はその処理物を含有する。本発明において、飲食品には飲料も包含される。本発明の飲食品には、アミノ酸及び／又はペプチドにより健康増進を図る健康飲食品、機能性飲食品、特定保健用飲食品などの他、本発明の乳酸菌及び発酵乳を配合できる、全ての飲食品が含まれる。

本発明の飲食品として、機能性飲食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性飲食品」は、生体に対して一定の機能性を有する飲食品を意味し、例えば、特定保健用飲食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）及び栄養機能飲食品を含む保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容飲食品（例えばダイエット飲食品）などのいわゆる健康飲食品全般を包含する。

飲食品の具体例としては、経管経腸栄養剤などの流動食、錠菓、錠剤、チュアブル錠、錠剤、粉剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤及びドリンク剤などの製剤形態の健康飲食品及び栄養補助飲食品；緑茶、ウーロン茶及び紅茶などの茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、野菜飲料、果汁飲料、醗酵野菜飲料、醗酵果汁飲料、発酵乳飲料、発酵乳（ドリンクヨーグルト、固形ヨーグルト）、発酵乳飲料（殺菌）、乳酸菌飲料、濃縮タイプ飲料、濃縮固形物、乳飲料（コーヒー牛乳など）、粉末飲料、ココア飲料、牛乳並びに精製水などの飲料；バター、ジャム、ふりかけ及びマーガリンなどのスプレッド類；マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、ヨーグルト、スープ又はソース類、菓子（例えば、ビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）などが挙げられる。

本発明の飲食品は、本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳のほかに、その飲食品の製造に用いられる他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸などの酸味料、安定剤、フレーバー）などを配合して、常法に従って製造することができる。

本発明の飲食品において、乳酸菌、発酵乳又はそれらの処理物の配合量は、飲食品の形態や求められる食味又は食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。このように本発明の飲食品を、望ましい摂取量を管理できる形態で飲食することにより、該飲食品を用いた血圧降下、ストレス緩和、栄養補給、エネルギー補助、筋肉増強、脳機能改善、自律神経調節、副交感神経調節、交感神経調節、筋肉分解・損傷抑制、筋肉増強、疲労感の軽減、持久力の向上、アルコール代謝などの方法が提供される。

本発明の飲食品は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって製造することができる。例えば、本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）を、液体状、ゲル状、固体状、粉末状又は顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合することができる。あるいは本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）を、飲食品の原料中に直接混合又は溶解してもよい。乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）は、飲食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付けてもよい。乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）は、飲食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させてもよい。乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）を入れたカプセルなどを調剤してもよい。乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳（処理物）に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明の飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。

本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナトリウム等）、着色料（クチナシ色素、赤102等）、香料（オレンジ香料等）、甘味料（ステビア、アスパルテーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDTA二ナトリウム、ビタミンC等）、pH調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）等、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンA等）、賦形剤（水溶性デキストリン等）等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。

本発明の飲食品は、上述したとおり、アミノ酸及び／又はペプチドに起因する種々の機能を有し、なおかつ安全性が高く副作用の心配がない。また、本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳は酸度を抑えることができ、風味がよく、様々な飲食品に添加してもその飲食品の風味を阻害しない。得られる飲食品は長期間の継続的摂取が容易であり、長期にわたって種々の機能の発揮が期待される。

さらに本発明の乳酸菌及び／又は発酵乳は、ヒト用の飲食品のみならず、家畜（ウシ、ブタなど）、競走馬、ペット（イヌ、ネコなど）の動物の飼料にも配合することができる。飼料は、対象がヒト以外であることを除き飲食品とほぼ等しいことから、上記の飲食品に関する記載は、飼料についても同様に当てはめることができる。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］L. helveticus CP3232株の同定
L. helveticus CM4株（受託番号 FERM BP-6060）を育種し、得られた変異株の中から、実施例２〜５に示す性質を示す新規なL. helveticus CP3232株を得た。

L. helveticus CP3232株をMRS寒天培地で37℃24時間嫌気培養し、得られたコロニーの形態観察学的性質及び生理学的性質などを調べた。また、16S rRNAの配列を決定し、他のラクトバチルス・ヘルベティカス（タイプストレイン）と99.9％の相同性があることを確認した。よって、得られた菌株が確かにL. helveticusに属し、新規な菌株であることがわかった。

［実施例２］発酵乳の調製
9.00％(w/w)還元脱脂粉乳を95℃達温殺菌し、15℃に冷却したものを乳培地として利用した。乳培地に、乳酸菌を含む発酵乳を5％の割合で接種し、37℃24時間培養を行った。さらに、これを繰り返し、得られた発酵乳をスターターとして用いた。本培養は、乳培地にスターターを3％添加し、32℃又は37℃で24時間培養を行った。発酵乳のpH及び酸度を測定した。酸度は、平沼自動滴定装置COMTITE-450（平沼産業）を用いて測定した。乳酸菌として、L. helveticus CP3232株と、比較用にL. helveticus CP3264株（抗高血圧製品より分離）、L. helveticus CM4株（受託番号 FERM BP-6060）、L. helveticus CP1092株、L. helveticus CP1100株、L. helveticus CP1081株及びL. helveticus CPN4株（特開平7-123977号公報）を使用した。

その結果を表１に示す。結果は、IPPの重量あたりのACE阻害活性がVPPの1.7倍であることから、IPP量及びVPP量を以下の式によりVPP換算量として表した：
VPP換算量（μg/ml）＝IPP量（μg/ml）×1.7＋VPP量（μg/ml）

また、「酸度」は、発酵乳に含まれる酸（乳酸）の濃度を表す。表１に示されるように、L. helveticus CP3232株の発酵により得られる発酵乳において、生成される乳酸（すなわち酸度）に対するIPPペプチド及びVPPペプチドの量はVPP換算量で6.2mg／gであり、酸度当たりのペプチド量が高いことが示された。発酵乳比重は1.02として算出した。

［実施例３］発酵乳上清中の遊離アミノ酸の測定
実施例２で得られた発酵乳を、10000gで10分間遠心分離し、上清を蒸留水で適当に希釈した後、0.2μMのメンブレンフィルターでろ過し、高速液体クロマトグラフィ（HPLC、島津製作所）のアミノ酸自動分析計（C-R7A/LC-10A）によって測定した。分析条件は以下の通りである。

カラム：Shim-pack Amino-Li(100mmL x 6.0mmI.D.)
アンモニアトラップ：Shim-pack ISC-30Li (50mmL x 4.0 mmI.D.)
カラム温度：38〜58℃
反応温度：65℃
移動相：島津アミノ酸分析用移動相キットLi型
反応液：島津アミノ酸分析用反応液キットOPA試薬
流速：0.4ml/min。

プロリン検出のため、反応液には次亜塩素酸ナトリウムを添加した。最終的にオルトフタルアルデヒドと反応したアミノ酸の蛍光発色を分光蛍光検出器（Ex：348nm, Em: 450 nm）で測定した。標準物質として、濃度既知のアミノ酸混合標準タイプ（H）を用い、含有量を算出した。

その結果を図１及び２に示す。図１のＡは、各乳酸菌を32℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる各アミノ酸量（nmol/ml）の結果を、Ｂは、各乳酸菌を37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれるアミノ酸量（nmol/ml）の結果を示す。また、図２のＡは、各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる遊離アミノ酸総量（μmol/ml）を、Ｂは、各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる分岐鎖アミノ酸量（μmol/ml）を示す。これらの結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で遊離アミノ酸を25mol/ml以上生成することがわかった。特に、37℃での発酵では29.9μmol/ml、32℃での発酵では33.1μmol/mlの遊離アミノ酸を生成した（図２Ａ）。また、生成された遊離アミノ酸に含まれる分岐鎖アミノ酸量が多く、24時間の発酵で生成される遊離アミノ酸のうち15％以上が分岐鎖アミノ酸であったことが示された。具体的には、37℃での発酵では約19.4％が分岐鎖アミノ酸であり、32℃の発酵では約21.5％が分岐鎖アミノ酸であった（図２Ｂ）。

［実施例４］発酵乳上清中のペプチド量（OPA法）
実施例２で得られた発酵乳上清中のペプチド量をChurchら（J. Dairy Sci. 1983. 66:1219-1227.）の方法に準じて測定した。簡単に説明すると、100mM四ホウ酸ナトリウム溶液25ml、20％SDS 2.5ml、2-メルカプトエタノール0.1mlを混合し、これにo−フタルアルデヒドをメタノールに4重量％溶解した溶液1mlを加え、最終的に蒸留水で50mlに調製し、これをOPA試薬とした。実施例２で得られた発酵乳を10000gで10分間遠心分離し、培養上清を適当に希釈して分析サンプルとした。OPA試薬200μlと分析サンプル10μlを混合し、十分攪拌した後、室温で5分放置し、340nmの吸収を測定した。標準物質として、バクトトリプトンを用いた。

その結果を図３に示す。この結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、発酵により多くのペプチドを生成することが示された。具体的には、24時間の発酵でペプチドを8.5mg/ml以上生成し、32℃の発酵では11.1mg/ml、37℃の発酵では9.6mg/mlのペプチドを生成した（図３）。

［実施例５］機能性ペプチドの定量
実施例２で得られた発酵乳を、10000gで10分間遠心分離し、上清を蒸留水で適当に希釈した後、0.2μMのメンブレンフィルターでろ過し、LC/MSで分析した。LC/MS分析は、Inoueら（J. Biosci. Bioeng., 2009, 108, 111-115.）の方法に従い実施した。すなわち、LCMS-2010Aシステム（島津製作所）に、分離カラムとしてRP-aqueousカラム（野村科学）を用い分析を行った。合成ペプチドを標準物質として含有量を算出した。合成ペプチドは、(¹³C₅)Val-(¹³C₅)Pro-Pro、Ile-(¹³C₅)Pro-Pro、Glu-Pro、Gln-Pro（以上、スクラム社より購入）、Leu-Pro-Pro, Tyr-Pro、Val-Pro、Ile-Pro、Ala-Pro, Arg-Pro、Thr-Pro、Met-Pro、Gly-Pro（以上、Bachem社より購入）を用いた。

その結果を図４及び５に示す。図４のＡ及びＢに示す結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で種々の機能性ペプチドを生成することがわかった。図４に列挙されている機能性ペプチドのうち、VPP及びIPPはACE阻害活性及びリラックス効果を有し、LPPはACE阻害活性を有し、YPは血圧降下作用及び抗不安作用を有し、VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及びGPは生体内非分解性であり、ACE阻害活性を有することが報告されている。L. helveticus CP3232株は、特にVPP、IPP、YP、QP及びTPを多く生成した。

また、図５のＡ及びＢに示す結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で機能性ペプチド（XP＋XPP）を総量で260μg/ml以上生成することがわかった。特に、32℃での発酵では318μmol/ml（図５Ａ）、37℃での発酵では282μmol/mlの機能性ペプチドを生成した（図５Ｂ）。

［実施例６］発酵乳の調製とペプチド量の測定
実施例２と同様に、乳酸菌として、L. helveticus CP3232株と、比較用にL. helveticus CNCM I-3435株（特許文献４）、L. helveticus FERM BP-5445株（特許文献７）、及びL. helveticus CM4株（受託番号 FERM BP-6060）を使用して、培養後の発酵乳のpH及び酸度と、生成されたIPPペプチド及びVPPペプチドの量を測定した。

その結果を表２に示す。結果は、実施例２と同様に、IPP量及びVPP量をVPP換算量として表した。また、「酸度」は、発酵乳に含まれる酸（乳酸）の濃度を表す。表２に示されるように、L. helveticus CP3232株の発酵により得られる発酵乳において、生成される乳酸（すなわち酸度）に対するIPPペプチド及びVPPペプチドの量はVPP換算量で7.0mg／gであり、酸度当たりのペプチド量が高いことが示された。発酵乳比重は1.02として算出した。

［実施例７］発酵乳上清中の遊離アミノ酸の測定
実施例６で得られた発酵乳を用いて、実施例３と同様に遊離アミノ酸について測定した。その結果を図６及び７に示す。

図６のＡは、各乳酸菌を32℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる各アミノ酸量（nmol/ml）の結果を、Ｂは、各乳酸菌を37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれるアミノ酸量（nmol/ml）の結果を示す。また、図７のＡは、各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる遊離アミノ酸総量（μmol/ml）を、Ｂは、各乳酸菌を32℃又は37℃にて24時間発酵させて得られた発酵乳上清に含まれる分岐鎖アミノ酸量（μmol/ml）を示す。これらの結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で遊離アミノ酸を25mol/ml以上生成することがわかった。特に、37℃での発酵では28.1μmol/ml、32℃での発酵では32.4μmol/mlの遊離アミノ酸を生成した（図７Ａ）。また、生成された遊離アミノ酸に含まれる分岐鎖アミノ酸量が多く、24時間の発酵で生成される遊離アミノ酸のうち15％以上が分岐鎖アミノ酸であったことが示された。具体的には、37℃での発酵では約20％が分岐鎖アミノ酸であり、32℃の発酵では約21％が分岐鎖アミノ酸であった（図７Ｂ）。

［実施例８］発酵乳上清中のペプチド量（OPA法）
実施例６で得られた発酵乳上清中のペプチド量を、実施例４と同様に測定した。その結果を図８に示す。この結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、発酵により多くのペプチドを生成することが示された。具体的には、24時間の発酵でペプチドを8.5mg/ml以上生成し、32℃の発酵では10.4mg/ml、37℃の発酵では9.1mg/mlのペプチドを生成した（図８）。

［実施例９］機能性ペプチドの定量
実施例６で得られた発酵乳を、実施例５と同様にLC/MSで分析し、機能性ペプチド量を測定した。その結果を図９及び１０に示す。図９のＡ及びＢに示す結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で種々の機能性ペプチドを生成することがわかった。L. helveticus CP3232株は、特にVPP、IPP、YP、QP及びTPを多く生成した。

また、図１０のＡ及びＢに示す結果から、L. helveticus CP3232株が高いタンパク質分解活性を有し、24時間の発酵で機能性ペプチド（XP＋XPP）を総量で260μg/ml以上生成することがわかった。特に、32℃での発酵では280μmol/ml（図１０Ａ）、37℃での発酵では295μmol/mlの機能性ペプチドを生成した（図１０Ｂ）。

［参考例１］L. helveticus CP3232株及びその変異株の同定方法
実施例１において得られた乳酸菌L. helveticus CP3232株とその変異株は、実施例２〜９に記載したような方法により測定することに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法による識別を組み合わせることで、他の乳酸菌株と容易に識別が可能である。また、L. helveticus CP3232株の親株であるL. helveticus CM4株の変異株であるか否かも、PCR法により簡便に判定することができる。

一例を簡単に説明すると、目的とする乳酸菌について、DNA試料を調製し、以下のプライマーを用いたPCR法により遺伝子増幅を行い、0.9％アガロースゲルで電気泳動し、その泳動パターンを分析することにより、L. helveticus CP3232株の変異株であるか否か、及びL. helveticus CM4株の変異株であるか否かを判定することができる。

プライマー：
agccacttcctccgattacag（配列番号１）、及び
gctattttagcagcgattcg（配列番号２）。

本実施例においては、複数のL. helveticus菌株を用いて、上記のPCR法を実施した。その結果を図１１に示す。図１１において、各レーンは以下の通りである。

レーン1：L. helveticus CP3232株
レーン2：L. helveticus CM4株
レーン3：L. helveticus CP3231株
レーン4：L. helveticus CP3264 株
レーン5：L. helveticus CP1081株
レーン6：L. helveticus CP209株
レーン7：L. helveticus CP210株
レーン8：L. helveticus CP293株
レーン9：L. helveticus CP617株
レーン10：L. helveticus CP39株
レーン11：L. helveticus CP790株
レーン12：L.helveticus JCM1120株
M：λファージDNA制限酵素HindIII分解物。

図１１に示されるように、CM4変異株L. helveticus CP3232株、CP3231株及び親株CM4株（レーン1〜3）には、特徴的なDNA断片が認められ、他のL. helveticus株には、この断片は認められなかった。DNAマーカーとして、λファージDNAの制限酵素HindIII分解物を同時に電気泳動し、特徴的なDNA断片の分子量を測定したところ、約2.2kbであった。

なお、L. helveticus CP3232株とCP3231株、親株CM4株の識別は、実施例４及び８に記載したようなOPA試薬を用いた発酵乳中のペプチド量分析によりL. helveticus CP3232株を選別することも可能である。すなわち、実施例２に従い調製した発酵乳中のペプチド量をOPA試薬で測定した値をみると、L. helveticus CP3231株及びCM4株がそれぞれ7.5mg/ml及び4.5mg/mlであるのに対し、L.helveticus CP3232株は11.1mg/mlと高い値を示し容易に識別することができる。

［参考例２］L. helveticus CP3232株及びその変異株の同定方法
参考例１と同様にして、実施例１において得られた乳酸菌L. helveticus CP3232株とその変異株を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって、他の乳酸菌株（L. helveticus CNCM I-3435株（特許文献４）及びL. helveticus FERM BP-5445株（特許文献７））と識別できるかどうか試験した。

プライマーを用いたPCR法により遺伝子増幅を行い、電気泳動を行った結果を図１２に示す。図１２において、各レーンは以下の通りである：
レーン1：L. helveticus CP3232株
レーン2：L. helveticus CM4株
レーン3：L. helveticus CNCM I-3435株
レーン4：L. helveticus FERM BP-5445株
M：λファージDNA制限酵素HindIII分解物。

図１２に示されるように、CM4変異株であるL. helveticus CP3232株と親株CM4株（レーン1及び2）には、特徴的なDNA断片が認められ、他のL. helveticus株には、この断片は認められなかった。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。

本発明により、高タンパク質分解活性を有し、ペプチド生成能及び／又はアミノ酸生成能に優れたラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌が提供される。本乳酸菌が生成するアミノ酸及び／又はペプチドは、種々の機能を有するものであり、例えばIPP、VPP、YPなどのペプチドは血圧降下作用を有する。また本乳酸菌を発酵に使用することで、そのような種々の機能を有する多様なアミノ酸及び／又はペプチドを高濃度で含み、風味が良好な発酵乳が得られる。従って、本発明は、医薬、飲食品、健康増進などの分野において有用である。

受託番号FERM BP-11271（Lactobacillus Helveticus(ラクトバチルス・ヘルベチカス)CP3232株、平成22年（2010年）8月4日寄託）
受託番号FERM BP-6060（Lactobacillus Helveticus(ラクトバチルス・ヘルベチカス)CM4株、平成9年（1997年）8月15日寄託）

配列番号１及び２：DNA（合成オリゴヌクレオチド）

Claims (21)

1. 以下の（a）、（b）及び（c）の性質又は（a）、（b）及び（d）の性質を有することを特徴とするラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌であって、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株（受託番号 FERM BP-6060）の変異株、又はラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株（受託番号 FERM BP-11271）若しくはその変異株である乳酸菌。
   （a）獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上生成する
   （b）獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上生成する
   （c）獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で260μg/ml以上生成する
   （d）獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0 mg／g以上である
2. 遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、請求項１に記載の乳酸菌。
3. YPペプチドを60μg/ml以上生成する、請求項１又は２に記載の乳酸菌。
4. （a）〜（d）のすべての性質を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸菌。
5. ラクトバチルス・ヘルベティカスCP3232株（受託番号 FERM BP-11271）。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1種のラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸菌を含有することを特徴とする、獣乳からアミノ酸及び／又はペプチドを生成するための組成物。
7. 獣乳を発酵させることにより遊離アミノ酸を25μmol/ml以上生成する、請求項６に記載の組成物。
8. 遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、請求項７に記載の組成物。
9. 獣乳を発酵させることによりペプチドを8.5mg/ml以上生成する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 獣乳を発酵させることによりXPペプチド及び／又はXPPペプチドを総量で260μg/ml以上生成する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 獣乳を発酵させることによりYPペプチドを60μg/ml以上生成する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 獣乳を30℃以上34℃以下で発酵させて得られる発酵乳の酸度当たりのIPPペプチド及びVPPペプチドの量がVPP換算量で6.0 mg／g以上である、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. 以下の（a）、（b）及び（c）の成分又は（a）、（b）及び（d）の成分を含み、かつ請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1種の乳酸菌を含有することを特徴とする発酵乳。
    （a）25μmol/ml以上の遊離アミノ酸
    （b）8.5mg/ml以上のペプチド
    （c）総量で260μg/ml以上のXPペプチド及び／又はXPPペプチド
    （d）6.0mg／g以上であるIPPペプチド及びVPPペプチドの酸度当たりのVPP換算量
14. 遊離アミノ酸の15％以上が分岐鎖アミノ酸である、請求項１３に記載の発酵乳。
15. 60μg/ml以上のYPペプチドを含む、請求項１３又は１４に記載の発酵乳。
16. 血圧降下剤、脳機能改善剤、自律神経調節剤、副交感神経調節剤、交感神経調節剤、栄養補助剤、エネルギー補給剤、筋肉分解・損傷抑制剤、筋肉増強剤、疲労感の軽減剤、持久力の向上剤、風味改善剤、又はアルコール代謝剤として使用するための、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の発酵乳を含む組成物。
17. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1種の乳酸菌及び／又はその処理物、並びに／あるいは請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の発酵乳及び／又はその処理物を含有することを特徴とする飲食品。
18. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも1種の乳酸菌又は請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物を用いて獣乳又は乳タンパク質を発酵させ、得られる発酵物からアミノ酸及び／又はペプチドを採取することを特徴とするアミノ酸及び／又はペプチドの製造方法。
19. アミノ酸が分岐鎖アミノ酸である、請求項１８に記載の方法。
20. ペプチドがXPペプチド及び／又はXPPペプチドからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 発酵を30℃以上34℃以下の温度で行う、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。

Images