WO2023008218A1

WO2023008218A1 - レスベラトロールグルクロニドの新たな用途

Info

Publication number: WO2023008218A1
Application number: PCT/JP2022/027758
Authority: WO
Inventors: 昂洸藤井; 尚井上; 高史宅見; 俊雄荒木; 通済本田
Original assignee: Ikeda Food Research Co Ltd
Current assignee: Ikeda Food Research Co Ltd
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2023-02-02
Anticipated expiration: 2024-01-28
Also published as: JPWO2023008218A1

Abstract

優れた機能性を有し、且つ水溶性が高い、化粧品、医薬品、飲食品等に利用可能な素材の提供。　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。

Description

レスベラトロールグルクロニドの新たな用途

　本発明は、レスベラトロールグルクロニドの新たな用途に関する。

　レスベラトロール及びレスベラトロール３－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ピセイド）は、抗老化能、抗酸化能、活性酸素除去能、美肌、美白効果があることが報告され（特許文献１、２）、化粧品素材として広く利用されている。しかし、レスベラトロールは水への溶解度が０．０３ｍｇ／ｍＬ程度と極めて低い（特許文献１）。一方、ピセイドにおいてはレスベラトロールと比較すると改善はしているものの、水への溶解度が０．４ｍｇ／ｍＬ程度であり、十分な溶解性を持つとは言い難い（特許文献１）。このように従来のレスベラトロール、ピセイドは化粧品素材として優れた機能性を有しているにも関わらず、水溶性が低いことが問題であった。

　そこで従来、上記の問題を解決する為、ピセイド等のレスベラトロール配糖体に、さらに複数の糖残基を付加させることで、水溶性を向上させる技術が提案されている（特許文献２）。しかし、前述の手法ではレスベラトロールに２～９個の糖が付加された化合物が得られており、安定した品質を有する製品の製造法として課題が残されている。
　また、レスベラトロールを非イオン性界面活性剤、及び液状の多価アルコールで水へ可溶化する手法（特許文献３）や、ビニルピロリドンコポリマーと共存させる手法（特許文献４）、カテキン化合物と共存させる手法（特許文献５）、シクロデキストリンを添加させることで水への溶解性を向上させる手法（非特許文献１）が既に報告されているが、これらはいずれも高価な試薬を必要とする点で課題が残されている。

　一方、化合物にグルクロン酸を付加することで水溶性が向上することは広く知られており、薬物代謝等でのグルクロン酸抱合が有名である（非特許文献２）。同様に化合物にグルコース等を付加する配糖体化も、化合物の水溶性を向上させる効果が既に知られているが（非特許文献３）、配糖体のグルコース残基をグルクロン酸に変換した際の水溶性に与える影響については知られていない。
　例えば、ポリフェノール配糖体の一種であるケルセチングルコシドは親水性（又は疎水性）を示す指標の一つであるＬｏｇＰ（正に大きいと疎水性が高く、負になると親水性が高い）が０．０９９（非特許文献４）であるのに対し、ケルセチングルクロニドはＬｏｇＰが０．２５６（非特許文献５）となっており、グルコース残基をグルクロン酸に変換したことで水溶性が悪化することが知られている。
　また、これまでにレスベラトロールグルクロニドの水溶性を評価した結果は知られていないが、ＰｕｂＣｈｅｍに記載されている予想ＬｏｇＰ（ＸＬｏｇＰ　３．０で計算）は１．６（非特許文献６）となり、同じ手法で計算したピセイドの予想ＬｏｇＰ：１．７（非特許文献７）と比較すると、僅かに水溶性が良くなる可能性は示唆されるものの、劇的な改善は期待できない数値となっている。また、レスベラトロールグルクロニドの機能性についても評価された例はなく、実際に皮膚に適用された例も知られていない。

国際公開第２０１５／１５６３２８号特開２０１６－２８０１８号公報特開２０１５－１９３５９０号公報特開２０１８－９５５９７号公報特開２０１３－２５６６３３号公報

「第５８回　α－シクロデキストリンによるレスベラトロールの水溶化」、［online］、株式会社シクロケム、［令和３年７月１９日検索］、インターネット〈URL:http://www.cyclochem.com/cyclochembio/research/058.html> 肝臓　４２巻６号　２７７－３０８（２００１）薬学雑誌．乙号　１３５（７），　８６７－８８２，２０１５「isoquercetin」、［online］、Chemspider、［令和３年７月１９日検索］、インターネット＜URL:http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444361.html?rid=0dfcbf9d-9fa7-4971-815c-4be7954eec43＞「Miquelianin」、［online］、Chemspideｒ、［令和３年７月１９日検索］、インターネット＜URL:http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4438874.html?rid=357ef1f2-ca29-49d6-9b6b-d365b8ea3154＞「trans-resveratrol-3-O-glucuronide」、［online］、PubChem、［令和３年７月１９日検索］、インターネット＜URL:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5273285＞「Polydatin」、［online］、PubChem、［令和３年７月１９日検索］、インターネット＜URL:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Polydatin＞「オリザ油化」、［レスベラトロール］、ヒアルロニダーゼ、［令和３年７月１９日検索］、インターネット＜URL: https://www.oryza.co.jp/cms/wp-content/uploads/2017/10/e375f75b4b0460c7880cdb81a33593ae.pdf＞

本発明が解決しようとする課題

　前述のとおり、レスベラトロールは優れた機能性を有しているにも関わらず、水溶性の低さから化粧水等の水系の製剤に配合させる場合はエタノール等の有機溶剤や、界面活性剤、シクロデキストリン等の添加物と共存させなければ高濃度に溶解させることは不可能だった。近年、化粧品等においては無添加の製品（有機溶剤フリー等）が好まれる傾向にあることから、化粧品素材等を高濃度、且つ添加剤を使用しない条件で水に溶解させる技術が求められている。

　本発明は、優れた機能性を有し、且つ水溶性が高い、化粧品、医薬品、飲食品等に利用可能な素材を提供することに関する。

　本発明者は、フラビン結合型グルコース脱水素酵素（フラビン結合型ＧＤＨ、ＥＣ　１．１．５．９）に、グルコースの６位のヒドロキシメチル基に対する酸化に特異性を有するものがあり、当該グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をグルコシド等のグルコース誘導体に作用させるとグルコース骨格の６位のヒドロキシメチル基を酸化し、特異的にグルクロン酸誘導体を生成することを見出し、簡便にレスベラトロールグルクロニドを取得することに成功している（本出願人による国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／００１０８６）。そしてさらに、取得したレスベラトロールグルクロニドの機能性を評価した結果、親水性及び水への溶解性が大幅に改善していることを見出した。また、レスベラトロールグルクロニドが優れたヒアルロニダーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は、以下の〔１〕～〔１０〕に係るものである。
〔１〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
〔２〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗炎症剤。
〔３〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗アレルギー剤。
〔４〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤。
〔５〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗酸化剤。
〔６〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗老化剤。
〔７〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
〔８〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするメラニン生成抑制剤。
〔９〕レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする美白剤。
〔１０〕レスベラトロールグルクロニドを含有する皮膚外用剤。

　また、本発明は、以下の〔１１〕～〔３８〕に係るものである。
〔１１〕ヒアルロニダーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１２〕抗炎症剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１３〕抗アレルギー剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１４〕コラゲナーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１５〕抗酸化剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１６〕抗老化剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１７〕チロシナーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１８〕メラニン生成抑制剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔１９〕美白剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
〔２０〕皮膚外用剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。

〔２１〕ヒアルロニダーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２２〕抗炎症に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２３〕抗アレルギーに使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２４〕コラゲナーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２５〕抗酸化に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２６〕抗老化に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２７〕チロシナーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２８〕メラニン生成抑制に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
〔２９〕美白に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。

〔３０〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するヒアルロニダーゼ阻害方法。
〔３１〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗炎症方法。
〔３２〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗アレルギー方法。
〔３３〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するコラゲナーゼ阻害方法。
〔３４〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗酸化方法。
〔３５〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗老化方法。
〔３６〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するチロシナーゼ阻害方法。
〔３７〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するメラニン生成抑制方法。
〔３８〕レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する美白方法。

　レスベラトロールグルクロニドは、ヒアルロニダーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有し、且つ水溶性が極めて高いことから、化粧品素材や医薬品素材、食品素材等として有用である。従って、本発明によれば、製剤の形態を問わず高濃度でレスベラトロールグルクロニドを配合することができ、優れた皮膚の抗老化、美肌、美白等の効果が期待される。

レスベラトロールグルクロニドの¹Ｈ－ＮＭＲ解析及び¹³Ｃ－ＮＭＲ解析の結果を示す。レスベラトロールグルクロニド及びピセイドのヒアルロニダーゼ阻害率を示す。レスベラトロールグルクロニドのコラゲナーゼ阻害率を示す。レスベラトロールグルクロニドのチロシナーゼ阻害率を示す。

　本発明において用いられるレスベラトロールグルクロニドは、レスベラトロールグルコシド（分子式：Ｃ₂₀Ｈ₂₂Ｏ₈）のグルコース残基がグルクロン酸に変換した化合物である。レスベラトロールグルクロニドには、立体異性体が存在し、本発明では、純粋な立体異性体又はそれらの混合物を用いることができる。レスベラトロールグルクロニドは、好ましくは下記式（１）で表されるトランス－レスベラトロール－３－Ｏ－β－Ｄ－グルクロニドである。

　本発明においてレスベラトロールグルクロニドは、特に限定されず、試薬として市販されているものを用いることができる。また、実施例に示される方法により製造することができる。すなわち、レスベラトロールグルコシドに、メディエーターの存在下、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するフラビン結合型グルコース脱水素酵素を作用させて、レスベラトロールグルクロニドを生成させる工程を含む、レスベラトロールグルクロニドの製造方法により製造することができる。

　本明細書において、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するフラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、「フラビン結合型ＧＤＨ」と称することがある）とは、フラビンを補酵素として、グルコースの６位のヒドロキシメチル基を脱水素（酸化）する反応を触媒する酵素をいう。本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、グルコースの６位に選択的に作用し、グルコースの６位のヒドロキシメチル基をカルボキシ基に特異的に酸化するため、当該酵素をグルコシド等のグルコース誘導体に作用させるとグルコース骨格の６位のヒドロキシメチル基を特異的に酸化し、グルコース誘導体から特異的にグルクロン酸誘導体を生成する。
　グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性は、グルコースに対してグルコース－６－デヒドロゲナーゼを作用させ、その反応産物を薄層クロマトグラフィー、又はＨＰＬＣにて分析し、グルコースの６位が酸化されているグルクロン酸標品と比較することで確認できる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、実質的にグルコース－１－デヒドロゲナーゼ活性を有さず、基質であるグルコースからグルコン酸を実質的に生成しない。ここで、実質的とは、反応産物の薄層クロマトグラフィー、又はＨＰＬＣ分析の結果、グルコン酸の生成が確認できないことを指す。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素であれば特に制限はないが、以下の（ｉ）～(iii)のいずれかのタンパク質であることが好ましい。
（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列を有し、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（iii)配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質

　配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列における、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１～２０個が好ましく、１～１０個がさらに好ましく、１～８個がさらに好ましい。

　本明細書において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列との配列同一性は８０％以上であるが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）等を用いることができる。

　配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ順に、コレトトリカム・プルリボラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ３０５７９０、ファンガス・Ｆ５１２６（Ｆｕｎｇｕｓ_Ｆ５１２６）、コレトトリカム・エスピー.（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ_ｓｐ.）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、コレトトリカム・オービキュラーレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、コレトトリカム・トフィエルディアエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｔｏｆｉｅｌｄｉａｅ）、コレトトリカム・ゴデティアエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｏｄｅｔｉａｅ）ＭＡＦＦ２４０２８９、グロメレラ・エスピー（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｓｐ.）ＲＤ０５７０３７、ディアポルテ・ヘリアンティ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｈｅｌｉａｎｔｈｉ）、クスキア・オリザエ(Ｋｈｕｓｋｉａｏｒｙｚａｅ)、アクレモニウム・ストリクツム(Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｔｒｉｃｔｕｍ)、クスキア・オリザエ(Ｋｈｕｓｋｉａｏｒｙｚａｅ)、ラシオスパエリス・ハースートウ（Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉｓｈｉｒｓｕｔｅ）、ディアポルタセアエ・エスピー(Ｄｉａｐｏｒｔｈａｃｅａｅｓｐ.)、コレトトリカム・タナケティ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｔａｎａｃｅｔｉ）、フザリウム・ラングセティアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｌａｎｇｓｅｔｈｉａｅ）、フィアモニオシス・カルバタ（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｏｐｓｉｓｃｕｒｖａｔａ）のゲノム情報に基づくものである。また、配列番号３６、３８は配列番号３２、３４の分泌シグナルと推定される配列をアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来ＧＤＨのシグナル配列に置換した配列である。
　配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列は、既知のアミノ酸配列特許第６４５５７１４号記載の配列番号２、及び特許第５４３５１８０号記載の配列番号１と同一、配列番号８、１０、１２、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、及び３４で示されるアミノ酸配列は、公知のデータベースに登録されたアミノ酸配列であるが、当該アミノ酸配列を有するタンパク質がグルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有することの報告例は無い。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、以下の性質（１）～（８）を有することが好ましい。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられ、好ましくはＦＡＤである。
（１）作用：フラビンを補酵素として、グルコースの６位のヒドロキシメチル基を脱水素（酸化）する反応を触媒する
（２）溶解性：水溶性
（３）ｐＨ安定性：少なくともｐＨ５．５～８．６の間で安定
　本酵素は、少なくともｐＨ５．５～８．６の間であれば、３０℃、１時間の処理後、８０％以上の残存酵素活性を有する。ｐＨ安定性は、好ましくはｐＨ４．３～９．３、ｐＨ５．５～８．７、ｐＨ３．２～９．３、ｐＨ５．５～９．３、ｐＨ４．４～９．３、ｐＨ４．０～９．６、ｐＨ４．４～９．３、ｐＨ５．０～９．３、ｐＨ３．３～９．６、ｐＨ５．５～８．６、ｐＨ４．３～９．６、ｐＨ５．０～９．６、ｐＨ４．０～８．６、ｐＨ４．９～８．７、ｐＨ３．３～９．９、ｐＨ４．４～９．８、ｐＨ４．０～８．８、ｐＨ４．４～９．８、ｐＨ４．０～９．６である。
　なお、同じｐＨであっても緩衝液の種類によって残存活性は異なることがある。
（４）熱安定性：少なくとも３５℃で安定
　本酵素は、少なくとも３５℃であれば、１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、７．０又は８．０）、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、６０分の処理後、８０％以上の残存酵素活性を有する。好ましくは４０℃まで、４５℃まで、又は５０℃まで安定である。
（５）基質特異性：グルコースに対する作用性を１００％とした場合にマルトース、キシロース、ガラクトースへの作用性が２．０％以下
　本酵素は、マルトース、キシロース及びガラクトースに対する作用性が低く、グルコースに対する基質特異性が高い。５０ｍＭのＤ－グルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭのマルトース、Ｄ－キシロース、Ｄ－ガラクトースへの作用性は、２．０％以下であり、好ましくは０．３％以下、０．９％以下又は０．２％以下である。
（６）Ｋｍ値（対グルコース）：３０ｍＭ以上
　Ｄ－グルコースに対するＫｍ値は、好ましくは１５０～３００ｍＭ、５０～１２０ｍＭ、又は３０～８０ｍＭである。
（７）分子量：６４～６６ｋＤａ（シグナル除去後のアミノ酸配列からの計算）
　本酵素の分子量は、酵素の分泌シグナル配列をシグナル配列予測サイト（ＳｉｇｎａｌＰ-５．０、http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）で予測し、その予測シグナル部分を除去した形で分子量をアミノ酸配列から算出している。
（８）グルコースオキシダーゼ活性：検出できず

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、上記のとおり、グルコースの６位に特異的に作用するため、キシロースに対する作用性が低い。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨの由来微生物としては、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えば、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐ．（ＲＤ０５６７７９）、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｔｏｆｉｅｌｄｉａｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｏｄｅｔｉａｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｔａｎａｃｅｔｉ）、グロメレラ属（例えば、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｓｐ. ＲＤ０５７０３７）、ディアポルテ属（例えば、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｈｅｌｉａｎｔｈｉ）、クスキア属（例えば、Ｋｈｕｓｋｉａｏｒｙｚａｅ）、アクレモニウム属（例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｔｒｉｃｔｕｍ）、ラシオスパエリス属（例えば、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉｓｈｉｒｓｕｔｅ）、フザリウム属（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍｌａｎｇｓｅｔｈｉａｅ）、フィアモニオシス属（例えば、Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｏｐｓｉｓｃｕｒｖａｔａ）に属する微生物等が挙げられる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、上記微生物（野生株や変異株）由来の酵素、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により得られる組換え酵素、化学合成によって得られる合成酵素のいずれでもよい。好ましくは組換え酵素である。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、以下の（ａ）～(ｅ)のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有し、かつグルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７で示される塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）以下の（ｉ）、（ii）又は(iii)のタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列を有し、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（iii)配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルコース－６－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質

　配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列における、１～数個の塩基とは、１～１０個が好ましく、１～５個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１又は２個がさらに好ましい。また、塩基の欠失とは塩基の欠落又は消失を意味し、塩基の置換とは塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、塩基の付加とは塩基が付け加えられていることを意味する。「付加」には、配列の一端又は両端への塩基の付加、及び配列中の塩基の間に別の塩基が挿入されることが含まれる。

　本明細書において、塩基配列の配列同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Ｐｒｏ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,１９９３,９０:５８７３－５８７７)を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている(Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,１９９０,２１５,ｐ.４０３－４１０)。また、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘのホモロジー解析(Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ)プログラムを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(https://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。

　本明細書において、ストリンジエントな条件とは、同一性が高い塩基配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い塩基配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。「ストリンジエントな条件」とは、求める同一性の高低によって、適宜条件を変えることができる。より高ストリンジェントな条件であるほど、より同一性の高い配列のみがハイブリダイズすることになる。例えば、ストリンジエントな条件として、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ:ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ (ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ,Ｊ.Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ.ａｌ,１９８９)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬ　ニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用したフラビン結合型ＧＤＨの調製は、例えば、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を含む発現ベクターを微生物等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することで本発明のフラビン結合型ＧＤＨを産生させることができる。形質転換体には、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子をベクターの状態で保持させても良いし、当該遺伝子をゲノム内に保持させても良い。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、本明細書が開示する遺伝子配列情報を参考に、ＰＣＲ法等の当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離された状態に調製することができる。

　ベクターの種類は、特に限定されず、タンパク質生産に通常用いられるベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。なかでも、プラスミドベクターが好ましく、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えば、ｐＥＴやｐＢＩＣ等を好適に用いることができる。プラスミドベクターへの遺伝子の導入手順は、当該分野で周知である。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する細菌、酵母、糸状菌が挙げられる。

　形質転換体の培養に使用する培地、培養条件は、形質転換体の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。
　例えば、微生物が資化し得る炭素源、無機窒素源又は有機窒素源、無機塩、その他必要な有機微量栄養源を含有する培地を用いて、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行うことができる。培地は、合成培地、天然培地、半合成培地のいずれであってもよく、又は市販の培地であってもよい。培地は、好ましくは液体培地である。
　培地のｐＨは、例えばｐＨ５からｐＨ９の範囲が好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。例えば、培養温度は１０℃～４０℃、培養期間は２日～１４日の範囲が好ましい。

　培養後、培養物を利用することができるが、好ましくは遠心分離等の分離操作を行って培養上清液を得た後に利用される。或いは、微生物菌体を得、任意の方法で微生物菌体を破砕し、破砕液から上清液を得た後に利用される。ここで、培養物は、培養液、微生物菌体又はその処理物（凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体等）であってもよい。また、任意の方法で固定化された固定化酵素又は固定化菌体であってもよい。
　形質転換体が産生した本発明のフラビン結合型ＧＤＨの精製は、公知の精製方法が利用できる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。

　レスベラトロールグルクロニドの製造方法において、フラビン結合型ＧＤＨの形態は特に限定されず、培養上清、粗酵素、精製酵素、固定化酵素であってよく、フラビン結合型ＧＤＨを含む微生物であってもよい。フラビン結合型ＧＤＨを含む微生物は、フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子が導入された組換え微生物が好ましい。フラビン結合型ＧＤＨを含む微生物は、その生死は問わず、また上述したような微生物菌体の処理物も含まれる。
　レスベラトロールグルクロニドの生成は、通常、水、緩衝液、一価アルコール、二価アルコール等の水性媒体中で行われる。また、必要に応じて各種のｐＨ調整剤、界面活性剤、消泡剤等を添加しても良い。

　本工程において、基質濃度は、１０ｍＭ～１，０００ｍＭ程度が好ましい。

　本工程に用いられるメディエーターは、電子の授受能に優れる化学物質を用いることができる。メディエーターは、電子伝達体、電子受容体、酸化還元媒介剤とも称される。
　メディエーターとしては、オスミウム系化合物（例えば、オスミウム（ＩＩ）－２，２'－ビピリジン錯体）、キノン系化合物（例えば、ベンゾキノン、１，４－ナフトキノン、ビタミンＫ３（メナジオン））、フェノール系化合物（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、ハイドロキノン、４-アミノフェノール、ブチルヒドロキシアニソール、オイゲノール、カテコール、グアイアコール、ピロガロール、バニリン、没食子酸ｎ－プロピル）、フェナジン系化合物（例えば、フェナジンメトサルフェート、１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト、メチレンブルー）、フェリシアン化物（例えば、フェリシアン化カリウム）、フラボノイド（ケルセチン２水和物、ヘスペリジン）等が挙げられる。なかでも、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイトが好ましい。
　メディエーターの使用量は、その種類によって適宜設定することができるが、通常、０．５ｍＭ～５０ｍＭ程度が好ましい。

　レスベラトロールグルコシドに本発明のフラビン結合型ＧＤＨを作用させる条件は、フラビン結合型ＧＤＨが失活しない条件であれば特に限定されない。本工程も、常温、常圧下で反応が進行し、また、中性～アルカリ条件下で反応が進行する。
　反応温度は、通常、１０℃～６０℃、好ましくは２０℃～４０℃で、反応時間は、通常、３０分間～７２時間、好ましくは１時間～４８時間、より好ましくは３時間～２４時間である。
　また、反応ｐＨは、ｐＨ５．０～ｐＨ９．０が好ましい。

　本発明のフラビン結合型ＧＤＨの使用量は、終濃度として１Ｕ/ｍＬ～５０Ｕ/ｍＬが好ましい。

　本工程において、メディエーターの再酸化を行う観点から、更に酸化酵素を作用させることが好ましい。酸化酵素としては、ラッカーゼ（ＥＣ１．１０.３．２）等のフェノールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１.１．７）が挙げられる。
　また、反応系の活性酸素の除去を行う観点から、カタラーゼ（ＥＣ１．１１.１．６）を使用することが好ましい。
　これらの酵素の使用量は終濃度として０．２５Ｕ/ｍＬ～５００Ｕ/ｍＬ程度が好ましい。

　このようにして、基質であるレスベラトロールグルコシドのグルコース骨格の６位のヒドロキシメチル基がカルボキシ基に酸化され、レスベラトロールグルクロニドが特異的に生成される。レスベラトロールグルクロニドの生成率は薄層クロマトグラフィーでの分析結果よりほぼ１００％である。

　後記実施例に示すように、レスベラトロールグルクロニドは、有機化合物の親水性（又は疎水性）を示す指標であるＬｏｇＰ値が－２．１５と、ピセイド（ＬｏｇＰ値１．０１）と比べても親水性が高く、水への溶解性に極めて優れる。
　また、レスベラトロールグルクロニドは、ヒアルロニダーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性、抗酸化活性（ジフェニルピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカル消去活性）及びチロシナーゼ阻害活性を有する。

　ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素である。ヒアルロニダーゼは炎症時に活性化され、結合組織マトリックスを破壊し、炎症系の組織への浸潤、血管の透過性の充進、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの放出に介在している。従って、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することで抗アレルギー、抗炎症効果が期待される。Ｉ型アレルギーとしては、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アナフィラキシーショック等が挙げられる。また、ヒアルロン酸は皮膚、関節液、硝子体等の生体に広く分布しており、ヒアルロン酸が減少すると皮膚の潤い、ハリがなくなり、シミやたるみの原因となる。そのため、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することによって、美肌、抗老化効果も期待される。

　コラゲナーゼは、コラーゲンを分解する酵素である。コラーゲンは、皮膚のハリ・弾力性の維持を担っている。コラーゲンは加齢により減少し、また、紫外線の刺激により活性化されるコラゲナーゼによって分解が促進される。そのため、コラゲナーゼの活性を組害することによって、皮膚のハリが保たれ、抗老化効果が期待される。

　活性酸素種としては、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素が挙げられ、これら活性酸素種は、皮膚の様々な疾患、例えば、炎症、皮膚黒化、ＤＮＡ損傷、シミ、シワ等の皮膚老化に密接に関与していることが知られている。そのため、抗酸化能によって、活性酸素が関与する皮膚の光老化や色素沈着、シミ、くすみの改善が期待される。

　チロシナーゼは、チロシンからのメラニン生合成に関与する酵素である。生体内ではチロシナーゼの働きでチロシンからドーパキノンが生成し、酸化反応が進行することによってメラニンが生成される。そのため、チロシナーゼの活性を阻害することで、メラニンの生成を抑えることができ、美白効果が得られる。

　このように、レスベラトロールグルクロニドは、そのヒアルロニダーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性に基づき、皮膚に適用することで、皮膚の抗老化（例えば、皮膚のハリ、シワやたるみを予防又は改善）、抗アレルギー、抗炎症、美肌（例えば、保湿）、美白（例えば、皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス、くすみを予防又は改善）等の効果が期待される。
　従って、レスベラトロールグルクロニドは、ヒアルロニダーゼ阻害剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、コラゲナーゼ阻害剤、抗酸化剤、抗老化剤、チロシナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤、美白剤（以下、「ヒアルロニダーゼ阻害剤等」とも記する）となり得、ヒアルロニダーゼ活性を阻害するため、抗炎症のため、抗アレルギーのため、コラゲナーゼ活性を阻害するため、抗酸化のため、抗老化のため、チロシナーゼ活性を阻害するため、メラニン生成を抑制するため、美白のために使用することができ、またヒアルロニダーゼ阻害剤等を製造するために使用することができる。

　当該ヒアルロニダーゼ阻害剤等のヒト又は非ヒト動物への適用形態は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚外用（経皮）、経粘膜、経鼻、経腸、注射、坐剤、吸入等の非経口、又は経口が挙げられる。

　非経口の場合、皮膚外用（経皮）が好ましい。
　皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品のいずれの形態であってもよい。具体的には、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、チック剤、リニメント剤、ローション剤、スプレー剤、基礎化粧料（化粧水、乳液、クリーム、美容液、ジェル、パック等）、メイクアップ用化粧料（ファンデーション、口紅等）、顔又はボディ用の洗浄料（シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム等）、入浴剤等が挙げられる。なかでも、好適な形態は、基礎化粧料、メイクアップ用化粧料であり、より好適な形態は、水系の製品（化粧水等）である。

　また、経口の場合、医薬品、医薬部外品、飲食品のいずれの形態であってもよい。飲食品には、特定保健用食品、機能性表示食品等の保健機能食品が含まれる。具体的には、経口固形製剤（錠剤（素錠、コーティング錠等）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤等）、経口液状製剤（液剤、シロップ剤、ドリンク剤等）、各種食品組成物（パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、冷凍食品、アイスクリーム類、あめ類、スープ類、乳製品、飲料、調味料、栄養補給用食品等）等が挙げられる。なかでも、好適な形態は、水系の製品（経口液状製剤、飲料等）である。

　このような種々の剤形の製剤は、レスベラトロールグルクロニドを単独で、又は必要に応じて、薬学的に許容される担体、化粧料に許容される担体又は食品に許容される添加物、あるいは他の有効成分、薬効成分、化粧成分、任意の食品材料等と組み合わせて、常法に従って製造することができる。
　当該薬学的に許容される担体又は化粧料に許容される担体としては、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、分散剤、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等が挙げられる。
　食品に許容される添加物としては、例えば、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、ｐＨ調整剤、安定剤、着色剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等が挙げられる。
　他の有効成分、薬効成分、化粧成分としては、例えば、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、角質溶解剤、清涼剤、抗脂漏剤、洗浄剤、メイクアップ成分等が挙げられる。

　本発明の製剤中のレスベラトロールグルクロニドの含有量は、製剤の形態に応じて異なるため一概にはいえないが、レスベラトロールグルクロニドの機能性と水溶性の高さから、例えば製剤の総量を基準として、好ましくは０．０００６質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。レスベラトロールグルクロニドをこのような高濃度で含有する製剤はこれまでに知られていない。

　本発明の製剤では、レスベラトロールグルクロニドの水溶性の高さから、エタノール等の有機溶剤や、界面活性剤等の添加剤の使用を低減又は回避することが可能である。本発明の製剤中、有機溶剤の含有量は、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは０～５質量％、更に好ましくは１質量％未満であり、実質的に０質量％、すなわち有機溶剤を含まないのが更に好ましい。また、本発明の製剤中、界面活性剤の含有量は、好ましくは２５質量％以下、より好ましくは０～５質量％であり、実質的に０質量％、すなわち界面活性剤を含まないのが更に好ましい。

　レスベラトロールグルクロニドの投与量又は使用量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量又は使用量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態、又はその他の要因に従って変動し得るが、皮膚外用剤等の非経口の場合には、成人（６０ｋｇ）１人当たり１回、レスベラトロールグルクロニドとして例えば０．００１～２ｍｇ／ｃｍ²程度である。また、経口の場合には、成人（６０ｋｇ）１人に対して１日当たり、レスベラトロールグルクロニドとして例えば５～２０ｍｇ程度である。
　本発明では斯かる量を１日に１回～複数回に分けて、１日間以上、好ましくは７日間以上、より好ましくは１４日間以上、よりさらに好ましくは４２日間以上、反復・継続して投与又は使用し得る。

　本発明の製剤を投与又は使用する対象としては、例えば、皮膚の抗老化、抗アレルギー、抗炎症、美肌、美白等の効果を所望するヒトが挙げられる。非ヒト動物としては、類人猿、その他霊長類等の非ヒト哺乳動物等が挙げられる。
　本発明の製剤を投与又は使用する皮膚の部位としては、例えば、顔、頸、腕、手の甲、指等が挙げられる。

　次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

［製造例１］
（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍ由来ＧＤＨの取得）
　以下のとおり、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍ由来のフラビン結合型グルコース－６－脱水素酵素（以下、「ＣｐＧＤＨ」）遺伝子を組み込んだＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＮＳ４株を国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／００１０８６に記載の手法で取得した。

（１）菌体培養
　デキストリン（富士フィルム和光純薬社）２％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（富士フィルム和光純薬社）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を調製し、１０ｍＬを太試験管に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、ＧＤＨ生産菌（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍＭＡＦＦ３０５７９０）を接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。

（２）全ＲＮＡの単離
　（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを－８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。

（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
　（２）で取得したＲＮＡから、逆転写酵素及びアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（タカラバイオ社）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。

（４）ＧＤＨ遺伝子のクローニング
　（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＤＨ遺伝子取得用プライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＧＤＨ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＤＨ配列を基に、種々のＧＤＨ遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記ＰＣＲ産物を精製し、塩基配列を決定した。

　決定した塩基配列を基に、ＧＤＨ遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて５'ＲＡＣＥ法及び３'ＲＡＣＥ法によって、ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｐｌｕｒｉｖｏｒｕｍＭＡＦＦ３０５７９０ＧＤＨ株由来ＧＤＨ（「ＣｐＧＤＨ」）遺伝子全長を解明した。

　解明したＣｐＧＤＨ遺伝子配列をアスペルギルス・オリゼのコドン頻度に最適化した配列を配列番号１に示した。更に、当該遺伝子配列より予測したアミノ酸配列を配列番号２に示した。

（５）ＣｐＧＤＨ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製
　公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＣｐＧＤＨ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。次に、前記ＰＣＲ産物を鋳型とし、ベクター挿入用のＣｐＧＤＨ遺伝子を調製した。

　最終的に、前記プロモーターの下流に調製したＣｐＧＤＨ遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを作製した。作製した発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、ｉｌｌｕｓｔｒａｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐＭｉｄｉＦｌｏｗＫｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いてプラスミドベクターを抽出した。該プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、ＣｐＧＤＨ遺伝子を含む塩基配列が確認できた。

（６）形質転換体の取得
　（５）で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.,６１(８),１３６７－１３６９,１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４－５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＣｐＧＤＨを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製した。得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。
　使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。

（７）組換えカビ由来ＣｐＧＤＨの確認
　デキストリン（富士フィルム和光純薬社）２％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（富士フィルム和光純薬社）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を調製し、１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で１２０時間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、後述のＧＤＨ活性測定法でＧＤＨ活性を測定したところ、ＣｐＧＤＨ活性が確認できた。
（グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）活性測定法）
　１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ　２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（以下「ＤＣＩＰ」という）０．１４ｍＬ、３ｍＭ　１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト（以下「１－ｍ－ＰＭＳ」という）０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。
　反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。尚、酵素の希釈溶液は、終濃度として５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、及び１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡを含む溶液を使用した。

　グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（－（ΔＡ６００－ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。

（８）ＣｐＧＤＨの精製
　（７）に記載の液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社）でろ過して培養上清を回収した。

　回収した培養上清について、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ－６５０Ｓ（東ソー社）カラムを用いて夾雑蛋白を除去して精製した。精製サンプルを分画分子量１０，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換し、精製ＣｐＧＤＨとした。該精製ＣｐＧＤＨをＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、単一バンドを示すことを確認した。

［製造例２］
（レスベラトロールグルクロニドの取得）
　終濃度が２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、基質として１００ｍＭ相当のピセイド粉末（東京化成工業社）、メディエーターとして１０ｍＭ　ＴＢＨＱ、活性酸素の除去剤として２００Ｕ／ｍＬ　カタラーゼ（富士フィルム和光純薬社、ウシ肝臓由来）、２Ｕ／ｍＬ　ラッカーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、アスペルギルス属由来）からなる反応液に終濃度が１４Ｕ／ｍＬとなるよう製造例１で取得した精製ＣｐＧＤＨを添加し、反応系中のｐＨが６．５～７．０になるように１ＮのＮａＯＨを添加しながら、室温で通気を行いながら撹拌し、レスベラトロールグルクロニドを取得した。取得したレスベラトロールグルクロニドはダイヤイオンＨＰ２０（三菱ケミカル社）を用いた精製を行い、夾雑物を除去した。
　図１に、取得したレスベラトロールグルクロニドの¹Ｈ－ＮＭＲ解析及び¹³Ｃ－ＮＭＲ解析の結果を示す。

［実施例１］
（レスベラトロールグルクロニドの水／オクタノール分配係数）
　以下の方法でレスベラトロールグルクロニドの水／オクタノール分配係数（以下、ＬｏｇＰ）を算出した。

（分析用サンプルの調製）
　０．４５μｍフィルターで濾過したメタノールにサンプルを溶解させ、終濃度として１ｍＭのサンプル溶液を調製した。調製したサンプル溶液のうち、０．１ｍＬを正確に計り取り、減圧濃縮によって乾固させた後、０．４５μｍフィルターで濾過した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を０．２ｍＬ加え、４０℃で３０分間加温した。加温後、更に１－オクタノール　０．２ｍＬを加えて懸濁し、室温条件下で２，９００×ｇ、５分間遠心して懸濁液を２相に分離させた後、水相とオクタノール相を個別に回収し、分析用サンプルとした。

（ＨＰＬＣ分析とＬｏｇＰの算出）
　ＨＰＬＣ分析用カラムはＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８（５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）を使用し、ＨＰＬＣ分析装置としてＳＩＬ－１０Ａシリーズ（島津製作所）を、検出器にＵＶ－ＶＩＳ検出器ＳＰＤ－１０ＡＶ（波長３０５ｎｍ、島津製作所）を用いて、各相に含まれるサンプルのピーク面積を測定した。オクタノール相に存在するサンプルピーク面積（Ｃｏ）と水相に存在するサンプルピーク面積（Ｃｗ）から、ＬｏｇＰ＝Ｌｏｇ（Ｃｏ／Ｃｗ）の値を計算することで各サンプルのＬｏｇＰを算出した。
　その結果、ピセイドのＬｏｇＰは１．０１となったのに対し、レスベラトロールグルクロニドのＬｏｇＰは－２．１５となり、親水性が大幅に向上していることが確認できた。

［実施例２］
（レスベラトロールグルクロニドのヒアルロニダーゼ阻害活性）
　以下の方法でレスベラトロールグルクロニドのヒアルロニダーゼ阻害活性を評価した。

（試薬溶液の調製）
　０．１Ｍ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて３，３００Ｕ／ｍＬ　ヒアルロニダーゼＩＶ－Ｓ溶液（ウシ精巣由来、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．８ｍｇ／ｍＬ　ヒアルロン酸ナトリウム溶液（鶏冠由来、富士フィルム和光純薬社）、０．８ｍｇ／ｍＬ　コンパウンド４８／８０溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）、およびサンプルとしてピセイド溶液とレスベラトロールグルクロニド溶液を調製した。

（ヒアルロニダーゼ阻害活性の評価）
　表１の条件で各溶液をガラス試験管に分注した後、３７℃で２０分間のインキュベートを行った。インキュベート終了後、各試験管にコンパウンド４８／８０溶液を１００μＬ添加し、更に３７℃で２０分間のインキュベートを行った。インキュベート終了後、各試験管にヒアルロン酸ナトリウム溶液を２５０μＬずつ加え、３７℃で４０分間反応させた後、各試験管を氷上に５分間静置した。静置後の各試験管に０．４Ｍ　ＮａＯＨ溶液を１００μＬ添加して、氷上に５分間静置し、更に各試験管に０．８Ｍ　ホウ酸溶液を１００μＬ添加した後、沸騰水中で３分間加熱して酵素反応を停止させた。酵素反応停止後の各サンプルに１％　ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド酢酸溶液を３．０ｍＬ加え、３７℃で２０分間のインキュベートを行った。インキュベート終了後、各試験管から２００μＬの反応液を９６穴マイクロプレートに分取し、５８５ｎｍの吸光度測定を実施し、下記の式１を用いてヒアルロニダーゼ阻害率を算出した。

（式１）
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝（１－［（サンプルの吸光度－サンプルブランクの吸光度）／（コントロールの吸光度－コントロールブランクの吸光度）］）×１００

（評価結果）
　得られたレスベラトロールグルクロニド、及びピセイドのヒアルロニダーゼ阻害率を図２に示す。また、各サンプルのヒアルロニダーゼ阻害活性のＩＣ５０を算出した結果、レスベラトロールグルクロニドのＩＣ５０は約２００μＭとなり、同条件で比較したピセイドではヒアルロニダーゼ阻害活性はほぼ確認できなかった。また、レスベラトロールのヒアルロニダーゼ阻害活性のＩＣ５０は１，３００μＭ程度であることが既に公知である（非特許文献８）。これらの結果よりレスベラトロールグルクロニドはレスベラトロール、ピセイドと比較して高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有しており、ヒアルロン酸分解に伴う老化現象（シワ、たるみ等）を抑制する効果や、ヒアルロニダーゼが関与するアレルギー、炎症への効果が期待できる。

［実施例３］
（レスベラトロールグルクロニドのコラゲナーゼ阻害活性）
　以下の方法でレスベラトロールグルクロニドのコラゲナ－ゼ阻害活性を評価した。

（試薬溶液の調製）
　ダルベッコＰＢＳ（－）用いて、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼ　Ｂ溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）、５μＭ　蛍光基質溶液（ＭＯＣＡｃ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａ２ＰＲ（ＤＮＰ）－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＮＨ２、ペプチド研究所）、およびサンプルとしてレスベラトロールグルクロニド溶液を調製した。

（コラゲナーゼ阻害活性の評価）
　９６穴ブラックプレートに表２の条件で各溶液を分注した後、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、各区分に蛍光基質溶液を５０μＬずつ添加し、遮光条件下で３７℃、３０分間インキュベートした後、励起波長：３２０ｎｍ、蛍光波長：４０５ｎｍで測定し、レスベラトロールグルクロニドによるコラゲナーゼ阻害率を下記の式２を用いて算出した。

（式２）
コラゲナーゼ阻害率（％）＝（１－［（サンプルの蛍光強度　－　サンプルブランクの蛍光強度）／（コントロールの蛍光強度　－　コントロールブランクの蛍光強度）］）×１００

（評価結果）
　得られたレスベラトロールグルクロニドのコラゲナーゼ阻害率を図３に示す。また、各サンプルのコラゲナーゼ阻害活性のＩＣ５０を算出した結果、レスベラトロールグルクロニドのＩＣ５０はサンプル終濃度として約６０μＭとなった。また、レスベラトロールのコラゲナーゼ阻害活性のＩＣ５０は約４４０μＭ（非特許文献８）であることが既に知られている。これらの結果からレスベラトロールグルクロニドは高いコラゲナーゼ阻害活性を有しており、皮膚におけるコラーゲン分解に伴う老化現象（シワ、たるみ等）を抑制する効果が期待できる。

［実施例４］
（レスベラトロールグルクロニドの抗酸化活性）
　以下の方法でレスベラトロールグルクロニドの抗酸化活性を、ＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル、富士フィルム和光純薬社）を用いて測定した。

（試薬溶液の調製）
　４００μＭ　ＤＰＰＨ溶液を１０ｍＬ、０．２Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を１０ｍＬ、２０％エタノールを１０ｍＬ混合してプレミックス溶液を調製した。サンプル溶液として、レスベラトロール、ピセイド、レスベラトロールグルクロニド、及びトロロックス標準品（富士フィルム和光純薬社）をそれぞれ８０％エタノールに溶解させ、それを８０％エタノールで希釈することによって、任意の濃度のサンプル溶液を０．３ｍＬずつ調製した。

（ＤＰＰＨ除去能の評価）
　プレミックス溶液０．９ｍＬと終濃度が２４、４７、７１、９４、１１８μＭになるよう調製したサンプル溶液０．３ｍＬを混合し、室温で２０分間遮光した状態で静置することによってサンプルとＤＰＰＨを反応させた。反応終了後、９６穴マイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注し、５２０ｎｍの吸光度を測定した。その後、評価したトロロックスの濃度とＤＰＰＨラジカル消去活性との関係から、各サンプル１ｍｇ当たりのＤＰＰＨラジカル消去活性をトロロックス相当量（ｍｇ）として算出した。

（評価結果）
　各サンプル１ｍｇが有するＤＰＰＨラジカル消去活性をトロロックス相当量に換算すると、レスベラトロールが約０．６９４ｍｇ、ピセイドが約０．２１４ｍｇ、レスベラトロールグルクロニドが約０．１８８ｍｇとなり、レスベラトロールグルクロニドはピセイドと同程度のＤＰＰＨラジカル消去活性を維持していることが確認できた。
　このことからレスベラトロールグルクロニドは高い抗酸化活性を有しており、皮膚における老化現象（シワ、たるみ等）を抑制する効果、美白効果が期待できる。

［実施例５］
（レスベラトロールグルクロニドのチロシナーゼ阻害活性）
　以下の方法でレスベラトロールグルクロニドのチロシナーゼ阻害活性を評価した。

（試薬溶液の調製）
　５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて、３１０Ｕ／ｍＬ　チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）、５ｍＭ　Ｌ－ＤＯＰＡ（Ｔｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、およびサンプルとしてレスベラトロールグルクロニド溶液を調製した。

（チロシナーゼ阻害活性の評価）
　９６穴マイクロプレートに表３に記載の条件で各溶液を分注し、分注直後の４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その後室温で３０分間静置した後、再度４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、下記の式３を用いてチロシナーゼ阻害率を算出した。

（式３）
チロシナーゼ阻害率（％）＝［１－（（３０分静置後のサンプルの吸光度　－　調製直後のサンプルの吸光度）－（３０分静置後のサンプルブランクの吸光度　－　調製直後のサンプルブランクの吸光度））／（３０分静置後のコントロールの吸光度　－　調製直後のコントロールの吸光度）］×１００

（評価結果）
　レスベラトロールグルクロニドのチロシナーゼ阻害率を図４に示す。その結果、レスベラトロールグルクロニドは終濃度として５ｍＭの添加量で、チロシナーゼ活性を４０％程度阻害することが確認できた。このことからレスベラトロールグルクロニドは皮膚の美白効果が期待できる。

［実施例６］
（レスベラトロールグルクロニドの水への溶解性）
　レスベラトロールグルクロニドの水への溶解性を確認するため、室温条件下でレスベラトロールグルクロニドを超純水に懸濁し、１時間振盪し、溶解させた。振盪後、目視で溶解しているかを確認した結果、レスベラトロールグルクロニドは超純水に終濃度１０ｍＭの条件において完全に溶解していることを確認した。

Claims

　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗炎症剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗アレルギー剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗酸化剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする抗老化剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とするメラニン生成抑制剤。
　レスベラトロールグルクロニドを有効成分とする美白剤。
　レスベラトロールグルクロニドを含有する皮膚外用剤。
　基礎化粧料及びメイクアップ用化粧料から選ばれるものである請求項１０記載の皮膚外用剤。
　ヒアルロニダーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　抗炎症剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　抗アレルギー剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　コラゲナーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　抗酸化剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　抗老化剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　チロシナーゼ阻害剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　メラニン生成抑制剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　美白剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　皮膚外用剤を製造するためのレスベラトロールグルクロニドの使用。
　皮膚外用剤が基礎化粧料及びメイクアップ用化粧料から選ばれるものである請求項２１記載の使用。
　ヒアルロニダーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　抗炎症に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　抗アレルギーに使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　コラゲナーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　抗酸化に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　抗老化に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　チロシナーゼ阻害に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　メラニン生成抑制に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　美白に使用するためのレスベラトロールグルクロニド。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するヒアルロニダーゼ阻害方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗炎症方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗アレルギー方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するコラゲナーゼ阻害方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗酸化方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する抗老化方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するチロシナーゼ阻害方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用するメラニン生成抑制方法。
　レスベラトロールグルクロニドを、それを必要とする対象に有効量で投与又は使用する美白方法。