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WO2022039279A1 - ヒト始原生殖細胞／ヒト始原生殖細胞様細胞の維持増幅方法 - Google Patents

ヒト始原生殖細胞／ヒト始原生殖細胞様細胞の維持増幅方法 Download PDF

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WO2022039279A1
WO2022039279A1 PCT/JP2021/030701 JP2021030701W WO2022039279A1 WO 2022039279 A1 WO2022039279 A1 WO 2022039279A1 JP 2021030701 W JP2021030701 W JP 2021030701W WO 2022039279 A1 WO2022039279 A1 WO 2022039279A1
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WO
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cells
hpgclc
hpgc
cell
culture
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PCT/JP2021/030701
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English (en)
French (fr)
Inventor
通紀 斎藤
佑介 村瀬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
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Publication date
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Priority to US18/042,134 priority patent/US20240271088A1/en
Priority to CN202180050606.4A priority patent/CN116323917A/zh
Priority to JP2022544032A priority patent/JPWO2022039279A1/ja
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    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for maintaining and amplifying human primordial germ cells / human primordial germ cell-like cells, a reagent for that purpose, and the like.
  • Germline ensures continuity and diversity of epigenic information across generations as well as genetic information, thereby providing the basis for the permanence and evolution of a given species.
  • abnormal germ cell development results in pathological conditions including infertility and genetic or epigenetic disorders of offspring. Therefore, research on the developmental mechanism of germ cells is a fundamental theme of both biology and medicine.
  • mice Using mice as model animals, studies on the mechanism of germ cell development in mammals have been conducted, and in vitro reconstitution of germ cell development in mice has been reported.
  • PGC primordial germ cells
  • PGCLC primordial germ cell-like cells
  • human PGC may be referred to as "hPGC" / hPGCLC.
  • hPGCLC can be maintained and amplified by culturing the isolated hPGCLC in the presence of forskolin and cytokines.
  • hPGCLC can be cultured for a long period of time (for example, 120 days or more). It was confirmed from the analysis of the gene expression state that the hPGCLC cultured by the method of the present invention proliferated while maintaining the properties of the initial human PGC. Moreover, from the analysis of the genomic DNA methylation state, it was found that hPGCLC generally maintained the DNA methylation state during the culture period.
  • Patent Document 1 This is in contrast to the mPGCLC culture system (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1) in which genome-wide DNA demethylation associated with proliferation was observed, and epigenome information in humans is different from that in mice. It was suggested that the reorganization of the mouse may proceed.
  • the present inventors further performed reconstituted ovarian culture that mimics the intraovarian environment in order to verify the function of the proliferated hPGCLC.
  • hPGCLC-derived cells express genes such as DDX4 (also known as VASA homolog) and DAZL, and differentiate into oogonia-like cells morphologically characterized by oogonia. .. That is, it was confirmed that the properties as germ cells are maintained in this culture system.
  • the present inventors measured the number of cells dedifferentiated from amplified hPGCLC by FACS analysis using hPGC marker, dead cell marker, and human-specific cell surface antigen in the maintenance amplification culture of hPGCLC, and degenerated.
  • hPGC marker, dead cell marker, and human-specific cell surface antigen in the maintenance amplification culture of hPGCLC, and degenerated.
  • a method for evaluating the maintenance amplification efficiency of hPGCLC in the culture system was established.
  • hPGC marker-positive cells and other cells are sorted without selecting hPGCLC-derived cells and feeder cells, and non-hPGC marker-positive cells are analyzed by FACS. It was found that the cells dedifferentiated from hPGCLC and the feeder cells can be distinguished by attaching them to the FSC / SSC two-dimensional plot.
  • the present inventors used the evaluation method to add inhibitors of various signaling pathways to the above-mentioned maintenance amplification culture system of hPGCLC, and the maintenance amplification efficiency of hPGCLC (dedifferentiation rate from hPGCLC). It was found that a Wnt signaling inhibitor, particularly a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation, remarkably suppresses the dedifferentiation of hPGCLC. As a result of further research based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method for maintaining and amplifying human primordial germ cells (hPGC) or human primordial germ cell-like cells (hPGCLC) derived from human pluripotent stem cells.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • EGF epithelial growth factor
  • cytokine is a combination of LIF and EGF, bFGF alone, or a combination of LIF, EGF and bFGF.
  • hPGCLC is induced via human early mesoderm-like cells (hiMeLC).
  • hPGCLC, hiMeLC in the presence of bone morphogenetic protein 4 (BMP4) and optionally one or more cytokines selected from the group consisting of stem cell factor (SCF), LIF and EGF for 5-8 days.
  • BMP4 bone morphogenetic protein 4
  • SCF stem cell factor
  • EGF EGF
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], which comprises selecting hPGC or hPGCLC using hPGC marker positive as an index and subculturing in the culture.
  • the hPGC marker is BLIMP1 and / or TFAP2C, or INTERGRIN ⁇ 6 and EpCAM.
  • a method for producing a cell population containing hPGC or hPGCLC which comprises a step of maintaining and amplifying hPGC and / or hPGCLC by the method according to any one of [1] to [10] and [10a].
  • An amplified hPGC population or hPGCLC population obtained by the method according to any one of [1] to [10] and [10a].
  • a reagent kit for maintaining and amplifying hPGC or hPGCLC which comprises (a) a forskolin or PDE4 inhibitor, and (b) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • [16] The reagent kit according to any one of [13] to [15], further comprising a Wnt signaling inhibitor.
  • [16a] The reagent kit according to [16], wherein the Wnt signaling inhibitor is a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation.
  • [16b] The reagent kit according to [16], wherein the Wnt signaling inhibitor is IWR1 or XAV939.
  • [17] The reagent kit according to any one of "13" to [16], [16a] and [16b], further comprising an antibody against INTERIN ⁇ 6 and / or an antibody against EpCAM.
  • [18] A method for producing human oogonia / progenitor germ cell-like cells, which comprises agglutinating the hPGC or hPGCLC according to [12] with ovarian somatic cells. [18a] The method of [18], wherein the ovarian somatic cells are of non-human mammal origin. [19] A method for evaluating maintenance culture of hPGC or hPGCLC. (1) A step of culturing hPGC or hPGCLC on feeder cells under predetermined conditions. (2) A step of selecting live cells from the cell population obtained in (1), (3) A step of sorting the living cells obtained in (2) into hPGC marker-positive cells and other cells.
  • enrichment score log 2 (number of cells positive for hPGC marker / number of cells dedifferentiated)
  • the method according to [19] or [19a] which is performed based on the enrichment score represented by.
  • a method for screening a dedifferentiation inhibitor of hPGC or hPGCLC is cultured on feeder cells under predetermined conditions.
  • the maintenance efficiency of hPGC or hPGCLC was evaluated by the method of [19], [19a], [19b] or [20].
  • C When the maintenance efficiency in the presence of the candidate substance is higher than the maintenance efficiency in the absence of the candidate substance, the candidate substance is selected as a dedifferentiation inhibitor of hPGC or hPGCLC. Including, method.
  • the present invention also provides the following: [22] A method for maintaining and amplifying PGC or PGCLC, which comprises culturing PGC or PGCLC in the presence of a Wnt signaling inhibitor. [22a] The method of [22], wherein the culture is carried out under conditions further comprising forskolin and / or a PDE4 inhibitor. [22b] PGC or PGCLC is a human cell, the culture further comprises (i) forskolin or a PDE4 inhibitor, and / or (ii) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF. The method according to [22], which is carried out under the conditions further including.
  • PGCs or PGCLCs are non-human animal cells and cultures are performed under conditions that further include (i) forskolin and PDE4 inhibitors and / or (ii) cyclosporin A (CsA). 22].
  • [22d] The method according to [22], [22a], [22b] or [22c], wherein the Wnt signaling inhibitor is a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation.
  • the Wnt signaling inhibitor is IWR1 or XAV939.
  • a method for suppressing PGC or PGCLC dedifferentiation which comprises doubling the cells in the presence of a Wnt signaling inhibitor in a maintenance-amplified culture of PGC or PGCLC.
  • PGC or PGCLC is a human cell, the culture further comprises (i) forskolin or a PDE4 inhibitor, and / or (ii) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF.
  • the method according to [23] which is carried out under the conditions further including.
  • PGC or PGCLC is a non-human animal cell and the culture is carried out under conditions that further include (i) forskolin and a PDE4 inhibitor and / or (ii) CsA, according to [23]. the method of. [23d] The method according to [23], [23a], [23b] or [23c], wherein the Wnt signaling inhibitor is a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation. [23e] The method according to [23d], wherein the Wnt signaling inhibitor is IWR1 or XAV939. [24] A PGC or PGCLC dedifferentiation inhibitor comprising a Wnt signaling inhibitor. [25] A method for producing PGCLC, which comprises inducing differentiation of pluripotent stem cells (PSC) into PGCLC in the presence of a Wnt signaling limiting agent.
  • PSC pluripotent stem cells
  • hPGC or hPGCLC can be cultured for a long period of time (for example, 120 days or more) and amplified 1 million times or more.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Conditions for mPGCLC amplification green. Conditions without additional chemicals / cytokines: gray. Search for conditions that amplify hPGCLC in vitro.
  • C BT + AG + FACS passage scheme of cells. BT + and AG + cells were defined as cells within the designated FACS gate. Search for conditions that amplify hPGCLC in vitro.
  • D A series of experiments of BT + AG + cell amplification in designated basal medium containing 15% KSR, 2.5% FBS, 100 ng / ml SCF, 10 ⁇ M forskolin, and 20 ng / ml bFGF. result.
  • the graph on the right side of the chart shows TRA-1-85 + / BT + AG + cells (purple), TRA-1-85 + / non-BT + AG + cells (green), TRA-1-85 - cells (red), And DRAQ7 + cell (blue) ratio is shown.
  • D Relief contrast (left) and fluorescence images of amplified culture of BT + AG + cells at c30, 70 and 120 [BT (center) and AG (right)]. When AG + cells were cultured two-dimensionally on the plate, the fluorescence of AG became dark. Scale bar, 50 ⁇ m. Long-term growth of hPGCLC under specified conditions in vitro.
  • the TRA-1-85 - m220 feeder shows weak autofluorescence and is plotted diagonally below BT + AG + cells when sorted by BTAG fluorescence.
  • D Karyotype analysis by array comparative genomic hybridization (aCHG) of parental 585B1 BTAG hiPSC (upper) and BT + AG + cells (lower) in c70 in amplified culture, nuclei in BT + AG + cells in c70. The type indicates that it is substantially retained.
  • aCHG array comparative genomic hybridization
  • BT + AG + cells are amplified and cultured with related cell types [hiPSC, iMeLC, d6 hPGCLC and d6 hPGCLC-derived cells cultured in xr ovary (Yamashiro et al., 2018)].
  • c Number of culture days during amplification culture; ag: Number of culture days during agglutination culture in xr ovary Transcriptome analysis between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • B Principal component analysis (PCA) of the transcriptome of cells similar to (A). Cells were plotted on a two-dimensional plane defined by PC1 and PC2 values. The meaning of the colors is as shown. Transcriptome analysis between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • C Heat map representation of gene expression that characterizes the differentiation process of hiPSC-derived oogonia / gonocyte-like cells in cells similar to (A) (genes of clusters 1-5; Yamashiro et al., 2018).
  • A Comparison of transcriptome dispersal diagrams between the indicated cell types between d6 hPGCLC to BT + AG + cell amplification.
  • the up-regulated and down-regulated genes [log 2 (RPM + 1) ⁇ 4, log 2 (magnification of change) ⁇ 1] in the cell type on the Y-axis are shown in red and blue, respectively.
  • a gene (DEG) differentially expressed between BT + AG + cells during BT + AG + cell amplification culture.
  • B Representative genes of GO enrichment and DEG in genes differentially expressed between d6 hPGCLC and c10 BT + AG + cells. The meaning of the colors is as shown.
  • C (Left) Comparison of dispersion diagram between c30 of BT + AG + cells and ag7 (top) or ag21 (bottom). The meaning of the color is as shown in (A). (Right) GO enrichment and representative genes in genes differentially expressed between BT + AG + cells between c30 and ag7 (top) or ag21 (bottom). The meaning of the colors is as shown. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • A Genome-wide DNA methylation profile measured by whole genome bisulfite sequence (WGBS) analysis in BT + AG + cells during amplification culture of BT + AG + cells.
  • a violin diagram (Violin-prot) of levels [5-methylcytosine (5 mC) levels] and the associated cell types shown. The average level is indicated by a red bar. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • B Comparison of dispersal diagrams combined with a genome-wide 5mC level (genome-wide 2kb window) histogram representation (top and right side of the dispersal diagram) between the indicated cell types.
  • Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures (C) Heat map display showing 5 mC levels in the indicated genomic elements on the autosomal in the indicated cell type. HCP / ICP / LCP: Strong / moderate / weak CpG promoter. The meaning of the colors is as shown. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • D Heat map display showing 5 mC levels in the indicated repeat elements on the autosomal chromosome in the indicated cells.
  • Truncated elements were excluded using repeat elements of repStart ⁇ 5 and repEnd> 5 kb for LINE, ERVK, ERVL, and ERV1 and repStart ⁇ 5 and repEnd > 310 for SINE.
  • E Heat map display showing 5 mC levels in the differentially methylated regions of the indicated imprinted genes in the indicated cells. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • F IF analysis of DNMT1 or UHRF1 expression in hiPSC and c66 BT + AG + cells.
  • hiPSC was co-stained with NANOG; c66 BT + AG + cells were co-stained with GFP (AG); both cell types were counterstained with DAPI.
  • the lower panel is an enlarged view of the upper panel. Scale bar, 20 ⁇ m. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • G A violin plot representing genome-wide 5 mC levels in CpG, CpA, CpT and CpC sequences in mouse germ cells in vivo. The median level is indicated by a yellow bar. E: embryogenic day; F: female; M: male.
  • c number of culture days in amplification culture; ag: number of culture days in agglutination culture in xr ovary. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • H Violin plot representing genome-wide 5 mC levels in CpG, CpA, CpT and CpC sequences in cells during in vitro mPGCLC induction and amplification. The median level is indicated by a yellow bar.
  • c number of culture days in amplification culture; ag: number of culture days in agglutination culture in xr ovary. Genome-wide methylation profile of BT + AG + cells between BT + AG + cellular amplification cultures.
  • c number of culture days in amplification culture; ag: number of culture days in agglutination culture in xr ovary. Genome-wide DNA methylation profile of BT + AG + cells during amplification culture.
  • B DNA methylation profile near the MT1 gene cluster in cells during hPGCLC induction, amplification, and differentiation in the xr ovary. Genome-wide DNA methylation profile of BT + AG + cells during amplification culture.
  • C (Top) Expression kinetics measured by RNA-seq analysis of TCL1A in the cell type shown, also seen in FIG. 5, (Bottom) d6 PGCLC (3 replicates) and c10, c70. And 5 mC levels in the promoter of TCL1A in BT + AG + cells of c120 (2 replicates each).
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • (B) Brightfield images and FACS plots of BTAG expression in cells of the xr ovary in ag77 by d6 hPGCLC (top) or d6c30 BT + AG + cells (bottom). Scale bar, 200 ⁇ m. Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • D TFAP2C, FOXL2, SOX17, DAZL, DDX4 and AG + (yellow) cells / mouse ovarian somatic cells in xr ovary in ag77 by d6 hPGCLC (left) or d6c30 BT + AG + cells (right).
  • hMC human mitochondrial antigen
  • BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • E Expression of the indicated genes in BT + AG + cells isolated from xr ovaries in ag7, ag35, and ag77 produced by d6 hPGCLC (black) or d6c30 BT + AG + cells (red).
  • qPCR analysis For each gene tested, ⁇ Ct was calculated from the mean Ct values (set to 0) of the two independent housekeeping genes RPLP0 and PPIA and plotted for the two independent experiments. The average values are connected by lines. The absence of a mean bar indicates that gene expression was detected in only one of the two replicates. * : Not detected.
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • F 5 mC levels of the promoter of the indicated gene in the indicated cell type. The number below the indication of cell status indicates the number of replicates. Mean promoter methylation levels of DPPA3 and PIWIL2 in d6c10 cells were significantly reduced compared to those of d6 hPGCLC (Welch's t-test, P ⁇ 0.05).
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • G Box plot analysis of 5 mC level promoters of cluster 3 genes as in (FIG.
  • Asterisk means RNA-seq data of ag35 and ag77 cells produced in this study.
  • blue and red arrows indicate ag35 / 77 BT + AG + cell data from d6 hPGCLC and c30 BT + AG + cells, respectively. The meaning of the colors is as shown.
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • (I) A heat map showing the expression of the genes of clusters 1-5 in FIG. 7C in BT + AG + cells isolated from xr ovaries in ag35 and ag77 produced by d6 hPGCLC or d6c30 BT + AG + cells.
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • K (Left) Genome-wide 5 mC level violin plot (Violin-plot) measured by genome-wide bisulfite sequence analysis in the cell types shown. The average level is indicated by a red bar.
  • RV Comparison of scatter plots combining genome-wide 5 mC levels (genome-wide 2 kb window) with histogram displays (top and right of the scatter-plot) among the cell types shown.
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • Amplified BT + AG + cells differentiate into oogonia / gonocute-like cells in the xr ovary.
  • BT + AG + cells in maintenance-amplified culture differentiate into oogonia / progenitor-like cells in the xr ovary.
  • BT + AG + cells in maintenance-amplified culture differentiate into oogonia / progenitor-like cells in the xr ovary.
  • B Unsupervised hierarchical clustering of transcriptomes of BT + AG + cells during maintenance amplification culture and differentiation in xr ovary is shown with the indicated related cell types. The Euclidean distance and Ward's method were used. * Shows RNA-seq data of ag35 and ag77 cells obtained in the present invention. The meaning of each color is as shown in the upper right.
  • BT + AG + cells in maintenance-amplified culture differentiate into oogonia / progenitor-like cells in the xr ovary.
  • C A heat map showing 5mC levels in the indicated repeating elements on the autosomal in the indicated cell type. For LINE, ERVK, ERVL and ERV1, repStart ⁇ 5 and repEnd> 5 kb were used, and for SINE, repStart ⁇ 5 and repEnd > 310 were used to eliminate shortened elements.
  • BT + AG + cells in maintenance-amplified culture differentiate into oogonia / progenitor-like cells in the xr ovary.
  • PGCLC was induced from a human iPSC having the PGCLC reporter gene BLIMP1-2A-tdTomato / AP2 ⁇ -2A-eGFP (BTAG) and cultured.
  • the cell population negative for the dead cell staining reagent DRAQ7 and negative for the human-specific cell surface antigen TRA-1-85 is considered to be mouse-derived feeder cells (m220-5), with forward-scattered light (FSC) and lateral-scattered light.
  • FSC forward-scattered light
  • SSC forward-scattered light
  • TRA-1-85 positive cells are considered to be derived from hPGCLC, but non-BTAG double-positive cells other than BTAG double-positive proliferating hPGCLC have low SSC values in the FSC / SSC two-dimensional plot.
  • the pattern in which FSC takes a wide range of values is shown (green).
  • the feeder cells and non-BTAG double-positive cells were displayed on the same FSC / SSC two-dimensional plot, the respective cell populations were seen almost independently and were distinguishable (purple).
  • the number after the lowercase letter "c” indicates the number of days of culture. It is a figure which shows the effect of suppressing the dedifferentiation of PGCLC by the Wnt signaling inhibitor.
  • the present invention provides a method for maintaining and amplifying human primordial germ cell-like cells (hPGCLC) derived from human primordial germ cells (hPGC) or human pluripotent stem cells (hPSC).
  • the method uses hPGC or hPGCLC.
  • hPGCLC Forskolin or phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor, and (ii) selected from the group consisting of basic fibroblast growth factor (bFGF), leukemia inhibitory factor (LIF) and epidermal growth factor (EGF) 1 Includes culturing in the presence of the above cytokines.
  • PDE4 forskolin or phosphodiesterase 4
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • EGF epidermal growth factor
  • the hPGC used in the present invention can be isolated by any method known per se in the art (see, for example, Patent Document 1). For example, it can be isolated from the tissue of a dead fetus about 5 to 9 weeks gestation by a method such as FACS using the expression of hPGC-specific markers (eg, INTEGRIN ⁇ 6, EpCAM, etc.) as an index, but the present invention is not limited thereto.
  • the hPGCLC used in the present invention may be any as long as it is derived in vitro from the isolated hPSC and has the same characteristics as hPGC.
  • the hPGCLC can be produced from the isolated hPSC by the method shown below.
  • hPGCLC Production of hPGCLC from hPSC
  • the hPSC used as a starting material for the production of hPGCLC has "self-renewal ability" capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and "pluripotency” capable of differentiating into all three primary germ layers.
  • Any isolated undifferentiated cell may be used.
  • isolated means that it has been placed in an in vivo to in vitro state, and does not necessarily have to be purified.
  • isolated PSCs include iPS cells, ES cells, embryonic reproductive (EG) cells, embryonic cancer (EC) cells and the like, with iPS cells or ES cells being preferred.
  • ES cells examples include, but are not limited to, methods of culturing the inner cell mass (Thomson JA, et al., Science. 282, 1145-1147, 1998).
  • ES cells can be obtained from a predetermined institution, and can also be purchased as a commercial product.
  • human ES cell lines H1 and H9 are available from the WiCell Institute at the University of Wisconsin, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • iPS cells can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of nucleic acids (DNA or RNA) or proteins, with properties similar to ES cells, such as pluripotency and self.
  • Artificial stem cells derived from somatic cells having the ability to proliferate by replication (Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; Takahashi, K. et al. (2007) Cell, 131: 861-872; Yu, J. et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 101-106; WO 2007/069666).
  • somatic cell refers to any human cell except germline cells such as eggs, oocytes, ES cells and totipotent cells.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal somatic cells, neonatal somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells, passaged cells, and somatic cells. Any of the cell lines are included.
  • the somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, (3) lymphocytes, and epithelium.
  • Endothelial cells muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lung cells, renal cells And differentiated cells such as fat cells are exemplified.
  • Reprogramming factors are genes that are specifically expressed in ES cells, their gene products or non-coding RNAs, or genes that play an important role in maintaining undifferentiated ES cells, their gene products or non-coding factors. It may be composed of a coding RNA or a small molecule compound. Genes contained in the reprogramming factor include, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, ECAT15.
  • initialization factors may be used alone or in combination.
  • the combinations of initialization factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 /.
  • Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 can be used as initialization factors. More preferably, in addition to the three factors, Myc family members (M) selected from L-Myc, N-Myc and c-Myc (including the T58A mutant) can be used.
  • M Myc family members
  • Lin28 promotes the formation of TRA-1-60 positive cells and inhibits reversion to TRA-1-60 negative cells, so in addition to factor 3 (OSK) or factor 4 (OSKM), Lin28 It is also preferable to use it as an initialization factor.
  • the reprogramming factors include, for example, histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg, small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), tricostatin A, sodium butyrate, MC1293, M344, siRNA and shRNA against HDACs (eg, siRNA and shRNA against HDAC).
  • HDAC histone deacetylase
  • nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipole), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg, PD184352, PD026059, PD026059, PD026059) , Glycogen synthase kinase-3 inhibitors (eg Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg 5-azacitidine), histone methyltransferase inhibitors (eg BIX-01294 and other small molecule inhibitors, Suv39h1, Suv39h2).
  • HDAC1 siRNA Smartpool registered trademark
  • HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 OriGene
  • MEK inhibitors eg, PD184352, PD026059, PD026059, PD026059
  • Glycogen synthase kinase-3 inhibitors eg Bio and CHIR990
  • Nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against SetDB1 and G9a), L-channel calcium agonists (eg Bayk8644), butyric acid, TGF ⁇ inhibitors or ALK5 inhibitors (eg LY364497, SB431542, 616453 and A-83-).
  • p53 inhibitors eg siRNA and shRNA against p53
  • ARID3A inhibitors eg siRNA and shRNA against ARID3A
  • miRNAs such as miR-291-3p, miR-294, miR-295 and mir-302, Wnt
  • signaling agonists eg, soluble Wnt3a
  • neuropeptides Y eg, soluble Wnt3a
  • prostaglandins eg, prostaglandins E2 and prostaglandins J2
  • hTERT SV40LT
  • UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1 e.g, SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1 and the like.
  • the reprogramming factor is, for example, lipofection, fusion with cell membrane permeable peptides (eg, HIV-derived TAT and polyarginine) (Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4 (5): 381-4). , May be introduced into somatic cells by a method such as microinjection.
  • cell membrane permeable peptides eg, HIV-derived TAT and polyarginine
  • the reprogramming factor When the reprogramming factor is in the form of DNA, it can be introduced into somatic cells by a method such as a virus, a plasmid, a vector such as an artificial chromosome, lipofection, a liposome, or microinjection.
  • a viral vector examples include a retrovirus vector, a lentiviral vector (Cell, 126: 663-676, 2006; Cell, 131: 861-872, 2007; Science, 318: 1917-1920, 2007), an adenoviral vector (Science, 322: 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (Hemagglutinating Virus of Japan vector) (WO 2010/008054) and the like are exemplified.
  • the artificial chromosome vector includes, for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC, PAC) and the like.
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites, etc. so that the nuclear reprogramming substance can be expressed, and further, if necessary, a drug resistance gene (eg, drug resistance gene).
  • the vector has LoxP sequences before and after introduction into somatic cells in order to excise both the gene encoding the reprogramming factor or the promoter and the gene encoding the reprogramming factor that binds to the promoter. You may.
  • RNA morphology it may be introduced into somatic cells by a method such as lipofection or microinjection, and 5-methylcytidine and pseudouridine (TriLink Biotechnologies) are incorporated in order to suppress degradation.
  • RNA may be used (Warren, L. (2010) Cell Stem Cell, 7: 618-630).
  • the RNA form reprogramming factor may be introduced into somatic cells using an RNA viral vector such as Sendai viral vector (Patent No. 5963309).
  • a method of introducing a predetermined synthetic mRNA into a somatic cell using a cationic vehicle and reprogramming it Cell Stem Cell.
  • the reprogramming factor may be a small molecule compound.
  • VPA VPA
  • CHIR99021, 616452 tranylcypromine
  • forskolin forskolin
  • DZNep DZNep
  • the cells After contacting the reprogramming factors, the cells are subjected to, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME cultures containing 10-15% FBS (these cultures are further supplemented with LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L- Glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained) or a commercially available culture medium [for example, a culture medium for primate ES cell culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell)). , Serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology)] and the like are included.
  • DMEM DMEM / F12 or DME cultures containing 10-15% FBS
  • LIF penicillin / streptomycin
  • puromycin puromycin
  • L- Glutamine non-essential amino acids
  • ⁇ -mercaptoethanol etc.
  • a commercially available culture medium for example, a culture medium for primate ES cell
  • the somatic cells and the reprogramming factor are brought into contact with each other on DMEM or DMEM / F12 culture medium containing 10% FBS and cultured for about 4 to 7 days. Then, the cells are re-sown on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and about 10 days after the contact between the somatic cells and the reprogramming factor, the culture medium for bFGF-containing primate ES cell culture is used. It can be cultured to give rise to iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • ES-like colonies can be generated after about 25 to about 30 days or more. ..
  • the reprogrammed somatic cells themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin-). 5 (WO2009
  • Selection of candidate colonies for iPS cells includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method by visual morphological observation.
  • the former includes, for example, a drug resistance gene and / or a drug resistance gene at the locus of a gene specifically highly expressed in a pluripotent cell (eg, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a pluripotent cell eg, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, preferably Nanog or Oct3 / 4.
  • a pluripotent cell eg, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, preferably Nanog or Oct3 / 4
  • Using recombinant cells targeted to the reporter gene drug-resistant and / or reporter activity-positive colonies are selected.
  • a method of selecting a candidate colony by visual observation of morphology for example, Takahashi et al. , Cell, 131, 861-872 (2007).
  • the hPSC obtained by the above method is cultivated using feeder cells or serum, it is desirable to cultivate under the culture conditions having a known composition.
  • serum-free and feeder-free conditions for example, Nakagawa M, et al. , Scientific Rep. No on extracellular matrix (eg, Laminin 5 (WO2009 / 123349), Laminin 5 fragments (eg, Laminin-5E8 (Nippi)) and Matrigel (BD)), such as the method described in 4,3594, 2014. It is a method of culturing using a serum medium (for example, mTeSR (Stemcell Technology), Essential 8 (Life Technologies) and StemFit (Ajinomoto)).
  • mTeSR StemTeSR
  • Essential 8 Life Technologies
  • StemFit Ajinomoto
  • Human ES cells and iPS cells have biological (morphological, molecular and functional) characteristics that are very different from those of mouse ES cells and iPS cells.
  • Mouse pluripotent stem cells can exist in two functionally distinct states: LIF-dependent ES cells and bFGF-dependent epiblast stem cells (EpiSC). Molecular analysis suggests that the pluripotent state of human ES cells and iPS cells is not that of mouse ES cells and iPS cells, but rather similar to that of mouse EpiSC. Therefore, by culturing hPSC in the presence of BMP4 and LIF, differentiation can be induced into hPGCLC (Cell. 2009 May 1; 137 (3): 571-84).
  • Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc and Nanog are ectopically induced in the presence of LIF (Cell Stem Cell. 2010 Jun 4; 6 (6): 535-46), or LIF and GSK3 ⁇ . And by in combination with ERK1 / 2 pathway inhibitors to ectopically induce Oct3 / 4, Klf4 and Klf2 (Proc Natl Acad Sci US A. 2010 May 18; 107 (20): 9222-7).
  • Human ES and iPS cells also referred to as naive human ES and iPS cells
  • naive human ES and iPS cells in a pluripotent state like mouse ES cells have been established. These naive human ES and iPS cells are more immature than conventional human ES and iPS cells in their pluripotency and can be used as a starting material for the present invention.
  • Examples of the basic medium for inducing differentiation include Neurobasal medium, Natural Projector Basic medium, NS-A medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, minimum essential medium (MEM), Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, and Dalveco modification.
  • Eagle's medium (DMEM) Glassgow's minimum essential medium (GMEM), Applied MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, DMEM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fisher's medium, and a mixture of these.
  • DMEM Minimum essential medium
  • GMEM Glassgow's minimum essential medium
  • IMDM medium Applied MEM Zinc Option medium
  • IMDM medium Medium 199 medium
  • DMEM / F12 medium ham medium
  • RPMI 1640 medium Fisher's medium
  • the basal medium can be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • a serum-free medium can be used.
  • Serum-free medium means a medium that does not contain any untreated or unpurified serum, and thus includes a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (growth factors, etc.). Can be.
  • the concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum etc.
  • SFM may or may not include any serum substitute.
  • Serum substitutes include, for example, albumin (eg, lipid-rich albumin, albumin substitutes such as recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolyzate, etc.), transferrin (or other iron transporter), fatty acids, insulin. , Collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol, or equivalents thereof, and the like as appropriate.
  • albumin eg, lipid-rich albumin, albumin substitutes such as recombinant albumin, plant starch, dextran and protein hydrolyzate, etc.
  • transferrin or other iron transporter
  • fatty acids insulin.
  • Collagen precursors e.g., trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol, or equivalents thereof, and the like as appropriate.
  • Such serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO 98/30679. Further, for the sake of simplicity, a commercially available product can be used.
  • the basal medium may contain other additives known per se.
  • Additives are not particularly limited, but are, for example, growth factors (eg, insulin, etc.), polyamines (eg, putrecin, etc.), minerals (eg, sodium selenate, etc.), sugars (eg, glucose, etc.), organic acids (eg, glucose, etc.).
  • each additive is contained in a concentration range known per se.
  • amino acids eg, non-essential amino acids (NEAA), L-glutamine, etc.
  • reducing agents eg, 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins eg, ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • Steroids eg, [beta] -estradiol, progesterone, etc.
  • antibiotics eg, streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.
  • buffers eg, HEPES, etc.
  • nutritional additives eg, B27 supplement, N2 supplement, StemPro).
  • -Nutrient Supplement, etc. can be mentioned. It is preferable that each additive is contained in a concentration range known per se.
  • the hPSC may be cultured in the presence or absence of feeder cells.
  • the feeder cells are not particularly limited, and feeder cells known per se can be used for use in culturing pluripotent stem cells such as ESC and iPSC.
  • fibroblasts mouse embryonic fibroblasts, mouse fibroblast line STO, etc.
  • the feeder cells are inactivated by a method known per se, for example, treatment with radiation (gamma rays or the like) or an anticancer agent (mitomycin C or the like).
  • the hPSC is cultured under feeder-free conditions.
  • the concentration of BMP4 added to the basal medium is, for example, about 100 ng / ml or more, preferably about 200 ng / ml or more, and more preferably about 300 ng / ml or more.
  • the concentration of BMP4 is, for example, about 1,000 ng / ml or less, preferably about 800 ng / ml or less, and more preferably about 600 ng / ml or less.
  • BMP4 may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • the concentration of LIF added to the basal medium is, for example, about 300 U / ml or more, preferably about 500 U / ml or more, and more preferably about 800 U / ml or more.
  • the concentration of LIF is, for example, about 2,000 U / ml or less, preferably about 1,500 U / ml or less, and more preferably about 1,200 U / ml or less.
  • a medium supplemented with BMP4 and LIF can be used as a differentiation-inducing medium.
  • the LIF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • the differentiation-inducing medium may further contain at least one additive selected from SCF, BMP8b and EGF.
  • SCF, BMP8b and EGF significantly prolong the duration of hPGCLC maintenance in Blimp1- and Stella-positive states when present in the effective concentration range.
  • the concentration of SCF is, for example, about 30 ng / ml or more, preferably about 50 ng / ml or more, and more preferably about 80 ng / ml or more.
  • the concentration of SCF is, for example, about 200 ng / ml or less, preferably about 150 ng / ml or less, and more preferably about 120 ng / ml or less.
  • the SCF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • the concentration of BMP8b is, for example, about 100 ng / ml or more, preferably about 200 ng / ml or more, and more preferably about 300 ng / ml or more.
  • the concentration of BMP8b is, for example, about 1,000 ng / ml or less, preferably about 800 ng / ml or less, and more preferably about 600 ng / ml or less.
  • the concentration of EGF is, for example, about 10 ng / ml or more, preferably about 20 ng / ml or more, and more preferably about 30 ng / ml or more.
  • BMP8b may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • concentration of EGF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 80 ng / ml or less, and more preferably about 60 ng / ml or less.
  • EGF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has activity that can be used in this step.
  • the differentiation-inducing medium contains BMP, LIF, SCF, BMP8b and EGF in addition to the basal medium.
  • concentrations of these components are about 200 to about 800 ng / ml for BMP4, preferably about 300 to about 600 ng / ml, and about 500 to about 1500 U / ml for LIF, preferably about 800 to about 1,200 U / ml.
  • BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF contained in the differentiation-inducing medium are not particularly limited with respect to the source thereof, and are from cells of any mammal (for example, human, mouse, monkey, pig, rat, dog, etc.). Although isolated and purified, it is preferred to use human-derived BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF.
  • BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF may be chemically synthesized, biochemically synthesized using a cell-free translation system, or from a transformant having a nucleic acid encoding each protein. It may be manufactured. Recombinants of BMP4, LIF, SCF, BMP8b and EGF are commercially available.
  • the incubator used in this step is not particularly limited, but is limited to a flask, a tissue culture flask, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, a multiwell plate, and a micro. Examples include slides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the incubator can be cell adherent.
  • the cell adhesion incubator can be coated with any cell adhesion substrate such as extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell adhesion substrate can be any substance intended for adhesion of pluripotent stem cells or feeder cells (if used).
  • collagen As substrates for cell adhesion, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ornidine, laminin, and fibronectin and mixtures thereof, such as Matrigel, and lysed cell membrane preparations (lysed cell membrane). Preparations) (Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365: p1636-1641).
  • hPSC is seeded in a cell non-adhesive or low-adhesive incubator known per se, for example, about 3-10 ⁇ 10 4 cells / mL, preferably about 4-8 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • the density is 1 to 10% CO 2/99 to 90% in an atmospheric atmosphere, in an incubator at about 30 to about 40 ° C, preferably about 37 ° C, for about 4 to about 10 days, preferably about 4 to about 8. Incubate for days, more preferably about 4 to about 6 days, even more preferably about 4 days.
  • the fact of differentiation into hPGCLC can be confirmed by analyzing the expression of BLIMP1 by, for example, RT-PCR. Furthermore, if necessary, the expression of other genes and cell surface antigens can be examined. Examples of other genes include TFAP2C.
  • pluripotent stem cells having a fluorescent protein gene under the control of the BLIMP1- and / or TFAP2C-promoter are used as starting materials, the fact of differentiation into hPGCLC can be confirmed by FACS analysis. If the human PSC does not have a suitable transgenic reporter, the fact of hPGCLC differentiation is preferably confirmed by FACS analysis or the like using one or more cell surface antigens specifically expressed in hPGCLC. ..
  • At least one marker gene selected from the group consisting of PECAM (CD31), INTEGRIN ⁇ 6 (CD49f), INTEGRlN ⁇ 3 (CD61), KlT (CD117), EpCAM, PODOPLANIN and TRA1-81 is exemplified and preferably. INTERIN ⁇ 6 and EpCAM are exemplified.
  • hPGCLC which is the starting material in the maintenance amplification method of the present invention, is derived from hPSC via hiMeLC.
  • (3-1) Induction of differentiation from hPSC to hiMeLC examples include, but are not limited to, the basic medium exemplified for use in (2) above.
  • the basal medium may contain other additives known per se as exemplified for use in (2) above.
  • the medium can be a serum-containing medium or a serum-free medium (SFM).
  • a serum-free medium can be used.
  • concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • SFM may or may not contain any serum substitute such as KSR. The details are as described in (2) above.
  • the medium for inducing differentiation from hPSC to hiMeLC contains activin A and a GSK-3 ⁇ inhibitor as essential additives in the basal medium.
  • the concentration of activin A in the medium for inducing differentiation from hPSC to hiMeLC is, for example, about 5 ng / ml or more, preferably about 10 ng / ml or more, more preferably about 15 ng / ml or more, and for example, about 100 ng / ml or less. It is preferably about 90 ng / ml or less, more preferably about 80 ng / ml or less. For example, about 5 to about 100 ng / ml, about 10 to about 90 ng / ml, about 15 to about 80 ng / ml, about 20 to about 70 ng / ml, or about 30 to about 60 ng / ml. Particularly preferably, the concentration of activin A is about 50 ng / ml.
  • a GSK-3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of the GSK-3 ⁇ protein (eg, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin), and many of them are already known, for example.
  • Lithium protein (LiCl) which was first discovered as a GSK-3 ⁇ inhibitor, BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoinsilvin 3'-oxym), which is an indylvin derivative, and SB216763 (maleimide derivative).
  • GSK-3 ⁇ inhibitor which is a phenyl ⁇ bromomethylketone compound VII (4-dibromoacetophenone), L803-mts (also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2), a cell membrane permeabilizing kinase, and CHIR99021 (6- [2] with high selectivity.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor used in this step may preferably be CHIR99021.
  • the concentration of CHIR99021 in the medium is not particularly limited, but is preferably about 0.1 ⁇ M to about 50 ⁇ M, for example, at a concentration of 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M or more. However, it is not particularly limited to these. Preferably, a concentration higher than about 1 ⁇ M, which is the concentration used in GSK-3 ⁇ inhibition, is used, more preferably about 3 ⁇ M or higher. Particularly preferably, the concentration of CHIR99021 is about 3 ⁇ M.
  • the medium does not contain bFGF and BMP4.
  • the medium may further contain a fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitor.
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • the FGFR inhibitor is not particularly limited as long as it is a drug that inhibits the binding of the FGF receptor to FGF or inhibits the signal transduction that occurs after the binding, and examples thereof include PD173574 and BGJ398.
  • the concentration in the medium is not particularly limited, but is preferably about 1 nM to about 50 nM, for example, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, and so on. 13nM, 14nM, 15nM, 16nM, 17nM, 18nM, 19nM, 20nM, 25nM, 30nM, 35nM, 40nM, 45nM, 50nM or more, but not limited to these. More preferably, it is about 25 nM.
  • the medium further contains a knockout serum substitute (KSR).
  • KSR significantly increases the induction efficiency of mesoderm-like cells when present in the effective concentration range.
  • concentration of KSR is exemplified by, for example, 5%, 10%, 15%, 20% or more. More preferably, it is about 15%.
  • the medium further contains a ROCK inhibitor for the purpose of suppressing apoptosis when dissociating hPSC into a single cell.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK), but for example, Y-27632 can be preferably used in the present invention.
  • the concentration of Y-27632 in the medium is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M, 12 ⁇ M, 13 ⁇ M, 14 ⁇ M. , 15 ⁇ M, 16 ⁇ M, 17 ⁇ M, 18 ⁇ M, 19 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, and 50 ⁇ M, but are not limited thereto. More preferably, it is about 10 ⁇ M.
  • the incubator used in this step the incubator exemplified in the above (2) can be used in the same manner, but a fibronectin-coated incubator is preferable.
  • hPSC is sown on the incubator and has a cell density of, for example, about 104 to about 105 cells / cm 2 , preferably about 2 to about 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 1 to 10%.
  • CO 2/99 to 90% Under atmospheric atmosphere, in incubator at about 30 to about 40 ° C, preferably about 37 ° C, less than 60 hours, preferably 42 hours (eg, ⁇ 2 hours error is acceptable). Incubate.
  • iMeLC is defined as a cell with either or both of the following properties: (1) Increased expression of at least one gene selected from T, EOMES, EVX1, SP5, MIXL1 and NODAL, as compared to PSC before differentiation induction. (2) Decreased expression of at least one gene selected from POU5F1, NANOG and SOX2 as compared to PSC before differentiation induction.
  • the basal medium used for inducing differentiation from hiMeLC to hPGCLC include, but are not limited to, the basal medium exemplified for use in (2) above.
  • the basal medium may contain other additives known per se as exemplified for use in (2) above.
  • the medium can be serum-containing medium or serum-free medium (SFM).
  • SFM serum-free medium
  • concentration of serum eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, etc.
  • FBS fetal bovine serum
  • human serum etc.
  • SFM may or may not contain any serum substitute such as KSR. The details are as described in (2) above.
  • the medium for inducing differentiation from hiMeLC to hPGCLC contains BMP as an essential additive in the basal medium.
  • the BMP used is preferably BMP2, BMP4, or BMP7.
  • a more preferred BMP is BMP2 or BMP4.
  • the concentration of BMP is, for example, about 50 ng / ml or more, preferably about 100 ng / ml or more, and more preferably about 150 ng / ml or more.
  • the concentration of BMP is, for example, about 1,000 ng / ml or less, preferably about 800 ng / ml or less, and more preferably about 600 ng / ml or less.
  • the concentration of BMP is about 200 ng / ml.
  • the medium for inducing differentiation from hiMeLC to hPGCLC further contains at least one cytokine selected from the group consisting of SCF, EGF and LIF as an additive.
  • the concentration of SCF is, for example, about 30 ng / ml or more, preferably about 50 ng / ml or more, and more preferably about 80 ng / ml or more.
  • the concentration of SCF is, for example, about 200 ng / ml or less, preferably about 150 ng / ml or less, and more preferably about 120 ng / ml or less.
  • it is about 30 to about 200 ng / ml, about 50 to about 150 ng / ml, and about 80 to about 120 ng / ml.
  • the concentration of SCF is about 100 ng / ml.
  • the concentration of LIF is, for example, about 300 U / ml or more, preferably about 500 U / ml or more, and more preferably about 800 U / ml or more. Further, for example, it is about 2,000 U / ml or less, preferably about 1,500 U / ml or less, and more preferably 1,200 U / ml or less.
  • the concentration of LIF is, for example, about 0.1 ng / ml or more, preferably about 1 ng / ml or more, and more preferably about 5 ng / ml or more.
  • the concentration of LIF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 50 ng / ml or less, and more preferably about 25 ng / ml or less. For example, it is about 0.1 to about 100 ng / ml, about 1 to about 50 ng / ml, and about 5 to about 25 ng / ml. Particularly preferably, the concentration of LIF is about 10 ng / ml.
  • the concentration of EGF is, for example, about 10 ng / ml or more, preferably about 20 ng / ml or more, and more preferably about 30 ng / ml or more.
  • the concentration of EGF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 80 ng / ml or less, and more preferably about 60 ng / ml or less.
  • it is about 10 to about 100 ng / ml, about 20 to about 80 ng / ml, and about 30 to about 60 ng / ml.
  • the concentration of EGF is about 50 ng / ml.
  • the medium when dissociating hiMeLC into a single cell, it is preferable that the medium further contains a ROCK inhibitor for the purpose of suppressing apoptosis.
  • a ROCK inhibitor for the purpose of suppressing apoptosis. The same ROCK inhibitor as described above is used.
  • hiMeLC is seeded in a cell non-adhesive or low adhesive incubator known per se, for example, about 1-50 ⁇ 10 3 cells / cm 2 , preferably about 5-20 ⁇ 10 3 cells / mL.
  • Cell density is 1-10% CO 2 /99-90% in an air atmosphere, in an incubator at about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C, for 4-10 days, preferably 5-8 days, more preferably.
  • cells positive for the above-mentioned reporter fluorescent protein or cell surface antigen from the cells obtained by the above culture are, for example, fluorescent activated cell sorting (FACS). It is preferable to sort using.
  • FACS fluorescent activated cell sorting
  • hPGC or hPGCLC obtained by the above method is used. Incubate in the presence of (i) forskolin or a PDE4 inhibitor and (ii) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF.
  • hPGCLC cells of d4 to d10, preferably d5 to d8, and more preferably about d6 can be used, with the start date of differentiation induction from hiMeLC as d0.
  • the medium used in this step is the basic medium described in 1.
  • the medium exemplified for (2) can be used in the same manner, but it is preferably other than the F-12 medium and the mixed medium containing the same.
  • DMEM, GMEM, RPMI, CMRL and the like can be mentioned, and DMEM is preferable.
  • the glucose concentration of the medium is, for example, 0.1 to 5 g / L, preferably 0.2 to 4.5 g / L, more preferably 0.5 to 2 g / L, and particularly preferably about 1 g / L. ..
  • serum and / or serum substitute it is preferable to add serum and / or serum substitute to the medium.
  • the type and concentration of serum or serum substitute used here are as described in 1. above.
  • the one exemplified with respect to (2) can be used in the same manner.
  • the medium may also contain other additives known per se.
  • the additive is not particularly limited as long as it can support the maintenance amplification of hPGCLC, and those exemplified with respect to (2) above can be used as well.
  • KSR knockout serum substitute
  • FBS 2.5% fetal bovine serum
  • NEAA non-essential amino acid solution
  • 2-mercaptoethanol examples include, but are not limited to, 1% penicillin streptomycin, 2 mM L-glutamine (eg, GlutaMAX TM ), DMEM (1 g / L glucose) medium containing 100 ng / ml SCF, and the like.
  • the proliferation of mPGCLC can be synergistically increased up to about 50 times.
  • the combined use of forskolin and a PDE4 inhibitor offsets the amplification effect. Therefore, in the maintenance amplification method of the present invention, either forskolin or a PDE4 inhibitor is used alone. Preferably, forskolin is used.
  • the concentration of forskolin is, for example, about 0.1 ⁇ M or more, preferably about 0.5 ⁇ M or more, more preferably about 1 ⁇ M or more, and the concentration of forskolin is, for example, about 100 ⁇ M or less, preferably about 50 ⁇ M or less. , More preferably about 30 ⁇ M or less.
  • the concentration of forskolin can be appropriately selected within the range of about 0.5 to about 50 ⁇ M, preferably about 1 to about 30 ⁇ M. Particularly preferably, the concentration of forskolin is about 10 ⁇ M.
  • Forskolin may contain derivatives, salts, or solvates thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • the PDE4 inhibitor added to the medium is not particularly limited as long as it is a substance capable of inhibiting the enzymatic activity of PDE4, that is, the hydrolysis activity of cAMP, but is preferably a selective inhibitor of PDE4 (phosphodiesterase (PDE)). It does not inhibit not only enzymes other than) but also PDEs other than PDE4). Examples thereof include, but are not limited to, ibudilast, S- (+)-rolipram, rolipram, GSK256066, cilomilast and the like. Preferably, it is rolipram.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor is, for example, about 0.1 ⁇ M or more, preferably about 0.5 ⁇ M or more, and more preferably about 1 ⁇ M or more.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor is, for example, about 100 ⁇ M or less, preferably about 50 ⁇ M or less, and more preferably about 30 ⁇ M or less.
  • the concentration of the PDE4 inhibitor can be appropriately selected within the range of about 0.5 to about 50 ⁇ M, preferably about 1 to about 30 ⁇ M.
  • the concentration of rolipram is particularly preferably about 10 ⁇ M.
  • PDE4 inhibitors may include derivatives, salts, or solvates thereof, as long as they have activity that can be used in this step.
  • the medium for maintaining and amplifying hPGC or hPGCLC of the present invention further contains one or more cytokines selected from bFGF, LIF and EGF.
  • cytokines selected from bFGF, LIF and EGF.
  • it is a combination of LIF and EGF, bFGF alone, or a combination of LIF, EGF and bFGF.
  • the agent (i) is rolipram
  • the cytokine is preferably bFGF alone.
  • the concentration of LIF is, for example, about 300 U / ml or more, preferably about 500 U / ml or more, and more preferably about 800 U / ml or more.
  • the concentration of LIF is, for example, about 2,000 U / ml or less, preferably about 1,500 U / ml or less, and more preferably 1,200 U / ml or less.
  • the concentration of LIF is, for example, about 0.1 ng / ml or more, preferably about 1 ng / ml or more, and more preferably about 5 ng / ml or more.
  • the concentration of LIF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 50 ng / ml or less, and more preferably about 25 ng / ml or less. For example, it is about 0.1 to about 100 ng / ml, about 1 to about 50 ng / ml, and about 5 to about 25 ng / ml. Particularly preferably, the concentration of LIF is about 10 ng / ml.
  • the LIF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • the concentration of EGF is, for example, about 10 ng / ml or more, preferably about 20 ng / ml or more, and more preferably about 30 ng / ml or more.
  • the concentration of EGF is, for example, about 100 ng / ml or less, preferably about 80 ng / ml or less, and more preferably about 60 ng / ml or less.
  • it is about 10 to about 100 ng / ml, about 20 to about 80 ng / ml, and about 30 to about 60 ng / ml.
  • the concentration of EGF is about 50 ng / ml.
  • EGF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has activity that can be used in this step.
  • the concentration of bFGF is, for example, about 5 ng / ml or more, preferably about 10 ng / ml or more, and more preferably about 15 ng / ml or more.
  • the concentration of bFGF is, for example, about 50 ng / ml or less, preferably about 30 ng / ml or less, and more preferably about 25 ng / ml or less.
  • it is about 5 to about 50 ng / ml, about 10 to about 30 ng / ml, and about 15 to about 25 ng / ml.
  • the concentration of bFGF is about 20 ng / ml.
  • bFGF may contain variants, fragments, or modifications thereof.
  • the maintenance and amplification medium of hPGC or hPGCLC further contains SCF.
  • the concentration of SCF is, for example, about 30 ng / ml or more, preferably about 50 ng / ml or more, and more preferably about 80 ng / ml or more.
  • the concentration of SCF is, for example, about 200 ng / ml or less, preferably about 150 ng / ml or less, and more preferably about 120 ng / ml or less.
  • the concentration of SCF can be appropriately selected within the range of about 50 to about 150 ng / ml, preferably about 80 to about 120 ng / ml.
  • the concentration of SCF is about 100 ng / ml.
  • the SCF may contain variants, fragments, or modifications thereof, as long as it has an activity that can be used in this step.
  • cyclosporine A in addition to forskolin and PDE4 inhibitor further improves the amplification efficiency, but in the maintenance amplification method of the present invention, cyclosporine A maintains hPGCLC. It is desirable not to use it because it rather inhibits.
  • hPGC / hPGCLC may be cultured in the presence or absence of feeder cells.
  • the type of feeder cell is not particularly limited, but a feeder cell known per se can be used.
  • fibroblasts mouse embryonic fibroblasts, mouse fibroblast line STO, etc.
  • the feeder cells are inactivated by a method known per se, for example, treatment with radiation (gamma rays or the like) or an anticancer agent (mitomycin C or the like). If the feeder cells are vulnerable to PDE4 inhibitors and / or forskolin, several generations of feeder cells should be subcultured in advance in the presence of these additives to acclimatize to the additives. Is desirable.
  • the incubator used for the maintenance and amplification of hPGC or hPGCLC is not particularly limited, and for example, the above 1.
  • the one exemplified in (2) can be used in the same manner.
  • hPGC or hPGCLC is seeded on an incubator (pre-seeded with feeder cells), eg, about 104 to 105 cells / cm 2 , preferably about 2 to 8 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • Cell density is 1-10% CO 2 /99-90% in an incubator at about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C, for 3-14 days, preferably 4-12 days, more preferably. Incubate for 5-10 days.
  • colonies are formed as a result of culturing, BLIMP1 and TFAP2C continue to be strongly expressed, and the characteristics of early hPGC are maintained.
  • hPGC or hPGCLC can be selected and purified using hPGC or hPGCLC marker positivity as an index, and the culture can be continued by subculturing to a medium having the same composition.
  • hPGCLC having a fluorescent protein gene under the control of BLIMP1- and / or TFAP2C-promoter is used
  • hPGCLC can be selected by, for example, FACS, using BLIMP1 and / or TFAP2C positivity as an index.
  • hPGCLC differentiated from hiMeLC for 5 to 8 days, preferably about 6 days, is used as a starting material, cells negative for either BLIMP1 or TFAP2C do not substantially appear even after long-term subculture.
  • BLIMP1 or TFAP2C may be used as a selection marker, but in the case of hPGCLC in which differentiation induction was performed for less than 4 days from hiMeLC, BLIMP1-positive / TFAP2C-negative cells may appear in a small number during the passage. Therefore, it is desirable to use TFAP2C positive or double positive with BLIMP1 as an index.
  • hPGC or hPGCLC amplified by FACS analysis or the like is selected and purified using one or more cell surface antigens specifically expressed in hPGC or hPGCLC.
  • the cell surface antigen include at least one marker gene selected from the group consisting of PECAM (CD31), INTEGRIN ⁇ 6 (CD49f), INTEGRlN ⁇ 3 (CD61), KlT (CD117), EpCAM, PODOPLANIN and TRA1-81.
  • a combination of INTERIN ⁇ 6 and EpCAM is preferable.
  • the culture can be performed for at least 30 days even in the selection using the surface antigen marker as an index, and for at least 120 days in the selection using the reporter expression of BLIMP1 and TFAP2C as an index, and the culture can be performed for 120 days.
  • the hPGCLC can be amplified up to about 1 million times. Gell et al. (Stem Cell Reports, 2020, doi: 10.016 / j. Stemcr. 2020.01.009) can incubate hPGCLC in vitro using the mPGCLC maintenance amplification methodology developed by the present inventors. However, considering that the amplification efficiency was about twice in 10 days, the high amplification efficiency by the maintenance amplification method of the present invention is surprising.
  • the Wnt signaling inhibitor can suppress the dedifferentiation of hPGC or hPGCLC. Therefore, in the maintenance amplification culture of the present invention, by culturing hPGC or hPGCLC under conditions further containing a Wnt signaling inhibitor, dedifferentiation of hPGC or hPGCLC is suppressed and the maintenance efficiency of hPGC or hPGCLC is improved. be able to.
  • the Wnt signaling inhibitor may be added to the above-mentioned medium for maintenance amplification culture of the present invention.
  • the Wnt signaling inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the dedifferentiation of hPGC or hPGCLC, and examples thereof include substances that promote the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibit the nuclear translocation. More specifically, there are substances that stabilize axin. More specifically, substances that inhibit tankylase (eg, IWR1, XAV939, IWR2, JW55, JW74, G007-LK, NVP-TNKS656, WIKI4) can be mentioned. Another example is a substance that inhibits the secretion of Wnt (eg, Wnt-C59, IWP2) and the like.
  • a substance that promotes the decomposition of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation is preferable, a substance that stabilizes axin is more preferable, and a substance that inhibits tankylase is more preferable.
  • Particularly preferred can be IWR1 or XAV939. Any one of these Wnt signaling inhibitors may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the concentration of the Wnt signaling inhibitor is about 0.1 ⁇ M or more, preferably about 0.5 ⁇ M or more, more preferably about 1 ⁇ M or more, and the concentration of the Wnt signaling inhibitor is, for example, about 100 ⁇ M or less, preferably about 100 ⁇ M or less. Is about 50 ⁇ M or less, more preferably about 30 ⁇ M or less.
  • the concentration of Wnt signaling inhibitor can be appropriately selected within the range of about 0.5 to about 50 ⁇ M, preferably about 1 to about 30 ⁇ M. For example, about 0.5 ⁇ M, about 1 ⁇ M, about 1.5 ⁇ M, about 2 ⁇ M, about 2.5 ⁇ M.
  • Wnt signaling inhibitors may include derivatives, salts, or solvates thereof, as long as they have activity that can be used in this step.
  • the Wnt signaling inhibitor may be added throughout the maintenance-amplified culture of the invention or may be added at any time during the maintenance-culture period (which may be continuous or intermittent). May be done.
  • the lower limit of the addition period is not particularly limited, and examples thereof include 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 10 days or more, 15 days or more, and 20 days or more.
  • the amplified hPGC or hPGCLC population hPGC or hPGCLC obtained by the maintenance amplification method of the present invention can be cryopreserved by a method known per se.
  • the cryopreserved hPGC or hPGCLC can be thawed by a method known per se and then subjected to culture again.
  • the thawed hPGC or hPGCLC may be further cultured by the maintenance amplification method of the present invention.
  • hPGCLC-derived cells expressed genes such as DDX4 (VASA homolog) and DAZL. Since it differentiates into oogonia-like / germ cell-like cells that also have the characteristics of oogonia morphologically, it was confirmed that the properties as germ cells are maintained in this amplified culture system.
  • the present invention also provides a method for producing a cell population containing hPGC or hPGCLC, which comprises a step of maintaining and amplifying hPGC and / or hPGCLC by the method described above.
  • the cell population obtained by this method may consist of a single cell type or may contain a plurality of cell types.
  • the cell population contains about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more of hPGC or hPGCLC.
  • the amplified hPGC or hPGCLC population can be further purified by using a method such as FACS using the expression of the above-mentioned hPGC marker as an index.
  • the maintenance amplification culture method for hPGC or hPGCLC of the present invention uses hPGCLC derived from hPGC or hPSC. Incubate in the presence of (i) forskolin or a PDE4 inhibitor and (ii) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF. Accordingly, the invention also comprises (a) forskolin or a PDE4 inhibitor and (b) maintenance of hPGC or hPGCLC comprising (b) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF.
  • the reagent kit of the present invention contains forskolin as the agent of (a), and the cytokine of (b) is preferably a combination of LIF and EGF, FGF alone, or bFGF, LIF. And EGF combinations.
  • the reagent kit of the present invention may further include a Wnt signaling inhibitor as a constituent.
  • Wnt signaling inhibitor one or more of the above-mentioned ones or more can be mentioned in the maintenance amplification method of the present invention.
  • each of these components may be provided in the form of being dissolved in water or a suitable buffer solution, or may be provided as a lyophilized powder, and may be used by being dissolved in a suitable solvent at the time of use. Further, each of these components may be kitted as a single reagent, or two or more kinds may be mixed and provided as one reagent as long as they do not adversely affect each other.
  • the reagent kit of the present invention comprises an antibody against the surface antigen marker of hPGC or hPGCLC, preferably an antibody against INTERIN ⁇ 6, as a reagent for selecting (preferably FACS) the amplified hPGC or hPGCLC in the maintenance amplification method of the present invention. And / or an antibody against EpCAM may be further included as a configuration.
  • the reagent kit of the present invention can contain a medium that can be suitably used for the maintenance amplification method of the present invention. As an example of such a suitable medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) having a glucose concentration of 1 g / L can be mentioned.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the hPGCLC amplified by the maintenance amplification method of the present invention can be maintained and amplified for an extremely long period of time while maintaining characteristics similar to those of early hPGC, as compared with a culture system to which the method of maintenance amplification culture of mPGCLC is applied as it is.
  • the amplified hPGCLC which was maintained for a long time by subculture, showed a significantly different transcriptome profile as compared with the hPGCLC immediately after differentiation induction from hiMeLC, and was aggregated and cultured with heterologous ovarian somatic cells such as mice.
  • the survival rate and proliferation rate are superior to those of hPGCLC immediately after the induction of differentiation (d6). Therefore, it can be said that the amplified hPGCLC obtained by the maintenance amplification method of the present invention is a cell different from the conventionally known hPGCLC. Therefore, the present invention also provides an amplified hPGCLC obtained by the maintenance amplification method of the present invention. Since such amplified hPGCLC cannot be directly specified by its structure or properties, or is approximately impractical, within the scope of the claims described below, the amplified hPGCLC is specified by its manufacturing method.
  • the hPGCLC may be provided in a suspended state in the above-mentioned maintenance and amplification medium, or in another preferred embodiment, it may be provided in a cryopreserved state by a method known per se.
  • the amplified hPGC or hPGCLC obtained by the maintenance amplification method of the present invention may be, for example, Science 362: 356-360 (2016) or the following implementation. As described in the examples, it aggregates with somatic cells from the ovary of a mammal, eg, a non-human mammal (eg, mouse) to form a reconstituted ovary (r ovary), eg, a heterologous reconstituted ovary (xr ovary).
  • a mammal eg, a non-human mammal (eg, mouse) to form a reconstituted ovary (r ovary), eg, a heterologous reconstituted ovary (xr ovary).
  • the amplified hPGC or hPGCLC used here may be hPGC or hPGCLC purified from the cell population obtained by the method for producing a cell population containing hPGC or hPGCLC described above.
  • the present invention also provides a method for evaluating a maintenance-amplified culture system of hPGC or hPGCLC.
  • the method is characterized by including the following steps. (1) A step of culturing hPGC or hPGCLC on feeder cells under predetermined conditions. (2) A step of selecting live cells from the cell population obtained in (1), (3) A step of sorting the living cells obtained in (2) into hPGC marker-positive cells and other cells.
  • a maintenance amplification culture system using feeder cells from the hPGC or hPGCLC population cultured in the culture system to be evaluated in order to measure the cell number of human cells dedifferentiated from amplified hPGC or hPGCLC and hPGC or hPGCLC.
  • dead cells are removed to select live cells
  • feeder cells are removed to select a cell population containing human cells dedifferentiated from amplified hPGC or hPGCLC, and then amplified using the presence or absence of an hPGC marker as an index.
  • Select hPGC or hPGCLC from dedifferentiated human cells are selected from the cells.
  • a living cell population can be obtained without selecting a cell population containing human cells dedifferentiated from amplified hPGC or hPGCLC and a feeder cell.
  • the hPGC marker-positive cells (amplified hPGC or hPGCLC) and the marker-negative cells (cell population including dedifferentiated human cells and feeder cells) were sorted, and the hPGC marker-negative cells were FACS-analyzed and FSC / SSC two-dimensional plot.
  • the dedifferentiated human cells and feeder cells can be distinguished from the distribution pattern (that is, both show a mutually exclusive FSC / SSC pattern), and the number of dedifferentiated human cells can be determined. Can be measured.
  • the feeder cells used in the evaluation method of the present invention can support the maintenance amplification of hPGC or hPGCLC and are subjected to FACS analysis in the coexistence with human cells dedifferentiated from hPGC or hPGCLC.
  • hPGC or hPGCLC As long as the / SSC two-dimensional plot shows a distribution that can be clearly distinguished from dedifferentiated human cells, there are no particular restrictions on the origin or cell type of the animal. For example, m220-5 cells are mentioned as mouse cells. Can be done.
  • the "predetermined conditions" in the step (1) are various conditions for specifying the culture system evaluated by the evaluation method of the present invention, for example, the basic medium composition, the type and concentration of the medium additive, and the type of the incubator. , Culture temperature, CO 2 concentration, culture type, culture period, etc., and is different for each culture system to be evaluated.
  • Specific examples of the "predetermined conditions” include culture conditions that can support the maintenance and amplification of existing hPGC or hPGCLC (for example, any combination of various conditions described in WO2019 / 107576), or the present invention. Any combination of the above-mentioned various conditions of the maintenance amplification method, and conditions in which one or more conditions are changed from those culture conditions (for example, addition or deletion of medium additive, replacement with another medium additive). Etc.), but not limited to them.
  • the cell population obtained in the step (1) can be used as a dead cell marker (for example, DRAQ-7, DRAQ-5, TO-PRO-3, etc.) known per se or live. It can be performed by FACS or the like using a cell marker.
  • a dead cell marker for example, DRAQ-7, DRAQ-5, TO-PRO-3, etc.
  • the viable cell population obtained in the step (2) is selected from the marker positive cells and the negative cells by FACS or the like using an hPGC marker, and the number of cells thereof is used as the amplified hPGC or hPGCLC. Is calculated.
  • the hPGC marker at least one marker selected from the group consisting of BLIMP1 and / or TFAP2C, or ECAM (CD31), INTEGRIN ⁇ 6 (CD49f), INTEGRlN ⁇ 3 (CD61), KlT (CD117), EpCAM, PODOPLANIN and TRA1-81.
  • BLIMP1 and TFAP2C double positive cells are sorted as hPGC marker positive cells, ie hPGC or hPGCLC.
  • step (4) the hPGC marker-negative cells obtained in step (3), that is, cell populations other than hPGC or hPGCLC are subjected to FACS analysis, and an FSC / SSC two-dimensional plot is created. Since the FSC / SSC pattern that is mutually exclusive between the human cells dedifferentiated from hPGC or hPGCLC and the feeder cells on the two-dimensional plot, both can be easily distinguished, and the dedifferentiated human cells can be easily distinguished. The number of cells can be measured.
  • step (5) the number of hPGC marker-positive cells (amplified hPGC or hPGCLC) obtained in step (3) is compared with the number of cells dedifferentiated from hPGC or hPGCLC obtained in (4).
  • the maintenance efficiency of hPGC or hPGCLC under predetermined conditions is evaluated. It can be said that the larger the number of amplified hPGC or hPGCLC cells and the smaller the number of dedifferentiated cells, the higher the maintenance efficiency of hPGC or hPGCLC.
  • the present invention also provides a method for screening a dedifferentiation inhibitor of hPGC or hPGCLC.
  • hPGC or hPGCLC is cultured on feeder cells under predetermined conditions in the presence or absence of a candidate substance for a dedifferentiation inhibitor, as in step (1) of the evaluation method of the present invention. ..
  • the "predetermined condition" is synonymous with the above.
  • the hPGC or hPGCLC population cultured in the presence or absence of the candidate substance is subjected to the same steps as in steps (2) to (5) of the evaluation method of the present invention, respectively, and the hPGC or hPGCLC is subjected to the same steps. Calculate maintenance efficiency. Then, when the maintenance efficiency in the presence of the candidate substance is higher than the maintenance efficiency in the absence of the candidate substance, the candidate substance can be selected as a dedifferentiation inhibitor of hPGC or hPGCLC. .. As shown in Examples described later, the present inventors have found a Wnt signaling inhibitor as a dedifferentiation inhibitor of hPGC or hPGCLC using this screening method, and demonstrated the effectiveness of the screening system.
  • the present invention also provides a method for maintaining and amplifying PGC or PGCLC, which comprises culturing PGC or PGCLC in the presence of a Wnt signaling inhibitor.
  • the method can be used not only for humans but also for PGCs or PGCLCs derived from other mammals (eg, mice, etc.).
  • the culture is carried out under conditions that can support, for example, the maintenance and amplification of PGC or PGCLC known per se.
  • WO 2019/107576 describes that PGC or PGCLC can be maintained and amplified by culturing PGC or PGCLC in the presence of forskolin and / or PDE4 inhibitor using mice as an example. ..
  • forskolin and a PDE4 inhibitor may be used in combination as shown in Examples described later, but when either of them is used alone, the maintenance amplification efficiency is further improved. Therefore, even in the maintenance amplification of PGC or PGCLC using a Wnt signaling inhibitor, it is preferable that the culture is carried out under conditions further containing forskolin and / or a PDE4 inhibitor.
  • PGC or PGCLC is a human cell
  • culture should be performed in addition to the Wnt signaling inhibitor. It is more preferably carried out under conditions further comprising (i) forskolin or a PDE4 inhibitor and / or (ii) one or more cytokines selected from the group consisting of bFGF, LIF and EGF. ) And (ii) are more preferable in combination.
  • concentration of various additives, the composition of the basal medium, the culture temperature, the culture period, and the like can be appropriately selected with reference to the above-mentioned maintenance and amplification method of the present invention.
  • the culture is performed in addition to the Wnt signaling inhibitor. It is more preferably carried out under conditions that further include (i) forskolin and a PDE4 inhibitor and / or (ii) cyclosporin A (CsA), and the combination of (i) and (ii) is further preferred. preferable.
  • concentrations of various additives, the composition of the basal medium, the culture temperature, the culture period, and the like can be appropriately selected with reference to, for example, International Publication No. 2019/107576.
  • the Wnt signaling inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the dedifferentiation of hPGC or hPGCLC, and is, for example, a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation (eg, IWR1, etc.). Examples thereof include XAV939, IWR2, JW55, JW74, G007-LK, NVP-TNKS656, WIKI4), substances that inhibit Wnt secretion (eg, Wnt-C59, IWP2) and the like. It is preferably a substance that promotes the degradation of ⁇ -catenin and / or inhibits nuclear translocation, and more preferably IWR1 or XAV939. Any one of these Wnt signaling inhibitors may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the concentration of the Wnt signaling inhibitor is about 0.1 ⁇ M or more, preferably about 0.5 ⁇ M or more, more preferably about 1 ⁇ M or more, and the concentration of the Wnt signaling inhibitor is, for example, about 100 ⁇ M or less, preferably about 100 ⁇ M or less. Is about 50 ⁇ M or less, more preferably about 30 ⁇ M or less.
  • the concentration of Wnt signaling inhibitor can be appropriately selected within the range of about 0.5 to about 50 ⁇ M, preferably about 1 to about 30 ⁇ M. For example, about 0.5 ⁇ M, about 1 ⁇ M, about 1.5 ⁇ M, about 2 ⁇ M, about 2.5 ⁇ M.
  • Wnt signaling inhibitors may be added throughout the maintenance-amplification culture or at any time during the maintenance-amplification period (which may be continuous or intermittent). good.
  • the lower limit of the addition period is not particularly limited, and examples thereof include 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 10 days or more, 15 days or more, and 20 days or more.
  • the above-mentioned method for maintaining and amplifying PGC or PGCLC is intended to improve the maintenance efficiency of PGC or PGCLC by suppressing the dedifferentiation of PGC or PGCLC in the maintenance and amplification culture by the action of a Wnt signaling inhibitor. .. Accordingly, in another aspect, the invention is a method of suppressing PGC or PGCLC dedifferentiation, comprising doubling the cells in the presence of a Wnt signaling inhibitor in a maintenance-amplified culture of PGC or PGCLC. I will provide a.
  • the present invention also provides a PGC or PGCLC dedifferentiation inhibitor, including a Wnt signaling inhibitor.
  • a Wnt signaling inhibitor the same as above can be used.
  • the Wnt signaling inhibitor may be provided in the form dissolved in water or a suitable buffer solution, or may be provided as a lyophilized powder, and may be used by being dissolved in a suitable solvent at the time of use.
  • Wnt signaling limiting agents can also suppress the emergence of cells that are not suitable for PGCLC differentiation in the process of inducing pluripotent stem cells (PSCs) to differentiate into PGCLC. Therefore, the present invention also provides a method for producing PGCLC, which comprises inducing differentiation of PSC into PGCLC in the presence of a Wnt signaling limiting agent.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • the above-mentioned method for inducing direct differentiation from PSC to PGCLC or the method for inducing differentiation via early mesoderm-like cells (iMeLC) can be used.
  • the Wnt signaling limiting agent may be added throughout the differentiation-inducing culture or at any time during the maintenance culture (which may be continuous or intermittent). It may be added.
  • the term "about” allows some variability in a value or range when referring to a number or range. For example, it can mean up to ⁇ 10% or ⁇ 5% of the mentioned value or the mentioned range limit.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
  • Example 1 ⁇ Material> Information on the reagents and other resources used in Example 1 is summarized in Tables 1-1-4.
  • hiPSC The cells used in this example were maintained at 37 ° C. in a humidified 5% CO 2 incubator.
  • hiPSC strains 585B1 BTAG (46XY) (Sasaki et al., Cell Stem Cell. 2015 Aug 6; 17 (2): 178-94) and 1383D6 (46XY) (Yokobayashi et al., Biol Reprod. 6): 1154-1166) was cultured in StemFit AK03 or AK03N (Ajinomoto) on a plate coated with a laminin-511 E8 fragment (iMATRIX-511; Nippi, 892014).
  • hPGCLC was induced from hiPSC via iMeLCC (Sasaki et al, 2015 (above), Yokobayashi et al., 2017 (above)). Briefly, 3 ⁇ M CHIR99021 (TOCRIS, 4423), 3 ⁇ M CHIR99021 (TOCRIS, 4423), on wells of 12-well plates coated with MeLcC from hiPSC (1.0-2.0 ⁇ 10 5 cells / well) with fibronectin (Millipore, FC010).
  • GK medium supplemented with 50 ng / mL Actibin A (ProproTech, AF-120-14) and 10 ⁇ M Y-27632 [15% knockout serum substitute (KSR) (GIBCO, 10828-028), 1% MEM non-essential amino acid solution (GMEM (GIBCO, 11710-035) containing NEAA) (GIBCO, 11140-050), 1% penicillin streptomycin, 2 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate (GIBCO, 11360-070), and 0.1 mM 2-mercaptoethanol. )] (The induction time was 44 to 48 hours for 585B1 BTAG hiPSC and 60 hours for 1683D6 hiPSC).
  • hPGCLC from iMeLC on a v-bottom 96-well plate (NOF, 51011612 or Greener, 651970), 200 ng / mL BMP4 (R & D SYSTEMS, 314-BP), 100 ng / mL SFP (R & D SYSTEMS, 255-SC), 10 ng / It was induced in GK15 medium supplemented with mL LIF (Merck Millipore, LIF1010), 50 ng / mL EGF (R & D SYSTEMS, 236-EG or ProproTech AF-100-15) and 10 ⁇ M Y-27632.
  • mL LIF Merck Millipore, LIF101010101010
  • EGF R & D SYSTEMS, 236-EG or ProproTech AF-100-15
  • hPGCLC was isolated by FACS sorting [see the section on sorting fluorescently activated cells]. Images of iPSC and iMeLC were taken with a CKX41 inverted microscope (Olympus) equipped with a DS-Fi2 camera (Nikon). Images of iMeLC aggregates under hPGCLC induction conditions were taken with an M205C microscope equipped with a DP72 camera (Olympus).
  • xr ovary culture As previously reported, xr ovaries were prepared and cultured (Yamashiro et al., Science. 2018 Oct 19; 362 (6412): 356-360). Briefly, 5.0 ⁇ 10 3 d6 hPGCLC or d6c30 hPGCLC was aggregated at E12.5 with 7.5 ⁇ 10 4 ICR strain mouse embryonic ovarian somatic cells (Shimadzu Laboratory Supply). After suspension culture in GK cells containing 10 ⁇ M Y-27632 in a U-bottom 96-well plate (Thermo Fisher Nunc, 174925) for 2 days to form aggregates, the aggregates are transferred to xr.
  • Transwell-COL membrane inserts in ovarian culture medium [ ⁇ MEM containing 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 150 ⁇ M L-ascorbic acid (Sigma, A4403) and 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol] under liquid gas interfacial conditions. It was cultured on Corning, 3496). The xr ovary culture medium was replaced with a new one every 3 days. Isolation of mouse embryonic ovarian somatic cells was performed as previously described (Hayashi & Saitou, Nat Protocol. 2013 Aug; 8 (8): 1513-24, Yamashiro et al., 2018 (above)).
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • DMEM fetal calf serum
  • hPGCLC (Sasaki et al., 2015 (described above), Yokobayashi et al., 2017 (described above)) having a cell marker
  • dissociated iMeLC aggregates were subjected to BV421-binding anti-CD49f (INTERGRIN ⁇ 6) antibody ( Biolegend, 313624) and APC-bound CD326 (EpCAM) antibody (Biolegend, 324208) were incubated on ice for 15 minutes in the dark in FACS buffer and washed once with PBS ( ⁇ ). After pelleting, cells were resuspended in FACS buffer and filtered through a FALCON cell strainer.
  • BT + AG + or INTEGRIN ⁇ 6 high or low / EpCAM high cells were sorted by FACSAria III (BD Bioscience). Cells were sorted into FACS buffer for amplification culture. Cells were sorted into cellsotion (ZENOAQ, CB051) to harvest cells for the following analyses (RT-qPCR, RNA-seq and Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS)). For xr ovarian culture, BT + AG + cells were sorted into GK15 medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632.
  • hPGCLC For passage of amplified hPGCLC, cells were washed once with PBS (-) and treated in a 1: 4 mixture of 0.5% trypsin-EDTA and PBS (-) at 37 ° C. for 5 minutes. .. After vigorous pipetting, trypsinization was neutralized with STOP medium or PBS ( ⁇ ) containing 10% FBS, 10 ⁇ M Y-27632 and 0.1 mg / mL DNase. The cells were then pelleted and resuspended in FACS buffer. After removing the intercellular clamps equipped with FALCON cell strainers, the cells were subjected to FACS sorting.
  • BT + AG + or INTEGRIN ⁇ 6 high or low / EpCAM high cells were isolated by FACSAria III.
  • T + AG + or INTEGRIN ⁇ 6 high or low / EpCAM high cells were sorted into FACS buffer.
  • TRA-1-85 in hPGCLC-derived cells were placed on ice with an anti-TRA-1-85 antibody (BD Horizon, 563302) in the dark. Incubated for 30 minutes with PBS ( ⁇ ) and washed once. After pelleting the cells, they were resuspended in FACS buffer and passed through a FALCON cell strainer. 3 mM DRAQ7 (abcam, ab109202) was added to the cell suspension, and the cells were incubated at room temperature for 10 minutes and then subjected to FACS analysis.
  • hPGCLC amplified culture m220-5 cell line Dolci et al., Nature. 1991 Aug 29; 352 (6338): 809-11; Major et al., J Biol Chem. 1994 Jan 14; 269 (2): 1237-42. Ohta et al., EMBO J. 2017 Jul 3; 36 (13): 1888-1907; Miyauchi et al., Methods Cell Biol.
  • m220-5 cells were used as feeder cells for hPGCLC amplification culture. Prior to MMC treatment, m220-5 cells were passaged with 10 ⁇ M forskolin (sigma, F3917) and 10 ⁇ M rolipram (abcam, ab120029) for amplification and adaptation to added chemicals.
  • cytokines and / or chemicals contain 2.5% FBS and 100 ng / mL SCF, and cytokines and / or chemicals [10 ng / mL LIF; 50 ng / mL EGF; 20 ng / In GK15 supplemented with mL bFGF; 10 ⁇ M forskolin; 10 ⁇ M rolipram; 5 ⁇ M cyclosporin A (SIGMA, 30024)], hPGCLC was treated with MMC and passaged every 10 days. See].
  • the defined hPGCLC amplified culture medium contained: 15% KSR, 2.5% FBS, 1% NEAA, 2 mM GlutaMAX (GIBCO, 35050-061), 1% penicillin streptomycin, and 0.1 mM 2.
  • the subculture and medium exchange operations are as described above.
  • the protocol for each step of maintenance-amplification culture of hPGCLC is as follows. 1.
  • Flat bottom cell culture plates FALCON, 353043 are coated with 0.1% gelatin solution at room temperature for 1 hour.
  • MMC-treated (4 ⁇ g / mL, 2 hours) m220-5 feeders are seeded on gelatin-coated cell culture plates. Typically, 5.0 ⁇ 10 5 cells are seeded per well of a 12-well plate (containing 1 ml of DMEM containing 10% FBS, 1% penicillin streptomycin and 2 mM L-glutamine). 3. 3.
  • D6 hPGCLC or amplified hPGCLC (BT + AG + cells or INTEGRIN ⁇ 6 high / EpCAM high cells) are collected in FACS buffer by FACS sorting (see above) and centrifuged at 200 g for 7 minutes to pellet sedimentation. 4. After removing the supernatant, the cells are suspended in hPGCLC maintenance amplification culture medium containing 10 ⁇ M Y27632 so that the cell concentration is 1.0 ⁇ 104 cells / mL. 5. d6 hPGCLC or amplified hPGCLC is seeded on an MMC-treated m220-5 feeder.
  • hPGCLC maintenance amplification culture medium is added. Usually, 1 mL of medium is added per well of a 12-well plate. 7. Replace whole medium with fresh on day 3 (2 mL). On days 8.5, 7 and 9, half of the medium is replaced with fresh medium (1 mL). 9. On day 10, the amplified hPGCLC is subcultured to a new culture plate.
  • IF Immunofluorescence analysis
  • Amplified PGCLC was cultured in a film bottom dish (Matsunami Glass, FD10300) for several days and washed once with PBS ( ⁇ ). Cells were immobilized with 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature and washed 3 times with PBS ( ⁇ ). Immobilized cells for blocking and permeabilization are blocked buffer [10% normal donkey serum (Jackson ImmunoResearch, 017-000-121), 3% BSA (SIGMA, A3059), and 0.1% Trilon-X. 100 (Nacalai Tesque, 35501-02)] was incubated.
  • the cells were then incubated in 0.5 ⁇ blocking buffer [a 1: 1 mixture of blocking buffer and PBS ( ⁇ )] containing the primary antibody.
  • the conditions used for incubation with the primary antibody are as follows: Mouse anti-BLIMP1, goat anti-SOX17, mouse anti-AP2 ⁇ / TFAP2C, mouse anti-OC4 / POU5F1, goat anti-SOX2, and mouse anti-human mitochondrial antibodies were incubated overnight at 4 ° C.
  • Mouse anti-UHRF1 and rabbit anti-DNMT1 antibodies were incubated for 30 minutes at room temperature.
  • Goat anti-NANOG antibodies were incubated overnight at 4 ° C. or at room temperature for 30 minutes.
  • mouse anti-BLIMPI 1/200; R & D SYSTEMS MAB36081
  • goat anti-SOX17 (1/100; R & D SYSTEMS MAB36081
  • mouse anti-AP2 ⁇ / TFAP2C (1/100; Santa Cruz sc-12762
  • Mouse Anti-OCT4 / POU5F1 (1/100; Santa Cruz sc-5279
  • Goat Anti-NANOG (1/100; R & D SYSTEMS AF 1997
  • Goat Anti-SOX2 (1/100; Santa Cruz sc) -17320
  • Mouse anti-UHRF1 (1: 200; Milipore MABE308)
  • Rabbit anti-DNMT1 (1: 200; abcam ab19905
  • Mouse anti-human mitochondria (1: 500; Millipore MAB1273)
  • Goat anti-FOXL2 (1) / 500; Novus Biological NB100-1277
  • Mouse anti-DAZL (1/100; Santa Cruz sc-390929
  • Alexa Floor 488 donkey anti-rat IgG A21208
  • AlexaFluor 568 donkeyanti-mouse IgG A10037
  • Alexa Floor 647 donkey anti-mouse IgG A41571
  • Alexa Donkey Anti-rat IgG A41571
  • Images were acquired using the FV1000-IX81 confocal microscope system (Olympus) and processed by FV10-AV software. The processed images were cropped using XnConvert software (https://xnview.com/en/xconvert/).
  • RNA extraction reverse transcription, and cDNA amplified RNA extraction, cells harvested in Cellution were pelleted, lysed, and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • RNA extraction was performed using RNeasy Micro Kit (QIAGEN, 74004) or NucleoSpin RNA XS (MACHEREY-NAGEL, UO902A) according to the manufacturer's instructions.
  • NucleoSpin RNA XS an additional centrifuge was added just before elution stopped. The RNA concentration was measured using the Qubit RNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32855).
  • RNA concentration was too low to measure (in this study, RNA extraction was performed by 1606 to 1096 cells), the RNA was centrifuged to reduce its volume and the total concentrated RNA solution was reverse transcribed. And used for cDNA amplification.
  • qPCR qPCR
  • RNA-seq RNA sequence analysis
  • the amplified cDNA described above was used for qPCR analysis.
  • QPCR was performed on the Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, 4367659) on the CFX384 Touch Real-Time PCR detection system (BIO-Rad Laboratories).
  • the primer sequences used are as shown in Table 3.
  • a sequence library was constructed using the amplified cDNA.
  • the AXyprep PCR amplification MAG PCR Clean-Up kit (Axygen, Mag-PCR-CL-250) was used instead of AMple XP (Beckman Coulter, A6381). Sequencing was performed on the ILLUMINA NextSeq 500/550 platform (ILLUMINA) with NextSeq 500/550 High output Kit v2.5 (75 cycles).
  • WGBS Whole Genome Bisulfite Sequencing
  • PBAT post-bisulfite adapter tagging
  • Phusion Hot Strat High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, F540S) and Agencourt AMPure XP
  • Phusion Hot Strat (Corning, Mag-PCR-CL-250) were used respectively. Sequencing was performed on the Illumina Hisseq 2500 platform (Illumina) with the TruSeq SR Clusterer kit v3-cBot-HS and the TruSeq SBS kit v3-HS.
  • Array Comparative Genomic Hybridization In order to extract genomic DNA, cells were collected in Cellotion and pelleted, and genomic DNA was extracted using NucleoSpin Tissue (MACHEREY-NAGEL, UO952Q) according to the manufacturer's instructions. Microarray CGH experiments and image processing were performed by Takara Bio using the Complete NA Labeling Kit (Agilent Technologies, 5190-4240). Human male reference DNA (Agilent Technologies) was used for gender-matched reference DNA. Briefly, 200 ng of genomic DNA was digested with Alu1 and Rsa1 and then labeled with cyanine 3 (reference genomic DNA) or cyanine 5. Labeled genomic DNA was hybridized at 200 rpm at 60 ° C. for 24 hours on SurePrint G3 Human CGH Microray 8 ⁇ 60K (Agilent Technologies, G4450A). The resulting image was treated with Feature Extraction 12.1.0.3 (Agilent Technologies) (see CGH Data Analysis).
  • RNA-seq Data Processing and Analysis Human Genome Sequences and Annotations Release 107 (GRCh38.p2) transcript annotation GFE3 files were obtained from the NCBI ftp site (ftp: // ftp.ncbi.nlm.nih.gov/). The annotation of the reference gene at the 3'end extended to 10 kb and fully covered the transcription termination site (TSS).
  • Gene ontology (GO) analysis was performed using DAVID 6.8 (Hang et al., Nat Protocol. 2009; 4 (1): 44-57).
  • p2 was used as the human genome and transcript reference.
  • the promoter region was defined as the region between 900 bp upstream and 400 bp downstream of the transcription initiation site (TSS). Strong, moderate, and weak CpG promoters (HCP, ICP, and LCP, respectively) were described by Borgel et al. , Nat Genet. Calculated as described in 2010 Dec; 42 (12): 1093-100.
  • a list of CpG islands (CpG) can be found in Illingworth et al. , PLoS Genet. 2010 Sep 23; 6 (9): obtained from e1001134.
  • RepeatMasker data of human GRCh38 used for genome repeat element information was obtained from UCSC table browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables). Intergenic regions were randomly selected from 2 kb bins between genes excluding repeating elements. 200 randomly selected areas are shown in the heatmap. Read processing, mapping and estimation of methylated C levels were performed as previously described (Shirane et al., 2016 (see above)). Simply put, all reads are processed by the Trim_galore program (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), 5'end to 4 bases, 3'end to 1 base, adapter.
  • c30ag77 cells (the present invention), ag77_2 and ag120 AG + VT + cells (Yamashiro et al., 2018 (described above)), and pooled 7-9 week old human germ cells (Tang et al., Cell. 2015 Jun 4; Escape from DNA demethylation in 161 (6): 1453-67) (“escapes”) in the hypermr program (Song, et al., PLoS One. 2013 Dec 6; 8) in the MethPipe v3.4.3 package. (12): e81148) was clarified using the default settings. Escapes common to these cells or specific to some cell types, merge and intersect of bedtools v2.29.2 (Quinlan & Hall, Bioinformatics.
  • Raw aCGH data was analyzed using CytoGenemics 5.0.2.5 (Agilent Technologies) by the analysis method of "Defoult Analysis methods-CGH v2" that detects abnormal intervals by the aCGH data analysis algorithm ADM2.
  • CytoGenemics 5.0.2.5 Analog to Physical Component Ratios 5.0.2.5
  • ADM2 a CytoGenemic data analysis algorithm
  • a "Fuzzy Zero" calibration was applied to mitigate false calls at unusual intervals.
  • a list of variations in the number of copies in the human Alignment male reference DNA for hg19 is available from CytoGenenomics 5.0.2.5.
  • RNA-Seq data GSE147448 (GEO database); WGBS data: GSE147499 (GEO database); aCGH data: GSE148415 (GEO database)
  • RNA-seq data hiPSCs / iMeLCs: GSE99350 (GEO database); d6 hPGCLCs and ag7 / 21/35/49/63/77/120 cells: GSE117101; WGBS data: hiPSCs / iMeLCs / d6 hPGCLCs and ag35 / 77 cells: DRA006618 (DDBJ database); ag120 cells: DRA007077 (DDBJ database)
  • iMeLCs by actibin A (ActA) and WNT signaling activator (CHIR99021), followed by bone morphogenetic protein 4 (BMP4), leukemia inhibitory factor (LIF), stem cell factor (SCF). , And epidermal growth factor (EGF) induced to BTAG positive (BT + AG + ) hPGCLC (Fig. 1A).
  • BT + AG + hPGCLC (d6 hPGCLC) induced for 6 days was isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS), and 5.0 ⁇ 10 3 of the cells were isolated from 15% knockout serum substitute (KSR), 2.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • FIG. 1D The results of two independent experiments are shown in FIG. 1D. Amplification rates varied slightly between experiments under each condition, but DMEM containing 1 g / L glucose was most effective for BT + AG + cell amplification during 30 days of culture (up to 80-fold amplification). ).
  • DMEM (1 g / L glucose), GMEM, and 7 different basal media (DMEM / F12, F12, Temin's MEM, ⁇ MEM, IMDM, RPMI and CMRL; Table 2) were similarly compared. It was found that DMEM (1 g / L glucose) showed the most remarkable effect on BT + AG + cell amplification, while basal media such as F12 and DMEM / F12 had little effect (Fig. 1E). The superior effect of DMEM (1 g / L glucose) on BT + AG + cell amplification was also verified in other experiments comparing the effects of DMEM (1 g / L glucose), GMEM, RPMI and CMRL (Fig. 1E). ..
  • FIG. 1F shows on an m220 feeder in DMEM (1 g / L glucose) containing selected additives (15% KSR, 2.5% FBS, 100 ng / ml SCF, 10 ⁇ M forskolin, and 20 ng / ml bFGF).
  • DMEM 1 g / L glucose
  • selected additives 15% KSR, 2.5% FBS, 100 ng / ml SCF, 10 ⁇ M forskolin, and 20 ng / ml bFGF.
  • BT + AG + cells c21 to c30
  • BT + cells characterized by oil droplet-like vesicles around the nucleus show slow but accelerated amplification. After culturing for 10 days, clear morphological colonies were formed (Fig. 1F).
  • 6 dhPGCLC is capable of growing in culture as BT + AG + cells, and not only the requirements for them to grow efficiently, but also the mode of their growth is mPGCLC and how much. Seems to be different (Ohta et al., 2017 (above)).
  • BT + AG + cells make up approximately 46% of all cells, while TRA-1-85 + [human-specific antigens (Draper et al., J Anat. 2002 Mar; 200). Pt 3): 249-58)], non-BT + AG + cells accounted for approximately 13%, and TRA-1-85 - cells (m220 feeder) constituted approximately 36% (dead cells: ⁇ 5%) ( FIG. 2C).
  • BT + AG + cells make up about 37% of the total cell population
  • TRA-1-85 + , non-BT + AG + cells make up about 38%
  • TRA-1-85 - cells (m220 feeder). ) Consists of approximately 20% (Fig. 2C).
  • the TRA-1-85 - m220 feeder was plotted diagonally below BT + AG + cells when sorted by BTAG fluorescence and showed weak autofluorescence (FIG. 3C). Combined with the analysis of changes in cell population with respect to BTAG expression during the entire culture period (FIGS. 2A, 2B, 3A, 3B), these findings indicate that under selected conditions, d6 hPGCLC is d4 hPGCLC.
  • RNA of BT + AG + cells derived from c10 to c120 was isolated and the expression of the key gene was analyzed by quantitative PCR (qPCR).
  • + AG + cells continuously expressed genes such as BLIMP1 (PRDM1), TFAP2C, SOX17, POU5F1 and NANOG up to at least c120 at similar levels, while SOX2 expression was stably suppressed (FIG. 2G). ).
  • INTERIN ⁇ 6 high / EpCAM high when the cell population of INTERIN ⁇ 6 high / EpCAM high was subcultured, such cells succeeded in proliferation and passage up to at least c30 and amplified up to to 50-fold (FIGS. 4D, 4E, 4G). Furthermore, by qPCR analysis, INTERIN ⁇ 6 high / EpCAM high cells expressed key hPGC genes such as BLIMP1 (PRDM1), TFAP2C, SOX17, POU5F1, and NANOG, and were similar to BT + AG + cells in amplified culture. SOX2 was suppressed by the appearance (Fig. 4H).
  • BLIMP1 PRDM1
  • TFAP2C TFAP2C
  • SOX17 SOX17
  • POU5F1 POU5F1
  • NANOG NANOG
  • hPGCLC retains the early hPGC (LC) transcriptome
  • LC hPGC
  • the cell types analyzed were as follows: hiPSCs and iMeLCs (585B1 BTAG, 1383D6), BT + AG + cells at c10, c30, c50, c70, c90 and c120 (585B1 BTAG), INTEGRIN ⁇ 6 at c10 and c30.
  • high / EpCAM high cells INTERIN ⁇ 6 low / EpCAM high cells (1383D6) at c10, BT + AG + cells (585B1 BTAG) (Yamashiro) at aggregation days (ag) 7, 21, 35, 49, 63 and 77.
  • Unsupervised hierarchical clustering reveals that the analyzed cells are mainly classified into two large clusters, one consisting of hiPSC / iMeLC and the other consisting of d6 hPGCLC-derived cells (Fig.). 7A).
  • d6 hPGCLC-derived cells Fig. 7A.
  • BT + AG + cells and INTERGRING6 high / EpCAM high cells in amplified culture form a solid cluster while mixing with those with different culture periods, such cells.
  • clusters are not only clusters consisting of hPGCLC-derived cells (BT + AG + cells in ag7) (Yamashiro et al., 2018 (described above)) in xr ovary during the early culture period, but also clusters of d6 hPGCLC. It showed similarities (Fig. 7A).
  • clusters of BT + AG + / INTEGRIN ⁇ 6 high / EpCAM high cells during amplification culture showed BT + AG + cells in the late stage of the culture period (ag21, ag35, ag49, ag63, and ag77, and AG + VT ⁇ in ag120.
  • Clusters of hPGCLC-derived cells [including oogonia / progenitor cell-like cells (cells in ag77 and ag120)] in xr ovary in / AG +/- VT + / AG + VT + / AG - VT + cells) (Fig. 7A) (Yamashiro et al., 2018 (above)).
  • SOX17, PRDM1, NANOS3, KLF4, TCLIA are continuously expressed thereafter
  • cluster 2 genes for example, HLA-DQB1, HLA-DPA1, MT2A, TRPC5, TRPC6
  • cluster 3 genes are gradually suppressed. It is specifically upregulated approximately after ag35 and characterizes protozoal / progenitor development (eg, DAZL, DDX4, MAEL, TDRD9, PIWIL1), with clusters 4 and 5 genes being hPGCLC.
  • cluster-4 genes eg, SOX2, TDGF1, GJA1, OTX2, CDH1
  • cluster 5 genes eg, IFITM2, IFITM3, SLC2A3
  • SLC2A1 is gradually suppressed.
  • BT + AG + / INTERGRIN ⁇ 6 high / EpCAM high cells in amplified culture continue to express the genes of clusters 1, 2 and 5, and d6 hPGCLC / BT + AG of ag7.
  • TCL1A is known to act as a coactivator of AKT and promote glycolysis in PSC (Line et al., Mol Cell. 2000 Aug; 6 (2): 395-407, Nishimura et al., Stem Cell Reports. 2017 Mar 14; 8 (3): 787-801) suggests that the AKT and glycolytic pathways are gradually down-regulated during expansion.
  • Genes that are upregulated in c10 BT + AG + cells compared to d6 hPGCLC are enriched in gene ontology (GO) functional terms such as "negative regulation of growth” and "mineral absorption” and are metallothionein (metallothionein).
  • MT 1E, 1F, 1G, 1H, 1X and 2A, as well as superoxide dismutase (SOD) 1 and 2, for the constancy of essential heavy metals such as zinc or the removal of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • c10 BT + AG + cells are "heart development” (eg GATA2, GATA3, HANDI1, ID1, ID3, SALL1), "kidney development” (eg NPHP3, LZTS2, LHX1, ARID5B, OVOL1), and " Genes that enrich GO terms such as "extracellular matrix organization” (eg, COL2A1, COL3A1, COL4A5, LAMA4, LAMB2) (FIG. 8B) and are co-activated by hPGCLC fate determination in association with somatic cell programs are hPGCLC. It suggests that it is suppressed during amplification culture.
  • extracellular matrix organization eg, COL2A1, COL3A1, COL4A5, LAMA4, LAMB2
  • GO terms such as “CENP-A-containing nucleosome assembly” and GO terms such as “mitotic cell division” are enriched (Fig. 8C), and BT + AG + cells in amplified culture are BT + in xr ovary. Consistent with the idea that mitosis is more active compared to AG + cells.
  • the genes (162 genes) up-regulated in the c30 BT + AG + cells compared to the ag21 BT + AG + cells further include members of the MT gene family, ag21 BT + AG + in the cells. Reflects those downregulations in (Fig. 8C).
  • the genes up-regulated in ag7 / 21 BT + AG + cells (101 and 70 genes, respectively) compared to c30 BT + AG + cells include FOS, FOSB, EGR1, EGR2.
  • EGR3 (Fig. 8C), which are the earliest genes that respond to various cell stimuli, and that the xr ovarian environment triggers a separate signaling pathway in BT + AG + cells. Suggests.
  • d6 hPGCLC-derived BT + AG + / INTERGRIN ⁇ 6 high / EpCAM high cells are amplified, although upregulation of some genes during culture may indicate application to culture. In culture, it takes a developmental pathway towards oogonia / progenitor-like cells, but stops their development early and shows that it faithfully maintains the properties of early hPGCLC.
  • Amplified hPGCLC retains early hPGC (LC) DNA methylome
  • LC DNA methylome
  • WGBS whole genome bisulfite sequence
  • hiPSC and iMeLC show very similar genome-wide 5-methylcytosine (5mC) profiles, have an average of ⁇ 80% 5mC, and d6 hPGCLC has a slight but significant reduction in overall 5mC levels. Received ( ⁇ 75% on average) (Yamashiro et al., 2018 (above)) (FIGS. 9A, 9B).
  • BT + AG + cells showed a further reduction of 5 mC from d6 hPGCLC and achieved an average 5 mC level of ⁇ 65% at c10 (FIGS. 9A, 9B, 10A).
  • c70 and c120 their genome-wide 5mC levels and profiles were subsequently substantially maintained, albeit with a slight increase ( ⁇ 68%) in c120 (FIGS. 9A, 9B, 10A).
  • mPGCLC was genomic-wide DNA demethylation during their amplified culture. This is in stark contrast to the finding of undergoing methylation (Ohta et al., 2017 (above), Shirane et al., 2016 (above)).
  • the loci of the MT1 gene cluster show characteristic upregulation in c10 BT + AG + cells compared to d6 hPGCLC (FIGS. 8A, 8B, 5B) for hPGCLC induction / differentiation / amplification.
  • DNMT3A denovo DNA methyltransferases
  • DNMT1 and UHRF1 proteins in BT + AG + cells in maintenance-amplified culture was analyzed by IF analysis.
  • hiPSC expressed both DNMT1 and UHRF1 strongly and relatively uniformly in the nucleus.
  • DNMT1 will show clear punctate localization and will correspond to replication focal points (Fig. 9F) (Leonhardt., J Cell Biol. 2000 Apr 17; 149 (2): 271). -80., O'Keefe., J Cell Biol. 1992 Mar; 116 (5): 1095-110).
  • BT + AG + cells in c66 strongly expressed DNMT1, but their punctate nuclear localization was not detected.
  • BT + AG + cells expressed UHRF1 somewhat weakly and non-uniformly. That is, about half of them expressed UHRF1 in the nucleus, but the others expressed only a small amount of UHRF1 (Fig. 9F). In both hiPSC and c66 BT + AG + cells, they expressed in the cytoplasm. UHRF1 was not detected (Fig. 9F). From these findings, it was concluded that BT + AG + cells in maintenance-amplified cultures express UHRF1, albeit at low levels and somewhat heterogeneous.
  • E Fetal (E) 10.5 and E13.5 mouse germ cells during the elimination of genome-wide CpG methylation. It exhibits low CpH methylation levels (on average ⁇ 1%), followed by non-female male germ cells, especially in the case of methyl CpA (mCpA) (on average> 2.5%) at E16.5 (it is> 2.5%).
  • mCpA methyl CpA
  • High CpH is associated with the acquisition of a genome-wide androgenic CpG methylation profile (Kobayashi et al., 2013 (above), Kubo et al., 2015 (above), Seisenberger et al., 2012 (above)). Reanalysis revealed that the methylation level was obtained (Fig. 9G).
  • the mESC suppresses de novo DNMT activity (Habibi et al., Cell Stem Cell. 2013 Sep 5; 13 (3): 360-9., Yamaji et al., Cell Stem Cell.
  • Amplified hPGCLC undergoes epigenetic reprogramming to differentiate into oogonia / progenitor cells in xr ovary, then BT + AG + cells in amplified culture are capable of differentiating in the manner of human germ cells Evaluated whether or not.
  • 585B1 BTAG hiPSC was induced into hPGCLC
  • d6 hPGCLC was cultured for 30 days
  • c30 BT + AG + cells 5,000 cells
  • E12.5 mouse embryonic ovarian somatic cells (75,000 cells).
  • the xr ovary with C30 BT + AG + cells developed in a manner similar to the xr ovary with d6 hPGCLC (Fig. 11B), and FACS analysis showed that the number of surviving BT + AG + cells was between the xr ovaries.
  • c30 BT + AG + cell-derived BT + AG + cell gene expression on ag7, ag35 and ag77 (c30ag7, c30ag35 and c30ag77 cells), qPCR (c30ag7 / c30ag35 / c30ag77) or RNA-seq analysis (c30ag35 / c) was measured by.
  • FIG. 11E such cells continued to express markers for hPGC containing PRDM1, TFAP2C, SOX17, POU5F1 and NANOG, and like cells from 6hPGCLC, UHRF1 was gradually suppressed while DNMT1 Was maintained.
  • BT + AG + cells in growth culture reduced the 5mC level of promoter to DPPA3, PIWIL2 and PRAME to a substantial extent compared to d6hPGCLC (DPPA3; ⁇ 52%, PRAME; ⁇ 19%).
  • Unsupervised hierarchical clustering of the transcriptome of the relevant cell type is different from BT + AG + cells in amplified culture, where both c30ag35 and c30ag77 cells are classified as egg progenitor / progenitor-like cell clusters, c30ag35. And c30ag77 cells are classified into early and late proto-embryonic / progenitor-like cells, respectively (FIG. 12B), with PCA of the gene set that characterizes the progression of development from hPGC (LC) to proto-embryonic / proto-germ cells, respectively.
  • the expression profile provided consistent results (FIG. 11H). Consistent with qPCR analysis (FIG.
  • c30ag35 and c30ag77 cells show more advanced properties compared to d6 hPGCLC-derived ag35 and ag77 cells (ag35 and ag77 cells), eg, they are in a more prominent manner.
  • the gene of cluster 2 was down-regulated and the gene of cluster 3 was up-regulated (FIGS. 11I and 11J).
  • c30ag77 cells Whole-genome bisulfite sequence analysis of c30ag77 cells revealed that they underwent substantial genome-wide DNA methylation, reaching ⁇ 15% levels of genome-wide 5 mC levels (Fig. 11K).
  • Human egg progenitor cells / progenitor cells (Guo et al., 2015 (above), Tang et al., 2015 (above)) and ag120 cells (Yamashiro et al., 2018 (above)) at 7 to 10 weeks of development. ) Is the same value.
  • c30ag77 cells erase 5 mC from the entire genome containing promoters, exons, introns, intergenic regions, representative repeat elements, non-promoter CGI and ICR (FIGS.
  • Example 2 Establishment of culture system evaluation method Further detailed analysis was performed on the results of FACS analysis of proliferated human PGCLC derived from 585B1-868BTAG (BLIMP1-tdTomato and AP2 ⁇ -EGFP) iPS cells. The results are shown in FIG.
  • FACS analysis the expression of human cell-specific cell surface antigen TRA-1-85 was analyzed in the population excluding dead cells by DRAQ7 staining.
  • the TRA-1-85 positive cell population was defined as a BTAG double positive population and a non-BTAG double positive population (hereinafter referred to as TRA-1-85 positive BTAG negative cell population) based on the BTAG expression pattern.
  • the TRA-1-85 negative cell population and the TRA-1-85 positive BTAG negative cell population show a pattern of mutually exclusive side scatter light (Side Scatter, SSC) and forward scatter light (Forward Scatter, FSC). Became clear.
  • SSC Segment Scatter
  • FSC Forward Scatter
  • the logarithmic conversion value of the ratio of the number of proliferated PGCLC cells to the number of dedifferentiated cells was defined as an enrichment score and used as an index for evaluating the state of the culture system (Equation 1).
  • a positive value for the enrichment score indicates that the number of cells in the proliferating PGCLC is predominant.
  • enrichment score log 2 (number of hPGC marker-positive cells / number of dedifferentiated cells) (Formula 1)
  • expanded PGCLCs are PGCLC marker-positive cells (eg. BT (+) AG (+) cells) in a growth culture system
  • delimited cells are PGCLC marker-negative cells having a relatively small SSC value and a wide range of FSC values. be.
  • Example 3 Suppression of PGCLC dedifferentiation by inhibition of WNT signaling pathway
  • Proliferation culture was performed using PGCLCs on day 6 of differentiation induction derived from 585B1-868BTAG iPSC.
  • culture was carried out for 30 days under the conditions of adding IWR1 of each concentration, IWR1, XAV939, Wnt-C59 and IWP2 of each concentration, or DMSO of the solvent. Passage and cell count were measured by FACS every 10 days to create a growth curve.
  • the enrichment score was calculated for each number of culture days.
  • FIGS. 14A to 14C The results are shown in FIGS. 14A to 14C.
  • IWR1 did not affect the proliferation of hPGCLC (FIG. 14A) and significantly suppressed the appearance of dedifferentiated cells (FIG. 14B).
  • XAV939 also showed the same tendency as IWR1 (Fig. 14C).
  • hPGCLC can be cultured for 120 days or more and amplified 1 million times or more. Therefore, it is possible to carry out various experiments that have been difficult to apply due to the problem of cell number, and to verify humoral factors / genes such as cytokines and their functions that are important for further differentiation of human germline. Is possible.

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Abstract

本発明は、ヒト始原生殖細胞（ｈＰＧＣ）又はヒト多能性幹細胞由来のヒト始原生殖細胞様細胞（ｈＰＧＣＬＣ）の維持増幅方法であって、ｈＰＧＣＬＣを、（ｉ）フォルスコリン又はホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害薬、並びに（ｉｉ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１以上のサイトカインの存在下で培養することを含む、方法を提供する。

Description

ヒト始原生殖細胞／ヒト始原生殖細胞様細胞の維持増幅方法
　本願は、２０２０年８月１８日に米国に出願された仮出願第６３／０６６，９１４号および２０２０年８月１９日に米国に出願された仮出願第６３／０６７，７７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　本発明は、ヒト始原生殖細胞／ヒト始原生殖細胞様細胞の維持増幅方法、及びそのための試薬等に関する。
　生殖細胞系統は遺伝情報のみならず、世代を超えたエピジェニック情報の連続性と多様性を保証し、それによって所定の種の永続性と進化の基盤となる。ヒトの場合には生殖細胞の発達の異常は、不妊及び子孫の遺伝的又はエピジェネティックな疾患を含む病的な状態をもたらす。よって生殖細胞の発生メカニズムの研究は、生物学と医学の両方の基盤となるテーマである。
　モデル動物としてマウスを用いて、哺乳動物の生殖細胞の発生のメカニズムの研究が行われており、マウスにおける生殖細胞の発生のインビトロでの再構成が報告されている。その一例として本発明者らは以前、ｃＡＭＰの細胞内産生を刺激するフォルスコリンとロリプラムとを使用して、マウスの始原生殖細胞（ＰＧＣ）／始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）をインビトロで増殖させる方法を報告している（特許文献１、非特許文献１）（以下、マウスのＰＧＣを「ｍＰＧＣ」、マウスのＰＧＣＬＣを「ｍＰＧＣＬＣ」と称することがある）。
　一方、ヒト生殖細胞の発生メカニズムの研究は、ヒト生殖細胞の発生の解析が困難であることと、適切な実験系が欠如していることのために、現在に至るまで十分に行われていなかった。その様な状況下でＧｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．はフォルスコリンとロリプラムを含む培養系で、ヒトの始原生殖細胞様細胞（以下、ヒトのＰＧＣＬＣを「ｈＰＧＣＬＣ」と称することがある）をインビトロで培養したことを報告した（非特許文献２）。しかし、Ｇｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．の報告におけるｈＰＧＣＬＣの増殖は１０日で２倍程度であり、実用的に用いるには十分とは言えない。
国際公開２０１９／１０７５７６号
Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ，（２０１７）Ｖｏｌ．３６，ｐ１８８８−１９０７ Ｇｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０２０）Ｖｏｌ．１４，ｐ４３３−４４６
　よってヒトの始原生殖細胞（以下、ヒトのＰＧＣを「ｈＰＧＣ」と称することがある）／ｈＰＧＣＬＣをより効率的に増殖させる方法を提供することが、本発明の課題である。
　本発明者らは、単離されたｈＰＧＣＬＣをフォルスコリン及びサイトカインの存在下で培養することにより、ｈＰＧＣＬＣを維持増幅できることを見出した。本発明の方法によれば、長期間（例えば１２０日以上）に亘ってｈＰＧＣＬＣを培養することができる。本発明の方法により培養されたｈＰＧＣＬＣは、初期のヒトＰＧＣの性質を保ちながら増殖していることが遺伝子発現状態の解析から確認された。またゲノムＤＮＡメチル化状態の解析から、ｈＰＧＣＬＣは培養期間中のＤＮＡメチル化状態を概ね維持していることが判明した。
　これは、増殖に伴うゲノムワイドなＤＮＡの脱メチル化が認められた、ｍＰＧＣＬＣの培養系（特許文献１、非特許文献１）とは対照的であり、ヒトにおいてはマウスと異なるメカニズムでエピゲノム情報の再編成が進行する可能性が示唆された。
　本発明者らはさらに、増殖したｈＰＧＣＬＣの機能を検証するために、卵巣内環境を模倣した再構成卵巣培養を行った。その結果、ｈＰＧＣＬＣ由来細胞がＤＤＸ４（ＶＡＳＡホモログとしても知られる）やＤＡＺＬ等の遺伝子を発現し、形態的にも卵原細胞の特徴を有する卵原細胞様の細胞へ分化することが確認された。すなわち、生殖細胞としての性質が本培養系において維持されることが確認された。
　また、本発明者らは、ｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養において、ｈＰＧＣマーカー、死細胞マーカー、ヒト特異的細胞表面抗原を用いたＦＡＣＳ解析により、増幅ｈＰＧＣＬＣと脱分化した細胞の細胞数を測定し、脱分化細胞数に対する増幅ＰＧＣＬＣ細胞数の比の対数変換値（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ）を算出することで、当該培養系におけるｈＰＧＣＬＣの維持増幅効率を評価する手法を確立した。また、フィーダー細胞を適切に選択することで、ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞とフィーダー細胞とを選別せずとも、ｈＰＧＣマーカー陽性細胞とそれ以外の細胞とを選別し、非ｈＰＧＣマーカー陽性細胞をＦＡＣＳ解析してＦＳＣ／ＳＳＣ二次元プロットに付すことにより、ｈＰＧＣＬＣから脱分化した細胞とフィーダー細胞とを識別可能であることを見出した。
　さらに、本発明者らは、当該評価法を用いて、上記したｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養系に種々のシグナル伝達経路の阻害剤を添加して、ｈＰＧＣＬＣの維持増幅効率（ｈＰＧＣＬＣからの脱分化率）を評価したところ、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬、特にβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質が、ｈＰＧＣＬＣの脱分化を顕著に抑制することを見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　ヒト始原生殖細胞（ｈＰＧＣ）又はヒト多能性幹細胞由来のヒト始原生殖細胞様細胞（ｈＰＧＣＬＣ）の維持増幅方法であって、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、（ｉ）フォルスコリン又はホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害薬、並びに（ｉｉ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１以上のサイトカインの存在下で培養することを含む、方法。
［２］　前記（ｉ）の薬剤がフォルスコリンである、［１］に記載の方法。
［３］　前記サイトカインが、ＬＩＦ及びＥＧＦの組み合わせ、ｂＦＧＦ単独、あるいはＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　ｈＰＧＣＬＣが、ヒト初期中胚葉様細胞（ｈｉＭｅＬＣ）を経由して誘導されたものである、［１］~［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］　ｈＰＧＣＬＣが、ｈｉＭｅＬＣを、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、並びに、任意で幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインの存在下で、５~８日間培養することにより誘導される、［４］に記載の方法。
［６］　前記培養において、ｈＰＧＣマーカー陽性を指標としてｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを選別し、継代培養することを含む、［１］~［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］　ｈＰＧＣマーカーがＢＬＩＭＰ１及び／もしくはＴＦＡＰ２Ｃ、又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６及びＥｐＣＡＭである、［６］に記載の方法。
［８］　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを少なくとも３０日間培養する、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］　前記培養において、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をさらに含む条件下で培養することを含む、［１］~［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質である、［９］に記載の方法。
［１０ａ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９である、［９］に記載の方法。
［１１］　［１］~［１０］及び［１０ａ］のいずれか１つに記載の方法でｈＰＧＣ及び／又はｈＰＧＣＬＣを維持増幅する工程を含む、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを含む細胞集団を製造する方法。
［１２］　［１］~［１０］及び［１０ａ］のいずれか１つに記載の方法により得られる、増幅されたｈＰＧＣ集団又はｈＰＧＣＬＣ集団。
［１３］　（ａ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬、並びに（ｂ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインを含んでなる、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅用試薬キット。
［１４］　前記（ａ）の薬剤がフォルスコリンであり、前記（ｂ）のサイトカインがＬＩＦ及びＥＧＦとの組み合わせ、ｂＦＧＦ単独、又はＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせである、［１３］に記載の試薬キット。
［１５］　グルコース濃度１ｇ／Ｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をさらに含む、［１３］又は［１４］に記載の試薬キット。
［１６］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をさらに含む、［１３］~［１５］のいずれか１つに記載の試薬キット。
［１６ａ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質である、［１６］に記載の試薬キット。
［１６ｂ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９である、［１６］に記載の試薬キット。
［１７］　ＩＮＴＥＧＲＩＮα６に対する抗体及び／又はＥｐＣＡＭに対する抗体をさらに含む、「１３」~［１６］、［１６ａ］及び［１６ｂ］のいずれか１つに記載の試薬キット。
［１８］　［１２］に記載のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、卵巣体細胞と凝集培養することを含む、ヒト卵原細胞／原生殖細胞様細胞の製造方法。
［１８ａ］　卵巣体細胞が非ヒト哺乳動物由来である、［１８］に記載の方法。
［１９］　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持培養の評価方法であって、
（１）ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣをフィーダー細胞上、所定の条件下で培養する工程、
（２）（１）で得られた細胞集団から生細胞を選別する工程、
（３）（２）で得られた生細胞をｈＰＧＣマーカー陽性細胞とそれ以外の細胞とに選別する工程、
（４）（３）で得られたｈＰＧＣマーカー陽性細胞以外の細胞をフローサイトメトリーに供し、ＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットによりｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化した細胞とフィーダー細胞とを識別する工程、及び
（５）（３）で得られるｈＰＧＣマーカー陽性細胞数と（４）で得られる脱分化した細胞数とに基づいて、前記所定の条件におけるｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を評価する工程
を含む、方法。
［１９ａ］　フィーダー細胞がｍ２２０−５細胞である、［１９］に記載の方法。
［１９ｂ］　工程（５）における評価が、下式：
　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ＝ｌｏｇ２（ｈＰＧＣマーカー陽性細胞数／脱分化した細胞数）
で表されるｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅに基づいて行われる、［１９］又は［１９ａ］に記載の方法。
［２０］　ｈＰＧＣマーカー陽性細胞がＢＬＩＭＰ１及びＴＦＡＰ２Ｃ二重陽性細胞である、［１９］、［１９ａ］又は［１９ｂ］に記載の方法。
［２１］　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）候補物質の存在下又は非存在下で、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣをフィーダー細胞上、所定の条件下で培養し、
（ｂ）［１９］、［１９ａ］、［１９ｂ］又は［２０］の方法によりｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を評価し、
（ｃ）候補物質の非存在下での維持効率と比較して、候補物質の存在下での維持効率が高かった場合に、該候補物質をｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬として選択すること
を含む、方法。
　本発明はまた、以下のものを提供する。
［２２］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣをＷｎｔシグナル伝達阻害薬の存在下で培養することを含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅方法。
［２２ａ］　培養がフォルスコリン及び／又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む条件下で行われる、［２２］に記載の方法。
［２２ｂ］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣがヒト細胞であり、培養が
（ｉ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインをさらに含む条件下で行われる、［２２］に記載の方法。
［２２ｃ］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣが非ヒト動物細胞であり、培養が
（ｉ）フォルスコリン及びＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）をさらに含む
条件下で行われる、［２２］に記載の方法。
［２２ｄ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質である、［２２］、［２２ａ］、［２２ｂ］又は［２２ｃ］に記載の方法。
［２２ｅ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９である、［２２ｄ］に記載の方法。
［２３］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅培養において、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の存在下で該細胞を倍養することを含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化を抑制する方法。
［２３ａ］　培養がフォルスコリン及び／又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む条件下で行われる、［２３］に記載の方法。
［２３ｂ］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣがヒト細胞であり、培養が
（ｉ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインをさらに含む条件下で行われる、［２３］に記載の方法。
［２３ｃ］　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣが非ヒト動物細胞であり、培養が
（ｉ）　フォルスコリン及びＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）ＣｓＡをさらに含む
条件下で行われる、［２３］に記載の方法。
［２３ｄ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質である、［２３］、［２３ａ］、［２３ｂ］又は［２３ｃ］に記載の方法。
［２３ｅ］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９である、［２３ｄ］に記載の方法。
［２４］　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化抑制剤。
［２５］　多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、Ｗｎｔシグナル伝達限害薬の存在下、ＰＧＣＬＣに分化誘導することを含む、ＰＧＣＬＣの製造方法。
　本発明の方法によれば、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを長期間（例えば１２０日以上）培養し、１００万倍以上増幅させることが可能である。
インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ａ）ｍ２２０−５フィーダー上での誘導と培養のスキーム。ｈＰＧＣＬＣをＢＬＩＭＰ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＢＴ）及びＴＦＡＰ２Ｃ−ＥＧＦＰ（ＡＧ）陽性（ＢＴ＋ＡＧ＋）細胞としてＦＡＣＳによりソーティングした。スケールバー、２００μｍ。 インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ｂ）（左）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増殖のための条件の探索のためのスキーム。（右）ＦＡＣＳ解析で決定された指定された条件下で１０日間培養した後のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の数を示すプロット。（青色）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増殖のために使用された化学物質の組み合わせ［フォルスコリン（１０μＭ）、ロリプラム（１０μＭ）、及びシクロスポリンＡ（５μＭ）］。（黄色）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増殖のために使用されたサイトカインの組み合わせ［ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ）］。約５０００個のｈＰＧＣＬＣを出発細胞集団として使用した。シクロスポリンＡはＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増殖に悪影響を及ぼしたため、シクロスポリンＡを除いた条件で再現実験を行った。平均倍数変化（ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）を横棒で示す。ｍＰＧＣＬＣ増幅の条件：緑。さらなる化学物質／サイトカインがない条件：灰色。 インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ｃ）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のＦＡＣＳによる継代のスキーム。ＢＴ＋とＡＧ＋の細胞は指定されたＦＡＣＳゲート内の細胞であると規定された。 インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ｄ）１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを含む指定された基礎培地中でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅の２連の実験の結果。約５０００個のｈＰＧＣＬＣを出発細胞集団（培養日数０：ｃ０）として使用し、ｃ１０、ｃ２０及びｃ３０での継代においてＦＡＣＳにより測定したそれらの数の増加を、ｃ０からの倍数変化として示した。 インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ｅ）１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを含む指定された基礎培地中でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅の２連の実験の結果。約５０００個のｈＰＧＣＬＣを出発細胞集団（培養日数０：ｃ０）として使用し、ｃ１０、ｃ２０及びｃ３０での継代においてＦＡＣＳにより測定したそれらの数の増加を、ｃ０からの倍数変化として示した。 インビトロでｈＰＧＣＬＣを増幅させる条件の探索。（Ｆ）ｃ２１からｃ３０までのＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養のレリーフコントラストと蛍光（ＢＴ）画像の典型的な例。Ｃ２１、２３、２５、２７、２９及び３０における画像を示す。中央パネルのｃ３０において四角で囲んた部分を拡大したのが、右端のパネルである。矢印は典型的な形態を有するＢＴ＋細胞を示す。スケールバー：左、１００μｍ；右から２番目、２００μｍ；右、５０μｍ。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ａ）ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ６と、１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｍｇ／ｎｌ　ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ（グルコース１ｇ／Ｌ）中のｍ２２０フィーダー細胞上でのｄ６　ｈＰＧＣＬＣから出発したＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養のｃ１０からｃ１２０におけるＢＴＡＧのＦＡＣＳプロット。ＢＴＡＧ発現がポジティブであることは図１Ｃに示されている。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｂ）ｃ１２０までのＢＴ＋ＡＧ＋細胞増殖の間のＢＴ＋ＡＧ＋、ＢＴ＋、ＡＧ＋細胞のパーセンテージの変化。色の意味は別枠に示した通りである。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｃ）ｃ２０（左）とｃ６０（右）の細胞における、ＤＲＡＱ７取り込み（上）、ＴＲＡ−１−８５発現（中央）、及びＴＲＡ−１−８５＋細胞におけるＢＴ・ＡＧ（下）のポジティブ性についてのＦＡＣＳ解析チャート。チャート右側のグラフは、ＴＲＡ−１−８５＋／ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（紫）、ＴＲＡ−１−８５＋／非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（緑）、ＴＲＡ−１−８５−細胞（赤）、及びＤＲＡＱ７＋細胞（青）の比率を示す。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｄ）ｃ３０、７０及び１２０におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養のレリーフコントラスト（左）と蛍光画像［ＢＴ（中央）及びＡＧ（右）］。ＡＧ＋細胞をプレート上で二次元的に培養した場合、ＡＧの蛍光は暗くなった。スケールバー、５０μｍ。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｅ）２連の実験におけるｃ１２０までのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のｌｏｇ１０（増加倍数）により示された、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の成長曲線。出発細胞集団として１０，０００個のｈＰＧＣＬＣを使用し、各継代において１０，０００個のＢＴ＋ＡＧ＋細胞を再プレーティングした。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｆ）ｃ２８［低倍率（左）と高倍率（中央）］とｃ６６［高倍率（右）］におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養の間の、ＡＧ＋（ＧＦＰ）（黄色）細胞中のＢＬＩＭＰ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＳＯＸ１７、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）及びＮＡＮＯＧ（シアン）の発現の免疫蛍光（ＩＦ）解析。細胞をＤＡＰＩ（白色）で対比染色した。ｃ２８［低倍率］については、マージした画像を右端に示す。スケールバー、２０μｍ。 インビトロにおける指定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの長期増殖。（Ｇ）ｈＰＧＣＬＣ誘導とＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養の間の示された遺伝子の発現の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析。試験した各遺伝子について、２つの独立したハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬＰ０とＰＰＩＡ（０として設定した）の平均Ｃｔ値からの△Ｃｔを計算し、２つの独立した試験についてプロットした。平均値を線で繋げた。＊：検出せず又は△Ｃｔが＜−１０。 ｄ４　ｈＰＧＣＬＣからのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の長期増幅。（Ａ）１５％　ＫＳＲ、２．５％　ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ（グルコース１ｇ／Ｌ）中の、ｍ２２０フィーダー上での、ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ４におけるＢＴＡＧ発現と、ｄ４　ｈＰＧＣＬＣから出発したＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養のｃ１０~ｃ１２０におけるＢＴＡＧ発現のＦＡＣＳプロット。ＢＴＡＧ発現の陽性は図１Ｃに示された様に規定された。 ｄ４　ｈＰＧＣＬＣからのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の長期増幅。（Ｂ）ｃ１２０までのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋、ＢＴ＋、及び＋ＡＧ＋細胞のパーセンテージの変化。色の意味は示した通りである。 ｄ４　ｈＰＧＣＬＣからのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の長期増幅。（Ｃ）ＴＲＡ−１−８５−細胞（ｍ２２０フィーダー）のＢＴＡＧ蛍光レベルのＦＡＣＳ解析。（左）ＤＲＡＱ７−細胞を生細胞として選別し、ＴＲＡ−１−８５の発現を解析した。（右）ＴＲＡ−１−８５＋ヒト細胞およびＴＲＡ−１−８５−ｍ２２０フィーダーのＢＴＡＧ蛍光。ＴＲＡ−１−８５−ｍ２２０フィーダーは弱い自家蛍光を示し、ＢＴＡＧ蛍光でソートすると、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の下に対角線上にプロットされている。 ｄ４　ｈＰＧＣＬＣからのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の長期増幅。（Ｄ）親の５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣ（上部）と増幅培養のｃ７０におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞（下部）のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＨＧ）による核型解析であり、ｃ７０におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞において核型は実質的に保持されていることを示している。 ｄ４　ｈＰＧＣＬＣからのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の長期増幅。（Ｅ）ｃ２９でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養における、ＧＦＰ（ＡＧ）、ヒトミトコンドリア抗原（ｈＭｃｄ）、およびＳＯＸ２の発現のＩＦ解析。培養中のＡＧ−細胞はＳＯＸ２を発現し、ＡＧ＋／ＳＯＸ２−細胞と一緒に発生した。スケールバー、５０μｍ。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ａ）ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ６におけるＡＧ＋細胞から生成し、ｃ１０とｃ５０でＡＧポシティブ性を有する、培養物中のＡＧ発現についてのＦＡＣＳプロット。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｂ）ＡＧ＋細胞をｃ６０まで増幅させる間の、ｌｏｇ１０（増加倍数）で示されたＡＧ＋細胞の成長曲線。ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ６における１０，０００個のＡＧ＋細胞を出発細胞集団として使用し、１０，０００個のＡＧ＋細胞を各継代において再プレーティングした。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｃ）ｃ６０における（Ｂ）と同様の培養のＢＴＡＧ発現のＦＡＣＳプロット。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｄ）ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ６におけるＩＮＴＥＧＲＩＮαｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞（青色で示す）から生じ、ＩＮＴＥＧＲＩＮαｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ発現を有してｃ１０、２０及び３０に継代された培養物中のＩＮＴＥＧＲＩＮαとＥｐＣＡＭ発現のＦＡＣＳプロット。培養中に出現したＩＮＴＥＧＲＩＮαｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞を黄色で示した。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｅ）ｃ１０とｃ３０における（Ｄ）と同様の培養物のレリーフコントラスト画像。スケールバー、２００μｍ。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｆ）（上）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養の間のｃ４０における、（５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣ由来の）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞中のＩＮＴＥＧＲＩＮαとＥｐＣＡＭの発現パターン。（下）ｃ４０でのＩＮＴＥＧＲＩＮａ６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ（青）またはＩＮＴＥＧＲＩＮａ６ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ（黄色）細胞におけるＢＴＡＧの発現パターン（図３Ｃを参照）。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｇ）ＩＮＴＥＧＲＩＮαｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞をｃ３０まで増幅させる間の、ｌｏｇ１０（増加倍数）で示されたその細胞の成長曲線（三連の実験）。ｈＰＧＣＬＣ誘導のｄ６における１０，０００個の細胞を出発細胞集団として使用し、各継代において１０，０００個の細胞を再プレーティングした。 表面マーカー選択による独立したｈｉＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの増幅。（Ｈ）ｈＰＧＣＬＣ誘導とＩＮＴＥＧＲＩＮαｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞増幅培養の間の、示された遺伝子の発現のｑＲＮＡ解析。試験した各遺伝子について、２つの独立したハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬＰ０とＰＰＩＡ（０として設定する）の平均Ｃｔ値からの△Ｃｔを計算し、２つの独立した実験についてプロットした。平均値を線で繋げた。＊：検出せず又は△Ｃｔが＜−１０。＊＊：１つの実験においてのみ検出された。 ｘｒ卵巣（ｘｒＯｖａｒｉｅｓ）中での、ｈＰＧＣＬＣ誘導、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅、および分化の間で鍵となる遺伝子のトランスクリプトーム解析および発現。（Ａ）増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞の示されたレプリケートの間のトランスクリプトームの分散プロット比較。 ｘｒ卵巣（ｘｒＯｖａｒｉｅｓ）中での、ｈＰＧＣＬＣ誘導、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅、および分化の間の間で鍵となる遺伝子のトランスクリプトーム解析および発現。（Ｂ）示された細胞型において、鍵となる示された遺伝子のＲＮＡ−ｓｅｑ解析により測定された発現動態。示された各遺伝子について、ｈｉＰＳＣ、ｉＭｅＬＣ、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ、およびｃ１０~ｃ１２０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞についての３つのレプリケートと、ａｇ７~ａｇ７７　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（１つのレプリケートを有するａｇ４９　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞を除く）についての２つのレプリケートに由来するｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値を、線で繋がれた平均値で示す。ｃ１０ＩＴＧＡ６ｌｏｗ細胞は１３８３Ｄ６　ｈｉＰＳＣに由来するのに対し、他のすべてのセルタイプは５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣに由来する。 増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のトランスクリプトーム解析。ｃ１０とｃ３０のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間の差次的に発現する遺伝子における、ＧＯエンリッチメントと代表的な遺伝子。色の意味は示した通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のトランスクリプトーム解析。（Ａ）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞を関連する細胞型［ｈｉＰＳＣ，ｉＭｅＬＣ，ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ及びｘｒ卵巣中で培養されたｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８）］と増幅培養している間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のトランスクリプトームの教師なし階層クラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ　ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）（ＵＨＣ）。使用された当初のｈｉＰＳＣ株と細胞状態を色彩で示した。細胞状態の表示の下の数はレプリケート数を示す。ｃ：増幅培養中の培養日数；ａｇ：ｘｒ卵巣中で凝集培養した培養日数 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のトランスクリプトーム解析。（Ｂ）（Ａ）と同様の細胞のトランスクリプトームの主成分解析（ＰＣＡ）。細胞をＰＣ１値とＰＣ２値により規定された２次元平面にプロットした。色の意味は示された通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のトランスクリプトーム解析。（Ｃ）（Ａ）と同様の細胞中のｈｉＰＳＣ由来の卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）様細胞の分化プロセスを特徴付ける遺伝子の発現のヒートマップ表示（クラスター１~５の遺伝子；Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８）。各クラスターにおける、代表的な遺伝子と遺伝子オントロジー（ＧＯ）機能タームのエンリチメントを右側に示す。色の意味は（Ａ）に示したのと同様である。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のトランスクリプトーム解析。（Ｄ）示された細胞型における（Ｃ）のクラスター１~５の遺伝子の平均発現レベルのボックスプロット解析。ボックスは２５番目と７５番目のパーセンタイルを示し、バーは中央値を示す。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のトランスクリプトーム解析。（Ｅ）示された細胞型の中の（Ｃ）のクラスター１~５の遺伝子の発現プロファイルのスピアマンの順位相関解析（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ　ｒａｎｋ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）。色の意味は示した通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞間で差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）。（Ａ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣからＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅の間の示された細胞型の間のトランスクリプトームの分散図の比較。Ｙ軸上の細胞型においてアップレギュレート及びダウンレギュレートされた遺伝子［ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）≧４、ｌｏｇ２（変化の倍率）≧１］をそれぞれ、赤色と青色で示す。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞間で差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）。（Ｂ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣとｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で差次的に発現した遺伝子におけるＧＯエンリッチメントとＤＥＧの代表的な遺伝子。色の意味は示した通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞間で差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）。（Ｃ）（左）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のｃ３０と、ａｇ７（上）又はａｇ２１（下）の間の分散図比較。色の意味は（Ａ）で示した通りである。（右）ｃ３０とａｇ７（上）又はａｇ２１（下）の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で差次的に発現した遺伝子におけるＧＯエンリッチメントと代表的な遺伝子。色の意味は示した通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ａ）ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞中の、全ゲノムバイサルファイトシークエンス（ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ　ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＷＧＢＳ）解析により測定された、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイルレベル［５−メチルシトシン（５ｍＣ）レベル］のバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）と、示された関連する細胞型。平均レベルを赤いバーで示す。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｂ）示された細胞型の間の、ゲノムワイドな５ｍＣレベル（ゲノムワイドな２ｋｂウィンドウ）のヒストグラム表現（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）（分散図の上と右側）と組み合わせた分散図の比較。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｃ）示された細胞型における常染色体上の示されたゲノムエレメント中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ表示。ＨＣＰ／ＩＣＰ／ＬＣＰ：強い／中程度／弱いＣｐＧプロモーター。色の意味は示した通りである。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｄ）示された細胞における常染色体上の示された繰り返しエレメント（ｒｅｐｅａｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ表示。ＬＩＮＥ、ＥＲＶＫ、ＥＲＶＬ、およびＥＲＶ１についてｒｅｐＳｔａｒｔ＜５かつｒｅｐＥｎｄ＞５ｋｂ、ＳＩＮＥについてｒｅｐＳｔａｒｔ＜５かつｒｅｐＥｎｄ＞３１０の繰り返しエレメントを使用して、切り捨てられたエレメントを除外した。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｅ）示された細胞中の示されたインプリントされた遺伝子（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　ｇｅｎｅ）の差次的にメチル化された領域中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ表示。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｆ）ｈｉＰＳＣおよびｃ６６　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞におけるＤＮＭＴ１またはＵＨＲＦ１の発現のＩＦ解析。ｈｉＰＳＣはＮＡＮＯＧと共染色した；ｃ６６　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞はＧＦＰ（ＡＧ）で共染色した；両方の細胞型はＤＡＰＩで対比染色した。下のパネルは上のパネルの拡大図である。スケールバー、２０μｍ。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｇ）インビボでのマウス生殖細胞中での、ＣｐＧ，ＣｐＡ，ＣｐＴ及びＣｐＣ配列中のゲノムワイドの５ｍＣレベルを表すバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）。中央値レベルを黄色バーで示す。Ｅ：胚発生日（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｄａｙ）；Ｆ：雌；Ｍ：雄。ｃ：増幅培養における培養日数；ａｇ：ｘｒ卵巣中での凝集培養における培養日数。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｈ）インビトロでのｍＰＧＣＬＣ誘導と増幅の間の細胞中での、ＣｐＧ，ＣｐＡ，ＣｐＴ及びＣｐＣ配列中のゲノムワイドの５ｍＣレベルを表すバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）。中央値レベルを黄色バーで示す。ｃ：増幅培養における培養日数；ａｇ：ｘｒ卵巣中での凝集培養における培養日数。 ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間の、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなメチル化プロファイル。（Ｉ）インビトロでのｘｒ卵巣におけるｈＰＧＣＬＣ誘導、増幅及び分化の間の細胞中での、ＣｐＧ，ＣｐＡ，ＣｐＴ及びＣｐＣ配列中のゲノムワイドの５ｍＣレベルを表すバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）。中央値レベルを赤いバーで示す。細胞状態の表示の下の数はレプリケート数を示す。ｃ：増幅培養における培養日数；ａｇ：ｘｒ卵巣中での凝集培養における培養日数。 増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイル。（Ａ）増幅培養中のｄ６　ｈＰＧＣＬＣ／ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の示されたレプリケートの間のＤＮＡメチル化プロファイルの分散図の比較。 増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイル。（Ｂ）ｘｒ卵巣中でのｈＰＧＣＬＣ誘導、増幅、及び分化の間の細胞中でのＭＴ１遺伝子クラスターの付近のＤＮＡメチル化プロファイル。 増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイル。（Ｃ）（上）図５においても見られる、示された細胞型の中でのＴＣＬ１ＡのＲＮＡ−ｓｅｑ解析により測定される発現動態と、（下）ｄ６　ＰＧＣＬＣ（３つのレプリケート）とｃ１０、ｃ７０及びｃ１２０（各々２つのレプリケート）のＢＴ＋ＡＧ＋細胞における、ＴＣＬ１Ａのプロモーター中の５ｍＣレベル。 増幅培養の間のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイル。（Ｄ）示された細胞型におけるＨ１９（染色体位置：１１ｐ１５）、ＩＧ−ＤＭＲ（１４ｑ３２）、およびＩＧＦ　１Ｒ（１５ｑ２６．３）のインプリント制御領域（ＩＣＲ）の制御下での示されたインプリントされた（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　ｇｅｎｅ）発現のヒートマップ表示。細胞状態の表示の下の数はレプリケート数を示す。色の意味は示した通りである。ｄ６ｃ１２０細胞におけるＨ１９の発現レベルは、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣにおける発現レベルと比較して有意にアップレギュレートされている（Ｗｅｌｃｈのｔ検定、Ｐ＝０．００９）。インプリントされた遺伝子（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　ｇｅｎｅ）は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｐａｒｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｉｇｉｎ　ＥｆｆｅｃｔｓのＷｅｂサイトから入手した（ｈｔｔｐ：／／ｉｇｃ．ｏｔａｇｏ．ａｃ．ｎｚ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ；Ｍｏｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ，２００５）。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ａ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ（上）又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（下）によりｘｒ卵巣を作製するためのスキーム。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｂ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ（上）又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（下）によるａｇ７７におけるｘｒ卵巣の細胞中のＢＴＡＧ発現の明視野画像とＦＡＣＳプロット。スケールバー、２００μｍ。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｃ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞に由来するａｇ３５とａｇ７７のｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の数。Ｐ値はＷｅｌｃｈのｔ検定で計算した。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｄ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ（左）又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（右）によるａｇ７７におけるｘｒ卵巣中の、ＡＧ＋（黄色）細胞／マウス卵巣体細胞中の、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＦＯＸＬ２、ＳＯＸ１７、ＤＡＺＬ、ＤＤＸ４及びヒトミトコンドリア抗原（ｈＭＣ；シアン）の発現のＩＦ解析。細胞をＤＡＰＩ（白色）により対比染色し、マージした画像を右に示す。スケールバー、２０μｍ。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｅ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ（黒）又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（赤）により作製されたａｇ７、ａｇ３５、およびａｇ７７におけるｘｒ卵巣から単離されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞中の示された遺伝子の発現のｑＰＣＲ解析。試験された各遺伝子について、２つの独立したハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬＰ０とＰＰＩＡの平均Ｃｔ値（０と設定した）から△Ｃｔを計算し、２つの独立した実験についてプロットした。平均値を線により繋げた。平均バーのない点は、遺伝子発現が２つのレプリケートのうちの１つでのみ検出されたことを示す。＊：検出されなかった。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｆ）示された細胞型における示された遺伝子のプロモーターの５ｍＣレベル。細胞状態の表示の下の数はレプリケート数を示す。ｄ６ｃ１０細胞におけるＤＰＰＡ３およびＰＩＷＩＬ２の平均プロモーターメチル化レベルは、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣのものと比較して有意に減少した（Ｗｅｌｃｈのｔ検定、Ｐ＜０．０５）。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｇ）示された細胞型における（図７Ｃ）におけるようなクラスター３遺伝子のプロモーターの５ｍＣレベルのボックスプロット解析。ボックスは２５番目と７５番目のパーセンタイルを示し、バーは中央値を示す。細胞状態の表示の下の数はレプリケート数を示す。ｄ６ｃ１０細胞の平均プロモーターメチル化レベルは、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣにおけるものと比較して有意に減少した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、Ｐ＜０．０５）。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｈ）示された関連する細胞型を有するｘｒ卵巣中でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養と分化の間における、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のトランスクリプトームのＰＣＡ。アスタリスク（＊）は、本研究で作製されたａｇ３５とａｇ７７細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータを意味する。ＰＣＡにおいて、青と赤の矢印は、それぞれ、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来およびｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来のａｇ３５／７７　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のデータを示す。色の意味は示した通りである。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｉ）ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ又はｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞により作製されたａｇ３５とａｇ７７におけるｘｒ卵巣から単離されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞中の、図７Ｃにおけるクラスター１~５の遺伝子の発現を示すヒートマップ表示である。色の意味は示した通りである。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｊ）示された細胞型における（Ｉ）におけるクラスター１~５の遺伝子の平均発現レベルを示すバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）。四角は２５番目と７５番目のパーセンタイルを示し、バーは中央値を示す。ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞と比較して、ｄ６ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来の細胞では、クラスター３の遺伝子は顕著なアップレギュレーションを示し、クラスター４と５は顕著なダウンレギュレーションを示す（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、ｐ＜０．０５）。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｋ）（左）示された細胞型において全ゲノムバイサルファイトシークエンス解析により測定された、ゲノムワイドの５ｍＣレベルのバイオリン図（Ｖｉｏｌｉｎ−ｐｌｏｔ）。平均レベルを赤いバーで示す。（右）示された細胞型の間で、ゲノムワイドの５ｍＣレベル（ゲノムワイドの２ｋｂウィンドウ）を、ヒストグラム表示（分散図（ｓｃａｔｔｅｒ−ｐｌｏｔ）の上と右）と組み合わせた、分散図の比較。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｌ）示された細胞における、常染色体の示されたゲノムエレメント中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ表示。色の意味は示した通りである。 増幅されたＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞（ｏｏｇｏｎｉａ）／原生殖細胞（ｇｏｎｏｃｕｙｔｅ）様細胞に分化する。（Ｍ）示された細胞における、示されたインプリントされた遺伝子（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　ｇｅｎｅ）の差次的にメチル化された領域中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ表示。色の意味は示した通りである。 維持増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分化する。（Ａ）示された細胞型における図７Ｃ中のクラスター１~５の遺伝子群のプロモーターの５ｍＣレベルを箱ひげ図で示す。箱は２５~７５パーセンタイルを示し、箱内の線は中央値を示す。各細胞状態の表示の後の数字はレプリケートの数を表す。 維持増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分化する。（Ｂ）維持増幅培養中及びｘｒ卵巣内で分化中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のトランスクリプトームの教師なし階層クラスタリングを、示された関連する細胞型とともに示す。ユークリッド距離とウォード法を用いた。＊は、本発明で得られたａｇ３５及びａｇ７７細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータを示す。各色の意味は右上に示されたとおりである。 維持増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分化する。（Ｃ）示された細胞型における常染色体上の示された繰り返しエレメント中の５ｍＣレベルを示すヒートマップ。ＬＩＮＥ、ＥＲＶＫ、ＥＲＶＬ及びＥＲＶ１については、ｒｅｐＳｔａｒｔ＜５及びｒｅｐＥｎｄ＞５ｋｂ、ＳＩＮＥについては、ｒｅｐＳｔａｒｔ＜５及びｒｅｐＥｎｄ＞３１０の繰り返しエレメントを用い、短縮化されたエレメントを排除した。 維持増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分化する。（Ｄ）（左）示された細胞型のＤＮＡ脱メチル化「エスケープ」（実施例１、＜実験方法＞、「ＷＧＢＳデータ処理と解析」の項を参照）の数と、それらの間で共通する数とを示すＵｐｓｅｔプロット。ｈＧＣ：Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ，２０１５に記載の７~９週のヒト生殖細胞。（右）示された細胞型におけるＤＮＡ脱メチル化「エスケープ」における示されたゲノムエレメントの富化。ＴＳＳ：転写開始部位、ＵＴＲ：非翻訳領域、ＴＴＳ：転写終結部位。 維持増幅培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分化する。（Ｅ）ヒストグラム（スキャッタープロットの上と右）と組み合わせた、ｖｏｎ　Ｍｅｙｅｎｎ　ｅｔ　ａｌ（２０１６）で報告されたｄ１２　ｈＰＧＣＬＣと、示された細胞型（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ，２０１５、Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ，２０１８、及び本発明）との間のゲノムワイドな５ｍＣレベル（ゲノムワイド２−ｋｂウィンドウ）のスキャッタープロットの比較。Ｗｋ：週齢。胚の性別を週齢の表示の後に示す。Ｆ：雌性、Ｍ：雄性。 本発明のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持培養系の評価方法の有効性を示す図である。ＰＧＣＬＣレポーター遺伝子ＢＬＩＭＰ１−２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＡＰ２γ−２Ａ−ｅＧＦＰ（ＢＴＡＧ）を有するヒトｉＰＳＣからＰＧＣＬＣを誘導し増殖培養を行った。死細胞染色試薬ＤＲＡＱ７陰性かつヒト特異的細胞表面抗原ＴＲＡ−１−８５陰性の細胞集団はマウス由来のフィーダー細胞（ｍ２２０−５）であると考えられ、前方散乱光（ＦＳＣ）と側方散乱光（ＳＳＣ）の二次元プロットではＳＳＣが幅広い値を取る特徴的なパターンを示した（赤色）。一方、ＴＲＡ−１−８５陽性細胞はｈＰＧＣＬＣに由来する細胞と考えられるが、ＢＴＡＧ二重陽性の増殖ｈＰＧＣＬＣ以外の非ＢＴＡＧ二重陽性細胞はＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットでＳＳＣの値が低く、ＦＳＣが幅広い値を取るパターンを示した（緑色）。フィーダー細胞と非ＢＴＡＧ二重陽性細胞を同一のＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットに表示すると、それぞれの細胞集団はほとんど独立して見られ、区別可能であった（紫色）。このことは、ＴＲＡ−１−８５の発現を解析せずとも、ＢＴＡＧ二重陽性の増殖ＰＧＣＬＣ以外をＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットに表示することで、フィーダー細胞とｈＰＧＣＬＣ由来の脱分化した細胞（非ＢＴＡＧ二重陽性細胞）とが区別可能であることを示している。 Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬によるＰＧＣＬＣの脱分化抑制効果を示す図である。（Ａ）は種々の濃度のＩＷＲ１をｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養培地に添加して３０日間培養した実験の結果を示す。３０日間の培養における各条件でのＢＴＡＧ二重陽性細胞の増殖曲線（ｎ＝３）。３回の実験の平均値をプロットし、直線で繋いだ。小文字「ｃ」の後の数字は培養日数を示す。 Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬によるＰＧＣＬＣの脱分化抑制効果を示す図である。（Ｂ）は種々の濃度のＩＷＲ１をｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養培地に添加して３０日間培養した実験の結果を示す。ｃ１０、ｃ２０及びｃ３０における各条件でのｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ（ｎ＝３）。平均値を赤色のひし形でプロットした。ＤＭＳＯ添加群を対照群とし、Ｄｕｎｎｅｔ法による多重比較検定を行った。＊：ｐ＜０．１，＊＊：ｐ＜０．０５ Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬によるＰＧＣＬＣの脱分化抑制効果を示す図である。（Ｃ）は種々のＷｎｔシグナル伝達阻害薬（ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＩＷＰ２）を２．５μＭの濃度で培地に添加して３０日間培養した実験の結果を示す。ｃ１０、ｃ２０及びｃ３０における各Ｗｎｔシグナル阻害薬添加条件でのｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ。ｎｏｎｅ：ｎ＝５（ｃ１０，ｃ２０）；ｎ＝２（ｃ３０）、ＤＭＳＯ：ｎ＝５（ｃ１０，ｃ２０）；ｎ＝４（ｃ３０）、ＩＷＲ１：ｎ＝３、ＸＡＶ９３９：ｎ＝２、ＩＷＰ２：ｎ＝１、Ｗｎｔ−Ｃ５９：ｎ＝１
［Ｉ］ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅方法
　本発明は、ヒト始原生殖細胞（ｈＰＧＣ）又はヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のヒト始原生殖細胞様細胞（ｈＰＧＣＬＣ）の維持増幅方法を提供する。当該方法は、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、
（ｉ）フォルスコリン又はホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害薬、並びに
（ｉｉ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１以上のサイトカイン
の存在下で培養することを含む。
　本発明で用いられるｈＰＧＣは、当該技術分野において自体公知のいかなる方法によっても単離することができる（例えば、特許文献１を参照）。例えば、妊娠５~９週程度の死亡胎児の組織から、ｈＰＧＣ特異的マーカー（例、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６、ＥｐＣＡＭ等）の発現を指標としてＦＡＣＳ等の手法により単離することができるが、これに限定されない。本発明で用いられるｈＰＧＣＬＣは、単離されたｈＰＳＣからインビトロで誘導され、かつｈＰＧＣと同等の特性を有するものであればいかなるものであってもよい。例えば、該ｈＰＧＣＬＣは、単離されたｈＰＳＣから、以下に示す方法により製造することができる。
１．ｈＰＳＣからのｈＰＧＣＬＣの製造
　ｈＰＧＣＬＣ製造の出発材料として使用するｈＰＳＣは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と、三つの一次胚葉すべてに分化できる「分化多能性」とを有する、単離された未分化細胞であればいずれでもよい。ここで「単離された」とは、生体内（インビボ）から生体外（インビトロ）の状態におかれたことを意味し、必ずしも純化されている必要はない。例えば、単離されたＰＳＣとして、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞などが挙げられるが、好ましくはｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である。
（１）ｈＰＳＣの作製
（ｉ）ＥＳ細胞（ＥＳＣ）
　内部細胞塊を培養する方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２，１１４５−１１４７，１９９８）が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＥＳ細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトＥＳ細胞株であるＨ１及びＨ９は、ウィスコンシン大学のＷｉＣｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手可能であり、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
（ｉｉ）ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）
　ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．及びＳ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６；ＷＯ２００７／０６９６６６）。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞及び分化全能性細胞を除くあらゆるヒト細胞をいう。体細胞には、非限定的に、胎児の体細胞、新生児の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡ、またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディングＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３、Ｇｌｉｓ１等が例示される。これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３：５６８−５７４、Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ，Ａ．（２００８）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３：１３２−１３５、Ｆｅｎｇ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１１：１９７−２０３、Ｊｕｄｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ，４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，６：１６７−７４、Ｈａｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．（２０１０）Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２８：７１３−７２０及びＭａｅｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ，４７４：２２５−９に記載の組み合わせが例示される。
　好ましい態様において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（ＯＳＫ）を初期化因子として用いることができる。より好ましくは、該３因子に加え、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｍｙｃ（Ｔ５８Ａ変異体を含む）から選択されるＭｙｃファミリーメンバー（Ｍ）を用いることができる。さらに、Ｌｉｎ２８は、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の形成を促進し、ＴＲＡ−１−６０陰性細胞への逆戻り転換を阻害するので、３因子（ＯＳＫ）又は４因子（ＯＳＫＭ）に加え、Ｌｉｎ２８を初期化因子として使用することも好ましい。
　上記初期化因子には、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１　ｓｉＲＮＡ　Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ　２９ｍｅｒ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７及びＰＤ０３２５９０１）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−アザシチジン）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈ１、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢ１およびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔシグナリングアゴニスト（例えば可溶性Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳ１、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢ１等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれるが、それらに限定されない。本明細書においては、これらの樹立効率を高めることを目的として用いられる因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｍａｙ　８；４（５）：３８１−４）、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　初期化因子がＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎのベクター）（ＷＯ　２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができ、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
　また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）（ＴｒｉＬｉｎｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，７：６１８−６３０）。ＲＮＡ形態の初期化因子は、センダイウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクターを用いて体細胞内に導入してもよい（特許第５９６３３０９号）。また、所定の合成ｍＲＮＡをカチオン性ビヒクルを用いて体細胞内に導入して初期化する方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１０　Ｎｏｖ　５；７（５）：６１８−３０）や、所定のｍｉＲＮＡを体細胞内にトランスフェクションすることにより体細胞を初期化する方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１１　Ｊｕｎ　３；８（６）：６３３−８）も知られている。
　初期化因子は低分子化合物であってもよい。例えば、ＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、６１６４５２、トラニルシプロミン、フォルスコリン、およびＤＺＮｅｐを用いる方法が知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３　Ａｕｇ　９；３４１（６１４６）：６５１−４）。
　初期化因子を接触させた後、細胞を、例えば、１０~１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、３７℃、５％　ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４~７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０~約４５日またはそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、３７℃、５％　ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５~約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
　ｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４など、好ましくはＮａｎｏｇ又はＯｃｔ３／４）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばＴａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１−８７２（２００７）に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、ｉＰＳ細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。初期化因子としてＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２の３因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがＥＳ細胞と比較して遜色のない高品質のｉＰＳ細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくｉＰＳ細胞を樹立することが可能である。
　選択されたコロニーの細胞がｉＰＳ細胞であることの確認は、上記したＮａｎｏｇ（若しくはＯｃｔ３／４）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、ＧＦＰ陽性など）及び目視によるＥＳ細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確性を期すために、各種ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　上述の方法で得られたｈＰＳＣは、フィーダー細胞や血清を用いて培養することによって多様性が生じることから、既知組成の培養条件で培養することが望ましい。このような無血清及び無フィーダー条件として、例えば、Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．４，３５９４，２０１４に記載の方法など、細胞外基質（例えば、ラミニン５（ＷＯ２００９／１２３３４９）、ラミニン５断片（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５Ｅ８（ニッピ社））およびマトリゲル（ＢＤ社））上で、無血清培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社））を用いて培養する方法である。
（２）ｈＰＳＣからｈＰＧＣＬＣへの直接分化誘導
　ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、マウスＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と非常に異なる生物学的（形態的、分子的及び機能的）特性を有する。マウス多能性幹細胞は、２つの機能的に区別される状態、即ちＬＩＦ依存的なＥＳ細胞と、ｂＦＧＦ依存的なエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）とで存在し得る。分子学的解析から、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の多能性状態は、マウスＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のそれではなく、むしろマウスＥｐｉＳＣのそれに類似していることが示唆されている。従って、ｈＰＳＣをＢＭＰ４及びＬＩＦの存在下で培養することにより、ｈＰＧＣＬＣへと分化誘導し得る（Ｃｅｌｌ．２００９　Ｍａｙ　１；１３７（３）：５７１−８４）。
　また、ＬＩＦの存在下にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ及びＮａｎｏｇを異所的に誘導するか（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１０　Ｊｕｎ　４；６（６）：５３５−４６）、ＬＩＦ並びにＧＳＫ３β及びＥＲＫ１／２経路阻害薬と組み合わせて、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ２を異所的に誘導する（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０１０　Ｍａｙ　１８；１０７（２０）：９２２２−７）ことにより、マウスＥＳ細胞様の多能性状態にあるヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞（ナイーヴヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞とも呼ばれる）が樹立されている。これらのナイーヴヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞は、それらの多能性が従来のヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞に比べてより未熟であり、本発明のための出発材料として用いることができる。
　分化誘導用の基本培地としては、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ−Ａ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
　基本培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（ＳＦＭ）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清など）の濃度は、０~２０％、好ましくは０~５％、より好ましくは０~２％、最も好ましくは０％（すなわち、無血清）であり得る。ＳＦＭは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ　９８／３０６７９に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
　基本培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。添加物は特に限定されないが、例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミンなど）、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、ｄ−ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］−エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳなど）、栄養添加物（例えば、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ−Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
　ｈＰＳＣは、フィーダー細胞の存在下又は不在下にて培養されてよい。フィーダー細胞は特に限定されず、ＥＳＣ、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞の培養に使用するために自体公知のフィーダー細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株ＳＴＯなど）が挙げられる。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンＣなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。しかし、好ましい一実施態様において、ｈＰＳＣは、無フィーダー条件下で培養される。
　基本培地に添加されるＢＭＰ４の濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約３００ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＢＭＰ４の濃度は、例えば、約１，０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６００ｎｇ／ｍｌ以下である。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＢＭＰ４には、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。基本培地に添加されるＬＩＦの濃度は、例えば、約３００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは約５００Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは約８００Ｕ／ｍｌ以上である。また、ＬＩＦの濃度は、例えば、約２，０００Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは約１，５００Ｕ／ｍｌ以下、より好ましくは約１，２００Ｕ／ｍｌ以下である。ＢＭＰ４およびＬＩＦを添加した培地を、分化誘導用培地として用いることができる。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＬＩＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　分化誘導用培地は、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦから選択される少なくとも１つの添加物をさらに含有してもよい。ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦは、有効濃度範囲で存在した場合に、ｈＰＧＣＬＣがＢｌｉｍｐ１−及びＳｔｅｌｌａ−陽性状態で維持される期間を著しく延長する。ＳＣＦの濃度は、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＳＣＦの濃度は、例えば、約２００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約１２０ｎｇ／ｍｌ以下である。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＳＣＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。ＢＭＰ８ｂの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約３００ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＢＭＰ８ｂの濃度は、例えば、約１，０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６００ｎｇ／ｍｌ以下である。ＥＧＦの濃度は、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ以上である。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＢＭＰ８ｂには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。また、ＥＧＦの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６０ｎｇ／ｍｌ以下である。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＥＧＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　好ましい一実施態様において、分化誘導用培地は、基本培地に加えてＢＭＰ、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦを含有する。これら成分の濃度は、ＢＭＰ４については約２００~約８００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３００~約６００ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦについては約５００~約１５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約８００~約１，２００Ｕ／ｍｌ、ＳＣＦについては約５０~約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約８０~約１２０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ８ｂについては約２００~約８００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３００~約６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦについては約２０~約８０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３０~約６０ｎｇ／ｍｌの範囲に亘って適宜選択され得る。
　分化誘導用培地に含有されるＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦは、そのソースに関して特に限定されず、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなど）の細胞から単離及び精製されてよいが、ヒト由来のＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦを使用することが好ましい。ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦは、化学的に合成されてもよく、無細胞翻訳系を用いて生化学的に合成されてもよく、或いは各タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体から製造されてもよい。ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ及びＥＧＦの組換え産物は市販されている。
　本工程に使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（ｌｙｓｅｄ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が挙げられる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ　２００５．Ｌａｎｃｅｔ　３６５：ｐ１６３６−１６４１）。
　この培養において、自体公知の細胞非接着性又は低接着性培養器にｈＰＳＣを播種し、例えば、約３~１０×１０４細胞／ｍＬ、好ましくは約４~８×１０４細胞／ｍＬの細胞密度とし、１~１０％ＣＯ２／９９~９０％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約３０~約４０℃、好ましくは約３７℃で、約４~約１０日間、好ましくは約４~約８日間、より好ましくは約４~約６日間、さらに好ましくは約４日間培養する。
　ｈＰＧＣＬＣへの分化の事実は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどによりＢＬＩＭＰ１の発現を分析することによって確認できる。さらに必要に応じて、他の遺伝子や細胞表面抗原の発現を調べることもできる。他の遺伝子の例にはＴＦＡＰ２Ｃが挙げられる。ＢＬＩＭＰ１−及び／又はＴＦＡＰ２Ｃ−プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用する場合には、ｈＰＧＣＬＣへの分化の事実はＦＡＣＳ解析により確認できる。ヒトＰＳＣが適切なトランスジェニックレポーターを有さない場合には、ｈＰＧＣＬＣの分化の事実は、ｈＰＧＣＬＣに特異的に発現する１種以上の細胞表面抗原を用いて、ＦＡＣＳ解析などにより確認することが好ましい。細胞表面抗原として、ＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６（ＣＤ４９ｆ）、ＩＮＴＥＧＲｌＮβ３（ＣＤ６１）、ＫｌＴ（ＣＤ１１７）、ＥｐＣＡＭ、ＰＯＤＯＰＬＡＮＩＮおよびＴＲＡ１−８１からなる群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が例示され、好ましくはＩＮＴＥＧＲＩＮα６及びＥｐＣＡＭが例示される。
（３）ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣを経由したｈＰＧＣＬＣへの分化誘導
　ｈＰＳＣからｈＰＧＣＬＣへの誘導は、マウスの場合と同様に、Ｈａｙａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１１　Ａｕｇ　１９；１４６（４）：５１９−３２に記載の方法で行うことができる。しかしながら、当該方法を用いると、死細胞が多く発生し、誘導効率が低い。一方、ｈＰＳＣをアクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養し、ヒト初期中胚葉様細胞（ｈｉＭｅＬＣ）を誘導し、該ｈｉＭｅＬＣをマウスＰＧＣＬＣの誘導条件に供すると、ｈＰＧＣＬＣの誘導効率が上がり、死細胞の発生が抑えられる（ＷＯ２０１７／００２８８８）。従って、好ましい実施態様において、本発明の維持増幅方法における出発材料であるｈＰＧＣＬＣは、ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣを経由して誘導されたものである。
（３−１）ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣへの分化誘導
　ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣへの分化誘導用の基本培地としては、前記（２）で使用するために例示した基本培地が挙げられるが、これらに限定されない。当該基本培地は、前記（２）で使用するために例示したような自体公知のその他の添加物を含有してもよい。
　培地は、血清含有培地又は無血清培地（ＳＦＭ）であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清など）の濃度は、０~約２０％、好ましくは０~約５％、より好ましくは０~約２％、最も好ましくは０％（すなわち無血清）であり得る。ＳＦＭは、ＫＳＲなど任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくともよい。詳細は前記（２）で述べたとおりである。
　ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣへの分化誘導用培地は、基本培地にアクチビンＡおよびＧＳＫ−３β阻害剤を必須の添加物として含有する。
　ｈＰＳＣからｈｉＭｅＬＣへの分化誘導用培地におけるアクチビンＡの濃度は、例えば、約５ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌ以上、また、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約９０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約５~約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０~約９０ｎｇ／ｍｌ、約１５~約８０ｎｇ／ｍｌ、約２０~約７０ｎｇ／ｍｌ、または約３０~約６０ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、アクチビンＡの濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。
　本明細書において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、ＧＳＫ−３β阻害剤として最初に見出されたＬｉｔｈｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬｉＣｌ）、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６−［２−［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ：ＣＡＳ　Ｎｏ．２５２９１７−０６−９）が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
　本工程で使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。
　培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、特に限定されないが、約０．１μＭ~約５０μＭが好ましく、例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭまたはこれ以上の濃度であるが特にこれらに限定されない。好ましくは、ＧＳＫ−３β阻害において使用される濃度である約１μＭよりも高い濃度が使用され、より好ましくは、約３μＭ以上である。特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は約３μＭである。
　培地には、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４が含有されていないことが好ましい。
　培地には、さらに線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤が含有されていてもよい。ＦＧＦＲ阻害剤とは、ＦＧＦ受容体とＦＧＦとの結合を阻害するまたは、当該結合後に起こるシグナル伝達を阻害する薬剤であれば特に限定されないが、例えば、ＰＤ１７３０７４またはＢＧＪ３９８が挙げられる。
　ＰＤ１７３０７４を用いる場合、培地中における濃度は、特に限定されないが、約１ｎＭ~約５０ｎＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭまたはこれ以上であるがこれらに限定されない。より好ましくは、約２５ｎＭである。
　培地には、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）がさらに含有されていることが好ましい。ＫＳＲは、有効濃度範囲で存在する場合に中胚葉様細胞の誘導効率を顕著に増大させる。ＫＳＲの濃度は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上が例示される。より好ましくは、約１５％である。
　この培養において、ｈＰＳＣを単一細胞へと解離するにあたり、アポトーシスを抑制させる目的で、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤がさらに含有されていることが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｙ−２７６３２が本発明において好適に使用され得る。
　培地中におけるＹ−２７６３２の濃度は、特に限定されないが、１μＭ~５０μＭが好ましく、例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。より好ましくは、約１０μＭである。
　本工程に使用される培養器としては、前記（２）において例示されたものが同様に使用可能であるが、好ましくは、フィブロネクチンでコートされた培養器である。
　この培養において、ｈＰＳＣを上記培養器上に播き、例えば、約１０４~約１０５細胞／ｃｍ２、好ましくは約２~約６×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度とし、１~１０％　ＣＯ２／９９~９０％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約３０~約４０℃、好ましくは約３７℃で、６０時間未満、好ましくは４２時間（例えば、±２時間の誤差は許容である）培養する。
　ｈｉＭｅＬＣへの分化の事実は、例えば、ｉＭｅＬＣ及び／又はＰＳＣのマーカー遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより分析することにより確認できる。ｉＭｅＬＣは、以下の特性のいずれか又は両方を有する細胞として定義される：
（１）分化誘導前のＰＳＣに比して、Ｔ、ＥＯＭＥＳ、ＥＶＸ１、ＳＰ５、ＭＩＸＬ１およびＮＯＤＡＬから選択される少なくとも１つの遺伝子発現の上昇、
（２）分化誘導前のＰＳＣに比して、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２から選択される少なくとも１つの遺伝子発現の低下。
（３−２）ｈｉＭｅＬＣからｈＰＧＣＬＣへの分化誘導
　このようにして得られたｈｉＭｅＬＣをＢＭＰの存在下で培養することにより、ｈＰＧＣＬＣへと分化誘導することができる。
　ｈｉＭｅＬＣからｈＰＧＣＬＣへの分化誘導に用いられる基本培地としては、前記（２）で使用するために例示した基本培地が挙げられるが、これらに限定されない。当該基本培地は、前記（２）で使用するために例示したような自体公知のその他の添加物を含有してもよい。培地は、血清含有培地又は無血清培地（ＳＦＭ）であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清など）の濃度は、０~２０％、好ましくは０~５％、より好ましくは０~２％、最も好ましくは０％（すなわち無血清）であり得る。ＳＦＭは、ＫＳＲなど任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくともよい。詳細は前記（２）で述べたとおりである。
　ｈｉＭｅＬＣからｈＰＧＣＬＣへの分化誘導用培地は、基本培地にＢＭＰを必須の添加物として含有する。用いるＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、またはＢＭＰ７であることが好ましい。より好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４である。ＢＭＰの濃度は、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＢＭＰの濃度は、例えば、約１，０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６００ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約５０~約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００~約８００ｎｇ／ｍｌ、約１５０~約６００ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＢＭＰの濃度は約２００ｎｇ／ｍｌである。
　ｈｉＭｅＬＣからｈＰＧＣＬＣへの分化誘導用培地には、さらにＳＣＦ、ＥＧＦおよびＬＩＦからなる群より選択される少なくとも一つのサイトカインを添加物として含有させることが好ましい。
　ＳＣＦの濃度は、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＳＣＦの濃度は、例えば、約２００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約１２０ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約３０~約２００ｎｇ／ｍｌ、約５０~約１５０ｎｇ／ｍｌ、約８０~約１２０ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＳＣＦの濃度は約１００ｎｇ／ｍｌである。
　ＬＩＦの濃度は、例えば、約３００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは約５００Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは約８００Ｕ／ｍｌ以上である。また、例えば、約２，０００Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは約１，５００Ｕ／ｍｌ以下、より好ましくは１，２００Ｕ／ｍｌ以下である。ＬＩＦの濃度は、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＬＩＦの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約０．１~約１００ｎｇ／ｍｌ、約１~約５０ｎｇ／ｍｌ、約５~約２５ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＬＩＦの濃度は約１０ｎｇ／ｍｌである。
　ＥＧＦの濃度は、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６０ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約１０~約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０~約８０ｎｇ／ｍｌ、約３０~約６０ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＥＧＦの濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。
　本工程において、ｈｉＭｅＬＣを単一細胞へと解離するにあたり、アポトーシスを抑制させる目的で、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤がさらに含有されていることが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上述と同じものが使用される。
　この培養において、自体公知の細胞非接着性又は低接着性培養器にｈｉＭｅＬＣを播種し、例えば、約１~５０×１０３細胞／ｃｍ２、好ましくは約５~２０×１０３細胞／ｍＬの細胞密度とし、１~１０％　ＣＯ２／９９~９０％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約３０~４０℃、好ましくは約３７℃で、４~１０日間、好ましくは５~８日間、より好ましくは約６日間（例えば、１４４±１２時間、好ましくは１４４±６時間）培養する。
　ｈＰＧＣＬＣへの分化の事実は、前記（２）の場合と同様にして確認することができる。本発明の維持増幅方法に供するｈＰＧＣＬＣを単離するために、上記培養により得られた細胞から上述のレポーター蛍光タンパク質や細胞表面抗原が陽性である細胞を、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて選別することが好ましい。
２．ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅
　本工程では、例えば、ｈＰＧＣ又は上記の方法により得られたｈＰＧＣＬＣを、
（ｉ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬、並びに
（ｉｉ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカイン
の存在下で培養する。
　ｈＰＧＣＬＣとしては、ｈｉＭｅＬＣからの分化誘導開始日をｄ０として、ｄ４~ｄ１０、好ましくはｄ５~ｄ８、より好ましくは、約ｄ６の細胞が用いられ得る。
　本工程に使用される培地は、基本培地として、前記１．（２）に関して例示した培地を、同様に使用することができるが、Ｆ−１２培地やそれを含む混合培地以外のものであることが好ましい。例えば、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ等が挙げられ、好ましくはＤＭＥＭである。また、培地のグルコース濃度は、例えば、０．１~５ｇ／Ｌ、好ましくは０．２~４．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５~２ｇ／Ｌ、特に好ましくは約１ｇ／Ｌである。
　培地には、血清及び／又は血清代替物を添加することが好ましい。ここで用いられる血清又は血清代替物の種類及び添加濃度は、前記１．（２）に関して例示されたものが、同様に使用可能である。また、培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。そのような添加物としては、ｈＰＧＣＬＣの維持増幅を支持し得る限り、特に制限されず、前記（２）に関して例示されたものが、同様に使用可能である。例えば、本工程に使用される培地として、１５％　ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、２．５％　胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１％　非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１％　ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（例えばＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ）、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦを含むＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）培地等が挙げられるが、これに限定されない。
　ｍＰＧＣＬＣの維持増幅において、フォルスコリンとＰＤＥ４阻害薬とを併用すると、相乗的にｍＰＧＣＬＣの増殖を約５０倍まで増大させることができる。しかし、ｈＰＧＣＬＣの場合、フォルスコリンとＰＤＥ４阻害薬とを併用すると、増幅効果が相殺されてしまう。従って、本発明の維持増幅方法においては、フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬のいずれかを単独で使用する。好ましくは、フォルスコリンが使用される。
　フォルスコリンの濃度は、例えば、約０．１μＭ以上、好ましくは約０．５μＭ以上、より好ましくは約１μＭ以上である、また、フォルスコリンの濃度は、例えば、約１００μＭ以下、好ましくは約５０μＭ以下、より好ましくは約３０μＭ以下である。好ましい実施態様において、フォルスコリンの濃度は、約０．５~約５０μＭ、好ましくは約１~約３０μＭの範囲内で適宜選択され得る。特に好ましくは、フォルスコリンの濃度は約１０μＭである。本工程で用いることができる活性を有する限り、フォルスコリンには、その誘導体、塩、又は溶媒和物が含まれ得る。
　上記培地に添加されるＰＤＥ４阻害薬としては、ＰＤＥ４の酵素活性、即ち、ｃＡＭＰの加水分解活性を阻害し得る物質であれば特に制限はないが、好ましくはＰＤＥ４の選択的阻害薬（ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）以外の酵素だけでなく、ＰＤＥ４以外のＰＤＥｓも阻害しない）である。例えば、イブジラスト、Ｓ−（＋）−ロリプラム、ロリプラム、ＧＳＫ２５６０６６、シロミラスト等が挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、ロリプラムである。
　ＰＤＥ４阻害薬の濃度は、例えば、約０．１μＭ以上、好ましくは約０．５μＭ以上、より好ましくは約１μＭ以上である。また、ＰＤＥ４阻害薬の濃度は、例えば、約１００μＭ以下、好ましくは約５０μＭ以下、より好ましくは約３０μＭ以下である。好ましい実施態様において、ＰＤＥ４阻害薬の濃度は、約０．５~約５０μＭ、好ましくは約１~約３０μＭの範囲内で適宜選択され得る。ロリプラムを用いる場合、特に好ましくは、ロリプラムの濃度は約１０μＭである。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＰＤＥ４阻害薬には、その誘導体、塩、又は溶媒和物が含まれ得る。
　本発明のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅用培地には、さらに、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦから選択される１以上のサイトカインが含有される。好ましくは、ＬＩＦ及びＥＧＦの組み合わせ、ｂＦＧＦ単独、あるいはＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせである。前記（ｉ）の薬剤がロリプラムである場合は、サイトカインとしては、ｂＦＧＦ単独であることが好ましい。
　ＬＩＦの濃度は、例えば、約３００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは約５００Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは約８００Ｕ／ｍｌ以上である。また、ＬＩＦの濃度は、例えば、約２，０００Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは約１，５００Ｕ／ｍｌ以下、より好ましくは１，２００Ｕ／ｍｌ以下である。ＬＩＦの濃度は、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＬＩＦの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約０．１~約１００ｎｇ／ｍｌ、約１~約５０ｎｇ／ｍｌ、約５~約２５ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＬＩＦの濃度は約１０ｎｇ／ｍｌである。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＬＩＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　ＥＧＦの濃度は、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約６０ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約１０~約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０~約８０ｎｇ／ｍｌ、約３０~約６０ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ＥＧＦの濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＥＧＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　ｂＦＧＦの濃度は、例えば、約５ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ｂＦＧＦの濃度は、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌ以下である。例えば、約５~約５０ｎｇ／ｍｌ、約１０~約３０ｎｇ／ｍｌ、約１５~約２５ｎｇ／ｍｌである。特に好ましくは、ｂＦＧＦの濃度は約２０ｎｇ／ｍｌである。本工程で用いることができる活性を有する限り、ｂＦＧＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅用培地には、ＳＣＦがさらに含有されていることが好ましい。ＳＣＦの濃度は、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約８０ｎｇ／ｍｌ以上である。また、ＳＣＦの濃度は、例えば、約２００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約１２０ｎｇ／ｍｌ以下である。好ましい実施態様において、ＳＣＦの濃度は、約５０~約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約８０~約１２０ｎｇ／ｍｌの範囲内で適宜選択され得る。特に好ましくは、ＳＣＦの濃度は約１００ｎｇ／ｍｌである。本工程で用いることができる活性を有する限り、ＳＣＦには、その変異体、断片、又は修飾体が含まれ得る。
　尚、ｍＰＧＣＬＣの維持増幅においては、フォルスコリンとＰＤＥ４阻害薬に加えて、さらにシクロスポリンＡを添加すると、さらに増幅効率が向上するが、本発明の維持増幅方法においては、シクロスポリンＡはｈＰＧＣＬＣの維持増幅をむしろ阻害するので、使用しないことが望ましい。
　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅方法において、ｈＰＧＣ／ｈＰＧＣＬＣは、フィーダー細胞の存在下又は非在下にて培養されてよい。フィーダー細胞の種類は特に限定されないが、自体公知のフィーダー細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株ＳＴＯなど）が挙げられ得る。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンＣなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。フィーダー細胞がＰＤＥ４阻害薬及び／又はフォルスコリンに対して脆弱である場合には、予めこれらの添加物の存在下で数世代フィーダー細胞を継代培養して、該添加物に馴化させておくことが望ましい。
　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅のために使用される培養器は特に限定されず、例えば前記１．（２）において例示されたものが、同様に使用可能である。
　この培養において、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを（フィーダー細胞が予め播種された）培養器上に播き、例えば、約１０４~１０５細胞／ｃｍ２、好ましくは約２~８×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度とし、１~１０％　ＣＯ２／９９~９０％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約３０~４０℃、好ましくは約３７℃で、３~１４日間、好ましくは４~１２日間、より好ましくは５~１０日間培養する。ｈＰＧＣＬＣは、培養の結果、コロニーが形成され、ＢＬＩＭＰ１及びＴＦＡＰ２Ｃを強発現し続け、早期ｈＰＧＣの特性を維持する。
　上記の期間培養した後、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣマーカー陽性を指標にしてｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを選別・純化し、同じ組成の培地に継代して、培養を続けることができる。例えば、ＢＬＩＭＰ１−及び／又はＴＦＡＰ２Ｃ−プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有するｈＰＧＣＬＣを用いた場合には、ＢＬＩＭＰ１及び／又はＴＦＡＰ２Ｃ陽性を指標として、例えばＦＡＣＳによりｈＰＧＣＬＣを選別することができる。ｈｉＭｅＬＣから５~８日間、好ましくは約６日間分化誘導されたｈＰＧＣＬＣを出発材料とする場合、長期間継代培養しても、ＢＬＩＭＰ１又はＴＦＡＰ２Ｃのいずれかが陰性の細胞は実質的に出現しないので、ＢＬＩＭＰ１又はＴＦＡＰ２Ｃのいずれを選別マーカーとしてもよいが、ｈｉＭｅＬＣから４日間以下しか分化誘導を行わなかったｈＰＧＣＬＣの場合、継代途中でＢＬＩＭＰ１陽性／ＴＦＡＰ２Ｃ陰性の細胞が少数ではあるが出現する場合があるので、ＴＦＡＰ２Ｃ陽性又はＢＬＩＭＰ１との二重陽性を指標とすることが望ましい。あるいは、ｈＰＧＣ又はトランスジェニックレポーターを有しないｈＰＧＣＬＣを用いる場合、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣに特異的に発現する１種以上の細胞表面抗原を用いて、ＦＡＣＳ解析などにより増幅したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを選別・純化することが好ましい。細胞表面抗原として、例えば、ＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６（ＣＤ４９ｆ）、ＩＮＴＥＧＲｌＮβ３（ＣＤ６１）、ＫｌＴ（ＣＤ１１７）、ＥｐＣＡＭ、ＰＯＤＯＰＬＡＮＩＮおよびＴＲＡ１−８１から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が例示され、好ましくはＩＮＴＥＧＲＩＮα６及びＥｐＣＡＭの組み合わせである。
　本発明の維持増幅培養によれば、表面抗原マーカーを指標とした選別でも少なくとも３０日間、ＢＬＩＭＰ１及びＴＦＡＰ２Ｃのレポーター発現を指標とした選別では、少なくとも１２０日間にわたり培養が可能であり、１２０日間の培養でｈＰＧＣＬＣを約１００万倍にまで増幅することができる。Ｇｅｌｌら（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０２０．０１．００９）は、本発明者らが開発したｍＰＧＣＬＣの維持増幅の方法論を用いて、ｈＰＧＣＬＣをインビトロで培養可能であることを示したが、その増幅効率は１０日間で２倍程度であったことを考慮すると、本発明の維持増幅方法による増幅効率の高さは驚くべきことである。
　後述するように、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬は、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化を抑制することができる。したがって、本発明の維持増幅培養において、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をさらに含む条件下で培養することにより、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化が抑制され、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を向上させることができる。具体的には、上記した本発明の維持増幅培養用の培地中に、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を添加すればよい。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬としては、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化を抑制し得る限り、特に制限はなく、例えば、β−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質が挙げられる。より具体的には、アキシンを安定化させる物質が挙げられる。さらに詳細には、タンキラーゼを阻害する物質（例、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ２、ＪＷ５５、ＪＷ７４、Ｇ００７−ＬＫ、ＮＶＰ−ＴＮＫＳ６５６、ＷＩＫＩ４）が挙げられる。別の例として、Ｗｎｔの分泌を阻害する物質（例、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＩＷＰ２）等が挙げられる。好ましくは、β−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質であり、より好ましくはアキシンを安定化させる物質であり、さらに好ましくはタンキラーゼを阻害する物質である。特に好ましくは、ＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９であり得る。これらのＷｎｔシグナル伝達阻害薬は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、約０．１μＭ以上、好ましくは約０．５μＭ以上、より好ましくは約１μＭ以上である、また、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、例えば、約１００μＭ以下、好ましくは約５０μＭ以下、より好ましくは約３０μＭ以下である。好ましい実施態様において、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、約０．５~約５０μＭ、好ましくは約１~約３０μＭの範囲内で適宜選択され得る。例えば、約０．５μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭである。本工程で用いることができる活性を有する限り、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬には、その誘導体、塩、又は溶媒和物が含まれ得る。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬は、本発明の維持増幅培養の全期間を通じて添加されてもよいし、維持培養期間中の任意の期間（連続的であっても、断続的であってもよい）に添加されてもよい。添加期間の下限も特に制限されず、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、１０日以上、１５日以上、２０日以上などが挙げられる。
　本発明の維持増幅方法により得られる増幅されたｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ集団のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣは、自体公知の方法により凍結保存することが可能である。凍結保存したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣは自体公知の方法により解凍した後、再度培養に供することができる。解凍したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、本発明の維持増幅方法によりさらに培養してもよい。
　本発明の維持増幅方法により得られる増幅ｈＰＧＣＬＣは、初期のｈＰＧＣの性質を保ちながら増殖していることが遺伝子発現状態の解析から確認された。またゲノムＤＮＡメチル化状態の解析から、ｈＰＧＣＬＣは培養期間中のＤＮＡメチル化状態を概ね維持していることが判明した。これは、増殖に伴うゲノムワイドなＤＮＡの脱メチル化が認められた、ｍＰＧＣＬＣの維持増幅培養系とは対照的であり、ヒトにおいてはマウスと異なるメカニズムでエピゲノム情報の再編成が進行する可能性が示唆される。
　さらに増幅したｈＰＧＣＬＣの機能を検証するために、卵巣内環境を模倣した異種再構成卵巣（ｘｒ卵巣）培養を行ったところ、ｈＰＧＣＬＣ由来細胞はＤＤＸ４（ＶＡＳＡホモログ）やＤＡＺＬ等の遺伝子を発現し、形態的にも卵原細胞の特徴を有する卵原細胞様／原生殖細胞様の細胞へ分化することから、生殖細胞としての性質が本増幅培養系において維持されることが確認された。
　従って、本発明はまた、上述した方法でｈＰＧＣ及び／又はｈＰＧＣＬＣを維持増幅する工程を含む、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを含む細胞集団を製造する方法を提供する。この方法で得られる細胞集団は、単一の細胞種からなっていてもよく、複数の細胞種を含んでいてもよい。例えば、当該細胞集団は、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上含む。当該細胞集団から、上述のｈＰＧＣマーカーの発現を指標としてＦＡＣＳ等の手法を用いて、増幅されたｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ集団をさらに純化することができる。
［ＩＩ］本発明の維持増幅用試薬キット
　上述のとおり、本発明のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養方法は、ｈＰＧＣ又はｈＰＳＣ由来のｈＰＧＣＬＣを、
（ｉ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬、並びに
（ｉｉ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカイン
の存在下で培養する。
　従って、本発明はまた、（ａ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬と、（ｂ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインとを構成として含んでなる、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅用試薬キットを提供する。好ましくは、本発明の試薬キットは、前記（ａ）の薬剤として、フォルスコリンを含み、また、前記（ｂ）のサイトカインとしては、好ましくは、ＬＩＦ及びＥＧＦの組み合わせ、ＦＧＦ単独、又はｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦの組み合わせが挙げられる。本発明の試薬キットは、さらにＷｎｔシグナル伝達阻害薬を構成として含んでもよい。Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬としては、本発明の維持増幅方法において上記したうちのいずれか１種以上を挙げることができる。これらの成分は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。また、これらの成分はそれぞれ単独の試薬としてキット化されていてもよいし、互いに悪影響を与えない限り、２種以上を混合して１つの試薬として提供することもできる。
　本発明の試薬キットは、本発明の維持増幅方法において増幅されたｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの選別（好ましくはＦＡＣＳ）を行うための試薬として、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの表面抗原マーカーに対する抗体、好ましくはＩＮＴＥＧＲＩＮα６に対する抗体、及び／又はＥｐＣＡＭに対する抗体を、さらに構成として含んでもよい。
　また、本発明の試薬キットは、本発明の維持増幅方法に好適に使用することができる培地を含むことができる。そのような好適な培地の例としては、グルコース濃度１ｇ／Ｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を挙げることができる。
［ＩＩＩ］本発明の増幅ｈＰＧＣＬＣ
　本発明の維持増幅法により増幅されたｈＰＧＣＬＣは、ｍＰＧＣＬＣの維持増幅培養の方法論をそのまま適用した培養系と比較して、早期ｈＰＧＣに相似した特性を保持しつつ、きわめて長期間にわたって維持増幅が可能であり、かつ継代培養により長期維持された増幅ｈＰＧＣＬＣは、ｈｉＭｅＬＣから分化誘導した直後のｈＰＧＣＬＣと比較して、顕著に異なるトランスクリプトームプロファイルを示し、マウス等の異種卵巣体細胞との凝集培養（ｘｒ卵巣）において、分化誘導直後（ｄ６）のｈＰＧＣＬＣよりも優れた生存率・増殖率を示す。従って、本発明の維持増幅方法により得られる増幅ｈＰＧＣＬＣは、従来公知のｈＰＧＣＬＣとは、物として異質の細胞であると言える。
　従って、本発明はまた、本発明の維持増幅法により得られる、増幅されたｈＰＧＣＬＣを提供する。そのような増幅ｈＰＧＣＬＣは、その構造又は特性により直接特定することが不可能であるか、又はおよそ実際的でないので、後述の請求の範囲では、その製造方法により増幅ｈＰＧＣＬＣを特定する。当該ｈＰＧＣＬＣは、上記の維持増幅用培地に懸濁した状態で提供されてもよいし、好ましい別の実施態様においては、自体公知の方法により凍結保存した状態で提供することもできる。
［ＩＶ］ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣからの卵原細胞／原生殖細胞様細胞の製造方法
　本発明の維持増幅方法により得られる増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣは、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ　３６２：３５６−３６０（２０１８）や後述の実施例に記載されるように、哺乳動物、例えば非ヒト哺乳動物（例、マウス）の卵巣由来の体細胞と凝集させ、再構成卵巣（ｒ卵巣）、例えば異種再構成卵巣（ｘｒ卵巣）を形成させて培養することにより、インビトロでＤＤＸ４（ＶＡＳＡホモログ）やＤＡＺＬ等の遺伝子を発現し、形態的にも卵原細胞の特徴を有する卵原細胞様／原生殖細胞様の細胞へ分化させることができる。ここで用いられる増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣは、上述したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを含む細胞集団を製造する方法により得られた細胞集団から純化されたｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣであってもよい。
［Ｖ］ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養系の評価方法
　本発明はまた、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養系の評価方法を提供する。当該方法は以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣをフィーダー細胞上、所定の条件下で培養する工程、
（２）（１）で得られた細胞集団から生細胞を選別する工程、
（３）（２）で得られた生細胞をｈＰＧＣマーカ一陽性細胞とそれ以外の細胞とに選別する工程、
（４）（３）で得られたｈＰＧＣマーカ一陽性細胞以外の細胞をフローサイトメトリーに供し、ＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットによりｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化した細胞とフィーダー細胞とを識別する工程、及び
（５）（３）で得られるｈＰＧＣマーカ一陽性細胞数と（４）で得られる脱分化した細胞数とに基づいて、前記所定の条件におけるｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を評価する工程
　通常、フィーダー細胞を用いた維持増幅培養系では、増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣとｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化したヒト細胞の細胞数を測定するために、評価すべき培養系にて培養したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ集団から、まず死細胞を除去して生細胞を選別し、さらにフィーダー細胞を除去して、増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣと脱分化したヒト細胞を含む細胞集団を選別した後、ｈＰＧＣマーカーの有無を指標として、増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣと脱分化したヒト細胞とを選別する。しかし、本発明の評価方法を用いることで、適切なフィーダー細胞を選択することにより、増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣと脱分化したヒト細胞を含む細胞集団とフィーダー細胞とを選別することなく、生細胞集団をｈＰＧＣマーカー陽性細胞（増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ）と該マーカー陰性細胞（脱分化したヒト細胞とフィーダー細胞を含む細胞集団）とに選別し、ｈＰＧＣマーカー陰性細胞をＦＡＣＳ解析して、ＦＳＣ／ＳＳＣ二次元プロットに付すことにより、その分布パターンから脱分化したヒト細胞とフィーダー細胞とを識別することができ（即ち、両者が相互排他的なＦＳＣ／ＳＳＣパターンを示し）、脱分化したヒト細胞の細胞数を測定することができる。
　本発明の評価方法に用いられるフィーダー細胞は、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅を支持することができ、かつｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化したヒト細胞との共存下でＦＡＣＳ解析に供された場合に、ＦＳＣ／ＳＳＣ二次元プロットにより、脱分化したヒト細胞と明確に識別可能な分布を示す限り、動物の由来や細胞種に特に制限はないが、例えば、マウス細胞としては、ｍ２２０−５細胞を挙げることができる。
　工程（１）における「所定の条件」とは、本発明の評価方法により評価される培養系を特定するための各種条件、例えば、基本培地組成、培地添加物の種類と濃度、培養器の種類、培養温度、ＣＯ２濃度、培養形式、培養期間等の組み合わせをいい、評価される培養系ごとにそれぞれ異なる。当該「所定の条件」の具体例としては、既存のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅を支持し得る培養条件（例えば、国際公開２０１９／１０７５７６号に記載された各種条件の任意の組み合わせ）、あるいは本発明の維持増幅法の上記した各種条件の任意の組み合わせ、さらには、それらの培養条件から１以上の条件を変更させた条件（例えば、培地添加物の追加や削除、別の培地添加物との置換など）を挙げることができるが、それらに限定されない。
　工程（２）における生細胞の選別は、例えば、工程（１）で得られた細胞集団を自体公知の死細胞マーカー（例えば、ＤＲＡＱ−７、ＤＲＡＱ−５、ＴＯ−ＰＲＯ−３等）や生細胞マーカーを用いてＦＡＣＳ等により行うことができる。
　工程（３）では、工程（２）で得られた生細胞集団を、ｈＰＧＣマーカーを用いてＦＡＣＳ等により該マーカー陽性細胞と陰性細胞とを選別し、前者を増幅したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣとしてその細胞数を算出する。ｈＰＧＣマーカーとしては、ＢＬＩＭＰ１及び／又はＴＦＡＰ２Ｃ、あるいはＥＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６（ＣＤ４９ｆ）、ＩＮＴＥＧＲｌＮβ３（ＣＤ６１）、ＫｌＴ（ＣＤ１１７）、ＥｐＣＡＭ、ＰＯＤＯＰＬＡＮＩＮおよびＴＲＡ１−８１から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー、好ましくはＩＮＴＥＧＲＩＮα６及びＥｐＣＡＭの組み合わせ等を挙げることができる。より好ましくは、ＢＬＩＭＰ１及びＴＦＡＰ２Ｃ二重陽性細胞をｈＰＧＣマーカー陽性細胞、即ちｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣとして選別する。
　工程（４）では、工程（３）で得られたｈＰＧＣマーカー陰性細胞、即ちｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ以外の細胞集団をＦＡＣＳ解析に供し、ＦＳＣ／ＳＳＣ二次元プロットを作成する。該二次元プロット上で、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化したヒト細胞とフィーダー細胞とは相互排他的なＦＳＣ／ＳＳＣパターンを示すので、両者を容易に識別することができ、該脱分化したヒト細胞の細胞数を測定することができる。
　工程（５）では、工程（３）で得られたｈＰＧＣマーカ一陽性細胞（増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ）数と（４）で得られるｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化した細胞数とを比較することにより、前記所定の条件におけるｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を評価する。増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの細胞数が大きいほど、また、脱分化した細胞数が小さいほど、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率は高いといえる。
　好ましい一実施態様においては、工程（５）における評価を、下式：
　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ＝ｌｏｇ２（ｈＰＧＣマーカ一陽性細胞数／脱分化した細胞数）
で表されるｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅに基づいて行うことができる。ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅが正の値をとれば、増幅ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの細胞数が優位であることを示す。
　本発明の評価方法を用いて、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬をスクリーニングすることができる。したがって、本発明はまた、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬のスクリーニング方法を提供する。
　当該方法では、脱分化抑制薬の候補物質の存在下又は非存在下で、上記本発明の評価方法の工程（１）と同様に、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣをフィーダー細胞上、所定の条件下で培養する。ここで「所定の条件」とは上記と同義である。さらに、候補物質の存在下又は非存在下でそれぞれ培養したｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣ集団を、上記本発明の評価方法の工程（２）~（５）と同様の工程に付し、それぞれについてｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を算出する。そして、候補物質の非存在下での維持効率と比較して、候補物質の存在下での維持効率が高かった場合に、該候補物質をｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬として選択することができる。
　後述の実施例に示されるとおり、本発明者らは、このスクリーニング方法を用いて、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化抑制薬として見出し、当該スクリーニング系の有効性を実証した。
［ＶＩ］Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を用いたＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅方法等
　上記のとおり、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬は、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化を抑制することができる。したがって、本発明はまた、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣをＷｎｔシグナル伝達阻害薬の存在下で培養することを含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅方法を提供する。
　当該方法は、ヒトだけでなく他の哺乳動物（例、マウス等）由来のＰＧＣ又はＰＧＣＬＣにも用いることができる。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を用いたＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅方法において、培養は、例えば、自体公知のＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅を支持し得る条件下で行われる。例えば、国際公開２０１９／１０７５７６号には、マウスを実施例として、フォルスコリン及び／又はＰＤＥ４阻害薬の存在下にＰＧＣ又はＰＧＣＬＣを培養することにより、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣを維持増幅できることが記載されている。また、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの場合には、後述の実施例に示されるとおり、フォルスコリンとＰＤＥ４阻害薬を併用してもよいが、いずれかを単独で使用するとさらに維持増幅効率がよい。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を用いたＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅においても、培養はフォルスコリン及び／又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む条件下で行われることが好ましい。
　ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣがヒト細胞の場合、培養は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬に加えて、
（ｉ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインをさらに含む条件下で行われることがより好ましく、（ｉ）と（ｉｉ）を併用することがさらに好ましい。この場合の各種添加物の濃度や、基礎培地の組成、培養温度や培養期間などは、上記の本発明の維持増幅方法を参照して適宜選択することができる。
　一方、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣがマウス等の非ヒト動物細胞の場合、培養は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬に加えて、
（ｉ）フォルスコリン及びＰＤＥ４阻害薬をさらに含む、及び／又は
（ｉｉ）シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）をさらに含む
条件下で行われることがより好ましく、（ｉ）と（ｉｉ）を併用することがさらに好ましい。この場合の各種添加物の濃度や、基礎培地の組成、培養温度や培養期間などは、例えば、国際公開２０１９／１０７５７６号を参照して適宜選択することができる。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬としては、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの脱分化を抑制し得る限り、特に制限はなく、例えば、β−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質（例、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ２、ＪＷ５５、ＪＷ７４、Ｇ００７−ＬＫ、ＮＶＰ−ＴＮＫＳ６５６、ＷＩＫＩ４）、Ｗｎｔの分泌を阻害する物質（例、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＩＷＰ２）等が挙げられる。好ましくは、β−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質であり、より好ましくはＩＷＲ１又はＸＡＶ９３９であり得る。これらのＷｎｔシグナル伝達阻害薬は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、約０．１μＭ以上、好ましくは約０．５μＭ以上、より好ましくは約１μＭ以上である、また、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、例えば、約１００μＭ以下、好ましくは約５０μＭ以下、より好ましくは約３０μＭ以下である。好ましい実施態様において、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の濃度は、約０．５~約５０μＭ、好ましくは約１~約３０μＭの範囲内で適宜選択され得る。例えば、約０．５μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭである。
　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬は、維持増幅培養の全期間を通じて添加されてもよいし、維持培養期間中の任意の期間（連続的であっても、断続的であってもよい）に添加されてもよい。添加期間の下限も特に制限されず、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、１０日以上、１５日以上、２０日以上などが挙げられる。
　上記ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持増幅方法は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の作用により、該維持増幅培養におけるＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化を抑制ことにより、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの維持効率を向上させんとするものである。したがって、別の側面において、本発明は、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣをの維持増幅培養において、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬の存在下で該細胞を倍養することを含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化を抑制する方法を提供する。
　本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬を含む、ＰＧＣ又はＰＧＣＬＣの脱分化抑制剤を提供する。Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬としては、上記と同様のものが使用され得る。Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。
　Ｗｎｔシグナル伝達限害薬は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）をＰＧＣＬＣに分化誘導する過程において、ＰＧＣＬＣへの分化に向かわない細胞の出現を抑制することもできる。したがって、本発明はまた、ＰＳＣをＷｎｔシグナル伝達限害薬の存在下でＰＧＣＬＣへ分化誘導することを含む、ＰＧＣＬＣの製造方法を提供する。
　ＰＳＣをＰＧＣＬＣへ分化誘導する方法としては、例えば、上記したＰＳＣからＰＧＣＬＣへの直接分化誘導法や、初期中胚葉様細胞（ｉＭｅＬＣ）を経由した分化誘導法を用いることができる。ここで、Ｗｎｔシグナル伝達限害薬は、分化誘導培養の全期間を通じて添加されてもよいし、維持培養期間中の任意の期間（連続的であっても、断続的であってもよい）に添加されてもよい。
　本明細書中で用いられる場合、別の指示がなければ、用語「約」は、数値または範囲を指す場合に、その値または範囲におけるある程度の変動性を許容する。例えば、言及された値または言及された範囲限界値の±１０％または±５％までを意味し得る。以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１
＜材料＞
　実施例１で使用した試薬及びその他のリソースに関する情報を表１−１~１−４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、実施例１で使用した基礎培地及び試験した培地組成を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜実験方法＞
動物及びｈｉＰＳＣ
　すべての動物実験は、京都大学の倫理ガイドラインの下で実施した（Ａｐｐｒｏｖａｌ　ｎｏ．ＭｅｄＫｙｏ１９００１）。ｈｉＰＳＣを用いたすべての実験は、京都大学の学内評議委員会の承認を得て、文部科学省のガイドラインに従って実施した。
ｈｉＰＳＣの培養
　本実施例において使用された細胞は加湿された５％ＣＯ２のインキュベーターの中で３７℃で維持された。ｈｉＰＳＣ株５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ（４６ＸＹ）（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１５　Ａｕｇ　６；１７（２）：１７８−９４）と１３８３Ｄ６（４６ＸＹ）（Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．２０１７　Ｊｕｎ　１；９６（６）：１１５４−１１６６）を、ラミニン−５１１　Ｅ８断片（ｉＭＡＴＲＩＸ−５１１；ニッピ，８９２０１４）でコートされたプレート上の、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３又はＡＫ０３Ｎ（味の素）の中で培養した。継代のために、ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ，１２５６３−０１１）と、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ナカライテスク、０６８９４−１４）を含んでいるＰＢＳ（−）の、１：１の混合液を使用した処理により、細胞を単一細胞へ解離させた。プレーティングの際に１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２；和光、２５３−００５１３又はＴＯＣＲＩＳ１２５４）を添加し、次の日に培地をＴ２７６３２を含まない新鮮なものと交換した。ｈｉＰＳＣコロニーの画像を、ＤＳ−ｉ２カメラ（ニコン）を装備したＣＫＸ４１倒立顕微鏡（オリンパス）で撮影した。
ｈＰＧＣＬＣの誘導
　以前報告されたように、ｈｉＰＳＣからｉＭｅＬｃＣを介してｈＰＧＣＬＣを誘導した（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ，２０１５（上述），Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣ（１．０~２．０×１０５細胞／ウェル）からＭｅＬｃＣを、フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＦＣ０１０）でコーティングした１２ウェルプレートのウェル上の、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（ＴＯＣＲＩＳ，４４２３）、５０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＰｒｏｐｒｏＴｅｃｈ，ＡＦ−１２０−１４）及び１０μＭ　Ｙ−２７６３２を添加したＧＫ培地［１５％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（ＧＩＢＣＯ，１０８２８−０２８）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ＧＩＢＣＯ，１１１４０−０５０）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ，１１３６０−０７０）、及び０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，１１７１０−０３５）］の中で誘導した（誘導時間は、５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣについては４４~４８時間であり、１６８３Ｄ６　ｈｉＰＳＣについては６０時間であった）。ｈＰＧＣＬＣはｉＭｅＬＣから、ｖ底９６ウェルプレート（ＮＯＦ，５１０１１６１２又はＧｒｅｉｎｅｒ，６５１９７０）上の、２００ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ，３１４−ＢＰ）、１００ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ，２５５−ＳＣ）、１０ｎｇ／ｍＬ　ＬＩＦ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＬＩＦ１０１０）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ，２３６−ＥＧ又はＰｒｏｐｒｏＴｅｃｈ　ＡＦ−１００−１５）及び１０μＭ　Ｙ−２７６３２を添加したＧＫ１５培地の中で誘導した。ｈＰＧＣＬＣを４~６日間誘導した後に、ＦＡＣＳソーティングによりｈＰＧＣＬＣを単離した［蛍光活性化細胞のソーティングの項を参照のこと］。ＤＳ−Ｆｉ２カメラ（ニコン）を装備したＣＫＸ４１倒立顕微鏡（オリンパス）により、ｉＰＳＣとｉＭｅＬＣの画像を撮影した。ｈＰＧＣＬＣ誘導条件下でのｉＭｅＬＣ凝集体の画像を、ＤＰ７２カメラ（オリンパス）を装備したＭ２０５Ｃ顕微鏡により撮影した。
ｘｒ卵巣培養
　以前報告されたようにｘｒ卵巣を作製し培養した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８　Ｏｃｔ　１９；３６２（６４１２）：３５６−３６０）。簡単に言うと、５．０×１０３のｄ６　ｈＰＧＣＬＣ又はｄ６ｃ３０　ｈＰＧＣＬＣを、Ｅ１２．５において、７．５×１０４のＩＣＲ株のマウス胚性卵巣体細胞（島津ラボラトリーサプライ）と凝集させた。Ｕ底９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｎｕｎｃ，１７４９２５）中で１０μＭのＹ−２７６３２を含んでいるＧＫ細胞の中で２日間浮遊培養して凝集体を形成させた後に、その凝集体を移してｘｒ卵巣培養培地［１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１５０μＭ　Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ａ４４０３）及び５５μＭ　２−メルカプトエタノールを含むαＭＥＭ］の中で、液ガス界面条件下でＴｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬメンブランインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４９６）上で培養した。ｘｒ卵巣培養培地を３日後毎に新しいものと交換した。マウス胚性卵巣体細胞の単離を既に述べたように行った（Ｈａｙａｓｈｉ　＆　Ｓａｉｔｏｕ，Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３　Ａｕｇ；８（８）：１５１３−２４，Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））。磁気活性化ソーティングのために、解離した体細胞を抗ＳＳＥＡ−１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０９４−５３０）及び抗ＣＤ３１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０９７−４１８）と氷上で２０~４０分間インキュベートした。Ｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞数の統計学的解析のため、Ｒソフトウェア　バージョン３．６．１中の“ｖａｒ．ｅｑｕａｌ＝Ｆ”オプションを用いたｔ−検定関数により、Ｗｅｌｃｈのｔ−検定を行った。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
　以前報告されたように（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ，２０１５（上述），Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））、ｉＭｅＬＳの細胞凝集体から、ｈＰＧＣＬＣを単離した。典型的には、凝集体をＰＢＳ（−）で１回洗浄し、０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ，１５４００−０５４）とＰＢＳ（−）の１：１の混合液で１５分間インキュベートした。ピペッティングにより凝集体を分散させ、ＳＴＯＰ培地［１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ４４０３）、１０μＭ　Ｙ−２７６３２、及び０．１ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，１０３１３−０２１）］によりトリプシン処理を中和した。ペレッティングの後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＬＣＯＮセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５２２３５）によりろ過をした。
　細胞マーカーを有するｈＰＧＣＬＣ（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述），Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））を単離するために、解離されたｉＭｅＬＣ凝集体を、ＢＶ４２１結合抗ＣＤ４９ｆ（ＩＮＴＥＧＲＩＮα６）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３１３６２４）及びＡＰＣ結合ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３２４２０８）と、ＦＡＣＳ緩衝液中で暗い中で１５分間氷上でインキュベートし、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。ペレッティングを行った後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＬＣＯＮセルストレーナーによりろ過をした。
　ＢＴ＋ＡＧ＋又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ　ｏｒ　ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によりソーティングした。増幅培養のために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中にソーティングした。下記の解析（ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ及び全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ））のための細胞を採取するために、細胞をｃｅｌｌｏｔｉｏｎ（ＺＥＮＯＡＱ，ＣＢ０５１）中にソーティングした。ｘｒ卵巣培養のために、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２を添加したＧＫ１５培地中にソーティングした。
　増幅したｈＰＧＣＬＣの継代のために、細胞をＰＢＳ（−）で１回洗浄し、０．５％トリプシン−ＥＤＴＡとＰＢＳ（−）の１：４の混合液中で３７℃で５分間処理した。激しいピペッティングの後に、トリプシン処理をＳＴＯＰ培地又は１０％ＦＢＳ、１０μＭ　Ｙ−２７６３２及び０．１ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅを含んでいるＰＢＳ（−）で中和した。その後細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ＦＡＬＣＯＮセルストレーナーを備えた細胞間クランプを除いた後に、細胞をＦＡＣＳソーティングにかけた。ＣＤ４９ｆとＣＤ３２６の発現を基にして増幅したｈＰＧＣＬＣを継代するために、既に述べたようにして、解離した細胞に免疫ラベルを付した。ＢＴ＋ＡＧ＋又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ　ｏｒ　ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩで単離した。継代のために、Ｔ＋ＡＧ＋又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ　ｏｒ　ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞をＦＡＣＳ緩衝液中にソーティングした。
　維持増幅培養中のｈＰＧＣＬＣ由来細胞におけるＴＲＡ−１−８５の発現を解析するために、ＦＡＣＳバッファー中に懸濁した細胞を、氷上で抗ＴＲＡ−１−８５抗体（ＢＤ　Ｈｏｒｉｚｏｎ，５６３３０２）と暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。細胞をペレット化した後、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＬＣＯＮセルストレイナーに通した。該細胞懸濁液に３ｍＭ　ＤＲＡＱ７（ａｂｃａｍ，ａｂ１０９２０２）を加えて、室温で１０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ解析に供した。
ｈＰＧＣＬＣ増幅培養
　ｍ２２０−５細胞株（Ｄｏｌｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９１　Ａｕｇ　２９；３５２（６３３８）：８０９−１１；Ｍａｊｕｍｄａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．１９９４　Ｊａｎ　１４；２６９（２）：１２３７−４２；Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．２０１７　Ｊｕｌ　３；３６（１３）：１８８８−１９０７；Ｍｉｙａｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０１８；１４４：４０９−４２９）を、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ　１０４３７−０２８又はＳＩＧＭＡ　Ｆ７５２４）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，１５１４０−１２２）、及び２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ，２５０３０−０８１）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，１０３１０−０２１）中で維持した。ｈＰＧＣＬＣ増幅培養のために、フィーダー細胞として、マイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ，ＳＩＧＭＡ　Ｍ０５０３又はＫＹＯＷＡ　ＫＩＲＩＮ　ＭＩＴＯＭＹＣＩＮ注用：２又は４μｇ／ｍｌ，２時間）処理されたｍ２２０−５細胞を使用した。ＭＭＣ処理の前に、増幅と添加化学物質への適応のために、ｍ２２０−５細胞を１０μＭフォルスコリン（シグマ、Ｆ３９１７）と１０μＭロリプラム（ａｂｃａｍ，ａｂ１２００２９）で継代した。
　サイトカイン及び／又は化学物質がｈＰＧＣＬＣ増殖に及ぼす影響を検討するために、２．５％ＦＢＳと１００ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦを含み、サイトカイン及び／又は化学物質［１０ｎｇ／ｍＬ　ＬＩＦ；５０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ；１０μＭフォルスコリン；１０μＭロリプラム；５μＭシクロスポリンＡ（ＳＩＧＭＡ，３００２４）］が添加されたＧＫ１５中、ｈＰＧＣＬＣをＭＭＣで処理し、１０日間ごとに継代した［蛍光活性化細胞のソーティングの項を参照のこと］。継代の日に２４ウェルプレート中に約５．０×１０３細胞をプレーティングし（Ｙ２７６３２の１０μＭを含んでいる０．５ｍＬの培地）、次の日にＹ２７６３２を含まない０．５ｍＬの培地を０．５ｍＬ添加した。３日目に、全培地を交換した（１ｍＬ／ウェル）。継代後の５日目、７日目、及び９日目に培地の半分を新しいものに交換した。基礎培地とグルコース濃度の効果を評価するためにｈＰＧＣＬＣを、ＭＭＣで処理されたｍ２２０−５細胞上で、２．５％ＦＢＳ、１０μＭフォルスコリン、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ及び２０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦが添加された種々の培地中で培養し、１０日毎に継代した［蛍光活性化細胞のソーティングの項を参照のこと］。使用した培地は表２に示すとおりである。継代の日に２４ウェルプレート上に４．５~５．０×１０３細胞をプレーティングし（１０μＭ　Ｙ２７６３２を含む培地０．５ｍＬ）、Ｙ２７６３２を含まない培地を次の日に添加した。培地交換を上述のとおり行った。
　規定されたｈＰＧＣＬＣ増幅培養培地には下記が含まれていた：１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、２ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ，３５０５０−０６１）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、及び０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ，２１９８５−０２３）を含み、１０μＭフォルスコリン、１００ｎｇｍＬ　ＳＣＦ、及び２０ｍｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ。継代と培地交換操作は上記の通りである。
　ｈｉＰＳＣ培養、ｈＰＧＣＬＣ誘導、ｘｒ卵巣培養及び付随するＦＡＣＳ解析の詳細なステップごとのプロトコールは、Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２０２０　Ａｐｒ；１５（４）：１５６０−１５８３を参照のこと。
　ｈＰＧＣＬＣの維持増幅培養のステップごとのプロトコールは以下のとおりである。
１．平底細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ，３５３０４３）を０．１％　ゼラチン溶液にて室温で１時間コーティングする。
２．ＭＭＣ処理（４μｇ／ｍＬ，２時間）したｍ２２０−５フィーダーをゼラチンコートした細胞培養プレートに播種する。通常、１２−ウェルプレートの１ウェル（１０％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン・ストレプトマイシン及び２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ　１ｍｌを含む）あたり５．０×１０５細胞を播種する。
３．ＦＡＣＳソーティング（上記項目を参照）によりｄ６　ｈＰＧＣＬＣ又は増幅ｈＰＧＣＬＣ（ＢＴ＋ＡＧ＋細胞又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞）をＦＡＣＳバッファー中に集め、２００ｇで７分間遠心してペレット沈降させる。
４．上清を除去した後、１０μＭ　Ｙ２７６３２を含むｈＰＧＣＬＣ維持増幅培養用培地中に、細胞濃度が１．０×１０４細胞／ｍＬとなるように細胞を懸濁する。
５．ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ又は増幅ｈＰＧＣＬＣをＭＭＣ処理したｍ２２０−５フィーダー上に播種する。通常、１２−ウェルプレートの１ウェルあたり、１．０×１０４細胞に相当する細胞懸濁液１ｍＬを播種する。
６．翌日、ｈＰＧＣＬＣ維持増幅培養用培地を添加する。通常、１２−ウェルプレートの１ウェルあたり、培地１ｍＬを添加する。
７．３日目に全培地を新鮮なものに交換する（２ｍＬ）。
８．５、７及び９日目に、培地の半分を新鮮な培地と交換する（１ｍＬ）。
９．１０日目に、増幅ｈＰＧＣＬＣを新しい培養プレートに継代する。
免疫蛍光（ＩＦ）解析
　増幅されたＰＧＣＬＣをフィルムボトムディッシュ（松浪硝子、ＦＤ１０３００）の中で数日間培養し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。細胞を室温で１５分間４％パラフォルムアルデヒドにより固定化し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。ブロッキングと透過処理のために、固定化した細胞をブロッキング緩衝液［１０％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，０１７−０００−１２１）、３％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ，Ａ３０５９）、及び０．１％　Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ　１００（ナカライテスク、３５５０１−０２）］中でインキュベートした。その後細胞を、一次抗体を含んでいる０．５×ブロッキング緩衝液［ブロッキング緩衝液とＰＢＳ（−）の１：１の混合液］の中でインキュベートした。一次抗体とのインキュベーションに用いた条件は以下のとおりである：
　マウス抗ＢＬＩＭＰ１、ヤギ抗ＳＯＸ１７，マウス抗ＡＰ２γ／ＴＦＡＰ２Ｃ、マウス抗ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１、ヤギ抗ＳＯＸ２、及びマウス抗ヒトミトコンドリア抗体については、４℃で一晩インキュベートした。マウス抗ＵＨＲＦ１及びウサギ抗ＤＮＭＴ１抗体については室温で３０分間インキュベートした。ヤギ抗ＮＡＮＯＧ抗体については、４℃で一晩又は室温で３０分間インキュベートした。一次抗体反応の後に、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ＤＡＰＩを１μｇ／ｍＬと二次抗体を含んでいる０．５×ブロッキング緩衝液中、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ｉｂｉｄｉ封入剤（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉａ）（ｉｂｉｄｉ，５０００１）の中にマウントした。
　以前報告されたように（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））ｘｒ卵巣のＩＦ解析を行った。染色された切片をマウントするために、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ，Ｈ−１０００）の代わりに、ＤＡＰＩを含まないｉｂｉｄｉ封入剤を使用した。
　次の抗体を示した希釈液で使用した：マウス抗ＢＬＩＭＰＩ（１／２００；Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ　ＭＡＢ３６０８１）；ヤギ抗−ＳＯＸ１７（１／１００；Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ　ＭＡＢ３６０８１）；マウス抗−ＡＰ２γ／ＴＦＡＰ２Ｃ（１／１００；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　ｓｃ−１２７６２）；マウス抗−ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１（１／１００；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　ｓｃ−５２７９）；ヤギ抗−ＮＡＮＯＧ（１／１００；Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ　ＡＦ１９９７）；ヤギ抗−ＳＯＸ２（１／１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ　ｓｃ−１７３２０）；マウス抗−ＵＨＲＦ１（１：２００；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ　ＭＡＢＥ３０８）；ウサギ抗−ＤＮＭＴ１（１：２００；ａｂｃａｍ　ａｂ１９９０５）；マウス抗−ヒトミトコンドリア（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＭＡＢ１２７３）；ヤギ抗−ＦＯＸＬ２（１／５００；Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＮＢ１００−１２７７）；マウス抗ＤＡＺＬ（１／１００；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　ｓｃ−３９０９２９）；ヤギ抗−ＤＤＸ４（１／４００；Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ　ＡＦ２０３０）；ラット抗ＧＦＰ（１／２５０；ナカライテスク　０４４０４−８４）。
　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの下記の二次抗体を１／８００希釈で使用した：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ４８８ロバ抗ラットＩｇＧ（Ａ２１２０８）；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８ｄｏｎｋｅｙａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ａ１００３７）；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ６４７ロバ抗マウスＩｇＧ（Ａ４１５７１）；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ６４７ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ａ２１４４７）；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ６４７ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａ３１５７３）。
　ＦＶ１０００−ＩＸ８１共焦点顕微鏡システム（オリンパス）を用いて画像を取得し、ＦＶ１０−ＡＶソフトウェアにより処理した。処理された画像をＸｎＣｏｎｖｅｒｔソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｘｎｖｉｅｗ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｘｃｏｎｖｅｒｔ／）を用いてトリミングした。
ＲＮＡ抽出、逆転写、及びｃＤＮＡ増幅
　ＲＮＡ抽出のために、Ｃｅｌｌｏｔｉｏｎに採取された細胞をペレット化し、溶解し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。製造業者の指示書に従って、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，７４００４）又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　ＸＳ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，ＵＯ９０２Ａ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　ＸＳを使用しているときに、溶出が停止する直前に、追加の遠心を加えた。Ｑｕｂｉｔ　ＲＮＡ　ＨＳアッセイキット（インビトロゲン、Ｑ３２８５５）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。各試料から逆転写のために１ｎｇの全ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡ増幅を以前報告されたように（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０１５　Ｍａｙ　１９；４３（９）：ｅ６０）行った。ＲＮＡ濃度が測定するには低すぎた（本研究において、ＲＮＡ抽出は１６０６から１０９６８細胞により行われた）ときには、ＲＮＡをＲＮＡ溶液を遠心分離してその容量を減らし、全濃縮ＲＮＡ溶液を逆転写とｃＤＮＡ増幅に使用した。
ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とＲＮＡ配列（ＲＮＡ−ｓｅｑ）解析
　上記で述べた増幅されたｃＤＮＡをｑＰＣＲ解析に使用した。ＣＦＸ３８４　Ｔｏｕｃｈ　Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ検出システム（ＢＩＯ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上のＰｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３６７６５９）でｑＰＣＲを行った。
　使用されたプライマー配列は表３の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＲＮＡ配列解析のために、以前報告された（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述）；Ｉｓｈｉｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．２０１６　Ｄｅｃ　６；１７（１０）：２７８９−２８０４）方法を幾らか改変して、増幅されたｃＤＮＡを用いて配列ライブラリーを構築した。ｃＤＮＡライブラリーを精製するときに、ＡＭｐｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａ６３８８１）の代わりに、ＡＸｙｐｒｅｐ　ＰＣＲ増幅ＭＡＧ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ａｘｙｇｅｎ，Ｍａｇ−ＰＣＲ−ＣＬ−２５０）を使用した。配列決定は、ＮｅｘｔＳｅｑ　５００／５５０　Ｈｉｇｈ　ｏｕｔｐｕｔ　Ｋｉｔ　ｖ２．５（７５サイクル）を有するＩＬＬＵＭＩＮＡ　ＮｅｘｔＳｅｑ　５００／５５０プラットフォーム（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）上で行った。
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）
　ＷＧＢＳライブラリーを、ｐｏｓｔ−ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ａｄａｐｔｏｒ　ｔａｇｇｉｎｇ（ＰＢＡＴ）法により作製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｅｓｔ−ｉｈｅｃ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（Ｍｉｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０１２　Ｓｅｐ　１；４０（１７）：ｅ１３６，Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ．２０１６　Ｏｃｔ　１０；３９（１）：８７−１０３）。１００００~１５０００個の細胞を、非メチル化λファージＤＮＡ（プロメガ、Ｄ１５２１）を含む溶解緩衝液［ＤＮａｓｅを含まない水（ＧＩＢＣＯ，１５２３０−１６０）の中の０．１％ＳＤＳ及び１μｇ／ＬプロテイナーゼＫ］の中に、３７℃で６０分間溶解し、９８℃で１５分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。単一の細胞が６ｐｇのゲノムＤＮＡを有すると推定し、入れたＤＮＡの０．５％に相当する非メチル化λファージＤＮＡを添加した。バイサルファイト処理のために、細胞溶解液を製造業者の指示書に従って、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏｇｅｎ　Ｄ５００５）で処理した。配列ライブラリーを構築するために、バイサルファイト処理されたＤＮＡを、一連の単一末端のアダプターにタグを付した相補的ＤＮＡ断片の合成にかけた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｅｓｔ−ｉｈｅｃ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ＰＢＡＴ法を行うときに、Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｏｔ　Ｓｒａｒｔ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆ５４０Ｓ）とＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰの代わり、Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｏｔ　Ｓｒａｒｔ　ＩＩ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆ５４９Ｓ）とＡｘｙＰｒｅｐ　ＭＡＧ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ−ＵＰ　Ｋｉｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｇ−ＰＣＲ−ＣＬ−２５０）をそれぞれ使用した。ＴｒｕＳｅｑ　ＳＲ　Ｃｌｕｓｔｅｒキットｖ３−ｃＢｏｔ−ＨＳとＴｒｕＳｅｑ　ＳＢＳキットｖ３−ＨＳを有するＩｌｌｕｍｉｎａ　Ｈｉｓｅｑ　２５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の上で配列決定を行った。
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）
　ゲノムＤＮＡを抽出するために、細胞をＣｅｌｌｏｔｉｏｎに採取してペレット化し、製造業者の指示書に従いＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，ＵＯ９５２Ｑ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。マイクロアレイのＣＧＨ実験と画像処理は、宝バイオにより、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，５１９０−４２４０）を用いて行われた。ヒト男性のレファレンスＤＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、性が一致したレファレンスＤＮＡのために使用した。簡単の述べると、２００ｎｇのゲノムＤＮＡをＡｌｕ１及びＲｓａ１で消化し、その後シアニン３（レフェレンスゲノムＤＮＡ）又はシアニン５により標識化した。標識化したゲノムＤＮＡを、２００ｒｐｍで６０℃で２４時間、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ　Ｇ３　Ｈｕｍａｎ　ＣＧＨ　Ｍｉｃｒｏａｒａｙ　８×６０Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇ４４５０Ａ）上でハイブリダイズした。得られた画像をＦｅａｔｕｒｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　１２．１．０．３（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）処理した（ＣＧＨデータ解析を参照のこと）。
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ処理と解析
　ヒトゲノム配列とアノテーションリリース１０７（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）の転写産物アノテーションＧＦＥ３ファイルは、ＮＣＢＩ　ｆｔｐサイト（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得た。３’末端におけるレフェレンス遺伝子のアノテーションは１０ｋｂまで伸長し、転写終結部位（ＴＳＳ）を十分にカバーした。
　リードの発現レベルへのプロセシングを、以前に記載された方法（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ，２０１５（上述））を改変して行った。簡単に言えば、全てのリードをｃｕｔａｄａｐｔ　ｖ１．９．１（Ｍａｒｔｉｎ，ＥＭＢｎｅｔｊｏｕｒｎａｌ．２０１１　１７：１０）により処理し、品質が低い（品質値＜３０）配列又はアダプター配列を除去した。リード（＞３０ｍｅｒ）をＴｏｐｈａｔ（ｖ２．１．０）／Ｂｏｗｔｉｅ（ｖ２．２．７）を用いてヒトゲノムＧＲＣｈ３８．３Ｐ２の上に、「カバレッジ検索なし（−ｎｏ−ｃｏｖｅｒａｇｅ−ｓｅａｒｃｈ）」オプション（Ｌａｎｇｍｅａｄ　＆　Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２　Ｍａｒ　４；９（４）：３５７−９；Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌ．２０１３　Ａｐｒ　２５；１４（４）：Ｒ３６）によりマップし、ＨＩＳｅｑ（ｖ０．９．１；Ａｎｄｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５　Ｊａｎ　１５；３１（２）：１６６−９）により遺伝子当たりのフォワードリードを評価した。全ての遺伝子についての全てのフォワードリードの合計を用いて、リードカウントを１００万個のマップされたリード（ＲＰＭ）当たりのロードに変換した。少なくとも１つの試料中のｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）〉≧４の遺伝子を、教師なし階層クラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ　ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）（ＵＨＣ）及び主成分分析（ＰＣＡ）のために使用した。Ｒソフトウェアのバージョン３．６．１（Ｒ　ＣｏｒｅＴｅａｍ，２０１９）を使用して、ＵＨＣ及びＰＣを行った。ＰＣＡはｐｒｃｏｍｐ関数により行った。ＵＨＣはｍｅｔｈｏｄ＝”ｅｕｃｌｉｄｅａｎ”の設定のＤｉｓｔ関数、及びｍｅｔｈｏｄ＝”ｗａｒｄ．Ｄ２”の設定のｈｃｌｕｓｔ関数により行った。遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析は、ＤＡＶＩＤ６．８（Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１）：４４−５７）を用いて行った。
ＷＧＢＳデータ処理と解析
　ゲノムリリースＧＲＣｈ３８．ｐ２を、ヒトゲノム及び転写産物レファレンスとして使用した。プロモーター領域を、転写開始部位（ＴＳＳ）の９００ｂｐ上流且つ４００ｂｐ下流の間の領域として規定した。強い、中程度の、及び弱いＣｐＧプロモーター（それぞれ、ＨＣＰ、ＩＣＰ、及びＬＣＰ）をＢｏｒｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２０１０　Ｄｅｃ；４２（１２）：１０９３−１００の中で述べられたようにして計算した。ＣｐＧアイランド（ＣｐＧ）のリストをＩｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅｔ．２０１０　Ｓｅｐ　２３；６（９）：ｅ１００１１３４から得た。ｈｇ１９ゲノム中のＣＧＩを、ＬｉｆｔＯｖｅｒプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＬｉｆｔＯｖｅｒ）を用いてＧＴＣｈ３８に変換した。インプリントされた差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）はＣｏｕｒｔ　ｅｔ　ａｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．２０１４　Ａｐｒ；２４（４）：５５４−６９から得た。精子と卵母細胞（精子で≧５０％又は卵母細胞で≧５０％に加えて、精子と卵母細胞の数に５０％より多い差）で差次的なメチル化を示す領域を図に示す。ゲノム繰り返しエレメント情報に用いるヒトＧＲＣｈ３８のＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータを、ＵＣＳＣ　ｔａｂｌｅ　ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＴａｂｌｅｓ）から入手した。
　遺伝子間領域は、無作為に、繰り返しエレメントを除く遺伝子の間の２ｋｂビンを選択した。２００個の無作為に選択された領域をヒートマップ中に示す。リードの処理、マッピング及びメチル化されたＣレベルの推定は、以前に述べたように行われた（Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））。簡単に言えば、全てのリードをＴｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）により処理し、５’末端から４塩基、３’末端から１塩基、アダプター配列、及び質が低いリード（ｑｕａｌｉｔｙ　ｓｃｏｒｅ＜２０）を除去した。”−−ｐｂａｔ”オプションを有する（Ｋｒｕｅｇｅｒ　＆　Ａｎｄｒｅｗｓ　２０１１）Ｂｉｓｍａｒｋ（ｖ０．１７．０）由来のｂｉｓｍａｒｋプログラムにより、処理されたリードをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）上にマッピングした。マッピングされたデータ（ＢＡＭフォーマット）を、Ｂｉｓｍａｒｋ由来のｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒプログラムを用いて、メチル化レベルに変換した。Ｓａｍｔｏｏｌ（ｖ１．３）（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９　Ａｕｇ　１５；２５（１６）：２０７８−９）とＩＧＶＴｏｏｌ（ｖ２．３．５２）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１　Ｊａｎ；２９（１）：２４−６）を使用してＢＡＭファイルを操作し、ｗｉｇファイルを作成した。
　リード深さが４から２００の間であるＣｐＧのみが、メチル化されたＣ（ｍＣ）％の計算に使用された。２ｋｂのビンのゲノム広さの中でＣｐＧリード（リード深さ≧４）カウントが４以上であるの領域のみが、プロモーター、エキソン、イントロン、遺伝子間領域又はインプリントされたＤＭＲが、平均又は他の解析を計算するために使用された。ＣｐＡ、ＣｐＣ及びＣｐＴメチル化に関する解析のために、以下のようにしてｋｂ当たりのｍＣ％としてメチル化％を計算した：１ｋｂビンのゲノム広さに亘るメチル化コール（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｃａｌｌ）の数を合計し、同じ領域内の非メチル化コールの数の合計で割り算をした。ＣｐＡ、ＣｐＣ、及びＣｐＴについてのｋｂ当たりのメチル化レベルを全ゲノムに亘って別個に計算した。
　ｃ３０ａｇ７７細胞（本発明）、ａｇ７７＿２及びａｇ１２０　ＡＧ＋ＶＴ＋細胞（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））、並びにプールした７~９週のヒト生殖細胞（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６１（６）：１４５３−６７）におけるＤＮＡ脱メチル化からのエスケープ（「ｅｓｃａｐｅｅｓ」）を、ＭｅｔｈＰｉｐｅ　ｖ３．４．３パッケージ中のｈｙｐｅｒｍｒプログラム（Ｓｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２０１３　Ｄｅｃ　６；８（１２）：ｅ８１１４８）をデフォルト設定で用いて明らかにした。これらの細胞に共通の、あるいはいくつかの細胞種に特異的なエスケープを、ｂｅｄｔｏｏｌｓ　ｖ２．２９．２（Ｑｕｉｎｌａｎ　＆　Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０　Ｍａｒ　１５；２６（６）：８４１−２）のｍｅｒｇｅ及びｉｎｔｅｒｓｅｃｔコマンドを用いて計算した。エスケープのアノテーションは、Ｈｏｍｅｒ　ｖ４．９．１中のａｎｎｏｔａｔｅ　Ｐｅａｋｓプログラムを用いて行った。‘ＵｐＳｅｔＲ’ライブラリー中の‘ｕｐｓｅｔ’関数を用いて、Ｒソフトウェアでデータを可視化した。エンリッチメントスコアを、同じカテゴリーで重複するシャッフルされたビンの数を超える、示されたゲノムエレメントで重複するエスケープの数から計算した（５回の試行の平均）。
　ｘｒ卵巣（Ｙａｎｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））、精子及び卵母細胞（Ｏｋａｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅｔ．２０１４　Ｄｅｃ　１１；１０（１２）：ｅ１００４８６８）由来のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞のためのデータ処理は、上記で述べたように行った。ｍＰＧＣＬＣのためのデータ（Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））をマウスゲノムｍｍ１０／ＧＲＣｍ３８の上にマッピングし、上記で述べたのと同じ様にして処理した。
ａＣＧＨデータ解析
　アルゴリズムＡＤＭ２による異常な間隔を検出する”Ｄｅｆａｕｌｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ‐ＣＧＨ　ｖ２”の解析方法により、ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓ５．０．２．５（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてａＣＧＨ生データを解析した。加えて、異常な間隔の誤ったコールを軽減するために、”Ｆｕｚｚｙ　Ｚｅｒｏ”校正を適用した。ｈｇ１９に対するヒトＡｌｉｇｅｎｔ男性レファレンスＤＮＡ中のコピー数の変動のリストが、ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓ５．０．２．５から入手可能である。
統計学的解析
　すべての統計学的試験はＲソフトウェア　バージョン３．６．１（Ｒ　ＣｏｒｅＴｅａｍ，２０１９）を用いて行った。Ｗｅｌｃｈのｔ−検定は“ｖａｒ．ｅｑｕａｌ＝Ｆ”オプションを用いてｔ検定関数により行い、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定はｗｉｌｃｏｘ．ｅｘａｃｔ関数を用いて行った。
データの入手可能性
　本発明において生じたデータのアクセッション番号：
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータ：ＧＳＥ１４７４９８（ＧＥＯデータベース）；
ＷＧＢＳ　ｄａｔａ：ＧＳＥ１４７４９９（ＧＥＯデータベース）；
ａＣＧＨデータ：ＧＳＥ１４８４１５（ＧＥＯデータベース）
　ＲＮＡ−ｓｅｑデータのアクセッション番号：
ｈｉＰＳＣｓ／ｉＭｅＬＣｓ：ＧＳＥ９９３５０（ＧＥＯデータベース）；
ｄ６　ｈＰＧＣＬＣｓ及びａｇ７／２１／３５／４９／６３／７７／１２０細胞：ＧＳＥ１１７１０１；
ＷＧＢＳデータ：
ｈｉＰＳＣｓ／ｉＭｅＬＣｓ／ｄ６　ｈＰＧＣＬＣｓ及びａｇ３５／７７細胞：ＤＲＡ００６６１８（ＤＤＢＪデータベース）；
ａｇ１２０細胞：ＤＲＡ００７０７７（ＤＤＢＪデータベース）
ｄ４ｃ３／ｄ４ｃ７　ｍＰＧＣＬＣｓのＷＧＢＳデータのアクセッション番号：ＤＲＡ００５１６６；
ｍＥＳＣｓ／ＥｐｉＬＣｓ／ｄ２／ｄ４／ｄ６　ｍＰＧＣＬＣｓ：ＤＲＡ００３４７１；
Ｅ１０．５／Ｅ１３．５／Ｅ１６．５生殖細胞：ＤＲＡ０００６０７；
＜実験結果＞
ｈＰＧＣＬＣのインビトロ増幅のための条件の探索
　ｈＰＧＣＬＣのインビトロ増幅のための条件を確立するために、ｍＰＧＣＬＣのインビトロ増幅と類似した条件の下でｈＰＧＣＬＣが増殖できるかを検討した（Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））。この目的のために、ＢＬＩＭＰ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＢＴ）とＴＦＡＰ２Ｃ−ＥＧＦＰ（ＡＧ）アレル［５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣ（ＸＹ）］（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述），Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））を有するｈｉＰＳＣを、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）とＷＮＴシグナル伝達アクチベーター（ＣＨＩＲ９９０２１）によりｉＭｅＬＣｓに、その後骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）によりＢＴＡＧ陽性（ＢＴ＋ＡＧ＋）ｈＰＧＣＬＣに誘導した（図１Ａ）。６日間誘導されたＢＴ＋ＡＧ＋　ｈＰＧＣＬＣ（ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ）を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により単離し、当該細胞５．０×１０３個を、１５％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、及びｍＰＧＣ（ＬＣ）増幅に対してポシティブな効果を有することが知られている化学物質［フォルスコリン（１０μＭ）、ロリプラム（１０μＭ）、及びシクロスポリンＡ（５μＭ）］とサイトカイン［ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ）］の様々な組み合わせ（合計で３２の組み合せ）（Ｄｅ　Ｆｅｌｉｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ．１９９３　Ｍａｙ；１５７（１）：２７７−８０，Ｄｏｌｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１（上述），Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９１　Ｏｃｔ　２４；３５３（６３４６）：７５０−２，Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））を含むＧＭＥＭ中で、ｍ２２０　サブラインのフィーダー上に播種した（図１Ａ、１Ｂ）。
　２日毎に培地交換をしながら１０日間培養した後に、各条件下でｄ６　ｈＰＧＣＬＣの数が増幅したかどうかをＦＡＣＳ解析により検討した。化学物質については、フォルスコリン＋ロリプラム又はフォルスコリン＋シクロスポリンＡのいずれかの添加よりも、フォルスコリン単独の添加はＢＴ＋ＡＧ＋細胞の数の増幅に貢献することが見い出され（シクロスポリンＡはＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅にネガティブな効果を有していた）（図１Ｂ）、サイトカインについては、ＬＩＦとＥＧＦ、ＦＧＦ単独、又は３つ全てのサイトカインの添加は、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅にポシティブな効果を有した（図１Ｂ）。従って、フォルスコリン／ＬＩＦ／ＥＧＦ又はフォルスコリン／ｂＦＧＦの添加は、１０日間培養後にＢＴ＋ＡＧ＋細胞の４倍超の増幅をもたらした（図１Ｂ）。ストラテジーがより簡便であるために、以下の実験においては、フォルスコリン／ｂＦＧＦの条件を使用すると決定した。
　次に基礎組成がｈＰＧＣＬＣの増幅に影響するかどうかを試験した。最初に４つの異なる基礎培地［ＧＭＥＭ及び３つの異なるグルコース濃度（４．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、０．２２ｇ／Ｌ）を有するとＤＭＥＭ］の影響を試験した。それぞれ１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した４つの培地中のｍ２２０フィーダー上に５．０×１０３個のＢＴ＋ＡＧ＋　ｄ６　ｈＰＧＧＬＣ細胞を播種した。１０日間培養した後に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の数をＦＡＣＳにより評価し、５．０×１０３個のＢＴ＋ＡＧ＋細胞を継代し、各条件下で培養日数３０（ｃ３０）まで解析を繰り返した（図１Ｃ）。２つの独立した実験の結果を図１Ｄに示す。各条件下において増幅率は実験間でやや変動したが、３０日の培養の間でＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅に１ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭが最も有効であった（最大８０倍の増幅）。その後、ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）、ＧＭＥＭ、及び７つの異なる基礎培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｆ１２、Ｔｅｍｉｎ’ｓ　ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ及びＣＭＲＬ；表２）の効果を同様に比較したところ、ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）はＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅に関して最も顕著な効果を示し、一方Ｆ１２とＤＭＥＭ／Ｆ１２等の基礎培地が及ぼす効果は乏しいことが見出された（図１Ｅ）。ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅に関するＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）の優れた効果は、ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ及びＣＭＲＬの効果を比較した他の実験でも検証された（図１Ｅ）。
　図１Ｆは、選択された添加物（１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ）を含むＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）中のｍ２２０フィーダー上で、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（ｃ２１からｃ３０）を培養した典型的な例を示す。培養の間、核の周囲の油滴様の小胞により特徴付けられるＢＴ＋細胞（ＡＧの蛍光は倒立蛍光顕微鏡下においては比較的に弱くなる）は、速度は遅いものの、増幅の進行を示し、１０日間培養した後には明確な形態のコロニーを形成した（図１Ｆ）。これらの知見は、６ｄ　ｈＰＧＣＬＣはＢＴ＋ＡＧ＋細胞として培養物の中で増殖可能であることを示し、それらが効率的に増殖するための要件のみならずそれらの増殖の様式は、ｍＰＧＣＬＣと幾らか異なっているようである（Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））。
規定された条件下でのｈＰＧＣＬＣの持続的な増幅
　選択された条件［１５％ＫＳＲ、２．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、１０μＭフォルスコリン、及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）中のｍ２２０フィーダー上］の下で、ｈＰＧＣＬＣがＢＴ＋ＡＧ＋細胞として増幅できる程度を検討した。出発細胞集団としてｄ４とｄ６のｈＰＧＣＬＣを使用し、１０日毎のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の継代でそれらを培養した。図２Ａと図３Ａに示されるように、ｄ４とｄ６のｈＰＧＣＬＣの培養は両方とも成功し、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞として少なくともｃ１２０まで継代された。出発細胞集団としてｄ４　ｈＰＧＣＬＣを使用したときには、継代におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞のパーセンテージ（各継代後の１０日目に測定した）は継代の初期（~ｃ２０）においては~２０％付近であり、継代の後期（~ｃ３０からｃ１２０）においては~１０％であり、培養の間、ＢＴ＋ＡＧ−細胞を含む非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のパーセンテージの増加が進行した（最大~９５％）（図３Ａ、図３Ｂ）。一方、出発細胞集団としてｄ６　ｈＰＧＣＬＣを使用したときには、継代後のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のパーセンテージはより高く、継代の初期（~ｃ２０）においては~４０％付近であり、継代の後期（~ｃ３０からｃ１２０）においては~２０％であり（図２Ａ、図２Ｂ）、そのために非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞のパーセンテージはより低く（~８０％）、培養の間にＢＴ＋ＡＧ−又はＢＴ−ＡＧ＋細胞は実質的に含まれていなかった（図２Ａ、図２Ｂ）。
　ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ増幅培養の継代後の細胞集団の組成をより綿密に検討した。１つの実験では、ｃ２０においてＢＴ＋ＡＧ＋細胞は全細胞のおよそ４６％を構成し、一方、ＴＲＡ−１−８５＋［ヒト特異的抗原（Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ａｎａｔ．２００２　Ｍａｒ；２００（Ｐｔ　３）：２４９−５８）］、非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞はおよそ１３％を占め、ＴＲＡ−１−８５−細胞（ｍ２２０フィーダー）はおよそ３６％を構成した（死細胞：~５％）（図２Ｃ）。ｃ６０において、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は全細胞集団のおよそ３７％を占め、ＴＲＡ−１−８５＋、非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞はおよそ３８％を構成し、ＴＲＡ−１−８５−細胞（ｍ２２０フィーダー）はおよそ２０％を構成した（図２Ｃ）。ＴＲＡ−１−８５−ｍ２２０フィーダーは、ＢＴＡＧ蛍光によりソーティングした場合ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の斜め下にプロットされ、弱い自家蛍光を示した（図３Ｃ）。は全培養期間の間のＢＴＡＧ発現に関する細胞集団の変化の解析と組み合わせて（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ）、これらの知見は、選択された条件下では、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣはｄ４　ｈＰＧＣＬＣよりも、より安定な様式でＢＴ＋ＡＧ＋細胞として増殖可能であり、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の一定の画分は、特に後期の継代においては非ＢＴ＋ＡＧ＋細胞に分化するが（下記を参照のこと）、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ培養物の大部分はＢＴ＋ＡＧ＋細胞として留まり、ｃ１２０においてさえも特徴的なコロニーを形成する能力を有した（図２Ｄ）。合わせるとこれらの結果は、２回の繰り返し実験において、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のＢＴ＋ＡＧ＋細胞はｃ１２０迄に~１．０×１０６倍近く増殖（図２Ｅ）することを示し、ｃ７０における比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）による核型解析により、増幅中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の核型は実質的に正常であることが実証された（図３Ｄ）。
　ＢＴＡＧ発現がポシティブであることと良く一致して、免疫蛍光（ＩＦ）解析は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のｃ２８とｃ６６におけるコロニーは共に、ＢＬＩＭＰ１とＴＦＡＰ２Ｃ（ＡＰ２γ）を均一に発現し、ｈＰＧＣ（ＬＣ）ｓの鍵となるマーカーであるＳＯＸ１７、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）、及びＮＡＮＯＧについてもポシティブであることが明らかとなった（図２Ｆ）。本発明者らは、培養中の大部分のＡＧ−細胞がＳＯＸ２を発現し、これらの細胞がＡＧ＋／ＳＯＸ２−細胞の近傍に生じていることを見出した（図３Ｅ、以下参照）。ｃ１０からｃ１２０（ｃ１０、ｃ３０、ｃ５０、ｃ７０、ｃ９０、及びｃ１２０）由来のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の全ＲＮＡを単離し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により鍵となる遺伝子の発現を解析したところ、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、少なくともｃ１２０まで、ＢＬＩＭＰ１（ＰＲＤＭ１）、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＳＯＸ１７、ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧ等の遺伝子を類似したレベルで継続的に発現する一方、ＳＯＸ２発現は安定して抑制されるた（図２Ｇ）。これらの知見は、ｈＰＧＣＬＣ、特にｄ６　ｈＰＧＣＬＣは、ｈＰＧＣの性質を維持しながら、規定された条件下で~１．０×１０６倍又はそれ以上に増殖可能であることを示している。
表面マーカー選抜を用いたｈＰＧＣＬＣの増幅
　他のｈＰＳＣ株に適用が容易である継代操作で、ｈＰＧＣＬＣの増殖が可能であるかを検討した。出発細胞集団としてｄ６　ｈＰＧＣＬＣを使用したときに、本発明者らの培養条件下でＢＴ−ＡＧ＋細胞は出現しなかった（図２Ａ、図２Ｂ）という観察に基づいて、ＡＧレポーターのみを使用した継代によりｈＰＧＣＬＣは増殖をさせることが可能であるかどうかをまず試験した。５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣ由来のｄ６　ｈＰＧＣＬＣは、ＡＧ＋細胞として、ｃ６０又はそれ以上まで継代して増殖することが可能であると見出され（図４Ａ、図４Ｂ）、ｃ６０においてもたらされる細胞集団は、ＢＴＡＧ陽性を用いて継代されたものと本質的に同じであった（図４Ｃ）。
　次に、細胞表面マーカーを使用した継代を用いて、ｈＰＧＣＬＣを増殖させることができるかを試験した。蛍光レポーターを有さない、独立したｈｉＰＳＣ株１３８３Ｄ６（ＸＹ）（Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７）をｈＰＧＣＬＣに誘導し、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６とＥｐＣＡＭを発現しているｄ６　ｈＰＧＣＬＣを単離し（Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述），Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述））（図４Ｄ）、本発明者らが選択した条件の下でそれらを培養した。ｃ１０において、特徴的な形態のコロニーの形成が観察され（図４Ｄ、図４Ｅ）、ＦＡＣＳ解析を行ったところ、高レベルのＩＮＴＥＧＲＩＮα６をＥｐＣＡＭを発現している細胞の明らかな集団が培養中で殖えている（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、同時にＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞集団（それらの特性解析については下記を参照のこと）が発生していることが判った（図４Ｄ）。５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣ由来のｃ４０におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、１３８３Ｄ６　ｈｉＰＳＣから誘導されたＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞集団と類似した、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６とＥｐＣＡＭ発現のプロファイルを示した一方で、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞に対応するＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞集団及びＩＮＴＥＧＲＩＮα６−／ＥｐＣＡＭ−の細胞集団は主にｍ２２０フィーダーにより構成されていた（図４Ｆ、図３Ｃ）。従って、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞集団を継代したところ、そのような細胞は少なくともｃ３０まで増殖と継代に成功し、最大~５０倍に増幅した（図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｇ）。さらにｑＰＣＲ解析により、ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞は、ＢＬＩＭＰ１（ＰＲＤＭ１）、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＳＯＸ１７、ＰＯＵ５Ｆ１、及びＮＡＮＯＧ等の鍵となるｈＰＧＣ遺伝子を発現し、且つ増幅培養においてＢＴ＋ＡＧ＋細胞と類似した様子でＳＯＸ２を抑制した（図４Ｈ）。５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ株由来の１３８３Ｄ６株由来のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増殖効率と比較してのＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈの細胞の幾分低めの増殖効率（ｃ３０の時点で~５０倍対~１００−２００倍）は、表面マーカーに対する比較的複雑なソーティング手順の結果による開始細胞集団へのダメージに関連するものか、オリジナルのｈｉＰＳＣ株のクローンの違いによるものかもしれない。細胞表面マーカーを用いた継代により、ｈＰＧＣＬＣを成功裏に増殖させることができるという結論が得られた。
増幅したｈＰＧＣＬＣは早期ｈＰＧＣ（ＬＣ）トランスクリプトームを保持する
　増幅培養中のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞の性質をさらに検討するために、関連する細胞タイプのトランスクリプトームをＲＮＡシークエンス法により測定し（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述））、ｘｒ卵巣中のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞のトランスクリプトームとの比較においてそれらの性質を解析した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））。解析した細胞タイプは次の通り：ｈｉＰＳＣｓ及びｉＭｅＬＣｓ（５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ、１３８３Ｄ６）、ｃ１０、ｃ３０、ｃ５０、ｃ７０、ｃ９０及びｃ１２０時点でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞（５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ）、ｃ１０及びｃ３０時点でのＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞、ｃ１０時点でのＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞（１３８３Ｄ６）、凝集日（ａｇ）７、２１、３５、４９、６３及び７７時点でのＢＴ＋ＡＧ＋細胞（５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ）（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））、及びａｇ１２０時点でのＡＧ＋ＶＴ−／ＡＧ＋／−ＶＴ＋／ＡＧ＋ＶＴ＋／ＡＧ−ＶＴ＋細胞［１３９０Ｇ３　ＡＧＶＴ（ＤＤＸ４（ヒトＶａｓａホモログとしても知られる）−ｔｄＴｏｍａｔｏ）］（図５Ａ）。
　教師なし階層クラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ　ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）により、解析された細胞は主として２つの大きなクラスターに分類されることが明らかとなり、１つはｈｉＰＳＣ／ｉＭｅＬＣからなり、他はｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞からなる（図７Ａ）。ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞の大きなクラスター内で、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞とＩＮＴＥＧＲＩＮ６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞は、培養期間が異なったものと混ざり合いながら堅固なクラスターを形成し、その様な細胞の全クラスターは、培養期間の早期におけるｘｒ卵巣中のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞（ａｇ７におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞）（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））からなるクラスターのみならず、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣのクラスターとも類似性を示した（図７Ａ）。
　一方、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞のクラスターは、培養期間の後期（ａｇ２１，ａｇ３５，ａｇ４９，ａｇ６３，及びａｇ７７におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞、並びにａｇ１２０におけるＡＧ＋ＶＴ−／ＡＧ＋／−ＶＴ＋／ＡＧ＋ＶＴ＋／ＡＧ−ＶＴ＋細胞）におけるｘｒ卵巣中のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞［卵原細胞／原生殖細胞様細胞（ａｇ７７とａｇ１２０における細胞）を含む］のクラスターと比較的に遠い関係性を示した（図７Ａ）（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））。興味深いことに、ｃ１０におけるＩＮＴＥＧＲＩＮ６ｌｏｗ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞はｈｉＰＳＣ／ｉＭｅＬＣとクラスター化し、ｈｉＰＳＣ／ｉＭｅＬＣと同様の様式において多能性関連遺伝子及びその他の鍵となる遺伝子を発現することが見出され（図７Ａ、図５Ｂ）、それらは脱分化した細胞集団を表していることを示唆している。これらの結果と良く一致して主成分解析（ＰＣＡ）は、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞はそれらの培養期間に関わらずに、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣとａｇ２１におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞の位置の間に存在する、ａｇ７におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞の位置と近い位置にプロットされることが示された（図７Ｂ）。
　次に、ｈＰＧＣ（ＬＣ）から卵原細胞／原生殖細胞への発達の進行を特徴付ける遺伝子セットの発現を試験した（それは本発明者らにより、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞においてそれは既に規定されている（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述）））。既に報告され（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））、図７Ｃにも示されるように、クラスター１と２の遺伝子は、ｈＰＧＣＬＣ運命決定によりアップレギュレートされるものであり、クラスター１遺伝子（例えばＳＯＸ１７，ＰＲＤＭ１，ＮＡＮＯＳ３，ＫＬＦ４，ＴＣＬＩＡ）はその後も継続的に発現し、クラスター２遺伝子（例えばＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１，ＭＴ２Ａ，ＴＲＰＣ５，ＴＲＰＣ６）はおよそａｇ３５以降次第に抑制され、クラスター３遺伝子はおよそａｇ３５の後に特異的にアップレギュレートされるものであり、卵原細胞／原生殖細胞の発達（例えば、ＤＡＺＬ，ＤＤＸ４，ＭＡＥＬ，ＴＤＲＤ９，ＰＩＷＩＬ１）を特徴付け、クラスター４と５の遺伝子はｈＰＧＣＬＣ運命決定の後にダウンレギュレートされるものであり、クラスタ−４遺伝子（例えば、ＳＯＸ２，ＴＤＧＦ１，ＧＪＡ１，ＯＴＸ２，ＣＤＨ１）は比較的に速く抑制され、クラスター５遺伝子（例えば、ＩＦＩＴＭ２，ＩＦＩＴＭ３，ＳＬＣ２Ａ３，ＳＬＣ２Ａ１）は徐々に抑制される。図７Ｃと図７Ｄから明らかであるように、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞は、クラスター１、２及び５の遺伝子を発現し続け、ａｇ７のｄ６　ｈＰＧＣＬＣ／ＢＴ＋ＡＧ＋細胞と同様にクラスター４の遺伝子を抑制し、ＢＲＤＴ，ＩＲＸ４及びＩＬ１２Ｂ等の遺伝子を除いてクラスター３の遺伝子をアップレギュレートせず、ａｇ７におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞と非常に類似した性質を示す。それと一致して、この遺伝子セットを使用したスピアマンの順位相関解析（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ　ｒａｎｋ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）は、様々な培養期間における増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞のトランスクリプトームは相関性が高いことを示し、ａｇ７のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のトランスクリプトームと最も近接した相関性を、次にａｇ２１におけるトランスクリプトームと相関性を示した（図７Ｅ）。
　増幅培養中の様々な培養期間において、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で差次的に発現した遺伝子［ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）≧４、ｌｏｇ２（変化の倍率）≧１］を測定した。差次的に発現した遺伝子の数は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣとｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で最も高く（ｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞において３７７個と５４８個の遺伝子がそれぞれアップ／ダウンレギュレートされた）、ｃ１０とｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で実質的に低減し（ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞中で７２個と５６個の遺伝子がそれぞれアップ／ダウンレギュレートされた）、ｃ３０の後にＢＴ＋ＡＧ＋細胞は殆ど同じトランスクリプトームを示し、増幅培養中に斬進的にダウンレギュレートされるＴＣＬ１Ａが僅かな例外に含まれる（図８Ａ、図５Ｂ、図６と下記を参照のこと）。ＴＣＬ１ＡはＡＫＴのコアクチベーターとして作用し、ＰＳＣにおける解糖を促進することが知られている（Ｌａｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．２０００　Ａｕｇ；６（２）：３９５−４０７，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７　Ｍａｒ　１４；８（３）：７８７−８０１）ことから、拡大培養の間はＡＫＴ及び解糖経路が次第にダウンレギュレートされることが示唆される。ｄ６　ｈＰＧＣＬＣと比較してｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞でアップレギュレートされる遺伝子は、「成長のネガティブな制御」と「ミネラル吸収」等の遺伝子オントロジー（ＧＯ）の機能的タームにおいてエンリッチされ、メタロチオネイン（ＭＴ）１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，１Ｈ，１Ｘ及び２Ａ、並びにスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）１及び２を含み、それらは、亜鉛等の必須の重金属の恒常性又は活性酸素種（ＲＯＳ）の除去のため機能することが知られている（図８Ｂ）（Ｈａｑ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ．２００３　Ｄｅｃ　１０；５３３（１−２）：２１１−２６）。ＭＴ遺伝子はｘｒ卵巣中でａｇ７においてＢＴ＋ＡＧ＋細胞中でもアップレギュレートされ、その後にダウンレギュレートされる（図５Ｂ）。それに対して、ｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は「心臓発生」（例えばＧＡＴＡ２，ＧＡＴＡ３，ＨＡＮＤＩ１，ＩＤ１，ＩＤ３，ＳＡＬＬ１）、「腎臓発生」（例えば、ＮＰＨＰ３，ＬＺＴＳ２，ＬＨＸ１，ＡＲＩＤ５Ｂ，ＯＶＯＬ１）、及び「細胞外基質組織化」（例えば、ＣＯＬ２Ａ１，ＣＯＬ３Ａ１，ＣＯＬ４Ａ５，ＬＡＭＡ４，ＬＡＭＢ２）（図８Ｂ）等のＧＯタームをエンリッチし、体細胞プログラムと関連しｈＰＧＣＬＣ運命決定により同時に活性化される遺伝子は、ｈＰＧＣＬＣ増幅培養の間に抑制されていることを示唆している。
　増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の発達経路をｘｒ卵巣中の発達経路と区別する潜在的な機構についての洞察を得るために、［ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）≧４、変化の倍率≧３］の差次的に発現した遺伝子をｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞とａｇ７／ａｇ２１　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の間で探索した（図８Ｃ）。ａｇ７　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞と比較して、ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞でアップレギュレートされた遺伝子（２２１個の遺伝子）にはＣＥＮＰＮ／Ｃ／Ｋ，ＣＥＴＮ３，ＣＤＣ７／２６，ＣＣＮＡ２及びＥ２Ｆ３を含み、「ＣＥＮＰ−Ａ含有ヌクレオソームアッセンブリー」等のＧＯタームと「有糸分裂的細胞分裂」等のＧＯタームがエンリッチされ（図８Ｃ）、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、ｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞と比較して有糸分裂がより活性であるという考えと一致している。ａｇ２１　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞と比較してｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞中でアップレギュレートされた遺伝子（１６２個の遺伝子）には、ＭＴ遺伝子ファミリーのメンバーがさらに含まれ、ａｇ２１　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞中のそれらのダウンレギュレートを反映している（図８Ｃ）。それに対して、ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞と比較してａｇ７／２１　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞でアップレギュレートされる遺伝子（それぞれ、１０１個と７０個の遺伝子）には、ＦＯＳ，ＦＯＳＢ，ＥＧＲ１，ＥＧＲ２及びＥＧＲ３が含まれ（図８Ｃ）、それらは様々な細胞刺激に反応する最初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅ）であり、ｘｒ卵巣環境はＢＴ＋ＡＧ＋細胞中で別個のシグナル伝達経路を引き起こすことを示唆している。全体としてこれらの知見は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のＢＴ＋ＡＧ＋／ＩＮＴＥＧＲＩＮα６ｈｉｇｈ／ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ細胞は、培養中幾らかの遺伝子のアップレギュレートが培養への適用を示している可能性はあるものの、増幅培養において、卵原細胞／原生殖細胞様細胞に向かう発達経路を取るが、それらの発達の進行を早い時期に停止し、早期のｈＰＧＣＬＣの性質を忠実に維持していることを示している。
増幅したｈＰＧＣＬＣは早期ｈＰＧＣ（ＬＣ）ＤＮＡメチロームを保持する
　次に増幅培養中のｃ１０，ｃ７０及びｃ１２０におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞のゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイルを、全ゲノムバイサルファイトシークエンス（ＷＧＢＳ）解析により測定し（Ｍｉｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２（上述），Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））、それらの性質を、ｈｉＰＳＣ，ｉＭｅＬＣ，ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ及びｘｒ卵巣中のｈＰＧＣＬＣ由来の細胞（ａｇ３５とａｇ７７におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞とａｇ１２０におけるＡＧ＋ＶＴ−／ＡＧ＋ＶＴ＋／ＡＧ−ＶＴ＋細胞）を含む、他の関連する細胞型の性質と比較して試験した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））（図１０Ａ）。ｈｉＰＳＣとｉＭｅＬＣは非常に類似したゲノムワイドな５−メチルシトシン（５ｍＣ）プロファイルを示し、~８０％の平均５ｍＣを有し、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣは僅かであるが有意な、全体的な５ｍＣレベルの低下を受けた（平均で~７５％）（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））（図９Ａ、図９Ｂ）。増幅培養においてＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣから５ｍＣのさらなる低下を示し、ｃ１０において~６５％の平均５ｍＣレベルを獲得したことが見出された（図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ）。しかしながら、その後ｃ７０とｃ１２０において、それらのゲノムワイド５ｍＣレベル及びプロファイルは、ｃ１２０において僅かな増加（~６８％）を伴うが、実質的に維持された（図９Ａ、９Ｂ、図１０Ａ）。従って、プロモーター、エキソン、イントロン、遺伝子間領域、代表的な繰り返しエレメント、非プロモーターＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）及びインプリント制御領域（ＩＣＲ）を含むゲノムに亘った代表的なエレメント中の５ｍＣレベルの試験は、それらのエレメントの全ては増幅培養の間に本質的にそれらの５ｍＣレベルを保持したことが明らかとなった（図９Ｃ~Ｅ）。これらの観察は、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、それらを増幅培養する間に早期ｈＰＧＣのトランスクリプトームを実質的に保持するという知見と良く一致する一方（図７）、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣは卵原細胞／原生殖細胞へと分化し、ｘｒ卵巣中でケノムワイドなＤＮＡ脱メチル化を受け（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））（図９Ａ）、ｍＰＧＣＬＣはそれらの増幅培養の間にゲノムワイドなＤＮＡ脱メチル化を受ける（Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述），Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））という知見と非常に対照的である。興味深いことに、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣと比較してｃ１０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞では特徴的なアップレギュレートを示す（図８Ａ、図８Ｂ、図５Ｂ）ＭＴ１遺伝子クラスターの遺伝子座は、ｈＰＧＣＬＣ誘導／分化／増幅のプロセスに亘ってユニークな低メチル化状態を示し（図１０Ｂ）、従って、維持増幅培養の間のＭＴ遺伝子のアップレギュレーションはそれらのプロモーターの脱メチル化の結果ではなかった。対照的に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増幅培養の間に抑制の進行を示した僅かな遺伝子の中で、ＴＣＬ１Ａのプロモーターは培養の間にメチル化を回復した（図８Ａ、図８Ｂ、図１０Ｃ）。さらに、ＩＧ−ＤＭＲ、Ｈ１９及びＩＧＦ１ＲのＩＣＲは、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の維持増幅培養の間、わずかに脱メチル化したが（図９Ｅ）、Ｈ１９遺伝子を除いて、それらの制御下にあるインプリントされた遺伝子の発現に影響しないようであった（図１０Ｄ）。
　増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞における全体的なＤＮＡメチル化プロファイルの制御のメカニズムを検討するために、それらの細胞におけるＤＮＡメチル化／脱メチル化に関連している遺伝子の発現動態を最初に検討した。デノボＤＮＡメチルトランスファラーゼ（ＤＮＭＴ）の間で、ＤＮＭＴ３Ａは、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のみならず、ｈｉＰＳＣ、ｉＭｅＬＣ及びｘｒ卵巣中の
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５）］を示す一方で、ＤＮＭＴ３ＢはｈＰＧＣＬＣ運命決定により急速な減少を示し、増幅培養の中とｘｒ卵巣の中の両方のＢＴ＋ＡＧ＋細胞において低い発現レベル
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
な発現を示さなかった（図５Ｂ）。ＤＮＡメチル化維持のための遺伝子の間で、解析された
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
焦点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｃｉ）へＤＮＭＴ１をリクルートするための鍵となるタンパク質をコードするＵＨＲＦ１は（Ｂｏｓｔｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７　Ｓｅｐ　２１；３１７（５８４５）：１７６０−４．，Ｓｈａｒｉｆ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００７　Ｄｅｃ　６；４５０（７１７１）：９０８−１２）、ｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞において進行的にダウンレギュレートされたが（図５Ｂ）（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））、増幅培養の期間に亘り、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞において、ａｇ７におけるｄ６　ｈＰＧＣＬＣ／ＢＴ＋ＡＧ＋
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
伝子の中で、ＴＥＴ１は実質的なレベルで発現したが、一方で、ＴＥＴ２とＴＥＴ３は解析した全ての細胞型の中で非常に低いレベルでの発現しか示さなかった（図５Ｂ）。これらの知見は、ＵＨＲＦ１発現レベルの維持は、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞をｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞から区別する鍵となる特性であり、増幅培養中のにＢＴ＋ＡＧ＋細胞において全体的な５ｍＣレベルの維持の基になっているかもしれないことを示唆している。この点をさらに調べるべく、ＩＦ解析により維持増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞におけるＤＮＭＴ１及びＵＨＲＦ１タンパク質の発現を解析した。図９Ｆに示されるように、ｈｉＰＳＣは、核内でＤＮＭＴ１及びＵＨＲＦ１の両方を、強くかつ比較的均一に発現していた。いくつかの核では、ＤＮＭＴ１は明確な点状の局在性を示し、複製焦点に対応しているだろう（図９Ｆ）（Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０００　Ａｐｒ　１７；１４９（２）：２７１−８０．，Ｏ’Ｋｅｅｆｅ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９９２　Ｍａｒ；１１６（５）：１０９５−１１０）。一方、ｃ６６におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はＤＮＭＴ１を強く発現してはいるが、その点状の核局在化は検出されなかった。これはおそらく、ｈｉＰＳＣと比較して、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞の増殖動態がより遅いことによると考えられる。ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、ＵＨＲＦ１をいくぶん弱く、不均一に発現していた。即ち、それらの約半分は核内にＵＨＲＦ１を発現していたが、その他はＵＨＲＦ１を少ししか発現していなかった（図９Ｆ）ｈｉＰＳＣ及びｃ６６のＢＴ＋ＡＧ＋細胞のいずれにおいても、細胞質内にＵＨＲＦ１は検出されなかった（図９Ｆ）。これらの知見から、低レベルかついくぶん不均一ではあるものの、維持増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞はＵＨＲＦ１を発現していると結論づけられた。
　次に、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞増幅培養の間のみならず、ｍＰＧＣＬＣ誘導と増幅を含む他の関連した環境中における非ＣｐＧサイト（ＣｐＨ：ＣｐＡ，ＣｐＴ及びＣｐＣ）のメチル化レベルの動態を解析した。なぜならば、そのようなメチル化レベルは所定の細胞中のデノボＤＮＭＴ活性のための適切な指標として働くからである（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０００　Ｍａｙ　９；９７（１０）：５２３７−４２；Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２０１５　Ｍａｙ；４７（５）：４６９−７８．）。過去の知見と一致して（Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．２０１２　Ｄｅｃ　２８；４８（６）：８４９−６２；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．２０１３　Ａｐｒ；２３（４）：６１６−２７．；Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５　Ａｕｇ　２０；１６（１）：６２４．）、ゲノムワイドのＣｐＧメチル化の消去の間の胎生期（Ｅ）１０．５とＥ１３．５のマウス生殖細胞は、低いＣｐＨメチル化レベル（平均で＜１％）を示し、その後に、雌ではない雄の生殖細胞は、特にＥ１６．５におけるメチルＣｐＡ（ｍＣｐＡ）（平均で＞２．５％）の場合（それはゲノムワイドなアンドロゲン性ＣｐＧメチル化プロファイルの獲得を伴う（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３（上述），Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述），Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２（上述）））には、高いＣｐＨメチル化レベルを獲得することが、再解析により明らかとなった（図９Ｇ）。ｍＰＧＣＬＣ誘導／増幅システムにおいて、ｍＥＳＣは、デノボＤＮＭＴ活性が抑制される（Ｈａｂｉｂｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１３　Ｓｅｐ　５；１３（３）：３６０−９．，Ｙａｍａｊｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１３　Ｍａｒ　７；１２（３）：３６８−８２，Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））と知られている「基底状態（ｇｒｏｕｎｄ　ｓｔａｔｅ）」条件下で培養され、低いＣｐＧメチル化レベル（平均で＜１％）を示し、一方、デノボＤＮＭＴ活性をアップレギュレートするＥｐｉＬＣは（Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述），Ｙａｍａｊｉ，ｅｔ　ａｌ．，２０１３（上述））、実質的にｍＣｐＡを実質的に上昇させた（平均で~２％）（図９Ｈ）。ｍＰＧＣＬＣ（その中でデノボＤＮＭＴの発現は強く抑制されている（Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１（上述），Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７（上述），Ｓｈｉｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述）））中のｍＣｐＡレベルは、急速に基底レベルに低下した（平均で＜１％）（図９Ｈ）。これらの知見は、デノボＤＮＭＴ活性のための指標としてｍＣｐＨが適していることを実証する。ＥｐｉＬＣと相同的な遺伝子発現特性を有すると知られている（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６（上述））ｈｉＰＳＣは、高いｍＣｐＡレベル（平均で~２％）を示し、それはｉＭｅＬＣでは僅かに低減し（平均で~１．５％）、その後、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞、及びｘｒ卵巣中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞で、基底レベルまでさらに低減した（平均で＜１％）（図９Ｉ）。まとめると、これらの知見は、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞はデノボＤＮＭＴ活性の低減を示すが、維持型ＤＮＭＴ活性を保持し、それが増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の早期ｈＰＧＣ（ＬＣ）のゲノムワイド５ｍＣプロファイルが保存される原因となるという考えを支持する。
増幅されたｈＰＧＣＬＣはエピジェネティックなリプログラミングを受けてｘｒ卵巣中で卵原細胞／原生殖細胞に分化する
　次に、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞はヒト生殖細胞の様式で分化能を有するかどうかを評価した。この目的のために、５８５Ｂ１　ＢＴＡＧ　ｈｉＰＳＣをｈＰＧＣＬＣに誘導し、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣを３０日間培養し、ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞（５，０００細胞）とＥ１２．５マウス胚性卵巣体細胞（７５，０００細胞）を用いてｘｒ卵巣を作製した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））（図１１Ａ）。Ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞を有するｘｒ卵巣は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣを有するｘｒ卵巣と類似した様式で発達し（図１１Ｂ）、ＦＡＣＳ解析により、生存しているＢＴ＋ＡＧ＋細胞の数はｘｒ卵巣の間で変動した［ｘｒ卵巣当たり：ａｇ３５：~１４９から９８４；ｃ３０ａｇ３５：~１８９から２２６７；ａｇ７７：~０から４９４２；ｃ３０ａｇ７７：~１５から７３２２］ものの、ｘｒ卵巣中でＣ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞は、ａｇ３５とａｇ７７の両方でｄ６　ｈＰＧＣＬＣよりも、ＢＴ＋ＡＧ＋細胞としてより良い生存／増殖の傾向を示すことが明らかとなった（図１１Ｃ）。その結果、ａｇ７７におけるＩＦ解析は、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のＡＧ＋細胞、ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来のＡＧ＋細胞は、僅かにしかＤＡＰＩ染色されないとの特徴を示し、ＳＯＸ１７、ＴＦＡＰ２Ｃ及びヒトミトコンドリア抗原についてポシティブであり、ＦＯＸＬ２＋マウス顆粒膜細胞により線引きされる（図１１Ｄ）ことを示した。重要なことに、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のＡＧ＋細胞と類似して、そのようなｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来のＡＧ＋細胞の多くは、卵原細胞／原生殖細胞の鍵となるマーカーであるＤＡＺＬとＤＤＸ４についてポシティブとなることが見出された（図１１Ｄ）（Ｇｋｏｕｎｔｅｌａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６１（６）：１４２５−３６．；Ｇｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６１（６）：１４３７−５２；Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１７　Ｊｕｎ　１；２０（６）：８５８−８７３．ｅ４；Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述）；Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））。
　ｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来のＢＴ＋ＡＧ＋細胞の遺伝子発現をａｇ７とａｇ３５とａｇ７７（ｃ３０ａｇ７とｃ３０ａｇ３５とｃ３０ａｇ７７細胞）に、ｑＰＣＲ（ｃ３０ａｇ７／ｃ３０ａｇ３５／ｃ３０ａｇ７７）又はＲＮＡ−ｓｅｑ解析（ｃ３０ａｇ３５／ｃ３０ａｇ７７）により測定した。図１１Ｅに示されるように、そのような細胞はＰＲＤＭ１，ＴＦＡＰ２Ｃ，ＳＯＸ１７，ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧを含むｈＰＧＣのマーカーを発現し続け、６ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞のように、ＵＨＲＦ１が次第に抑制された一方で、ＤＮＭＴ１は維持された。しかしながら、興味深いことに、ｄ６ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞と比較して、それらはＤＰＰＡ３，ＰＲＡＭＥ，ＰＩＷＩＬ２，ＤＡＺＬ及びＤＤＸ４を含む卵原細胞／原生殖細胞に関する遺伝子をより早期にアップレギュレートしていた：それらはこれらの遺伝子をａｇ７にもアップレギュレートしている一方で、これらの遺伝子の発現レベルに関して、ｄ６ｈＰＧＣＬＣ由来の細胞はｃ３０　ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来の細胞にａｇ７７までに追いついた（図１１Ｅ）。注目すべきは、ｄ６ｈＰＧＣＬＣと比較して、増殖培養におけるＢＴ＋ＡＧ＋細胞はＤＰＰＡ３，ＰＩＷＩＬ２及びＰＲＡＭＥに対するプロモータの５ｍＣレベルを実質的な程度で低減させ（ＤＰＰＡ３；~５２％、ＰＲＡＭＥ；~１９％、ＰＩＷＩＬ２；~１６％）、ＤＡＺＬ及びＤＤＸ４ではゲノムワイドなアベレージ（~１０％）で低減させた（図１１Ｆ）。実際、クラスター３遺伝子のプロモータ（これらはｄ６ｈＰＧＣＬＣにおいて高いレベルでメチル化されていた）は、増幅培養の始めの１０日間の間、実質的な脱メチル化を示した（図１１Ｇ、図１２Ａ）。
　関連する細胞型のトランスクリプトームの教師なし階層クラスタリングは増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞とは異なり、ｃ３０ａｇ３５とｃ３０ａｇ７７細胞は両方とも卵原細胞／原生殖細胞様細胞のクラスターに分類され、ｃ３０ａｇ３５とｃ３０ａｇ７７細胞はそれぞれ、早期と後期卵原細胞／原生殖細胞様細胞に分類され（図１２Ｂ）、ｈＰＧＣ（ＬＣ）から卵原細胞／原生殖細胞への発達の進行を特徴付ける遺伝子セットのＰＣＡと発現プロファイルは、一貫した結果を提供した（図１１Ｈ）。ｑＰＣＲ解析（図１１Ｅ）と一致して、ｄ６　ｈＰＧＣＬＣ由来のａｇ３５とａｇ７７細胞（ａｇ３５とａｇ７７細胞）と比較して、ｃ３０ａｇ３５とｃ３０ａｇ７７細胞はより進行した性質を示し、例えばそれらは、より顕著な様式でクラスター２の遺伝子をダウンレギュレートし、クラスター３の遺伝子をアップレギュレートした（図１１Ｉ、図１１Ｊ）。これらの知見は、ｄ６ｈＰＧＣＬＣと比較して、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞が、ｘｒ卵巣により提供されたシグナル／環境に応答してより迅速に卵原細胞／原生殖細胞様の細胞へ分化する、発生的により進んだ特性を備えているとの見解と一致する。
　ｃ３０ａｇ７７細胞の全ゲノムバイサルファイトシークエンス解析を行ったところ、それらは実質的なゲノムワイドなＤＮＡメチル化を受け、~１５％のレベルのゲノムワイド５ｍＣレベルに達することが明らかとなり（図１１Ｋ）、それは発達の７から１０週目におけるヒト卵原細胞／原生殖細胞（Ｇｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述），Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述））及びａｇ１２０細胞（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８（上述））と同等の値である。従ってｃ３０ａｇ７７細胞は、プロモーター、エキソン、イントロン、遺伝子間領域、代表的な反復エレメント、非プロモーターＣＧＩ及びＩＣＲ（図１１Ｌ、図１１Ｍ、図１２Ｃ）を含むゲノム全体から５ｍＣを消去し、ヒト生殖細胞系列のエピジェネティックな「ナイーブ」状態を獲得した。我々は、ａｇ７７細胞、ｃ３０ａｇ７７細胞、およびａｇ１２０ＡＧ＋ＶＴ＋細胞のＤＮＡ脱メチル化（５ｍＣ＞２０％）を回避する「エスケープ」を、ｉｎ　ｖｉｖｏのヒト生殖細胞中のそれと比較して分析し（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５（上述））、エスケープの大部分がこれらの細胞間でオーバーラップしており、それらの数はこれらの細胞型の残存する５ｍＣレベルと相関していることを見出した（図１２Ｄ）。このことは、ｘｒ卵巣のｄ６ｈＰＧＣＬＣ／ｃ３０ＢＴ＋ＡＧ＋細胞由来細胞がインビボでのヒト生殖細胞と同様の様式でゲノム全体のＤＮＡメチル化を消去することを示している。したがって、エスケープは、ＳＶＡ、ＥＲＶＫ、ＥＲＶ１などの反復エレメントの周囲で濃縮されたが、他の主要なゲノムエレメントの周囲では枯渇した（図１２Ｄ）。合わせて考えると、これらの知見は、増幅培養中のＢＴ＋ＡＧ＋細胞はヒト生殖細胞として分化する十分な能力を有し、従って、本発明で開発された培養システムは正真正銘のｈＰＧＣとして、インビトロでｈＰＧＣＬＣを増殖させることを明らかにしている。
実施例２　培養系評価法の確立
　５８５Ｂ１−８６８ＢＴＡＧ（ＢＬＩＭＰ１−ｔｄＴｏｍａｔｏとＡＰ２γ−ＥＧＦＰ）ｉＰＳ細胞由来の増殖ヒトＰＧＣＬＣのＦＡＣＳ解析の結果について、さらに詳細な解析を行った。結果を図１３に示す。そのＦＡＣＳ解析ではＤＲＡＱ７染色により死細胞を除いた集団について、ヒト細胞特異的な細胞表面抗原ＴＲＡ−１−８５の発現を解析した。ＴＲＡ−１−８５陽性細胞集団をＢＴＡＧの発現パターンからＢＴＡＧ二重陽性の集団とそれ以外の集団（以降ＴＲＡ−１−８５陽性ＢＴＡＧ陰性細胞集団と呼ぶ）を定義した。すると、ＴＲＡ−１−８５陰性細胞集団とＴＲＡ−１−８５陽性ＢＴＡＧ陰性細胞集団は相互排他的な側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ，ＳＳＣ）と前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ，ＦＳＣ）のパターン示すことが明らかになった。ＴＲＡ−１−８５の発現に関わらず、全てのＢＴＡＧ陰性細胞集団をＳＳＣとＦＳＣについてプロットしたとき、比較的小さなＳＳＣ値と幅広いＦＳＣ値を持つものがＴＲＡ−１−８５陽性細胞に相当する。このことから、比較的小さなＳＳＣ値と幅広いＦＳＣ値を持つＢＴＡＧ陰性細胞をヒトＰＧＣＬＣに由来する脱分化細胞と考えた。脱分化細胞数に対する増殖ＰＧＣＬＣ細胞数の比の対数変換値をｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅと定義し、培養系の状態を評価する指標とした（式１）。ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅが正の値をとれば増殖ＰＧＣＬＣの細胞数が優位である事を示す。
　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅ＝ｌｏｇ２（ｈＰＧＣマーカ一陽性細胞数／脱分化した細胞数）（式１）
ここで、ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＰＧＣＬＣｓは増殖培養系におけるＰＧＣＬＣマーカー陽性細胞（ｅ．ｇ．ＢＴ（＋）ＡＧ（＋）ｃｅｌｌｓ）、ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓはＰＧＣＬＣマーカー陰性で比較的小さなＳＳＣ値と幅広いＦＳＣ値を持つ細胞である。
実施例３　ＷＮＴシグナル伝達経路の阻害によるＰＧＣＬＣの脱分化抑制
　５８５Ｂ１−８６８ＢＴＡＧ　ｉＰＳＣに由来する分化誘導６日目のＰＧＣＬＣｓを用いて増殖培養を行った。その際、実施例１にて採用した条件に加え、各濃度のＩＷＲ１、２．５μＭのＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、Ｗｎｔ−Ｃ５９及びＩＷＰ２、あるいは溶媒のＤＭＳＯを添加した条件で３０日間培養を行なった。１０日おきにＦＡＣＳによる継代と細胞数の測定を行い、増殖曲線を作成した。また、各培養日数においてｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅを算出した。結果を図１４Ａ~図１４Ｃに示す。ＩＷＲ１はｈＰＧＣＬＣの増殖に影響を与えず（図１４Ａ）、脱分化した細胞の出現を有意に抑制した（図１４Ｂ）。ＸＡＶ９３９も、ＩＷＲ１と同様の傾向を示した（図１４Ｃ）。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明の方法によれば、ｈＰＧＣＬＣを１２０日以上培養し、１００万倍以上増幅させることが可能である。よって、これまで細胞数の問題から適用が困難であった様々な実験が可能となると共に、ヒト生殖細胞系列のさらなる分化に重要なサイトカインなどの液性因子／遺伝子やそれらの機能を検証することが可能となる。

Claims (20)

  1. 　ヒト始原生殖細胞（ｈＰＧＣ）又はヒト多能性幹細胞由来のヒト始原生殖細胞様細胞（ｈＰＧＣＬＣ）の維持増幅方法であって、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、（ｉ）フォルスコリン又はホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害薬、並びに（ｉｉ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１以上のサイトカインの存在下で培養することを含む、方法。
  2. 　前記（ｉ）の薬剤がフォルスコリンである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記サイトカインが、ＬＩＦ及びＥＧＦの組み合わせ、ｂＦＧＦ単独、あるいはＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　ｈＰＧＣＬＣが、ヒト初期中胚葉様細胞（ｈｉＭｅＬＣ）を経由して誘導されたものである、請求項１~３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　ｈＰＧＣＬＣが、ｈｉＭｅＬＣを、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、並びに、任意で幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインの存在下で、５~８日間培養することにより誘導される、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記培養において、ｈＰＧＣマーカー陽性を指標としてｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを選別し、継代培養することを含む、請求項１~５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　ｈＰＧＣマーカーがＢＬＩＭＰ１及び／もしくはＴＦＡＰ２Ｃ、又はＩＮＴＥＧＲＩＮα６及びＥｐＣＡＭである、請求項６に記載の方法。
  8. 　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを少なくとも３０日間培養する、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記培養において、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をさらに含む条件下で培養することを含む、請求項１~８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬がβ−カテニンの分解を促進、及び／又は核内移行を阻害する物質である、請求項９に記載の方法。
  11. 　請求項１~１０のいずれか１項に記載の方法でｈＰＧＣ及び／又はｈＰＧＣＬＣを維持増幅する工程を含む、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを含む細胞集団を製造する方法。
  12. 　請求項１~１０のいずれか１項に記載の方法により得られる、増幅されたｈＰＧＣ集団又はｈＰＧＣＬＣ集団。
  13. 　（ａ）フォルスコリン又はＰＤＥ４阻害薬、並びに（ｂ）ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及びＥＧＦからなる群より選択される１以上のサイトカインを含んでなる、ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持増幅用試薬キット。
  14. 　前記（ａ）の薬剤がフォルスコリンであり、前記（ｂ）のサイトカインがＬＩＦ及びＥＧＦとの組み合わせ、ｂＦＧＦ単独、又はＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせである、請求項１３に記載の試薬キット。
  15. 　グルコース濃度１ｇ／Ｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の試薬キット。
  16. 　Ｗｎｔシグナル伝達阻害薬をさらに含む、請求項１３~１５のいずれか１項に記載の試薬キット。
  17. 　ＩＮＴＥＧＲＩＮα６に対する抗体及び／又はＥｐＣＡＭに対する抗体をさらに含む、請求項１３~１６のいずれか１項に記載の試薬キット。
  18. 　請求項１２に記載のｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣを、卵巣体細胞と凝集培養することを含む、ヒト卵原細胞／原生殖細胞様細胞の製造方法。
  19. 　ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持培養の評価方法であって、
    （１）ｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣをフィーダー細胞上、所定の条件下で培養する工程、
    （２）（１）で得られた細胞集団から生細胞を選別する工程、
    （３）（２）で得られた生細胞をｈＰＧＣマーカー陽性細胞とそれ以外の細胞とに選別する工程、
    （４）（３）で得られたｈＰＧＣマーカー陽性細胞以外の細胞をフローサイトメトリーに供し、ＦＳＣ／ＳＳＣの二次元プロットによりｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣから脱分化した細胞とフィーダー細胞とを識別する工程、及び
    （５）（３）で得られるｈＰＧＣマーカー陽性細胞数と（４）で得られる脱分化した細胞数とに基づいて、前記所定の条件におけるｈＰＧＣ又はｈＰＧＣＬＣの維持効率を評価する工程
    を含む、方法。
  20. 　ｈＰＧＣマーカー陽性細胞がＢＬＩＭＰ１及びＴＦＡＰ２Ｃ二重陽性細胞である、請求項１９に記載の方法。
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