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WO2021235775A1 - 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 - Google Patents

신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 Download PDF

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WO2021235775A1
WO2021235775A1 PCT/KR2021/006033 KR2021006033W WO2021235775A1 WO 2021235775 A1 WO2021235775 A1 WO 2021235775A1 KR 2021006033 W KR2021006033 W KR 2021006033W WO 2021235775 A1 WO2021235775 A1 WO 2021235775A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
seq
leucine
acid sequence
microorganism
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2021/006033
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English (en)
French (fr)
Inventor
이하윤
김주은
심지현
이지혜
이성근
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2022562152A priority patent/JP7584536B2/ja
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Priority to US17/760,462 priority patent/US20230088135A1/en
Priority to CN202180027726.2A priority patent/CN115516087B/zh
Priority to AU2021276867A priority patent/AU2021276867B2/en
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Definitions

  • the present application relates to a novel variant polypeptide having isopropylmalate synthase activity; a polynucleotide encoding it; a vector comprising the polynucleotide; a microorganism comprising the variant polypeptide, the polynucleotide, the vector, or a combination thereof; And it relates to a method for producing L-leucine by culturing the microorganism.
  • L-amino acids are industrially produced by fermentation using coryneform bacteria or amino acid-producing bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae having L-amino acid production ability.
  • amino acid-producing bacteria strains isolated from nature or artificial mutants of the strains, or recombinants in which L-amino acid biosynthesis enzyme is enhanced by genetic recombination are used in order to improve productivity.
  • L-leucine is an essential amino acid and is an expensive amino acid widely used in medicine, food, feed additives, and industrial drugs, and is mainly produced using microorganisms. Fermentation production of L-leucine is mainly made through microorganisms of the genus Escherichia or microorganisms of the genus Corynebacterium, and it is known that 2-ketoisocaproate is biosynthesized as a precursor through several steps from pyruvic acid. have. However, it is difficult to industrially mass-produce L-leucine because the enzymes involved in L-leucine biosynthesis have feedback inhibition by L-leucine or a derivative thereof, which is the final product.
  • the inventors of the present application completed the present invention by confirming that the mutant strain obtained by mutating a specific position of isopropylmalate synthase can be used for high-yield L-leucine production by optimizing the enzyme activity.
  • Patent Document 1 US 2018-0251772 A1
  • the present application provides a variant polypeptide having isopropylmalate synthase activity in which the 247th proline amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid residue other than proline.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the present application provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present application provides a microorganism comprising at least one selected from the group consisting of the variant polypeptide, the polynucleotide, and a vector including the polynucleotide.
  • the present application provides a method for producing L-leucine comprising the step of culturing the microorganism in a medium.
  • the present application relates to the variant polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, a vector comprising the polynucleotide, and the microorganism (eg, a variant polypeptide of the present application, a polynucleotide of the present application, and/or It provides a composition for producing L-leucine, comprising at least one selected from the group consisting of microorganisms (recombinant cells)) comprising the vector of the present application.
  • the present application relates to the variant polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, a vector comprising the polynucleotide, and the microorganism (eg, a variant polypeptide of the present application, a polynucleotide of the present application, and/or Provided is a use for production of one or more L-leucine selected from the group consisting of microorganisms (recombinant cells) comprising the vector of the present application.
  • the microorganism eg, a variant polypeptide of the present application, a polynucleotide of the present application, and/or Provided is a use for production of one or more L-leucine selected from the group consisting of microorganisms (recombinant cells) comprising the vector of the present application.
  • One aspect of the present application is isopropyl malate synthase activity in which the amino acid residue at the 247th or corresponding position from the N-terminus in the amino acid sequence of the isopropylmalate synthase protein of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid residue It can provide a variant polypeptide (or variant) having a.
  • isopropylmalate synthase isopropylmalate synthase, 2-isopropylmalate synthase, ⁇ -isopropylmalate synthase
  • 2-ketoisovalerate (2-ketoisovalerate, 3-methyl-2-oxobutanoate
  • the isopropyl malate synthase may be included regardless of the origin of the microorganism as long as it is an enzyme having the conversion activity, for example, it may be an enzyme derived from a microorganism of the genus Corynebacterium. .
  • the isopropyl malate synthase may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and at least 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 94% or more, 96% or more, 98% or more , or 99% or more, 99.5% or more, or 99.8% or more of homology as a polypeptide, and if it is an enzyme having the same or corresponding conversion activity as isopropylmalate synthase, some sequences in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted, modified , Polypeptides having a substituted or added amino acid sequence may also be included within the scope of the present application as the isopropylmalate synthase.
  • the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO If it has the same or corresponding activity as a polypeptide (or protein) consisting of can be used
  • a polypeptide having the same or corresponding activity as a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' may belong to a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1'.
  • amino acid sequence of the isopropyl malate synthase and the nucleotide sequence of the gene encoding isopropyl malate synthase are known in the art such as the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the Japan DNA Data Bank (DDBJ). can be easily obtained from NCBI.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • a polynucleotide or polypeptide comprising a specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence means that the polynucleotide or polypeptide consists of, or consists essentially of, the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence. It may mean that, in the range of maintaining the original function and / or desired function of the polynucleotide or polypeptide, mutation (deletion, substitution, modification, and / or addition) can be interpreted as including the added sequence (or not excluding the mutation).
  • reference to a polynucleotide or polypeptide "comprising a specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence” means that the polynucleotide or polypeptide (i) consists of or contains the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence.
  • nucleic acid sequence or amino acid sequence having homology may mean to retain the original function and/or the desired function.
  • amino acid sequence of isopropylmalate synthase derived from wild-type Corynebacterium glutamicum (eg, ATCC13032) is shown in SEQ ID NO: 1, isopropylmalate synthase derived from wild-type strain
  • SEQ ID NO: 2 The nucleotide sequence of the leuA gene encoding is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Isopropyl malate synthase is shown to consist of 616 amino acids in SEQ ID NO: 1, but according to the literature, it is known that the translation initiation codon is written after 35 to consist of 581 amino acids.
  • the amino acid sequence of propylmalate synthase is shown in SEQ ID NO: 16.
  • Isopropylmalate synthase consisting of 581 amino acids may be included within the scope of the present application as the isopropylmalate synthase, and in this case, the 247th position may be interpreted as the 212th position and included in the scope of the present application. .
  • the 558th (or corresponding position) arginine amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid residue other than arginine,
  • the 561st (or corresponding position) glycine amino acid residue may be substituted with an amino acid residue other than glycine, or may be further mutated by both.
  • the 558th position is interpreted as the 523th position
  • the 561th position is interpreted as the 526th position, which will be included in the scope of the present application.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art. For example, homology can be determined by aligning sequence information and using readily available computer programs to determine sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity and similarity. It may be determined by directly aligning parameters such as The computer program may be BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), and the like.
  • homology between polynucleotides can be determined by hybridizing polynucleotides under conditions of forming stable double strands between homologous regions and then digesting them with a single-stranded-specific nuclease to determine the size of the digested fragment.
  • the 247th (or corresponding position) proline amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid residue other than proline, a mutation having isopropylmalate synthase activity type polypeptides can be provided.
  • Another aspect may provide a variant polypeptide having isopropyl synthase activity in which the 212th proline amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is substituted with an amino acid residue other than proline.
  • ' ⁇ th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: ⁇ ' may be used in the same meaning as 'from the N-terminus of the polypeptide consisting of (or consisting of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: ⁇ '.
  • Amino acids other than proline may include arginine, alanine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, tryptophan, methionine, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, lysine, histidine, aspartic acid and glutamic acid.
  • the variant polypeptide may be one in which the 247th (or the corresponding position) proline in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine.
  • the variant polypeptide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Variant polypeptide is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 94% or more, 96 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16)
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 247 (position 212 in the case of SEQ ID NO: 16) in the amino acid sequence of a polypeptide having at least %, at least 98%, or at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.8% homology may be substituted with another amino acid residue.
  • the amino acid sequence of the 247th proline (or the 212th proline in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16) or a corresponding position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, SEQ ID NO: 1 (Or SEQ ID NO: 16) than the polypeptide comprising the amino acid sequence L- leucine production activity may be increased.
  • the variant polypeptide is isopropylmalate synthase may have activity.
  • the other amino acid residue may refer to an amino acid residue other than the amino acid (eg, proline) that was present at the position (the 247th or a position corresponding to the 247th position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) before being substituted.
  • an amino acid residue other than the amino acid eg, proline
  • the amino acid residue at the 247th (or 212th) proline or a corresponding position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) is substituted with another amino acid residue, derived from a wild-type strain L-leucine production activity may be increased compared to isopropyl malate synthase (eg, isopropyl malate synthase comprising (or consisting of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16).
  • the amino acid residue at the 247th (or 212th) proline or a corresponding position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) is substituted with another amino acid residue, derived from a wild-type strain
  • the enzymatic activity of isopropyl malate synthase may be increased compared to that of isopropyl malate synthase (eg, isopropyl malate synthase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16)).
  • isopropyl malate synthase means an increase in conversion activity to isopropyl malate. It may have a higher level of conversion activity to isopropylmalate compared to a polypeptide having the activity of isopropylmalate synthase comprising the sequence.
  • increasing activity may be used in combination with “enhancing activity”.
  • isopropylmalate is one of the precursors of L-leucine
  • the activity of isopropylmalate synthase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) when using the variant polypeptide according to one embodiment is reduced.
  • the conversion activity to isopropyl malate may be directly confirmed by measuring the level of isopropyl malate produced, or may be indirectly confirmed by measuring the level of CoA produced.
  • the enzymatic activity of isopropylmalate synthase can be measured by known methods and is described, for example, in Kohlhaw et al. (Methods in Enzymology 166:423-9 (1988))], and DTNB (5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), Elman
  • the activity of the isopropylmalate synthase enzyme can be measured by measuring the change in absorbance at 412 nm due to thionitrobenzoate (TNB) formed from (Ellman's reagent).
  • the amino acid sequence of the 247th (or 212th) proline or a corresponding position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) is substituted with another amino acid, derived from a wild-type strain It is possible to reduce feedback inhibition by L-leucine and/or its derivatives than isopropylmalate synthase (eg, isopropylmalate synthase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • feedback inhibition means that the end product of an enzyme system inhibits a reaction in an initial stage of the enzyme system.
  • the feedback inhibition may be that L-leucine and/or a derivative thereof inhibits the activity of isopropylmalate synthase, which mediates the first step of its biosynthetic pathway. Therefore, when the feedback inhibition of isopropyl malate synthase is reduced (or released), the productivity of L-leucine can be increased compared to the case where it is not.
  • the term "derivative” may refer to compounds known to inhibit the production of L-leucine from microorganisms by inducing feedback inhibition in relation to the biosynthesis of L-leucine, which is the final product of the present invention, e.g.
  • it may include isoleucine, terleucine, norleucine, and/or cycloleucine.
  • the variant polypeptide is additionally mutated at positions other than the 247th (or 212th) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) to (1) increase L-leucine production activity; (2) increased enzymatic activity of isopropylmalate synthase; And (3) one or more effects selected from the group consisting of a reduction in feedback inhibition by L-leucine and/or derivatives thereof may be synergistically increased.
  • the variant polypeptide (1) increase L-leucine production activity; (2) increased enzymatic activity of isopropylmalate synthase; and (3) L-leucine and/or a derivative thereof may further include a mutation capable of exhibiting at least one effect selected from the group consisting of reduced feedback inhibition.
  • the variant polypeptide is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 the 558th (or corresponding position) arginine amino acid residue is substituted with an amino acid residue other than arginine;
  • the 561st (or corresponding position) glycine amino acid residue may be substituted with an amino acid residue other than glycine, or may be further mutated by both.
  • the variant polypeptide is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 the 523th (or corresponding position) arginine amino acid residue is substituted with an amino acid residue other than arginine;
  • the 526th (or corresponding position) glycine amino acid residue may be substituted with an amino acid residue other than glycine, or may be further mutated by both.
  • Amino acids other than arginine include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, lysine, histidine, aspartic acid and glutamic acid
  • the amino acids other than glycine are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, arginine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, lysine, histidine, aspartic acid and It may include glutamic acid, but is not limited thereto.
  • the amino acid other than arginine may be histidine.
  • the amino acid other than glycine may be aspartic acid.
  • the variant polypeptide is the variant polypeptide
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 the 558th arginine amino acid residue is substituted with a histidine amino acid residue
  • the 561th glycine amino acid residue is substituted with an aspartic acid amino acid residue, or
  • the variant polypeptide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • isopropylmalate synthase derived from a wild-type strain eg, isopropylmalate synthase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 16 16
  • One or more effects selected from the group consisting of the following (1) to (3) may be increased:
  • amino acids at positions 247, 558, and/or 561 are different
  • amino acids substituted with amino acids of the mutant polypeptide may be one in which one or more effects selected from the group consisting of the following (1) to (3) are synergistically increased:
  • polynucleotide is a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain form by covalent bonds, and more specifically, a polynucleotide encoding the variant. nucleotide fragments.
  • the variant polypeptide is the same as described above.
  • the polynucleotide may include, without limitation, a polynucleotide sequence encoding a variant polypeptide of the present application.
  • it may be a polynucleotide encoding a polypeptide in which the 247th (or 212th) proline amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) is substituted with an amino acid residue other than proline, or SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) and 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 94% or more, 96% or more, 98% or more, or 99%
  • the amino acid residue at the position corresponding to the 247th (or 212th) position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) is substituted with another amino acid residue
  • It may be a polynucleotide encoding a polypeptide in which a polypeptide or a sequence thereof is deleted, modified, substituted or added.
  • the polynucleotide is capable of hybridizing under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence, and SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 16) of the amino acid sequence of the 247th (or 212th) position or an amino acid at the corresponding position is substituted with another amino acid, as long as it is a probe comprising a sequence corresponding to a sequence encoding a protein variant, it may be included without limitation.
  • the "stringent conditions” refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • genes with homology 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 94% or more, 96% or more, 98% or more, or 99% Genes with homology of 99.5% or more, or 99.8% or more hybridize with each other, and genes with lower homology do not hybridize, or wash conditions of normal Southern hybridization at 60° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically at a salt concentration and temperature corresponding to 60° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, washing once, specifically 2 to 3 times Conditions can be listed (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)).
  • the probe used for the hybridization may be a part of a complementary sequence of a nucleotide sequence.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known sequence as a primer and a gene fragment containing such a nucleotide sequence as a template.
  • a gene fragment having a length of about 300 bp can be used as the probe. More specifically, in the case of using a probe having a length of about 300 bp, 50° C., 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS may be suggested as washing conditions for hybridization.
  • the polynucleotide may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, and work due to codon degeneracy Polynucleotides that can be translated into variant polypeptides according to embodiments may also be included in the scope of the present application.
  • Another aspect may provide a vector comprising the polynucleotide.
  • vector refers to any medium for cloning and/or transfer of a base into a host cell.
  • a vector may be a replicator capable of binding other DNA fragments to bring about replication of the bound fragment.
  • Replication unit refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, that is, is capable of replicating under its own control. .
  • the vector may be a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target protein can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • the vector may be a natural or recombinant plasmid, cosmid, virus, and bacteriophage, and MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, pWE15, M13 as a phage vector or a cosmid vector.
  • ⁇ EMBL3, ⁇ EMBL4, ⁇ FIXII, ⁇ DASHII, ⁇ ZAPII, ⁇ gt10, ⁇ gt11, Charon4A, and/or Charon21A may be used, and as a plasmid vector, pDC, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, and pCL may be used. , pDZ-based, and/or pET-based, and the like can be used.
  • pDC pDC2, pDCM2, pCR2.1, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 and/or pCC1BAC vectors may be used.
  • Another aspect may provide a microorganism (or recombinant cell) comprising at least one selected from the group consisting of the variant polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, and a vector comprising the polynucleotide.
  • variant polypeptides, polynucleotides and vectors are as described above.
  • the microorganism may additionally include a mutation to increase L-leucine production, and the location of the mutation and/or the type of gene to be mutated is such that L-leucine production is increased. may be included.
  • the microorganism may additionally include a mutation that enhances the activity of an enzyme involved in L-leucine biosynthesis. Enzyme activity is enhanced as described above.
  • the microorganism may be used without limitation as long as it is a transformable cell.
  • the microorganism may have L-leucine-producing ability.
  • the microorganism may have L-leucine-producing ability that the cells before recombination, the parent strain, and/or the wild-type strain do not have, or the L-leucine-producing ability may be more improved.
  • the amino acid sequence corresponding to isopropylmalate synthase is mutated so that its activity is increased compared to the cell before recombination, the parent strain, and/or the wild-type strain, or L-leucine and derivatives thereof It may be that feedback inhibition is released, or both an increase in enzyme activity and a cancellation of feedback inhibition.
  • the microorganism may be one in which the polynucleotide according to one embodiment is integrated into a chromosome, for example, the polynucleotide according to one embodiment is a native leuA gene (isopropyl) at a gene site in the chromosome. for the gene encoding malate synthase) or integrated into an additional gene site.
  • the polynucleotide according to one embodiment is integrated into a chromosome
  • the polynucleotide according to one embodiment is a native leuA gene (isopropyl) at a gene site in the chromosome. for the gene encoding malate synthase) or integrated into an additional gene site.
  • having L-leucine-producing ability refers to a cell and/or a microorganism having a leucine-producing ability naturally, or a microorganism to which a leucine-producing ability is imparted to a cell and/or a microorganism having no leucine-producing ability.
  • a microorganism of the genus Corynebacterium having L-leucine-producing ability is a native microorganism itself or an external gene related to a leucine production mechanism is inserted, or the activity of an intrinsic gene is enhanced or inactivated to improve L-leucine-producing ability. It means microorganisms of the genus Corynebacterium that have
  • the microorganism may be a Corynebacterium sp. microorganism.
  • the Corynebacterium genus microorganism is Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Corynebacterium acetoacidophilum ( Corynebacterium acetoacidophilum ), Corynebacterium aceto Glutamicum ( Corynebacterium acetoglutamicum ), Corynebacterium alkanolyticum ( Corynebacterium alkanolyticum ), Corynebacterium callunae ( Corynebacterium callunae ), Corynebacterium lilium ( Corynebacterium lilium ), Corynebacterium melase and the like (Corynebacterium melassecola), Corynebacterium thermo amino to Ness (Corynebacterium thermoaminogenes), Corynebacterium epi when Enschede (Corynebacter
  • the microorganism may be artificially produced through transformation, or may include both naturally occurring ones.
  • the microorganism may be transformed with a polynucleotide encoding the mutant polypeptide according to an embodiment or a vector including the same.
  • transformation refers to introducing a gene or polynucleotide into a host cell so that it can be expressed in the host cell, and if the transformed gene or polynucleotide can be expressed in the host cell, the chromosome of the host cell It may include, but is not limited to, an insertion within or outside a chromosome.
  • the transformation method is included without limitation as long as it is a method of introducing a gene into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art according to the host cell.
  • electroporation calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, retroviral infection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dex
  • the tran method, the cationic liposome method, and/or the lithium acetate-DMSO method may be used, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be one in which the polynucleotide sequence according to one embodiment is integrated into a chromosome. Homologous recombination allows, in conjunction with the use of a vector according to an embodiment, the exchange of DNA fragments on a chromosome for a polynucleotide according to an embodiment that is delivered into a cell by the vector.
  • the DNA region to be exchanged containing the polynucleotide according to one example is provided with a nucleotide sequence homologous to the target site at the end; They determine the site of integration of the vector and the exchange of DNA.
  • a polynucleotide according to one embodiment may be exchanged for a native leuA gene at a native genetic site within a chromosome or may be integrated at an additional genetic site.
  • Another aspect may provide a method for producing L-leucine, comprising culturing the microorganism (or recombinant cell) in a medium.
  • the method may further comprise recovering L-leucine from the cultured medium or microorganism (or recombinant cell).
  • the culture may be made according to an appropriate medium and culture conditions known in the art, and it should meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner, and may be appropriately modified by a person skilled in the art.
  • the culture method may include, for example, batch culture, continuous culture, fed-batch culture, or a combination culture thereof, but is not limited thereto.
  • a medium for culturing microorganisms may refer to the known literature (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), but is not limited thereto.
  • the medium may contain various carbon sources, nitrogen sources and trace element components, and the recombinant cells are subjected to temperature and/or pH in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, etc. It can be cultivated under control.
  • Carbon sources that may be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and/or cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and/or coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, and/or linoleic acid; alcohols such as glycerol, and/or ethanol; organic acids such as acetic acid.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen source may also be used individually or as a mixture, but is not limited thereto.
  • Sources of phosphorus that may be used include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • the medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth, but is not limited thereto.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be included.
  • precursors suitable for the medium may be used.
  • the medium or individual components may be added batchwise or continuously by an appropriate method to the culture medium during the culturing process, but is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid may be added to the microbial culture medium in an appropriate manner to adjust the pH of the culture medium.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester during culture can suppress the formation of bubbles.
  • oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture medium may be 20 °C to 45 °C, 25 °C to 40 °C, or 30 °C to 37 °C.
  • the incubation period may be continued until a useful substance (eg, L-leucine) is obtained in a desired amount, for example, it may be 10 to 160 hours.
  • the step of isolating or recovering L-leucine from the cultured microorganism (or recombinant cell) and/or culture medium may be performed using a suitable method known in the art according to the culture method. For example, centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), and/or chromatography (eg ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion), but is not limited thereto.
  • the culture medium refers to a medium in which microorganisms (or recombinant cells) are cultured.
  • the culture in the step of separating or recovering L-leucine, may be centrifuged at low speed to remove biomass, and the obtained supernatant may be separated through ion exchange chromatography.
  • the method for producing L-leucine may further include a step of purifying L-leucine.
  • variant polypeptide of the present application a polynucleotide encoding the variant polypeptide, a vector comprising the polynucleotide, and a microorganism of the present application (eg, a variant polypeptide of the present application, a polynucleotide of the present application) , and / or microorganisms (recombinant cells) containing the vector of the present application) comprising at least one selected from the group consisting of, it is possible to provide a composition for producing L- leucine.
  • a microorganism of the present application eg, a variant polypeptide of the present application, a polynucleotide of the present application
  • microorganisms recombinant cells
  • composition of the present application may further include any suitable excipients commonly used in compositions for the production of amino acids, and these excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents, etc.
  • excipients commonly used in compositions for the production of amino acids
  • these excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents, etc.
  • the present invention is not limited thereto.
  • variant polypeptides, polynucleotides, vectors, microorganisms, media, and the like are as described in the other aspects above.
  • variant polypeptide of the present application a polynucleotide encoding the variant polypeptide, a vector comprising the polynucleotide, and/or a microorganism of the present application (eg, a variant polypeptide of the present application, the present application of polynucleotides, and/or microorganisms (recombinant cells) comprising the vectors of the present application) for use in the production of L-leucine may be provided.
  • variant polypeptides, polynucleotides, vectors, microorganisms, media, and the like are as described in the other aspects above.
  • L-leucine can be produced in high yield.
  • Example 1 Construction of a DNA library encoding a mutated isopropylmalate synthase
  • Example 1-1 leuA Create a vector containing
  • a recombinant vector containing leuA was first prepared.
  • the amplified PCR product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using TOPO Cloning Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's manual to obtain 'pCR-leuA'.
  • SEQ ID NO: sequence (5'->3') SEQ ID NO: 7 CTAATCTCGAGGTCACCCATGTCTCCTAAC
  • SEQ ID NO: 8 GGCTGGCGGCGTTTAAAACCGGTTGAT
  • a leuA mutation library was prepared using an error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit).
  • a PCR reaction was performed using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 using the pCR-leuA vector as a template under conditions in which 0 to 3 mutations per 1000 bp can occur. Specifically, as a condition in which 0 to 3 mutations per 1000bp occur, pre-heating at 94°C for 30 seconds, followed by a process of 30 seconds at 94°C and 1 minute and 30 seconds at 68°C 25 times ( cycle) was repeated to carry out the PCR reaction.
  • the PCR reaction was repeated 25 times for 50 seconds at 95°C, 50 seconds at 60°C, and 12 minutes at 68°C, followed by DpnI treatment Then, the PCR product treated with DpnI was transformed into E. coli DH5 ⁇ through heat shock and spread on LB solid medium containing kanamycin (25 mg/L). After selecting 20 transformed colonies, plasmids were obtained and nucleotide sequences were analyzed. As a result, it was confirmed that mutations were introduced at different positions at a frequency of 2 mutations/kb. About 20,000 transformed E. coli colonies were taken and plasmids were extracted, and this was named 'pTOPO-leuA-library'.
  • Example 2-1 Selection of mutant strains with increased L-leucine production
  • the pTOPO-leuA-library prepared in Example 1-2 was transformed into wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by electroporation, and the transformed strain was nutrient containing 25 mg/L of kanamycin. By plating on the medium (Table 2), 10,000 colonies of strains into which the mutant gene was inserted were selected. Each selected colony was named ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 1 to ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 10,000. Fermentation potency was evaluated in the following manner for each colony in order to confirm the colonies with increased L-leucine production among the secured 10,000 colonies.
  • Badge type ingredient production medium Glucose 100g, (NH 4 ) 2 SO 4 40g, Soy Protein 2.5g, Corn Steep Solids 5g, Urea 3g, KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 H 2 O 0.5g, Biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1,000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 3,000 ⁇ g, CaCO 3 30g; (based on 1 liter of distilled water), pH 7.0 nutrient medium Glucose 10g, broth 5g, polypeptone 10g, sodium chloride 2.5g, yeast extract 5g, agar 20g, urea 2g (based on 1 liter of distilled water)
  • the Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 5306 strain having a mutation in the leuA gene has L-leucine production capacity of about 1.5 compared to the parent strain, Corynebacterium glutamicum ATCC13032. times improved.
  • DNA of the ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306 strain using the primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 described in Table 4 After denaturing at 94 ° C for 5 minutes as a template, after repeating 30 times at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, PCR was performed under conditions of 5 minutes at 72 ° C. DNA sequencing was performed.
  • an insertion vector was prepared. PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 and primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 using the chromosome of Corynebacterium glutamicum wild type (ATCC13032) as a template. Specifically, after denaturation at 94°C for 5 minutes, PCR was performed at 94°C for 30 seconds, at 55°C for 30 seconds, and at 72°C for 1 minute and 30 seconds 30 times, and then at 72°C for 5 minutes. The specific sequences of the primers used are shown in Table 5.
  • the resultant PCR product was cloned by fusion of the homologous sequence of the terminal 15 base between the DNA fragments using the pDZ vector on the line cut with SmaI restriction enzyme and the In-Fusion enzyme and cloned. Cys), a vector 'pDZ-leuA(P247C)' was constructed.
  • Example 3-2 within strain ATCC13032 leuA introduction of genetic mutations
  • the pDZ-leuA (P247C) vector prepared in Example 3-1 was transformed into ATCC13032 by electroporation, and the vector was transferred to the chromosome by recombination of the homologous sequence in a medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • the inserted strain was selected.
  • the selected primary strain was again subjected to secondary cross-over, and a strain introduced with a mutation in the leuA gene was selected.
  • whether the leuA gene mutation was introduced into the transformed strain was determined by PCR using the primers of SEQ ID NO. Repeat, 72°C for 5 minutes), and confirmed through sequencing.
  • the flask fermentation titer was evaluated similarly to the method of Example 2. After inoculating each of the parent strains, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and ATCC13032_leuA_P247C, 1 platinum each in a 250ml corner-barpool flask containing 25ml of the production medium, cultured with shaking at 30°C for 60 hours at 200rpm to L- leucine was produced. After the culture was completed, the production of L-leucine was measured by HPLC, and the concentration of L-leucine in the culture solution for each strain was shown in Table 7 below.
  • ATCC13032_leuA_P247C improved the yield of L-leucine by about 1.55 times compared to the parent strain, Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
  • the pDZ-leuA (R558H, G561D) vector (Korean Patent Publication No. 10-2018-0077008) containing the leuA gene mutation was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by electroporation and kanamycin ( kanamycin) 25 mg/L, a strain into which the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected. The selected primary strain was again subjected to a secondary cross-over, and a strain into which a mutation of the leuA gene was introduced was selected. Finally, whether the mutation of the transformed strain was introduced was determined by PCR using the primers of SEQ ID NO.
  • PCR was performed using the primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10 and primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 using the chromosome of CJL-8100 strain as a template. After denaturing at 94°C for 5 minutes, PCR was repeated 30 times at 94°C for 30 seconds, at 55°C for 30 seconds, and at 72°C for 1 minute and 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the PCR product obtained as a result was cloned by fusion of the homologous sequence of the terminal 15 base between the DNA fragments using the In-Fusion enzyme and the pDZ vector on the line cut with SmaI restriction enzyme, and the 558th amino acid in the LeuA amino acid sequence of the wild type strain.
  • Vector pDZ- which contains a leuA mutation encoding a LeuA variant in which the gene is substituted with histidine and glycine at the 561th amino acid is substituted with aspartic acid, and proline (Pro) at the 247th amino acid of LeuA is substituted with cysteine (Cys) leuA (P247C, R558H, G561D) was prepared.
  • the strain CJL-8100 an L-leucine-producing strain, was transformed with the pDZ-leuA (P247C, R558H, G561D) vector prepared in Example 4-2, and the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence. Selection was made in a medium containing 25 mg/L of kanamycin. The selected primary strain was again subjected to secondary cross-over, and a strain into which the mutation of the target gene was introduced was selected.
  • the introduction of the leuA gene mutation in the transformed strain is determined by PCR using the primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 15 (94 ° C for 5 minutes, 94 ° C for 30 seconds / 55 ° C for 30 seconds / 72 ° C for 90 seconds 30 times Repeat, 72°C for 5 minutes), and then the nucleotide sequence was analyzed.
  • the 1673th nucleotide, G, of the leuA gene in the chromosome of the strain was substituted with A, GC, the 1682th and 1683th nucleotides, was substituted with AT, and the 739th and 740th nucleotides CC were substituted with TG and LeuA LeuA in which arginine, the 558th amino acid, is substituted with histidine, the 561th amino acid, glycine, is substituted with aspartic acid, and the 247th amino acid, proline (Pro), is substituted with cysteine (Cys) It was confirmed that the leuA mutation encoding the variants (P247C, R558H, G561D) was introduced into the strain.
  • the produced CJL8100_leuA_P247C was named 'CA13-8105', and it was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, on April 29, 2020, and was given the deposit number KCCM12709P.
  • the amino acid sequence of the LeuA variant (P247C, R558H, G561D) including the above three mutations and the nucleotide sequence of the leuA variant encoding it are the same as SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the L-leucine producing strain Corynebacterium glutamicum CJL8100
  • the CA13-8105 strain which additionally introduced the leuA_P247C mutation in the CJL8100 strain, improved the L-leucine production ability by about 150% compared to the parent strain CJL8100. From the above results, it can be confirmed that the amino acid at position 247 in the amino acid sequence of the LeuA protein is an important position for L-leucine production activity.
  • Example 4-4 Measurement of isopropylmalate synthase activity in strains introduced with LeuA variants
  • strains CJL-8100, CA13-8105
  • wild-type ATCC13032 were inoculated with 1 platinum each in a 250 ml corner-barpool flask containing 25 ml of each seed medium (production medium in Table 2), and then 16 at 30 ° C. Incubated with shaking at 200 rpm for hours. After completion of the culture, the culture medium was centrifuged, the supernatant was discarded, and the pellet was washed and turbid with a lysis buffer solution to disrupt the cells with a bead crusher. Protein quantification of the lysate followed the Bradford method, and a lysate containing 100 ⁇ g/ml of protein was used.
  • strain Relative isopropylmalate synthase activity (%) ATCC13032 100 ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) : CJL-8100 113 CJL8100_leuA_P247C: CA13-8105 121
  • the L-leucine-producing strains CJL-8100 and CA13-8105 transformed with the LeuA mutant expression vector were isopropyl malate synthase compared to the control group, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. It was confirmed that the activity was improved by 1.13 times and 1.21 times, respectively. In addition, it was confirmed that the L-leucine-producing strains maintained the isopropyl malate synthase enzyme activity at 78% and 88%, respectively, even under the condition that 2 g/l of leucine was added, thereby confirming that feedback inhibition by leucine was released.

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Abstract

본 출원은 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 L-류신의 생산 방법에 관한 것으로, 일 예에 따른 변이형 폴리펩티드를 사용하면, L-류신을 고수율로 생산할 수 있다.

Description

신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 L-류신의 생산 방법
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2020년 05월 20일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0060578호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규한 변이형 폴리펩티드; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터, 또는 이의 조합을 포함하는 미생물; 및 상기 미생물을 배양하여 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-아미노산은, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형(coryneform) 세균 또는 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 아미노산 생산균을 사용하여 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 이들 아미노산 생산균으로서는, 생산성을 향상시키기 위해 자연계로부터 분리된 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주, 또는 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소가 증강된 재조합체 등이 사용되고 있다.
L-아미노산 중에서 L-류신은 필수 아미노산의 일종으로 의약, 식품, 사료 첨가물 및 공업 약품 등에 광범위하게 사용되는 고가의 아미노산으로서, 주로 미생물을 이용하여 생산된다. L-류신의 발효 생산은, 주로 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 2-케토이소카프로산(2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다. 그러나, L-류신 생합성에 관여하는 효소들은 최종 산물인 L-류신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 발생하여 공업적으로 L-류신을 대량 제조하는데 어려움이 있다.
이에, 본 출원의 발명자들은 이소프로필말레이트 신타제의 특정 위치를 변이시켜 얻어진 변이주가 효소 활성을 최적화하여 고수율 L-류신 생산에 이용될 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) US 2018-0251772 A1
본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째 프롤린(proline) 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-류신의 생산 방법을 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 미생물(예를 들면, 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물(재조합 세포))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, L-류신 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 미생물(예를 들면, 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물(재조합 세포))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 L-류신 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원의 일 양상은 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 247 번째 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드(또는 변이체)를 제공할 수 있다.
본 명세서에서, "이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase, 2-isopropylmalate synthase, α-isopropylmalate synthase)"는 2-케토아이소발러레이트(2-ketoisovalerate, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 2-엑소이소발러레이트)와 아세틸-CoA의 아세틸기와의 축합을 촉매하여 L-류신의 전구체 중 하나인 이소프로필말레이트(2-isopropylmalate, 3-카르복시-3-히드록시-4-메틸펜타노에이트)로 전환하는 효소를 의미하고, 상기 이소프로필말레이트 신타제는 상기 전환 활성을 가지는 효소이면 미생물 유래에 상관없이 포함될 수 있고, 예를 들면, 코리네박테리움속 미생물 유래의 효소일 수 있다.
상기 이소프로필말레이트 신타제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한 미생물의 유래에 상관없이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 99.5% 이상 또는 99.8% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드로서, 이소프로필말레이트 신타제와 동일하거나 상응하는 전환 활성을 갖는 효소라면 서열번호 1의 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 상기 이소프로필말레이트 신타제로서 본 출원의 범위 내에 포함될 수 있다.
즉 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(또는 단백질)', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(또는 단백질)'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(또는 단백질)와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(또는 단백질)도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'와 동일한 혹은 상응하는 활성을 가지는 폴리펩티드는 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있다.
상기 이소프로필말레이트 신타제의 아미노산 서열 및 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 미국 생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 당업계에 공지된 데이터 베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 포함한다" 함은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 서열을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 포함한다" 함은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 (i) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(예를 들면, ATCC13032)으로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제의 아미노산 서열은 서열번호 1에 표시하였고, 야생형 균주로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 leuA 유전자의 염기서열은 서열번호 2에 표시하였다. 이소프로필말레이트 신타제는 서열번호 1에서는 616 개의 아미노산으로 이루어진 것으로 표시하였으나, 문헌에 따라 번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 581개의 아미노산으로 이루어진 것으로 공지한 경우도 있고, 581개의 아미노산으로 이루어진 이소프로필말레이트 신타제의 아미노산 서열은 서열번호 16에 표시하였다. 581개의 아미노산으로 이루어진 이소프로필말레이트 신타제는 상기 이소프로필말레이트 신타제로서 본 출원의 범위 내에 포함될 수 있고, 이러한 경우 상기 247 번째 위치는 212 번째 위치로 해석되어 본 출원의 범위에 포함될 수 있다.
일 예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 558 번째(또는 이에 상응하는 위치) 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 561 번째(또는 이에 상응하는 위치) 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환, 또는 이들 모두에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다.
일 예에서, 서열번호 16의 581개의 아미노산으로 이루어진 이소프로필말레이트 신타제의 경우 상기 558 번째 위치는 523 번째 위치로 해석되고, 상기 561번째 위치는 526 번째 위치로 해석되어 본 출원의 범위에 포함될 수 있다.
본 명세서에서, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 이에 상응하는 위치) 프롤린(proline) 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 16의 아미노산 서열에서 212 번째 프롤린 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
본 명세서에서, '서열번호 ~의 아미노산 서열에서 ~번째'는 '서열번호 ~의 아미노산 서열로 구성되는(또는 이루어지는) 폴리펩티드의 N-말단에서 ~번째'와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 프롤린 이외의 다른 아미노산은 알지닌, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 이에 상응하는 위치) 프롤린이 시스테인(cysteine)으로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.8% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 상기 247 번째 위치(서열번호 16의 경우 212번째 위치)에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째 프롤린(또는 서열번호 16의 아미노산 서열에서 212 번째 프롤린) 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 서열이 다른 아미노산으로 치환되어, 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 보다 L-류신 생산 활성이 증가된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서, 247 번째 프롤린(proline) 아미노산 잔기 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된, 변이형 폴리펩티드는 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가질 수 있다. 상기 다른 아미노산 잔기는 치환되기 전에 상기 위치(서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째 또는 이에 상응하는 위치)에 존재하던 아미노산(예를 들면, 프롤린) 외의 다른 종류의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다.
일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 프롤린 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어, 야생형 균주로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이루어진) 이소프로필말레이트 신타제) 보다 L-류신 생산 활성이 증가된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 프롤린 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어, 야생형 균주로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제(예를 들면, 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열로 이루어진 이소프로필말레이트 신타제) 보다 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성이 증가된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "이소프로필말레이트 신타제의 활성이 증가" 되었다는 것은 이소프로필말레이트로의 전환 활성 증가를 의미하므로, 일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열을 포함하는 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 더 높은 수준의 이소프로필말레이트로의 전환 활성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, "활성 증가"는 "활성 강화"와 병용하여 사용될 수 있다. 나아가, 이소프로필말레이트는 L-류신의 전구체 중 하나이므로 일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드를 이용하는 경우 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열을 포함하는 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 결과적으로 더 높은 수준으로 L-류신을 생산할 수 있다.
상기 이소프로필말레이트로의 전환 활성은 생성되는 이소프로필말레이트의 수준을 측정하여 직접 확인하거나, 또는 생성되는 CoA의 수준을 측정하여 간접적으로 확인할 수 있다. 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성은 공지된 방법으로 측정될 수 있고 예를 들면, 문헌[Kohlhaw et al. (Methods in Enzymology 166:423-9 (1988))]에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있으며, 생성되는 CoA를 이용한 환원에 의해 DTNB(5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 엘만(Ellman) 시약)로부터 형성된 티오니트로벤조에이트(TNB)로 인한 412nm에서의 흡광 변화를 측정하여 이소프로필말레이트 신타제 효소의 활성을 측정할 수 있다.
일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 프롤린 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산 서열이 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 균주로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 이소프로필말레이트 신타제) 보다 L-류신 및/또는 이의 유도체에 의한 피드백 억제를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서, "피드백 억제(feedback inhibition, 피드백 저해)"는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 피드백 저해는 L-류신 및/또는 이의 유도체가 이의 생합성 경로의 첫 번째 단계를 매개하는 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, 이소프로필말레이트 신타제의 피드백 억제를 감소(또는 해제)하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 L-류신의 생산성을 높일 수 있다.
본 명세서에서, "유도체"는 본 발명의 최종산물인 L-류신의 생합성에 관련하여 피드백 저해를 유발하여 미생물로부터 L-류신의 생산능을 저해시킬 수 있다고 공지된 화합물들을 의미할 수 있고, 예를 들면, 이소류신(isoleucine), 테르류신(terleucine), 노르류신(norleucine), 및/또는 사이클로류신(cycloleucine) 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 이외의 다른 위치가 추가적으로 변이되어 (1) L-류신 생산 활성 증가; (2) 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성이 증가; 및 (3) L-류신 및/또는 이의 유도체에 의한 피드백 억제 감소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과가 상승적으로 증가한 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 (1) L-류신 생산 활성 증가; (2) 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성 증가; 및 (3) L-류신 및/또는 이의 유도체에 의한 피드백 억제 감소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과를 나타낼 수 있는 변이를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드는,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 558 번째(또는 이에 상응하는 위치) 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 561 번째(또는 이에 상응하는 위치) 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환, 또는 이들 모두에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드는,
서열번호 16의 아미노산 서열에서 523 번째(또는 이에 상응하는 위치) 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환,
서열번호 16의 아미노산 서열에서 526 번째(또는 이에 상응하는 위치) 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환, 또는 이들 모두에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다.
상기 알지닌 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 글리신 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 알지닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 알지닌 이외의 다른 아미노산은 히스티딘(histidine)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 글리신 이외의 다른 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 558 번째 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 히스티딘(histidine) 아미노산 잔기로 치환,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 561 번째 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 아스파르트산(aspartic acid) 아미노산 잔기로 치환, 또는
이들 모두에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 따라, 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 변이형 폴리펩티드에서,
서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 558 번째(또는 523 번째) 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환, 561 번째(또는 526 번째) 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환, 또는 이들 모두에 의하여 추가로 변이된 변이형 폴리펩티드는,
(i) 야생형 균주로부터 유래된 이소프로필말레이트 신타제(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 이소프로필말레이트 신타제) 또는 (ii) 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 프롤린 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 변이형 폴리펩티드 보다
하기 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효과가 증가한 것일 수 있다:
(1) L-류신 생산 활성 증가;
(2) 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성이 증가; 및
(3) L-류신 및/또는 이의 유도체에 의한 피드백 억제 감소.
일 구체예에 따르면, 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째, 558 번째, 및/또는 561 번째(또는 212 번째, 523 번째, 및/또는 526 번째) 위치의 아미노산이 다른 종류의 아미노산으로 치환되는 변이의 조합에 따라 일 예에 따른 변이형 폴리펩티드는 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효과가 상승적으로 증가한 것일 수 있다:
(1) L-류신 생산 활성 증가;
(2) 이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성이 증가; 및
(3) L-류신 및/또는 이의 유도체에 의한 피드백 억제 감소.
상기 (1) 내지 (3)의 효과에 대해서는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미할 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 폴리뉴클레오티드에는 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
일 예에 따르면, 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 프롤린 아미노산 잔기가 프롤린 이외이 다른 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 또는 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.8% 이상의 상동성을 가지고 상기 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열에서 247 번째(또는 212 번째) 위치에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩티드나 이의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있고 서열번호 1(또는 서열번호 16)의 아미노산 서열의 247 번째(또는 212 번째) 또는 이에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 서열에 상응하는 서열을 포함하는 프로브라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 상동성이 높은 유전자끼리, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.8% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 약 300bp 정도 길이의 프로브를 사용하는 경우에, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2ХSSC 및 0.1% SDS가 제시될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공할 수 있다.
본 명세서에서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다.
일 예에서, 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 명세서에서, "작동 가능하게 연결"된 것은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있고, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및/또는 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDC계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pDZ계, 및/또는 pET계 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, pDC, pDCM2, pCR2.1, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 및/또는 pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 미생물(또는 재조합 세포)을 제공할 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 추가적으로 L-류신 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자의 종류는 L-류신 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 추가적으로 L-류신 생합성에 관여하는 효소의 활성이 강화되도록 하는 변이를 포함할 수 있다. 효소의 활성이 강화된다는 것은 전술한 바와 같다.
상기 미생물(재조합 세포)은 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용 가능할 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 L-류신 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물(또는 재조합 세포)은 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주가 가지지 않는 L-류신 생산능을 가지게 되거나 또는 L-류신 생산능이 보다 향상된 것일 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 이소프로필말레이트 신타제에 상응하는 아미노산 서열이 변이되어 그 활성이 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주 비교하여 증가되거나, L-류신 및 이의 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되거나, 효소의 활성 증가 및 피드백 저해의 해제가 모두 이루어진 것일 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 통합된 것일 수 있고, 예를 들면, 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체 내의 유전자 부위에서 천연(native) leuA 유전자(이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 유전자)에 대해 교환되거나 추가의 유전자 부위에 통합된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "L-류신 생산능을 갖는다"는 것은 자연적으로 류신 생산능을 갖는 세포 및/또는 미생물, 또는 류신 생산능이 없는 세포 및/또는 미생물에 류신 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 예를 들면, L-류신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 미생물 자체 또는 류신 생산 기작과 관련된 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 L-류신 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아 게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네 박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 및/또는 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis) 등일 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 형질전환을 통해 인공적으로 제조되거나, 또는 자연적으로 발생되는 것을 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물(또는 재조합 세포)은 일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "형질전환"은 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자또는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주 세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.
본 명세서에서, 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 방법이면 제한 없이 포함되며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및/또는 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 서열이 염색체 내에 통합된 것일 수 있다. 상동 재조합은 일 예에 따른 벡터의 사용과 함께, 벡터에 의해 세포 내로 전달되는 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드에 대한 염색체 상의 DNA 절편의 교환을 허용한다. 벡터의 고리형 DNA 분자 및 염색체 상의 표적 DNA 사이의 효율적인 재조합을 위해, 일 예에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 교환될 DNA 영역에는 단부에 표적 부위에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 제공되고; 이들은 벡터의 통합 및 DNA의 교환 부위를 결정한다. 예를 들면, 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에서 천연 유전자 부위에서 천연 leuA 유전자에 대해 교환될 수 있거나 추가의 유전자 부위에 통합될 수 있다.
다른 양상은 상기 미생물(또는 재조합 세포)을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-류신의 생산방법을 제공할 수 있다.
일 예에서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물(또는 재조합 세포)에서 L-류신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있고 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다.
상기 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture), 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
미생물(또는 재조합 세포)을 배양하기 위한 배지는 공지된 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있고, 상기 재조합 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도 및/또는 pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 및/또는 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 및/또는 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 및/또는 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 및/또는 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 20℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 37℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질(예를 들면, L-류신)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면, 10 내지 160 시간일 수 있다.
상기 배양된 미생물(또는 재조합 세포) 및/또는 배양 배지에서 L-류신을 분리 또는 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 및/또는 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 배양 배지는 미생물(또는 재조합 세포)을 배양한 배지를 의미한다.
일 구체예에 따르면, L-류신을 분리 또는 회수하는 단계는 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
상기 L-류신의 생산방법은 L-류신을 정제하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
다른 양상은 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 본 출원의 미생물(예를 들면, 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물(재조합 세포))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, L-류신 생산용 조성물을 제공할 수 있다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이형 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 배지 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
또 다른 양상은 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및/또는 본 출원의 미생물(예를 들면, 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물(재조합 세포))의 L-류신 생산에 사용하기 위한 용도를 제공할 수 있다.
본 출원의 용도에서, 변이형 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 배지 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
일 구체예에 따른 변이형 폴리펩티드를 사용하면 L-류신을 고수율로 생산할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 변이된 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 DNA 라이브러리 제작
실시예 1-1. leuA 를 포함하는 벡터 제작
이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이체를 암호화하는 leuA 변이 라이브러리를 제작하기 위해 우선 leuA를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다.
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 LeuA(2-isopropylmalate synthase) 단백질(서열번호 1, Uniprot accession code: P42455)을 암호화하는 leuA 유전자(서열번호 2)를 증폭하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 야생주의 염색체를 주형으로 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분간 Pfu DNA 중합효소로 중합하는 조건을 25회 반복하는 PCR 방법을 수행하였다. 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 표 1에 기재하였다.
증폭된 PCR 산물을 TOPO Cloning Kit(Invitrogen)를 이용하여, 제조사의 매뉴얼에 따라, 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 'pCR-leuA'를 얻었다.
서열번호 서열(5'->3')
서열번호 7 CTAATCTCGAGGTCACCCATGTCTCCTAAC
서열번호 8 GGCTGGCGGCGTTTAAAACCGGTTGAT
실시예 1-2. leuA 변이 라이브러리 제작
상기 실시예 1-1에서 제작된 벡터를 기반으로 error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 leuA 변이 라이브러리를 제작하였다. 1000bp 당 0 내지 3개의 변이가 발생할 수 있는 조건에서, pCR-leuA 벡터를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로, 1000bp 당 0 내지 3개의 변이가 발생하는 조건으로서, 94℃에서 30초 동안 프리-히팅(pre-heating) 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 과정을 25회(cycle) 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 메가프라이머로(megaprimer)(50~125ng)로 하여 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 12분의 과정을 25회 반복하여 PCR 반응을 수행한 후 DpnI 처리하고, DpnI이 처리된 PCR 산물을 대장균 DH5α에 열 충격방법을 통해 형질전환하여 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 염기서열을 분석한 결과 2 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 'pTOPO-leuA-라이브러리'로 명명하였다.
실시예 2. 제작한 라이브러리 평가 및 변이체 선별
실시예 2-1. L-류신 생산량이 증가된 변이 균주 선별
상기 실시예 1-2에서 제작된 pTOPO-leuA-라이브러리를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환하고, 형질전환된 균주를 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지(표 2)에 도말하여 변이 유전자가 삽입된 균주 10,000개의 콜로니를 선별하였다. 선별된 각 콜로니를 ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 1 내지 ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 10,000로 명명하였다. 확보된 10,000개의 콜로니 중 L-류신 생산량이 증가된 콜로니를 확인하기 위해 각각의 콜로니에 대해 하기와 같은 방법으로 발효 역가 평가를 진행하였다.
배지 종류 성분
생산배지 포도당 100g, (NH4)2SO4 40g, 대두 단백질(Soy Protein) 2.5g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3g, KH2PO4 1g, MgSO4·H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 3,000㎍, CaCO3 30g; (증류수 1리터 기준), pH 7.0
영양배지 포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
가압 살균한 생산배지(표 2) 25㎖에 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에 각 콜로니를 백금이를 이용하여 접종한 후, 30℃에서 60 시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC, SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 L-류신 생산량을 측정하였다. 확보된 10,000개의 콜로니 중 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC13032) 대비 L-류신 생산능이 가장 향상된 균주(ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306) 1종을 선별하였다. 선별된 균주(ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306)에서 생산된 L-류신의 농도는 아래 표 3과 같다
균주명 L-류신 (g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306 1.32
상기 표 3에 나타난 바와 같이, leuA 유전자에 변이가 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 5306 균주는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 비해 L-류신 생산능이 약 1.5배 향상되었다.
실시예 2-2. L-류신 생산량이 증가된 변이 균주의 변이 확인
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pTOPO_leuA(mt) 5306 균주의 leuA 유전자 변이를 확인하기 위하여, 표 4에 기재된 서열번호 9 와 서열번호 10 의 프라이머를 이용하여 ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306 균주의 DNA를 주형으로 하여 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분의 조건으로 PCR을 수행하고 DNA시퀀싱을 진행하였다.
서열번호 서열(5'->3')
서열번호 9 AACACGACCGGCATCCCGTCGC
서열번호 10 AAATCATTTGAGAAAACTCGAGG
시퀀싱 결과, ATCC13032/pTOPO_leuA(mt)5306 균주는 leuA 유전자의 739번째, 740번째 뉴클레오티드인 CC가 TG로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 LeuA 단백질의 247번째(번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 LeuA 단백질이 581 개의 아미노산으로 이루어진 것(서열번호 16)으로 공지한 문헌에 기초하는 경우는 212 번째; 이하 247 번째로만 표기) 아미노산인 프롤린이 시스테인으로 치환된 변이체(이하, P247C)를 암호화할 수 있음을 의미한다. 상기 LeuA 변이체(P247C)의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 leuA 변이체의 염기 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4와 같다.
이하 실시예에서는, 상기 변이(P247C)가 코리네박테리움 속 미생물의 L-류신 생산량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3. 선별된 변이 균주의 L-류신 생산능 확인
실시예 3-1. leuA 변이를 포함하는 삽입 벡터 제작
본 실시예에서는 위치 지정 돌연변이 생성(Site directed mutagenesis) 방법을 사용하여 선별된 변이(P247C)를 균주 내로 도입하기 위해, 삽입용 벡터를 제작하고자 하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형(ATCC13032)의 염색체를 주형으로 서열번호 11 및 12의 프라이머와 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 94℃에서 5분간 변성 후에 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 표 5에 기재하였다.
서열번호 서열(5'->3')
서열번호 11 GTGAATTCGAGCTCGGTACCCAAATCATTTGAGAAAACTCGAGGC
서열번호 12 GGTGATCATCTCAACGGTGGAACACAGGTTGATGATCATTGGGTT
서열번호 13 AACCCAATGATCATCAACCTGTGTTCCACCGTTGAGATGATCACC
서열번호 14 GGTCGACTCTAGAGGATCCCCAAGAAGGCAACATCGGACAGC
그 결과 얻어진 PCR 산물을 SmaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터와 In-Fusion 효소를 이용해 DNA 단편 간의 말단 15 base의 상동서열을 fusion 시켜 클로닝하여 LeuA의 247 번째 아미노산인 프롤린(Pro)을 시스테인(Cys)으로 치환하는 벡터 'pDZ-leuA(P247C)'를 제작하였다.
실시예 3-2. ATCC13032 균주 내 leuA 유전자 변이 도입
상기 실시예 3-1에서 제작한 pDZ-leuA(P247C) 벡터를 ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환하고 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 배지에서 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, leuA 유전자에 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종적으로 형질전환된 균주의 leuA 유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 9와 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR(94℃ 5분 후, 94℃ 30초/55℃ 30초/72℃ 90초 30회반복, 72℃ 5분) 수행한 후 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 염기서열 분석 결과, 균주 염색체 내 leuA 유전자의 739번째, 740번째 뉴클레오티드인 CC가 TG로 치환되어, 247 번째 아미노산인 프롤린(Pro)이 시스테인(Cys)으로 치환된 LeuA를 암호화하는 leuA 변이가 균주 내에 도입된 것을 확인하였다. 제작된 균주는 'ATCC13032_leuA_P247C'로 명명하였다. 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 표 4 및 표 6에 기재하였다.
서열번호 서열(5'->3')
서열번호 15 ATCCATTCAATGGAGTCTGCG
실시예 3-3. 변이 균주의 L-류신 생산능 평가
상기 실시예 3-2에서 제작된 ATCC13032_leuA_P247C 균주의 L-류신 생산능을 평가하기 위해, 상기 실시예 2의 방법과 유사하게, 플라스크 발효 역가 평가를 진행하였다. 생산배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 ATCC13032_leuA_P247C을 각각 1백금이씩 접종한 후, 30℃에서 60시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다. 배양 종료 후 HPLC로 L-류신의 생산량을 측정하여, 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 하기 표 7에 기재하였다.
균주명 L-류신(g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032_leuA_P247C 1.35
상기 표 7에 나타난 바와 같이, ATCC13032_leuA_P247C는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 비해 L-류신의 수율이 약 1.55 배 향상되었다.
실시예 4. 류신 생산 변이 균주에서 류신 생산능 평가
코리네박테리움 속 야생형의 균주는 L-류신을 미량 생산하므로, ATCC13032 유래의 류신 생산 균주를 제작하고, 상기 실시예 2에서 선별한 변이(P247C)를 도입하여 L-류신 생산능을 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같다.
실시예 4-1. L-류신 생산 균주 (CJL-8100 균주) 제조
고농도의 L-류신 생산을 위한 균주로서 (1) leuA 유전자의 1673 번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 LeuA 단백질의 558 번째 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되는 변이(R558H)와 (2) leuA 유전자의 1682 번째, 1683 번째 뉴클레오티드인 GC가 AT로 치환되어 561 번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환되는 변이(G561D)를 포함하는 ATCC13032 유래의 균주를 제조하였다.
구체적으로 상기의 leuA 유전자 변이를 포함하는 pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터(대한민국 공개특허 제10-2018-0077008호)를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환하고 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 배지에서 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, leuA 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종적으로 형질전환된 균주의 변이 도입 여부는 서열번호 7과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 PCR(94℃ 5분 후, 94℃ 30초/55℃ 30초/72℃ 90초 30회 반복, 72℃ 5분)을 수행하고 염기서열을 분석하여 R558H, G561D 변이가 도입된 것을 확인하였다. 사용한 프라이머의 구체적인 서열은 표 1 및 표 5에 기재하였다. pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터로 형질전환된 ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) 균주를 'CJL-8100'으로 명명하였다.
실시예 4-2. leuA 변이를 포함하는 삽입 벡터 제작
본 실시예에서는 LeuA에 2개의 변이(R558H, G561D)가 도입된 L-류신 생산 균주인 CJL-8100에 상기 실시예 2에서 선별된 변이(P247C)를 도입하기 위해 삽입용 벡터를 제작하고자 하였다.
CJL-8100 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 9 및 10의 프라이머, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 PCR 산물을 SmaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터와 In-Fusion 효소를 이용해 DNA 단편 간의 말단 15 base의 상동서열을 fusion 시켜 클로닝하여, 야생형 균주의 LeuA 아미노산 서열에서 558 번째 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되고, 561 번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된 LeuA 변이체를 암호화하는 leuA 변이를 포함하고, LeuA의 247 번째 아미노산인 프롤린(Pro)을 시스테인(Cys)으로 치환하는 벡터 pDZ-leuA(P247C, R558H, G561D)를 제작하였다.
실시예 4-3. CLJ-8100 균주 내 LeuA 변이체(P247C) 도입 및 평가
L-류신 생산 균주인 CJL-8100을 상기 실시예 4-2에서 제작한 pDZ-leuA(P247C, R558H, G561D) 벡터로 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종적으로 형질전환된 균주의 leuA유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 9과 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR(94℃ 5분 후, 94℃ 30초/55℃ 30초/72℃ 90초 30회 반복, 72℃ 5분)을 수행한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과, 균주 염색체 내 leuA 유전자의 1673 번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되고, 1682 번째, 1683 번째 뉴클레오티드인 GC가 AT로 치환되었으며, 739번째, 740번째 뉴클레오티드인 CC가 TG로 치환되어 LeuA 단백질의 558 번째 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되고, 561 번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환되고, 247 번째 아미노산인 프롤린(Pro)이 시스테인(Cys)으로 치환된 LeuA 변이체(P247C, R558H, G561D)를 암호화하는 leuA 변이가 균주 내에 도입된 것을 확인하였다. 제작된 CJL8100_leuA_P247C 를 'CA13-8105'로 명명하고 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)에 2020년 4월 29일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12709P를 부여 받았다. 상기 총 3종의 변이를 포함하는 LeuA 변이체(P247C, R558H, G561D)의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 leuA 변이체의 염기 서열은 각각 서열번호 5 및 서열번호 6와 같다.
ATCC13032, 제작된 CJL-8100, 및 CA13-8105 균주의 L-류신의 생산능을 평가하였다. 구체적으로, 실시예 2-2와 같은 방식으로 플라스크 배양을 진행하였고, 배양 종료 후 HPLC를 이용하여, 모균주 및 변이 균주의 L-류신 생산량을 측정하여 그 결과를 표 8에 기재하였다.
균주명 L-류신 (g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) : CJL-8100 2.71
CJL8100_leuA_P247C: CA13-8105 3.52
상기 표 8에 나타난 바와 같이, L-류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8100은 모균주인 ATCC13032에 비해 L-류신 생산능이 약 130 % 향상되었다. CJL8100 균주 내 leuA_P247C 변이를 추가적으로 도입한 CA13-8105 균주는 모균주인 CJL8100 대비 L-류신 생산능이 약 150 % 향상되었다. 상기 결과를 통해, LeuA 단백질의 아미노산 서열 중 상기 247번째 위치의 아미노산이 L-류신 생산 활성에 중요한 위치임을 확인할 수 있다.
실시예 4-4. LeuA 변이체가 도입된 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제 활성 측정
상기 실시예 4-3에서 제작한 L-류신 생산균주인 CJL-8100 및 CA13-8105에서 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
각각의 종배지(표 2의 생산배지) 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에 상기 균주(CJL-8100, CA13-8105) 및 야생형 ATCC13032를 각각 1 백금이 접종한 후, 30℃에서 16 시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 원심분리하여 상층액은 버리고, 펠렛을 용균완충용액으로 세척 및 혼탁하여 구슬파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 용균액의 단백질 정량은 브래드포드법을 따랐으며, 100㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였다. 이때, 생성되는 CoA를 이용한 환원에 의해 DTNB(5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 엘만(Ellman) 시약)로부터 형성된 티오니트로벤조에이트(TNB)로 인한 412nm에서의 흡광 변화를 측정하여 이소프로필말레이트 신타제 효소의 활성을 측정하였다.
각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성 측정 결과는 하기 표 9와 같다.
균주 상대적인 이소프로필말레이트 신타제 활성 (%)
ATCC13032 100
ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) : CJL-8100 113
CJL8100_leuA_P247C: CA13-8105 121
다음으로, 상기 효소의 류신에 대한 피드백 저해에 대한 해제 정도를 확인하기 위해 류신이 2g/l 첨가된 조건에서 100㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 CoA를 측정함으로써 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성측정 결과는 하기 표 10과 같다.
균주 류신 0g/l 류신 2g/l
상대적인 이소프로필말레이트
신타제 활성 (%)
ATCC13032 100 36
ATCC13032_leuA_(R558H, G561D): CJL-8100 100 78
CJL8100_leuA_P247C: CA13-8105 100 88
상기 표 9 및 10에 나타난 바와 같이, LeuA 변이체 발현벡터가 형질 전환된 L-류신 생산균주 CJL-8100 및 CA13-8105는 대조군인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 비해 이소프로필말레이트 신타제의 활성이 각각 1.13배, 1.21배로 향상됨을 확인하였다. 또한, 상기 L-류신 생산균주들은 류신이 2g/l 첨가된 조건에서도 이소프로필말레이트 신타제 효소 활성을 각각 78%, 88% 로 유지하는 것을 확인하여 류신에 의한 피드백 저해가 해제되었음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12709P
수탁일자 : 20200429
Figure PCTKR2021006033-appb-I000001

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 247 번째 프롤린(proline) 아미노산 잔기가 프롤린 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 247 번째 프롤린이 시스테인(cysteine)으로 치환된, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 558 번째 알지닌(arginine) 아미노산 잔기가 히스티딘(histidine) 아미노산 잔기로 치환,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 561 번째 글리신(glycine) 아미노산 잔기가 아스파르트산(aspartic acid) 아미노산 잔기로 치환, 또는
    이들 모두에 의하여 추가로 변이된 것인, 변이형 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 변이형 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 L-류신 생산능을 갖는 것인, 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)인, 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  12. 제8항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-류신의 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 L-류신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-류신의 생산 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드; 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 벡터를 포함하는 미생물로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, L-류신 생산용 조성물.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드; 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 벡터를 포함하는 미생물로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 L-류신 생산에 사용하기 위한 용도.
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