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WO2018124440A2 - 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 - Google Patents

신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 Download PDF

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WO2018124440A2
WO2018124440A2 PCT/KR2017/011622 KR2017011622W WO2018124440A2 WO 2018124440 A2 WO2018124440 A2 WO 2018124440A2 KR 2017011622 W KR2017011622 W KR 2017011622W WO 2018124440 A2 WO2018124440 A2 WO 2018124440A2
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WO
WIPO (PCT)
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leua
leucine
pcj7
amino acid
seq
Prior art date
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PCT/KR2017/011622
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English (en)
French (fr)
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WO2018124440A3 (ko
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이지혜
송병철
전애지
김종현
김혜원
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CA3048802A priority patent/CA3048802C/en
Priority to EP17889165.1A priority patent/EP3564366B1/en
Priority to ES17889165T priority patent/ES2896257T3/es
Priority to JP2019535387A priority patent/JP6848067B2/ja
Priority to MX2019007782A priority patent/MX2019007782A/es
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)

Definitions

  • the present application relates to a novel variant polypeptide having isopropylmalate synthase activity, a polynucleotide encoding the same, a microorganism comprising the polypeptide, and a method of culturing the microorganism to produce L-leucine. .
  • L-leucine is an essential amino acid and is an expensive amino acid widely used in medicine, food, feed additives, and industrial medicine, and is mainly produced using microorganisms. Fermentation production of branched chain amino acids, including L-leucine, is mainly through microorganisms of the genus Escherichia or Corynebacterium, and through the several steps from pyruvic acid, 2-ketoisocaproate It is known to be biosynthesized as a precursor (Korean Patent No. 10-0220018, Korean Patent No. 10-0438146).
  • Isopropylmalate synthase (hereinafter referred to as "IPMS"), an enzyme involved in leucine biosynthesis, is a leucine biosynthesis for 2-ketoisovalerate produced in the valine biosynthetic pathway instead of valine. It is a one-step enzyme of leucine biosynthesis that converts to isopropylmalate, which is an important enzyme in the process of leucine biosynthesis.
  • the IPMS is subject to feedback inhibition by the final product, L-leucine or a derivative thereof.
  • various prior arts exist for IMPS variants that release feedback inhibition for the purpose of producing high concentrations of leucine US Patent No. 2015-0079641, US Patent No. 6403342), but there are still studies on finding better variants. It is becoming.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop IMPS variants that can be used for the production of high concentrations of L-leucine, and have thus developed novel IMPS variants.
  • the variant was confirmed that the inhibition of feedback to the final product L- leucine is released and enhanced activity, to produce L- leucine in high yield from the microorganism comprising the same, and completed the present application.
  • the present application includes, for one purpose, novel variant polypeptides having isopropylmalate synthase activity.
  • the present application includes polynucleotides encoding such variant polypeptides.
  • the present application is another object, the genus Corynebacterium having the ability to produce L- leucine, including the polypeptide ( Corynebacterium sp . ) Contains microorganisms.
  • the present application includes a method for producing L- leucine by culturing the microorganism in a medium for another purpose.
  • the variant polypeptide having novel isopropylmaleate synthase activity of the present application has increased activity compared to wild-type isopropyl maleate synthase and release of feedback inhibition by L-leucine. Can be mass produced in high yield.
  • novel variant polypeptide having isopropylmalate synthase activity is an amino acid residue other than arginine of the 558 th amino acid from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid residue of the 561 th glycine amino acid residue other than glycine. It may be a variant polypeptide having isopropylmaleate synthase activity, substituted with.
  • the variant polypeptides of the present application have a higher activity as compared to the polypeptide having the activity of isopropylmalate synthase of SEQ ID NO: 1, and has a feature in that feedback inhibition to L-leucine is released.
  • isopropylmalate synthase refers to isopropylmalate, one of the precursors of L-leucine, by reacting 2-ketoisovalerate with acetyl-CoA ( isopropylmalate).
  • isopropyl maleate synthase may be included irrespective of the microorganism, as long as the enzyme has the above-described conversion activity, and specifically, may be an enzyme derived from the genus Corynebacterium.
  • isopropyl malate synthase is Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum ) may be derived from isopropyl maleate synthase, specifically, may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the isopropylmaleate synthase may comprise a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence having such homology and exhibiting efficacy corresponding to isopropylmaleate synthase even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added, it is obvious that the scope of the present application is included.
  • the term "increased activity of isopropylmaleate synthase” in the present application means increased conversion activity to isopropyl maleate, so that the variant polypeptide of the present application has the activity of isopropylmaleate synthase of SEQ ID NO: 1 It has a higher level of isopropylmaleate conversion activity compared to polypeptides.
  • the isopropyl maleate conversion activity can be directly confirmed by measuring the level of isopropyl maleate produced, or indirectly by measuring the level of CoA produced.
  • the term “increasing activity” may be used in combination with "enhancing activity”.
  • isopropylmaleate is one of the precursors of L-leucine, so when using variant polypeptides of the present application, consequently higher levels of L-leucine compared to polypeptides having isopropyl maleate synthase activity of SEQ ID NO: 1 Can produce
  • the variant polypeptides of the present application may have a feature in which feedback inhibition by the final product L-leucine or a derivative thereof is released.
  • the term "feedback inhibition” refers to the inhibition of a reaction of an enzyme system early in the enzyme system.
  • the feedback inhibition may be that L-leucine or a derivative thereof inhibits the activity of isopropylmaleate synthase that mediates the first step of its biosynthetic pathway. Therefore, when the feedback inhibition of isopropyl maleate synthase is released, the productivity of L-leucine can be increased as compared with the case where it is not.
  • variant refers to a culture or individual that exhibits one stable phenotypic change, genetically or non-genetically.
  • amino acid sequence corresponding to isopropylmalate synthase derived from Corynebacterium glutamicum is mutated so that its activity is increased efficiently compared to the wild type, or feedback on L-leucine and its derivatives Inhibition may be released or a variant in which both increased activity and feedback inhibition are released.
  • the variant polypeptide having isopropylmaleate synthase activity of the present application is an amino acid residue other than arginine, wherein arginine is the 558th amino acid from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Or a variant polypeptide having isopropylmaleate synthase activity wherein the 561th glycine amino acid residue is substituted with an amino acid residue other than glycine.
  • amino acids other than the arginine include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, lysine, histidine, aspartic acid and glutamic acid
  • Amino acids other than glycine may be alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, arginine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, lysine, histidine, aspartic acid and glutamic acid It may be to include, but is not limited thereto.
  • the 558 th arginine amino acid residue is replaced with histidine, alanine or glutamine, or the 561 th glycine amino acid residue is substituted with aspartic acid, arginine or tyrosine.
  • It may be a type polypeptide, but is not limited thereto.
  • the variant polypeptide may be substituted with histidine, alanine or glutamine in the 558 th arginine, and the 561 th glycine is substituted with aspartic acid, alginine or tyrosine, but is not limited thereto.
  • the variant polypeptide may include an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 35.
  • the variant polypeptide comprises a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology with an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 21-35 can do.
  • an amino acid sequence having such homology and exhibiting efficacy corresponding to isopropylmaleate synthase a change in the amino acid sequence corresponding to the specific variation position 558 th and / or 561 th amino acid sequence is fixed.
  • enzyme variants having amino acid sequences in which some sequences have been deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present application.
  • specific mutation positions 558th and 561th means a position identified based on the N-terminal in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, when some amino acids are added or deleted at the N-terminal of SEQ ID NO: 1 It will be apparent to those skilled in the art that the amount calculated in consideration of the number of amino acids is also included within the scope of the present application.
  • leuA a gene encoding isopropylmaleate synthase
  • the 558 th position is interpreted as the 523 th position
  • the 561 th position may be interpreted as the 526 th position and may be included in the scope of the present application.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to confirm the size of the digested fragments.
  • Another aspect of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the polynucleotide is substituted from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by arginine, which is the 558th amino acid, to an amino acid residue other than arginine, or 561th glycine amino acid residue by another amino acid residue other than glycine
  • arginine which is the 558th amino acid
  • 561th glycine amino acid residue by another amino acid residue other than glycine
  • Polynucleotides encoding variant polypeptides having sequences can be included without limitation.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence eg, a sequence that encodes a protein having isopropylmaleate synthase activity by hydration under stringent conditions with complementary sequences to all or part of the base sequence
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • genes with high homology for example, 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more Genes having homologous hybridization and hybridization with less homologous genes, or 60 ° C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1 At a salt concentration and temperature corresponding to x SSC, 0.1% SDS, more specifically 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, the conditions for washing once, specifically, two to three times can be enumerated ( Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)).
  • the probe used for hybridization may be part of the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a probe can be constructed by PCR using an oligonucleotide made based on a known sequence as a primer as a template of a gene fragment containing such a nucleotide sequence.
  • a gene fragment of about 300 bp in length can be used as the probe. More specifically, when using a probe of about 300 bp in length, as washing conditions for hybridization, 50 ° C., 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS may be presented.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 36 to SEQ ID NO: 50, and may also include a polynucleotide that can be translated into the variant polypeptide by codon degeneracy It is self-evident.
  • Another embodiment of the present application is a genus of Corynebacterium having the ability to produce L-leucine, including the variant polypeptide ( Corynebacterium). sp . ) Microorganisms.
  • the microorganism may include both artificially produced or naturally occurring through transformation.
  • the microorganism may be a microorganism transformed with a vector comprising a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • transformation means to be able to express the gene after introduction into the host cell.
  • the transformation method in the present application includes any method of introducing a gene into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art. Electroporation, calcium phosphate co-precipitation, retroviral infection, microinjection, DEAE-dextran, cationic liposome Law, heat shock method, and the like, but is not limited thereto.
  • the gene to be transformed may include both the form inserted into the chromosome of the host cell and the form located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the gene may include DNA and RNA as a polynucleotide capable of encoding a polypeptide, and may be used without limitation as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell itself or in the form of a polynucleotide structure, for example, a vector, and may be operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the term "vector” refers to any medium for cloning and / or transferring polynucleotides to a host cell.
  • the vector may be a replica, in which other DNA fragments can bind to result in replication of the bound fragment.
  • a "replicating unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, i.e., is replicable by its own regulation. .
  • the term “vector” may include viral and non-viral mediators for introducing polynucleotides into host cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the term "vector” may also include minispherical DNA.
  • the vector may be a plasmid that does not have a bacterial DNA sequence. Removal of bacterial DNA sequences enriched in the CpG region has been done to reduce transgene expression silencing and to bring more sustained expression from plasmid DNA vectors (eg, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10 : 215-25; Yet, NS (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, ZY et al. (2004) Gene Ther 11: 856-64).
  • the term “vector” may also include transposons (Izsvak et al. J. MoI. Biol.
  • telomeres such as Sleeping Beauty, or artificial chromosomes.
  • vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector
  • pDZ-based, pBR-based, pUC-based , pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based, etc. may be used, and specifically, the pECCG117 vector may be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known expression / substitution vectors may be used.
  • the vector may be a recombinant vector which may further include various antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance gene is a gene having resistance to antibiotics, and since the cells having the cells survive in the environment treated with the antibiotics, as a selection marker in the process of obtaining a large amount of plasmid from a microorganism such as E. coli. It can be usefully used. Since the antibiotic resistance gene in the present application is not a factor that greatly affects the expression efficiency according to the optimal combination of vectors, which is the core technology of the present application, antibiotic resistance genes generally used as selection markers can be used without limitation. As specific examples, resistance genes for ampicillin, tetratracyclin, kanamycin, chloroamphenicol, streptomycin, or neomycin may be used.
  • operably linked generally means that the base expression control sequence and the polynucleotide sequence encoding the desired polypeptide can be linked to affect the expression of the base sequence to perform the function.
  • Operable linkages with vectors can be made using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be made using cleavage and linking enzymes, and the like, in the art.
  • the term "transformed) host cell into which a vector is introduced” means a cell transformed with a vector having a polynucleotide encoding one or more target proteins.
  • the host cell may include any of prokaryotic and eukaryotic microorganisms, as long as the host cell is a microorganism including a variant polypeptide capable of introducing the vector to produce isopropyl maleate synthase.
  • Escherichia sp. Erwinia sp .
  • Serratia sp . Serratia sp .
  • Corynebacterium sp . Corynebacterium sp .
  • Brevibacterium genus (Brevibacterium sp . May include microbial strains. Examples of microorganisms in the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum , but are not limited thereto.
  • Microorganisms capable of expressing the variant polypeptides having the isopropyl maleate synthase activity of the present application, having L-leucine production capacity may be used in various known methods in addition to the vector introduction. And all microorganisms capable of expressing the variant polypeptide.
  • Another embodiment of the present application (a) producing the L- leucine by culturing the microorganism of the genus Corynebacterium producing L- leucine in the medium; And (b) recovering L-leucine from the microorganism or culture medium.
  • the term "culture” means growing the microorganisms under appropriately controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application may be made according to suitable media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous and fed-batch, but is not limited thereto.
  • Carbon sources included in the medium include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, Fatty acids such as stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources included in the medium include organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and soybean wheat, inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate This may be included. These nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto. Potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate and corresponding sodium-containing salts may be included as the person included in the medium, but are not limited thereto. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate. In addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture, but are not limited thereto.
  • organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and soybean wheat
  • inorganic nitrogen sources such as ammonium sul
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture may be usually 27 ° C to 37 ° C, specifically 30 ° C to 35 ° C, but is not limited thereto. The incubation period may continue until the desired amount of useful material is obtained, specifically 10 to 100 hours, but is not limited thereto.
  • Recovering the L-leucine produced in the culturing step of the present application may collect the desired L- leucine from the microorganism or the medium using a suitable method known in the art depending on the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like can be used, and the desired L-leucine can be recovered from the medium or microorganism using any suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a purification process.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC14067 was inoculated into the seed medium of the ingredients described below sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, incubated for 13 hours, and 25 ml of the culture was recovered.
  • the recovered culture solution was washed with 100 mM citric acid buffer, and then treated with NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) at a final concentration of 400 ⁇ g / ml for 30 minutes. Washed with 100 mM phosphate buffer. The killing rate was 99.6% when NTG-treated strains were plated on the minimum medium of the ingredients described below.
  • NTG-treated strains were plated in minimal media added with NL final concentrations of 20 mM, 40 mM and 50 mM, respectively, and 5 days at 30 ° C. Cultured to obtain NL resistant mutants.
  • Glucose 20 g Peptone 10 g, Yeast extract 5 g, Urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine HCl 1000 ⁇ g, Calcium 2000 ⁇ g pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide (based on 1 liter of distilled water), pH 7.0
  • the mutants obtained by the above method were named Corynebacterium glutamicum KCJ-24 and Corynebacterium glutamicum KCJ-28 (Corynebacterium glutamicum KCJ-28). On the 22nd, they were deposited with the Korea Microbiological Conservation Center, an international depositary organization under the Budapest Treaty, and were given accession numbers KCCM11661P and KCCM11662P, respectively.
  • the mutant strains Corynebacterium glutamicum KCJ-24 and Corynebacterium glutamicum KCJ-28 produce L-leucine at concentrations of 2.7 and 3.1 g / L, respectively, and are approximately 10-fold higher than that of the parent strain. It was confirmed that leucine productivity increased.
  • the amino acid sequence of wild type leuA (SEQ ID NO: 1) was confirmed by referring to WP_003863358.1 of Genebank. Mutant chromosomal DNA was amplified by polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as 'PCR method').
  • the leuA is known as 616 amino acids, but according to the literature, the translation initiation codon is written after 35, and may be known as 581 amino acids. In this case, the numbers of the amino acids described below may vary, and in the case of assuming that 581 amino acids are additionally indicated by the parentheses.
  • GC which is the 1682 th and 1683 th nucleotides
  • leuA (R558H, G561D) was produced.
  • two fragments were each amplified using primers 5, 7 and primers 8, 6 as templates for ATCC14067 in order to prepare vectors containing respective mutations.
  • the amplified fragment was treated with restriction enzymes SalI and XbaI, and then ligated with pDZ treated with the same enzyme to prepare pDZ-leuA (R558H).
  • PDZ-leuA (G561D) was prepared using primers 5, 9 and primers 10, 6 in the same manner.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC14067 was transformed with each of the pDZ-leuA (R558H), pDZ-leuA (G561D), and pDZ-leuA (R558H, G561D) vectors prepared in Example 2 by electroporation. .
  • Each strain produced through the second crossover process was named 14067 :: leuA (R558H), 14067 :: leuA (G561D) and 14067 :: leuA (R558H, G561D).
  • the 14067 :: leuA (R558H, G561D) strain transformed with the pDZ-leuA (R558H, G561D) vector was named KCJ-0148, and was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on January 25, 2016 to obtain accession number KCCM11811P. Granted.
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC14067 and Corynebacterium glutamicum 14067 :: leuA (R558H), 14067 :: leuA in a 250 ml corner-pool flask containing 25 ml of each production medium (G561D) and 14067 :: leuA (R558H, G561D) were inoculated with 1 platinum each, followed by shaking culture at 200 ° C. for 60 hours at 30 ° C. to produce L-leucine.
  • L-leucine concentration in the culture for each strain tested is shown in Table 1 below.
  • L-leucine producing strain Corynebacterium glutamicum 14067 leuA (R558H), 14067 :: leuA (G561D) and 14067 with R558H, G561D or R558H / G561D mutations in the leuA gene.
  • leuA (R558H, G561D) was found to be about 12 to 25 times the L-leucine production capacity compared to the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC14067.
  • p117_PCJ7-leuA WT
  • p117_PCJ7-leuA R558H
  • p117_PCJ7-leuA G561D
  • p117_PCJ7-leuA R558H, G561D
  • the PCJ7 promoter is known from Korean Patent Nos. 10-0620092 and International Publication No. 2006-065095 as promoters for enhancing expression of genes.
  • Each of the p117_PCJ7-leuA (WT), p117_PCJ7-leuA (R558H), p117_PCJ7-leuA (G561D) and p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D) vectors prepared in Example 5 was used as Corynebacterium glutamicum ATCC14067, KCCM11661P.
  • KCCM11662P by electroporation to 14067 :: p117_PCJ7-leuA (WT), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561D), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D ), KCCM11661P :: p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11661P :: p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P :: p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11661P :: p117_PCJ7-leuA (R558H, G561AP :: K117C, P561DP: (WT), KCCM11662P :: p117_PCJ7-leuA (R558H),
  • L-leucine concentration in the culture for each strain tested is shown in Table 2 below.
  • the L-leucine-producing strain 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561D) and 14067 transformed with an overexpression vector containing a mutation in the leuA gene in the ATCC14067 strain.
  • p117_PCJ7-leuA R558H, G561D
  • KCCM11661P p117_PCJ7-leuA (R558H)
  • KCCM11661P p117_PCJ7-leuA (G561D)
  • KCCM11661P p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D)
  • KCCM11661P p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D) produced 2.3-fold to 4.5-fold production compared to its parent strain, KCCM11661P.
  • L-leucine-producing strain KCCM11662P :: p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P :: p117_PCJ7-leuA (G561D) and KCCM11662P :: p117APCJ7-enhanced transformed overexpression vector containing mutations in the leuA gene in the KCKCM11662P strain (R558H, G561D) produces L-leucine compared to its parent strain KCCM11662P A 2 to 4.2-fold improvement was confirmed.
  • experiments were performed as follows.
  • L-leucine-producing strain Corynebacterium glutamicum 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561D) transformed with IPMS variant expression vectors and 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D) showed 1.05 times, 1.3 times, and 3.2 times more isopropylmaleate synthase activity than Corynebacterium glutamicum 14067 :: p117_PCJ7-leuA (WT), respectively. The improvement was confirmed. In addition, the L-leucine-producing strains confirmed that the inhibition of leucine feedback was released by maintaining IPMS activity at 61%, 70%, and 89%, even when leucine was added 2 g / l.
  • the 558 th arginine produced a variant substituted with alanine (Ala) or glutamine (Gln).
  • the p117_PCJ7-leuA (R558H) vector was used as a template, and primers of SEQ ID NOs: 13 and 14, and primer pairs of SEQ ID NOs: 15 and 16 were used as alanine (Ala P117_PCJ7-leuA (R558A) vector substituted with) and p117_PCJ7-leuA (R558Q) vector substituted with glutamine (Gln) for the 558th amino acid were prepared.
  • the 561th glycine produced a variant substituted with arginine (Arg) or tyrosine (Tyr).
  • P117_PCJ7 using p117_PCJ7-leuA (G561D) as a template with the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18, and the 561th amino acid by arginine (Arg) using primer pairs of SEQ ID NOs: 19 and 20 -leuA (G561R), p117_PCJ7-leuA (G561Y) vector was obtained by replacing the 561th amino acid with tyrosine (Tyr).
  • the p117_PCJ7-leuA (R558A), p117_PCJ7-leuA (R558Q), p117_PCJ7-leuA (G561R) and p117_PCJ7-leuA (G561Y) vectors prepared in Example 9 were electroporated to Corynebacterium glutamicum ATCC14067. 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558A), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558Q), 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561R) and 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561Y) were produced.
  • a 250 ml corner-pool flask containing 25 ml of each production medium was inoculated with 1 platinum each of the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC14067 and each of the strains, followed by 200 rpm at 60C for 60 hours. Shake culture produced L-leucine.
  • L-leucine concentrations in the culture for each strain tested are shown in Table 5 below.
  • L-leucine producing strains Corynebacterium glutamicum 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558A) and 14067 :: p117_PCJ7-leuA (R558Q) are parent strains of Corynebacterium glutamicum It was confirmed that L-leucine production capacity was improved by 32 to 38 times compared to ATCC14067.
  • L-leucine-producing strains Corynebacterium glutamicum 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561R) and 14067 :: p117_PCJ7-leuA (G561Y) were compared to the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC14067. It was confirmed that the production capacity improved about 36 to 40 times.

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Abstract

본 출원은 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 L-류신의 생산 방법
본 출원은 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-류신은 필수 아미노산의 일종으로 의약, 식품, 사료첨가물 및 공업 약품 등에 광범위하게 사용되는 고가의 아미노산으로서, 주로 미생물을 이용하여 생산된다. L-류신을 포함한 분지쇄 아미노산의 발효 생산은, 주로 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 2-케토이소카프로산 (2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다 (대한민국 등록특허 제10-0220018호, 대한민국 등록특허 제10-0438146호).
상기 류신 생합성에 관여하는 효소인 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase, 이하, "IPMS"로 지칭함)는 발린 생합성 경로 중 생성되는 2-케토아이소발러레이트 (2-ketoisovalerate)를 발린 대신 류신 생합성에 필요한 이소프로필말레이트 (isopropylmalate)로 전환하는 류신 생합성의 1 단계 효소로, 류신 생합성 과정에서 중요한 효소이다. 그러나 상기 IPMS는 최종 산물인 L-류신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해를 받는다. 이에 고농도 류신 생산을 목적으로 피드백 저해를 해제한 IMPS 변이체에 대하여 다양한 선행기술이 존재하나 (미국 공개특허 제2015-0079641호, 미국 등록특허 제6403342호), 여전히 더 나은 변이체 발굴에 대한 연구는 지속되고 있다.
본 발명자들은 고농도의 L-류신 생산에 사용할 수 있는 IMPS 변이체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 IMPS 변이체를 개발하였다. 상기 변이체는 최종산물인 L-류신에 대한 피드백 저해가 해제되고 활성도 강화되어, 이를 포함하는 미생물로부터 고수율로 L-류신을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 출원을 완성하였다.
본 출원은 하나의 목적으로, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드를 포함한다.
본 출원은 다른 목적으로, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원은 또 다른 목적으로, 상기 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물을 포함한다.
본 출원은 또 다른 목적으로, 상기 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 방법을 포함한다.
본 출원의 신규한 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 야생형 이소프로필말레이트 신타제에 비해 활성이 증가되고 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 것으로, 이를 이용하여 L-류신을 고수율로 대량 생산할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드이다. 상기 신규 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 본 출원의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 활성이 높을 뿐 아니라 L-류신에 대한 피드백 저해가 해제된 특징을 가진다.
본 출원에서 용어, "이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)"는 2-케토아이소발러레이트 (2-ketoisovalerate)를 아세틸-CoA와 반응시켜 L-류신의 전구체 중 하나인 이소프로필말레이트 (isopropylmalate)로 전환하는 효소이다. 본 출원에서 이소프로필말레이트 신타제는 상기 전환 활성을 가지는 효소이면 미생물 유래에 상관없이 포함될 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움속 미생물 유래의 효소일 수 있다. 더욱 구체적으로 이소프로필말레이트 신타제는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래 이소프로필말레이트 신타제일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 이소프로필말레이트 신타제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 이소프로필말레이트 신타제에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "이소프로필말레이트 신타제의 활성 증가"는 이소프로필 말레이트로의 전환 활성 증가를 의미하므로, 본 출원의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 더 높은 수준의 이소프로필말레이트 전환 활성을 갖는다. 상기 이소프로필말레이트 전환 활성은 생성되는 이소프로필말레이트의 수준을 측정하여 직접 확인하거나, 또는 생성되는 CoA의 수준을 측정하여 간접적으로 확인할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "활성 증가"는 "활성 강화"와 병용하여 사용될 수 있다. 나아가, 이소프로필말레이트는 L-류신의 전구체 중 하나이므로 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 이용하는 경우 서열번호 1의 이소프로필 말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 결과적으로 더 높은 수준으로 L-류신을 생산할 수 있다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드와 달리, 최종 산물인 L-류신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 해제된 특징을 가지는 것일 수 있다. 본 출원에서 용어, "피드백 저해 (feedback inhibition)"는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하는 것을 말한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 출원의 목적상 상기 피드백 저해는 L-류신 또는 이의 유도체가 이의 생합성 경로의 첫 번째 단계를 매개하는 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 저해하는 것일 수 있다. 따라서, 이소프로필말레이트 신타제의 피드백 저해를 해제하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 L-류신의 생산성을 높일 수 있다.
본 출원에서 용어 "변이", "변이형" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻한다. 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)에 상응하는 아미노산 서열이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가되거나, L-류신 및 이의 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되거나 활성 증가와 피드백 저해가 해제가 모두 이루어진 변이체를 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 상기 알지닌 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 글리신 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 알지닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 알지닌 아미노산 잔기가 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된 변이형 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 상기 558 번째 알지닌이 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로 치환되고, 상기 561 번째 글리신이 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 이소프로필말레이트 신타제에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 특정 변이 위치인 558 번째 및/또는 561 번째 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열이 변이된 것은 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 한편, 특정 변이 위치인 558 번째 및 561 번째는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단을 기준으로 파악되는 위치를 의미하는 바, 서열번호 1의 N-말단에 일부 아미노산이 부가 또는 결손되는 경우 해당 아미노산의 개수를 고려하여 산정되는 것 역시 본 출원의 범위 내에 포함되는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 예컨대, 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 유전자인 leuA는 서열번호 1에서는 616 개의 아미노산으로 표기하였으나, 문헌에 따라 번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 581개의 아미노산으로 공지한 경우도 있으므로, 이러한 경우 상기 558 번째 위치는 523 번째 위치로, 561 번째 위치는 526 번째 위치로 해석되어 본 출원의 범위에 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로는 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지면서 서열번호 21 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 이와 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드 또는 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지며 상기 폴리펩티드에서 특정 변이 위치인 558 번째 및/또는 561 번째 아미노산 서열이 변이된 것은 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제한 없이 포함될 수 있다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열도 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 상동성이 높은 유전자끼리, 예를 들면, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 약 300bp 정도 길이의 프로브를 사용하는 경우에, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 제시될 수 있다.
한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36 내지 서열번호 50 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 변이형 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물이다.
본 출원에서 상기 미생물은 형질전환을 통해 인공적으로 제조되거나, 또는 자연적으로 발생되는 것을 모두 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물 일 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 본 출원에서 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법, 열 충격법 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환되는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체, 예를 들어 벡터의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함할 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) 같은 트랜스포존 (Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 pECCG117 벡터를 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현/치환 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수 있는 재조합 벡터일 수 있다.
본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균 등의 미생물에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에서 선별 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린 (ampicilin), 테트라사이클린 (tetracyclin), 카나마이신 (kanamycin), 클로람페니콜 (chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신 (neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 것을 의미한다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어, "벡터가 도입된 (형질전환된) 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는, 상기의 벡터를 도입하여 이소프로필말레이트 신타제를 생산할 수 있는 변이형 폴리펩티드를 포함한 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 속 (Escherichia sp.), 어위니아 속 (Erwinia sp .), 세라티아 속 (Serratia sp .), 프로비덴시아 속 (Providencia sp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 및 브레비박테리움 속 (Brevibacterium sp .)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 상기 코리네박테리움 속의 미생물의 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 상기 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물은 상기 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함한다.
본 출원의 또 다른 양태는, (a) 상기 L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 미생물 또는 배양 배지로부터 L-류신을 회수하는 단계를 포함하는, L-류신을 생산하는 방법이다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 35 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생성된 L-류신을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 배지로부터 목적하는 L-류신을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-류신을 회수할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 류신 생산능을 가지는 미생물 KCCM11661P의 leuA 염기서열 확인
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 121 ℃에서 15 분간 멸균한 하기 기재된 성분의 종배지에 접종하고, 13 시간 동안 배양한 후 배양액 25 ㎖을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액 (citrate buffer)으로 세척한 후, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 400 ㎍/㎖가 되게 첨가하여 30 분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액 (phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 하기 기재된 성분의 최소배지에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 99.6 %였다. 노르류신 (Norleucine, NL)에 대한 내성 변이주를 구하기 위해서, NTG가 처리된 균주를 NL의 최종농도가 각각 20 mM, 40 mM 및 50 mM이 되게 첨가된 최소배지에 도말하고, 30 ℃에서 5 일간 배양하여 NL 내성 변이주를 획득하였다.
<종배지>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준), pH 7.0
<생산배지>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 (Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1,000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3,000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0
상기의 방법으로 얻어진 변이주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-24 (Corynebacterium glutamicum KCJ-24)와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-28(Corynebacterium glutamicum KCJ-28)라 명명하였고, 2015년 1월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM11661P 및 KCCM11662P를 부여받았다. 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-24와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-28은 각각 2.7, 3.1g/L의 농도로 L-류신을 생산하여, 모균주에 비해 약 10 배 이상 L-류신 생산성이 증가한 것을 확인하였다.
다음으로, 상기 변이주 KCCM11661P 에서 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase, IPMS)를 암호화하는 유전자 (leuA)의 변이 여부를 확인하고자 하였다. 야생형 leuA의 아미노산 서열 (서열번호 1)은 Genebank의 WP_003863358.1을 참고하여 확인하였다. 변이주의 염색체 DNA를 중합효소 연쇄반응방법 (이하 'PCR 방법'이라 함)을 통하여 증폭하였다. 상기 leuA는 616 개 아미노산으로 공지되었으나 문헌에 따라 번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 581 개의 아미노산으로 공지한 경우도 있다. 이 경우 하기에 변이로 기재한 아미노산의 번호가 달라질 수 있어, 581 개의 아미노산임을 전제로 하는 경우는 괄호로 변이 위치를 추가 표기하였다.
구체적으로, 먼저 상기 변이주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 2 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 2700 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 이를 동일한 프라이머로 염기서열을 분석한 결과, KCCM11661P에서 leuA 유전자의 1673 번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 IPMS 단백질의 558 번째 (또는 523 번째; 이하 558 번째로만 표기) 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되는 변이임을 의미한다. 또한, 1682 번째, 1683 번째 뉴클레오티드인 GC가 AT로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 561 번째 (또는 526 번째, 이하 561 번째로만 표기) 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환되는 변이임을 의미한다.
실시예 2 : IPMS 변이체 치환 벡터 제작
상기 실시예 1에서 확인된 변이 염기서열을 포함하는 벡터를 제작하고자, 상기 변이주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 5과 6의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 SalI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1460 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 SalI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)로 라이게이션 (ligation)을 통해 pDZ-leuA(R558H, G561D)를 제작하였다. 또한, 각각의 변이가 들어간 벡터를 제작하기 위해 ATCC14067을 주형으로 프라이머 5, 7 및 프라이머 8, 6을 이용하여 각각 2 개의 단편을 증폭하였다. 제작한 두 개의 단편을 주형으로 하여 프라이머 5, 6을 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 SalI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1460 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 SalI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 라이게이션을 통해 pDZ-leuA(R558H) 를 제작하였다. 동일한 방법으로 프라이머 5, 9 및 프라이머 10, 6을 이용하여 pDZ-leuA(G561D)를 제작하였다.
실시예 3 : IPMS 변이체 치환 균주 제작
상기 변이주에서 발견된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 균주를 제작하기 위해, 모균주로서 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 사용하였다.
전기천공법에 의해 상기 실시예 2에서 제작된 각각의 pDZ-leuA(R558H), pDZ-leuA(G561D), pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 형질전환시켰다. 2 차 교차 과정을 거쳐 제작된 각각의 균주를 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)로 명명하였다. leuA의 염기치환 여부는, 서열번호 3과 4 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 2 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 2700 개 염기쌍의 단편을 증폭한 후 동일한 프라이머로 염기서열을 분석하여 확인하였다.
상기 pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터로 형질전환된 14067::leuA(R558H, G561D) 균주를 KCJ-0148이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2016 년 1 월 25 일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11811P를 부여받았다.
실시예 4 : IPMS 변이체 치환 균주에서의 L- 류신 생산
상기 실시예 3에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 상기 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 1과 같다.
IPMS 변이체 치환 균주에서의 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067::leuA(R558H) 1.2
14067::leuA(G561D) 1.6
14067::leuA(R558H, G561D) 2.5
상기 표 1에 나타난 바와 같이, leuA 유전자에 R558H, G561D 또는 R558H/G561D 변이가 있는 L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 비해 L-류신 생산능이 약 12 내지 25 배 향상됨을 확인하였다.
실시예 5 : IPMS 변이체 과발현 벡터 제작
상기 실시예 1에서 확인된 변이 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하고자, ATCC14067 및 실시예 3에서 제작한 변이주 3 종의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA 중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 NdeI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 2050 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 NdeI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pECCG117 (Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726 (1991)) 벡터에 PCJ7 프로모터가 삽입된 p117_PCJ7를 이용하여 라이게이션을 통해 p117_PCJ7-leuA(WT), p117_PCJ7-leuA(R558H), p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 p117_ PCJ7-leuA(R558H, G561D) 발현 벡터를 제작하였다. PCJ7 프로모터는 유전자의 발현을 강화시키는 프로모터로 대한민국 등록특허 제10-0620092호 및 국제 공개특허 제2006-065095호에 공지되어 있다.
실시예 6 : IPMS 변이체 과발현 벡터가 형질전환된 균주 제작
상기 실시예 5에서 제작된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 균주를 제작하기 위해, 모균주인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 류신 생산균주 KCCM11661P, KCCM11662P를 사용하였다.
상기 실시예 5에서 제작된 각각의 p117_PCJ7-leuA(WT), p117_PCJ7-leuA(R558H), p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, KCCM11661P 및 KCCM11662P에 전기천공법으로 형질전환시켜 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)를 제작하였다.
실시예 7 : IPMS 변이체 과발현 벡터가 형질전환된 균주에서의 L- 류신 생산
상기 실시예 6에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D), KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11661P::117PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, KCCM11661P, KCCM11662P 및 상기 실시예 6에서 제작한 균주들을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 2과 같다.
IPMS 변이체 과발현 균주에서 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067:: p117_PCJ7-leuA(WT) 0.3
14067:: p117_PCJ7-leuA(R558H) 4.5
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 5.1
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 9.8
KCCM11661P 2.7
KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(WT) 3.0
KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(R558H) 6.1
KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 6.8
KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 12.3
KCCM11662P 3.1
KCCM11662P:: p117_PCJ7-leuA(WT) 3.3
KCCM11662P:: p117_PJ7-leuA(R558H) 6.3
KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 6.9
KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 13.1
상기 표 2에 나타난 바와 같이, ATCC14067 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 이의 모균주인 ATCC14067에 비해 L-류신 생산이 45 내지 98 배 향상되었으며, KCCM11661P 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 이의 모균주인 KCCM11661P에 비해 L-류신 생산이 2.3 배 내지 4.5 배 향상되었으며, KCKCM11662P 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D)는 이의 모균주인 KCCM11662P에 비해 L-류신 생산이 2 내지 4.2 배 향상됨을 확인하였다.
실시예 8: leuA의 과발현벡터가 형질전환된 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제 활성 측정
상기 실시예 6에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)에서 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
각각의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 상기 균주 4 종을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 16 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양종료 후 배양액을 원심분리하여 상층액은 버리고, 펠렛을 용균완충용액으로 세척 및 혼탁하여 구슬파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 용균액의 단백질 정량은 브래드포드법을 따랐으며, 100 ㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 CoA를 측정함으로써 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성측정 결과는 하기 표 3과 같다.
균주 상대적 IPMS 활성 (%)
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 100
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H) 105
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 130
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 328
다음으로, 상기 효소의 류신에 대한 피드백 저해에 대한 해제 정도를 확인하기 위해 류신이 3 g/l 첨가된 조건에서 100 ㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 CoA를 측정함으로써 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성측정 결과는 하기 표 4와 같다.
균주 류신 0 g/l 류신 2 g/l
상대적 IPMS 활성 (%)
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 100 24
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H) 100 61
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 100 70
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 100 89
상기 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, IPMS 변이체 발현벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 대조군인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT)에 비해 이소프로필말레이트 신타제의 활성이 각각 1.05 배, 1.3 배, 3.2 배로 향상됨을 확인하였다. 또한, 상기 L-류신 생산균주들은 류신이 2 g/l 첨가된 조건에서도 IPMS 활성을 각각 61 %, 70 %, 89 %로 유지하는 것을 확인하여 류신에 의한 피드백 저해가 해제되었음을 확인하였다.
실시예 9: 이소프로필말레이트 신타아제 변이체 개량을 위한 벡터 제작
상기 실시예 4, 7 및 8에서, 이소프로필말레이트 신타아제의 아미노산 서열 (서열번호 1) 중 상기 558 번째 및 561 번째 아미노산이 IPMS 변이체 효소 활성에 중요한 위치임을 확인하였기 때문에, 상기 변이체 외 다른 아미노산으로 치환하였을 때에도 효소 활성이 강화되고 또는 피드백 저해가 더욱 해제될 수 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 구조적 변이를 일으킬 수 있는 다른 아미노산 그룹의 아미노산으로 치환한 변이체를 제작하기로 하였다.
558 번째 알지닌은 알라닌 (Ala) 또는 글루타민 (Gln)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 위치 지정 돌연변이 생성 (Site directed mutagenesis) 방법을 사용하여 p117_PCJ7-leuA(R558H) 벡터를 주형으로 서열번호 13 및 14의 프라이머, 및 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍을 이용하여 558 번째 아미노산을 알라닌 (Ala)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(R558A), 558 번째 아미노산을 글루타민 (Gln)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(R558Q) 벡터를 제조하였다.
561 번째 글리신은 알지닌 (Arg) 또는 타이로신 (Tyr)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 위치 지정 돌연변이 생성 방법을 사용하여 p117_PCJ7-leuA(G561D)를 주형으로 서열번호 17 및 18의 프라이머, 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍을 이용하여 561 번째 아미노산을 알지닌 (Arg)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(G561R), 561 번째 아미노산을 타이로신 (Tyr)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(G561Y) 벡터를 확보하였다.
실시예 10: 이소프로필말레이트 개량 변이체를 도입한 균주 제작
상기 실시예 9 에서 제작된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 형질전환된 균주를 제작하기 위해, 모균주로서 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 사용하였다.
상기 실시예 9에서 제작된 각각의 p117_PCJ7-leuA(R558A), p117_PCJ7-leuA(R558Q), p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 p117_PCJ7-leuA(G561Y) 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 전기천공법으로 형질전환시켜 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)를 제작하였다.
실시예 11 : 이소프로필말레이트 신타아제 개량 변이체를 도입한 균주에서의 L-류신 생산
상기 실시예 10에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 상기 균주 4 종을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 5과 같다.
IPMS 변이체 과발현 균주에서 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 0.3
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H)(실시예 7) 4.5
14067::p117_PCJ7-leuA(R558A) 3.8
14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q) 3.2
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D)(실시예 7) 5.1
14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 4.0
14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y) 3.6
상기 표 5에 나타난 바와 같이, L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 비해 L-류신 생산능이 32 내지 38 배 향상 됨을 확인하였다.
또한, L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 에 비해 L-류신 생산능이 약 36 배 내지 40 배 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 이소프로필말레이트 신타아제의 아미노산 서열 (서열번호 1) 중 상기 558 번째 및 561 번째 아미노산이 IPMS 변이체 효소 활성에 중요한 위치이며, 또한 야생형 IPMS 단백질의 558 및 561 번째 아미노산이 각각 히스티딘 및 아스파르트산으로 치환되는 경우뿐만 아니라 다른 아미노산으로 치환되는 경우에도, 이러한 변이를 포함하는 균주에서 L-류신의 생산능이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명 보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2017011622-appb-I000001
Figure PCTKR2017011622-appb-I000002
Figure PCTKR2017011622-appb-I000003

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 알지닌 (arginine) 아미노산 잔기가 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 (glycine) 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 558 번째 알지닌이 히스티딘 (histidine), 알라닌 (alanine) 또는 글루타민 (glutamine)으로 치환된, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 561 번째 글리신이 아스파르트산 (aspartic acid), 알지닌 (alginine) 또는 타이로신 (tyrosine)으로 치환된, 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 558 번째 알지닌이 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로 치환되고, 상기 561 번째 글리신이 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된, 변이형 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 서열번호 35으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된, 변이형 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36 내지 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성된, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된, L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  11. (a) 제8항의 L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 또는 배양 배지로부터 L-류신을 회수하는 단계를 포함하는,
    L-류신을 생산하는 방법.
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