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WO2021261577A1 - 改変された遺伝暗号表を有する翻訳系 - Google Patents

改変された遺伝暗号表を有する翻訳系 Download PDF

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WO2021261577A1
WO2021261577A1 PCT/JP2021/024075 JP2021024075W WO2021261577A1 WO 2021261577 A1 WO2021261577 A1 WO 2021261577A1 JP 2021024075 W JP2021024075 W JP 2021024075W WO 2021261577 A1 WO2021261577 A1 WO 2021261577A1
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WO
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trna
codon
amino acid
translation system
represented
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/024075
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English (en)
French (fr)
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香緒梨 西村
貴昭 谷口
正次郎 篠原
万奈 籠谷
美樹 美細津
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US18/010,608 priority patent/US20240052340A1/en
Priority to EP21828111.1A priority patent/EP4166675A4/en
Priority to JP2022532551A priority patent/JPWO2021261577A1/ja
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • This disclosure relates to a translation system having a modified genetic code table and how to use it.
  • the display library is a very useful technology that can efficiently acquire molecules that bind to target proteins in terms of evolutionary engineering.
  • a high degree of diversity is required. Panning from the library you have is required.
  • Non-Patent Document 1 Reconstructed cell-free translation systems such as PURESYSTEM (Non-Patent Document 1) are natural because the concentrations of constituent components such as amino acids, tRNAs, and aminoacyl-tRNA synthesizes (ARS) can be adjusted. Codon-amino acid association can be changed.
  • ARS aminoacyl-tRNA synthesizes
  • Non-Patent Document 2 there is “play” in the pairing of the third letter of the codon and the first letter of the anticodon, which is called a wobble base pair in addition to the Watson-Crick base pair. Pairing between G and U is possible. Therefore, the anticodon GNN decodes the NNU and NNC codons, and the anticodon UNN decodes the NNA and NNG codons, making it impossible to distinguish between these codons and the amino acids that can be introduced into one codon box. The type is limited to a maximum of 2 amino acids (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 4, Patent Document 1
  • Non-Patent Document 4 Patent Document 1
  • the versatility of the amino acids that can be selected is considered to be low.
  • aminoacyl-tRNA prepared outside the system is used for translation, an aminoacyl-tRNA having a higher concentration than the concentration of aminoacyl-tRNA prepared by ARS in the system is required, and in that case, it is difficult to distinguish between NNA and NNG codon. It has also been mathematically shown to be (Non-Patent Document 5).
  • the quality of the display library is determined by applying various amino acids to the codon table and accurately reading and translating each codon. It is very important that the amino acids assigned to each codon are specifically translated from each codon.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), respectively.
  • At least two amino acids or amino acid analogs are translatable from the codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, [1].
  • Translation system described in. [3] (I) TRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and represented by M 1 M 2 G. A tRNA that has an anticodon complementary to the codon, or (Ii) TRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and represented by M 1 M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), respectively.
  • a translation system in which different amino acids or amino acid analogs are bound to the three types of tRNAs in (i) and (ii).
  • At least three amino acids or amino acid analogs are translatable from the codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, [1].
  • M 1 and M 2 are any of the following (i) to (x): (I) M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U), (Ii) M 1 is uridine (U) and M 2 is adenosine (A), (Iii) M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G).
  • M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A)
  • V M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G)
  • Vi M 1 is adenosine (A) and M 2 is uridine (U)
  • Vii M 1 is adenosine (A) and M 2 is cytidine (C)
  • Viii M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A)
  • (Ix) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G)
  • x M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • M 1 and M 2 are any of the following (i) to (vii): (I) M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U), (Ii) M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G), (Iii) M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A), (Iv) M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G), (V) M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A), (Vi) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G), or (vii) M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • the concentration of the tRNA contained in the translation system per codon is (i) 0.8 to 1000 ⁇ M, (ii) 1.6 to 500 ⁇ M, (iii) 3.2 to 250 ⁇ M, (iv) 6.4 to 150 ⁇ M, or (iv).
  • Translation system [12] The translation system according to any one of [1] to [11], wherein more than 20 kinds of amino acids or amino acid analogs can be translated from one genetic code table.
  • the translation system according to any one of [1] to [12] which is a cell-free translation system.
  • a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 A and a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 G are said outside the translation system.
  • the tRNA is obtained by any of [1] to [17], which is obtained by a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or a method using an aminoacyl-tRNA synthetase (ARS). Translation system described in Crab.
  • [20] The binding of an amino acid or an amino acid relative to tRNA outside the translation system is carried out by the pCpA method, the pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or a method using an aminoacyl-tRNA synthase (ARS).
  • [21] A method for producing a peptide, which comprises translating a nucleic acid using the translation system according to any one of [1] to [18] or the translation system obtained by the method according to [19] or [20].
  • the method of [21], wherein the peptide is a peptide having a cyclic moiety.
  • [24] Production of a peptide library comprising translating a nucleic acid library using the translation system according to any one of [1] to [18] or the translation system obtained by the method according to [19] or [20].
  • Method. [25] A peptide library produced by the method according to [24].
  • [26] [25] A method for identifying a peptide having a binding activity to the target molecule, which comprises contacting the target molecule with the peptide library according to [25].
  • [27] The translation system according to any one of [1] to [18], wherein the anticodon does not contain lysidine.
  • [29] The translation system according to any one of [1] to [18], [27] and [28], wherein the anticodon does not contain agmatidine.
  • [30] The translation system according to any one of [1] to [18] and [27] to [29], wherein the anticodon does not contain an agmatidine derivative.
  • [31] The translation according to any of [1] to [18] and [27] to [30], further comprising a nucleic acid comprising a codon represented by M 1 M 2 A and a codon represented by M 1 M 2 G. system.
  • the nucleic acid is (i) a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G, or (ii) M 1 M 2 31.
  • the translation system according to [31] comprising a codon represented by C, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G.
  • a method for producing a peptide which comprises translating a nucleic acid using a translation system.
  • the translation system comprises a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A and a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), respectively.
  • a method for producing a peptide which comprises translating a nucleic acid using a translation system.
  • the translation system (I) TRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and represented by M 1 M 2 G.
  • a tRNA that has an anticodon complementary to the codon or (Ii) TRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and represented by M 1 M 2 G.
  • Contains tRNAs with anticodons complementary to the codons M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), respectively.
  • [104] At least three amino acids or amino acid analogs are translatable from the codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, [101].
  • M 1 and M 2 are any of the following (i) to (x): (I) M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U), (Ii) M 1 is uridine (U) and M 2 is adenosine (A), (Iii) M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G).
  • M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A)
  • V M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G)
  • Vi M 1 is adenosine (A) and M 2 is uridine (U)
  • Vii M 1 is adenosine (A) and M 2 is cytidine (C)
  • Viii M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A)
  • (Ix) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G)
  • x M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • M 1 and M 2 are any of the following (i) to (vii): (I) M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U), (Ii) M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G), (Iii) M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A), (Iv) M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G), (V) M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A), (Vi) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G), or (vii) M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • the concentration of the tRNA contained in the translation system per codon is (i) 0.8 to 1000 ⁇ M, (ii) 1.6 to 500 ⁇ M, (iii) 3.2 to 250 ⁇ M, (iv) 6.4 to 150 ⁇ M, or (iv).
  • the tRNA is an initiating tRNA or an extended tRNA.
  • tRNA is a tRNA derived from a prokaryote or a eukaryote.
  • A adenosine
  • G guanosine
  • C cytidine
  • U uridine
  • the tRNA is obtained by any of [101] to [117], which is obtained by a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or a method using an aminoacyl-tRNA synthetase (ARS). The method described in Crab.
  • the method according to any of [101] to [118], wherein the nucleic acid comprises a codon represented by M 1 M 2 A and a codon represented by M 1 M 2 G.
  • the nucleic acid is (i) a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G, or (ii) M 1 M 2
  • a kit or composition for producing a peptide which is a kit or composition for producing a peptide. It contains a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), respectively.
  • kits or compositions Choose from one, The kit or composition to which different amino acids or amino acid analogs are bound to the two types of tRNA.
  • At least two amino acids or amino acid analogs are translatable from the codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, [201].
  • the method described in. [203] A kit or composition for producing a peptide, which is a kit or composition for producing a peptide.
  • a tRNA that has an anticodon complementary to the codon or (Ii) TRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and represented by M 1 M 2 G.
  • Contains anticodons that are complementary to codons M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 are either adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), or uridine (U), respectively.
  • A adenosine
  • G guanosine
  • C cytidine
  • U uridine
  • M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A)
  • V M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G)
  • Vi M 1 is adenosine (A) and M 2 is uridine (U)
  • Vii M 1 is adenosine (A) and M 2 is cytidine (C)
  • Viii M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A)
  • (Ix) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G)
  • x M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • M 1 and M 2 are any of (i) to (vii) below: (I) M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U), (Ii) M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G), (Iii) M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A), (Iv) M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G), (V) M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A), (Vi) M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G), or (vii) M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A).
  • the concentration of the tRNA per codon is (i) 0.8 to 1000 ⁇ M, (ii) 1.6 to 500 ⁇ M, (iii) 3.2 to 250 ⁇ M, (iv) 6.4 to 150 ⁇ M, or (v) 10 to 100 ⁇ M.
  • kits or composition according to any one of [201] to [209], wherein the tRNA is a prokaryotic or eukaryotic tRNA.
  • Kit or composition Kit or composition.
  • the translation system is a cell-free translation system. [214] 213.
  • a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 A and a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 G are said outside the translation system.
  • the tRNA is obtained by a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or a method using an aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), any of [201] to [217].
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CUU, CUA, and CUG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 6 for specific measured values).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are GUU, GUA, and GUG.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAU, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 8 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-7 (anticodon: aug, amino acid: nBuG)
  • Compound AAtR-8 (anticodon: uug, amino acid: Pic2)
  • Compound AAtR-9 (anticodon: cug, amino acid: dA)
  • mRNA: mR-7 (CAU codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are AAU, AAA, AAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 9 for specific measured values).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are GAU, GAA, and GAG.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are UUU, UUA, and UUG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 11 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-16 (anticodon: aaa, amino acid: nBuG)
  • Compound AAtR-17 (anticodon: uaa, amino acid: Pic2)
  • Compound AAtR-18 (anticodon: caa, amino acid: dA)
  • mRNA: mR-16 (UUU codon) (Including) mR-17 (including UUA codon) mR-18 (including UUG codon)
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are AGU, AGA, and AGG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 12 for specific measured values).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are UGC, UGA, and UGG.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAC, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 14 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-26 (anticodon: gug, amino acid: nBuG)
  • Compound AAtR-8 (anticodon: uug, amino acid: Pic2)
  • Compound AAtR-9 (anticodon: cug, amino acid: dA)
  • mRNA: mR-25 (CAC codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are AAC, AAA, AAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 15 for specific measured values).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are AGC, AGA, and AGG.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAU, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 17 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-29 (anticodon: aug, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-30 (anticodon: uug, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-31 (anticodon: cug, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA: mR-7 (CAU codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are AAU, AAA, AAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 18 for specific measured values).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are GAU, GAA, and GAG.
  • tRNA Compound AAtR-35 (anticodon: auc, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-36 antagonisticodon: uuc, amino acid: StBuOH
  • Compound AAtR-37 antagonisticodon: cuc, amino acid: MeSnPr
  • mRNA mR-13 (GAU codon) (Including) mR-14 (including GAA codon) mR-15 (including GAG codon)
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are UUU, UUA, and UUG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 20 for specific measured values).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are AGU, AGA, and AGG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 21 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-41 (anticodon: acu, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-42 (anticodon: ucu, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-43 (anticodon: ccu, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA: mR-19 (AGU codon) Includes) mR-20 (including AGA codon) mR-21 (including AGG codon)
  • 17 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are UGC, UGA, and UGG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 22 for specific measured values).
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are CAC, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 23 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-47 (anticodon: gug, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-30 antagonisticodon: uug, amino acid: StBuOH
  • Compound AAtR-31 antagonisticodon: cug, amino acid: MeSnPr
  • mRNA: mR-25 (CAC codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are AAC, AAA, AAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 24 for specific measured values).
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are GAC, GAA, and GAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 25 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-49 (anticodon: guc, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-36 (anticodon: uuc, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-37 (anticodon: cuc, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA: mR-27 (GAC codon) (Including) mR-14 (including GAA codon) mR-15 (including GAG codon)
  • 21 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are UUC, UUA, and UUG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 26 for specific measured values).
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are AGC, AGA, and AGG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 27 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-51 (anticodon: gcu, amino acid: MeA3Pyr)
  • Compound AAtR-42 (anticodon: ucu, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-43 (anticodon: ccu, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA: mR-29 (AGC codon) Includes) mR-20 (including AGA codon) mR-21 (including AGG codon)
  • 23-1 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CGC, CGA, and CGG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28 for specific measured values).
  • FIG. 23-2 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are CAU, CAA, and CAG.
  • FIG. 23-3 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAU, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28-3 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-63 (anticodon: aug, amino acid: nBuGly)
  • Compound AAtR-64 (anticodon: uug, amino acid: Pic2)
  • Compound AAtR-65 (anticodon: cug, amino acid: dA)
  • mRNA: mR-7 (CAU codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • 23-4 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAC, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28-4 for specific measured values).
  • FIG. 23-5 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are CAC, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28-5 for specific measured values).
  • tRNA Compound AAtR-69 (anticodon: gug, amino acid: nBuGly)
  • Compound AAtR-70 (anticodon: uug, amino acid: Pic2)
  • Compound AAtR-71 (anticodon: cug, amino acid: dA)
  • mRNA: mR-25 (CAC codon) Includes) mR-8 (including CAA codon) mR-9 (including CAA codon)
  • 23-6 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are GAU, GAA, and GAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28-6 for specific measured values).
  • FIG. 23-7 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are CAU, CAA, and CAG.
  • tRNA Compound AAtR-75 (anticodon: aug, amino acid: MeA3Pr)
  • Compound AAtR-76 (anticodon: uug, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-77 (anticodon: cug, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA: mR-7 (CAU codon) Includes) mR-8 (including CAA codon)
  • mR-9 including CAA codon
  • 23-8 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7.
  • the codons evaluated are CAC, CAA, and CAG.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of peptide translation obtained when translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below (see Table 28-8 for specific measured values).
  • FIG. 23-9 is a diagram showing the results of translation evaluation of three types of amino acid readings in one codon box, as described in Examples 6 to 7. The codons evaluated are GAU, GAA, and GAG.
  • tRNA Compound AAtR-81 (anticodon: auc, amino acid: MeA3Pr)
  • Compound AAtR-82 (anticodon: uuc, amino acid: StBuOH)
  • Compound AAtR-83 (anticodon: cuc, amino acid: MeSnPr)
  • mRNA mR-13 (GAU codon) (Including) mR-14 (including GAA codon) mR-15 (including GAG codon)
  • 24-1 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are UCU, UCC, UCA, UCG.
  • Translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below, and the translation amount of each peptide obtained as a result is shown on the vertical axis of the graph (see Table 29-1 for specific measured values).
  • FIG. 24-2 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are UCU, UCC, UCA, UCG.
  • tRNA Compound AAtR-52 (including codon UCC) mR-30 (including codons UCU)
  • mR-31 (anticodon: uga, amino: MeHph)
  • FIG. 29-2 for measured values.
  • 25-1 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are ACU, ACC, ACA, ACG.
  • Translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below, and the translation amount of each peptide obtained as a result is shown on the vertical axis of the graph (see Table 30-1 for specific measured values).
  • FIG. 25-2 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAed tRNA are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are ACU, ACC, ACA, ACG.
  • tRNA Compound AAtR-53 (including the codon ACC) mR-34 (including the codons for ACU) mR-35: (anticodon: UGU, amino: MeHph) tRNA Concentration: 12.8 ⁇ M 6.4 ⁇ M 3.2 ⁇ M 1.6 ⁇ M 0.8 ⁇ M mRNA mR-36 (including ACA codon) mR-37 (including ACG codon)
  • FIG. 30-2 for measured values.
  • 26-1 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • Translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below, and the translation amount of each peptide obtained as a result is shown on the vertical axis of the graph (see Table 31-1 for specific measured values).
  • FIG. 26-2 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAed tRNA are different, as described in Examples 6 to 7. .. The codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • tRNA Compound AAtR-54 (including codon AUC) mR-38 (including codons AUU) mR-39: (anticodon: UAU, amino: MeHph) tRNA Concentration: 12.8 ⁇ M 6.4 ⁇ M 3.2 ⁇ M 1.6 ⁇ M 0.8 ⁇ M mRNA mR-40 (including AUA codon) mR-41 (including AUG codon)
  • 27-1 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • Translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below, and the translation amount of each peptide obtained as a result is shown on the vertical axis of the graph (see Table 32-1 for specific measured values).
  • FIG. 27-2 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs differ, as described in Examples 6 to 7. .. The codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • tRNA Compound AAtR-55 (including codon AUC) mR-38 (including codons AUU) mR-39: (anticodon: UAU, amino: MeHph) tRNA Concentration: 12.8 ⁇ M 6.4 ⁇ M 3.2 ⁇ M 1.6 ⁇ M 0.8 ⁇ M mRNA mR-40 (including AUA codon) mR-41 (including AUG codon)
  • 28-1 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. ..
  • the codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • Translation is performed with each combination of tRNA and mRNA described below, and the translation amount of each peptide obtained as a result is shown on the vertical axis of the graph (see Table 33-1 for specific measured values).
  • FIG. 28-2 is a diagram showing the results of evaluating changes in the translation amounts of the target peptide and cross-read under conditions where the concentrations of aminoacyl-tRNAs are different, as described in Examples 6 to 7. .. The codons evaluated are AUU, AUC, AUA, and AUG.
  • tRNA Compound AAtR-56 (including codon AUC) mR-38 (including codons AUU) mR-39: (anticodon: UAU, amino: Ile) tRNA Concentration: 12.8 ⁇ M 6.4 ⁇ M 3.2 ⁇ M 1.6 ⁇ M 0.8 ⁇ M mRNA mR-40 (including AUA codon) mR-41 (including AUG codon)
  • a "codon” is a combination (triplet) of three nucleosides corresponding to each amino acid when genetic information in the living body is translated into a protein.
  • DNA four types of bases, adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T), are used, and in the case of mRNA, adenine (A), guanine (G), and cytosine are used.
  • Four types of bases (C) and uracil (U) are used.
  • the table showing the correspondence between each codon and the amino acid is called the genetic code table or the codon table, and 20 kinds of amino acids are assigned to 61 kinds of codons excluding the stop codon (Table 1).
  • the genetic code table shown in Table 1 is also called a standard genetic code table or a universal genetic code table because it is commonly used in almost all organisms in eukaryotes and prokaryotic organisms (eubacteria and archaea). ..
  • the genetic code table used in a naturally occurring organism is referred to as a natural genetic code table, and is referred to as an artificially reprogrammed genetic code table (with modified codon-amino acid correspondence). Distinguish.
  • four codons that are common to the first and second characters but differ only in the third character are usually grouped together in one box, which is called a codon box.
  • codons in mRNA may be represented by "M 1 M 2 M 3". Where M 1 , M 2 , and M 3 represent the first, second, and third letters of the codon, respectively.
  • Anticodon is three consecutive nucleosides on tRNA that correspond to codons on mRNA. Similar to mRNA, four types of bases are used for anticodon: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and uracil (U). Further, a modified base obtained by modifying them may be used. By specifically recognizing codons by anticodons, genetic information on mRNA is read and translated into proteins. The 5'to 3'direction codon sequence on the mRNA and the 5'to 3'direction anticodon sequence on the tRNA complementarily bind to the nucleosides of the first, second, and third letters of the codon. , Anticodons form complementary base pairs with the third, second, and first nucleosides of the anticodon, respectively.
  • the anticodon in tRNA may be represented by "N 1 N 2 N 3".
  • N 1 , N 2 , and N 3 represent the nucleosides of the first, second, and third letters of the anticodon, respectively.
  • N 1 , N 2 , and N 3 are numbered at positions 34, 35, and 36 of the tRNA, respectively.
  • thermodynamically stable base pairs combinations of nucleic acids that can form thermodynamically stable base pairs are said to be "complementary" to each other.
  • Watson-click base pairs such as adenosine and uridine (AU), guanosine and cytidine (GC), guanosine and uridine (GU), inosine and uridine (IU), inosine and adenosine (IA), inosine and cytidine (IC).
  • AU adenosine and uridine
  • GC guanosine and cytidine
  • GUI guanosine and uridine
  • IA inosine and adenosine
  • IC inosine and cytidine
  • RNA essential RNA
  • Genetic information is encoded on mRNA as codons, which correspond to all 20 types of amino acids. Protein translation begins at the start codon and ends at the stop codon.
  • the start codon in eukaryotes is AUG, but in eukaryotes (eubacteria and archaea), GUG and UUG may be used as start codons in addition to AUG.
  • AUG is a codon that encodes methionine (Met), and in eukaryotes and archaea, translation is started from methionine as it is.
  • stop codons UAA (ocher), UAG (amber), and UGA (opal).
  • RF release factor
  • Transfer RNA is a short RNA of 100 bases or less that mediates peptide synthesis using mRNA as a template. On the secondary structure, it has a clover leaf-like structure consisting of three stem loops (D arm, anticodon arm, T arm) and one stem (acceptor stem). Depending on the tRNA, one additional variable loop may be included.
  • anticodon arm there is a region consisting of three consecutive nucleosides called anticodons, and the codons are recognized by the anticodons forming a base pair with the codons on the mRNA.
  • a nucleic acid sequence consisting of cytidine-cytidine-adenosine exists at the 3'end of tRNA, and an amino acid is added to the adenosine residue at the end (specifically, ribose of the adenosine residue).
  • the hydroxyl group at the 2- or 3-position of the amino acid and the carboxyl group of the amino acid are ester-bonded).
  • Amino acid-added tRNAs are called aminoacyl-tRNAs.
  • aminoacyl-tRNA is also included in the definition of tRNA.
  • a method is known in which two terminal residues (C and A) are removed from the CCA sequence of tRNA and used for the synthesis of aminoacyl-tRNA.
  • a tRNA from which such a 3'-terminal CA sequence has been removed is also included in the definition of tRNA in the present disclosure.
  • aminoacyl-tRNA synthetase aaRS or ARS.
  • aaRS aminoacyl-tRNA synthetase
  • Each nucleoside in tRNA is numbered according to the tRNA numbering rule (SRocl et al., Nucleic Acids Res (1998) 26: 148-153). For example, anticodons are numbered at positions 34-36 and CCA sequences are numbered at positions 74-76.
  • “Initiator tRNA” is a specific tRNA used at the start of translation of mRNA.
  • the initiation tRNA bound to the initiation amino acid is introduced into the ribosome catalyzed by an initiation factor (IF) and binds to the initiation codon on the mRNA to initiate translation.
  • IF initiation factor
  • AUG which is a methionine codon
  • the start tRNA has an anticodon corresponding to AUG, and methionine (formylmethionine in prokaryotes) is bound as the start amino acid. There is.
  • Elongator tRNA is a tRNA used in the peptide chain elongation reaction in the translation process.
  • the extended tRNA bound to amino acids is sequentially transported to the ribosome by the GTP-ized translation factor (EF) EF-Tu / eEF-1, and the peptide chain elongation reaction proceeds. ..
  • EF GTP-ized translation factor
  • tRNA body in the present disclosure refers to the main body portion of tRNA (main structural portion composed of nucleic acid) excluding anticodon (positions 34 to 36).
  • the tRNA bodies of the present disclosure refer to positions 1-33 and 37-76 of the tRNA.
  • the tRNA body of the present disclosure refers to positions 1-33 and 37-74 of the tRNA.
  • Lysidine is a type of modified nucleoside, and is also referred to as 2-lysylcytidine (k2C or L). Lysidine is used as the first letter nucleoside of the anticodon in tRNA (tRNAIle2) corresponding to isoleucine in eubacteria. tRNAIle2 is synthesized in the state of a precursor having an anticodon of CAU, and then by the action of an enzyme called tRNAIle-lysidinesynthetase; TilS, the first letter of the anticodon is cytidine (TilS). C) is modified (converted) to lysidine (k2C).
  • tRNAIle2 with the anticodon of k2CAU is completed (Muramatsu et al., J Biol Chem (1988) 263: 9261-9267, Suzuki et al., FEBS Lett (2010) 584: 272-277).
  • the anticodon of k2CAU is known to specifically recognize only the isoleucine codon AUA. It is also believed that tRNAIle2 is recognized as a substrate by isoleucine tRNA synthase and aminoacylation of tRNAIle2 (addition of isoleucine) occurs only when the anticodon is modified to k2CAU.
  • Agmatidine is a type of modified nucleoside, and is also referred to as 2-agmatinylcytidine (agm2C or Agm). Agmatidine is used as the first letter nucleoside of the anticodon in tRNA (tRNAIle2) corresponding to isoleucine in archaea.
  • tRNAIle2 is synthesized in the form of a precursor with an anticodon of CAU, and then by the action of an enzyme called tRNAIle-agmatidinesynthetase (TiaS), the first letter of the anticodon is cytidine (TiaS). C) is modified (converted) to agmatidine (agm2C).
  • tRNAIle2 having an anticodon of agm2CAU is completed (Ikeuchi et al., Nat Chem Biol (2010) 6 (4): 277-282).
  • the anticodon of agm2CAU is known to specifically recognize only the isoleucine codon AUA. It is also believed that tRNAIle2 is recognized as a substrate by isoleucine tRNA synthase and aminoacylation of tRNAIle2 (addition of isoleucine) occurs only when the anticodon is modified to agm2CAU.
  • cross-read means a phenomenon in which an aminoacyl-tRNA extraly translates an amino acid other than the target by recognizing a codon other than the codon that should be recognized originally.
  • the extent to which amino acids other than the intended one are translated is not particularly limited, but usually refers to those at a level at which it is judged that the orthogonality of translation is not sufficiently achieved.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and does not contain a heteroatom or an unsaturated carbon-carbon bond in the skeleton. It has a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures containing hydrogen and carbon atoms.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • cycloalkyl for example C 3 -C 10 cycloalkyl and the like, specifically, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, etc. bicyclo [2.2.1] heptyl and the like ..
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP2 carbon atoms). Depending on the double bond and the arrangement of the substitutions (if any), the geometry of the double bond can be an entomen (E) or tuzanmen (Z), cis or trans arrangement. Examples thereof include straight-chain or branched-chain alkenyl, including straight-chain containing internal olefins and the like.
  • Alkenyl for example, C 2 -C 10 alkenyl, C 2 -C 6 such as alkenyl can be mentioned, specifically, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (cis, (Including trans), 3-butenyl, pentenyl, hexenyl and the like.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms).
  • Linear or branched alkynyls include internal alkylenes.
  • the alkynyl for example C 2 -C 10 alkynyl, C 2 -C 6 alkynyl and the like, specifically, ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl-2- Propinyl, 3- (2'-fluorophenyl) -2-propinyl, 2-hydroxy-2-propinyl, 3- (3-fluorophenyl) -2-propinyl, 3-methyl- (5-phenyl) -4-pentynyl And so on.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring.
  • the aryl for example C 6 -C 10 aryl and the like, specifically, phenyl, naphthyl (e.g., 1-naphthyl, 2-naphthyl).
  • heteroaryl means a monovalent group of an aromatic ring containing a heteroatom in the atoms constituting the ring, and may be partially saturated.
  • the ring may be a monocyclic ring or two fused rings (eg, bicyclic heteroaryl fused with benzene or monocyclic heteroaryl).
  • the number of atoms constituting the ring is, for example, 5-10 (5-membered-10-membered heteroaryl).
  • the number of heteroatoms contained in the atoms constituting the ring is, for example, 1-5.
  • heteroaryl examples include frill, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridadinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl and benzothienyl.
  • arylalkyl means a group containing both aryl and alkyl, for example, a group in which at least one hydrogen atom of the alkyl is substituted with aryl.
  • aralkyl examples include C 5- C 10 aryl C 1- C 6 alkyl, and specific examples thereof include benzyl.
  • alkylene means a divalent group derived by further removing one arbitrary hydrogen atom from the "alkyl”, and may be linear or branched.
  • the linear alkylene, C 2 -C 6 linear alkylene, such as C 4 -C 5 straight-chain alkylene can be mentioned, specifically, -CH 2 -, - (CH 2) 2 -, - (CH 2 ) 3 -,-(CH 2 ) 4 -,-(CH 2 ) 5 -,-(CH 2 ) 6- and the like.
  • alkenylene means a divalent group derived by further removing one arbitrary hydrogen atom from the “alkenyl”, and may be linear or branched. Depending on the double bond and the configuration of the substituents (if present), an entomen (E) or tsuzanmen (Z), cis or trans configuration can be taken.
  • arylene means a divalent group derived by further removing one arbitrary hydrogen atom from the aryl.
  • the ring may be a monocyclic ring or a condensed ring.
  • the number of atoms constituting the ring is not particularly limited, for example, 6-10 (C 6 -C 10 arylene).
  • Specific examples of the allylen include phenylene and naphthylene.
  • heteroarylene means a divalent group derived by further removing one arbitrary hydrogen atom from the heteroaryl.
  • the ring may be a monocyclic ring or a condensed ring.
  • the number of atoms constituting the ring is not particularly limited, but is, for example, 5-10 (5-membered to 10-membered heteroarylene).
  • heteroarylene examples include pyrrol diyl, imidazole diyl, pyrazole diyl, pyridine diyl, pyridazine diyl, pyrimidine diyl, pyrazine diyl, triazole diyl, triazine diyl, isooxazole diyl, oxazole diyl, oxadiazole diyl, and isothiazole diyl. , Thiadiazole diyl, thiadiazole diyl, frangyl, thiophendiyl and the like.
  • Translation system in the present disclosure is defined as a concept including both a method for translating a peptide and a composition and a kit for translating the peptide.
  • the translation system usually contains ribosomes, translation factors, tRNAs, amino acids, aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS), and factors necessary for the translation reaction of peptides such as ATP and GTP as constituents.
  • the main types of translation systems are translation systems that use living cells and translation systems that use cell extracts (cell-free translation systems).
  • a translation system using living cells for example, a system in which desired aminoacyl tRNA and mRNA are introduced into living cells such as African turkey oocytes and mammalian cells by a microinjection method or a lipofection method to perform peptide translation.
  • living cells such as African turkey oocytes and mammalian cells by a microinjection method or a lipofection method to perform peptide translation.
  • cell-free translation systems include red blood cells (Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690), yeast (Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969), and wheat germ.
  • the cell-free translation system also includes a translation system (reconstituted cell-free translation system) constructed by isolating and purifying the factors required for peptide translation and reconstructing them (Shimizu et al). ., Nat Biotech (2001) 19: 751-755).
  • Reconstructive cell-free translation systems typically include ribosomes, amino acids, tRNAs, aminoacyl tRNA synthases (aaRS), translation initiators (eg IF1, IF2, IF3), translation elongation factors (eg EF-Tu, EF).
  • RNA polymerase and the like may be further included.
  • Various factors contained in the cell-free translation system can be isolated and purified by a method well known to those skilled in the art, and a reconstituted cell-free translation system can be appropriately constructed using them. Alternatively, a commercially available reconstituted cell-free translation system such as Genefrontier's PUREfrex® or New England BioLabs' PURExpress® can be used. In the case of a reconstituted cell-free translation system, it is possible to construct a desired translation system by reconstructing only the necessary components among the components of the translation system.
  • Aminoacyl-tRNA is synthesized by a specific combination of amino acid, tRNA, and aminoacyl-tRNA synthase, and it is used for peptide translation. Instead of the above combination, aminoacyl-tRNA can be used as it is as a component of the translation system. In particular, when amino acids that are difficult to aminoacyl-tRNA with aminoacyl-tRNA synthase, such as unnatural amino acids, are used for translation, it is desirable to use tRNA that has been amino-acylated with unnatural amino acids in advance as a constituent component.
  • the translation is started by adding mRNA to the translation system.
  • the mRNA usually contains a sequence encoding the peptide of interest, and further, a sequence for increasing the efficiency of the translation reaction (eg, Shine-Dalgarno (SD) sequence in prokaryotes, true). Kozac sequences in prokaryotes, etc.) may be included.
  • Pre-transcribed RNA may be added directly to the system, or by adding template DNA containing a promoter and suitable RNA polymerase (eg, T7 promoter and T7 RNA polymerase) to the system instead of mRNA, the mRNA can be added. It may be transcribed from the template RNA.
  • the meaning of the terms “and / or” includes any combination of “and” and “or” as appropriate. Specifically, for example, “A, B, and / or C” includes the following seven variations; (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A and B, (v) A and C, (vi) B and C, (vii) A, B, and C.
  • the present disclosure is complementary to tRNAs having anticodons complementary to the codons represented by M 1 M 2 A and to codons represented by M 1 M 2 G.
  • a translation system containing a tRNA having an anticodon.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • Each of the two types of tRNA included in the translation system in the present disclosure can be an aminoacyl-tRNA in which different amino acids or amino acid analogs are bound to each other.
  • the tRNA in the present disclosure can selectively translate the codon represented by M 1 M 2 A and the codon represented by M 1 M 2 G. Therefore, by using the translation system containing the tRNA of the present disclosure, one codon box (the codon box is a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 C, M 1 M). From the codons represented by 2 A and the codons represented by M 1 M 2 G), at least two amino acids or amino acid analogs can be translated.
  • the codons represented by M 1 M 2 A and the codons represented by M 1 M 2 G include M 1 as adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U). Includes all combinations that can be selected from any and identified by selecting M 2 from any of adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), uridine (U).
  • the expressions "selectively translate codons” can be paraphrased as “distinguish codons” and “reduce cross-reading", and these can be interpreted in the same meaning.
  • the present disclosure presents a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 U, a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 A, and M 1 M. the codon represented by 2 G to provide a translation system comprising a tRNA having an anticodon complementary.
  • the present disclosure is a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and M 1.
  • a translation system containing a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • A adenosine
  • G guanosine
  • U uridine
  • Each of the three types of tRNA included in the translation system in the present disclosure can be an aminoacyl-tRNA in which different amino acids or amino acid analogs are bound to each other.
  • the tRNA in the present disclosure can selectively translate a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G. ..
  • the tRNA in the present disclosure can selectively translate the codon represented by M 1 M 2 C, the codon represented by M 1 M 2 A, and the codon represented by M 1 M 2 G. can. Therefore, by using the translation system containing the tRNA of the present disclosure, one codon box (the codon box is a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 C, M 1 M). From the codons represented by 2 A and the codons represented by M 1 M 2 G), at least three amino acids or amino acid analogs can be translated.
  • the codons represented by M 1 M 2 U and the codons represented by M 1 M 2 C include M 1 as adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U). Includes all combinations that can be selected from any and identified by selecting M 2 from any of adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), uridine (U).
  • the translation system in the present disclosure includes a plurality of different types of tRNA, and a plurality of different types of amino acids or amino acid analogs can be translated from these tRNAs.
  • the present disclosure provides compositions and kits for selectively translating codons, including a plurality of different types of tRNAs suitable for peptide translation.
  • the present disclosure provides a method for selectively translating a codon, comprising translating a nucleic acid in a translation system comprising a plurality of different types of tRNAs suitable for peptide translation.
  • the tRNAs of the present disclosure are included.
  • the codon combinations that can be selectively translated in the present disclosure are the codon combinations represented by M 1 M 2 A and the codons represented by M 1 M 2 G, represented by M 1 M 2 U. Codons, a combination of codons represented by M 1 M 2 A and M 1 M 2 G, and codons represented by M 1 M 2 C, codons represented by M 1 M 2 A and M. A combination of codons represented by 1 M 2 G is illustrated.
  • the translation system in the present disclosure may contain a nucleic acid containing one or more codons represented by M 1 M 2 A and one or more codons represented by M 1 M 2 G. Further, in one embodiment, the translation system in the present disclosure includes (i) a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G. A nucleic acid containing one or more of each, or (ii) a codon represented by M 1 M 2 C, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G, respectively. It may contain a plurality of nucleic acids.
  • the translation system in the present disclosure includes codons represented by M 1 M 2 A, codons represented by M 1 M 2 G, codons represented by M 1 M 2 U, and M 1 M. 2 A nucleic acid containing one or more codons represented by C may be contained. In one aspect, the translation system in the present disclosure may include one or more such nucleic acids.
  • the present disclosure relates to a method of manufacturing a translation system.
  • the method for producing a translation system in the present disclosure includes a step of binding an amino acid or an amino acid analog to tRNA outside the translation system and / or artificially.
  • the method for producing a translation system in the present disclosure further comprises mixing a tRNA bound to an amino acid or an amino acid analog with the translation system in the present disclosure.
  • the translation system usually contains ribosomes, translation factors, tRNAs, amino acids, aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS), and factors necessary for the translation reaction of peptides such as ATP and GTP as constituents.
  • a desired translation system by reconstructing only the necessary components among the components of the translation system.
  • the synthesis of aminoacyl-tRNA (tRNA to which an amino acid or an amino acid analog is added) in the translation system may be performed in the translation system or outside the translation system.
  • synthesis within the translation system and synthesis outside the translation system may be used in combination.
  • the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure and the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G are described. It is bound to an amino acid or an amino acid analog outside the translation system.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U in the present disclosure, a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and M 1 A tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 2 G is bound to an amino acid or an amino acid analog outside the translation system.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C in the present disclosure, a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and M 1 A tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 2 G is bound to an amino acid or an amino acid analog outside the translation system.
  • the tRNA other than the above contained in the translation system may be bound to an amino acid or an amino acid analog in the translation system, or may be bound to an amino acid or an amino acid analog outside the translation system.
  • the tRNA is an amino acid or an amino acid analog artificially linked.
  • the tRNA may be a natural tRNA derived from any organism (eg, Escherichia coli), or may be an artificially synthesized unnatural tRNA having a sequence different from that of the natural tRNA. Alternatively, it may be an artificially synthesized tRNA having the same sequence as the natural tRNA. Further, the tRNA in the present disclosure may be "tRNA transcribed and synthesized in vitro".
  • the modified tRNA in the present disclosure is a modified tRNA having a sequence different from the native tRNA
  • the modified tRNA is from the following group with respect to one or more nucleosides constituting the tRNA. It can contain at least one modification selected: (i) addition (adding any new nucleoside to an existing tRNA), (ii) deletion (removing any new nucleoside from an existing tRNA).
  • substitution (replacing any nucleoside in an existing tRNA with another arbitrary nucleoside), (iv) insertion (adding any new nucleoside between any two nucleosides in an existing tRNA) To do), (v) Modification (changing part of the structure of any nucleoside in an existing tRNA (eg, the base part or sugar part) to another structure). Modifications may be made to any structure of the tRNA (eg, D-arm, anticodon arm, T-arm, acceptor stem, variable loop, etc.). In some embodiments, the modification of the tRNA in the present disclosure is made to the anticodon contained in the anticodon arm.
  • the modification of the tRNA in the present disclosure is made to at least one of the first, second, and third letter nucleosides of the anticodon.
  • the first, second, and third letters of the anticodon correspond to the 34th, 35th, and 36th positions of tRNA, respectively.
  • the first, second, and third letters of the anticodon nucleosides may be referred to as N 1 , N 2 , and N 3 , respectively.
  • the number of nucleosides modified in the tRNAs of the present disclosure can be any number greater than or equal to 1.
  • the number of nucleosides modified in the tRNAs of the present disclosure is 20 or less, 15 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 Below, or 1.
  • the nucleic acid sequence of the modified tRNA is 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more as compared with the nucleic acid sequence before the modification. , 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more are the same.
  • percent (%) sequence identity for a base sequence is any conservative substitution after aligning the sequences to obtain maximum percent sequence identity and, if necessary, introducing gaps. Is also defined as the percentage ratio of the bases in the candidate sequence that are the same as the bases in the reference base sequence when not considered to be part of the sequence identity. Alignment for the purpose of determining percent sequence identity of a base sequence can be performed by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) software, or GENETYX®. This can be achieved by using publicly available computer software such as (Genetics Co., Ltd.). One of skill in the art can determine the appropriate parameters for aligning the sequences, including any algorithm required to achieve the maximum alignment over the entire length of the sequence being compared.
  • modification of a tRNA in the present disclosure means substituting one or more nucleosides constituting the tRNA.
  • the substituted nucleoside may be any nucleoside present in the natural tRNA or any nucleoside (artificially synthesized nucleoside) not present in the natural tRNA. There may be.
  • the natural tRNA also contains variants (modified nucleosides) obtained by modifying them.
  • the nucleosides present in the native tRNA can be selected from the following nucleosides: adenosine (A), cytidine (C), guanosine (G), uridine; U), 1-methyladenosine (m1A), 2-methyladenisine (m2A), N6-isopentenyladenosine (i6A), 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine (2) 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine; ms2i6A), N6-methyladenosine (m6A), N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A), N6-methyl-N6-threonylcarbamoyladenosine (N6-) methyl-N6-threonylcarbamoyladenosine; m6t6A), 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine
  • the tRNA modified in the present disclosure can be appropriately selected from tRNAs having an arbitrary nucleic acid sequence.
  • the tRNA is tRNAAla, tRNAArg, tRNAAsn, tRNAAsp, tRNACys, tRNAGln, tRNAGlu, tRNAGly, tRNAHis, tRNAIle, tRNALeu, tRNALys, tRNAMet, tRNAPhe, It is one of tRNAPro, tRNASer, tRNAThr, tRNATrp, tRNATyr, and tRNAVal.
  • tRNAfMet In addition to the above 20 types of tRNA, tRNAfMet, tRNASec (selenocysteine), tRNAPyl (pyrrrolysine), tRNAAsnE2, etc. can also be used.
  • the tRNA is one of tRNAGlu, tRNAAsp, tRNAAsnE2, tRNA (fMet), tRNA (Ile).
  • tRNA body is sometimes used to refer to the main body part of tRNA (the main structural part composed of nucleic acids).
  • tRNA may be expressed as follows. -"TRNA Xxx" or "tRNA (Xxx)”: Indicates the tRNA (total length) corresponding to the amino acid Xxx (for example, tRNA Glu or tRNA (Glu)). -"TRNA (Xxx) nnn”: A tRNA corresponding to the amino acid Xxx, which indicates a tRNA (full length) having an anticodon sequence of nnn (for example, tRNA (Glu) uga or tRNA (Glu) Lga).
  • nnn-CA A tRNA corresponding to the amino acid Xxx and having an anticodon sequence of nnn (for example, tRNA (Glu) from which the CA sequence at the 3'end has been removed). ) uga-CA and tRNA (Glu) Lga-CA etc.).
  • the tRNA of the present disclosure is an initiating or extended tRNA.
  • a tRNA may be prepared by modifying an initiating tRNA or an extended tRNA, or the tRNA produced by the modification may have a function as an initiating tRNA or an extended tRNA. Whether or not a tRNA has a function as an initiating tRNA is determined by (i) being introduced into the ribosome via IF2 and (ii) binding to the tRNA when the tRNA is used in a translation system. It can be determined by whether or not peptide translation can be initiated by using the existing amino acid as the starting amino acid.
  • Whether or not a certain tRNA has a function as an extended tRNA is determined by (i) being introduced into the ribosome via EF-Tu when the tRNA is used in a translation system, and (ii) the tRNA. It can be determined by whether or not the peptide chain can be extended by incorporating the amino acid bound to the peptide chain into the peptide chain.
  • the tRNAs of the present disclosure are prokaryotic-derived tRNAs or eukaryotic-derived tRNAs.
  • Mutant tRNA may be prepared by modifying prokaryotic-derived tRNA or eukaryotic-derived tRNA, and the tRNA produced by the modification is the highest as that of prokaryotic-derived tRNA or eukaryotic-derived tRNA. It may have nucleic acid sequence identity.
  • Eukaryotes are further classified into animals, plants, fungi and protists.
  • the tRNA of the present disclosure may be, for example, a human-derived tRNA. Prokaryotes are further classified into eubacteria and archaea.
  • eubacteria examples include Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, and Desulfitobacterium hafniense.
  • archaea examples include highly halophilic bacteria, thermophiles, and methane bacteria (for example, Methanosarcina mazei, Methanosarcina barkeri, Methanocaldococcus jannaschii).
  • the tRNA of the present disclosure may be, for example, a tRNA derived from Escherichia coli, Desulfitobacterium hafniense, or Methanosarcina mazei.
  • the tRNA in the present disclosure is one that does not have an anticodon, eg, either lysidine (k2C), lysidine derivative, agmatidine (agm2C), or agmatidine derivative at its first letter (N 1). You may. In certain embodiments, the tRNA in the present disclosure is one that does not have an anticodon, eg, a lysidine (k2C), a lysidine derivative, an agmatidine (agm2C), or an agmatidine derivative in its first letter (N 1). It's okay.
  • RNA for example, prepare DNA encoding the desired tRNA gene, place an appropriate promoter such as T7, T3, or SP6 upstream of it, and use RNA polymerase adapted to each promoter using the DNA as a template. It can be synthesized by carrying out a transcription reaction. RNA can also be prepared by purification from biological material. For example, tRNA can be recovered by preparing an extract from a material containing tRNA such as cells and adding a probe containing a sequence complementary to the nucleic acid sequence of tRNA to the extract. At this time, an expression vector capable of expressing a desired tRNA can be prepared, and cells transformed with the expression vector can be used as a material for preparation.
  • an appropriate promoter such as T7, T3, or SP6 upstream of it
  • RNA polymerase adapted to each promoter using the DNA as a template. It can be synthesized by carrying out a transcription reaction.
  • RNA can also be prepared by purification from biological material. For example, tRNA can be recovered
  • TRNAs synthesized by in vitro transcription usually contain only four typical nucleosides: adenosine, guanosine, cytidine, and uridine.
  • the intracellularly synthesized tRNA may also contain modified nucleosides obtained by modifying them.
  • tRNA can also be prepared by a method of linking a fragment synthesized by transcription or a chemically synthesized fragment or the like by an enzymatic reaction as described in Examples described later.
  • Aminoacyl-tRNA can also be prepared by chemical and / or biological synthetic methods.
  • aminoacyl-tRNA synthase ARS
  • ARS aminoacyl-tRNA synthase
  • the amino acid may be a natural amino acid or an unnatural amino acid as long as it can be a substrate for ARS.
  • the amino acid may be chemically modified after binding the natural amino acid to the tRNA.
  • Aminoacyl-tRNA can be synthesized by (pdCpA method; Hecht et al., J Biol Chem (1978) 253: 4517-4520).
  • a method using pCpA (dinucleotide composed of cytidine and adenosine) instead of pdCpA is also known (pCpA method; Wang et al., ACS Chem Biol (2015) 10: 2187-2192). That is, aminoacylated tRNA can be prepared by binding pCpA-amino acid and CA-deficient tRNA at the 3'end with RNA ligase.
  • Aminoacyl-tRNA can also be synthesized by binding an unnatural amino acid previously activated by esterification to tRNA using an artificial RNA catalyst (flexizyme) (WO2007 / 066627, WO2012 / 026566, H.I. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 655-662; H. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 1077-1084; H. Murakami et al., Nature Methods 3 , 2006, 357-359; N. Niwa et al., Bioorganic & Medical Chemistry Letters 19, 2009, 3892-3894).
  • RNA catalyst WO2007 / 066627, WO2012 / 026566
  • Flexizymes are artificial RNA catalysts capable of linking amino acids or hydroxy acids to tRNA.
  • the flexizyme in the present disclosure includes a prototype flexizyme (Fx), a modified dinitrobenzyl flexizyme (dFx), an enhanced flexizyme (eFx), an amino flexizyme (aFx) and the like.
  • the tRNA of the present disclosure is bound to an amino acid or an amino acid analog.
  • Amino acids or amino acid analogs are usually attached to the 3'end of the tRNA, more specifically to the adenosine residue of the CCA sequence at the 3'end.
  • the specific type of amino acid or amino acid analog bound to tRNA can be appropriately selected from the amino acids or amino acid analogs described below.
  • the amino acids in the present disclosure include ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids and the like.
  • the three-dimensional structure includes both L-type amino acids and D-type amino acids.
  • the amino acids in the present disclosure include natural amino acids and unnatural amino acids.
  • the natural amino acids are the following 20 ⁇ -amino acids: glycine (Gly), alanine (Ala), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine ( Ile), Phenylalanine (Phe), Tyrosine (Tyr), Tryptophan (Trp), Histidine (His), Glutamic Acid (Glu), Aspartic Acid (Asp), Glutamine (Gln), Asparagin (Asn), Cysteine (Cys), Methionine It consists of (Met), lysine (Lys), arginine (Arg), and proline (Pro).
  • the above-mentioned 20 kinds of amino acids minus any one or more kinds of amino acids may be used as the natural amino acids in the present disclosure.
  • the natural amino acid consists of 19 amino acids except isoleucine.
  • the natural amino acid consists of 19 amino acids except methionine.
  • the natural amino acid consists of 18 amino acids except isoleucine and methionine. Natural amino acids are usually L-type amino acids.
  • the unnatural amino acid refers to all amino acids except the natural amino acid consisting of the above 20 kinds of ⁇ -amino acids.
  • unnatural amino acids are ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, D-type amino acids, ⁇ -amino acids having different side chains from natural amino acids, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, and amino acids having a substituent on the main chain amino group. (N-substituted amino acid) and the like can be mentioned.
  • the side chain of the unnatural amino acid is not particularly limited, but may have, for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl and the like in addition to the hydrogen atom.
  • two side chains may form a ring.
  • these side chains may have one or more substituents.
  • the substituent can be selected from any functional group, including a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • C 1 -C 6 alkyl having substituent halogen in the present disclosure, it means a “C 1 -C 6 alkyl” in which at least one hydrogen atom is substituted with a halogen atom in an alkyl, specifically For example, trifluoromethyl, difluoromethyl, fluoromethyl, pentafluoroethyl, tetrafluoroethyl, trifluoroethyl, difluoroethyl, fluoroethyl, trichloromethyl, dichloromethyl, chloromethyl, pentachloroethyl, tetrachloroethyl, trichloro.
  • C 5- C 10 aryl C 1- C 6 alkyl having a substituent means “C 5- C 10 aryl C in which at least one hydrogen atom in aryl and / or alkyl is substituted with a substituent". It means “1- C 6 alkyl”.
  • “having two or more substituents” means that a certain functional group (for example, a functional group containing an S atom) is used as a substituent, and the functional group is another substituent (for example, amino or halogen). It also includes having a substituent (such as).
  • WO2013 / 100132 and WO2018 / 143145 can also be referred to.
  • Amino groups of the backbone of the non-natural amino acids may also unsubstituted amino group (NH 2 group) or a substituted amino group (NHR group).
  • R represents alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl which may have a substituent.
  • a carbon chain bonded to the N atom of the amino group of the main chain and a carbon atom at the ⁇ -position, such as proline, may form a ring.
  • the substituent can be selected from any functional group including a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • Examples of the alkyl substitution of the amino group include N-methylation, N-ethylation, N-propylation, N-butylation and the like, and examples of the aralkyl substitution include N-benzylation and the like.
  • Specific examples of N-methyl amino acids include N-methylalanine, N-methylglycine, N-methylphenylalanine, N-methyltyrosine, N-methyl-3-chlorophenylalanine, N-methyl-4-chlorophenylalanine, Examples thereof include N-methyl-4-methoxyphenylalanine, N-methyl-4-thiazolealanine, N-methylhistidine, N-methylserine, and N-methylaspartic acid.
  • substituent containing a halogen atom examples include fluoro (-F), chloro (-Cl), bromo (-Br), iodine (-I) and the like.
  • oxy examples include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • carbonyloxy examples include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like. ..
  • carbonylthio examples include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like. ..
  • Examples of oxycarbonylamino include alkoxycarbonylamino, cycloalkoxycarbonylamino, alkenyloxycarbonylamino, alkynyloxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, heteroaryloxycarbonylamino, aralkyloxy. Examples include carbonylamino.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • the H atom bonded to the N atom in -NH-SO 2- R is substituted with a substituent selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. May be good.
  • aminosulfonyl examples include alkylaminosulfonyl, cycloalkylaminosulfonyl, alkenylaminosulfonyl, alkynylaminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroarylaminosulfonyl, aralkylaminosulfonyl and the like.
  • H atom bonded to the N atom in the -SO 2 -NHR is alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and a substituent selected from the group consisting of aralkyl may be substituted .
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenyl sulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero.
  • Aryl sulfamoyl amino, aralkyl sulfamoyl amino and the like can be mentioned.
  • At least one of the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2- NHR is selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted with a substituent. When the two H atoms are substituted together, the substituents may be selected independently of each other, or these two substituents may form a ring.
  • thio examples include alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio and the like.
  • sulfinyl examples include alkylsulfinyl, cycloalkylsulfinyl, alkenylsulfinyl, alkynylsulfinyl, arylsulfinyl, heteroarylsulfinyl, aralkylsulfinyl and the like.
  • Examples of the sulfonyl (-S (O) 2- R) include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl and the like.
  • substituents containing an N atom include azide (-N 3 ), cyano (-CN), primary amino (-NH 2 ), secondary amino (-NH-R), tertiary amino (-NR (-NR)).
  • Examples of the secondary amino (-NH-R) include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • the two substituents R and R'on the N atom in the tertiary amino are independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. can do.
  • Examples of tertiary aminos include alkyl (aralkyl) aminos and the like. These two substituents may form a ring.
  • substituted amidinos include, for example, alkyl (aralkyl) (aryl) amidinos and the like. These substituents may form a ring with each other.
  • the three substituents R, R', and R'' on the N atom in aminocarbonylamino are hydrogen atom, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, hetero. It can be independently selected from the group consisting of aryl and aralkyl. These substituents may form a ring with each other.
  • substituent containing a B atom examples include boron (-BR (R')) and dioxyboryl (-B (OR) (OR')).
  • the two substituents R and R'on the B atom can be independently selected from the group consisting of hydrogen atom, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. These substituents may form a ring with each other.
  • the amino acids in the present disclosure include nBuG (2- (butylamino) acetic acid), Pic2 ((2S) -piperidine-2-carboxylic acid), dA ((2R) -2-aminopropanoic acid), MeA3Pyr.
  • Examples of amino acid analogs in the present disclosure include hydroxycarboxylic acids (hydroxy acids).
  • the hydroxycarboxylic acid includes ⁇ -hydroxycarboxylic acid, ⁇ -hydroxycarboxylic acid, ⁇ -hydroxycarboxylic acid and the like.
  • side chains other than hydrogen atoms may be bonded to the carbon at the ⁇ -position of the hydroxycarboxylic acid.
  • the three-dimensional structure may include both L-type and D-type.
  • the structure of the side chains can be defined in the same manner as the side chains of natural or unnatural amino acids described above.
  • Examples of hydroxycarboxylic acids include hydroxyacetic acid, lactic acid, phenyllactic acid and the like.
  • the amino acid in the present disclosure may be a translatable amino acid, and the amino acid analog may be a translatable amino acid analog.
  • a "translatable" amino acid or amino acid analog (sometimes collectively referred to as an amino acid or the like) can be incorporated into a peptide by translational synthesis (eg, using the translation system described in the present disclosure). It means possible amino acids and the like. Whether or not a certain amino acid or the like can be translated can be confirmed by a translation synthesis experiment using tRNA to which the amino acid or the like is bound. A reconstituted cell-free translation system may be used for translational synthesis experiments (see, eg, WO2013100132).
  • the unnatural amino acids and amino acid analogs in the present disclosure can be prepared by a conventionally known chemical synthesis method, a synthesis method described in Examples described later, or a synthesis method similar thereto.
  • the tRNAs of the present disclosure distinguish between codons represented by M 1 M 2 A and codons represented by M 1 M 2 G, with different amino acids or amino acid analogs for each of these codons. Can be translated. In some embodiments, the tRNAs of the present disclosure distinguish between codons represented by M 1 M 2 U, codons represented by M 1 M 2 A and codons represented by M 1 M 2 G. Different amino acids or amino acid analogs can be translated for each of the codons. In some embodiments, the tRNAs of the present disclosure distinguish between codons represented by M 1 M 2 C, codons represented by M 1 M 2 A and codons represented by M 1 M 2 G.
  • the first letter nucleoside (M 1 ) and the second letter nucleoside (M 2 ) of the codon are independently any of adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U). Is selected from.
  • the tRNA of the present disclosure has a specific codon represented by M 1 M 2 A, an anticodon complementary to a specific codon represented by M 1 M 2 G.
  • the tRNA of the present disclosure is a specific codon represented by M 1 M 2 U, a specific codon represented by M 1 M 2 A, and a specific codon represented by M 1 M 2 G.
  • the tRNA of the present disclosure is a specific codon represented by M 1 M 2 C, a specific codon represented by M 1 M 2 A, a specific codon represented by M 1 M 2 G.
  • the third letter nucleoside (N 3 ) and the second letter nucleoside (N 2 ) of the anticodon in the tRNA can be selected as complementary nucleosides to M 1 and M 2 , respectively, N 2 and N 3 can be independently selected from any of adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U).
  • N 2 (or M 1 ) when M 2 (or M 1 ) is adenosine, N 2 (or N 3 ) is uridine.
  • M 2 (or M 1 ) when M 2 (or M 1 ) is guanosine, N 2 (or N 3 ) is cytidine.
  • M 2 (or M 1 ) is cytidine, N 2 (or N 3 ) is guanosine.
  • M 2 (or M 1 ) is uridine
  • N 2 (or N 3 ) is adenosine.
  • a tRNA is translatable for a particular codon essentially includes the phrase "a tRNA has an anticodon complementary to a particular codon”. These expressions are substitutable as long as the sequence of anticodons on the tRNA is mentioned.
  • the first letter nucleoside (M 1 ) and the second letter nucleoside (M 2 ) of the codons that can be translated by the tRNAs constituting the translation system in the present disclosure are one of the codons constituting a specific codon box in the genetic code table. You can choose from the first letter nucleoside (M 1) and the second letter nucleoside (M 2), respectively.
  • the genetic code table is a standard genetic code table. In another embodiment, the genetic code table is a natural genetic code table.
  • M 1 and M 2 in the present disclosure have a stop codon assigned to the codon represented by M 1 M 2 A in the natural genetic code table and are represented by M 1 M 2 G. You can choose from a codon box in which amino acids are assigned to codons. In another embodiment, M 1 and M 2 in the present disclosure are allotted a stop codon to both the codon represented by M 1 M 2 A and the codon represented by M 1 M 2 G in the natural genetic code table. You can choose from the codon boxes that are available. In some embodiments, the translation system in which the genetic code table is identical to the natural genetic code table is excluded from the translation system in the present disclosure. In some embodiments, a translation system in which the genetic code table is identical to the genetic code table shown in Table 1 is excluded from the translation system in the present disclosure.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 that make up the codon box in which the codon whose third letter is A and G both encode the same amino acid. ..
  • the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (U) in the codons that make up the codon box can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 that make up the codon box in which the codon whose third letter is U and the codon whose third letter is both encode the same amino acid. ..
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (U) in the codons that make up the codon box can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 that make up the codon box in which the codon whose third letter is A and the codon whose third letter is G encode different amino acids, respectively. ..
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (U) in the codons constituting the codon box can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 that make up the codon box where the codon whose third letter is A and / or G is the stop codon, respectively.
  • the codon whose third letter is A (UGA) is a stop codon (opal), so the first letter nucleoside in the codons constituting the codon box.
  • U and the second letter nucleoside (G) can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by UUM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (U) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by UAM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (A) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by UGM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (G) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by CAM 3.
  • the first letter nucleoside (C) and the second letter nucleoside (A) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by CGM 3.
  • the first letter nucleoside (C) and the second letter nucleoside (G) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by AUM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (U) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by ACM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (C) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by AAM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (A) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by AGM 3.
  • the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (G) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • M 1 and M 2 can be selected from the codons M 1 and M 2 whose codons make up the codon box represented by GAM 3, respectively.
  • the first letter nucleoside (G) and the second letter nucleoside (A) at the codon can be selected as M 1 and M 2, respectively.
  • the third letter nucleoside (N 3 ) and the second letter nucleoside (N 2 ) of the anticodon in the tRNAs of the present disclosure can be selected as complementary nucleosides to M 1 and M 2, respectively.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (U) at the codons whose codons make up the codon box represented by UUM 3.
  • U first letter nucleoside
  • U second letter nucleoside
  • A can be selected as N 3 and A can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (A) at the codons whose codons make up the codon box represented by UAM 3.
  • U can be selected.
  • A can be selected as N 3 and U can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (U) and the second letter nucleoside (G) at the codons whose codons make up the codon box represented by UGM 3.
  • U first letter nucleoside
  • G second letter nucleoside
  • A can be selected as N 3
  • C can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (C) and the second letter nucleoside (A) at the codons whose codons make up the codon box represented by CAM 3.
  • C first letter nucleoside
  • A second letter nucleoside
  • G can be selected as N 3
  • U can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (C) and the second letter nucleoside (G) at the codons whose codons make up the codon box represented by CGM 3.
  • C first letter nucleoside
  • G second letter nucleoside
  • C can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (U) at the codons whose codons make up the codon box represented by AUM 3.
  • A can be selected as N 3
  • A can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (C) at the codons whose codons make up the codon box represented by ACM 3.
  • A first letter nucleoside
  • C second letter nucleoside
  • U can be selected as N 3
  • G can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (A) at the codons whose codons make up the codon box represented by AAM 3.
  • AAM 3 codon box represented by AAM 3.
  • U can be selected as N 3 and U can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (A) and the second letter nucleoside (G) at the codons whose codons make up the codon box represented by AGM 3.
  • A first letter nucleoside
  • G second letter nucleoside
  • U can be selected as N 3
  • C can be selected as N 2.
  • N 3 and N 2 are as complementary nucleosides to the first letter nucleoside (G) and the second letter nucleoside (A) at the codons whose codons make up the codon box represented by GAM 3.
  • G first letter nucleoside
  • A second letter nucleoside
  • C can be selected as N 3
  • U can be selected as N 2.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure selectively selects the codon represented by M 1 M 2 A as compared to other codons. Can be translated.
  • the other codon is either a codon different from the codon represented by M 1 M 2 A, such as a codon represented by M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, or M 1 M 2 G. be able to.
  • tRNAs having anticodons complementary to the codons represented by M 1 M 2 A in the present disclosure are represented by M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, and M 1 M 2 G. Compared to any codon, the codon represented by M 1 M 2 A can be selectively translated.
  • a tRNA can selectively translate a codon of M 1 M 2 A, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 A by the tRNA] is [the tRNA. Translation of other codons by], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times It means that it is 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • whether or not a tRNA can selectively translate the codon represented by CUA is determined by [the amount of translation of the CUA codon by the relevant tRNA] from [the amount of translation of the CUG codon by the relevant tRNA]. For example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more. It can be judged by whether or not it is 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • the codon represented by M 1 M 2 A rather than the other tRNA, selectively translated by tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure obtain.
  • Other tRNAs are tRNAs that have anticodons that are complementary to codons that are different from the codons represented by M 1 M 2 A, such as M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, or M 1 M 2 G. It can be a tRNA with an anticodon complementary to that codon.
  • the codon represented by M 1 M 2 A is a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 U codon, a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 C codon, and a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 C codon. It can be selectively translated by a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure, rather than any tRNA of a tRNA having an anticodon complementary to the codon of M 1 M 2 G. ..
  • the codon represented by M 1 M 2 A can be selectively translated by a certain tRNA, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 A by the tRNA] is [other.
  • Translation of M 1 M 2 A codons by tRNA for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, It means 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • a codon represented by CUA can be selectively translated by a certain tRNA is determined by [amount of translation of CUA codon by the tRNA] [tRNA having an anticodon complementary to the codon of CUG (tRNA).
  • the amount of translation of CUA codons by tRNA having CAG anticodon) for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times Whether 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more Can be judged by.
  • the translation system of the present disclosure may have both of the above-mentioned characteristics. That is, in certain embodiments, in the translation system of the present disclosure, (i) tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 A is, compared to other codons, M 1 M 2 A The codon represented by can be selectively translated, and (ii) the codon represented by M 1 M 2 A is more complementary to the codon represented by M 1 M 2 A than other tRNAs. Can be selectively translated by tRNA with a typical anticodon. When such a relationship is established, in the translation system of the present disclosure, peptide translation using tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A and other tRNA are used.
  • the peptide translations that have been present have an independent relationship that does not interact with each other, that is, an orthogonal (orthogonal) relationship.
  • an orthogonal (orthogonal) relationship In the translation system of naturally occurring organisms, a strict correspondence between codons and amino acids is originally established, and when non-orthogonal tRNA is added to it, the correspondence is broken and translation is performed. It may have a fatal effect on the function of the system. Therefore, in the translation system of the present disclosure, it is an important feature that orthogonality is established between a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A and another tRNA. Can be one.
  • the translation system in the present disclosure is complementary to (a) a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and (b) complementary to the codon represented by M 1 M 2 G.
  • tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A and tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G have the same nucleic acid sequence other than the anticodon. It may be different from each other.
  • the nucleic acid sequences other than the anticodon are the same, the physicochemical properties of these two tRNAs can be similar to each other, so that it may be possible to construct a translation system with more homogeneous reactivity.
  • the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G in the present disclosure selectively selects the codon represented by M 1 M 2 G as compared to other codons. Can be translated.
  • the other codon is either a codon different from the codon represented by M 1 M 2 G, such as a codon represented by M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, or M 1 M 2 A. be able to.
  • tRNAs having anticodons complementary to the codons represented by M 1 M 2 G in the present disclosure are represented by M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, and M 1 M 2 A. Compared to any codon, the codon represented by M 1 M 2 G can be selectively translated.
  • a tRNA can selectively translate a codon of M 1 M 2 G, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 G by the tRNA] is [the tRNA. Translation of other codons by], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times It means that it is 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • whether or not a tRNA can selectively translate a codon represented by CUG depends on [the amount of translation of the CUG codon by the relevant tRNA] from [the amount of translation of the CUA codon by the relevant tRNA]. For example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more. It can be judged by whether or not it is 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • the codon represented by M 1 M 2 G rather than the other tRNA, selectively translated by tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 G in the present disclosure obtain.
  • Other tRNAs are tRNAs that have anticodons that are complementary to codons that are different from the codons represented by M 1 M 2 G, such as M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, or M 1 M 2 A. It can be a tRNA with an anticodon complementary to that codon.
  • the codon represented by M 1 M 2 G is a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 U codon, a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 C codon, and a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 C codon. It can be selectively translated by a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G in the present disclosure, rather than any tRNA of a tRNA having an anticodon complementary to the codon of M 1 M 2 A. ..
  • a codon represented by M 1 M 2 G can be selectively translated by a certain tRNA, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 G by the tRNA] is [other.
  • Translation of M 1 M 2 G codons by tRNA for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, It means 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • a codon represented by CUG can be selectively translated by a certain tRNA is determined by [the amount of translation of the CUG codon by the tRNA] [tRNA having an anticodon complementary to the CUA codon (tRNA).
  • the amount of translation of CUG codons by tRNA having UAG anticodon) for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times Whether 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more Can be judged by.
  • the translation system of the present disclosure may have both of the above-mentioned characteristics. That is, in certain embodiments, in the translation system of the present disclosure, (i) tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 G, compared to other codons, M 1 M 2 G The codon represented by can be selectively translated, and (ii) the codon represented by M 1 M 2 G is more complementary to the codon represented by M 1 M 2 G than other tRNAs. Can be selectively translated by tRNA with a typical anticodon. When such a relationship is established, in the translation system of the present disclosure, peptide translation using tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G and other tRNA are used.
  • the peptide translations that have been present have an independent relationship that does not interact with each other, that is, an orthogonal (orthogonal) relationship.
  • an orthogonal (orthogonal) relationship In the translation system of the present disclosure, it is one of the important features that the orthogonality is established between the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G and the other tRNA. Can be.
  • an amino acid bound to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure (hereinafter, this amino acid is also referred to as “amino acid-A”) and M 1
  • amino acid-A amino acid bound to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure
  • amino acid-G amino acid bound to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 2 G
  • the codon of M 1 M 2 A and the amino acid -A, and the codon of M 1 M 2 G and the amino acid -G all have a one-to-one correspondence. That is, in the translation system of the present disclosure, two different amino acids can be translated from two codons (i) M 1 M 2 A and (ii) M 1 M 2 G existing in the same codon box. It is possible.
  • the translation system in the present disclosure is complementary to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by (a) M 1 M 2 A, and (b) complementary to the codon represented by M 1 M 2 G. It contains at least three tRNAs, a tRNA having an anticodon and (c) a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U. Represented by tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G, and M 1 M 2 U.
  • the tRNA having an anticodon complementary to the codon may have all the same nucleic acid sequences other than the anticodon, or may be different from each other.
  • the nucleic acid sequences other than the anticodon are the same, the physicochemical properties of these three tRNAs can be similar to each other, so that it may be possible to construct a translation system with more homogeneous reactivity.
  • the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U in the present disclosure selectively selects the codon represented by M 1 M 2 U as compared to other codons. Can be translated.
  • the other codon can be either a codon different from the codon represented by M 1 M 2 U, eg, a codon represented by M 1 M 2 A or M 1 M 2 G.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U in the present disclosure is compared to any of the codons represented by M 1 M 2 A and M 1 M 2 G. , M 1 M 2 U can be selectively translated.
  • a tRNA can selectively translate a codon of M 1 M 2 U, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 U by the tRNA] is [the tRNA. Translation of other codons by], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times It means that it is 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • whether or not a tRNA can selectively translate a codon represented by CUU depends on [the amount of translation of the CUU codon by the relevant tRNA] from [the amount of translation of the CUA codon by the relevant tRNA]. For example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more. It can be judged by whether or not it is 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • the codon represented by M 1 M 2 U rather than the other tRNA, selectively translated by tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 U in this disclosure obtain.
  • the codon represented by M 1 M 2 U is either a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 A codon or a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 G codon.
  • M 1 codon represented by M 2 U is, the may be selectively translated by one tRNA, is [translation of codons of M 1 M 2 U by the tRNA), (other Translation of M 1 M 2 U codons by tRNA], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, It means 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • whether or not a codon represented by CUU can be selectively translated by a certain tRNA is determined by [amount of translation of CUU codon by the tRNA] [tRNA having an anticodon complementary to the codon of CUA ( For example, the amount of translation of CUU codons by tRNA having UAG anticodon)], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times Whether 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more Can be judged by.
  • the translation system of the present disclosure may have both of the above-mentioned characteristics. That is, in certain embodiments, in the translation system of the present disclosure, (i) tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 U is compared to other codons, M 1 M 2 U The codon represented by can be selectively translated, and (ii) the codon represented by M 1 M 2 U is more complementary to the codon represented by M 1 M 2 U than other tRNAs. Can be selectively translated by tRNA with a typical anticodon. When such a relationship is established, in the translation system of the present disclosure, peptide translation using tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U and other tRNA are used.
  • the peptide translations that have been present have an independent relationship that does not interact with each other, that is, an orthogonal (orthogonal) relationship.
  • an orthogonal (orthogonal) relationship In the translation system of the present disclosure, it is one of the important features that the orthogonality is established between the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U and the other tRNA. Can be.
  • amino acid-A an amino acid attached to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure, to a codon represented by M 1 M 2 G.
  • Amino acids bound to tRNA with complementary anticodon (“amino acid-G”), and amino acids bound to tRNA with anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 U (hereinafter referred to as the present Amino acids are also referred to as "amino acids-U"), and the types of amino acids are all different from each other.
  • tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G, and M 1 M 2 U.
  • the codon of M 1 M 2 A and the amino acids -A, M 1 M 2 G The codon and amino acid-G, and the codon and amino acid-U of M 1 M 2 U all have a one-to-one correspondence.
  • the translation system of the present disclosure from the three codons (i) M 1 M 2 A, (ii) M 1 M 2 G, and (iii) M 1 M 2 U existing in the same codon box. It is possible to translate three different amino acids. Alternatively, the translation system of the present disclosure translates three different amino acids from a codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G. It is possible.
  • the translation system in the present disclosure is complementary to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by (a) M 1 M 2 A, and (b) complementary to the codon represented by M 1 M 2 G. It contains at least three tRNAs, a tRNA having an anticodon and (c) a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C. Represented by tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure, tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G, and M 1 M 2 C.
  • the tRNA having an anticodon complementary to the codon may have all the same nucleic acid sequences other than the anticodon, or may be different from each other.
  • the nucleic acid sequences other than the anticodon are the same, the physicochemical properties of these three tRNAs can be similar to each other, so that it may be possible to construct a translation system with more homogeneous reactivity.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C in the present disclosure selectively selects the codon represented by M 1 M 2 C as compared to other codons. Can be translated.
  • the other codon can be either a codon different from the codon represented by M 1 M 2 C, eg, a codon represented by M 1 M 2 A or M 1 M 2 G.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C in the present disclosure is compared to any of the codons represented by M 1 M 2 A and M 1 M 2 G. , M 1 M 2 C can be selectively translated.
  • a tRNA can selectively translate a codon of M 1 M 2 C, which means that [the amount of translation of the codon of M 1 M 2 C by the tRNA] is [the tRNA. Translation of other codons by], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times It means that it is 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • whether or not a tRNA can selectively translate the codon represented by CUC is determined by [the amount of translation of the CUC codon by the relevant tRNA] from [the amount of translation of the CUA codon by the relevant tRNA]. For example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more. It can be judged by whether or not it is 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • the codon represented by M 1 M 2 C rather than the other tRNA, selectively translated by tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 C in the present disclosure obtain.
  • the codon represented by M 1 M 2 C is either a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 A codon or a tRNA having an anticodon complementary to the M 1 M 2 G codon.
  • the codon represented by M 1 M 2 C is, the may be selectively translated by one tRNA, is [translation of codons by the tRNA M 1 M 2 C], [Other Translation of M 1 M 2 C codons by tRNA], for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, It means 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more.
  • a codon represented by CUC can be selectively translated by a certain tRNA is determined by [the amount of translation of the CUC codon by the tRNA] [tRNA having an anticodon complementary to the CUA codon (tRNA).
  • the amount of translation of CUC codons by tRNA having UAG anticodon) for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times Whether 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, or 100 times or more Can be judged by.
  • the translation system of the present disclosure may have both of the above-mentioned characteristics. That is, in certain embodiments, in the translation system of the present disclosure, (i) tRNA having an anticodon complementary to codon represented by M 1 M 2 C, compared to other codons, M 1 M 2 C the in represented codon can be selectively translated, yet, (ii) codons represented by M 1 M 2 C is than other tRNA, complementary to the codon represented by M 1 M 2 C Can be selectively translated by tRNA with a typical anticodon. When such a relationship is established, in the translation system of the present disclosure, peptide translation using tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C and other tRNA are used.
  • the peptide translations that have been present have an independent relationship that does not interact with each other, that is, an orthogonal (orthogonal) relationship.
  • an orthogonal (orthogonal) relationship In the translation system of the present disclosure, it is one of the important features that the orthogonality is established between the tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C and the other tRNA. Can be.
  • amino acid-A an amino acid attached to a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure, to a codon represented by M 1 M 2 G.
  • Amino acids bound to tRNA with complementary anticodon (“amino acid-G”) and amino acids bound to tRNA with anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C (hereinafter referred to as the present Amino acids are also referred to as "amino acids-C”), and the types of amino acids are all different from each other.
  • tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G, and M 1 M 2 C.
  • the codon of M 1 M 2 A and the amino acids -A, M 1 M 2 G The codon and amino acid-G, and the codon and amino acid-C of M 1 M 2 C all have a one-to-one correspondence.
  • the translation system of the present disclosure from the three codons (i) M 1 M 2 A, (ii) M 1 M 2 G, and (iii) M 1 M 2 C existing in the same codon box. It is possible to translate three different amino acids.
  • the translation system of the present disclosure translates three different amino acids from a codon box composed of M 1 M 2 U, M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G. It is possible.
  • a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A in the present disclosure a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G, M 1 M.
  • An unnatural amino acid is bound to at least one of a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by 2 U and a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 C. May be good.
  • the codons constituting at least one codon box in the genetic code table may be assigned the tRNAs of the present disclosure.
  • the codons constituting the plurality of codon boxes in the genetic code table may be assigned the tRNA of the present disclosure.
  • Multiple codon boxes include, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, etc. Or it can be 16 codon boxes. Which codon box each tRNA is assigned to is determined by the second letter nucleoside (N 2 ) and the third letter nucleoside (N 3 ) of the anticodon possessed by the tRNA. TRNAs assigned to codons that make up different codon boxes have different N 2 and N 3 from each other.
  • the tRNAs assigned to the codons constituting different codon boxes may have the same nucleic acid sequence other than the anticodon, or may be different from each other.
  • the nucleic acid sequences other than the anticodon are the same, the physicochemical properties of these tRNAs can be similar to each other, so that it may be possible to construct a translation system having a more homogeneous and stable reactivity.
  • the tRNA of the present disclosure may be assigned to a codon constituting at least one codon box selected from the following (i) to (x) in the genetic code table. In a further embodiment, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 selected from the following (i)-(x) in the genetic code table: The tRNA of the present disclosure may be assigned to the codons constituting the codon box.
  • the tRNA of the present disclosure may be assigned to a codon constituting at least one codon box selected from the following (i) to (vii) in the genetic code table.
  • any tRNA can be assigned to the codons constituting the remaining codon boxes to which the tRNA of the present disclosure has not been assigned.
  • the codons that make up the remaining codon box are assigned any set of tRNAs that can translate each codon into some amino acid.
  • Such sets of tRNAs may be derived from native tRNAs or may be artificially synthesized tRNAs.
  • the translation system of the present disclosure is a cell-free translation system.
  • the translation system of the present disclosure is a reconstituted cell-free translation system.
  • the cell extract and the factor required for peptide translation (for example, ribosome) in the cell-free translation system those derived from various biological materials can be used. Examples of such biological materials include Escherichia coli, yeast, wheat germ, rabbit reticulocytes, HeLa cells, insect cells and the like.
  • the cell-free translation system of the present disclosure comprises E. coli-derived ribosomes.
  • the translational system of the present disclosure produces tRNA per codon (tRNA corresponding to each codon) 0.8 ⁇ M, 1.6 ⁇ M, 2.4 ⁇ M, 3.2 ⁇ M, 4.0 ⁇ M, 4.8 ⁇ M, 5.6 ⁇ M, 6.4 ⁇ M.
  • the lower limit selected from the group consisting of 10 ⁇ M, and 100 ⁇ M, 150 ⁇ M, 200 ⁇ M, 250 ⁇ M, 300 ⁇ M, 350 ⁇ M, 400 ⁇ M, 450 ⁇ M, 500 ⁇ M, 550 ⁇ M, 600 ⁇ M, 650 ⁇ M, 700 ⁇ M, 750 ⁇ M, 800 ⁇ M, 850 ⁇ M, 900 ⁇ M, 950 ⁇ M, 1000 ⁇ M. It can be contained in a concentration within a range that can be specified by the upper limit selected from the group consisting of.
  • it can be contained at a concentration of 0.8 to 1000 ⁇ M, preferably 1.6 to 500 ⁇ M, more preferably 3.2 to 250 ⁇ M, still more preferably 6.4 to 150 ⁇ M, and particularly preferably 10 to 100 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is uridine (U) and M 2 is uridine (U). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by UUM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of UUA and UUG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of UUU, UUA, UUG codons, or the combination of UUC, UUA, UUG codons.
  • tRNA for example, transcriptionally synthesized tRNA
  • tRNA for example, transcriptionally synthesized tRNA
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is uridine (U) and M 2 is adenosine (A). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by UAM 3.
  • UAA uridine
  • A adenosine
  • the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by UAM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of UAA and UAG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of UAU, UAA, UAG codons, or the combination of UAC, UAA, UAG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the tRNA of the present disclosure contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is uridine (U) and M 2 is guanosine (G). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by UGM 3.
  • U uridine
  • G guanosine
  • the translation system containing tRNA in the present disclosure two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of UGA and UGG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from a combination of UGU, UGA, UGG codons, or a combination of UGC, UGA, UGG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is cytidine (C) and M 2 is adenosine (A). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by CAM 3.
  • C cytidine
  • A adenosine
  • the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by CAM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of CAA and CAG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of CAU, CAA, CAG codons, or the combination of CAC, CAA, CAG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is cytidine (C) and M 2 is guanosine (G). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by CGM 3.
  • C cytidine
  • G guanosine
  • the translation system containing tRNA in the present disclosure two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of codons of CGA and CGG.
  • three amino acids can be selectively translated from a combination of CGU, CGA, CGG codons, or a combination of CGC, CGA, CGG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is adenosine (A) and M 2 is uridine (U). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by AUM 3.
  • A adenosine
  • U uridine
  • the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by AUM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of AUA and AUG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of AUU, AUA, AUG codons, or the combination of AUC, AUA, AUG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the tRNA of the present disclosure contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is adenosine (A) and M 2 is cytidine (C). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by ACM 3.
  • ACM 3 a codon box whose codon is represented by ACM 3.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the tRNA of the present disclosure contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is adenosine (A) and M 2 is adenosine (A). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by AAM 3.
  • AAM 3 a codon box whose codon is represented by AAM 3.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is adenosine (A) and M 2 is guanosine (G). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by AGM 3.
  • A adenosine
  • G guanosine
  • the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by AGM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of AGA and AGG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of AGU, AGA, AGG codons, or the combination of AGC, AGA, AGG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the codons in the translational system of the present disclosure are codons in which M 1 is guanosine (G) and M 2 is adenosine (A). That is, the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by GAM 3.
  • G guanosine
  • A adenosine
  • the tRNA of the present disclosure can be assigned to a codon box whose codon is represented by GAM 3.
  • two kinds of amino acids can be selectively translated from the combination of GAA and GAG codons.
  • three amino acids can be selectively translated from the combination of GAU, GAA, GAG codons, or the combination of GAC, GAA, GAG codons.
  • tRNA of the present disclosure it is preferable to use an artificially synthesized tRNA (for example, a transcriptionally synthesized tRNA).
  • an artificially synthesized tRNA for example, a transcriptionally synthesized tRNA.
  • a sequence derived from any tRNA for example, tRNA (Glu), tRNA (AsnE2), tRNA (Asp), etc.
  • tRNA tRNA
  • AsnE2 tRNA
  • Asp tRNA
  • Anticodon sequences can also be linked and used.
  • the tRNA of the present disclosure is preferably composed of only four types of nucleosides, adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), and uridine (U), including the anticodon portion, and other than these. It is desirable that no modified nucleosides be included.
  • a cell-free translation system particularly a reconstituted cell-free translation system is preferable.
  • aminoacylating each tRNA it is preferable to bind amino acids outside the translation system, and as a method for that, for example, a pCpA method, a pdCpA method, a method using an artificial RNA catalyst (flexizyme), or aminoacyl-tRNA synthesis.
  • the method using an enzyme is preferable.
  • the amino acid to be bound to each tRNA either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used, but it is also from the viewpoint of the purpose of the present disclosure to use an unnatural amino acid that is not included in the natural genetic code table. desirable.
  • the concentration of the disclosed tRNA contained in the translation system per codon is preferably in the range of, for example, 0.8 to 1000 ⁇ M.
  • the present disclosure provides a method for producing a peptide, comprising translating a nucleic acid using the translation system in the present disclosure.
  • the present disclosure includes tRNAs having anticodons complementary to the codons represented by M 1 M 2 A and tRNAs having anticodons complementary to the codons represented by M 1 M 2 G.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide, which comprises translating a nucleic acid in a translation system.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • different amino acids or amino acid analogs are bound to each of the two types of tRNA.
  • the codon represented by M 1 M 2 U, the codon represented by M 1 M 2 C, the codon represented by M 1 M 2 A, and the codon M 1 M At least two amino acids or amino acid analogs can be translated from the codon represented by 2 G.
  • the present disclosure presents a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 U, a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 A, and M 1 M.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide, which comprises translating a nucleic acid in a translation system containing a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by 2G.
  • the present disclosure is a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and M 1.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide, which comprises translating a nucleic acid in a translation system containing a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • different amino acids or amino acid analogs are bound to each of the three types of tRNA.
  • the codon represented by M 1 M 2 U, the codon represented by M 1 M 2 C, the codon represented by M 1 M 2 A, and the codon M 1 M At least three amino acids or amino acid analogs can be translated from the codon represented by 2 G.
  • the nucleic acid in the present disclosure may contain one or more codons represented by M 1 M 2 A and one or more codons represented by M 1 M 2 G, respectively.
  • the tRNA in the present disclosure contains one or more codons represented by M 1 M 2 A and one codon represented by M 1 M 2 G, which can be contained in the nucleic acid. It may include a process of selectively translating (or a process of distinguishing).
  • one or more nucleic acids containing these codons can be translated.
  • the nucleic acids in the present disclosure may include one or more codons represented by M 1 M 2 U, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, respectively.
  • the method for producing a peptide in the present disclosure is such that the tRNA in the present disclosure is a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G, which can be contained in the nucleic acid. It may include the process of selectively translating (or distinguishing) the represented codons once or multiple times, respectively.
  • one or more nucleic acids containing these codons can be translated.
  • the nucleic acids in the present disclosure may include one or more codons represented by M 1 M 2 C, M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G, respectively.
  • the method for producing a peptide in the present disclosure is such that the tRNA in the present disclosure is a codon represented by M 1 M 2 C, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G, which can be contained in the nucleic acid. It may include the process of selectively translating (or distinguishing) the represented codons once or multiple times, respectively.
  • one or more nucleic acids containing these codons can be translated.
  • the nucleic acids in the present disclosure are the codons represented by M 1 M 2 U, the codons represented by M 1 M 2 C, the codons represented by M 1 M 2 A, and the codons represented by M 1 M 2 G. Each may contain one or more codons.
  • the tRNA in the present disclosure is represented by a codon represented by M 1 M 2 U, a codon represented by M 1 M 2 C, and a codon represented by M 1 M 2 A that can be contained in the nucleic acid. It may include the process of selectively translating (or distinguishing) the codons to be made and the codons represented by M 1 M 2 G once or multiple times, respectively.
  • one or more nucleic acids containing these codons can be translated.
  • the present disclosure comprises a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A and a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 G.
  • the present invention relates to a composition and a kit for producing a peptide.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • different amino acids or amino acid analogs are bound to each of the two types of tRNA.
  • compositions and kits in the present disclosure codons represented by M 1 M 2 U, codons represented by M 1 M 2 C, codons represented by M 1 M 2 A.
  • at least two amino acids or amino acid analogs can be translated from the codons represented by M 1 M 2 G.
  • the present disclosure presents a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 U, a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 1 M 2 A, and M 1 M.
  • the present invention relates to a composition and a kit for producing a peptide, which comprises a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by 2 G.
  • the present disclosure is a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 C, a tRNA having an anticodon complementary to the codon represented by M 1 M 2 A, and M 1.
  • the present invention relates to a composition and a kit for producing a peptide, which comprises a tRNA having an anticodon complementary to a codon represented by M 2 G.
  • M 1 and M 2 represent the first and second letter nucleosides of the codon, respectively, and M 1 and M 2 independently represent adenosine (A), guanosine (G), and cytidine, respectively. It is selected from either (C) or uridine (U).
  • different amino acids or amino acid analogs are bound to each of the three types of tRNA.
  • the codon represented by M 1 M 2 U, the codon represented by M 1 M 2 C, the codon represented by M 1 M 2 A, and the codon M 1 M At least three amino acids or amino acid analogs can be translated from the codon represented by 2 G.
  • the tRNA constituting the translation system in the present disclosure can constitute a composition containing a buffer or a substance usually used for translation of nucleic acid. Further, the tRNA constituting the translation system in the present disclosure can be pre-packaged together with various substances usually used for translation of peptides and supplied as a kit. Further, various substances included in the kit can be powdered or liquid depending on the mode of use. In addition, these can be stored in a suitable container and used in a timely manner.
  • a compound in which two or more amino acids are bound by an amide bond may be included in the peptide of the present disclosure.
  • a compound in which an amino acid analog such as a hydroxycarboxylic acid is bound by an ester bond instead of an amino acid may also be included in the peptide of the present disclosure.
  • the number of amino acids or amino acid analogs contained in the peptide is not particularly limited as long as it is 2 or more, but for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 pieces.
  • 9 or more, 10 or more, 11 or more, etc., 100 or less, 80 or less, 50 or less, 30 or less, 25 or less, 20 or less, 19 or less, 18 pieces Below, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, and the like can be mentioned. Alternatively, you can choose from 9, 10, 11, and 12.
  • compositions and kits in the present disclosure may contain nucleic acids.
  • the nucleic acids constituting the compositions and kits in the present disclosure may contain one or more codons represented by M 1 M 2 A and M 1 M 2 G, respectively.
  • the nucleic acids constituting the compositions and kits in the present disclosure are (i) codons represented by M 1 M 2 U, codons represented by M 1 M 2 A, and M 1 M 2 G. Containing one or more codons represented by, or (ii) codons represented by M 1 M 2 C, codons represented by M 1 M 2 A, and codons represented by M 1 M 2 G, respectively. be able to.
  • the nucleic acids constituting the compositions and kits in the present disclosure are codons represented by M 1 M 2 A, codons represented by M 1 M 2 G, and codons represented by M 1 M 2 U. , And can contain one or more codons represented by M 1 M 2 C, respectively. In one aspect, the compositions and kits in the present disclosure may contain one or more such nucleic acids.
  • the peptide of the present disclosure may contain N-substituted amino acids, and the number of N-substituted amino acids contained in the peptide is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or the like. It can be 8, 9, 10 and so on.
  • the peptide of the present disclosure may contain amino acids that are not N-substituted, and the number of amino acids that are not N-substituted is, for example, 1, 2, 3, 4, or the like. There can be.
  • the peptides of the present disclosure may contain both N-substituted amino acids and non-N-substituted amino acids.
  • the peptide of the present disclosure may be a linear peptide or a peptide having a cyclic moiety.
  • a peptide having a cyclic portion is a peptide in which the main chain or side chain of an amino acid or amino acid relative existing on the peptide chain is bound to the main chain or side chain of another amino acid or amino acid relative existing on the same peptide chain. By doing so, it means a peptide having a cyclic structure formed in the molecule.
  • the peptide having a cyclic portion may be composed of only the cyclic portion, or may contain both the cyclic portion and the linear portion.
  • the number of amino acids or amino acid analogs contained in the cyclic portion is, for example, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, and 14 or less, 13 or more. Below, it can be 12 or less, 11 or less, and so on. Alternatively, you can choose from 9, 10, or 11.
  • the number of amino acids or amino acid analogs contained in the linear moiety may be, for example, 0 or more, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, and the like. can. Alternatively, you can select from 0, 1, 2, and 3.
  • a peptide bond formed from an amino group and a carboxyl group can be used.
  • Carbon-carbon bonds can be formed by transition metal-catalyzed reactions such as the Suzuki reaction, the Heck reaction, and the Sonogashira reaction.
  • the peptides of the present disclosure contain at least one set of functional groups capable of forming the above bonds within the molecule.
  • the formation of the cyclic portion may be carried out by separately carrying out a reaction for binding the above-mentioned functional groups after the linear peptide is produced using the translation system of the present disclosure.
  • the nucleic acid translated in the translation system of the present disclosure is mRNA.
  • the mRNA may encode a peptide having the desired amino acid sequence.
  • translation of the mRNA into a peptide can be performed.
  • RNA polymerase for transcribing DNA into mRNA is included in the translation system, by adding the DNA to the translation system of the present disclosure, the transcription of the DNA into mRNA and the transcription of the mRNA into a peptide are performed. Translation can also be done.
  • the mRNA is at least the codon represented by M 1 M 2 A and the codon represented by M 1 M 2 G, the codon represented by M 1 M 2 U, the codon represented by M 1 M 2 A and M 1 It may include a codon represented by M 2 G, or a codon represented by M 1 M 2 C, a codon represented by M 1 M 2 A, and a codon represented by M 1 M 2 G. ..
  • Methionine is usually present as the starting amino acid at the N-terminal of the peptide to be translated, but several methods for introducing amino acids other than methionine into the N-terminal have also been reported. They may be used in combination with the method for producing peptides in the present disclosure. As such a method, for example, a method of translating a nucleic acid started from a desired amino acid by using an aminoacylated initiation tRNA with an amino acid other than methionine can be mentioned (Initiation suppression). In particular, since the extent to which foreign amino acids can be tolerated is higher at the start of translation than at the extension of the peptide chain, amino acids having a structure significantly different from that of natural amino acids can be used at the N-terminal.
  • the present disclosure provides a peptide produced by the method for producing a peptide in the present disclosure.
  • Peptides obtained by further chemical modification of the peptides produced by the method in the present disclosure are also included in the peptides provided in the present disclosure.
  • the present disclosure provides a method of producing a peptide library, comprising translating the nucleic acid library using the translation system in the present disclosure.
  • Nucleic acid molecules that encode each peptide and by preparing multiple nucleic acid molecules with a wide variety of nucleic acid sequences and translating them into peptides, a plurality of peptide molecules with a wide variety of amino acid sequences can be obtained. Can be manufactured.
  • the size of the library is not particularly limited, but for example, 10 6 or more, 10 7 or more, 10 8 or more, 10 9 or more, 10 10 or more, 10 11 or more, 10 12 or more, 10 13 or more, 10 14 or more, and the like. be able to.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • RNA is usually mRNA. DNA is translated into peptides via transcription into mRNA.
  • a nucleic acid library can be prepared by a method known to those skilled in the art or a method similar thereto.
  • a plurality of nucleic acid molecules having a wide variety of nucleic acid sequences can be easily prepared by using a mixed base at a desired position. Examples of codons using mixed bases include, for example, NNN (where N represents a mixture of four bases A, T, G, and C) and NNW (where W represents a mixture of two bases A and T).
  • NNM where W represents a mixture of two bases A and C
  • NNK where K represents a mixture of two bases G and T
  • NNS where S represents a C, It represents a mixture of two bases of G.
  • the peptide library in the present disclosure is a library in which a peptide is presented on a nucleic acid (nucleic acid display library, or simply display library).
  • a display library is a library characterized in that a phenotype and a genotype are associated with each other by binding a peptide and a nucleic acid encoding the peptide to form one complex. Examples of major display libraries are the mRNA display method (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 12297-12302), in vitro virus method (Nemoto et al., FEBS Lett (1997) 414: 405).
  • cDNA display method (Yamaguchi et al., Nucleic Acids Res (2009) 37: e108), Ribosome display method (Mattheakis et al, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 9022-9026), covalent display method (Reiersen et al., Nucleic Acids Res (2005) 33: e10), CIS display method (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101: 2806-2810), etc. Can be done.
  • a library created using the in vitro compartmentalization method (Tawfik and Griffiths, Nat Biotechnol (1998) 16: 652-656) can also be mentioned as one aspect of the display library.
  • the present disclosure provides a peptide library produced by the method for producing a peptide library in the present disclosure.
  • the present disclosure provides a method for identifying a peptide having a binding activity to a target molecule, which comprises contacting the target molecule with the peptide library in the present disclosure.
  • the target molecule is not particularly limited, and can be appropriately selected from, for example, low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, nucleic acids, peptides, proteins, sugars, lipids and the like.
  • the target molecule may be a molecule existing outside the cell or a molecule existing inside the cell. Alternatively, it may be a molecule present in the cell membrane, in which case any of the extracellular domain, transmembrane domain, and intracellular domain may be targeted.
  • the target molecule In the step of contacting the peptide library with the target molecule, the target molecule is usually immobilized on some solid phase carrier (eg, microtiter plate, microbead, etc.). Then, by removing the peptide that is not bound to the target molecule and recovering only the peptide that is bound to the target molecule, the peptide having the binding activity to the target molecule can be selectively concentrated (). Panning method).
  • the peptide library used is a nucleic acid display library
  • the nucleic acid encoding the genetic information is bound to the recovered peptide. Therefore, by isolating and analyzing them, the nucleic acid encoding the recovered peptide is used. Sequences and amino acid sequences can be easily identified. Furthermore, the identified peptides can be individually produced by chemical synthesis or gene recombination method based on the obtained nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • the present disclosure provides a nucleic acid-peptide complex comprising a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, the complex having the following characteristics: (i) The nucleic acid sequence encoding the peptide contains two codons , M 1 M 2 A and M 1 M 2 G, and (ii) In the amino acid sequence of the peptide, the types of amino acids or amino acid relatives corresponding to the M 1 M 2 A codon and the amino acid or amino acid relatives corresponding to the M 1 M 2 G codon are different from each other. Where M 1 and M 2 represent the first and second letters of a particular codon, respectively (except for codons where M 1 is A and M 2 is U).
  • the present disclosure provides a nucleic acid-peptide complex comprising a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, the complex having the following characteristics: (i) The nucleic acid sequence encoding the peptide contains three codons , M 1 M 2 U, M 1 M 2 A and M 1 M 2 G, and (ii) In the amino acid sequence of the peptide, the amino acid or amino acid relative corresponding to the M 1 M 2 U codon, the amino acid or amino acid relative corresponding to the M 1 M 2 A codon, and the M 1 M 2 G codon. The types of corresponding amino acids or amino acid analogs are all different from each other. Where M 1 and M 2 represent the first and second letters of a particular codon, respectively.
  • the present disclosure provides a nucleic acid-peptide complex comprising a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, the complex having the following characteristics: (i) The nucleic acid sequence encoding the peptide contains three codons , M 1 M 2 C, M 1 M 2 A and M 1 M 2 G, and (ii) In the amino acid sequence of the peptide, the amino acid or amino acid relative corresponding to the M 1 M 2 C codon, the amino acid or amino acid relative corresponding to the M 1 M 2 A codon, and the M 1 M 2 G codon. The types of corresponding amino acids or amino acid analogs are all different from each other. Where M 1 and M 2 represent the first and second letters of a particular codon, respectively.
  • the nucleic acid-peptide complex described above may be included therein as one of the constituent elements of a peptide library (particularly a nucleic acid display library).
  • the present disclosure provides a library (peptide library or nucleic acid display library) comprising the nucleic acid-peptide complex in the present disclosure.
  • the nucleic acid-peptide complexes and libraries described above can be made using the tRNAs in the present disclosure, or the translation system in the present disclosure. All prior art documents cited herein are incorporated herein by reference.
  • Example 1 Synthesis of pCpA-Amino Acids Used in Cell-Free Translation Systems Aminoacylated pCpA (SS14, SS15, SS16, SS48, SS49, SS50, SS51) was synthesized according to the following scheme.
  • the buffer solution A was prepared as follows. Acetic acid is added to an aqueous solution of N, N, N-trimethylhexadecane-1-aminium chloride (6.40 g, 20 mmol) and imidazole (6.81 g, 100 mmol) to pH 8, 20 mM N, N, N-trimethylhexadecane. -1-Aminium, 100 mM imidazole buffer A (1 L) was obtained.
  • Synthetic intermediates for compound SS48 were synthesized according to the following scheme.
  • Trifluoroacetic acid (2.3 mL) was added to the reaction solution, the reaction solution was freeze-dried, and then purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution / 0.05% trifluoroacetic acid acetonitrile) to purify the title compound.
  • Compound SS48, F-Pnaz-MeA3Pyr-pCpA (64.4 mg, 5%) was obtained.
  • LCMS (ESI) m / z 1098.5 (MH)- Retention time: 0.39 minutes (analysis condition SQDFA05_01)
  • Trifluoroacetic acid (2.3 mL) was added to the reaction solution, the reaction solution was freeze-dried, and then purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution / 0.05% trifluoroacetic acid acetonitrile) to purify the title compound.
  • Compound SS49, F-Pnaz-StBuOH-pCpA (55.3 mg, 5%) was obtained.
  • LCMS (ESI) m / z 1095.4 (MH)- Retention time: 0.46 minutes (analysis condition SQDFA05_01)
  • N-Methyl-O-propyl-L-serine (Compound SS58, MeSnPr-OH) (920 mg, 5.71 mmol) under a nitrogen atmosphere, carbonate- (4-nitrophenyl) synthesized by the method described in Patent Document (WO2018143145A1).
  • DMSO 15 mL
  • triethylamine (1.3 mL, 9.43 mmol) were added to a mixture of -4- (2- (4-fluorophenyl) acetamide) benzyl (compound ts11) (2 g, 4.71 mmol) at room temperature.
  • Trifluoroacetic acid (2.3 mL) was added to the reaction solution, the reaction solution was freeze-dried, and then purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution / 0.05% trifluoroacetic acid acetonitrile) to purify the title compound.
  • Compound SS50, F-Pnaz-MeSnPr-pCpA (70.2 mg, 6%) was obtained.
  • LCMS (ESI) m / z 1079.5 (MH)- Retention time: 0.52 minutes (analysis condition SQDFA05_01)
  • Fmoc-Gly-OH as an Fmoc amino acid, Fmoc-Thr (THP)-synthesized by the method described in Patent Document (WO2018225864), using 2-kuguchi ritylresin (100 mg) carrying Fmoc-Gly-OH.
  • Peptide elongation was performed on a peptide synthesizer using OH (aa01), Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-MePhe-OH, and Fmoc-Pro-OH (amino acids). The abbreviation of is described separately in this specification).
  • Peptides were elongated according to the peptide synthesis method by the Fmoc method (WO2013100132B2). After the peptide was extended, the N-terminal Fmoc group was removed on a peptide synthesizer, and then the resin was washed with DCM. TFE / DCM (1: 1, v / v, 2 mL) was added to the resin and shaken for 1 hour to cut out the peptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtering the solution in the tube with a synthetic column, and the resin was washed twice with TFE / DCM (1: 1, v / v, 1 mL).
  • Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr (THP) -OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe were used as Fmoc amino acids using 2-kuguchi ritylresin (100 mg) carrying Fmoc-Ala-OH.
  • Peptides were extended by a peptide synthesizer using -OH and Fmoc-Pro-OH (amino acid abbreviations are described separately in this specification). Peptides were elongated according to the peptide synthesis method by the Fmoc method (WO2013100132B2).
  • the N-terminal Fmoc group was removed on a peptide synthesizer, and then the resin was washed with DCM.
  • TFE / DCM (1: 1, v / v, 2 mL) was added to the resin and shaken for 1 hour to cut out the peptide from the resin.
  • the resin was removed by filtering the solution in the tube with a synthetic column, and the resin was washed twice with TFE / DCM (1: 1, v / v, 1 mL). All the extracts were mixed, DMF (2 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure.
  • Example 5 Synthetic template DNA for aminoacyl tRNA (SEQ ID NO: 1 (D-1) to SEQ ID NO: 34 (D-34), SEQ ID NO: 35 (D-76) to SEQ ID NO: 37 (D-78) and SEQ ID NO:: From 224 (D-82) to SEQ ID NO: 241 (D-99), tRNA (SEQ ID NO: 38 (TR-1) to SEQ ID NO: 74 (TR-37) by in vitro transcription reaction using T7 RNA polymerase. ) And SEQ ID NO: 242 (TR-38) to SEQ ID NO: 259 (TR-55)) were synthesized and purified by RNeasy kit (Qiagen).
  • tRNA SEQ ID NO: 38 (TR-1) tRNA (Glu) aag-CA RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC tRNA SEQ ID NO: 39 (TR-2) tRNA (Glu) uag-CA RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC tRNA SEQ ID NO: 40 (TR-3) tRNA (Glu) cag-CA RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC tRNA SEQ ID NO: 41 (TR-4) tRNA (Glu) aac-CA RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAACAGGGCGGUAACAGGG
  • a reaction solution prepared with Nuclease free water so as to be a solution) was prepared, and a ligation reaction was carried out at 15 ° C. for 45 minutes.
  • the reaction solution before adding T4 RNA ligase and aminoacyl-zylated pCpA was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then left at room temperature for 5 minutes to perform tRNA refolding in advance.
  • the aminoacylated pCpA starting with "ts" or "TS” are all the compounds described in WO2018143145A1 synthesized by the method described in WO2018143145A1.
  • aminoacylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uag-CA (SEQ ID NO: 39 (TR-2)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cag-CA (SEQ ID NO: 40 (TR-3)) by the method described above. gone.
  • an aminoacylated pCpA (ts14) was subjected to a ligation reaction with the transcribed tRNA (Glu) aac-CA (SEQ ID NO: 41 (TR-4)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uac-CA (SEQ ID NO: 42 (TR-5)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cac-CA (SEQ ID NO: 43 (TR-6)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) aug-CA (SEQ ID NO: 44 (TR-7)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uug-CA (SEQ ID NO: 45 (TR-8)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cug-CA (SEQ ID NO: 46 (TR-9)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) auu-CA (SEQ ID NO: 47 (TR-10)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uuu-CA (SEQ ID NO: 48 (TR-11)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cuu-CA (SEQ ID NO: 49 (TR-12)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) auc-CA (SEQ ID NO: 50 (TR-13)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uuc-CA (SEQ ID NO: 51 (TR-14)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cuc-CA (SEQ ID NO: 52 (TR-15)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) aaa-CA (SEQ ID NO: 53 (TR-16)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uaa-CA (SEQ ID NO: 54 (TR-17)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) caa-CA (SEQ ID NO: 55 (TR-18)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) acu-CA (SEQ ID NO: 56 (TR-19)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ucu-CA (SEQ ID NO: 57 (TR-20)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ccu-CA (SEQ ID NO: 58 (TR-21)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gca-CA (SEQ ID NO: 59 (TR-22)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uca-CA (SEQ ID NO: 60 (TR-23)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cca-CA (SEQ ID NO: 61 (TR-24)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gug-CA (SEQ ID NO: 63 (TR-26)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) guu-CA (SEQ ID NO: 64 (TR-27)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gcu-CA (SEQ ID NO: 67 (TR-30)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) aug-CA (SEQ ID NO: 44 (TR-7)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uug-CA (SEQ ID NO: 45 (TR-8)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cug-CA (SEQ ID NO: 46 (TR-9)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) auu-CA (SEQ ID NO: 47 (TR-10)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uuu-CA (SEQ ID NO: 48 (TR-11)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cuu-CA (SEQ ID NO: 49 (TR-12)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) auc-CA (SEQ ID NO: 50 (TR-13)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uuc-CA (SEQ ID NO: 51 (TR-14)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cuc-CA (SEQ ID NO: 52 (TR-15)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) aaa-CA (SEQ ID NO: 53 (TR-16)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uaa-CA (SEQ ID NO: 54 (TR-17)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) caa-CA (SEQ ID NO: 55 (TR-18)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) acu-CA (SEQ ID NO: 56 (TR-19)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ucu-CA (SEQ ID NO: 57 (TR-20)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ccu-CA (SEQ ID NO: 58 (TR-21)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gca-CA (SEQ ID NO: 59 (TR-22)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uca-CA (SEQ ID NO: 60 (TR-23)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) cca-CA (SEQ ID NO: 61 (TR-24)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gug-CA (SEQ ID NO: 63 (TR-26)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) guu-CA (SEQ ID NO: 64 (TR-27)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) guc-CA (SEQ ID NO: 65 (TR-28)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gaa-CA (SEQ ID NO: 66 (TR-29)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gcu-CA (SEQ ID NO: 67 (TR-30)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS16) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uga-CA (SEQ ID NO: 68 (TR-31)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS16) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ugu-CA (SEQ ID NO: 69 (TR-32)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS16) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) uau-CA (SEQ ID NO: 70 (TR-33)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS16) was ligated to the transcribed tRNA (Ile) uau-CA (SEQ ID NO: 71 (TR-34)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS51) was ligated to the transcribed tRNA (Ile) uau-CA (SEQ ID NO: 71 (TR-34)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) gcg-CA (SEQ ID NO: 72 (TR-35)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS15) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ucg-CA (SEQ ID NO: 73 (TR-36)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Glu) ccg-CA (SEQ ID NO: 74 (TR-37)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) aug-CA (SEQ ID NO: 242 (TR-38)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) uug-CA (SEQ ID NO: 246 (TR-42)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) cug-CA (SEQ ID NO: 248 (TR-44)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) aug-CA (SEQ ID NO: 243 (TR-39)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) uug-CA (SEQ ID NO: 247 (TR-43)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) cug-CA (SEQ ID NO: 249 (TR-45)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) gug-CA (SEQ ID NO: 244 (TR-40)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) uug-CA (SEQ ID NO: 246 (TR-42)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) cug-CA (SEQ ID NO: 248 (TR-44)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) gug-CA (SEQ ID NO: 245 (TR-41)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) uug-CA (SEQ ID NO: 247 (TR-43)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) cug-CA (SEQ ID NO: 249 (TR-45)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (ts14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) auc-CA (SEQ ID NO: 250 (TR-46)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS14) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) uuc-CA (SEQ ID NO: 251 (TR-47)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (TS24) was ligated to the transcribed tRNA (Asp) cuc-CA (SEQ ID NO: 252 (TR-48)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) aug-CA (SEQ ID NO: 253 (TR-49)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) uug-CA (SEQ ID NO: 255 (TR-51)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) cug-CA (SEQ ID NO: 256 (TR-52)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) gug-CA (SEQ ID NO: 254 (TR-50)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) uug-CA (SEQ ID NO: 255 (TR-51)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) cug-CA (SEQ ID NO: 256 (TR-52)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS48) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) auc-CA (SEQ ID NO: 257 (TR-53)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS49) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) uuc-CA (SEQ ID NO: 258 (TR-54)) by the method described above. gone.
  • aminoacyl-tylated pCpA (SS50) was ligated to the transcribed tRNA (AsnE2) cuc-CA (SEQ ID NO: 259 (TR-55)) by the method described above. gone.
  • each ligation product is mixed at the stage where the phenol / chloroform solution is added, and the phenol is mixed in the state of a mixture or in a single state. Chloroform extraction and ethanol precipitation were performed and recovered. Specifically, 0.3M sodium acetate was added to three types of ligation products of compound AAtR-1, compound AAtR-2, and compound AAtR-3, and a solution containing a phenol / chloroform solution was mixed in equal amounts to obtain phenol.
  • 0.3M sodium acetate was added to the two ligation products of compound AAtR-57 and compound AAtR-59, and the solution containing the phenol / chloroform solution was mixed in equal amounts to perform phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Then, an aminoacylated tRNA mixed solution (a mixed solution of compound AAtR-57 and compound AAtR-59) was prepared. Similarly, 0.3M sodium acetate was added to three types of ligation products of compound AAtR-60, compound AAtR-61, and compound AAtR-62, and a solution containing a phenol / chloroform solution was mixed in equal amounts, and phenol / chloroform was mixed.
  • Extraction and ethanol precipitation were carried out to prepare an aminoacylated tRNA mixed solution (a mixed solution of Compound AAtR-60, Compound AAtR-61, and Compound AAtR-62). Similarly, 0.3M sodium acetate was added to three types of ligation products of compound AAtR-63, compound AAtR-64, and compound AAtR-65, and a solution containing a phenol / chloroform solution was mixed in equal amounts, and phenol / chloroform was mixed. Extraction and ethanol precipitation were carried out to prepare an aminoacylated tRNA mixed solution (a mixed solution of compound AAtR-63, compound AAtR-64, and compound AAtR-65).
  • the following compounds were purified and prepared without mixing.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-52 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-52.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-53 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-53.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-54 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-54.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-55 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-55.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-56 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-56.
  • Sodium acetate was added to the ligation product of compound AAtR-58 so as to be 0.3 M, and a solution containing a phenol / chloroform solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to prepare compound AAtR-58.
  • reaction solution before adding T4 RNA ligase and aminoacyl-zylated pCpA was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then left at room temperature for 5 minutes to perform tRNA refolding in advance.
  • Sodium acetate was added to the ligation reaction solution to 0.3 M, phenol / chloroform was extracted, and the initiator aminoacyl-tRNA (compound AAtR-25) was recovered by ethanol precipitation.
  • the initiator aminoacyl-tRNA was dissolved in 1 mM sodium acetate immediately prior to addition to the translation mixture.
  • Compound AAtR-7 SEQ ID NO: 81 nBuG-tRNA (Glu) aug
  • Compound AAtR-16 SEQ ID NO: 90 nBuG-tRNA (Glu) aaa
  • Compound AAtR-61 SEQ ID NO: 261: 261 Pic2-tRNA (Asp1) _uug
  • Example 6 Peptide translational synthesis
  • an experiment was conducted to confirm the distinction between the three amino acids in one codon box in the presence of three aminoacylated tRNAs. Specifically, it contains one of three types of codons in the same codon box, and the other codons have the same sequence as template mRNAs (template mRNA SEQ ID NO: 134 (mR-1) to SEQ ID NO: 162 (mR). -29), SEQ ID NO: 219 (mR-42) to SEQ ID NO: 221 (mR-44)) were translated using an aminoacyl-acylated tRNA mixed solution, and a peptide compound was translated and synthesized.
  • template mRNA SEQ ID NO: 134 mR-1 to SEQ ID NO: 162 (mR).
  • -29 SEQ ID NO: 219 (mR-42) to SEQ ID NO: 221 (mR-44)
  • wobble codons could be read separately, and another codon could be read at the same time.
  • Amino acids were verified in two combinations, and it was shown that under any of the conditions, it is possible to distinguish between 3 amino acids in one codon box in a specific codon box.
  • PURE system which is a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from prokaryotes.
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.I.
  • coli MRE600 RNase Negative Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 35 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M Phe
  • coli MRE600 RNase Negative Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 35 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M Phe
  • coli MRE600 RNase Negative -derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF 1, 0.4 ⁇ M IF 2, 1.5 ⁇ M IF 3, 40 ⁇ M EF-Tu, 54 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M P
  • coli MRE600 RNase Negative Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF 1, 0.4 ⁇ M IF 2, 1.5 ⁇ M IF 3, 40 ⁇ M EF-Tu, 54 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M P
  • coli MRE600 RNase Negative -derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF 1, 0.4 ⁇ M IF 2, 1.5 ⁇ M IF 3, 40 ⁇ M EF-Tu, 49 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M P
  • coli MRE600 RNase Negative Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF 1, 0.4 ⁇ M IF 2, 1.5 ⁇ M IF 3, 40 ⁇ M EF-Tu, 54 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / 1 ⁇ M template to ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS,
  • coli MRE600 RNase Negative Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF 1, 0.4 ⁇ M IF 2, 1.5 ⁇ M IF 3, 40 ⁇ M EF-Tu, 35 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M P
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.I.
  • coli MRE600 RNase Negative -derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.25 ⁇ M RF 1,4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside di Phosphoric acid kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 34.6 ⁇ M EF-Ts, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome , 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M PheRS, 0.16 ⁇ M ProRS, 0.09 ⁇ M ThrRS), 1 ⁇ M
  • Amino-acylated tRNA mixed solution (mixed solution of compound AAtR-22, compound AAtR-23, compound AAtR-24 or mixed solution of compound AAtR-44, compound AAtR-45, compound AAtR-46) so as to be 30 ⁇ M. It was added to the reaction mixture and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • initiator aminoacylated tRNA (Compound AAtR-25) 10 ⁇ M, aminoacylated tRNA mixed solution (Compound AAtR-26, Compound AAtR-8, Compound AAtR-9 mixed solution, Compound AAtR-47, Compound AAtR-30) , Compound AAtR-31, Compound AAtR-66, Compound AAtR-67, Compound AAtR-68, Compound AAtR-69, Compound AAtR-70, Compound AAtR-71, or Compound AAtR-78.
  • a mixture of compound AAtR-79 and compound AAtR-80) was added to the translation reaction mixture so as to have a concentration of 30 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphat
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphat
  • coli MRE600 RNase Negative Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 54 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M Phe
  • coli MRE600 RNase Negative Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 54 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M Phe
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.I.
  • coli MRE600 RNase Negative -derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.25 ⁇ M RF 1,4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside di Phosphoric acid kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 34.6 ⁇ M EF-Ts, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome , 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M PheRS, 0.16 ⁇ M ProRS, 0.09 ⁇ M ThrRS), 1 ⁇ M
  • Amino-acylated tRNA mixed solution (mixture of compound AAtR-44, compound AAtR-45, compound AAtR-46) was added to the translation reaction mixture so as to be 30 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. ..
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphata
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.I.
  • coli MRE600 RNase Negative Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic Pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 35 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1.2 ⁇ M ribosome, 0.5 mM PGA, 0.09 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.68 ⁇ M Phe
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyro
  • XXA in the codon box is present in the translation system in the situation where only the aminoacyl-tRNA having the anticodon of XXA is present in the translation system.
  • the ratio of cross-reads in codons other than codons was confirmed by the amount of translation. Specifically, it contains one of four types of codons in the same codon box, and the other codons have the same sequence as template mRNAs (template mRNA SEQ ID NO: 163 (mR-30) to SEQ ID NO: 174 (mR).
  • aminoacylated tRNA having an anticodon of XXA codon (Compound AAtR-52, or Compound AAtR-53, or Compound AAtR-54, or Compound AAtR-55, or Compound AAtR-56) under different concentration conditions.
  • the peptide compound was translated and synthesized. It was shown that the reading ratio in the codon box changes depending on the concentration of aminoacyl-tRNA. It was also shown that this phenomenon does not depend on the body sequence of tRNA or the amino acid to be charged.
  • PURE system which is a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from prokaryotes.
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEEPS-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiothreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase negative) -derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatin kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucle
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived tRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M
  • initiator aminoacylated tRNA (Compound AAtR-25) 10 ⁇ M
  • aminoacylated tRNA (Compound AAtR-53) 0.8 ⁇ M or 1.6 ⁇ M or 3.2 ⁇ M, 6.4 ⁇ M or 12.8 ⁇ M. It was added to the translation reaction mixture so as to be, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatin phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidin, 1 mM dithiosreitol, 3 ⁇ M Ala1BtRNA 1.5 mg / ml E .Coli MRE600 (RNase Negative) Derived TRNA (Roche), 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g / ml Cleatin Kinase, 3 ⁇ g / ml Myokinase, 2 unit / ml Inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M
  • Each group is 0.25 mM, initiator aminoacylated tRNA (Compound AAtR-25) 10 ⁇ M, aminoacylated tRNA (Compound AAtR-54, or Compound AAtR-55, or Compound AAtR-56) 0.8 ⁇ M or 1.6 ⁇ M.
  • it was added to the translation reaction mixture so as to be 3.2 ⁇ M, 6.4 ⁇ M or 12.8 ⁇ M, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the translation peptide compounds expected to be template mRNAs and their molecular weights are shown in Table 4 below.
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCUUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG Template mRNA SEQ ID NO: 135 (mR-2) RNA sequence: GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUCUAAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG Template mRNA SEQ ID NO: 136 (mR-3) RNA sequence: GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUCUGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG Template mRNA SEQ ID NO: 137 (mR-4) RNA sequence: GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUGUUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG Template
  • Example 7 Analysis of Translated Peptide
  • the unnatural peptide translation solution prepared in Example 6 was diluted 10-fold and analyzed using the LC-FLR-MS device.
  • the retention time of the target translated peptide was identified from the MS data, and the peptide translation amount was evaluated by quantifying the fluorescence peak of the corresponding retention time.
  • a calibration curve was prepared using LCT12 synthesized in Example 4 or LCT067 synthesized in Example 3 as a standard, and the content was calculated by relative quantification.
  • LC-MS was analyzed by selecting the optimum conditions according to the target sample according to the conditions in Table 5 below.
  • the tRNAs of the present disclosure are NNA codons and NNG codons, NNU codons and NNA codons and NNG codons, and NNC codons and NNA codons and NNG, which are not distinguished in the natural genetic code table. It is useful in that it is possible to distinguish the codons of.
  • the translation system of the present disclosure is useful in that it is capable of translating more types of amino acids (codon expansion) than translation systems using natural genetic code tables.

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Abstract

特定のコドンボックスにおいて、pCpA-アミノ酸と3'末端のCA欠損tRNAをligaseで結合させて調製したアミノアシル化tRNAを使用することで、wobble塩基対の存在により困難であったNNAとNNGコドンを読み分けることに成功した。さらに、同じコドンボックスのNNUもしくはNNCコドンに別のアミノ酸を割り当て、NNU、NNAおよびNNGまたはNNC、NNAおよびNNGの３つのコドンを含む配列を翻訳してコドンの読み分け能を評価したところ、目的のコドンからそれに対応するアミノ酸のみが特異的に翻訳され、正確な読み分けに成功した。またｔＲＮＡボディーの配列を変更しても同様の効果が得られることが確認された。

Description

改変された遺伝暗号表を有する翻訳系
　本開示は、改変された遺伝暗号表を有する翻訳系、ならびにその使用方法に関する。
　ディスプレイライブラリーは、標的タンパク質に結合する分子を進化工学的に効率よく取得できる、大変有用な技術である。ディスプレイライブラリーを用いて、任意の標的分子に対し高結合能を示す分子を取得したり、あるいは複数のエピトープに対してそれぞれ結合する分子を多種類取得したりするためには、高い多様性をもつライブラリーからのパニングが必要である。多様性の高いライブラリーを構築するためには、その構成単位（building block）の数を増やす、あるいは種類を増やすことが考えられるが、膜透過性の観点から分子量に制限がある場合、building blockの数にも制限がかかる。よって、ライブラリーの多様性を高めるためにbuilding blockの種類を増やすという手段は重要な意味を持つ。
　PURESYSTEM（非特許文献１）のような再構成された無細胞翻訳系は、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase; ARS）等の構成成分の濃度調整が可能であるため、天然のコドン－アミノ酸の対応付けを変更できる。このような翻訳系を用いることにより、任意のbuilding blockを20種類以上導入したディスプレイライブラリーを構築することも可能となっているが、3塩基コドンを用いた大腸菌の翻訳系においては、ウォブル（wobble）則の存在により、原理上は32種類が導入できるbuilding blockの上限であると考えられる。より具体的に説明すると、コドンの3文字目とアンチコドンの1文字目の対合には、“遊び”が存在し、ワトソン－クリック（Watson-Crick）塩基対以外にも、wobble塩基対と呼ばれるG・U間の対合が可能となっている。そのため、アンチコドンGNNはNNUおよびNNCのコドンを、アンチコドンUNNはNNAおよびNNGのコドンを解読（decode）してしまうため、これらのコドンを読み分けることができず、１つのコドンボックスに導入できるアミノ酸の種類は最大２アミノ酸に制限されてしまう（非特許文献２）。
　これまで、特定のコドンボックスにおいて、NNAとNNGのコドンに異なるアミノ酸を割り当てた報告(非特許文献３、非特許文献４、特許文献１)はあるが、さらに同じコドンボックスにおいて、もう1つ別のアミノ酸を割り当て、計３アミノ酸を同時にかつ正確に読み分け、building blockの数の拡張に成功している報告は存在しない。さらに、すでに報告された方法では、選択できるアミノ酸の汎用性は低いと考えられる。 また、系外で調製したアミノアシルｔＲＮＡを翻訳に使用する場合、系内でARSにより調製されるアミノアシル化ｔRNAの濃度よりも高濃度のアミノアシルｔＲＮＡが必要となり、その場合NNAとNNGコドンの読み分けが難しくなることも数学的に示されている（非特許文献５）。
　本技術分野においては、様々なアミノ酸をコドンテーブルに当てはめることと、各コドンを正確に読み分けて翻訳を行うことがディスプレイライブラリーの質を決定づける。各コドンに割り当てたアミノ酸が、それぞれのコドンから特異的に翻訳されることが非常に重要である。
WO2016/154675
Shimizu et al., Nat Biotechnol. 2001; 19(8): 751-755. Iwane et al., Nat Chem. 2016; 8(4): 317-325. Mukai et al., Nucleic Acids Res. 2015; 43(16): 8111-8122. Cui et al., J Am Chem Soc. 2015; 137(13): 4404-4413. Frenkel-Morgenstern et al., Mol Syst Biol. 2012; 8: 572.
　これまでにもコドン拡張を目的とした種々の試みがなされてきているが、NNAとNNGのコドンに異なるアミノ酸を割り当てて、それらが正確に読み分けられていることを明確に示した報告は存在しない。また、同じコドンボックス内に３つのアミノ酸を割り当てて、それらが正確に読み分けられていることを明確に示した報告も存在しない。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、コドンの読み分けを可能にする新たな手段を提供することを目的の一つとするものである。
　今回本発明者らは、特定のコドンボックスにおいて、wobble塩基対の存在により困難であったNNAとNNGコドンの読み分けに成功した。さらに、同じコドンボックスのNNUもしくはNNCコドンに別のアミノ酸を割り当てることを行った。これら３つのコドンを含む配列を実際に翻訳して読み分け能を評価したところ、目的のコドンからそれに対応するアミノ酸のみが特異的に翻訳され、正確な読み分けに成功していることが数値的にも確認された。
　本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下〔１〕～〔３２〕に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１〕
　M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAおよびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系であって、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され、
　前記2種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、翻訳系。
〔２〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔１〕に記載の翻訳系。
〔３〕
　（ｉ）M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、または、
　（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを含む翻訳系であって、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択され、
　前記（ｉ）および（ｉｉ）における3種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、翻訳系。
〔４〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔５〕
　M1およびM2が以下の（i）から(x)のいずれかである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の翻訳系：
　（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
　（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がアデノシン(A)である、
　（iii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
　（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
　（v） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
　（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がウリジン(U)である、
　（vii） M1がアデノシン(A)であり、M2がシチジン(C)である、
　（viii） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
　（ix） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
　（x） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔６〕
　M1およびM2が以下の（i）から(vii)のいずれかである、〔５〕に記載の翻訳系:
　（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
　（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
　（iii） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
　（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
　（v） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
　（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
　（vii） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔７〕
　前記翻訳系に含まれる前記tRNAの一コドンあたりの濃度が、（i）0.8～1000 μM、（ii）1.6～500 μM、（iii）3.2～250 μM、（iv）6.4～150 μM、または（v）10～100 μMのいずれかである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔８〕
　前記アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔９〕
　前記tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAである、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１０〕
　前記tRNAが原核生物由来または真核生物由来のtRNAである、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１１〕
　前記アンチコドンが、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、またはウリジン(U)のいずれか1種または複数種のヌクレオシドを含む、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１２〕
　一つの遺伝暗号表から、20種類より多くのアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳可能である、〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１３〕
　無細胞翻訳系である、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１４〕
　再構成型の無細胞翻訳系である、〔１３〕に記載の翻訳系。
〔１５〕
　大腸菌由来のリボソームを含む、〔１３〕または〔１４〕に記載の翻訳系。
〔１６〕
　前記tRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１７〕
　前記tRNAのうち、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１８〕
　前記tRNAが、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法によって得られるものである、〔１〕から〔１７〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔１９〕
　〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の翻訳系の製造方法であって、前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳系外でtRNAに結合させることを含む、方法。
〔２０〕
　前記翻訳系外でのアミノ酸またはアミノ酸類縁体のtRNAへの結合が、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法による、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕
　〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の翻訳系または〔１９〕もしくは〔２０〕に記載の方法によって得られる翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔２２〕
　ペプチドが環状部を有するペプチドである、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕
　〔２１〕または〔２２〕に記載の方法により製造されたペプチド。
〔２４〕
　〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の翻訳系または〔１９〕もしくは〔２０〕に記載の方法によって得られる翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む、ペプチドライブラリーの製造方法。
〔２５〕
　〔２４〕に記載の方法により製造されたペプチドライブラリー。
〔２６〕
　〔２５〕に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む、当該標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法。
〔２７〕
　前記アンチコドンがライシジンを含まない、〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔２８〕
　前記アンチコドンがライシジン誘導体を含まない、〔１〕から〔１８〕および〔２７〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔２９〕
　前記アンチコドンがアグマチジンを含まない、〔１〕から〔１８〕、〔２７〕および〔２８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔３０〕
　前記アンチコドンがアグマチジン誘導体を含まない、〔１〕から〔１８〕および〔２７〕から〔２９〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔３１〕
　M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを含む核酸をさらに含む、〔１〕から〔１８〕および〔２７〕から〔３０〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔３２〕
　前記核酸が、（ｉ）M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドン、または、（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンを含む、〔３１〕に記載の翻訳系。
　また本開示は、以下〔１０１〕～〔１２０〕に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１０１〕
　翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法であって、
　前記翻訳系が、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含み、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され、
　前記2種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、前記製造方法。
〔１０２〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔１０１〕に記載の方法。
〔１０３〕
　翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法であって、
　前記翻訳系が、
　（ｉ）M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、または、
　（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含み、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択され、
　前記（ｉ）および（ｉｉ）における3種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、前記製造方法。
〔１０４〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔１０１〕から〔１０３〕のいずれかに記載の方法。
〔１０５〕
　M1およびM2が以下の（i）から(x)のいずれかである、〔１０１〕から〔１０４〕のいずれかに記載の方法：
（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がアデノシン(A)である、
（iii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
（v） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がウリジン(U)である、
（vii） M1がアデノシン(A)であり、M2がシチジン(C)である、
（viii） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
（ix） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
（x） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔１０６〕
　M1およびM2が以下の（i）から(vii)のいずれかである、〔１０５〕に記載の方法:
（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
（iii） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
（v） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
（vii） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔１０７〕
　前記翻訳系に含まれる前記tRNAの一コドンあたりの濃度が、（i）0.8～1000 μM、（ii）1.6～500 μM、（iii）3.2～250 μM、（iv）6.4～150 μM、または（v）10～100 μMのいずれかである、〔１０１〕から〔１０６〕のいずれかに記載の方法。
〔１０８〕
　前記アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、〔１０１〕から〔１０７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０９〕
　前記tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAである、〔１０１〕から〔１０８〕のいずれかに記載の方法。
〔１１０〕
　前記tRNAが原核生物由来または真核生物由来のtRNAである、〔１０１〕から〔１０９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１１〕
　前記アンチコドンが、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、またはウリジン(U)のいずれか1種または複数種のヌクレオシドを含む、〔１０１〕から〔１１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１１２〕
　一つの遺伝暗号表から、20種類より多くのアミノ酸を翻訳可能である、〔１０１〕から〔１１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１１３〕
　翻訳系が無細胞翻訳系である、〔１０１〕から〔１１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１１４〕
　翻訳系が再構成型の無細胞翻訳系である、〔１１３〕に記載の方法。
〔１１５〕
　翻訳系が大腸菌由来のリボソームを含む、〔１１３〕または〔１１４〕に記載の方法。
〔１１６〕
　前記tRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔１０１〕から〔１１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１１７〕
　前記tRNAのうち、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔１０１〕から〔１１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１１８〕
　前記tRNAが、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法によって得られるものである、〔１０１〕から〔１１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１１９〕
　前記核酸が、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを含む、〔１０１〕から〔１１８〕のいずれかに記載の方法。
〔１２０〕
　前記核酸が、（ｉ）M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドン、または、（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンを含む、〔１０３〕から〔１１８〕のいずれかに記載の方法。
　また本開示は、以下〔２０１〕～〔２１８〕に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔２０１〕
　ペプチドを製造するためのキットまたは組成物であって、
　M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含み、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され、
　前記2種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、前記キットまたは組成物。
〔２０２〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔２０１〕に記載の方法。
〔２０３〕
　ペプチドを製造するためのキットまたは組成物であって、
　（ｉ）M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、または、
　（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを含み、
　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから独立に選択され、
　前記（ｉ）および（ｉｉ）における3種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、前記キットまたは組成物。
〔２０４〕
　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、〔２０１〕から〔２０３〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２０５〕
　M1およびM2が以下の（i）から(x)のいずれかである、〔２０１〕から〔２０４〕のいずれかに記載のキットまたは組成物：
（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がアデノシン(A)である、
（iii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
（v） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がウリジン(U)である、
（vii） M1がアデノシン(A)であり、M2がシチジン(C)である、
（viii） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
（ix） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
（x） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔２０６〕
　M1およびM2が以下の（i）から(vii)のいずれかである、〔２０５〕に記載のキットまたは組成物:
（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
（iii） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
（v） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
（vii） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
〔２０７〕
　前記tRNAの一コドンあたりの濃度が、（i）0.8～1000 μM、（ii）1.6～500 μM、（iii）3.2～250 μM、（iv）6.4～150 μM、または（v）10～100 μMのいずれかである、〔２０１〕から〔２０６〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２０８〕
　前記アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、〔２０１〕から〔２０７〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２０９〕
　前記tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAである、〔２０１〕から〔２０８〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１０〕
　前記tRNAが原核生物由来または真核生物由来のtRNAである、〔２０１〕から〔２０９〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１１〕
　前記アンチコドンが、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、またはウリジン(U)のいずれか1種または複数種のヌクレオシドを含む、〔２０１〕から〔２１０〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１２〕
　一つの遺伝暗号表から、20種類より多くのアミノ酸を翻訳可能である、〔２０１〕から〔２１１〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１３〕
　翻訳系が無細胞翻訳系である、〔２０１〕から〔２１２〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１４〕
　翻訳系が再構成型の無細胞翻訳系である、〔２１３〕に記載のキットまたは組成物。
〔２１５〕
　翻訳系が大腸菌由来のリボソームを含む、〔２１３〕または〔２１４〕に記載のキットまたは組成物。
〔２１６〕
　前記tRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔２０１〕から〔２１５〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１７〕
　前記tRNAのうち、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、〔２０１〕から〔２１６〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
〔２１８〕
　前記tRNAが、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法によって得られるものである、〔２０１〕から〔２１７〕のいずれかに記載のキットまたは組成物。
図１は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表６を参照）。　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２（アンチコドン：uag、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－１（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３（CUGのコドンを含む） 図２は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＵＵ，ＧＵＡ，ＧＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表７を参照）。　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４（アンチコドン：aac、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：uac、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：cac、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（GUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（GUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（GUGのコドンを含む） 図３は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表８を参照）。　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－７（アンチコドン：aug、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－７（CAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図４は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＡＵ，ＡＡＡ，ＡＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表９を参照）。　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１０（アンチコドン：auu、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１１（アンチコドン：uuu、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１２（アンチコドン：cuu、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１０（AAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（AAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（AAGのコドンを含む） 図５は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１０を参照）。　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１３（アンチコドン：auc、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１４（アンチコドン：uuc、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１５（アンチコドン：cuc、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１３（GAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（GAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（GAGのコドンを含む） 図６は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＵＵ，ＵＵＡ，ＵＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１１を参照）。　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１６（アンチコドン：aaa、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１７（アンチコドン：uaa、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１８（アンチコドン：caa、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１６（UUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１７（UUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１８（UUGのコドンを含む） 図７は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＧＵ，ＡＧＡ，ＡＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１２を参照）。　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１９（アンチコドン：acu、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２０（アンチコドン：ucu、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２１（アンチコドン：ccu、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１９（AGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２０（AGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２１（AGGのコドンを含む） 図８は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＧＣ，ＵＧＡ，ＵＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１３を参照）。　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２２（アンチコドン：gca、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２３（アンチコドン：uca、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２４（アンチコドン：cca、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－２２（UGCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２３（UGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２４（UGGのコドンを含む） 図９は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１４を参照）。　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２６（アンチコドン：gug、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－２５（CACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図１０は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＡＣ，ＡＡＡ，ＡＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１５を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２７（アンチコドン：guu、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１１（アンチコドン：uuu、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１２（アンチコドン：cuu、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－２６（AACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（AAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（AAGのコドンを含む） 図１１は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＧＣ，ＡＧＡ，ＡＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１６を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２８（アンチコドン：gcu、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２０（アンチコドン：ucu、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２１（アンチコドン：ccu、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－２９（AGCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２０（AGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２１（AGGのコドンを含む） 図１２は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１７を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２９（アンチコドン：aug、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３０（アンチコドン：uug、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３１（アンチコドン：cug、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－７（CAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図１３は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＡＵ，ＡＡＡ，ＡＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１８を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－３２（アンチコドン：auu、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３３（アンチコドン：uuu、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３４（アンチコドン：cuu、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－１０（AAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（AAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（AAGのコドンを含む） 図１４は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１９を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－３５（アンチコドン：auc、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３６（アンチコドン：uuc、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３７（アンチコドン：cuc、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－１３（GAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（GAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（GAGのコドンを含む） 図１５は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＵＵ，ＵＵＡ，ＵＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２０を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－３８（アンチコドン：aaa、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３９（アンチコドン：uaa、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４０（アンチコドン：caa、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－１６（UUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１７（UUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１８（UUGのコドンを含む） 図１６は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＧＵ，ＡＧＡ，ＡＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２１を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４１（アンチコドン：acu、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－４２（アンチコドン：ucu、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４３（アンチコドン：ccu、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－１９（AGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２０（AGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２１（AGGのコドンを含む） 図１７は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＧＣ，ＵＧＡ，ＵＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２２を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４４（アンチコドン：gca、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－４５（アンチコドン：uca、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４６（アンチコドン：cca、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２２（UGCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２３（UGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２４（UGGのコドンを含む） 図１８は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２３を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４７（アンチコドン：gug、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３０（アンチコドン：uug、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３１（アンチコドン：cug、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２５（CACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図１９は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＡＣ，ＡＡＡ，ＡＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２４を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４８（アンチコドン：guu、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３３（アンチコドン：uuu、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３４（アンチコドン：cuu、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２６（AACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（AAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（AAGのコドンを含む） 図２０は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＡＣ，ＧＡＡ，ＧＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２５を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－４９（アンチコドン：guc、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３６（アンチコドン：uuc、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３７（アンチコドン：cuc、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２７（GACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（GAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（GAGのコドンを含む） 図２１は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＵＣ，ＵＵＡ，ＵＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２６を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５０（アンチコドン：gaa、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－３９（アンチコドン：uaa、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４０（アンチコドン：caa、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２８（UUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１７（UUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１８（UUGのコドンを含む） 図２２は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＧＣ，ＡＧＡ，ＡＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２７を参照）。　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５１（アンチコドン：gcu、アミノ酸：MeA3Pyr）　　　　化合物ＡＡｔＲ－４２（アンチコドン：ucu、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４３（アンチコドン：ccu、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２９（AGCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２０（AGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２１（AGGのコドンを含む） 図２３－１は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５７（アンチコドン：gcg、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５８（アンチコドン：ucg、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５９（アンチコドン：ccg、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－４２（CGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４３（CGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４４（CGGのコドンを含む） 図２３－２は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－２を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６０（アンチコドン：aug、アミノ酸：nBuGly）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６１（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６２（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－７（CAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－３は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－３を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６３（アンチコドン：aug、アミノ酸：nBuGly）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６４（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６５（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－７（CAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－４は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－４を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６６（アンチコドン：gug、アミノ酸：nBuGly）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６７（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－６８（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－２５（CACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－５は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－５を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６９（アンチコドン：gug、アミノ酸：nBuGly）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７０（アンチコドン：uug、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７１（アンチコドン：cug、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－２５（CACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－６は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－６を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－７２（アンチコドン：auc、アミノ酸：nBuGly）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７３（アンチコドン：uuc、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７４（アンチコドン：cuc、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１３（GAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（GAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（GAGのコドンを含む） 図２３－７は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－７を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－７５（アンチコドン：aug、アミノ酸：MeA3Pr）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７６（アンチコドン：uug、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７７（アンチコドン：cug、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－７（CAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－８は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－８を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－７８（アンチコドン：gug、アミノ酸：MeA3Pr）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７９（アンチコドン：uug、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８０（アンチコドン：cug、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－２５（CACのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（CAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（CAGのコドンを含む） 図２３－９は、実施例６～７に記載されるように、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２８－９を参照）。　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－８１（アンチコドン：auc、アミノ酸：MeA3Pr）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８２（アンチコドン：uuc、アミノ酸：StBuOH）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８３（アンチコドン：cuc、アミノ酸：MeSnPr）　　mRNA：ｍＲ－１３（GAUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（GAAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（GAGのコドンを含む） 図２４－１は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた各ペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２９－１を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５２（アンチコドン：uga、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３０（UCUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３１（UCCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３２（UCAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３３（UCGのコドンを含む） 図２４－２は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた［各ペプチドの翻訳量］に対する［目的のペプチドの翻訳量］の比をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２９－２を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５２（アンチコドン：uga、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３０（UCUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３１（UCCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３２（UCAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３３（UCGのコドンを含む） 図２５－１は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた各ペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３０－１を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５３（アンチコドン：ugu、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３４（ACUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３５（ACCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３６（ACAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３７（ACGのコドンを含む） 図２５－２は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた［各ペプチドの翻訳量］に対する［目的のペプチドの翻訳量］の比をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３０－２を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５３（アンチコドン：ugu、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３４（ACUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３５（ACCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３６（ACAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３７（ACGのコドンを含む） 図２６－１は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた各ペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３１－１を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５４（アンチコドン：uau、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む） 図２６－２は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた［各ペプチドの翻訳量］に対する［目的のペプチドの翻訳量］の比をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３１－２を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５４（アンチコドン：uau、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む） 図２７－１は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた各ペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３２－１を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５５（アンチコドン：uau、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む） 図２７－２は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた［各ペプチドの翻訳量］に対する［目的のペプチドの翻訳量］の比をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３２－２を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５５（アンチコドン：uau、アミノ酸：MeHph）　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む） 図２８－１は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた各ペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３３－１を参照）。　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５６（アンチコドン：uau、アミノ酸：Ile）　　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む） 図２８－２は、実施例６～７に記載されるように、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度が異なる条件下における目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量のそれぞれの変化を評価した結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行い、その結果得られた［各ペプチドの翻訳量］に対する［目的のペプチドの翻訳量］の比をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表３３－２を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　tRNA：化合物ＡＡｔＲ－５６（アンチコドン：uau、アミノ酸：Ile）　　　tRNA濃度：12.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6.4μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.6μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.8μM　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　mRNA：ｍＲ－３８（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３９（AUCのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４０（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－４１（AUGのコドンを含む）
Ｉ．定義
　本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。
　「コドン」とは、生体内の遺伝情報がタンパク質に翻訳される際の、各アミノ酸に対応する3つのヌクレオシドの組合せ（トリプレット）のことである。DNAの場合は、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびチミン（T）の４種類の塩基が用いられ、mRNAの場合は、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびウラシル（U）の４種類の塩基が用いられる。各コドンとアミノ酸の対応関係を示した表は遺伝暗号表あるいはコドン表と呼ばれ、終止コドンを除く61種類のコドンに、20種類のアミノ酸が割り当てられている（表１）。表１に記載の遺伝暗号表は、真核生物および原核生物（真正細菌および古細菌）におけるほとんどすべての生物で共通して使用されていることから、標準遺伝暗号表あるいは普遍遺伝暗号表とも呼ばれる。本開示においては、天然に存在する生物で使用されている遺伝暗号表を天然の遺伝暗号表と称し、人工的にリプログラミングされた（コドンとアミノ酸の対応関係が改変された）遺伝暗号表とは区別する。遺伝暗号表においては、通常、1文字目と2文字目が共通で3文字目のみが異なる4つのコドンが一つのボックスにまとめられており、これらをコドンボックスと呼ぶ。
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　本開示において、mRNAにおけるコドンは「M1M2M3」で表されることがある。ここで、M1、M2、およびM3はそれぞれコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドを表す。
　「アンチコドン」とは、mRNA上のコドンに対応する、tRNA上の3つの連続したヌクレオシドのことである。mRNAと同様に、アンチコドンには、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびウラシル（U）の４種類の塩基が用いられる。さらに、それらを修飾して得られる修飾塩基が用いられることもある。コドンがアンチコドンによって特異的に認識されることによって、mRNA上の遺伝情報が読み取られ、タンパク質に翻訳される。mRNA上の5’から3’方向のコドン配列とtRNA上の5’から3’方向のアンチコドン配列は相補的に結合するため、コドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドと、アンチコドンの3文字目、2文字目、および1文字目のヌクレオシドとの間でそれぞれ相補的な塩基対が形成される。
　本開示において、tRNAにおけるアンチコドンは「N1N2N3」で表されることがある。ここで、N1、N2、およびN3はそれぞれアンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドを表す。後述のtRNAナンバリング則に従うと、N1、N2、およびN3はそれぞれtRNAの34位、35位、および36位に番号付けされる。
　本開示においては、熱力学的に安定な塩基対を形成し得るような核酸の組合せを互いに「相補的」であるという。アデノシンとウリジン（A-U）、グアノシンとシチジン（G-C）といったワトソン－クリック型塩基対に加えて、グアノシンとウリジン（G-U）、イノシンとウリジン（I-U）、イノシンとアデノシン（I-A）、イノシンとシチジン（I-C）などの非ワトソン－クリック型塩基対を形成する核酸の組合せも、本開示における「相補的」な核酸の組合せに含まれる。特に、コドンの1文字目とアンチコドンの3文字目、コドンの2文字目とアンチコドンの2文字目の間にはワトソン－クリック型塩基対の形成のみが許容されるのに対し、コドンの3文字目とアンチコドンの1文字目の間には空間的なゆらぎ（wobble）が存在するため、上記のような非ワトソン－クリック型塩基対の形成も許容されると考えられている（ゆらぎ仮説）。
　「伝令RNA（messenger RNA; mRNA）」とは、タンパク質に翻訳され得る遺伝情報を持ったRNAのことである。遺伝情報はコドンとしてmRNA上にコードされており、それらが全20種類のアミノ酸にそれぞれ対応している。タンパク質の翻訳は開始コドンから始まり、終止コドンで終了する。真核生物における開始コドンは原則としてAUGであるが、原核生物（真正細菌および古細菌）ではAUGの他にGUGやUUGなども開始コドンとして使用されることがある。AUGはメチオニン（Met）をコードするコドンであり、真核生物および古細菌ではそのままメチオニンから翻訳が開始される。一方、真正細菌では、開始コドンのAUG のみN-ホルミルメチオニン（fMet）に対応しているため、ホルミルメチオニンから翻訳が開始される。終止コドンには、UAA（オーカー）・UAG（アンバー）・UGA（オパール）の3種がある。終止コドンが翻訳終結因子（release factor; RF）と呼ばれるタンパク質によって認識されると、それまでに合成されたペプチド鎖がtRNAから解離し、翻訳工程は終了する。
　「転移RNA（transfer RNA; tRNA）」とは、mRNA を鋳型にしたペプチド合成を仲介する 100塩基以下の短い RNA のことである。二次構造上は、３つのステムループ（Ｄアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム）と１つのステム（アクセプターステム）からなる、クローバー葉状の構造を有している。tRNAによっては、さらに１つの可変ループが含まれることがある。アンチコドンアームには、アンチコドンと呼ばれる３つの連続したヌクレオシドからなる領域が存在し、アンチコドンがmRNA上のコドンと塩基対を形成することによってコドンが認識される。一方、tRNAの3’末端には、シチジン－シチジン－アデノシンからなる核酸配列（CCA配列）が存在し、その末端のアデノシン残基にアミノ酸が付加される（具体的には、アデノシン残基のリボースの2位または3位のヒドロキシル基と、アミノ酸のカルボキシル基がエステル結合する）。アミノ酸が付加したtRNAはアミノアシルtRNAと呼ばれる。本開示においては、アミノアシルtRNAもtRNAの定義に含まれる。また、後述のように、tRNAのCCA配列から末端の２残基（CおよびA）を除去し、それをアミノアシルtRNAの合成に用いる方法が知られている。そのような3’末端のCA配列が除去されたtRNAも、本開示におけるtRNAの定義に含まれる。生体内において、tRNA へのアミノ酸の付加は、アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase; aaRSまたはARS）という酵素によって行われる。通常、アミノ酸ごとに1種類のアミノアシルtRNA合成酵素が存在していて、なおかつそれぞれのアミノアシルtRNA合成酵素が複数のtRNAの中から特定のtRNAのみを基質として特異的に認識することから、tRNAとアミノ酸との対応関係は厳密に制御されている。
　tRNAにおける各ヌクレオシドは、tRNAナンバリング則に従って番号付けがなされている（Sprinzl et al., Nucleic Acids Res (1998) 26: 148-153）。例えば、アンチコドンは34位～36位に、CCA配列は74～76位にそれぞれ番号付けされている。
　「開始tRNA（initiator tRNA）」とは、mRNAの翻訳の開始時に使用される特定のtRNAのことである。開始アミノ酸を結合した開始tRNAが、翻訳開始因子（initiation factor; IF）に触媒されてリボソームに導入され、mRNA上の開始コドンに結合することで、翻訳が始まる。開始コドンとして、一般的にはメチオニンのコドンであるAUGが用いられるため、開始tRNAはAUGに対応するアンチコドンを有しており、また、開始アミノ酸としてメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）を結合している。
　「伸長tRNA（elongator tRNA）」とは、翻訳工程におけるペプチド鎖の伸長反応において使用されるtRNAのことである。ペプチド合成においては、アミノ酸を結合した伸長tRNAが、GTP化された翻訳伸長因子（elongation factor; EF）EF-Tu/eEF-1によりリボソームに順次運ばれることによって、ペプチド鎖の伸長反応が進行する。
　本開示における「tRNAボディ（tRNA body）」とは、アンチコドン（34～36位）を除くtRNAの本体部分（核酸で構成された主要な構造部分）を指す。いくつかの態様において、本開示のtRNAボディは、tRNAの1～33位及び37～76位を指す。別の態様において、本開示のtRNAボディは、tRNAの1～33位及び37～74位を指す。
　「ライシジン（lysidine）」は修飾ヌクレオシドの一種で、2-リジルシチジン（2-lysylcytidine; k2CあるいはL）とも表記される。ライシジンは、真正細菌におけるイソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。tRNA Ile2は、CAUのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、tRNA Ile-ライシジン合成酵素（tRNA Ile-lysidine synthetase; TilS）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（C）がライシジン（k2C）に改変（変換）される。その結果、k2CAUのアンチコドンをもったtRNA Ile2が完成する（Muramatsu et al., J Biol Chem (1988) 263: 9261-9267、Suzuki et al., FEBS Lett (2010) 584: 272-277）。k2CAUのアンチコドンは、イソロイシンのコドンAUAのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがk2CAUに改変されることによって初めて、イソロイシルtRNA合成酵素によりtRNA Ile2が基質として認識され、tRNA Ile2のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。
　「アグマチジン（agmatidine）」は修飾ヌクレオシドの一種で、2-アグマチニルシチジン（2-agmatinylcytidine; agm2CあるいはAgm）とも表記される。アグマチジンは、古細菌におけるイソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。tRNA Ile2は、CAUのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、tRNA Ile-アグマチジン合成酵素（tRNA Ile-agmatidine synthetase; TiaS）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（C）がアグマチジン（agm2C）に改変（変換）される。その結果、agm2CAUのアンチコドンをもったtRNA Ile2が完成する（Ikeuchi et al., Nat Chem Biol (2010) 6(4): 277-282）。agm2CAUのアンチコドンは、イソロイシンのコドンAUAのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがagm2CAUに改変されることによって初めて、イソロイシルtRNA合成酵素によりtRNA Ile2が基質として認識され、tRNA Ile2のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。
　本開示において「クロスリード」とは、あるアミノアシルtRNAが、本来認識すべきコドン以外のコドンも認識することによって、目的以外のアミノ酸が余分に翻訳される現象を意味する。目的以外のアミノ酸が翻訳される程度は特に限定されないが、通常は、翻訳の直交性が十分に達成されていないと判断されるレベルのものを指す。
　本開示において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１～２０個の範囲であり、アルキルとしては、例えばＣ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ３アルキルなどが挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、１－メチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、２，２－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチルなどが挙げられる。
　本開示において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとしては、例えばＣ３－Ｃ１０シクロアルキルが挙げられ、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
　本開示において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖状または分枝鎖状のアルケニルが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。アルケニルとしては、例えばＣ２－Ｃ１０アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルケニルなどが挙げられ、具体的には、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本開示において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。アルキニルとしては、例えばＣ２－Ｃ１０アルキニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニルなどが挙げられ、具体的には、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本開示において「アリール」とは、１価の芳香族炭化水素環を意味する。アリールとしては、例えばＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられ、具体的には、フェニル、ナフチル（例えば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本開示において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中にヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（例えば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は例えば５－１０個である（５員－１０員ヘテロアリール）。環を構成する原子中に含まれるヘテロ原子の数は例えば１－５個である。ヘテロアリールとしては、具体的には、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本開示において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味する。アラルキルとしては、例えばＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキルが挙げられ、具体的には、ベンジルなどが挙げられる。
　本開示において「アルキレン」とは、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。直鎖アルキレンとしては、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレン、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－などが挙げられる。分岐アルキレンとしては、Ｃ２－Ｃ６分岐アルキレン、Ｃ４－Ｃ５分岐アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－などが挙げられる。
　本開示において「アルケニレン」は、前記「アルケニル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。二重結合および置換基（存在する場合）の配置によって、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖アルケニレンとしては、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルケニレン、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルケニレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－などが挙げられる。
　本開示において「アリーレン」とは、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば６－１０個である（Ｃ６－Ｃ１０アリーレン）。アリーレンとしては、具体的には、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
　本開示において「ヘテロアリーレン」とは、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば５－１０個である（５員～１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとしては、具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイル、チオフェンジイルなどが挙げられる。
　本開示における「翻訳系」とは、ペプチドを翻訳するための方法およびペプチドを翻訳するための組成物およびキットの両方を含む概念として定義される。翻訳系には、通常、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、及びATPやGTPなどのペプチドの翻訳反応に必要な因子が構成成分として含まれる。翻訳系の主な種類としては、生細胞を利用した翻訳系や、細胞抽出液を利用した翻訳系（無細胞翻訳系）がある。生細胞を利用した翻訳系としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物細胞などの生細胞に、所望のアミノアシルtRNAおよびmRNAをマイクロインジェクション法やリポフェクション法により導入してペプチド翻訳を行う系が知られている（Nowak et al., Science (1995) 268: 439-442）。無細胞翻訳系の例としては、大腸菌（Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690）、酵母（Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969）、小麦胚芽（Erickson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 38-50）、ウサギ網状赤血球（Jackson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 50-74）、HeLa細胞（Barton et al., Methods Enzymol (1996) 275: 35-57）、あるいは昆虫細胞（Swerdel et al., Comp Biochem Physiol B (1989) 93: 803-806）などからの抽出液を利用した翻訳系が知られている。このような翻訳系は、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。無細胞翻訳系には、ペプチド翻訳に必要な因子をそれぞれ単離・精製して、それらを再構成して構築された翻訳系（再構成型の無細胞翻訳系）も含まれる（Shimizu et al., Nat Biotech (2001) 19: 751-755）。再構成型の無細胞翻訳系には、通常、リボソーム、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えばRF1、RF2、RF3）、リボソーム再生因子（ribosome recycling factor; RRF）、エネルギー源としてのNTP類、エネルギー再生系、および翻訳に必要なその他の因子などが含まれ得る。DNAからの転写反応を併せて行う場合は、さらにRNAポリメラーゼなどが含まれ得る。無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は、当業者に周知の方法によって単離・精製することが可能であり、それらを用いて再構成型の無細胞翻訳系を適宜構築することができる。あるいは、ジーンフロンティア社のPUREfrex（登録商標）や、New England BioLabs社のPURExpress（登録商標）などの市販されている再構成型の無細胞翻訳系を利用することもできる。再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。
　アミノ酸・tRNA・アミノアシルtRNA合成酵素の特異的な組合せにより、アミノアシルtRNAが合成され、それがペプチドの翻訳に用いられる。上記の組合せの代わりに、アミノアシルtRNAをそのまま翻訳系の構成成分として用いることもできる。特に、非天然アミノ酸など、アミノアシルtRNA合成酵素でアミノアシル化することが困難なアミノ酸が翻訳に用いられる場合は、あらかじめ非天然アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを構成成分として用いることが望ましい。
　翻訳系にmRNAを加えることによって、その翻訳が開始される。mRNAには、通常、目的のペプチドをコードする配列が含まれており、さらに、翻訳反応の効率を上昇させるための配列（例えば、原核生物におけるシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno; SD）配列、真核生物におけるコザック（Kozac）配列など）が含まれていてもよい。あらかじめ転写されたmRNAを系に直接加えてもよいし、mRNAの代わりに、プロモーターを含む鋳型DNAとそれに適したRNAポリメラーゼ（例えばT7プロモーターとT7 RNAポリメラーゼなど）を系に加えることによって、mRNAが鋳型DNAから転写されるようにしてもよい。
　本明細書において、数値範囲を示す「～」とはその両端の値を含み、例えば、「A～B」は、A以上であり、かつB以下である数値範囲を意味する。
　本明細書において、「および/または」との用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「A、B、および/またはC」には、以下の７通りのバリエーションが含まれる；
(i) A、(ii) B、(iii) C、(iv) AおよびB、(v) AおよびC、(vi) BおよびC、(vii) A、B、およびC。
ＩＩ．翻訳系および翻訳系の製造方法
　一局面において、本開示は、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系を提供する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。本開示における翻訳系に含まれる2種類のtRNAのそれぞれは、互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されたアミノアシルtRNAであることができる。本開示におけるtRNAは、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。したがって本開示のtRNAを含む翻訳系を使用することにより、一つのコドンボックス（当該コドンボックスは、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンよりなる）から、少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。
　本開示におけるM1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンには、M1をアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択し、M2をアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択することによって特定することが可能な全ての組み合わせが含まれる。
　なお開示において「コドンを選択的に翻訳する」の表現は「コドンを読み分ける」、「クロスリードを低減する」と言い換えることもでき、これらは同一の意味に解釈され得る。
　一局面において、本開示は、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系を提供する。また一局面において、本開示は、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系を提供する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。本開示における翻訳系に含まれる3種類のtRNAのそれぞれは、互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されたアミノアシルtRNAであることができる。一局面において本開示におけるtRNAは、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。また一局面において本開示におけるtRNAは、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。したがって本開示のtRNAを含む翻訳系を使用することにより、一つのコドンボックス（当該コドンボックスは、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンよりなる）から、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。
　本開示におけるM1M2Uで表されるコドンおよびM1M2Cで表されるコドンには、M1をアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択し、M2をアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択することによって特定することが可能な全ての組み合わせが含まれる。
　本開示における翻訳系には複数の異なる種類のtRNAが含まれ、それらのtRNAから複数の異なる種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のtRNAを含む、コドンを選択的に翻訳するための組成物およびキットを提供する。別の局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のtRNAを含む翻訳系において核酸を翻訳する工程を含む、コドンを選択的に翻訳するための方法を提供する。特定の局面において、前記の複数の異なる種類のtRNAの中に、本開示のtRNAが含まれる。
　本開示において選択的に翻訳することが可能なコドンの組み合わせとして、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンの組み合わせ、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンの組み合わせ、ならびにM1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンの組み合わせが例示される。
　本開示における翻訳系には、一態様において、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含む核酸が含まれていてもよい。また本開示における翻訳系には、一態様において、（ｉ）M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含む核酸、または、（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含む核酸が含まれていてもよい。また一態様において、本開示における翻訳系には、M1M2Aで表されるコドン、M1M2Gで表されるコドン、M1M2Uで表されるコドン、およびM1M2Cで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含む核酸が含まれていてもよい。一態様において、本開示における翻訳系は、このような核酸を１種または複数種含むことができる。
　一局面において、本開示は、翻訳系の製造方法に関する。本開示における翻訳系の製造方法は、アミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳系外でおよび／または人工的にtRNAに結合させる工程を含む。一局面において、本開示における翻訳系の製造方法は、アミノ酸またはアミノ酸類縁体を結合されたtRNAと本開示における翻訳系とを混合する工程をさらに含む。
　翻訳系には、通常、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、及びATPやGTPなどのペプチドの翻訳反応に必要な因子が構成成分として含まれる。特に、再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。翻訳系中におけるアミノアシルtRNA（アミノ酸またはアミノ酸類縁体が付加したtRNA）の合成は、翻訳系内で行われてもよいし、翻訳系外で行われてもよい。また、翻訳系内での合成と翻訳系外での合成が併用されてもよい。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、翻訳系外でアミノ酸またはアミノ酸類縁体に結合される。いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、翻訳系外でアミノ酸またはアミノ酸類縁体に結合される。いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、翻訳系外でアミノ酸またはアミノ酸類縁体に結合される。さらなる態様において、翻訳系中に含まれる上記以外のtRNAは、翻訳系内でアミノ酸またはアミノ酸類縁体に結合されてもよいし、翻訳系外でアミノ酸またはアミノ酸類縁体に結合されてもよい。
　本開示において、tRNAはアミノ酸またはアミノ酸類縁体が人工的に連結されたものであることが好ましい。tRNAは、任意の生物（例えば大腸菌など）に由来する天然tRNAであってもよいし、または天然tRNAとは異なる配列を有する、人工的に合成した非天然tRNAであってもよい。あるいは、天然tRNAと同じ配列を有する、人工的に合成したtRNAであってもよい。また本開示におけるtRNAは、「in vitroで転写合成されたtRNA」であってもよい。
　いくつかの態様において、本開示におけるtRNAが天然tRNAとは異なる配列を有する改変されたtRNAである場合、当該改変されたtRNAはtRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドに対して、以下の群から選択される少なくとも１種類以上の改変を含むことができる：(i) 付加（既存のtRNAに任意の新たなヌクレオシドを付け足すこと）、(ii) 欠失（既存のtRNAから任意のヌクレオシドを削除すること）、(iii) 置換（既存のtRNAにおける任意のヌクレオシドを別の任意のヌクレオシドに置き換えること）、(iv) 挿入（既存のtRNAにおける任意の２つのヌクレオシドの間に新たな任意のヌクレオシドを追加すること）、(v) 修飾（既存のtRNAにおける任意のヌクレオシドの構造の一部（例えば塩基部分や糖部分）を別の構造に変化させること）。改変はtRNAのどの構造（例えばＤアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム、アクセプターステム、可変ループなど）に対して行われてもよい。いくつかの態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンアームに含まれるアンチコドンに対して行われる。さらなる態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドのうちの少なくとも１つに対して行われる。tRNAにおけるヌクレオシドのナンバリング則に従うと、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドは、それぞれtRNAの34位、35位、および36位に該当する。本明細書においては、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドをそれぞれN1、N2、およびN3と表現することがある。本開示のtRNAにおいて改変されるヌクレオシドの数は1以上の任意の数であることができる。いくつかの態様において、本開示のtRNAにおいて改変されるヌクレオシドの数は、20以下、15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、あるいは1である。別の態様において、改変後のtRNAの核酸配列は、改変前の核酸配列と比べて、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、あるいは99％以上同一である。本開示において、ある塩基配列に対する「パーセント (％) 配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照塩基配列中の塩基と同一である候補配列中の塩基の、百分率比として定義される。塩基配列のパーセント配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
　いくつかの態様において、本開示におけるtRNAの改変とは、tRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドを置換することを意味する。ヌクレオシドの種類に関して、置換された後のヌクレオシドは、天然tRNA中に存在するいずれかのヌクレオシドであってもよいし、天然tRNA中には存在しない任意のヌクレオシド（人工的に合成されたヌクレオシド）であってもよい。天然tRNA中には、4つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンの他に、それらを修飾して得られる改変体（修飾ヌクレオシド）も含まれている。いくつかの態様において、天然tRNA中に存在するヌクレオシドは、以下のヌクレオシドの中から選択され得る：アデノシン（adenosine; A）、シチジン（cytidine; C）、グアノシン（guanosine; G）、ウリジン（uridine; U）、1-メチルアデノシン（1-methyladenosine; m1A）、2-メチルアデノシン（2-methyladenisine; m2A）、N6-イソペンテニルアデノシン（N6-isopentenyladenosine; i6A）、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン（2-methylthio-N6-isopentenyladenosine; ms2i6A）、N6-メチルアデノシン（N6-methyladenosine; m6A）、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（N6-threonylcarbamoyladenosine; t6A）、N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（N6-methyl-N6-threonylcarbamoyladenosine; m6t6A）、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine; ms2t6A）、2’-O-メチルアデノシン（2’-O-methyladenosine; Am）、イノシン（inosine; I）、1-メチルイノシン（1-methylinosine; m1I）、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸塩)（2’-O-ribosyladenosine (phosphate); Ar(p)）、N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン（N6-(cis-hydroxyisopentenyl)adenosine; io6A）、2-チオシチジン（2-thiocytidine; s2C）、2’-O-メチルシチジン（2’-O-methylcytidine; Cm）、N4-アセチルシチジン（N4-acetylcytidine; ac4C）、5-メチルシチジン（5-methylcytidine; m5C）、3-メチルシチジン（3-methylcytidine; m3C）、ライシジン（lysidine; k2C）、5-ホルミルシチジン（5-formylcytidine; f5C）、2’-O-メチル-5-ホルミルシチジン（2’-O-methyl-5-formylcytidine; f5Cm）、アグマチジン（agmatidine; agm2C）、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸塩)（2’-O-ribosylguanosine (phosphate); Gr(p)）、1-メチルグアノシン（1-methylguanosine; m1G）、N2-メチルグアノシン（N2-methylguanosine; m2G）、2’-O-メチルグアノシン（2’-O-methylguanosine; Gm）、N2, N2-ジメチルグアノシン（N2, N2-dimethylguanosine; m22G）、N2, N2, 2’-O-トリメチルグアノシン（N2, N2, 2’-O-trimethylguanosine; m22Gm）、7-メチルグアノシン（7-methylguanosine; m7G）、アーキオシン（archaeosine; G*）、キューオシン（queuosine; Q）、マンノシルキューオシン（mannosylqueuosine; manQ）、ガラクトシルキューオシン（galactosylqueuosine; galQ）、ワイブトシン（wybutosine; yW）、ペルオキシワイブトシン（peroxywybutosine; o2yW）、5-メチルアミノメチルウリジン（5-methylaminomethyluridine; mnm5U）、2-チオウリジン（2-thiouridine; s2U）、2’-O-メチルウリジン（2’-O-methyluridine; Um）、4-チオウリジン（4-thiouridine; s4U）、5-カルバモイルメチルウリジン（5-carbamoylmethyluridine; ncm5U）、5-メトキシカルボニルメチルウリジン（5-methoxycarbonylmethyluridine; mcm5U）、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-methylaminomethyl-2-thiouridine; mnm5s2U）、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン（5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine; mcm5s2U）、ウリジン5-オキシ酢酸（uridine 5-oxyacetic acid; cmo5U）、5-メトキシウリジン（5-methoxyuridine; mo5U）、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン（5-carboxymethylaminomethyluridine; cmnm5U）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine; cmnm5s2U）、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン（3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine; acp3U）、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル（5-(carboxyhydroxymethyl)uridinemethyl ester; mchm5U）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2’-O-methyluridine; cmnm5Um）、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン（5-carbamoylmethyl-2’-O-methyluridine; ncm5Um）、ジヒドロウリジン（dihydrouridine; D）、シュードウリジン（pseudouridine; Ψ）、1-メチルシュードウリジン（1-methylpseudouridine; m1Ψ）、2’-O-メチルシュードウリジン（2’-O-methylpseudouridine; Ψm）、5-メチルウリジン（5-methyluridine; m5U）、5-メチル-2-チオウリジン（5-methyl-2-thiouridine; m5s2U）、5, 2’-O-ジメチルウリジン（5, 2’-O-dimethyluridine; m5Um）。
　本開示において改変されるtRNAは、任意の核酸配列を有するtRNAの中から適宜選択することができる。いくつかの態様において、tRNAはtRNA Ala、tRNA Arg、tRNA Asn、tRNA Asp、tRNA Cys、tRNA Gln、tRNA Glu、tRNA Gly、tRNA His、tRNA Ile、tRNA Leu、tRNA Lys、tRNA Met、tRNA Phe、tRNA Pro、tRNA Ser、tRNA Thr、tRNA Trp、tRNA Tyr、tRNA Valのいずれかである。上記の20種類のtRNA以外にも、tRNA fMetやtRNA Sec（セレノシステイン）、tRNA Pyl（ピロリシン）、tRNA AsnE2なども用い得る。特定の態様において、tRNAはtRNA Glu、tRNA Asp、tRNA AsnE2、tRNA(fMet)、tRNA(Ile)のいずれかである。tRNAの本体部分（核酸で構成された主要な構造部分）を指してtRNA bodyとの用語が用いられることもある。
　なお、本開示において、tRNAは以下のように表記されることがある。
・「tRNA Xxx」あるいは「tRNA(Xxx)」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNA（全長）を示す（例えばtRNA GluやtRNA(Glu)など）。
・「tRNA(Xxx)nnn」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNAであって、アンチコドン配列がnnnであるtRNA（全長）を示す（例えばtRNA(Glu)ugaやtRNA(Glu)Lgaなど）。
・「tRNA(Xxx)nnn-CA」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNAであって、アンチコドン配列がnnnであるtRNA（3’末端のCA配列が除去されたもの）を示す（例えばtRNA(Glu)uga-CAやtRNA(Glu)Lga-CAなど）。
　いくつかの態様において、本開示のtRNAは、開始tRNAまたは伸長tRNAである。開始tRNAまたは伸長tRNAを改変することによってtRNAを作製してもよいし、改変により作製されたtRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAとしての機能を有していてもよい。あるtRNAが開始tRNAとしての機能を有しているか否かは、当該tRNAを翻訳系で用いた場合に、(i) IF2を介してリボソームに導入され、なおかつ(ii) 当該tRNAに結合しているアミノ酸を開始アミノ酸として用いて、ペプチド翻訳を開始させることができるか否かによって判断することができる。また、あるtRNAが伸長tRNAとしての機能を有しているか否かは、当該tRNAを翻訳系で用いた場合に、(i) EF-Tuを介してリボソームに導入され、なおかつ(ii) 当該tRNAに結合しているアミノ酸をペプチド鎖に取り込ませて、ペプチド鎖を伸長させることができるか否かによって判断することができる。
　いくつかの態様において、本開示のtRNAは、原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAである。原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAを改変することによって変異tRNAを作製してもよいし、改変により作製されたtRNAが、原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAと最も高い核酸配列同一性を有していてもよい。真核生物はさらに動物、植物、菌類および原生生物に分類される。本開示のtRNAは、例えばヒト由来のtRNAであってもよい。原核生物は、さらに真正細菌と古細菌に分類される。真正細菌としては、例えば大腸菌、枯草菌、乳酸菌、またはDesulfitobacterium hafnienseなどを挙げることができる。古細菌としては、例えば高度好塩菌、好熱菌、またはメタン菌（例えばMethanosarcina mazei, Methanosarcina barkeri, Methanocaldococcus jannaschii）などを挙げることができる。本開示のtRNAは、例えば大腸菌やDesulfitobacterium hafniense、Methanosarcina mazei由来のtRNAであってもよい。
　いくつかの態様において、本開示におけるtRNAは、アンチコドン、例えばその1文字目(N1)にライシジン(k2C)、ライシジン誘導体、アグマチジン(agm2C)、またはアグマチジン誘導体のいずれかを有さないものであってもよい。特定の態様において、本開示におけるtRNAは、アンチコドン、例えば、その1文字目(N1)にライシジン(k2C)、ライシジン誘導体、アグマチジン(agm2C)、またはアグマチジン誘導体のいずれをも有さないものであってよい。
　tRNAは、例えば、所望のtRNA遺伝子をコードするDNAを用意し、その上流にT7、T3、あるいはSP6などの適切なプロモーターを配置して、当該DNAを鋳型に各プロモーターに適応したRNAポリメラーゼを用いて転写反応を行うことによって合成することができる。また、tRNAは生物学的材料からの精製によっても調製することができる。例えば、細胞などのtRNAを含む材料から抽出液を調製して、そこにtRNAの核酸配列に相補的な配列を含むプローブを添加することによってtRNAを回収することができる。この際、所望のtRNAを発現可能な発現ベクターを用意して、当該発現ベクターで形質転換した細胞を材料に調製を行うこともできる。in vitroの転写によって合成されたtRNAには、通常、4つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンのみが含まれている。一方、細胞内で合成されたtRNAには、それらを修飾して得られた修飾ヌクレオシドなども含まれていることがある。あるいは、転写によって合成された断片もしくは、後述の実施例に記載のように、化学合成された断片等を酵素反応によって連結する手法によってもtRNAを調製することができる。
　アミノアシルtRNAも化学的および／または生物学的な合成法によって調製することができる。例えば、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いて、tRNAにアミノ酸を結合させることによってアミノアシルtRNAを合成することができる。アミノ酸はARSの基質となり得るものであれば、天然アミノ酸であっても、非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、天然アミノ酸をtRNAに結合させた後に、アミノ酸に化学的な修飾を加えてもよい。また、ARSにアミノ酸変異を導入することによって、非天然アミノ酸に対する作用が高められた例も多数報告されており（例えばWO2006/135096、WO2007/061136、WO2007/103307、WO2008/001947、WO2010/141851、WO2015/120287などを参照）、そのような変異ARSを用いて、tRNAにアミノ酸を結合させてもよい。ARSを用いる方法以外にも、例えば、tRNAの3’末端からCA配列を除去し、そこにアミノアシル化されたpdCpA（デオキシシチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）をRNAリガーゼを用いて結合させることによってアミノアシルtRNAを合成することができる（pdCpA法；Hecht et al., J Biol Chem (1978) 253: 4517-4520）。pdCpAの代わりにpCpA（シチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）を用いる方法も知られている（pCpA法；Wang et al., ACS Chem Biol (2015) 10: 2187-2192）。すなわち、pCpA-アミノ酸と3’末端のCA欠損tRNAをRNAリガーゼで結合させてアミノアシル化tRNAを調製できる。また、あらかじめエステル化により活性化した非天然型アミノ酸を人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いてtRNAに結合させることによってもアミノアシルtRNAを合成することができる（WO2007/066627、WO2012/026566、H. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 655-662； H. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 1077-1084； H. Murakami et al., Nature Methods 3, 2006, 357-359； N. Niwa et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 2009, 3892-3894）。フレキシザイムは、tRNAにアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結することのできる人工RNA触媒である。本開示におけるフレキシザイムには、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等も含まれる。
　いくつかの態様において、本開示のtRNAにはアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している。アミノ酸またはアミノ酸類縁体は、通常、tRNAの3’末端に、より具体的には、3’末端のCCA配列のアデノシン残基に結合している。tRNAに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体の具体的な種類は、以下に記載のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の中からそれぞれ適宜選択することができる。
　本開示におけるアミノ酸には、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸などが含まれる。立体構造としては、L型アミノ酸、D型アミノ酸のいずれも含まれる。また、本開示におけるアミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。特定の態様において、天然アミノ酸は、以下の20種類のα－アミノ酸：グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、ヒスチジン（His）、グルタミン酸（Glu）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびプロリン（Pro）からなる。あるいは、上述の20種類のアミノ酸から、任意の1種類以上のアミノ酸を除いたものを、本開示における天然アミノ酸としてもよい。一態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンを除く19種類のアミノ酸からなる。一態様において、天然アミノ酸は、メチオニンを除く19種類のアミノ酸からなる。さらなる態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンを除く18種類のアミノ酸からなる。天然アミノ酸は通常、L型アミノ酸である。
　本開示において、非天然アミノ酸とは、上記の20種類のα－アミノ酸からなる天然アミノ酸を除く全てのアミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例として、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、天然アミノ酸とは側鎖が異なるα－アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、主鎖のアミノ基が置換基を有するアミノ酸（Ｎ置換アミノ酸）などを挙げることができる。非天然アミノ酸の側鎖は、特に限定されないが、水素原子の他に、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどを有していてもよい。また、α，α－二置換アミノ酸の場合、２つの側鎖が環を形成していてもよい。さらに、これらの側鎖は、１つ以上の置換基を有していてもよい。特定の態様において、置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本開示において「ハロゲンを置換基に有するＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アルキルにおける少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子で置換された「Ｃ１－Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタフルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチルなどを含む。また、例えば「置換基を有するＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アリールおよび／またはアルキルにおける少なくとも一つの水素原子が置換基により置換された「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」を意味する。さらに、「置換基を２つ以上有している」とは、ある官能基（例えばＳ原子を含む官能基）を置換基として有し、さらにその官能基が別の置換基（例えばアミノやハロゲンなどの置換基）を有していることも含む。非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。
　非天然アミノ酸の主鎖のアミノ基は、非置換のアミノ基（ＮＨ２基）でもよく、置換されたアミノ基（ＮＨＲ基）であってもよい。ここで、Ｒは、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示す。また、プロリンのように主鎖のアミノ基のＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。アミノ基のアルキル置換の例としては、Ｎ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化などが、アラルキル置換の例としては、Ｎ－ベンジル化などが挙げられる。Ｎ－メチルアミノ酸の具体的な例としては、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸などを挙げることができる。
　ハロゲン原子を含む置換基の例としては、フルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）、ヨード（－Ｉ）などが挙げられる。
　Ｏ原子を含む置換基の例としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）などが挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
　カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。さらに、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。さらに、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子のうちの少なくとも１つは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。２つのＨ原子がともに置換されている場合は、それぞれ独立して置換基を選択してもよく、また、これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。
　Ｓ原子を含む置換基の例としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）などが挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどが挙げられる。
　スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
　スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子を含む置換基の例としては、アジド（－Ｎ３）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）などが挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））におけるＮ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。３級アミノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなどが挙げられる。これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。置換アミジノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の４つの置換基Ｒ、Ｒ'、Ｒ''、およびＲ'''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
　Ｂ原子を含む置換基の例としては、ボリル（－ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。Ｂ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ'は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
　いくつかの態様において、本開示におけるアミノ酸として、nBuG（2-(butylamino)acetic acid）、Pic2（(2S)-piperidine-2-carboxylic acid）、dA（(2R)-2-aminopropanoic acid）、MeA3Pyr（(2S)-2-(methylamino)-3-(3-pyridyl)propanoic acid）、StBuOH（(2S)-3-(2-hydroxy-2-methyl-propoxy)-2-(methylamino)propanoic acid）、MeSnPr（(2S)-2-(methylamino)-3-propoxy-propanoic acid）、SPh2Cl（(2S)-2-amino-3-(2-chlorophenoxy)propanoic acid）、MeHph（(2S)-2-(methylamino)-4-phenyl-butanoic acid）、およびIleなどを例示することができる。
　本開示におけるアミノ酸類縁体の例として、例えばヒドロキシカルボン酸（ヒドロキシ酸）を挙げることができる。ヒドロキシカルボン酸には、α－ヒドロキシカルボン酸、β－ヒドロキシカルボン酸、γ－ヒドロキシカルボン酸などが含まれる。ヒドロキシカルボン酸におけるα位の炭素には、アミノ酸と同様に、水素原子以外の側鎖が結合していてもよい。立体構造としては、L型およびD型のいずれも含まれ得る。側鎖の構造は、上述の天然アミノ酸または非天然アミノ酸の側鎖と同様に定義することができる。ヒドロキシカルボン酸の例として、ヒドロキシ酢酸、乳酸、フェニル乳酸などを挙げることができる。
　本開示におけるアミノ酸は、翻訳可能なアミノ酸であってもよく、アミノ酸類縁体は、翻訳可能なアミノ酸類縁体であってもよい。本明細書において「翻訳可能な」アミノ酸またはアミノ酸類縁体（まとめてアミノ酸等と呼ぶことがある）とは、翻訳合成により（例えば、本開示に記載の翻訳系を用いて）ペプチドに組み込むことが可能なアミノ酸等を意味する。あるアミノ酸等が翻訳可能か否かは、当該アミノ酸等を結合させたtRNAを用いた翻訳合成実験により確認することができる。翻訳合成実験には再構成の無細胞翻訳系を用いてもよい（例えば、WO2013100132を参照のこと）。
　本開示における非天然アミノ酸やアミノ酸類縁体は、従来公知の化学的な合成法や、後述の実施例に記載の合成法、それらに準ずる合成法によって調製することができる。
　いくつかの態様において、本開示のtRNAは、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを読み分けて、これらのコドンのそれぞれについて異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。いくつかの態様において、本開示のtRNAは、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを読み分けて、これらのコドンのそれぞれについて異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。いくつかの態様において、本開示のtRNAは、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを読み分けて、これらのコドンのそれぞれについて異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。ここで、コドンの1文字目のヌクレオシド（M1）および2文字目のヌクレオシド（M2）は、それぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。別の態様において、本開示のtRNAは、M1M2Aで表される特定のコドン、M1M2Gで表される特定のコドンに相補的なアンチコドンを有する。また別の態様において、本開示のtRNAは、M1M2Uで表される特定のコドン、M1M2Aで表される特定のコドン、M1M2Gで表される特定のコドンに相補的なアンチコドンを有する。また別の態様において、本開示のtRNAは、M1M2Cで表される特定のコドン、M1M2Aで表される特定のコドン、M1M2Gで表される特定のコドンに相補的なアンチコドンを有する。さらなる態様において、tRNAにおけるアンチコドンの3文字目のヌクレオシド（N3）および2文字目のヌクレオシド（N2）は、M1およびM2とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択することができ、N2およびN3は、それぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され得る。具体的には、M2（またはM1）がアデノシンのとき、N2（またはN3）はウリジンである。M2（またはM1）がグアノシンのとき、N2（またはN3）はシチジンである。M2（またはM1）がシチジンのとき、N2（またはN3）はグアノシンである。M2（またはM1）がウリジンのとき、N2（またはN3）はアデノシンである。
　本開示の文脈において、「あるtRNAが特定のコドンを翻訳可能である」との態様は、「あるtRNAが特定のコドンに相補的なアンチコドンを有している」との態様を本質的に内包するものであり、当該tRNA上のアンチコドンの配列について言及する限りにおいて、これらの表現は置き換えが可能である。
　本開示における翻訳系を構成するtRNAが翻訳可能なコドンの1文字目のヌクレオシド（M1）および2文字目のヌクレオシド（M2）は、遺伝暗号表における特定のコドンボックスを構成するコドンの1文字目のヌクレオシド（M1）および2文字目のヌクレオシド（M2）からそれぞれ選択することができる。特定の態様において、遺伝暗号表は標準遺伝暗号表である。別の態様において、遺伝暗号表は天然の遺伝暗号表である。
　別の態様において、本開示におけるM1およびM2は、天然の遺伝暗号表においてM1M2Aで表されるコドンに終止コドンが割り当てられていて、かつM1M2Gで表されるコドンにアミノ酸が割り当てられているコドンボックスから選択することができる。別の態様において、本開示におけるM1およびM2は、天然の遺伝暗号表においてM1M2Aで表されるコドンとM1M2Gで表されるコドンにともに終止コドンが割り当てられているコドンボックスから選択することができる。
　いくつかの態様において、遺伝暗号表が天然の遺伝暗号表と同一である翻訳系は、本開示における翻訳系から除かれる。いくつかの態様において、遺伝暗号表が表１に記載された遺伝暗号表と同一である翻訳系は、本開示における翻訳系から除かれる。
　一態様において、M1およびM2は、3文字目がAであるコドンとGであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがUUM3で表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（UUA）とGであるコドン（UUG）がともに同じアミノ酸（Leu）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　一態様において、M1およびM2は、3文字目がUであるコドンとAであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがAUM3で表されるコドンボックスにおいては、3文字目がUであるコドン（AUU）とAであるコドン（AUA）がともに同じアミノ酸（Ile）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　一態様において、M1およびM2は、3文字目がAであるコドンとGであるコドンが互いに異なるアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがAUM3で表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（AUA）とGであるコドン（AUG）が互いに異なるアミノ酸（IleとMet）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　一態様において、M1およびM2は、3文字目がAであるコドンおよび／またはGであるコドンが終止コドンであるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがUGM3で表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（UGA）が終止コドン（オパール）であるので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがUUM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがUAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがUGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがCAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがCGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがAUM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがACM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがAAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがAGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　さらなる態様において、M1およびM2は、コドンがGAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンのM1およびM2からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM1およびM2として選択することができる。
　本開示のtRNAにおけるアンチコドンの3文字目のヌクレオシド（N3）および2文字目のヌクレオシド（N2）は、M1およびM2とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがUUM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてAを、N2としてAをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがUAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてAを、N2としてUをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがUGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてAを、N2としてCをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがCAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてGを、N2としてUをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがCGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてGを、N2としてCをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがAUM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてUを、N2としてAをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがACM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（C）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてUを、N2としてGをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがAAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてUを、N2としてUをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがAGM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてUを、N2としてCをそれぞれ選択することができる。
　一態様において、N3およびN2は、コドンがGAM3で表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N3としてCを、N2としてUをそれぞれ選択することができる。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、他のコドンに比べて、M1M2Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M1M2Aで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM1M2U、M1M2C、または M1M2Gで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、M1M2U、M1M2C、および M1M2Gで表されるいずれのコドンと比べても、M1M2Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
　本開示の一態様において、あるtRNAが、M1M2Aのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM1M2Aのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、あるtRNAがCUAで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　ある特定のコドン（例えばM1M2A）が翻訳される量と、それ以外のコドン（例えばM1M2G）が翻訳される量とを比較する際には、例えば、あるペプチドをコードするmRNAであって、M1M2Aのコドンが含まれているmRNAと、M1M2AのコドンがM1M2Gのコドンに置き換えられている以外は全て前記mRNAと同じ核酸配列を有する別のmRNAを用意して、同じ条件下でそれらの２つのmRNAを翻訳し、その結果得られた２つのペプチドの合成量を比較することによって行うことができる。
　別の態様において、M1M2Aで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M1M2Aで表されるコドンとは異なるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、例えばM1M2U、M1M2C、またはM1M2Gのいずれかのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAであることができる。特定の態様において、M1M2Aで表されるコドンは、M1M2Uのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Cのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。
　本開示の一態様において、M1M2Aで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM1M2Aのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM1M2Aのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUAで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕が〔CUGのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（例えばCAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　本開示の翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、他のコドンに比べて、M1M2Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M1M2Aで表されるコドンが、他のtRNAよりも、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。天然に存在する生物の翻訳系においては、本来、コドンとアミノ酸との間に厳密な対応関係が確立されているため、直交性のないtRNAがそこに加わることによって、その対応関係が崩れ、翻訳系の機能に致命的な影響が出るおそれがある。よって、本開示の翻訳系において、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
　一態様において、本開示における翻訳系は、(a) M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および(b) M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAの少なくとも2つのtRNAを含む。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAおよびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、アンチコドン以外の核酸配列がともに同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら2つのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、他のコドンに比べて、M1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M1M2Gで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM1M2U、M1M2C、または M1M2Aで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、M1M2U、M1M2C、および M1M2Aで表されるいずれのコドンと比べても、M1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
　本開示の一態様において、あるtRNAが、M1M2Gのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM1M2Gのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、あるtRNAがCUGで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　別の態様において、M1M2Gで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M1M2Gで表されるコドンとは異なるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、例えばM1M2U、M1M2C、またはM1M2Aのいずれかのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAであることができる。特定の態様において、M1M2Gで表されるコドンは、M1M2Uのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Cのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Aのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。
　本開示の一態様において、M1M2Gで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM1M2Gのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM1M2Gのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUGで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕が〔CUAのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（例えばUAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUGのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　本開示の翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、他のコドンに比べて、M1M2Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M1M2Gで表されるコドンが、他のtRNAよりも、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
　さらなる態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-A”とも表記する）と、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-G”とも表記する）とは、アミノ酸の種類が互いに異なる。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAとM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、M1M2Aのコドンとアミノ酸-A、およびM1M2Gのコドンとアミノ酸-Gはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する(i) M1M2Aおよび(ii) M1M2Gの2つのコドンから、2種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。
　一態様において、本開示における翻訳系は、(a) M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、(b) M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および(c) M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAの少なくとも3つのtRNAを含む。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、アンチコドン以外の核酸配列が全て同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら3つのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、他のコドンに比べて、M1M2Uで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M1M2Uで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM1M2Aまたは M1M2Gで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、M1M2Aおよび M1M2Gで表されるいずれのコドンと比べても、M1M2Uで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
　本開示の一態様において、あるtRNAが、M1M2Uのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM1M2Uのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、あるtRNAがCUUで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUUのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　別の態様において、M1M2Uで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M1M2Uで表されるコドンとは異なるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、例えばM1M2AまたはM1M2Gのいずれかのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAであることができる。特定の態様において、M1M2Uで表されるコドンは、M1M2Aのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAおよびM1M2Gのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。
　本開示の一態様において、M1M2Uで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM1M2Uのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM1M2Uのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUUで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUUのコドンの翻訳量〕が〔CUAのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（例えばUAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUUのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　本開示の翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、他のコドンに比べて、M1M2Uで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M1M2Uで表されるコドンが、他のtRNAよりも、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
　さらなる態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-A”）、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-G”）、およびM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-U”とも表記する）は、アミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、M1M2Aのコドンとアミノ酸-A、M1M2Gのコドンとアミノ酸-G、およびM1M2Uのコドンとアミノ酸-Uはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する(i) M1M2A、(ii) M1M2G、および(iii) M1M2Uの3つのコドンから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。あるいは、本開示の翻訳系においては、M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。
　一態様において、本開示における翻訳系は、(a) M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、(b) M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および(c) M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAの少なくとも3つのtRNAを含む。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、アンチコドン以外の核酸配列が全て同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら3つのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、他のコドンに比べて、M1M2Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M1M2Cで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM1M2Aまたは M1M2Gで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAは、M1M2Aおよび M1M2Gで表されるいずれのコドンと比べても、M1M2Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
　本開示の一態様において、あるtRNAが、M1M2Cのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM1M2Cのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、あるtRNAがCUCで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUCのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　別の態様において、M1M2Cで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M1M2Cで表されるコドンとは異なるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、例えばM1M2AまたはM1M2Gのいずれかのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAであることができる。特定の態様において、M1M2Cで表されるコドンは、M1M2Aのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAおよびM1M2Gのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。
　本開示の一態様において、M1M2Cで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM1M2Cのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM1M2Cのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUCで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUCのコドンの翻訳量〕が〔CUAのコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（例えばUAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUCのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。
　本開示の翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、他のコドンに比べて、M1M2Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M1M2Cで表されるコドンが、他のtRNAよりも、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
　さらなる態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-A”）、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-G”）、およびM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-C”とも表記する）は、アミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、M1M2Aのコドンとアミノ酸-A、M1M2Gのコドンとアミノ酸-G、およびM1M2Cのコドンとアミノ酸-Cはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する(i) M1M2A、(ii) M1M2G、および(iii) M1M2Cの3つのコドンから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。あるいは、本開示の翻訳系においては、M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。
　いくつかの態様において、本開示におけるM1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAのうち、少なくとも一つに非天然アミノ酸が結合していてもよい。
　いくつかの態様において、遺伝暗号表における少なくとも１つのコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。さらなる態様において、遺伝暗号表における複数のコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。複数のコドンボックスとしては、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個のコドンボックスであることができる。それぞれのtRNAがどのコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるかは、当該tRNAが有するアンチコドンの2文字目のヌクレオシド（N2）および3文字目のヌクレオシド（N3）によって決定される。異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるtRNAどうしであれば、互いに異なるN2およびN3を有している。また、異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるtRNAどうしは、アンチコドン以外の核酸配列が同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これらのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
　特定の態様において、遺伝暗号表における以下の(i)～(x)から選択される少なくとも１つのコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。さらなる態様において、遺伝暗号表における以下の(i)～(x)から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。
（i）コドンがUUM3で表されるコドンボックス、
（ii）コドンがUAM3で表されるコドンボックス、
（iii）コドンがUGM3で表されるコドンボックス、
（iv）コドンがCAM3で表されるコドンボックス、
（v）コドンがCGM3で表されるコドンボックス、
（vi）コドンがAUM3で表されるコドンボックス、
（vii）コドンがACM3で表されるコドンボックス、
（viii）コドンがAAM3で表されるコドンボックス、
（ix）コドンがAGM3で表されるコドンボックス、
（x）コドンがGAM3で表されるコドンボックス。
　特定の態様において、遺伝暗号表における以下の(i)～(vii)から選択される少なくとも１つのコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。さらなる態様において、遺伝暗号表における以下の(i)～(vii)から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、または7個のコドンボックスを構成するコドンに、本開示のtRNAが割り当てられていてもよい。
（i）コドンがUUM3で表されるコドンボックス、
（ii）コドンがUGM3で表されるコドンボックス、
（iii）コドンがCAM3で表されるコドンボックス、
（iv）コドンがCGM3で表されるコドンボックス、
（v）コドンがAAM3で表されるコドンボックス、
（vi）コドンがAGM3で表されるコドンボックス、
（vii）コドンがGAM3で表されるコドンボックス。
　いくつかの態様において、本開示のtRNAが割り当てられなかった残りのコドンボックスを構成するコドンに対しては、任意のtRNAを割り当てることができる。望ましくは、残りのコドンボックスを構成するコドンに対して、各コドンを何らかのアミノ酸に翻訳可能な任意のtRNAのセットが割り当てられる。そのようなtRNAのセットは、天然tRNAに由来するものであってもよいし、人工的に合成されたtRNAであってもよい。
　いくつかの態様において、本開示の翻訳系から、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、または20種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することができる。あるいは、本開示のtRNAを用いて、1つのコドンボックスにおけるM1M2AとM1M2Gのコドン、M1M2U、M1M2AおよびM1M2Gのコドン、またはM1M2C、M1M2AおよびM1M2Gのコドンの読み分けを行えば、20種類より多くのアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することも可能である。さらなる態様において、本開示の翻訳系から、例えば21種類、22種類、23種類、24種類、25種類、26種類、27種類、28種類、29種類、30種類、31種類、32種類、33種類、34種類、35種類、36種類、37種類、38種類、39種類、40種類、41種類、42種類、43種類、44種類、45種類、46種類、47種類、または48種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳することが可能である。
　いくつかの態様において、本開示の翻訳系は、無細胞翻訳系である。さらなる態様において、本開示の翻訳系は、再構成型の無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系における細胞抽出液やペプチド翻訳に必要な因子（例えばリボソームなど）は、種々の生物材料に由来するものを利用することができる。そのような生物材料として、例えば、大腸菌、酵母、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、HeLa細胞、あるいは昆虫細胞などを挙げることができる。いくつかの態様において、本開示の無細胞翻訳系は、大腸菌由来のリボソームを含む。
　いくつかの態様において本開示の翻訳系は、一コドンあたりのtRNA（各コドンに対応するtRNA） を、0.8μM、1.6μM、2.4μM、3.2μM、4.0μM、4.8μM、5.6μM、6.4μMおよび10μMからなる群より選択される下限、および、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM、1000μMからなる群より選択される上限によって特定可能な範囲の濃度で含むことができる。具体的には、例えば、0.8～1000 μM 、好ましくは1.6～500 μM、より好ましくは3.2～250 μM、さらに好ましくは6.4～150 μM、特に好ましくは10～100 μMの濃度で含むことができる。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)であるコドンである。すなわち、コドンがUUM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、UUAおよびUUGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、UUU、UUA、UUGのコドンの組合せ、または UUC、UUA、UUGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。これらのコドンを選択的に翻訳するためには、本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がウリジン(U)であり、M2がアデノシン(A)であるコドンである。すなわち、コドンがUAM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、UAAおよびUAGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、UAU、UAA、UAGのコドンの組合せ、または UAC、UAA、UAGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)であるコドンである。すなわち、コドンがUGM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、UGAおよびUGGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、UGU、UGA、UGGのコドンの組合せ、またはUGC、UGA、UGGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)であるコドンである。すなわち、コドンがCAM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、CAAおよびCAGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、CAU、CAA、CAGのコドンの組合せ、またはCAC、CAA、CAGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)であるコドンである。すなわち、コドンがCGM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、CGAおよびCGGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、CGU、CGA、CGGのコドンの組合せ、またはCGC、CGA、CGGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がアデノシン(A)であり、M2がウリジン(U)であるコドンである。すなわち、コドンがAUM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、AUAおよびAUGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、AUU、AUA、AUGのコドンの組合せ、またはAUC、AUA、AUGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がアデノシン(A)であり、M2がシチジン(C)であるコドンである。すなわち、コドンがACM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、ACAおよびACGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、ACU、ACA、ACGのコドンの組合せ、またはACC、ACA、ACGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)であるコドンである。すなわち、コドンがAAM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、AAAおよびAAGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、AAU、AAA、AAGのコドンの組合せ、またはAAC、AAA、AAGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)であるコドンである。すなわち、コドンがAGM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、AGAおよびAGGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、AGU、AGA、AGGのコドンの組合せ、またはAGC、AGA、AGGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
　特定の態様において、本開示の翻訳系におけるコドンは、M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)であるコドンである。すなわち、コドンがGAM3で表されるコドンボックスに本開示のtRNAを割り当てることができる。本開示におけるtRNAを含む翻訳系を用いることにより、GAAおよびGAGのコドンの組合せから2種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。あるいは、GAU、GAA、GAGのコドンの組合せ、またはGAC、GAA、GAGのコドンの組合せから3種類のアミノ酸を選択的に翻訳することができる。本開示のtRNAとして、人工的に合成したtRNA（例えば転写合成したtRNA）を用いることが好ましい。その場合、天然のtRNAの配列を用いる他、アンチコドン以外の部分に任意のtRNA（例えばtRNA(Glu)、tRNA(AsnE2)、tRNA(Asp)など）に由来する配列を用いて、そこに所望のアンチコドンの配列を連結して用いることもできる。本開示のtRNAは、アンチコドンの部分も含めて、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)の4種類のヌクレオシドのみから構成されていることが好ましく、それら以外の修飾ヌクレオシドは含まれていないことが望ましい。本開示の翻訳系としては、無細胞翻訳系、特に再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。各tRNAをアミノアシル化する際には、翻訳系外でアミノ酸を結合させることが好ましく、そのための方法として、例えばpCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法が好ましい。各tRNAに結合させるアミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のどちらも用いることができるが、天然の遺伝暗号表には含まれていない非天然アミノ酸を用いることが本開示の目的の観点からも望ましい。翻訳系中に含まれる本開示のtRNAの一コドンあたりの濃度は、例えば0.8～1000 μMの範囲内であることが好ましい。
ＩＩＩ．ペプチドの製造方法、組成物およびキット
　一局面において、本開示は、ペプチドの製造方法であって、本開示における翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む方法を提供する。具体的には、本開示は、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系において核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法に関する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。一局面において、前記2種類のtRNAのそれぞれには互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されている。また一局面において、本開示における製造方法においては、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンから少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳され得る。
　一局面において、本開示は、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系において核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法に関する。また一局面において、本開示は、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系において核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法に関する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。一局面において、前記3種類のtRNAのそれぞれには互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されている。また一局面において、本開示における製造方法においては、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳され得る。
　本開示における核酸には、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンがそれぞれ一個または複数個含まれ得る。本開示におけるペプチドの製造方法は、本開示におけるtRNAが、当該核酸に含まれ得るM1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一回または複数回、選択的に翻訳するプロセス（あるいは読み分けるプロセス）を含み得る。一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法においては、これらのコドンを含む１種または複数種の核酸が翻訳され得る。
　本開示における核酸には、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンがそれぞれ一個または複数個含まれ得る。本開示におけるペプチドの製造方法は、本開示におけるtRNAが、当該核酸に含まれ得るM1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一回または複数回、選択的に翻訳するプロセス（あるいは読み分けるプロセス）を含み得る。一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法においては、これらのコドンを含む１種または複数種の核酸が翻訳され得る。
　本開示における核酸には、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンがそれぞれ一個または複数個含まれ得る。本開示におけるペプチドの製造方法は、本開示におけるtRNAが、当該核酸に含まれ得るM1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一回または複数回、選択的に翻訳するプロセス（あるいは読み分けるプロセス）を含み得る。一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法においては、これらのコドンを含む１種または複数種の核酸が翻訳され得る。
　本開示における核酸には、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンがそれぞれ一個または複数個含まれ得る。本開示におけるペプチドの製造方法は、本開示におけるtRNAが、当該核酸に含まれ得るM1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一回または複数回、選択的に翻訳するプロセス（あるいは読み分けるプロセス）を含み得る。一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法においては、これらのコドンを含む１種または複数種の核酸が翻訳され得る。
　一局面において、本開示は、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、および、M1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、ペプチドを製造するための組成物およびキットに関する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および２文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。一局面において、前記2種類のtRNAのそれぞれには互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されている。また一局面において、本開示における組成物およびキットを使用することにより、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンから少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳され得る。
　一局面において、本開示は、M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、ペプチドを製造するための組成物およびキットに関する。また一局面において、本開示は、M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、ペプチドを製造するための組成物およびキットに関する。一局面において、本開示においては、M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択される。一局面において、前記3種類のtRNAのそれぞれには互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合されている。また一局面において、本開示における製造方法においては、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳され得る。
　本開示における翻訳系を構成するtRNAは、核酸の翻訳に通常用いられるバッファーや物質などを含む組成物を構成することができる。また本開示における翻訳系を構成するtRNAは、ペプチドの翻訳に通常用いられる各種の物質などとともにあらかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。またキットに含まれる各種の物質は、その使用態様に応じて粉末状あるいは液状とすることができる。またこれらを適当な容器に収納し、適時に使用することができる。
　本開示においては、2つ以上のアミノ酸がアミド結合によって結合した化合物が、本開示のペプチドに含まれ得る。また、アミノ酸の代わりにヒドロキシカルボン酸などのアミノ酸類縁体がエステル結合によって結合した化合物も、本開示のペプチドに含まれ得る。ペプチドに含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は2個以上であれば特に限定されないが、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上などが挙げられ、また、100個以下、80個以下、50個以下、30個以下、25個以下、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下などが挙げられる。あるいは、9個、10個、11個、12個の中から選択することもできる。
　一局面において、本開示における組成物およびキットには核酸が含まれていてもよい。一態様において、本開示における組成物およびキットを構成する核酸は、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含むことができる。また一局面において、本開示における組成物およびキットを構成する核酸は、（ｉ）M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドン、または、（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドン、およびM1M2Gで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含むことができる。また一局面において、本開示における組成物およびキットを構成する核酸は、M1M2Aで表されるコドン、M1M2Gで表されるコドン、M1M2Uで表されるコドン、およびM1M2Cで表されるコドンをそれぞれ一個または複数個含むことができる。一態様において、本開示における組成物およびキットは、このような核酸を１種または複数種含むことができる。
　一態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸を含んでいてもよく、ペプチドに含まれるＮ置換アミノ酸の数は、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などであることができる。また、別の態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換されていないアミノ酸を含んでいてもよく、Ｎ置換されていないアミノ酸の数は、例えば1個、2個、3個、4個などであることができる。さらなる態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸とＮ置換されていないアミノ酸の両方を含んでいてもよい。
　いくつかの態様において、本開示のペプチドは、直鎖状のペプチドであってもよいし、環状部を有するペプチドであってもよい。環状部を有するペプチドとは、ペプチド鎖上に存在するあるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖が、同じペプチド鎖上に存在する別のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖と結合することによって、分子内に環状構造が形成されたペプチドを意味する。環状部を有するペプチドは、環状部のみから構成されていてもよいし、環状部と直鎖部をともに含んでいてもよい。環状部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上などであり、また、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下などであることができる。あるいは、9個、10個、11個の中から選択することもできる。また、直鎖部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば0個以上であり、また、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下などであることができる。あるいは、0個、1個、2個、3個の中から選択することもできる。
　環状部を形成するための結合としては、例えば、アミノ基とカルボキシル基から形成されるペプチド結合を利用することができる。それ以外にも、適切な官能基の組合せから形成されるアミド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、炭素－炭素結合、アルキル結合、アルケニル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、アミン結合、C＝N－C結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、チオアミド結合、スルフィニル結合、スルホニル結合、トリアゾール結合、ベンゾオキサゾール結合などを利用することができる。炭素－炭素結合は、鈴木（Suzuki）反応、ヘック（Heck）反応、薗頭（Sonogashira）反応などの遷移金属を触媒とした反応によって形成することができる。一態様において、本開示のペプチドは、分子内において上記の結合を形成することが可能な少なくとも1組の官能基を含んでいる。環状部の形成は、本開示の翻訳系を用いて直鎖状のペプチドが製造された後に、上記の官能基どうしを結合させるための反応を別途行うことによってなされてもよい。環状部を有するペプチドの合成については、WO2013/100132、WO2012/026566、WO2012/033154、WO2012/074130、WO2015/030014、WO2018/052002、Comb Chem High Throughput Screen (2010)13: 75-87、Nat Chem Biol (2009) 5: 502-507、Nat Chem Biol (2009) 5: 888-90、Bioconjug Chem (2007) 18: 469-476、ChemBioChem (2009) 10: 787-798、Chem Commun (Camb) (2011) 47: 9946-9958なども参照することができる。
　いくつかの態様において、本開示の翻訳系において翻訳される核酸はmRNAである。mRNAには、所望のアミノ酸配列を有するペプチドがコードされていてもよい。mRNAを本開示の翻訳系に添加することによって、当該mRNAのペプチドへの翻訳を行うことができる。一方、DNAをmRNAに転写するためのRNAポリメラーゼが翻訳系に含まれている場合、DNAを本開示の翻訳系に添加することによって、当該DNAのmRNAへの転写、および当該mRNAのペプチドへの翻訳を併せて行うことができる。mRNAは少なくとも、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドン、M1M2Uで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドン、または、M1M2Cで表されるコドン、M1M2Aで表されるコドンおよびM1M2Gで表されるコドンを含むものであってよい。
　翻訳されるペプチドのＮ末端には通常、開始アミノ酸としてメチオニンが存在しているが、メチオニン以外のアミノ酸をＮ末端に導入するための方法もいくつか報告されている。それらを本開示におけるペプチドの製造方法と組み合わせて用いてもよい。そのような方法として、例えば、メチオニン以外のアミノ酸でアミノアシル化された開始tRNAを用いて、所望のアミノ酸から開始される核酸を翻訳する方法が挙げられる（Initiation suppression）。特に、外来性のアミノ酸を許容し得る程度としては、ペプチド鎖の伸長時よりも翻訳開始時の方が高いことから、Ｎ末端では、天然アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸であっても利用できる可能性がある（Goto & Suga, J Am Chem Soc (2009) 131(14): 5040-5041）。他の方法として、翻訳系から開始メチオニルtRNAを除去することにより、あるいは、開始アミノ酸をメチオニン以外の翻訳効率の低いアミノ酸に置き換えることにより、２番目以降のコドンから翻訳を開始する方法が挙げられる（Initiation read-through；開始コドンの読み飛ばし）。さらに別法として、ペプチドデホルミラーゼ（peptide deformylase）およびメチオニンアミノペプチダーゼ（Methionine aminopeptidase）などの酵素を作用させることによって、ペプチドのＮ末端のメチオニンを削除する方法を挙げることもできる（Meinnel et al., Biochimie (1993) 75: 1061-1075）。メチオニンから開始されるペプチドライブラリーを用意し、これに上記の酵素を作用させることによって、Ｎ末端がランダムなアミノ酸から開始されるペプチドライブラリーを調製することができる。
　別の局面において、本開示は、本開示におけるペプチドの製造方法によって製造されたペプチドを提供する。本開示における方法により製造されたペプチドに対して、さらに化学修飾を行うなどして得られたペプチドもまた、本開示が提供するペプチドに含まれる。
　一局面において、本開示は、ペプチドライブラリーの製造方法であって、本開示における翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む方法を提供する。ペプチドをそれぞれコードする核酸分子であって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を用意し、それらをそれぞれペプチドに翻訳することによって、アミノ酸配列の多様性に富んだ複数のペプチド分子を製造することができる。ライブラリーのサイズは特に限定されないが、例えば、106以上、107以上、108以上、109以上、1010以上、1011以上、1012以上、1013以上、1014以上などであることができる。核酸はDNAであってもよいし、RNAであってもよい。RNAは通常mRNAである。DNAはmRNAへの転写を介してペプチドへの翻訳が行われる。そのような核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって調製することができる。核酸ライブラリーを合成する際、所望の位置に混合塩基を用いることによって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を容易に調製することができる。混合塩基を用いたコドンの例として、例えばNNN（ここで、NはA、T、G、Cの4塩基の混合を表す）やNNW（ここで、WはA、Tの2塩基の混合を表す）、NNM（ここで、WはA、Cの2塩基の混合を表す）、NNK（ここで、KはG、Tの2塩基の混合を表す）、NNS（ここで、SはC、Gの2塩基の混合を表す）などを挙げることができる。あるいは、コドンの3文字目で用いられる塩基を、A、T、G、Cのうちのいずれか1種類に限定することで、一部の特定のアミノ酸のみがコードされた核酸ライブラリーを合成することも可能である。さらに、混合塩基を含むコドンを作成する際、複数の塩基を等比ではなく異なる比率で混合することによって、そのコドンから得られるアミノ酸の出現頻度を任意に調節することも可能である。上記のようなコドンを１単位（ユニット）として、種類の異なるコドンユニットを複数用意し、それらを所望の順序で連結すれば、含まれるアミノ酸の出現位置や出現頻度が制御されたライブラリーをデザインすることも可能となる。
　いくつかの態様において、本開示におけるペプチドライブラリーは、ペプチドが核酸上に提示されたライブラリー（核酸ディスプレイライブラリー、あるいは単にディスプレイライブラリー）である。ディスプレイライブラリーは、ペプチドとそれをコードする核酸が結合して1つの複合体を形成することによって、表現型と遺伝子型が対応付けられていることを特徴とするライブラリーである。主なディスプレイライブラリーの例として、mRNAディスプレイ法（Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 12297-12302）、in vitroウィルス法（Nemoto et al., FEBS Lett (1997) 414: 405-408）、cDNAディスプレイ法（Yamaguchi et al., Nucleic Acids Res (2009) 37: e108）、リボソームディスプレイ法（Mattheakis et al, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 9022-9026）、covalentディスプレイ法（Reiersen et al., Nucleic Acids Res (2005) 33: e10）、CISディスプレイ法（Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101: 2806-2810）などで作製されたライブラリーを挙げることができる。あるいは、in vitro compartmentalization法（Tawfik and Griffiths, Nat Biotechnol (1998) 16: 652-656）を用いて作製されたライブラリーも、ディスプレイライブラリーの一態様として挙げることができる。
　別の局面において、本開示は、本開示におけるペプチドライブラリーの製造方法によって製造されたペプチドライブラリーを提供する。
　一局面において、本開示は、標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法であって、本開示におけるペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む方法を提供する。標的分子は特に限定されず、例えば低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質などの中から適宜選択することができる。標的分子は細胞外に存在する分子であってもよく、細胞内に存在する分子であってもよい。あるいは細胞膜に存在する分子であってもよく、その場合、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインのいずれが標的となってもよい。ペプチドライブラリーと標的分子を接触させる工程において、通常、標的分子は何らかの固相担体（例えばマイクロタイタープレートやマイクロビーズなど）に固定される。その後、標的分子に結合していないペプチドを除去して、標的分子に結合しているペプチドのみを回収することによって、標的分子に対して結合活性を有するペプチドを選択的に濃縮することができる（パニング法）。用いたペプチドライブラリーが核酸ディスプレイライブラリーの場合、回収されたペプチドにその遺伝情報がコードされた核酸が結合しているので、それらを単離し解析することによって、回収されたペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列を容易に同定することができる。さらに、得られた核酸配列あるいはアミノ酸配列をもとに、化学合成あるいは遺伝子組み換え手法などにより、同定されたペプチドを個別に製造することもできる。
　一局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M1M2AおよびM1M2Gの2つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M1M2Aのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体およびM1M2Gのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の種類が互いに異なる。
　ここで、M1およびM2は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す（ただし、M1がAであり、かつM2がUであるコドンは除く）。
　さらなる局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M1M2U、M1M2AおよびM1M2Gの3つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M1M2Uのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体、M1M2Aのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体、およびM1M2Gのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の種類がいずれも互いに異なる。
　ここで、M1およびM2は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す。
　別の局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M1M2C、M1M2AおよびM1M2Gの3つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M1M2Cのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体、M1M2Aのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体、およびM1M2Gのコドンに対応するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の種類がいずれも互いに異なる。
　ここで、M1およびM2は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す。
　いくつかの態様において、上述の核酸－ペプチド複合体は、ペプチドライブラリー（特に核酸ディスプレイライブラリー）を構成する要素の１つとしてそこに含まれ得る。一態様において、本開示は、本開示における核酸－ペプチド複合体を含むライブラリー（ペプチドライブラリーあるいは核酸ディスプレイライブラリー）を提供する。特定の態様において、上述の核酸－ペプチド複合体およびライブラリーは、本開示におけるtRNA、あるいは本開示における翻訳系を用いて作製され得る。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ　　　　　　酢酸アンモニウム
ＣＨ２ＣＮ　　　 シアノメチル基
ＤＢＵ　　　　　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ　　　　　ジクロロメタン
ＤＩＣ　　　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　　　　ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ　　　　ジメチルスルホキシド
ＦＡ　　　　　　ギ酸
Ｆｍｏｃ　　　　９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆ－Ｐｎａｚ　　４－（２－（４－フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
ＨＦＩＰ　　　　１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール
ＭｅＣＮ　　　　アセトニトリル
ＮＭＰ　　　　　Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＴＥＡ　　　　　トリエチルアミン
ＴＦＡ　　　　　トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ　　　　　２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ　　　　　テトラヒドロフラン
　また、本実施例では、以下の略号を用いた。ＧｌｙまたはＧ（グリシン）、ＩｌｅまたはＩ（イソロイシン）、ＬｅｕまたはＬ（ロイシン）、ＰｈｅまたはＦ（フェニルアラニン）、ＰｒｏまたはＰ（プロリン）、ＴｈｒまたはＴ（トレオニン）。これらに加えて、表２に記載の略号を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、ＬＣＭＳの分析条件を、下記の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１．無細胞翻訳系に用いるpCpA-アミノ酸の合成
　以下のスキームに従い、アミノアシル化pCpA(SS14、SS15、SS16、SS48、SS49、SS50、SS51)を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
(S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸(化合物SS17、F-Pnaz-Pic2-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　窒素雰囲気下、(S)-ピペリジン-2-カルボン酸(42.6 mg、0.33 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(140 mg、0.44 mmol)の混合物に室温にてDMF(330μL)を添加した。室温で5分撹拌した後、トリエチルアミン(105.6μL、2.25 mmol)を0℃にて添加した。反応混合物を室温において30分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸(化合物SS17、F-Pnaz-Pic2-OH)(92 mg、67％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 413 (M-H)-
保持時間：0.70分(分析条件SQDFA05_01)
(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)(化合物SS18、F-Pnaz-Pic2-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　窒素雰囲気下、((S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸(化合物SS17、F-Pnaz-Pic2-OH)(30 mg、0.072 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(20.23μL、0.116 mmol)をアセトニトリル(90μL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(5.34μL、0.080 mmol)を0℃において加え、室温で2時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)(化合物SS18、F-Pnaz-Pic2-OCH2CN)を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル(2.00 mL)に溶解し、そのまま次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z ＝ 452 (M-H)-
保持時間：0.79分(分析条件SQDFA05_01)
(2S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル)(化合物SS14、F-Pnaz-Pic2-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　緩衝液A(40 mL)に、文献(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)記載の方法で合成したリン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(113 mg、0.156 mmol)を溶解させ、(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)(化合物SS18、F-Pnaz-Pic2-OCH2CN)(35.4 mg、0.078 mmol)のアセトニトリル溶液(2.00 mL)を投与し、室温で150分撹拌した。反応液を0℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸(2.00 mL)を加えた。反応液を0℃で45分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS14、F-Pnaz-Pic2-pCpA)(6.0 mg、7.3％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1047.5 (M-H)-
保持時間：0.50分(分析条件SQDFA05_01)
　なお、緩衝液Aは以下のように調製した。
　N,N,N-トリメチルヘキサデカン-1-アミニウム 塩化物(6.40g、20 mmol)とイミダゾール(6.81g、100 mmol)の水溶液に酢酸を添加し、pH8、20 mM N,N,N-トリメチルヘキサデカン-1-アミニウム、100 mMイミダゾールの緩衝液A(1L)を得た。
O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン(化合物SS19、F-Pnaz-SPh2Cl-OH)の合成 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　窒素雰囲気下、特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成したO-(2-クロロフェニル)-L-セリン(化合物aa63)(1.25g、5.80 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(2g、4.71 mmol)の混合物に室温にてDMSO(15 mL)、トリエチルアミン(0.95 g、9.42 mmol)を添加した。反応混合物を室温において16時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン(化合物SS19、F-Pnaz-SPh2Cl-OH)(1.8g、73％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 523 (M＋Na)＋
保持時間：1.26分(分析条件SMD method6)
シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート(化合物SS20、F-Pnaz-SPh2Cl-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　窒素雰囲気下、O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン(化合物SS19、F-Pnaz-SPh2Cl-OH)(800 mg、1.60 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(0.412g、3.19 mmol)をDCM(15 mL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(760 mg、6.34 mmol)を室温において加え、室温で16時間撹拌した。反応液を濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート(化合物SS20、F-Pnaz-SPh2Cl-OCH2CN)(220 mg、26％)を得た。得られた生成物をアセトニトリル(5 mL)に溶解し、次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z ＝ 562 (M＋Na)＋
保持時間：1.15分(分析条件SMD method4)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート(化合物SS15、F-Pnaz-SPh2Cl-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　緩衝液A(100 mL)に、リン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(400 mg、0.55 mmol)を溶解させ、シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート(化合物SS20、F-Pnaz-SPh2Cl-OCH2CN)(220 mg、0.41 mmol)のアセトニトリル溶液(5 mL)をシリンジポンプを使い15分以上かけて滴下し、室温で5分撹拌した。続いて、反応液にトリフルオロ酢酸(2.3 mL)を加えた。反応液を凍結乾燥した後に、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS15、F-Pnaz-SPh2Cl-pCpA)(20.7 mg、2％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1133.4 (M-H)-
保持時間：0.55分(分析条件SQDFA05_01)
((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS21、MeHph-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成した(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物aa11)(150 mg、0.361 mmol)に室温にてDCM(903μL)、水(903μL)およびピペリジン(178μL、1.805 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を室温において30分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS21、MeHph-OH)(55 mg、79％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 192 (M-H)-
保持時間：0.15分(分析条件SQDFA05_02)
(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS22、F-Pnaz-MeHph-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　窒素雰囲気下、((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS21、MeHph-OH)(35.1 mg、0.182 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(85 mg、0.20 mmol)の混合物に室温にてDMSO(727μL)を添加した。トリエチルアミン(76μL、0.545 mmol)を50℃にて添加した。反応混合物を40℃において16時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS22、F-Pnaz-MeHph-OH)(80 mg、92％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 477 (M-H)-
保持時間：0.85分(分析条件SQDFA05_02)
(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル(化合物SS23、F-Pnaz-MeHph-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　窒素雰囲気下、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物SS22、F-Pnaz-MeHph-OH)(77 mg、0.16 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(31μL、0.176 mmol)の混合物にアセトニトリル(533μL)を室温にて加えた。その後、2-ブロモアセトニトリル(86μL、1.280 mmol)を室温において加え、反応混合物を40℃において1時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル(化合物SS23、F-Pnaz-MeHph-OCH2CN)を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル(5.00 mL)に溶解し、そのまま次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z ＝ 516 (M-H)-
保持時間：0.92分(分析条件SQDFA05_02)
(2S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物SS16、F-Pnaz-MeHph-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　緩衝液A(100 mL)に、リン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(127 mg、0.176 mmol)を溶解させ、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル(化合物SS23、F-Pnaz-MeHph-OCH2CN)(83 mg、0.16 mmol)のアセトニトリル溶液(5.00 mL)を投与し、室温で1時間撹拌した。反応液を0℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸(5.00 mL)を加えた。反応液を0℃で1時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、その後さらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、表題化合物(化合物SS16、F-Pnaz-MeHph-pCpA)(26 mg、14.6％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1111.5 (M-H)-
保持時間：0.64分(分析条件SQDFA05_02)
　化合物SS48の合成中間体は、以下のスキームに従って合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩(化合物SS52、Fmoc-MeA3Pyr-OH・TFA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(15g、38.62 mmol)、トリフルオロ酢酸(27 mL、348 mmol)およびパラホルムアルデヒド((CH2O)n)(3.48g、116 mmol)をトルエン(50 mL)に懸濁させ、窒素雰囲気下、40℃で16時間撹拌した。室温へと冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣をDCMに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過および減圧濃縮することで溶媒を除去し、(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸 (9H-フルオレン-9-イル)メチルを粗生成物として得た。
　得られた粗生成物である(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸 (9H-フルオレン-9-イル)(18g、44.95 mmol)をジクロロエタン(100 mL)に溶解し、トリエチルシラン(Et3SiH)(47g、404.20 mmol)およびトリフルオロ酢酸(100 mL)を室温で加えた。反応液を窒素雰囲気下、70℃で16時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸イソプロピルに溶解し、t-ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液(9:1)を加えた。その溶液を室温で20分間撹拌した後、4℃にて1時間静置した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、冷却したt-ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液(9:1)で洗浄し、(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩(化合物SS52、Fmoc-MeA3Pyr-OH・TFA)(19 g、95％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 403 (M＋H)＋
保持時間：0.77分(分析条件SMD method1)
(S)-2-(メチルアミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS53、MeA3Pyr-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩(化合物SS52、Fmoc-MeA3Pyr-OH・TFA)(19 g、47.21 mmol)に室温にてDMF(72 mL)およびピペリジン(28.5 mL)を添加し、反応混合物を室温において3時間撹拌した。ジエチルエーテル(140 mL)およびヘキサン(280 mL)を加え、室温においてさらに3時間撹拌した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、(S)-2-(メチルアミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS53、MeA3Pyr-OH)(7 g)を定量的に得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 181 (M＋H)＋
保持時間：0.15分(分析条件SMD method2)
(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS54、F-Pnaz-MeA3Pyr-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　窒素雰囲気下、(S)-2-(メチルアミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS53、MeA3Pyr-OH)(970 mg、5.38 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(2 g、4.71 mmol)の混合物に室温にてDMSO(15 mL)、トリエチルアミン(950 mg、9.43 mmol)を添加した。反応混合物を40℃において16時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS54、F-Pnaz-MeA3Pyr-OH)(1.0 g、46％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 466 (M＋H)＋
保持時間：0.98分(分析条件SMD method3)
(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸シアノメチル(化合物SS55、F-Pnaz-MeA3Pyr-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　窒素雰囲気下、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸(化合物SS54、F-Pnaz-MeA3Pyr-OH)(800 mg、1.72 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(444 mg、3.44 mmol)の混合物をDCM(20 mL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(818 mg、6.82 mmol)を室温において加え、室温で6時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/石油エーテル)にて精製し、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸シアノメチル(化合物SS55、F-Pnaz-MeA3Pyr-OCH2CN)(221 mg、25％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 505 (M＋H)＋
保持時間：0.83分(分析条件SMD method4)
(2S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物SS48、F-Pnaz-MeA3Pyr-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　緩衝液A(100 mL)に、文献(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)記載の方法で合成したリン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(400 mg、0.55 mmol)を溶解させ、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(ピリジン-3-イル)プロパン酸シアノメチル(化合物SS55、F-Pnaz-MeA3Pyr-OCH2CN)(146 mg、0.29 mmol)のアセトニトリル溶液(5 mL)をシリンジポンプを用いて15分以上かけて滴下し、室温で1時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸(2.3 mL)を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS48、F-Pnaz-MeA3Pyr-pCpA)(64.4 mg、5％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1098.5 (M-H)-
保持時間：0.39分(分析条件SQDFA05_01)
N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリン(化合物SS56、F-Pnaz-StBuOH-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　窒素雰囲気下、特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成したO-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリン(0.5 g、2.83 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(1g、2.36 mmol)の混合物に室温にてDMSO(7 mL)、トリエチルアミン(0.65 mL、4.72 mmol)を添加した。反応混合物を室温において16時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリン(化合物SS56、F-Pnaz-StBuOH-OH)(1 g、92％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 485 (M＋Na)＋
保持時間：0.80分(分析条件SMD method5)
シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリナート(化合物SS57、F-Pnaz-StBuOH-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　窒素雰囲気下、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリン(化合物SS56、F-Pnaz-StBuOH-OH)(1.2 g、2.59 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(670 mg、5.18 mmol)をDCM(36 mL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(1.23 g、10.25 mmol)を室温において加え、室温で48時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/石油エーテル)にて精製し、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリナート(化合物SS57、F-Pnaz-StBuOH-OCH2CN)(1 g、77％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 524 (M＋Na)＋
保持時間：0.97分(分析条件SMD method4)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリナート(化合物SS49、F-Pnaz-StBuOH-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　緩衝液A(100 mL)に、文献(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)記載の方法で合成したリン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(400 mg、0.55 mmol)を溶解させ、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-L-セリナート(化合物SS57、F-Pnaz-StBuOH-OCH2CN)(139 mg、0.28 mmol)のアセトニトリル溶液(5 mL)をシリンジポンプを用いて15分以上かけて滴下し、室温で1時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸(2.3 mL)を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS49、F-Pnaz-StBuOH-pCpA)(55.3 mg、5％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1095.4 (M-H)-
保持時間：0.46分(分析条件SQDFA05_01)
N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS58、MeSnPr-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成した(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸(化合物aa52)(20 g、52.16 mmol)に室温にてDMF(80 mL)およびピペリジン(30 mL)を添加し、反応混合物を室温において3時間撹拌した。ジエチルエーテル(160 mL)およびヘキサン(500 mL)を加え、室温においてさらに3時間撹拌した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS58、MeSnPr-OH)(7 g、83％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 162 (M＋H)＋
保持時間：0.34分(分析条件SMD method2)
N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS59、F-Pnaz-MeSnPr-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　窒素雰囲気下、N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS58、MeSnPr-OH)(920 mg、5.71 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(2 g、4.71 mmol)の混合物に室温にてDMSO(15 mL)、トリエチルアミン(1.3 mL、9.43 mmol)を添加した。反応混合物を室温において16時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS59、F-Pnaz-MeSnPr-OH)(2 g、95％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 469 (M＋Na)＋
保持時間：1.23分(分析条件SMD method3)
シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリナート(化合物SS60、F-Pnaz-MeSnPr-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　窒素雰囲気下、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリン(化合物SS59、F-Pnaz-MeSnPr-OH)(2.2 g、4.93 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(1.28 g、9.90 mmol)の混合物をDCM(40 mL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(2.35g、19.59 mmol)を室温において加え、室温で48時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/石油エーテル)にて精製し、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリナート(化合物SS60、F-Pnaz-MeSnPr-OCH2CN)(2 g、84％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 508 (M＋Na)＋
保持時間：1.32分(分析条件SMD method3)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリナート(化合物SS50、F-Pnaz-MeSnPr-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　緩衝液A(100 mL)に、文献(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)記載の方法で合成したリン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(400 mg、0.55 mmol)を溶解させ、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-N-メチル-O-プロピル-L-セリナート(化合物SS60、F-Pnaz-MeSnPr-OCH2CN)(135 mg、0.28 mmol)のアセトニトリル溶液(5 mL)をシリンジポンプを用いて15分以上かけて滴下し、室温で4時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸(2.3 mL)を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS50、F-Pnaz-MeSnPr-pCpA)(70.2 mg、6％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1079.5 (M-H)-
保持時間：0.52分(分析条件SQDFA05_01)
(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシン(化合物SS61、F-Pnaz-Ile-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　窒素雰囲気下、L-イソロイシン(52.5 mg、0.40 mmol)、特許文献(WO2018143145A1)記載の方法で合成した炭酸-(4-ニトロフェニル)-4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル(化合物ts11)(178 mg、0.42 mmol)の混合物に室温にてDMSO(2 mL)、トリエチルアミン(128μL、0.92 mmol)を添加した。反応混合物を室温にて2.5日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％ギ酸水溶液/0.1％ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシン(化合物SS61、F-Pnaz-Ile-OH)(125 mg、75％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 415.4 (M-H)-
保持時間：0.74分(分析条件SQDFA05_02)
シアノメチル (((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシナート(化合物SS62、F-Pnaz-Ile-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　窒素雰囲気下、(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシン(化合物SS61、F-Pnaz-Ile-OH)(42 mg、0.1 mmol)および2-ブロモアセトニトリル(13μL、0.200 mmol)をアセトニトリル(500μL)に溶解し、N-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(35μL、0.200 mmol)を室温において加え、室温で16時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル (((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシナート(化合物SS62、F-Pnaz-Ile-OCH2CN)を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル(3.00 mL)に溶解し、そのまま次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z ＝ 454 (M-H)-
保持時間：0.83分(分析条件SQDFA05_02)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシナート(化合物SS51、F-Pnaz-Ile-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　緩衝液A(60 mL)に、文献(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)記載の方法で合成したリン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(72.2 mg、0.100 mmol)を溶解させ、シアノメチル (((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-イソロイシナート(化合物SS62、F-Pnaz-Ile-OCH2CN)(45.5 mg、0.100 mmol)のアセトニトリル溶液(3.00 mL)を投与し、室温で20時間撹拌した。反応液を0℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸(3.00 mL)を加えた。反応液を室温で30分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％トリフルオロ酢酸水溶液/0.05％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物SS51、F-Pnaz-Ile-pCpA)(12 mg、11.4％)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1049.4 (M-H)-
保持時間：0.54分(分析条件SQDFA05_02)
実施例２．BdpFL-Phe-pCpA(MT01)の合成
(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン(化合物MT02、BdpFL-Phe-OH)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　窒素雰囲気下、3-(2-カルボキシエチル)-5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-4-イウム(200 mg，0.685 mmol)と1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン(87 mg，0.753 mmol) のNMP(4.5 mL)溶液にDIC(0.128 ml，0.822 mmol)を室温で加えたのち、40℃で終夜撹拌した。室温に戻したのち、反応液にL-フェニルアラニン(113 mg， 0.685 mmol)とTEA(0.191 ml，1.369 mmol)を加え、40℃で終夜撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)にて精製し、(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン(化合物MT02、BdpFL-Phe-OH)(102 mg， 34％収率)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 438.3 (M-H)-
保持時間：0.78分(分析条件SQDFA05_02)
(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン シアノメチルエステル(化合物MT03、BdpFL-Phe-OCH 2 CN)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　窒素雰囲気下、(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン(50 mg、0.114 mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(31.0 μL， 0.177 mmol)をアセトニトリル(500μL)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(12 μL， 0.177 mmol)を0℃で加えたのち、40℃で3時間撹拌した。反応液を濃縮し、(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン シアノメチルエステル(化合物MT03、BdpFL-Phe-OCH2CN)を粗生成物として得た。得られた粗生成物は、そのまま次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z ＝ 477.3(M-H)-
保持時間：0.86分(分析条件SQDFA05_01)
3-(3-(((2S)-1-(((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((フォスフォノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)フォスフォリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-3-オキソプロピル)-5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4-ジピロロ [1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-4-イウム(化合物MT01、BdpFL-Phe-pCpA)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　緩衝液A(11.3 mL)に、リン酸二水素((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物pc01)(33.2 mg、0.046 mmol)を溶解させ、(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-4λ4,5λ4-ジピロロ[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノイル)-L-フェニルアラニン シアノメチルエステル(化合物MT03、BdpFL-Phe-OCH2CN)(11 mg、0.023 mmol)のアセトニトリル溶液(0.13 mL)を加えたのち、室温で45分撹拌した。反応液に0℃でTFA(0.56 mL)を加え、5分撹拌したのち、室温にて10分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05％ TFA MeCN/H2O)にて精製し、表題化合物(化合物MT01、BdpFL-Phe-pCpA)(2.1 mg、8.5％収率)を得た。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1072.5 (M-H)-
保持時間：0.56分(分析条件SQDFA05_02)
実施例３．LC/MSの標品として用いるN末端にBdpFLを持つペプチド(LCT-67)の合成 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　Fmoc-Gly-OHを担持させた2-ク口口卜リチルレジン(100 mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc-Gly-OH、特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成したFmoc-Thr(THP)-OH(aa01)、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-Pro-OHを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載)。Fmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った(WO2013100132B2)。ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをDCMにて洗浄した。
　レジンにTFE/DCM(1:1、v/v、2 mL)を加えて1時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをTFE/DCM(1:1、v/v、1 mL)にて2回洗浄した。全ての抽出液を混合し、DMF(2 mL)を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をNMP(1 mL)に溶解し、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸N-スクシンイミジルエステル(5 mg、0.013 mmol)を室温にて加え、19時間撹拌した後、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)に通し、中間体を含むフラクションを減圧下濃縮した。得られた残査を5％TFA in DCM(2 mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)にて精製し、表題化合物(LCT-67)(13 mg)を得た。LCT-67のアミノ酸配列を配列番号：223に示す。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1751.2(M-H)-
保持時間：0.97分(分析条件SQDFA05_02)
実施例４．LC/MSの標品として用いるN末端にBdpFLを持つペプチド(LCT-12)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　Fmoc-Ala-OHを担持させた2-ク口口卜リチルレジン(100 mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(THP)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OHを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載)。Fmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った(WO2013100132B2)。ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをDCMにて洗浄した。
　レジンにTFE/DCM(1:1、v/v、2 mL)を加えて1時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをTFE/DCM(1:1、v/v、1 mL)にて2回洗浄した。全ての抽出液を混合し、DMF(2 mL)を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をNMP(0.5 mL)に溶解し、そのうち1/4(125μL)を次の反応に使用した。ペプチドのNMP溶液に76.5 mMに調製したBdpFLスクシンイミドエステル(140μL)を室温にて加え、40℃で終夜撹拌した後、減圧下濃縮した。得られた残査を0.05M テトラメチルアンモニウム硫酸水素塩 in HFIP(1.2 mL， 0.060 mmol)に溶解し、室温で2時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)にて精製し、表題化合物(LCT-12)(0.3 mg)を得た。LCT-12のアミノ酸配列を配列番号：222に示す。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1972.9 (M-H)-
保持時間：0.74分(分析条件SQDFA05_01)
実施例５．アミノアシルｔＲＮＡの合成
　鋳型ＤＮＡ（配列番号：１（Ｄ－１）～配列番号：３４（Ｄ－３４）、配列番号：３５（Ｄ－７６）～配列番号：３７（Ｄ－７８）及び配列番号：２２４（Ｄ－８２）～配列番号：２４１（Ｄ－９９））から、T7 RNA polymeraseを用いたin vitro 転写反応によりｔＲＮＡ（配列番号：３８（ＴＲ－１）～配列番号：７４（ＴＲ－３７）及び配列番号：２４２（ＴＲ－３８）～配列番号：２５９（ＴＲ－５５））を合成し、RNeasy kit（Qiagen社）により精製した。
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１（Ｄ－１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２（Ｄ－２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３（Ｄ－３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：４（Ｄ－４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAACACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：５（Ｄ－５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTACACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６（Ｄ－６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７（Ｄ－７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTATGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：８（Ｄ－８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：９（Ｄ－９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１０（Ｄ－１０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTATTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１（Ｄ－１１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１２（Ｄ－１２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１３（Ｄ－１３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTATCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４（Ｄ－１４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１５（Ｄ－１５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６（Ｄ－１６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７（Ｄ－１７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTAAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８（Ｄ－１８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCAAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９（Ｄ－１９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTACTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０（Ｄ－２０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTCTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１（Ｄ－２１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCCTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２（Ｄ－２２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGCAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３（Ｄ－２３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTCAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２４（Ｄ－２４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCCAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２５（Ｄ－２５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAA
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２６（Ｄ－２６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２７（Ｄ－２７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGTTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２８（Ｄ－２８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２９（Ｄ－２９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGAAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３０（Ｄ－３０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGCTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３１（Ｄ－３１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTGAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３２（Ｄ－３２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTGTACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３３（Ｄ－３３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTATACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３４（Ｄ－３４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCCCCTTAGCTCAGTGGTTAGAGCAGGCGACTTATAATCGCTTGGTCGCTGGTTCAAGTCCAGCAGGGGCCAC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３５（Ｄ－７６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGCGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３６（Ｄ－７７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTCGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：３７（Ｄ－７８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCCGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２４（Ｄ－８２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTAUGACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２５（Ｄ－８３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTAUGATGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２６（Ｄ－８４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTGUGACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２７（Ｄ－８５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTGUGATGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２８（Ｄ－８６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTUUGACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２２９（Ｄ－８７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTUUGATGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３０（Ｄ－８８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTCUGACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３１（Ｄ－８９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTCUGATGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３２（Ｄ－９０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTAUCACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３３（Ｄ－９１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTUUCACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３４（Ｄ－９２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTCUCACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３５（Ｄ－９３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTATGATTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３６（Ｄ－９４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTGTGATTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３７（Ｄ－９５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTTTGATTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３８（Ｄ－９６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTCTGATTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２３９（Ｄ－９７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTATCACTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２４０（Ｄ－９８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTTTCACTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２４１（Ｄ－９９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTCTCACTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：３８（ＴＲ－１）
tRNA(Glu)aag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：３９（ＴＲ－２）
tRNA(Glu)uag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４０（ＴＲ－３）
tRNA(Glu)cag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４１（ＴＲ－４）
tRNA(Glu)aac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４２（ＴＲ－５）
tRNA(Glu)uac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４３（ＴＲ－６）
tRNA(Glu)cac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４４（ＴＲ－７）
tRNA(Glu)aug-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４５（ＴＲ－８）
tRNA(Glu)uug-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４６（ＴＲ－９）
tRNA(Glu)cug-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４７（ＴＲ－１０）
tRNA(Glu)auu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４８（ＴＲ－１１）
tRNA(Glu)uuu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：４９（ＴＲ－１２）
tRNA(Glu)cuu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５０（ＴＲ－１３）
tRNA(Glu)auc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAUCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５１（ＴＲ－１４）
tRNA(Glu)uuc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUUCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５２（ＴＲ－１５）
tRNA(Glu)cuc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５３（ＴＲ－１６）
tRNA(Glu)aaa-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５４（ＴＲ－１７）
tRNA(Glu)uaa-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５５（ＴＲ－１８）
tRNA(Glu)caa-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCAAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５６（ＴＲ－１９）
tRNA(Glu)acu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUACUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５７（ＴＲ－２０）
tRNA(Glu)ucu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUCUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５８（ＴＲ－２１）
tRNA(Glu)ccu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCCUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：５９（ＴＲ－２２）
tRNA(Glu)gca-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGCAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６０（ＴＲ－２３）
tRNA(Glu)uca-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUCAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６１（ＴＲ－２４）
tRNA(Glu)cca-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCCAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６２（ＴＲ－２５）
tRNA(fMet)cau-CA　RNA配列：
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAA
ｔＲＮＡ　配列番号：６３（ＴＲ－２６）
tRNA(Glu)gug-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６４（ＴＲ－２７）
tRNA(Glu)guu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６５（ＴＲ－２８）
tRNA(Glu)guc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGUCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６６（ＴＲ－２９）
tRNA(Glu)gaa-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGAAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６７（ＴＲ－３０）
tRNA(Glu)gcu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGCUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６８（ＴＲ－３１）
tRNA(Glu)uga-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：６９（ＴＲ－３２）
tRNA(Glu)ugu-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUGUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７０（ＴＲ－３３）
tRNA(Glu)uau-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７１（ＴＲ－３４）
tRNA(Ile)uau-CA　RNA配列：
GGCCCCUUAGCUCAGUGGUUAGAGCAGGCGACUUAUAAUCGCUUGGUCGCUGGUUCAAGUCCAGCAGGGGCCAC
ｔＲＮＡ　配列番号：７２（ＴＲ－３５）
tRNA(Glu)gcg-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGCGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７３（ＴＲ－３６）
tRNA(Glu)ucg-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUCGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７４（ＴＲ－３７）
tRNA(Glu)ccg-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCCGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４２（ＴＲ－３８）
tRNA(Asp)aug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUAUGACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４３（ＴＲ－３９）
tRNA(Asp)ccg-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUAUGAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４４（ＴＲ－４０）
tRNA(Asp)gug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUGUGACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４５（ＴＲ－４１）
tRNA(Asp)gug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUGUGAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４６（ＴＲ－４２）
tRNA(Asp)uug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUUUGACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４７（ＴＲ－４３）
tRNA(Asp)uug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUUUGAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４８（ＴＲ－４４）
tRNA(Asp)cug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUCUGACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２４９（ＴＲ－４５）
tRNA(Asp)cug-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUCUGAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５０（ＴＲ－４６）
tRNA(Asp)auc-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUAUCACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５１（ＴＲ－４７）
tRNA(Asp)uuc-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUUUCACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５２（ＴＲ－４８）
tRNA(Asp)cuc-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUCUCACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５３（ＴＲ－４９）
tRNA(AsnE2)aug-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUAUGAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５４（ＴＲ－５０）
tRNA(AsnE2)gug-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUGUGAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５５（ＴＲ－５１）
tRNA(AsnE2)uug-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUUUGAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５６（ＴＲ－５２）
tRNA(AsnE2)cug-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUCUGAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５７（ＴＲ－５３）
tRNA(AsnE2)auc-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUAUCACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５８（ＴＲ－５４）
tRNA(AsnE2)uuc-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUUUCACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：２５９（ＴＲ－５５）
tRNA(AsnE2)cuc-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUCUCACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ混合液の調製
　化合物ＡＡｔＲ－１を調製するために、２５μＭ　転写tRNA(Glu)aag-CA（配列番号：３８（ＴＲ－１））、50 mM HEPES-KOH pH7.5、20 mM MgCl2、1 mM ATP、0.6 unit/μl T4 RNAリガーゼ（New england bio lab.社）、0.25 mM アミノアシル化pCpA（特許記載（WO2018143145A1）の方法で合成したWO2018143145A1に記載の化合物ts14のDMSO溶液）となるように、Nuclease free waterでメスアップした反応液を調製し、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ただし、T4 RNAリガーゼおよびアミノアシル化pCpAを加える前の反応液は、95℃で2分間加熱後、室温で5分間放置し、予めtRNAのリフォールディングを行った。なお、以降「ｔｓ」又は「ＴＳ」から始まるアミノアシル化ｐＣｐＡは全てWO2018143145A1に記載の方法で合成したWO2018143145A1に記載の化合物である。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２を調製するために、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：３９（ＴＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３を調製するために、転写tRNA(Glu)cag-CA（配列番号：４０（ＴＲ－３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４を調製するために、転写tRNA(Glu)aac-CA（配列番号：４１（ＴＲ－４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５を調製するために、転写tRNA(Glu)uac-CA（配列番号：４２（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６を調製するために、転写tRNA(Glu)cac-CA（配列番号：４３（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７を調製するために、転写tRNA(Glu)aug-CA（配列番号：４４（ＴＲ－７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８を調製するために、転写tRNA(Glu)uug-CA（配列番号：４５（ＴＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－９を調製するために、転写tRNA(Glu)cug-CA（配列番号：４６（ＴＲ－９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１０を調製するために、転写tRNA(Glu)auu-CA（配列番号：４７（ＴＲ－１０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１１を調製するために、転写tRNA(Glu)uuu-CA（配列番号：４８（ＴＲ－１１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１２を調製するために、転写tRNA(Glu)cuu-CA（配列番号：４９（ＴＲ－１２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１３を調製するために、転写tRNA(Glu)auc-CA（配列番号：５０（ＴＲ－１３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１４を調製するために、転写tRNA(Glu)uuc-CA（配列番号：５１（ＴＲ－１４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１５を調製するために、転写tRNA(Glu)cuc-CA（配列番号：５２（ＴＲ－１５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１６を調製するために、転写tRNA(Glu)aaa-CA（配列番号：５３（ＴＲ－１６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１７を調製するために、転写tRNA(Glu)uaa-CA（配列番号：５４（ＴＲ－１７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１８を調製するために、転写tRNA(Glu)caa-CA（配列番号：５５（ＴＲ－１８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１９を調製するために、転写tRNA(Glu)acu-CA（配列番号：５６（ＴＲ－１９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２０を調製するために、転写tRNA(Glu)ucu-CA（配列番号：５７（ＴＲ－２０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２１を調製するために、転写tRNA(Glu)ccu-CA（配列番号：５８（ＴＲ－２１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２２を調製するために、転写tRNA(Glu)gca-CA（配列番号：５９（ＴＲ－２２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２３を調製するために、転写tRNA(Glu)uca-CA（配列番号：６０（ＴＲ－２３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２４を調製するために、転写tRNA(Glu)cca-CA（配列番号：６１（ＴＲ－２４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２６を調製するために、転写tRNA(Glu)gug-CA（配列番号：６３（ＴＲ－２６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２７を調製するために、転写tRNA(Glu)guu-CA（配列番号：６４（ＴＲ－２７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２８を調製するために、転写tRNA(Glu)gcu-CA（配列番号：６７（ＴＲ－３０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２９を調製するために、転写tRNA(Glu)aug-CA（配列番号：４４（ＴＲ－７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３０を調製するために、転写tRNA(Glu)uug-CA（配列番号：４５（ＴＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３１を調製するために、転写tRNA(Glu)cug-CA（配列番号：４６（ＴＲ－９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３２を調製するために、転写tRNA(Glu)auu-CA（配列番号：４７（ＴＲ－１０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３３を調製するために、転写tRNA(Glu)uuu-CA（配列番号：４８（ＴＲ－１１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３４を調製するために、転写tRNA(Glu)cuu-CA（配列番号：４９（ＴＲ－１２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３５を調製するために、転写tRNA(Glu)auc-CA（配列番号：５０（ＴＲ－１３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３６を調製するために、転写tRNA(Glu)uuc-CA（配列番号：５１（ＴＲ－１４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３７を調製するために、転写tRNA(Glu)cuc-CA（配列番号：５２（ＴＲ－１５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３８を調製するために、転写tRNA(Glu)aaa-CA（配列番号：５３（ＴＲ－１６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３９を調製するために、転写tRNA(Glu)uaa-CA（配列番号：５４（ＴＲ－１７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４０を調製するために、転写tRNA(Glu)caa-CA（配列番号：５５（ＴＲ－１８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４１を調製するために、転写tRNA(Glu)acu-CA（配列番号：５６（ＴＲ－１９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４２を調製するために、転写tRNA(Glu)ucu-CA（配列番号：５７（ＴＲ－２０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４３を調製するために、転写tRNA(Glu)ccu-CA（配列番号：５８（ＴＲ－２１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４４を調製するために、転写tRNA(Glu)gca-CA（配列番号：５９（ＴＲ－２２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４５を調製するために、転写tRNA(Glu)uca-CA（配列番号：６０（ＴＲ－２３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４６を調製するために、転写tRNA(Glu)cca-CA（配列番号：６１（ＴＲ－２４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４７を調製するために、転写tRNA(Glu)gug-CA（配列番号：６３（ＴＲ－２６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４８を調製するために、転写tRNA(Glu)guu-CA（配列番号：６４（ＴＲ－２７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４９を調製するために、転写tRNA(Glu)guc-CA（配列番号：６５（ＴＲ－２８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５０を調製するために、転写tRNA(Glu)gaa-CA（配列番号：６６（ＴＲ－２９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５１を調製するために、転写tRNA(Glu)gcu-CA（配列番号：６７（ＴＲ－３０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５２を調製するために、転写tRNA(Glu)uga-CA（配列番号：６８（ＴＲ－３１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５３を調製するために、転写tRNA(Glu)ugu-CA（配列番号：６９（ＴＲ－３２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５４を調製するために、転写tRNA(Glu)uau-CA（配列番号：７０（ＴＲ－３３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５５を調製するために、転写tRNA(Ile)uau-CA（配列番号：７１（ＴＲ－３４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５６を調製するために、転写tRNA(Ile)uau-CA（配列番号：７１（ＴＲ－３４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５１）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５７を調製するために、転写tRNA(Glu)gcg-CA（配列番号：７２（ＴＲ－３５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５８を調製するために、転写tRNA(Glu)ucg-CA（配列番号：７３（ＴＲ－３６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５９を調製するために、転写tRNA(Glu)ccg-CA（配列番号：７４（ＴＲ－３７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６０を調製するために、転写tRNA(Asp)aug-CA（配列番号：２４２（ＴＲ－３８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６１を調製するために、転写tRNA(Asp)uug-CA（配列番号：２４６（ＴＲ－４２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６２を調製するために、転写tRNA(Asp)cug-CA（配列番号：２４８（ＴＲ－４４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６３を調製するために、転写tRNA(Asp)aug-CA（配列番号：２４３（ＴＲ－３９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６４を調製するために、転写tRNA(Asp)uug-CA（配列番号：２４７（ＴＲ－４３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６５を調製するために、転写tRNA(Asp)cug-CA（配列番号：２４９（ＴＲ－４５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６６を調製するために、転写tRNA(Asp)gug-CA（配列番号：２４４（ＴＲ－４０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６７を調製するために、転写tRNA(Asp)uug-CA（配列番号：２４６（ＴＲ－４２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６８を調製するために、転写tRNA(Asp)cug-CA（配列番号：２４８（ＴＲ－４４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６９を調製するために、転写tRNA(Asp)gug-CA（配列番号：２４５（ＴＲ－４１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７０を調製するために、転写tRNA(Asp)uug-CA（配列番号：２４７（ＴＲ－４３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７１を調製するために、転写tRNA(Asp)cug-CA（配列番号：２４９（ＴＲ－４５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７２を調製するために、転写tRNA(Asp)auc-CA（配列番号：２５０（ＴＲ－４６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７３を調製するために、転写tRNA(Asp)uuc-CA（配列番号：２５１（ＴＲ－４７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７４を調製するために、転写tRNA(Asp)cuc-CA（配列番号：２５２（ＴＲ－４８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７５を調製するために、転写tRNA(AsnE2)aug-CA（配列番号：２５３（ＴＲ－４９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７６を調製するために、転写tRNA(AsnE2)uug-CA（配列番号：２５５（ＴＲ－５１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７７を調製するために、転写tRNA(AsnE2)cug-CA（配列番号：２５６（ＴＲ－５２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７８を調製するために、転写tRNA(AsnE2)gug-CA（配列番号：２５４（ＴＲ－５０））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７９を調製するために、転写tRNA(AsnE2)uug-CA（配列番号：２５５（ＴＲ－５１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８０を調製するために、転写tRNA(AsnE2)cug-CA（配列番号：２５６（ＴＲ－５２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８１を調製するために、転写tRNA(AsnE2)auc-CA（配列番号：２５７（ＴＲ－５３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４８）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８２を調製するために、転写tRNA(AsnE2)uuc-CA（配列番号：２５８（ＴＲ－５４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８３を調製するために、転写tRNA(AsnE2)cuc-CA（配列番号：２５９（ＴＲ－５５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ５０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を混合し、混合物の状態で、もしくは単一の状態のまま、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－３の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－３の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５、化合物ＡＡｔＲ－６の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５、化合物ＡＡｔＲ－６の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１３、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１３、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７、化合物ＡＡｔＲ－１８の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７、化合物ＡＡｔＲ－１８の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２２、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２２、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３５、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３５、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３８、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３８、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４４、化合物ＡＡｔＲ－４５、化合物ＡＡｔＲ－４６の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４４、化合物ＡＡｔＲ－４５、化合物ＡＡｔＲ－４６の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４７、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４７、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４８、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４８、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４９、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４９、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５０、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－５０、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－５１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－５７、化合物ＡＡｔＲ－５９の2種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－５７、化合物ＡＡｔＲ－５９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６０、化合物ＡＡｔＲ－６１、化合物ＡＡｔＲ－６２の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６０、化合物ＡＡｔＲ－６１、化合物ＡＡｔＲ－６２の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６３、化合物ＡＡｔＲ－６４、化合物ＡＡｔＲ－６５の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６３、化合物ＡＡｔＲ－６４、化合物ＡＡｔＲ－６５の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６６、化合物ＡＡｔＲ－６７、化合物ＡＡｔＲ－６８の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６６、化合物ＡＡｔＲ－６７、化合物ＡＡｔＲ－６８の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６９、化合物ＡＡｔＲ－７０、化合物ＡＡｔＲ－７１の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６９、化合物ＡＡｔＲ－７０、化合物ＡＡｔＲ－７１の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７２、化合物ＡＡｔＲ－７３、化合物ＡＡｔＲ－７４の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－７２、化合物ＡＡｔＲ－７３、化合物ＡＡｔＲ－７４の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７５、化合物ＡＡｔＲ－７６、化合物ＡＡｔＲ－７７の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－７５、化合物ＡＡｔＲ－７６、化合物ＡＡｔＲ－７７の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－７８、化合物ＡＡｔＲ－７９、化合物ＡＡｔＲ－８０の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－７８、化合物ＡＡｔＲ－７９、化合物ＡＡｔＲ－８０の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－８１、化合物ＡＡｔＲ－８２、化合物ＡＡｔＲ－８３の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－８１、化合物ＡＡｔＲ－８２、化合物ＡＡｔＲ－８３の混合液）を調製した。
　以下の化合物は混合せずに精製し、調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５２のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５２を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５３のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５３を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５４のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５４を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５５のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５５を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５６のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５６を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－５８のligation産物に0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、化合物ＡＡｔＲ－５８を調製した。
アミノアシルｐＣｐＡを用いたｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡの調製
　25μM 転写tRNA(fMet)cau-CA（配列番号：６２（ＴＲ－２５）、50 mM HEPES-KOH pH7．5、20 mM MgCl2、1 mM ATP、0．6unit／μl T4 RNAリガーゼ（New england bio lab.社）、0.25 mM アミノアシル化pCpA（MT01のDMSO溶液）となるように、Nuclease free waterでメスアップした反応液を調製し、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ただし、T4 RNAリガーゼおよびアミノアシル化pCpAを加える前の反応液は、95℃で2分間加熱後、室温で5分間放置し、予めtRNAのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを0.3 Mになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出し、initiatorアミノアシルtRNA（化合物ＡＡｔＲ－２５）をエタノール沈殿により回収した。
　initiatorアミノアシル化tRNAは、翻訳混合物に添加する直前に1 mM酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１　配列番号：７５
nBuG-tRNA(Glu)aag
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
化合物ＡＡｔＲ－２　配列番号：７６
Pic2-tRNA(Glu)uag
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
化合物ＡＡｔＲ－３　配列番号：７７
dA-tRNA(Glu)cag
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
化合物ＡＡｔＲ－４　配列番号：７８
nBuG-tRNA(Glu)aac
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
化合物ＡＡｔＲ－５　配列番号：７９
Pic2-tRNA(Glu)uac
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
化合物ＡＡｔＲ－６　配列番号：８０
dA-tRNA(Glu)cac
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
化合物ＡＡｔＲ－７　配列番号：８１
nBuG-tRNA(Glu)aug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
化合物ＡＡｔＲ－８　配列番号：８２
Pic2-tRNA(Glu)uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
化合物ＡＡｔＲ－９　配列番号：８３
dA-tRNA(Glu)cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
化合物ＡＡｔＲ－１０　配列番号：８４
nBuG-tRNA(Glu)auu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
化合物ＡＡｔＲ－１１　配列番号：８５
Pic2-tRNA(Glu)uuu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
化合物ＡＡｔＲ－１２　配列番号：８６
dA-tRNA(Glu)cuu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
化合物ＡＡｔＲ－１３　配列番号：８７
nBuG-tRNA(Glu)auc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
化合物ＡＡｔＲ－１４　配列番号：８８
Pic2-tRNA(Glu)uuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
化合物ＡＡｔＲ－１５　配列番号：８９
dA-tRNA(Glu)cuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
化合物ＡＡｔＲ－１６　配列番号：９０
nBuG-tRNA(Glu)aaa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
化合物ＡＡｔＲ－１７　配列番号：９１
Pic2-tRNA(Glu)uaa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
化合物ＡＡｔＲ－１８　配列番号：９２
dA-tRNA(Glu)caa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
化合物ＡＡｔＲ－１９　配列番号：９３
nBuG-tRNA(Glu)acu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
化合物ＡＡｔＲ－２０　配列番号：９４
Pic2-tRNA(Glu)ucu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
化合物ＡＡｔＲ－２１　配列番号：９５
dA-tRNA(Glu)ccu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
化合物ＡＡｔＲ－２２　配列番号：９６
nBuG-tRNA(Glu)gca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
化合物ＡＡｔＲ－２３　配列番号：９７
Pic2-tRNA(Glu)uca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
化合物ＡＡｔＲ－２４　配列番号：９８
dA-tRNA(Glu)cca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
化合物ＡＡｔＲ－２５　配列番号：９９
BdpFL-Phe-tRNA(fMet)cau
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
化合物ＡＡｔＲ－２６　配列番号：１００
nBuG-tRNA(Glu)gug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
化合物ＡＡｔＲ－２７　配列番号：１０１
nBuG-tRNA(Glu)guu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
化合物ＡＡｔＲ－２８　配列番号：１０２
nBuG-tRNA(Glu)gcu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
化合物ＡＡｔＲ－２９　配列番号：１０３
MeA3Pr-tRNA(Glu)aug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
化合物ＡＡｔＲ－３０　配列番号：１０４
StBuOH-tRNA(Glu)uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
化合物ＡＡｔＲ－３１　配列番号：１０５
MeSnPr-tRNA(Glu)cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
化合物ＡＡｔＲ－３２　配列番号：１０６
MeA3Pr-tRNA(Glu)auu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
化合物ＡＡｔＲ－３３　配列番号：１０７
StBuOH-tRNA(Glu)uuu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
化合物ＡＡｔＲ－３４　配列番号：１０８
MeSnPr-tRNA(Glu)cuu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
化合物ＡＡｔＲ－３５　配列番号：１０９
MeA3Pr-tRNA(Glu)auc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
化合物ＡＡｔＲ－３６　配列番号：１１０
StBuOH-tRNA(Glu)uuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000072
化合物ＡＡｔＲ－３７　配列番号：１１１
MeSnPr-tRNA(Glu)cuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000073
化合物ＡＡｔＲ－３８　配列番号：１１２
MeA3Pr-tRNA(Glu)aaa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000074
化合物ＡＡｔＲ－３９　配列番号：１１３
StBuOH-tRNA(Glu)uaa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
化合物ＡＡｔＲ－４０　配列番号：１１４
MeSnPr-tRNA(Glu)caa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000076
化合物ＡＡｔＲ－４１　配列番号：１１５
MeA3Pr-tRNA(Glu)acu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000077
化合物ＡＡｔＲ－４２　配列番号：１１６
StBuOH-tRNA(Glu)ucu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000078
化合物ＡＡｔＲ－４３　配列番号：１１７
MeSnPr-tRNA(Glu)ccu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000079
化合物ＡＡｔＲ－４４　配列番号：１１８
MeA3Pr-tRNA(Glu)gca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000080
化合物ＡＡｔＲ－４５　配列番号：１１９
StBuOH-tRNA(Glu)uca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000081
化合物ＡＡｔＲ－４６　配列番号：１２０
MeSnPr-tRNA(Glu)cca
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000082
化合物ＡＡｔＲ－４７　配列番号：１２１
MeA3Pr-tRNA(Glu)gug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000083
化合物ＡＡｔＲ－４８　配列番号：１２２
MeA3Pr-tRNA(Glu)guu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000084
化合物ＡＡｔＲ－４９　配列番号：１２３
MeA3Pr-tRNA(Glu)guc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000085
化合物ＡＡｔＲ－５０　配列番号：１２４
MeA3Pr-tRNA(Glu)gaa
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000086
化合物ＡＡｔＲ－５１　配列番号：１２５
MeA3Pr-tRNA(Glu)gcu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000087
化合物ＡＡｔＲ－５２　配列番号：１２６
MeHph-tRNA(Glu)uga
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000088
化合物ＡＡｔＲ－５３　配列番号：１２７
MeHph-tRNA(Glu)ugu
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
化合物ＡＡｔＲ－５４　配列番号：１２８
MeHph-tRNA(Glu)uau
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000090
化合物ＡＡｔＲ－５５　配列番号：１２９
MeHph-tRNA(Ile2)uau
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
化合物ＡＡｔＲ－５６　配列番号：１３０
Ile-tRNA(Ile2)uau
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000092
化合物ＡＡｔＲ－５７　配列番号：１３１
nBuG-tRNA(Glu)gcg
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000093
化合物ＡＡｔＲ－５８　配列番号：１３２
SPh2Cl-tRNA(Glu)ucg
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000094
化合物ＡＡｔＲ－５９　配列番号：１３３
dA-tRNA(Glu)ccg
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000095
化合物ＡＡｔＲ－６０　配列番号：２６０
nBuGly-tRNA(Asp1)_aug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000096
化合物ＡＡｔＲ－６１　配列番号：２６１
Pic2-tRNA(Asp1)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000097
化合物ＡＡｔＲ－６２　配列番号：２６２
dA-tRNA(Asp1)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000098
化合物ＡＡｔＲ－６３　配列番号：２６３
nBuGly-tRNA(Asp1-ACL7U)_aug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
化合物ＡＡｔＲ－６４　配列番号：２６４
Pic2-tRNA(Asp1-ACL7A)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000100
化合物ＡＡｔＲ－６５　配列番号：２６５
dA-tRNA(Asp1-ACL7G)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000101
化合物ＡＡｔＲ－６６　配列番号：２６６
nBuGly-tRNA(Asp1)_gug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000102
化合物ＡＡｔＲ－６７　配列番号：２６７
Pic2-tRNA(Asp1)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000103
化合物ＡＡｔＲ－６８　配列番号：２６８
dA-tRNA(Asp1)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000104
化合物ＡＡｔＲ－６９　配列番号：２６９
nBuGly-tRNA(Asp1-ACL7C)_gug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000105
化合物ＡＡｔＲ－７０　配列番号：２７０
Pic2-tRNA(Asp1-ACL7A)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000106
化合物ＡＡｔＲ－７１　配列番号：２７１
dA-tRNA(Asp1-ACL7G)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000107
化合物ＡＡｔＲ－７２　配列番号：２７２
nBuGly-tRNA(Asp1)_auc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000108
化合物ＡＡｔＲ－７３　配列番号：２７３
Pic2-tRNA(Asp1)_uuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000109
化合物ＡＡｔＲ－７４　配列番号：２７４
nBuGly-tRNA(Asp1)_cuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000110
化合物ＡＡｔＲ－７５　配列番号：２７５
MeA3Pr-tRNA(AsnE2+ACL)_aug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000111
化合物ＡＡｔＲ－７６　配列番号：２７６
StBuOH-tRNA(AsnE2+ACL)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000112
化合物ＡＡｔＲ－７７　配列番号：２７７
MeSnPr-tRNA(AsnE2+ACL)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000113
化合物ＡＡｔＲ－７８　配列番号：２７８
MeA3Pr-tRNA(AsnE2+ACL)_gug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000114
化合物ＡＡｔＲ－７９　配列番号：２７９
StBuOH-tRNA(AsnE2+ACL)_uug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000115
化合物ＡＡｔＲ－８０　配列番号：２８０
MeSnPr-tRNA(AsnE2+ACL)_cug
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000116
化合物ＡＡｔＲ－８１　配列番号：２８１
MeA3Pr-tRNA(AsnE2+ACL)_auc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000117
化合物ＡＡｔＲ－８２　配列番号：２８２
StBuOH-tRNA(AsnE2+ACL)_uuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000118
化合物ＡＡｔＲ－８３　配列番号：２８３
MeSnPr-tRNA(AsnE2+ACL)_cuc
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000119
実施例６．ペプチドの翻訳合成
　次に、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３４（ｍＲ－１）～配列番号：１６２（ｍＲ－２９）、配列番号：２１９（ｍＲ－４２）～配列番号：２２１（ｍＲ－４４））を、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。特定のコドンボックスでは、ｗｏｂｂｌｅコドン同士を読み分け、さらにもう一つ別のコドンも同時に読み分けることができた。アミノ酸は２通りの組み合わせで検証し、いずれの条件でも、特定のコドンボックスにおいては、１コドンボックス内で３アミノ酸の読み分けが可能であることが示された。
　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１３４（ｍＲ－１）、配列番号：１３５（ｍＲ－２）、もしくは配列番号：１３６（ｍＲ－３））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１３７（ｍＲ－４），配列番号：１３８（ｍＲ－５），配列番号：１３９（ｍＲ－６））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１３７（ｍＲ－４）、配列番号：１３８（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１３９（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５、化合物ＡＡｔＲ－６の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１４０（ｍＲ－７），配列番号：１４１（ｍＲ－８），配列番号：１４２（ｍＲ－９））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１４０（ｍＲ－７）、配列番号：１４１（ｍＲ－８）、もしくは配列番号：１４２（ｍＲ－９））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６０、化合物ＡＡｔＲ－６１、化合物ＡＡｔＲ－６２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６３、化合物ＡＡｔＲ－６４、化合物ＡＡｔＲ－６５の混合液もしくは化合物ＡＡｔＲ－７５、化合物ＡＡｔＲ－７６、化合物ＡＡｔＲ－７７の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１４３（ｍＲ－１０），配列番号：１４４（ｍＲ－１１），配列番号：１４５（ｍＲ－１２））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１４３（ｍＲ－１０）、配列番号：１４４（ｍＲ－１１）、もしくは配列番号：１４５（ｍＲ－１２））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１４６（ｍＲ－１３），配列番号：１４７（ｍＲ－１４），配列番号：１４８（ｍＲ－１５））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１４６（ｍＲ－１３）、配列番号：１４７（ｍＲ－１４）、もしくは配列番号：１４８（ｍＲ－１５））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１３、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－７２、化合物ＡＡｔＲ－７３、化合物ＡＡｔＲ－７４の混合液もしくは化合物ＡＡｔＲ－８１、化合物ＡＡｔＲ－８２、化合物ＡＡｔＲ－８３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１４９（ｍＲ－１６），配列番号：１５０（ｍＲ－１７），配列番号：１５１（ｍＲ－１８））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１４９（ｍＲ－１６），配列番号：１５０（ｍＲ－１７），配列番号：１５１（ｍＲ－１８））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７、化合物ＡＡｔＲ－１８の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－３８、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５２（ｍＲ－１９），配列番号：１５３（ｍＲ－２０），配列番号：１５４（ｍＲ－２１））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５２（ｍＲ－１９）、配列番号：１５３（ｍＲ－２０）、もしくは配列番号：１５４（ｍＲ－２１））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の混合液もしくは化合物ＡＡｔＲ－４１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５５（ｍＲ－２２），配列番号：１５６（ｍＲ－２３），配列番号：１５７（ｍＲ－２４））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２５μＭ　ＲＦ１，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３４．６μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５５（ｍＲ－２２）、配列番号：１５６（ｍＲ－２３）、もしくは配列番号：１５７（ｍＲ－２４））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２２、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４の混合液もしくは化合物ＡＡｔＲ－４４、化合物ＡＡｔＲ－４５、化合物ＡＡｔＲ－４６の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５８（ｍＲ－２５），配列番号：１４１（ｍＲ－８），配列番号：１４２（ｍＲ－９））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５８（ｍＲ－２５）、配列番号：１４１（ｍＲ－８）、もしくは配列番号：１４２（ｍＲ－９））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－４７、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－３１の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６６、化合物ＡＡｔＲ－６７、化合物ＡＡｔＲ－６８の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６９、化合物ＡＡｔＲ－７０、化合物ＡＡｔＲ－７１の混合液もしくは化合物ＡＡｔＲ－７８、化合物ＡＡｔＲ－７９、化合物ＡＡｔＲ－８０の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５９（ｍＲ－２６），配列番号：１４４（ｍＲ－１１），配列番号：１４５（ｍＲ－１２））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５９（ｍＲ－２６）、配列番号：１４４（ｍＲ－１１）、もしくは配列番号：１４５（ｍＲ－１２））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１２の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－４８、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３４の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１６２（ｍＲ－２９），配列番号：１５３（ｍＲ－２０），配列番号：１５４（ｍＲ－２１））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６２（ｍＲ－２９）、配列番号：１５３（ｍＲ－２０）、もしくは配列番号：１５４（ｍＲ－２１））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２１の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１４６（ｍＲ－１３），配列番号：１４７（ｍＲ－１４），配列番号：１４８（ｍＲ－１５））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１４６（ｍＲ－１３）、配列番号：１４７（ｍＲ－１４）、もしくは配列番号：１４８（ｍＲ－１５））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３５、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５２（ｍＲ－１９），配列番号：１５３（ｍＲ－２０），配列番号：１５４（ｍＲ－２１））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５２（ｍＲ－１９）、配列番号：１５３（ｍＲ－２０）、もしくは配列番号：１５４（ｍＲ－２１））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４１、化合物ＡＡｔＲ－４２、化合物ＡＡｔＲ－４３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１５５（ｍＲ－２２），配列番号：１５６（ｍＲ－２３），配列番号：１５７（ｍＲ－２４））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２５μＭ　ＲＦ１，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３４．６μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１５５（ｍＲ－２２）、配列番号：１５６（ｍＲ－２３）、もしくは配列番号：１５７（ｍＲ－２４））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４４、化合物ＡＡｔＲ－４５、化合物ＡＡｔＲ－４６の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１６０（ｍＲ－２７），配列番号：１４７（ｍＲ－１４），配列番号：１４８（ｍＲ－１５））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６０（ｍＲ－２７）、配列番号：１４７（ｍＲ－１４）、もしくは配列番号：１４８（ｍＲ－１５））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－４９、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３７の混合液 ）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：１６１（ｍＲ－２８），配列番号：１５０（ｍＲ－１７），配列番号：１５１（ｍＲ－１８））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６１（ｍＲ－２８），配列番号：１５０（ｍＲ－１７），配列番号：１５１（ｍＲ－１８））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－５０、化合物ＡＡｔＲ－３９、化合物ＡＡｔＲ－４０の混合液 ）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　そのほかの配列（配列番号：２１９（ｍＲ－４２），配列番号：２２０（ｍＲ－４３），配列番号：２２１（ｍＲ－４４））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：２１９（ｍＲ－４２）、配列番号：２２０（ｍＲ－４３）、もしくは配列番号：２２１（ｍＲ－４４））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－５７、化合物ＡＡｔＲ－５９の混合液）を２０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－５８）を２０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　次に、アミノアシル化ｔＲＮＡの濃度に依存してコドンボックス内の読み分け効率に差が生じるか検証するため、XXAのアンチコドンをもつアミノアシルｔＲＮＡのみが翻訳系中に存在する状況で、コドンボックス内のXXAコドン以外のコドンにおけるクロスリードの割合を翻訳量で確認した。具体的には、同一コドンボックス内の4種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６３（ｍＲ－３０）～配列番号：１７４（ｍＲ－４１））を、XXAコドンのアンチコドンをもつアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－５２、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５３、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５４、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５５、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５６）を、異なる濃度条件で加え、ペプチド化合物を翻訳合成した。
　アミノアシルｔＲＮＡの濃度依存的にコドンボックス内の読み分け比率が変化することが示された。またこの現象は、ｔＲＮＡのｂｏｄｙ配列や、チャージするアミノ酸によらないことも示された。
　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６３（ｍＲ－３０）、配列番号：１６４（ｍＲ－３１）、配列番号：１６５（ｍＲ－３２）、配列番号：１６６（ｍＲ－３３））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－５２）を０．８μＭもしくは１．６μＭもしくは３．２μＭ、６．４μＭもしくは、１２．８μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　その他のコドンボックスについても同様の検証を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６７（ｍＲ－３４）、配列番号：１６８（ｍＲ－３５）、配列番号：１６９（ｍＲ－３６）、配列番号：１７０（ｍＲ－３７））それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－５３）を０．８μＭもしくは１．６μＭもしくは３．２μＭ、６．４μＭもしくは、１２．８μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　その他のコドンボックスについても同様の検証を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，３μＭ　Ａｌａ１ＢｔＲＮＡ１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．６８μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１７１（ｍＲ－３８）、配列番号：１７２（ｍＲ－３９）、配列番号：１７３（ｍＲ－４０）、配列番号：１７４（ｍＲ－４１））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２５）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－５４、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５５、もしくは化合物ＡＡｔＲ－５６）を０．８μＭもしくは１．６μＭもしくは３．２μＭ、６．４μＭもしくは、１２．８μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量に関しては、以下の表４に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000121
　鋳型ＤＮＡ（配列番号：１７５（Ｄ－３５）～配列番号：２１５（Ｄ－７５）及び配列番号：２１６（Ｄ－７９）～配列番号：２１８（Ｄ－８１））から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１３４（ｍＲ－１）～配列番号：１７４（ｍＲ－４１）、配列番号：２１９（ｍＲ－４２）～配列番号：２２１（ｍＲ－４４））を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７５（Ｄ－３５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７６（Ｄ－３６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７７（Ｄ－３７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７８（Ｄ－３８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１７９（Ｄ－３９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８０（Ｄ－４０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８１（Ｄ－４１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCATATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８２（Ｄ－４２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCAAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８３（Ｄ－４３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCAGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８４（Ｄ－４４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTAATATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８５（Ｄ－４５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTAAAATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８６（Ｄ－４６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTAAGATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８７（Ｄ－４７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCATATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８８（Ｄ－４８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCAAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１８９（Ｄ－４９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCAGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９０（Ｄ－５０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTGTTATTATTGGTGTTTTTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９１（Ｄ－５１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTGTTATTATTGGTGTTTTAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９２（Ｄ－５２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTGTTATTATTGGTGTTTTGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９３（Ｄ－５３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTAGTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９４（Ｄ－５４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTAGAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９５（Ｄ－５５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTAGGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９６（Ｄ－５６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTTGCATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９７（Ｄ－５７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTTGAATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９８（Ｄ－５８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTTGGATTATTCCGATTCTATAAGCTTC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１９９（Ｄ－５９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCACATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２００（Ｄ－６０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTAACATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０１（Ｄ－６１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTGACATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０２（Ｄ－６２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTGTTATTATTGGTGTTTTCATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０３（Ｄ－６３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTAGCATTATTCCGATTCTATAAGCTTC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０４（Ｄ－６４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０５（Ｄ－６５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCCATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０６（Ｄ－６６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０７（Ｄ－６７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０８（Ｄ－６８）
ＤＮＡ配列：
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２０９（Ｄ－６９）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１０（Ｄ－７０）
ＤＮＡ配列：
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１１（Ｄ－７１）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１２（Ｄ－７２）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１３（Ｄ－７３）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１４（Ｄ－７４）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１６（Ｄ－７９）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１７（Ｄ－８０）
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鋳型ＤＮＡ　配列番号：２１８（Ｄ－８１）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３６（ｍＲ－３）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３７（ｍＲ－４）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３８（ｍＲ－５）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３９（ｍＲ－６）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４０（ｍＲ－７）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４１（ｍＲ－８）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４２（ｍＲ－９）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４３（ｍＲ－１０）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４４（ｍＲ－１１）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４５（ｍＲ－１２）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４６（ｍＲ－１３）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４７（ｍＲ－１４）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４８（ｍＲ－１５）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１４９（ｍＲ－１６）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５０（ｍＲ－１７）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５１（ｍＲ－１８）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５２（ｍＲ－１９）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５３（ｍＲ－２０）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５４（ｍＲ－２１）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５５（ｍＲ－２２）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５６（ｍＲ－２３）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５７（ｍＲ－２４）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５８（ｍＲ－２５）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１５９（ｍＲ－２６）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６０（ｍＲ－２７）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６１（ｍＲ－２８）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６３（ｍＲ－３０）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６４（ｍＲ－３１）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６５（ｍＲ－３２）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６６（ｍＲ－３３）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６８（ｍＲ－３５）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６９（ｍＲ－３６）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７０（ｍＲ－３７）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７１（ｍＲ－３８）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７２（ｍＲ－３９）
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７３（ｍＲ－４０）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７４（ｍＲ－４１）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：２１９（ｍＲ－４２）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：２２０（ｍＲ－４３）
ＲＮＡ配列：
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鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：２２１（ｍＲ－４４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCGGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
実施例７．翻訳ペプチドの分析
　実施例６にて調製した非天然ペプチド翻訳溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳ペプチドの保持時間を同定し、該当保持時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例４にて合成したLCT12、もしくは実施例３にて合成したLCT067を標品とし検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の表５の条件に従い、対象となるサンプルに応じて最適な条件を選択して分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000122
　評価した結果を表６～表３３、図１～図２８に示す。試したコドンボックスのうち、ＣＵＸおよびＧＵＸでは、クロスリードによって目的外のアミノ酸がやや多く翻訳され、十分な読み分け効果は観察されなかった（表６～表７、図１～図２）。一方、それら以外のコドンボックスではいずれも3種類のコドンに対応した特異的なアミノ酸の翻訳が観察され、十分な読み分け効果が確認された。なお、ｔＲＮＡボディー（アンチコドン以外の配列部分）を変更しても、同様の効果が得られることが確認された。（表８～表２８－９、図３～図２３－９）。また、翻訳系中に添加するｔＲＮＡの濃度を増大させると、目的のペプチドおよびクロスリードの翻訳量がともに増加するが、その増加の割合は互いに異なる可能性が示唆された（表２９～表３３、図２４～図２８）。このことから、ｔＲＮＡ濃度の至適な条件（クロスリードに比べて目的のペプチドがより効率よく翻訳され得る条件）を設定することも可能と考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＵＵ，ＧＵＡ，ＧＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＡＵ，ＡＡＡ，ＡＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000127
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000128
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＵＵ，ＵＵＡ，ＵＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000129
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＧＵ，ＡＧＡ，ＡＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000130
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＧＣ，ＵＧＡ，ＵＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000131
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000132
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＡＣ，ＡＡＡ，ＡＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000133
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＧＣ，ＡＧＡ，ＡＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000134
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000135
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＡＵ，ＡＡＡ，ＡＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000136
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000137
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＵＵ，ＵＵＡ，ＵＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000138
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＧＵ，ＡＧＡ，ＡＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000139
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＧＣ，ＵＧＡ，ＵＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000140
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000141
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＡＣ，ＡＡＡ，ＡＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000142
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＡＣ，ＧＡＡ，ＧＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000143
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＵＣ，ＵＵＡ，ＵＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000144
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＧＣ，ＡＧＡ，ＡＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000145
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＧＵ，ＣＧＡ，ＣＧＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000146
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000147
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000148
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000149
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000150
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000151
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＵ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000152
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000153
 １コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＡＵ，ＧＡＡ，ＧＡＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000154
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証した結果の表である（評価したコドン：ＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000155
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証し、目的産物量との比率算出した結果の表である（評価したコドン：ＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000156
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証した結果の表である（評価したコドン：ＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000157
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証し、目的産物量との比率算出した結果の表である（評価したコドン：ＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000158
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000159
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証し、目的産物量との比率算出した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000160
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000161
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証し、目的産物量との比率算出した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000162
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000163
 単一コドンに対するアミノアシル化ｔＲＮＡ濃度依存的な、目的産物および同コドンボックス内のクロスリード翻訳物の翻訳量の変化を、翻訳実験で検証し、目的産物量との比率算出した結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＣ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
　一態様において、本開示のtRNAは、天然の遺伝暗号表では読み分けられていないNNAのコドンとNNGのコドン、NNUのコドンとNNAのコドンとNNGのコドン、およびNNCのコドンとNNAのコドンとNNGのコドンの読み分けが可能である点で有用である。一態様において、本開示の翻訳系は、天然の遺伝暗号表を用いた翻訳系よりも多くの種類のアミノ酸を翻訳すること（コドン拡張）が可能である点で有用である。

Claims (26)

  1. 　M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAおよびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む翻訳系であって、
    　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され、
    　前記2種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、翻訳系。
  2. 　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも2種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、請求項１に記載の翻訳系。
  3. 　（ｉ）M1M2Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、または、
    　（ｉｉ）M1M2Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを含む翻訳系であって、
    　M1およびM2はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M1およびM2はそれぞれ独立にアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択され、
    　前記（ｉ）および（ｉｉ）における3種類のtRNAにはそれぞれ互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、翻訳系。
  4. 　M1M2U、M1M2C、M1M2A、およびM1M2Gによって構成されるコドンボックスから、少なくとも3種類のアミノ酸またはアミノ酸類縁体が翻訳可能である、請求項１または３に記載の翻訳系。
  5. 　M1およびM2が以下の（i）から(x)のいずれかである、請求項１から４のいずれか一項に記載の翻訳系：
    　（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
    　（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がアデノシン(A)である、
    　（iii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
    　（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
    　（v） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
    　（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がウリジン(U)である、
    　（vii） M1がアデノシン(A)であり、M2がシチジン(C)である、
    　（viii） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
    　（ix） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
    　（x） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
  6. 　M1およびM2が以下の（i）から(vii)のいずれかである、請求項５に記載の翻訳系:
    　（i） M1がウリジン(U)であり、M2がウリジン(U)である、
    　（ii） M1がウリジン(U)であり、M2がグアノシン(G)である、
    　（iii） M1がシチジン(C)であり、M2がアデノシン(A)である、
    　（iv） M1がシチジン(C)であり、M2がグアノシン(G)である、
    　（v） M1がアデノシン(A)であり、M2がアデノシン(A)である、
    　（vi） M1がアデノシン(A)であり、M2がグアノシン(G)である、または
    　（vii） M1がグアノシン(G)であり、M2がアデノシン(A)である。
  7. 　前記翻訳系に含まれる前記tRNAの一コドンあたりの濃度が、（i）0.8～1000 μM、（ii）1.6～500 μM、（iii）3.2～250 μM、（iv）6.4～150 μM、または（v）10～100 μMのいずれかである、請求項１から６のいずれか一項に記載の翻訳系。
  8. 　前記アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、請求項１から７のいずれか一項に記載の翻訳系。
  9. 　前記tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAである、請求項１から８のいずれか一項に記載の翻訳系。
  10. 　前記tRNAが原核生物由来または真核生物由来のtRNAである、請求項１から９のいずれか一項に記載の翻訳系。
  11. 　前記アンチコドンが、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、またはウリジン(U)のいずれか1種または複数種のヌクレオシドを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の翻訳系。
  12. 　一つの遺伝暗号表から、20種類より多くのアミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の翻訳系。
  13. 　無細胞翻訳系である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の翻訳系。
  14. 　再構成型の無細胞翻訳系である、請求項１３に記載の翻訳系。
  15. 　大腸菌由来のリボソームを含む、請求項１３または１４に記載の翻訳系。
  16. 　前記tRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の翻訳系。
  17. 　前記tRNAのうち、M1M2Aで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA、およびM1M2Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAが、翻訳系外で前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体と結合されたものである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の翻訳系。
  18. 　前記tRNAが、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法によって得られるものである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の翻訳系。
  19. 　請求項１から１８のいずれか一項に記載の翻訳系の製造方法であって、前記アミノ酸またはアミノ酸類縁体を翻訳系外でtRNAに結合させることを含む、方法。
  20. 　前記翻訳系外でのアミノ酸またはアミノ酸類縁体のtRNAへの結合が、pCpA法、pdCpA法、人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いた方法、またはアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いた方法による、請求項１９に記載の翻訳系の製造方法。
  21. 　請求項１から１８のいずれか一項に記載の翻訳系または請求項１９もしくは２０に記載の方法によって得られる翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
  22. 　ペプチドが環状部を有するペプチドである、請求項２１に記載の方法。
  23. 　請求項２１または２２に記載の方法により製造されたペプチド。
  24. 　請求項１から１８のいずれか一項に記載の翻訳系または請求項１９もしくは２０に記載の方法によって得られる翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む、ペプチドライブラリーの製造方法。
  25. 　請求項２４に記載の方法により製造されたペプチドライブラリー。
  26. 　請求項２５に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む、当該標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法。
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