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WO2021117848A1 - 非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法 - Google Patents

非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法 Download PDF

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WO2021117848A1
WO2021117848A1 PCT/JP2020/046213 JP2020046213W WO2021117848A1 WO 2021117848 A1 WO2021117848 A1 WO 2021117848A1 JP 2020046213 W JP2020046213 W JP 2020046213W WO 2021117848 A1 WO2021117848 A1 WO 2021117848A1
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WO
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amino acid
peptide
protein
ribosome
translation
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2020/046213
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English (en)
French (fr)
Inventor
早貴子 吉井
康一郎 下村
聡 石野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US17/783,076 priority patent/US20230069218A1/en
Priority to KR1020227022165A priority patent/KR20220113729A/ko
Priority to JP2021564050A priority patent/JP7267458B2/ja
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a peptide containing an unnatural amino acid or a method for producing a library containing the peptide.
  • the present invention also relates to a modified L31 protein or the like for use in the method.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Several methods for synthesizing peptides containing unnatural amino acids using a translation system have been reported (Non-Patent Documents 1 and 2). However, the methods described in these documents have low efficiency in translational synthesis.
  • peptides are synthesized by polymerizing amino acids according to the base sequence information of mRNA.
  • the process of synthesizing this peptide is called translation.
  • Ribosomes play a central role in the translation process. Purified ribosomes are usually added to the cell-free translation system used to prepare the mRNA display library.
  • the L31 protein is known as a protein that constitutes the ribosome.
  • the L31 protein is a protein that forms the intersubunit Bridge B1b, and has a role of stabilizing the association state (70S) between 30S and 50S (Non-Patent Document 3).
  • the L31 protein is known to be degraded by protease 7 during its purification. Comparing these activities of ribosomes prepared from wild Escherichia coli strains, ribosomes prepared from protease7-deficient protease7KO strains, and ribosomes prepared from L31protein-deficient L31KO strains, from protease7-deficient strains It has been reported that the prepared ribosome has a higher activity than the ribosome prepared from the wild-type strain of Escherichia coli and the ribosome prepared from the L31-deficient strain (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 It has also been reported that ribosomes prepared from L31-deficient strains have a 38% reduction in initiation rate in vivo and a slower formation rate of 70S in vitro. Furthermore, it has been reported that Fidelity is lowered in L31-deficient strains (Non-Patent Document 4). Thus, in the translation of peptides consisting of natural amino acids, ribosomes containing L31 protein that have not been degraded by protease 7 have greater activity than ribosomes containing cleaved L31 protein and ribosomes not containing L31 protein. Was known.
  • An object of the present invention is to provide, in one aspect, an efficient method for producing a peptide containing an unnatural amino acid, a modified L31 protein for use in the method, and a ribosome containing the same.
  • the present inventors include a ribosome containing an L31 protein that has not been degraded by protease 7 and a ribosome containing an L31 protein cleaved by protease 7. Attempts were made to see if there was a difference in mRNA translation efficiency between the two. As a result, when translating mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid by the Initiation Suppression (iSP) method, the present inventors use a ribosome containing the L31 protein cleaved by protease 7 to generate a protease.
  • iSP Initiation Suppression
  • a method for producing a peptide which comprises a step of translating an mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein.
  • the method wherein the ribosome containing the modified L31 protein has greater translational activity of the peptide containing the unnatural amino acid than the ribosome containing the Escherichia coli wild-type L31 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a method for producing a peptide which comprises a step of translating mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein.
  • the modified L31 protein is selected from the group consisting of the proteins according to (1) to (3) below.
  • a method for producing a peptide which comprises a step of translating mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein.
  • the modified L31 protein is selected from the group consisting of the proteins according to (1) to (3) below.
  • the amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal according to the above (1) is an amino acid sequence in which 8 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal [2] or. The method according to [3].
  • [5] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described in (1) above, the amino acid sequence in which 8 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal consists of SEQ ID NOs: 2 and 42 to 48.
  • [6] Translation of peptides containing unnatural amino acids, as compared to ribosomes containing Escherichia coli wild-type L31 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the ribosomes containing the proteins according to (2) and (3) above. The method according to any one of [2] to [5], which has a high activity.
  • the ribosome containing the protein according to (1) above has a higher translational activity of the peptide containing an unnatural amino acid than the ribosome containing Escherichia coli wild-type L31 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 2] The method according to any one of [6]. [8] Any of [2] to [7], wherein the amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal is an amino acid sequence in which 6 to 50 amino acid residues are deleted from the C-terminal. The method described in C-terminal.
  • the modified L31 protein is a protein consisting of an amino acid sequence in which 8 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [1] to [11].
  • the method described in. [14] The method according to any one of [1] to [13], wherein the ratio of ribosomes containing the modified L31 protein to all ribosomes in the translation system is 50% or more.
  • [23] A peptide produced by the method according to any one of [1] to [22] or a library containing the peptide.
  • a method for screening a peptide that binds to a target substance which comprises the steps described in (a) and (b) below; (A) The step of bringing the target substance into contact with the peptide obtained by the method according to any one of [1] to [22] or the library containing the peptide, or the peptide or library described in [23]. (B) A step of selecting a peptide that binds to the target substance.
  • the modified L31 protein according to any one of [2] to [24].
  • [26] The modified L31 protein described in [25] (excluding the L31 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2).
  • [27] An isolated nucleic acid encoding the modified L31 protein according to [25] or [26].
  • [28] A vector or cell containing the nucleic acid according to [27].
  • a method for producing a ribosome containing a modified L31 protein which comprises the steps described in (a) to (c) below; (A) The step of culturing the cells according to [28]. (B) A step of producing a lysate from the culture of the cells, and (c) a step of purifying ribosomes from the lysate.
  • a method for producing a modified L31 protein which comprises the steps described in (a) and (b) below; (A) The step of culturing the cell according to [28], and (b) the step of isolating the expression product from the culture of the cell.
  • a method for producing a ribosome which comprises the steps described in (a) and (b) below; (A) A step of producing a lysate from a culture of wild-type Escherichia coli using a French press under a condition where the magnesium ion concentration is 5 mM or less, and (B) A step of purifying ribosomes from the lysate.
  • a ribosome comprising the modified L31 protein according to [25] or [26].
  • the composition according to [34] The composition according to [33], wherein the ratio of ribosomes containing the modified L31 protein to all ribosomes is 50% or more.
  • composition according to any one of [33] to [35], further comprising an initiating tRNA in which an unnatural amino acid is acylated.
  • a method for producing a cell-free translation system which comprises the following steps; (A) A step of producing a ribosome by the method according to [29] or [31], and (b) a step of mixing the ribosome with an initiating tRNA in which an unnatural amino acid is acylated.
  • the present invention provides an efficient method for producing a peptide containing an unnatural amino acid and a library containing the peptide.
  • the present invention also provides a modified L31 protein for use in this method and a ribosome containing it.
  • peptides containing unnatural amino acids and libraries thereof can be efficiently produced.
  • ribosomes containing the L31 protein cleaved by protease 7 are inferior in activity to ribosomes containing the uncleaved L31 protein.
  • the present invention comprises the step of translating mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein, a method for producing a peptide or peptide library.
  • a peptide or a library of peptides is produced by mixing a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein and mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids. be able to.
  • the present invention comprises a step of mixing a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein and an mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids and translating the mRNA.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide library.
  • the production method of the present invention efficiently uses a peptide containing an unnatural amino acid as compared with the case of using a ribosome containing a wild-type L31 protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 derived from Escherichia coli wild-type. It is a method that can be translated.
  • the L31 protein is one of the proteins constituting the ribosome and plays an important role in the association of the 50S subunit and the 30S subunit.
  • the present inventors are a translation system containing a ribosome containing a modified L31 protein in which the amino acid residue on the C-terminal side is deleted in the wild type L31 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 derived from the wild type of Escherichia coli.
  • SEQ ID NO: 1 derived from the wild type of Escherichia coli.
  • Escherichia coli wild-type L31 protein refers to L31 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is referred to as “E. coli wild-type L31", “intact L31", “L31 intact” and the like. In some cases.
  • modified L31 protein refers to "modified L31 protein in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in Escherichia coli wild-type L31 protein". In the present specification, among such proteins, "a modified L31 protein in which the amino acid residue after the 63rd amino acid residue is deleted in the Escherichia coli wild-type L31 protein", specifically, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • L31 having the above may be referred to as “short L31", “L31 short”, or the like.
  • a modified L31 protein lacking the (X + 1) th and subsequent amino acid residues in the Escherichia coli wild-type L31 protein may be referred to as "L31 (1-X)”. That is, the short L31 is also referred to as “L31 (1-62)”.
  • a ribosome containing a certain L31 protein may be described by adding "ribosome" after the name of the L31 protein.
  • ribosomes purified from Escherichia coli wild-type strains may be referred to as "WT ribosomes" or the like.
  • the modified L31 protein (1) A protein containing an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (2) A protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are inserted, substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence of the protein according to (1) above. (3) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of the protein according to (1) above. Can be exemplified.
  • the protein of (1) is a protein containing an amino acid sequence in which 8 or more amino acid residues or 9 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Also, for example, the lower limit value selected from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13 from the C-terminal, and 50, 49, 48, 47. Amino acids lacking the number of amino acid residues within the upper limit range selected from 4, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38 Examples include proteins containing sequences. Further, in one embodiment, the protein of (1) is any number in the range of 6 to 50 from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in the range of 6 to 43.
  • any number of amino acid residues in the range of 8 to 50, any number of amino acids in the range of 8 to 43, or any number of amino acid residues in the range of 8 to 43 was deleted.
  • a protein containing an amino acid sequence can be mentioned.
  • the protein of the above (1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 10, 11, 12, and 13 from the C-terminal. , 14, 15, 16, 17, 18, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 27, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, Examples include proteins containing amino acid sequences lacking 47, 48, 49, or 50 amino acid residues.
  • the modified L31 protein in the present disclosure includes 8, 43, 38, 33, 28, 23, etc. from the C-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Included are proteins containing amino acid sequences lacking 18 or 13 amino acids and proteins in which amino acid residues have been modified (deleted, substituted, and / or inserted) in these proteins. That is, the modified L31 protein in the present disclosure includes (1) A protein containing an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NO: 2 and 42 to 48.
  • the modified L31 protein of the present invention is preferably a protein functionally equivalent to any of SEQ ID NO: 2 and 42-48, or the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • “includes” means both “includes” and "consists of”.
  • the modified L31 protein of the present disclosure comprises an amino acid sequence lacking 6 or more or 8 or more amino acid residues from the C-terminus in (i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of a protein comprising, or (ii) a protein comprising an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 and 42-48, one or more (eg, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7). 6 or less, 5 or less, 4 or less, or 3 or less, or 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more than 10) And / or a protein containing the added amino acid sequence.
  • Amino acid additions, deletions, substitutions, and / or insertions can be performed by methods known in the art. For example, a site-directed mutagenesis method (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985)) or Overlap extension PCR is performed on a nucleic acid encoding an amino acid sequence. Can be done. These may be carried out individually or in combination as appropriate.
  • one or more in a protein do not affect the function of the peptide or of the original protein. It is known to even enhance functionality.
  • Amino acids include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, depending on the characteristics of their side chains. , G, H, K, S, T).
  • the side chains of amino acids are aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), side chains containing hydroxyl groups (S, T, Y), and side chains containing sulfur atoms (C, M).
  • Side chains containing carboxylic acids and amides D, N, E, Q
  • side chains containing bases R, K, H
  • side chains containing aromatics H, F, Y, W
  • the modified L31 protein of the present invention is a non-conservative modification as long as it is functionally equivalent to any of SEQ ID NOs: 2 and 42 to 48, or a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. May also be included.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence in which 6 or more or 8 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal, or SEQ ID NOs: 1, 2, and Proteins comprising an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence represented by any of 42-48 are also included in the modified L31 protein in the present disclosure.
  • high identity means at least 50% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more in the entire amino acid sequence or the entire base sequence.
  • ribosome containing the modified L31 protein is from the C-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with respect to the translation of the mRNA encoding the peptide containing the unnatural amino acid. It means that it exhibits translational activity equivalent to that of a ribosome containing an L31 protein consisting of an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted (for example, the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 2 and 42 to 48). ..
  • a ribosome containing a protein has an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, SEQ ID NO: 2 and 42 to 48).
  • a protein is "with SEQ ID NO: 1" when it has comparable activity in translating mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid as compared to a ribosome containing the L31 protein consisting of the described amino acid sequence).
  • Functionally equivalent to an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the represented amino acid sequence for example, a protein consisting of the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NO: 2 and 42 to 48).
  • the present inventors have described an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, SEQ ID NO: 2 and 42 to 48).
  • the ribosome containing the L31 protein containing (amino acid sequence) has a higher translational activity of the mRNA encoding the peptide containing an unnatural amino acid than the ribosome containing the L31 protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Clarified.
  • a ribosome containing a protein has a higher translational activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid as compared to a ribosome containing the L31 protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the protein is derived from "an amino acid sequence in which 6 or more amino acid residues are deleted from the C-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NO: 2 and 42 to 48). It can be said that the protein is functionally equivalent to the protein.
  • a protein when a protein constructs a ribosome, it exhibits translational activity of mRNA encoding a peptide containing a large unnatural amino acid relative to the ribosome as compared to the L31 protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the protein was "in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in one of the amino acid sequences lacking 6 or more amino acid residues from the C-terminus (eg, SEQ ID NO: 2 and 42-48). It can be said that the protein is functionally equivalent to the protein consisting of the described amino acid sequence).
  • translational activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid can also be expressed as "translation efficiency of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid", and specifically, an unnatural amino acid. Includes the ease of uptake of tRNA with, the degree of skipping of codons encoding unnatural amino acids, the amount of peptide translations, and / or the amount of by-products produced.
  • “high translation activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid” can also be expressed as "high translation efficiency of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid”. This means that tRNA having an unnatural amino acid is easily taken up, the codon encoding the unnatural amino acid is less skipped, the amount of the target peptide produced is large, and / or the amount of by-product produced is small.
  • the "translational activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid” in the present disclosure can be evaluated using the ratio of translation products in which amino acids are skipped to all translation products as an index.
  • the starting amino acid is skipped and the peptide translated from the amino acid of the second character starting (referred to as "1iRT” in the present disclosure) and
  • the initiation read-through (iRT) peptide such as a peptide in which the starting amino acid and the starting 2nd character amino acid are skipped and translated from the starting 3rd character amino acid (referred to as "2iRT” in the present disclosure).
  • the "iRT ratio” calculated by the following formula from the concentration of initiation read-through (iRT) and target product (TM) is adopted as "translational activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid". it can.
  • the "iRT total concentration” in the formula can be calculated as the total value of 1iRT (peptide whose translation started from the 2nd character starting) and 2iRT (peptide whose translation started from the 3rd character starting).
  • iRT ratio (iRT total concentration [nM]) / (iRT total concentration [nM] + TM concentration [nM]) ⁇ 100
  • the iRT ratio can be evaluated by the method described in the examples using the aminoacyl-tRNA described in the examples, the translation system, or the like.
  • “Activity" can be evaluated.
  • the translation activity of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid is high can mean that the iRT ratio is low.
  • the translational activity of the peptide containing the unnatural amino acid is greater, for example, "E. coli containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” It can mean that the iRT ratio of ribosomes containing the modified L31 protein of the present disclosure is 15%, 20%, 25%, or 30% or more lower than the iRT ratio of ribosomes containing wild-type L31. ..
  • the prokaryotic ribosome contains a large subunit of 50S and a small subunit of 30S.
  • the 50S subunit is further composed of 23S rRNA and 5S rRNA as well as multiple proteins.
  • the 30S subunit is composed of 16S rRNA and a plurality of proteins.
  • Eukaryotic ribosomes contain a large subunit of 60S and a small subunit of 40S.
  • the 60S subunit is further composed of 28S rRNA, 5.8S rRNA and 5S rRNA and multiple proteins.
  • the 40S subunit is composed of 18S rRNA and a plurality of proteins. Ribosome constituents are known to those of skill in the art.
  • amino acids constituting peptides include “natural amino acids” such as ⁇ -amino acids and "unnatural amino acids” such as ⁇ -amino acids and ⁇ -amino acids.
  • the three-dimensional structure of the amino acid may be either an L-type amino acid or a D-type amino acid.
  • amino acid residue amino acid residue
  • natural amino acid residue amino acid residue
  • unnatural amino acid residue amino acid residue
  • the natural amino acids are the following 20 ⁇ -amino acids: glycine (Gly), alanine (Ala), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine ( Ile), Phenylalanine (Phe), Tyrosine (Tyr), Tryptophan (Trp), Histidine (His), Glutamic acid (Glu), Aspartic acid (Asp), Glutamine (Gln), Asparagin (Asn), Cysteine (Cys), Methionine It consists of (Met), lysine (Lys), arginine (Arg), and proline (Pro).
  • the above-mentioned 20 kinds of amino acids minus any one or more kinds of amino acids may be used as the natural amino acids in the present disclosure.
  • the natural amino acid consists of 19 types of amino acids excluding isoleucine.
  • the natural amino acid consists of 19 different amino acids except methionine.
  • the natural amino acid consists of 18 amino acids except isoleucine and methionine. Natural amino acids are usually L-type amino acids.
  • unnatural amino acids refer to all amino acids except the natural amino acids consisting of the above 20 types of ⁇ -amino acids.
  • unnatural amino acids are ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, D-type amino acids, ⁇ -amino acids having different side chains from natural amino acids, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, and amino acids in which the amino group in the main chain has a substituent. (N-substituted amino acid) and the like can be mentioned.
  • the side chain of the unnatural amino acid is not particularly limited, but may have, for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl and the like in addition to the hydrogen atom.
  • two side chains may form a ring.
  • these side chains may have one or more substituents.
  • the substituent can be selected from any functional group, including a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • Trifluoromethyl difluoromethyl, fluoromethyl, pentafluoroethyl, tetrafluoroethyl, trifluoroethyl, difluoroethyl, fluoroethyl, trichloromethyl, dichloromethyl, chloromethyl, pentachloroethyl, tetrachloroethyl, trichloroethyl, dichloroethyl , Chloroethyl and the like.
  • C5-C10 aryl C1-C6 alkyl having a substituent means “C5-C10 aryl C1-C6 alkyl” in which at least one hydrogen atom in aryl and / or alkyl is substituted with a substituent.
  • “having two or more substituents” means that a certain functional group (for example, a functional group containing an S atom) is used as a substituent, and the functional group is another substituent (for example, amino or halogen). It also includes having a substituent (such as).
  • WO2013 / 100132 and WO2018 / 143145 can also be referred to.
  • Amino groups of the backbone of the non-natural amino acids may also unsubstituted amino group (NH 2 group) or a substituted amino group (NHR group).
  • R represents alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl which may have a substituent.
  • a carbon chain bonded to the N atom of the amino group of the main chain and a carbon atom at the ⁇ -position, such as proline, may form a ring.
  • alkyl substitutions of amino groups include N-methylation, N-ethylation, N-propylation, N-butylation and the like, and examples of aralkyl substitutions include N-benzylation and the like.
  • N-methyl amino acids include N-methylalanine, N-methylglycine, N-methylphenylalanine, N-methyltyrosine, N-methyl-3-chlorophenylalanine, N-methyl-4-chlorophenylalanine, Examples thereof include N-methyl-4-methoxyphenylalanine, N-methyl-4-thiazolealanine, N-methylhistidine, N-methylserine, and N-methylaspartic acid.
  • substituent containing a halogen examples include an alkyl group having a halogen as a substituent, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group and the like. Examples thereof include difluoroalkyl and trifluoroalkyl.
  • oxy examples include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • Examples of carbonyloxy include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like. ..
  • carbonylthio examples include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like. ..
  • Examples of carbonylamino include alkylcarbonylamino, cycloalkylcarbonylamino, alkenylcarbonylamino, alkynylcarbonylamino, arylcarbonylamino, heteroarylcarbonylamino, aralkylcarbonylamino and the like. ..
  • Examples of oxycarbonylamino include alkoxycarbonylamino, cycloalkoxycarbonylamino, alkenyloxycarbonylamino, alkynyloxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, heteroaryloxycarbonylamino, and aralkyloxy. Examples include carbonylamino.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • H atom bonded to the N atom in the -NH-SO 2 -R is alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, include other substituents aralkyl.
  • aminosulfonyl (-SO 2 -NHR), alkylaminosulfonyl, cycloalkyl aminosulfonyl, alkenyl aminosulfonyl, alkynyl aminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroaryl, aminosulfonyl, and the like aralkylaminosulfonlyaryl is.
  • H atom bonded to the N atom in the -SO 2 -NHR alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl include other substituents aralkyl.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenyl sulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero.
  • Aryl sulfamoyl amino, alkyne sulfamoyl amino and the like can be mentioned.
  • the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2- NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • thio examples include alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio and the like.
  • sulfinyl examples include alkylsulfinyl, cycloalkylsulfinyl, alkenylsulfinyl, alkynylsulfinyl, arylsulfinyl, heteroarylsulfinyl, aralkylsulfinyl and the like.
  • Examples of the sulfonyl (-S (O) 2- R) include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl and the like.
  • Examples of the secondary amino (-NH-R) include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • alkyl (aralkyl) amino and the like are independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl and the like.
  • Amino groups having any two substituents may be mentioned, and these any two substituents may form a ring.
  • the three substituents R, R', and R'' on the N atom are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , Heteroaryl, groups independently selected from aralkyl, for example, alkyl (aralkyl) (aryl) amidino and the like.
  • substituted guanidinos include R, R', R', and R''' as alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl. , Aryl, heteroaryl, groups independently selected from alkynes, or groups in which these form a ring, and the like can be mentioned.
  • R, R', and R'' are hydrogen atoms, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl. Examples thereof include groups independently selected from the group, or groups forming a ring.
  • substituent containing a B atom examples include boron (-BR (R')) and dioxyboryl (-B (OR) (OR')). These two substituents R and R'are independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc., or they may form a ring. ..
  • At least one atom constituting the "amino acid” constituting the peptide may be an atom (isotope) having the same atomic number (proton number) but different mass number (sum of protons and neutrons).
  • isotopes contained in the "amino acid" constituting the peptide is a hydrogen atom, a carbon atom, a nitrogen atom, an oxygen atom, a phosphorus atom, a sulfur atom, a fluorine atom, include a chlorine atom, respectively, 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl and the like are included.
  • halogen atom examples include F, Cl, Br or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and refers to a hetero atom (an atom other than a carbon and a hydrogen atom) in the skeleton. ) Or has a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures that do not contain unsaturated carbon-carbon bonds and contain hydrogen and carbon atoms.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Specifically, the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1- C 20 , hereinafter, "C p- C q " means that the number of carbon atoms is p to q).
  • alkyl preferably C 1 -C 10 alkyl, or more preferably C 1 -C 6 alkyl.
  • alkyl specifically, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, s-pentyl (1-pentyl).
  • Methylbutyl t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • Alkenyl as used herein, is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP 2 carbon atoms). Depending on the arrangement of the double bond and the substitution (if any), the geometry of the double bond can be in the Chrysler (E) or tuzanmen (Z), cis or trans arrangement. Alkenyl includes not only linear ones but also branched chain ones.
  • C 2 -C 10 alkenyl alkenyl more preferably include C 2 -C 6 alkenyl, specifically, for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • C 2 -C 6 alkenyl specifically, for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms).
  • Alkynyls include not only linear ones but also branched chain ones.
  • C 2 -C 10 alkynyl as alkynyl more preferably include C 2 -C 6 alkynyl, specifically, for example, ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl -2-Propynyl, 3- (2'-fluorophenyl) -2-propynyl, 2-hydroxy-2-propynyl, 3- (3-fluorophenyl) -2-propynyl, 3-methyl- (5-phenyl)- 4-Pentynyl and the like can be mentioned.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • a monocyclic ring Preferably include C 3 -C 8 cycloalkyl the cycloalkyl, specifically, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, spiro [ 3.3] Heptyl and the like can be mentioned.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C 6- C 10 aryl. Specific examples of the aryl include phenyl and naphthyl (for example, 1-naphthyl and 2-naphthyl).
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the ring may be a single ring, a fused ring with another ring, or may be partially saturated.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10-membered heteroaryl), and more preferably 5 to 7 (5 to 7-membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include frill, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridadinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl , Benzothia zolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzoxaziazolyl, benzoimidazolyl, indyl, isoindrill, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodiaxolyl, indridinyl, imidazolypyridyl,
  • Alkoxy as used herein, means an oxy group "alkyl” is bonded defined above, with preference given to C 1 -C 6 alkoxy. Specific examples of the alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, 3-methylbutoxy and the like.
  • alkenyloxy as used herein means an oxy group "alkenyl” is bonded defined above, with preference given to C 2 -C 6 alkenyloxy.
  • alkenyloxy include vinyloxy, allyloxy, 1-propenyloxy, 2-propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy (including cis and trans), 3-butenyloxy, pentenyloxy, and hexenyloxy. Can be mentioned.
  • cycloalkoxy as used herein, means an oxy group "cycloalkyl" is bonded defined above, with preference given to C 3 -C 8 cycloalkoxy. Specific examples of cycloalkoxy include cyclopropoxy, cyclobutoxy, cyclopentyloxy and the like.
  • aryloxy as used herein means an oxy group "aryl” is bonded defined above, with preference given to C 6 -C 10 aryloxy. Specific examples of the aryloxy include phenoxy, 1-naphthyloxy, 2-naphthyloxy and the like.
  • amino means -NH 2 in a narrow sense and -NRR'in a broad sense, where R and R'are independent of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo. Selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R'form a ring together with the nitrogen atom to which they are attached.
  • Preferred aminos include -NH 2 , mono-C 1- C 6 alkyl aminos, di C 1- C 6 alkyl aminos, 4- to 8-membered cyclic aminos and the like.
  • R is hydrogen and R 'is meant an "alkyl” is group defined above, preferably mono C 1 -C 6 Alkylamino can be mentioned.
  • Specific examples of the monoalkylamino include methylamino, ethylamino, n-propylamino, i-propylamino, n-butylamino, s-butylamino, t-butylamino and the like.
  • dialkylamino as used herein, of the "amino” defined above, and independently R and R 'means an “alkyl” is group defined above, preferably, di-C 1 -C 6 Alkylamino can be mentioned. Specific examples of the dialkylamino include dimethylamino and diethylamino.
  • aminoalkyl herein, means one or more radicals substituted by “amino” hydrogen the definition of “alkyl” defined above, C 1 -C 6 aminoalkyl are preferred. Specific examples of the aminoalkyl include 1-pyridylmethyl, 2- (1-piperidyl) ethyl, 3- (1-piperidyl) propyl, 4-aminobutyl and the like.
  • Alkyl (arylalkyl) as used herein, means at least one hydrogen atom is replaced by "aryl" defined group of "alkyl” defined above, preferably C 7 -C 14 aralkyl , C 7- C 10 aryl kills are more preferred.
  • Specific examples of the aralkyl include benzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl and the like.
  • WO2013 / 100132 and WO2018 / 143145 can also be referred to.
  • a peptide containing one or more unnatural amino acids obtained by the production method according to the present invention can be used as a pharmaceutical product.
  • the peptide When the peptide is used as a pharmaceutical product, it preferably has excellent metabolic stability and membrane permeability. Such properties are referred to herein as “druglikeness” or “druglike”.
  • drug-like amino acids are ⁇ , ⁇ and ⁇ amino acids, and are one of two hydrogen atoms of the main chain amino group (NH 2 group) or the main chain methylene group (-CH 2).
  • One or two of the hydrogen atoms of the group may be substituted with an alkyl group, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group or the like. These substituents may be further substituted with "substituents that contribute to druglikeness".
  • Amino acids having a "long side chain” disclosed in WO2018 / 225864 are preferably exemplified as drug-like amino acids.
  • the drug-like amino acid may be an L-type amino acid, a D-type amino acid, an ⁇ , an ⁇ -disubstituted amino acid, an N-substituted amino acid, or the like.
  • Drug-like amino acids do not necessarily have to be translatable.
  • a hit compound is obtained from the side chain portion of the peptide obtained from the "translated amino acid" (for example, when a hit compound is obtained from D-tyrosine, the hit compound is obtained from the chemically modified D-type amino acid, ⁇ -alanine.
  • ⁇ -amino acids chemically modified from the ⁇ -amino acids
  • amino acids that can be chemically synthesized by structural optimization of the N-substituted portion by chemical conversion of N-methyl amino acids. Since these amino acids function as components of drug-like peptides, they are selected from a range in which the peptides obtained by chemical modification performed after translation are drug-like. As described below, for example, a lysine having an aminoalkyl group is not included in the drug-like amino acid if the amino group is not involved in post-translational modification.
  • the amino group of lysine is utilized as a reactive functional group for post-translational modification (for example, a crossing unit)
  • the lysine unit is included as a drug-like amino acid unit.
  • substituents include, for example, an ester group (-CO-OR), a thioester group (-CO-SR), a thiol group (-SH), or protection from among the substituents defined separately above.
  • 2- R alkylboran group (-BRR'), alkoxyboran group (-B (OR) (OR')), azide group (-N 3 ), ketoic acid group (-CO-CO 2 H), thiocarboxylic Examples thereof include an acid group (-CO-SH), a phosphoryl ester group (-CO-PO (R) (R')), and an acylhydroxyamino group (-NH-O-CO-R).
  • 1 or 2 methylene groups not adjacent are contained in the side chain of the drug-like amino acids, the oxygen atom, a carbonyl group (-CO-), or a sulfonyl group (-SO 2 -) may be substituted
  • Examples of the "substituent that contributes to drug likeness" in the present specification include halogen (F, Cl, Br, I, etc.), hydroxy (-OH), alkoxy group (-OR), oxy (-OR), and the like.
  • amide (-NR-COR 'or -CO-NRR') sulfonyl (-SO 2 -R), sulfinyl (-SOR), oxyamino (-NR-oR '), aminooxy (-O-NRR'), Oxycarbonyl (-CO-OR), thiocarbonyl (-CO-SR), thiol (-SH), thio (-SR), primary amino (-NH 2 ), secondary amino (-NHR) or tertiary amino (-NRR'), sulfonylamino (-NH-SO 2- R), boryl (-BRR'), dioxyboryl (-B (OR) (OR')), azide (-N 3 ), carboxycarbonyl (
  • unnatural amino acid constituting the peptide containing one or more kinds of unnatural amino acids in the present disclosure MeSer (tBuOH), BODIPYFL-4-AMF, MeCys (StBu), MeG, MeStBuOH , Nle, S3F5MePyr, SPh2Cl, MeF, MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, Pic (2), MeHph, dA and the like can be exemplified.
  • These unnatural amino acids can be included, for example, at the 2nd or 3rd letter position of the peptide.
  • a peptide refers to a peptide in which two or more amino acids are bound by an amide bond and / or an ester bond.
  • the peptides in the present disclosure include chain peptides and cyclic peptides.
  • the peptide in the present disclosure includes a peptide, a peptide-nucleic acid complex (peptide-nucleic acid complex), a peptide-ribosome-nucleic acid complex, and the like.
  • “nucleic acid” in the present disclosure includes DNA, mRNA, and tRNA.
  • the "peptide” in the present disclosure may include a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the peptide in the present disclosure has 2 to 100, 3 to 50, 4 to 30, or 5 to 30 amino acids linked by an amide bond and / or an ester bond.
  • the number of amino acids constituting the peptide is 20 or less in order to obtain high membrane permeability.
  • 18 or less, 16 or less, 15 or less, or 14 or less is more preferable, 13 or less is particularly preferable, and specifically, 9, 10, 11, 12, and 13 are exemplified.
  • the number of amino acids constituting the peptide is preferably 8 or more, more preferably 9 or more, further preferably 10 or more, and particularly preferably 11 or more.
  • the number of amino acids constituting the peptide is preferably 5 to 20, or 7 to 20, more preferably 7 to 17, 8 to 16, 9 to 16, or 10 to 16.
  • 8 to 13, 10 to 15, 11 to 15, 10 to 14, 10 to 13, or 11 to 14 is more preferable, and 11 to 13 is particularly preferable.
  • the number of amino acids constituting the cyclic portion of the cyclic peptide in the present disclosure is not limited, but for example, 4 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 20 or less, 18 or less. , 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, and 16.
  • the number of amino acids constituting the cyclic portion is preferably 5 to 15, more preferably 5 to 14, 7 to 14, or 8 to 14, and 8 to 13, 9 to 13, 8 to 12, 8 to 11, or 9 to 12 are more preferable, and 9 to 11 is particularly preferable.
  • a "cyclic part" of a peptide means a cyclic part formed by connecting two or more amino acid residues.
  • the cyclic peptide in the present disclosure may have a linear moiety.
  • the "linear moiety" used when referring to the partial structure of a cyclic peptide is a moiety not included in the main chain structure of the cyclic moiety, and at least one amide on the chain of the moiety. Those having a bond and / or an ester bond.
  • the number of amino acids (number of units) in the linear portion is preferably 0 to 8, more preferably 0 to 5, and even more preferably 0 to 3.
  • the linear portion in the present specification may include a natural amino acid or an unnatural amino acid (including a chemically modified or skeletal-converted amino acid).
  • the number of unnatural amino acids contained in the peptides in the present disclosure is preferably 2 or more, more preferably 4 or more, 5 or more, or 6 or more, further preferably 7 or more, and particularly preferably 8 or more. Further, 20 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 10 or less, and 9 or less are preferably exemplified. Examples of the number of unnatural amino acids contained in the peptides in the present disclosure include 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, and 80% or more of the number of amino acids constituting the cyclic portion. To.
  • the type of unnatural amino acid contained in the peptide in the present disclosure is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, 3 or more, or 4 or more, further preferably 7 or more, particularly preferably 8 or more, and 20 or less. , 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 10 or less, 9 or less are preferably exemplified.
  • the site containing the unnatural amino acid is not limited, but as one embodiment, the unnatural amino acid can be contained at the position of the starting amino acid, and further, the second letter and / Or an unnatural amino acid can be included at the position of the amino acid in the third letter.
  • iRT Intelligent read through
  • mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids is translated to produce a peptide.
  • mRNA is RNA that has genetic information that can be translated into protein. The genetic information is encoded on mRNA as codons, which correspond to all 20 types of amino acids. Protein translation begins at the start codon and ends at the stop codon. In principle, the start codon in eukaryotes is AUG, but in prokaryotes (eubacteria and archaea), GUG and UUG may be used as start codons in addition to AUG.
  • AUG is a codon encoding methionine (Met), and in eukaryotes and archaea, translation is started from methionine as it is. On the other hand, in eubacteria, since only the start codon AUG corresponds to N-formylmethionine (fMet), translation is started from formylmethionine.
  • the mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in the present disclosure can be exemplified as an mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid at least at the position of the starting amino acid. ..
  • the site containing the unnatural amino acid is not limited, but one embodiment may include a codon encoding the unnatural amino acid at the position of the starting amino acid. it can.
  • a peptide containing one or more unnatural amino acids can be produced by translating it from the mRNA encoding the peptide.
  • translation means translating and synthesizing a peptide from a nucleic acid encoding the peptide (eg, DNA, RNA).
  • Translation is a step of obtaining a linear peptide by repeating an amide bond and / or an ester bond reaction using mRNA as a template by the action of ribosomes.
  • the present disclosure provides a peptide or a method for producing a library containing a peptide containing at least one unnatural amino acid, two or more, three or more, four or more, or five or more.
  • manufacturing methods may include (i) and (ii): (i) A step of preparing at least 1 type, 2 types or more, 3 types or more, 4 types or more, or 5 types or more of tRNA to which an unnatural amino acid is bound; (ii) A step of translating a nucleic acid containing at least one codon corresponding to the anticodon of the tRNA with a translation system to obtain the peptide.
  • the nucleic acid may contain at least one codon corresponding to the anticodon of the tRNA.
  • the mRNA encoding a peptide containing one or more unnatural amino acids in the present disclosure comprises a codon encoding a peptide containing an unnatural amino acid at least at the position of the starting amino acid. You can.
  • iSP Initiation Suppression
  • an unnatural amino acid may be acylated in the starting tRNA contained in the translation system.
  • translation system is defined as a concept including both a method for translating a peptide and a composition for translating a peptide.
  • the “translation system” is not limited as long as it includes a ribosome containing the modified L31 protein in the present disclosure.
  • the “translation system” in the present disclosure is a combination of protein factors involved in translation, energy sources such as tRNA, amino acids, and ATP, and a regeneration system thereof, and includes a system capable of translating mRNA into a protein. Is preferable. Also, a system during which translation is in progress may be included in the "translation system” herein.
  • the translation system in the present specification may include a nucleic acid serving as a template for translating a peptide, and may also include an initiation factor, an extension factor, a dissociation factor, an aminoacyl-tRNA synthetase, and the like. These factors can be obtained by purification from extracts of various cells.
  • Cells for purifying the factor can include, for example, prokaryotic cells or eukaryotic cells.
  • Prokaryotic cells can include Escherichia coli cells, hyperthermophilic cells, or Bacillus subtilis cells.
  • eukaryotic cells those made from yeast cells, wheat germs, rabbit reticulocytes, plant cells, insect cells, or animal cells are known.
  • tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase that recognizes unnatural amino acids can also be used.
  • an artificial tRNA or an artificial aminoacyl-tRNA synthetase a peptide into which an unnatural amino acid is introduced in a site-specific manner can be synthesized. If necessary, it can be transcribed from template DNA by adding RNA polymerase such as T7 RNA polymerase to the translation system.
  • including a substance having a translation system means that the substance is synthesized and contained in the system in the process of translation even if the substance is not contained at the start of translation. Including. For example, if an amino acid-acylated tRNA is synthesized during the translation process, it is understood that the translation system contains the aminoacyl-tRNA.
  • the main types of translation systems are translation systems that use living cells and translation systems that use cell extracts (cell-free translation systems).
  • a translation system using living cells for example, a system in which desired aminoacyl tRNA and mRNA are introduced into living cells such as African turkey oocytes and mammalian cells by a microinjection method or a lipofection method to perform peptide translation.
  • Known nowak et al., Science (1995) 268: 439-442).
  • Examples of cell-free translation systems include Escherichia coli (Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690), yeast (Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969), and wheat germ.
  • the cell-free translation system also includes a translation system (reconstituted cell-free translation system) constructed by isolating and purifying the factors required for peptide translation and reconstructing them (Shimizu et al). ., Nat Biotech (2001) 19: 751-755).
  • Reconstituted cell-free translation systems typically include ribosomes, amino acids, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS), translation initiation factors (eg IF1, IF2, IF3), translation elongation factors (eg EF-Tu, EF).
  • RNA polymerase and the like may be further included.
  • Various factors contained in the cell-free translation system can be isolated and purified by a method well known to those skilled in the art, and a reconstituted cell-free translation system can be appropriately constructed using them. Alternatively, commercially available reconstituted cell-free translation systems such as Genefrontier's PUREfrex® and New England Biolabs' PURExpress® can be used. In the case of a reconstituted cell-free translation system, it is possible to construct a desired translation system by reconstructing only the necessary components among the components of the translation system.
  • PURESYSTEM (registered trademark) (BioComber, Japan) is a reconstituted cell-free translation in which protein factors, energy regeneration enzymes, and ribosomes required for translation in Escherichia coli are extracted and purified, and mixed with tRNA, amino acids, ATP, GTP, etc. It is a system. Not only is the content of impurities low, but because it is a reconstituted system, it is possible to easily create a system that does not contain protein factors and amino acids that you want to eliminate ((i) Nat Biotechnol. 2001; 19: 751-5. Cell. -free translation reconstituted with purified components.
  • translational synthesis involves, for example, protein factors required for translation in Escherichia coli (methionyl tRNA transformerase, EF-G, RF1, RF2, RF3, RRF, IF1, IF2, IF3, EF-Tu, EF-Ts, ARS (AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS, GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS, LeuRS, LysRS, MetRS, PheRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS, ValRS Select)), ribosome, amino acid, creatin kinase, myokinase, inorganic pyrophosphatase, nucleoside diphosphate kinase, E.
  • protein factors required for translation in Escherichia coli methionyl tRNA transformerase, EF-G, RF1, RF2, RF3, RRF, IF1, IF2,
  • coli-derived tRNA creatin phosphate, potassium glutamate, HEPES-KOH pH7.6, magnesium acetate, spermidine, dithiosley
  • PURE SYSTEM in which tall, GTP, ATP, CTP, UTP, etc. are appropriately selected and mixed.
  • T7 RNA polymerase is added, transcription and translation from template DNA containing the T7 promoter can be coupled.
  • a peptide compound containing an unnatural amino acid can be translated and synthesized by adding a desired aminoacyl-tRNA group or an unnatural amino acid group (for example, F-Tyr) allowed by the aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) to the system (for example, F-Tyr).
  • ARS aminoacyl-tRNA synthetase
  • translating mRNA encoding a peptide containing unnatural amino acids by including in the system a variant of ARS in place of or in addition to native ARS and by including a group of unnatural amino acids in the system. Can be done.
  • mutants such as ribosomes and EF-Tu
  • the efficiency of translation of mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid and the accompanying introduction of an unnatural amino acid can be enhanced (Dedkova LM, et).
  • the translation system in the present disclosure contains ribosomes containing the modified L31 protein in the present disclosure at least 50% or more, preferably 60% or more, in terms of the ratio of the number of molecules to all ribosomes contained in the translation system. It is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more (for example, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more). It is preferable to include in the ratio of.
  • the "whole ribosome” is not particularly limited as long as it is a ribosome included in the translation system, but the ribosome containing the modified L31 protein in the present disclosure and other ribosomes (for example, the ribosome containing Escherichia coli wild-type L31 and its function). The sum with the equivalent ribosome) can be exemplified.
  • the ratio of the modified L31 protein to all ribosomes contained in the translation system can be calculated, for example, based on the ratio of the intensity of the modified L31 protein to the intensity of all ribosomes by a mass spectrometer.
  • the translation system in the present disclosure preferably contains magnesium ions. It is known that magnesium ions are required to maintain the associative state of the small and large subunits of the ribosome.
  • the L31 protein is one of the proteins that forms the interaction between the large and small subunits of the ribosome. It has been clarified that ribosomes lacking the L31 protein and ribosomes containing shortL31 have a higher magnesium ion concentration required to maintain an association state than ribosomes containing intact L31.
  • the magnesium ion concentration is higher than the magnesium ion concentration in the translation system in which the ribosome containing an intact L31 is used.
  • the method of the present invention can further include a step of adding magnesium ions to the translation system of the present invention.
  • a translation system to which magnesium ions have been added in advance can also be used.
  • the amount of magnesium added is not particularly limited, but is, for example, a lower limit selected from values of 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more or 7 mM or more, and 9 mM or less, 8 mM or less, 7 mM or less.
  • 6 mM or less, 5 mM or less, 4 mM or less, 3 mM or less can be exemplified by an arbitrary combination with an upper limit selected.
  • tRNA In introducing an unnatural amino acid into a peptide by translating an mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid, tRNA having orthogonality and being efficiently incorporated into the ribosome ((i) Biochemistry. 2003; 42). : 9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression. Anderson JC, Schultz PG., (Ii) Chem Biol. 2003; 10: 1077-84. Using a Aminoacylation of solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code. Murakami H, Kourouklis D, Suga H.) is required. The following five methods can be used as a method for aminoacylating tRNA.
  • aminoacyl-tRNA synthetase is prepared for each amino acid as an enzyme for aminoacylation of tRNA. Therefore, as the first method, a method that utilizes the fact that a certain ARS allows unnatural amino acids such as N-MeHis, or a mutant aminoacyl-tRNA synthetase that allows unnatural amino acids is prepared and used. Methods can be mentioned ((i) Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 9715-20.
  • aminoacyl-tRNA can be prepared by using the following method. Prepare a template DNA that encodes a desired tRNA sequence and has a T7, T3 or SP6 promoter upstream, and synthesizes RNA by transcription using an RNA polymerase suitable for the promoter such as T7 RNA polymerase or T3, SP6 RNA polymerase. Can be done. It is also possible to extract and purify tRNA from cells and extract the desired produced tRNA using a probe having a complementary sequence of the tRNA sequence. At this time, cells transformed with the target tRNA expression vector can also be used as a source. RNA of the desired sequence can also be synthesized by chemical synthesis.
  • an aminoacyl-tRNA can be obtained by binding a tRNA obtained by removing CA from the 3'-terminal CCA sequence thus obtained and an aminoacylated pdCpA or pCpA prepared separately with RNA ligase (pdCpA method). , PCpA method).
  • the tRNA is useful in the production of peptides.
  • aminoacylation with flexizyme which is a ribozyme in which a full-length tRNA is prepared and active esters of various unnatural amino acids are supported on the tRNA, is also possible.
  • Aminoacyl-tRNA can also be made using natural ARS or variants thereof, although not intended to be limiting.
  • the aminoacyl-tRNA once consumed in the translation system can be regenerated by the natural ARS or a variant thereof. Therefore, it is necessary to have a large amount of the aminoacyl-tRNA prepared in advance in the translation system. Absent. Such ARS variants are described in WO2016 / 148044. The methods for producing these aminoacyl-tRNAs can also be combined as appropriate.
  • the peptide in the present disclosure or the method for producing a library containing a peptide can further include the step of cyclizing the translated peptide.
  • cyclization for example, a ring using an amide bond, a carbon-carbon bond, a thioether bond, a disulfide bond, an ester bond, a thioester bond, a lactam bond, a bond via a triazole structure, a bond via a fluorophore structure, or the like. Is mentioned. Of these, an amide bond is preferable because of its high metabolic stability.
  • the peptide translation step and the cyclization reaction step may be separated or proceed continuously.
  • the cyclization can be carried out by a method known to those skilled in the art described in, for example, WO2013 / 100132, WO2008 / 117833, WO2012 / 074129 and the like.
  • the mode of binding in ring formation is not limited, but is limited to the N-terminal to C-terminal binding of the peptide, the N-terminal to the side chain of other amino acid residues of the peptide, and the C-terminal to other amino acid residues of the peptide. It may be either a chain bond or a bond between side chains of amino acid residues, and two or more of these may be used in combination.
  • the invention relates to, for example, a peptide or method of making a library containing a peptide comprising the following steps: (1) A step of producing an acyclic peptide containing one or more kinds of unnatural amino acids by the method described in the present specification, wherein the acyclic peptide has one side chain on the C-terminal side. A step comprising an amino acid residue having a reaction point in and an amino acid residue having another reaction point on the N-terminal side; and (2) the reaction point of the amino acid residue on the N-terminal side and the C-terminal side. A step of binding an amino acid residue having a reaction point on a side chain to the reaction point to form an amide bond, a carbon-carbon bond, or a thioether bond. The steps (1) and (2) may be separated or may proceed continuously.
  • the amino group of N-terminal methionine and the amino group of lysine located downstream (C-terminal side) are cystineimidyl glutarate.
  • a cyclization method by cross-linking with (DSG) or an amino acid derivative having a chloroacetyl group as an N-terminal translation initiation amino acid is introduced, and Cys is placed downstream to form a thioether by an intramolecular cyclization reaction.
  • DSG cross-linking with
  • Cys is placed downstream to form a thioether by an intramolecular cyclization reaction.
  • the C-terminal site of the peptide in the present disclosure may be chemically modified rather than remaining as a carboxylic acid.
  • the carboxylic acid moiety may be reacted with piperidine or the like to convert it to piperidine amide or the like.
  • the present invention also relates to a peptide produced by the method for producing a peptide described in the present specification and a library containing the peptide.
  • the present invention also relates to a library containing the peptide, which comprises the step of producing the peptide by the method for producing a peptide described in the present specification.
  • the libraries in the present disclosure include libraries containing the peptides in the present disclosure and libraries containing nucleic acids encoding the peptides in the present disclosure.
  • the library in the present disclosure includes a library of peptides in the present disclosure and a library of peptide-nucleic acid complexes.
  • a display library is preferable. Examples of the display library include a library using a display. Among them, an mRNA display library, a DNA display library, and a ribosome display library are preferable, and an mRNA display library is more preferable.
  • Display library A display library is a library in which an phenotypic peptide and an RNA or DNA encoding the peptide having the genotype are associated with each other.
  • This library can be used to identify peptides that can specifically bind to a target molecule.
  • the library can be contacted with a desired immobilized target to wash away molecules that do not bind to the target, thereby concentrating the peptide that binds to the target (panning method).
  • panning method By analyzing the genetic information associated with the peptide selected through such a process, the sequence of the peptide bound to the target can be clarified.
  • RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins Roberts RW, Szostak JW.
  • in vitro virus bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.).
  • a spacer such as puromycin is bound to the 3'end of the mRNA library obtained by transcription from a DNA library containing a promoter such as T7 promoter and the mRNA is translated into a protein by a cell-free translation system
  • puromycin becomes a ribosome.
  • the mRNA and the protein encoded by the mRNA are linked to form a library in which the mRNA and its product are associated with each other. Since this process does not include transformation such as Escherichia coli, high efficiency is realized and a large-scale display library can be constructed.
  • the sequence of the bound peptide can be clarified by synthesizing cDNA from mRNA, which is a tag containing genetic information attached to the selected molecule concentrated by panning, PCR amplification, and analysis of the base sequence.
  • the display library using the cell-free translation system includes a cDNA display (Nucleic Acids Res. 2009; 37), which is a library consisting of cDNA encoding a peptide in which a complex of a peptide and puromycin is bound.
  • cDNA display a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.
  • Ribosome display utilizing the relatively stable complex of ribosome and translation product during mRNA translation (Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 9022-6.
  • Bacteriophage endonuclease P2A uses the formation of a covalent bond with DNA covalent display (Nucleic Acid) : e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Robertsli I, Lost GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof .), CIS display (Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101: 2806-10. Utilizing the fact that the replication initiation protein RepA of the microbial plasmid binds to the replication initiation point ori.
  • CIS display In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, Hederer R, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D. In addition, in vitro compartmentalization (Nat Biotechnol. 1998; 16: 652-6. Man-) in which a transcriptional translation system is encapsulated in a water-in-oil emulsion or liposome for each molecule of DNA constituting the DNA library to perform a translation reaction. made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.) Is also known. The above method can be used as appropriate using a known method.
  • nucleic Acid Library may also include deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), or nucleotide derivatives having artificial bases. It can also contain peptide nucleic acids (PNA).
  • the nucleic acid can be any of these nucleic acids or a hybrid as long as the genetic information of interest is retained. That is, the nucleic acids in the present disclosure also include hybrid nucleotides of DNA-RNA and chimeric nucleic acids in which different nucleic acids such as DNA and RNA are linked in a single strand.
  • nucleic acid library that serves as a template for the peptide contained in the peptide library
  • examples of the nucleic acid library that serves as a template for the peptide contained in the peptide library include an mRNA library and a DNA library.
  • a nucleic acid library can be obtained by synthesizing a peptide sequence in which amino acid residues are not fixed by mixing bases.
  • A, T, G, C, and as an RNA library each of A, U, G, and C is a mixture of 4 bases (N), which is a multiple of 3, or the first letter of the codon.
  • the first letter is N
  • the third letter is synthesized as a mixture of two bases such as W, M, K, S, etc.
  • the third letter should be one type of base. There is also a way to do it.
  • the frequency of occurrence of amino acid residues can be freely adjusted by preparing codon units corresponding to the three letters of the codon, mixing them at an arbitrary ratio, and using them for synthesis.
  • nucleic acid libraries can be translated using a cell-free translation system.
  • a sequence encoding a spacer downstream of the nucleic acid of interest includes, but is not limited to, a sequence containing glycine or serine.
  • a linker formed of RNA, DNA, a hexaethylene glycol (spc18) polymer (for example, five polymers), etc. is contained between a compound incorporated into a peptide during translation by a ribosome such as puromycin or a derivative thereof and a nucleic acid library. Is preferable.
  • the production of the library in the present disclosure can be carried out according to the method for producing a peptide in the present disclosure, and can be appropriately combined with a known method.
  • the cell-free translation system of the present disclosure described above can be used to produce a library of peptides of the present disclosure. That is, the method for producing a library in the present disclosure may include a step of synthesizing a peptide using the cell-free translation system in the present disclosure.
  • the examples, preferred ranges, and embodiments described in the cell-free translation system of the present disclosure can be applied as is to the method for producing a library in the present disclosure.
  • a peptide capable of specifically binding to a target molecule can be selected by screening using the library in the present disclosure.
  • the screening method in the present disclosure involves contacting the target molecule with a library of peptides containing one or more unnatural amino acids in the present disclosure to wash away peptides that do not bind to the target molecule.
  • Peptides that bind to can be concentrated (panning).
  • cDNA is synthesized from mRNA which is a tag containing the base sequence information contained in the peptide selected in this manner, PCR-amplified, and the base sequence is analyzed to obtain the amino acid sequence of the bound peptide. Can be clarified.
  • the mRNA library may be obtained by transcribing the cDNA amplified above, or the peptide library may be produced again using these as templates.
  • this library is enriched with peptides that can bind to the target molecule
  • peptides that can specifically bind to the target molecule can be further concentrated by performing panning again using this library. By repeating this step a plurality of times, the target peptide can be further concentrated.
  • the amino acid sequence can be identified based on the base sequence information contained in the peptide thus concentrated, and a peptide capable of specifically binding to the target molecule can be produced.
  • the screening method in the present disclosure can be performed in vitro.
  • the peptide may be optimized by chemically modifying the peptide obtained by the screening method in the present disclosure by a known method.
  • “optimization” refers to a peptide having a stronger activity against a medicinal target, which is chemically modified to become a more drug-like peptide by converting the structure of each amino acid in the translated peptide. It means that the peptide is chemically modified so as to be, and / or the peptide is less toxic.
  • the screening method in the present disclosure comprises the following steps: (A) A step of contacting a target molecule with a peptide contained in the library in the present disclosure; (B) A step of selecting a peptide that can bind to the target molecule.
  • the screening method in the present disclosure may include a step of obtaining a library by the method described in the present specification before the step (a).
  • the library can be obtained according to the method for producing a peptide in the present disclosure.
  • the screening method in the present disclosure may concentrate peptides capable of specifically binding to a target molecule by repeating the steps (a) and (b) above twice or more.
  • Target molecule used in the screening method in the present disclosure is not particularly limited, and examples thereof include proteins, peptides, nucleic acids, sugars, and lipids, but it is preferable to target proteins. Further, the location of the target molecule in the living body is not particularly limited. In one aspect, intracellular proteins can also be targeted.
  • the target molecule used in the screening method in the present disclosure is used by being immobilized on a carrier.
  • the carrier is not particularly limited as long as the target molecule can be immobilized, and examples thereof include beads or a resin.
  • the target molecule can be immobilized on the carrier by a known method.
  • the target molecules of the library and the screening method in the present disclosure are not particularly limited, but are limited to GTPase KRas (KRAS), Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1), Mitogen-sctivated protein kinase 3 (ERK1),
  • KRAS GTPase KRas
  • MEK1 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1
  • ERK1 Mitogen-sctivated protein kinase 3
  • An example is an interleukin-6 receptor (IL-6R).
  • IL-6R interleukin-6 receptor
  • the method for producing a peptide in the present disclosure may include the following steps: (I) A step of contacting a target molecule with a peptide contained in the library in the present disclosure; (Ii) A step of selecting a peptide capable of binding to the target molecule; and (iii) A step of producing a peptide based on the amino acid sequence of the peptide selected in (ii).
  • the above method can include the step of obtaining the library by the method described herein.
  • the method for producing a library, the method for producing a peptide, and / or the screening method in the present disclosure may be performed in vitro.
  • the peptides in the present disclosure may be cyclized.
  • the present invention also relates to the modified L31 proteins of the present disclosure, ribosomes containing the proteins, isolated nucleic acids encoding the proteins.
  • the present invention also relates to a vector or cell containing the nucleic acid.
  • Examples of the modified L31 protein of the present disclosure include the following (1) to (6).
  • the modified L31 protein in the present disclosure, the ribosome containing the protein, the isolated nucleic acid encoding the protein, etc. are used, for example, in the production of a peptide containing an unnatural amino acid in the present disclosure, a library containing the peptide, and the like. It is possible to do.
  • isolated nucleic acid refers to a nucleic acid molecule separated from elements of the natural environment.
  • the isolated nucleic acid contains a nucleic acid molecule contained in a cell that normally contains the nucleic acid molecule, which is either extrachromosomally present or at a position different from its natural chromosomal location.
  • the isolated nucleic acid may be present at any location within the cell.
  • Nucleic acid in the present disclosure includes DNA (genomic DNA, cDNA) and RNA.
  • polynucleotide or “nucleic acid” refers to a polymer of nucleotides of any length, including DNA and RNA.
  • Nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or analogs thereof, or any substance that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction.
  • Polynucleotides can include modified nucleotides such as methylated nucleotides and analogs thereof.
  • a non-nucleotide component may interrupt the nucleotide sequence.
  • Polynucleotides can include modifications made after synthesis, such as conjugation to a label.
  • modifications include, for example, "caps", substitutions of one or more naturally occurring nucleotides and analogs, internucleotide modifications, such as uncharged linkages (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramic acids).
  • any hydroxyl group normally present in sugars can be replaced, for example, with a phosphonate group, a phosphate group, protected by standard protecting groups, or activated to generate additional linkages to additional nucleotides.
  • Or can be conjugated to a solid or semi-solid support.
  • OH at the 5'and 3'ends can be phosphorylated or substituted with amines or organic cap group moieties of 1-20 carbon atoms.
  • Other hydroxyls can also be derivatized to standard protecting groups.
  • Polynucleotides may also include similar forms of ribose or deoxyribose sugars commonly known in the art, including, for example: 2'-O-methyl-, 2'-O-allyl-, 2'-fluoro- or 2'-azido-ribose, carbocyclic sugar analogs, ⁇ -anomeric sugars, arabinose or epimer sugars such as xylose or lyxose, pyranose sugars, furanose sugars, sedoheptulose, acyclic analogs, and methylribosides.
  • Basic nucleoside analogs such as.
  • One or more phosphodiester bonds can be replaced by alternative linking groups.
  • linking groups include, but are not limited to, embodiments in which the phosphate is replaced by: P (O) S (“thioate”), P (S) S (“”. Dithioate “), (O) NR 2 ("Amidate “), P (O) R, P (O) OR', CO, or CH 2 (" Holm Acetal "), where each R or R'is independent H, or optionally an ether (-O-) linkage, aryl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, or substituted or unsubstituted alkyl (1-20C) containing arargyl. Not all linkages in the polynucleotide need be identical. The above description applies to all polynucleotides referred to herein, including RNA and DNA.
  • a method for preparing a nucleic acid encoding a modified L31 protein in the present disclosure for example, a site-directed mutagenesis method (Kramer, W. and Fritz, H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367).
  • a hybridization technique (Southern, EM (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503) can also be used functionally with the modified L31 protein according to any of SEQ ID NOs: 2 and 42-48. It is also possible to obtain nucleic acids encoding equivalent proteins.
  • the nucleic acid encoding the modified L31 protein in the present disclosure hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid encoding the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 2 and 42-48. May be.
  • Stringent hybridization conditions can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 ⁇ SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 ⁇ Denhardt solution, 20 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, at 42 ° C. After evening prehybridization, the labeled probe is added and the mixture is kept warm at 42 ° C. overnight for hybridization.
  • the cleaning liquid and temperature conditions in the subsequent cleaning are, for example, "2 x SSC, 0.1% SDS, 50 ° C", “2 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C", “1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C”.
  • the stricter conditions are “2 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C” and “0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, and the more severe conditions are "0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • isolation of a nucleic acid having higher homology with the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 2 and 42 to 48 can be expected.
  • the nucleic acid thus isolated is believed to have high homology at the amino acid level with the modified L31 protein described in any of SEQ ID NOs: 2 and 42-48. Further, at the base sequence level, it is considered to have high homology with the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence according to any one selected from SEQ ID NO: 2 and 42 to 48. As described above, high homology means at least 50% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably 90% in the entire amino acid sequence or the entire base sequence. Refers to the sequence identity of the above (eg, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more).
  • the nucleic acid of the present invention can be used, for example, for the preparation of a modified L31 protein or a ribosome containing the same.
  • a nucleic acid encoding the modified L31 protein is inserted into a suitable expression vector, and the vector is introduced into a suitable cell.
  • Transformed cells are cultured to isolate, purify, and culture the expressed modified L31 protein or ribosomes containing the same.
  • the modified L31 protein can also be expressed as a fusion protein with other proteins for the purpose of facilitating purification.
  • a method of preparing Escherichia coli as a fusion protein with maltose-binding protein (vector pMAL series released by New England BioLabs in the United States) and a method of preparing as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech).
  • Vector pGEX series released by the company a method of preparing by adding a histidine tag (pET series of Novagen), etc. can be used.
  • the vector may be a knock-in vector in which the nucleic acid of the present invention is knocked in by homologous recombination. That is, the modified L31 protein of the present invention, or a ribosome containing the same, can also be prepared by knocking in the nucleic acid of the present invention into a vector by homologous recombination.
  • a vector is constructed so that a modified L31 protein or a nucleic acid of the present invention for preparing a ribosome containing the same is inserted into the same reading frame of a target gene in a host such as Escherichia coli. It may be.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably inserted into an exon containing the translation start point so that the translation start point of the knock-in vector coincides with the translation start point of the target gene.
  • the base sequence upstream of the translation start point of the target gene is arranged on the 5'side of the translation start point of any foreign gene.
  • the 5'-side end of the exon-intron structure is the translation initiation point of the target gene. It is preferable that the translation start point is inserted in the exon including the translation start point.
  • the base sequence upstream of the translation start point of the target gene is arranged upstream on the 5'side of the 5'side end of the exon intron structure.
  • the knock-in vector has the ability to replicate in the host cell.
  • the knock-in vector is not particularly limited as long as it is a vector used for genetic engineering, and known vectors include, for example, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacterial artificial chromosome (BAC) vector, a yeast artificial chromosome (YAC) vector, and a retrovirus. Examples thereof include vectors, lentivirus vectors and other virus vectors.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for the expression of recombinant protein, and in addition to the above-mentioned Escherichia coli, for example, yeast, various animal and plant cells, insect cells and the like can be used.
  • Escherichia coli for example, yeast, various animal and plant cells, insect cells and the like
  • Various methods known to those skilled in the art can be used for introducing the vector into the host cell.
  • an introduction method using calcium ions (Mandel, M., Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162, Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) can be used.
  • the modified L31 protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or its cell culture or culture supernatant by a method known to those skilled in the art.
  • affinity purification can be easily performed.
  • the nucleic acid of the present invention may be inserted into a vector.
  • the vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in large quantities by Escherichia coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue) and prepared in large quantities.
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue
  • a vector having a selected gene for transformed Escherichia coli for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (for example, ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol, etc.)). ..
  • Examples of such a vector include M13-based vector, pUC-based vector, pBR322, pBluescript, pCR-Script and the like.
  • pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc. can be mentioned for the purpose of subcloning or excising the cDNA.
  • Expression vectors are particularly useful when the vector is used for the purpose of producing a modified L31 protein.
  • the expression vector for example, when the purpose is to express in Escherichia coli, in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli, the host is Escherichia coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue.
  • promoters that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al.) , Science (1988) 240, 1041-1043), or having a T7 promoter, etc. is essential.
  • lacZ promoter Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • araB promoter Better et al.
  • Science (1988) 240, 1041-1043 or having a T7 promoter, etc.
  • Examples of such a vector include pGEX-5X-1 (manufactured by Pharmacia), "QIAexpress system” (manufactured by Qiagen), pEGFP, pET and the like in addition to the above vectors.
  • the vector may contain a signal sequence for peptide secretion.
  • the signal sequence for the secretion of the polypeptide the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of Escherichia coli.
  • the vector can be introduced into a host cell by using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method. Examples of vectors expressed in plants include vectors such as pMH1, pMH2, and pCAMBIA.
  • Escherichia coli for example, as a vector for producing a modified L31 protein, an expression vector derived from a mammal (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) and pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • expression vector derived from insect cells eg "Bac-to-BAC baculovairus expression system" (Gibco BRL), pBacPAK8), expression vector derived from plants (eg pMH1, pMH1, pMH2), expression vector derived from animal virus (eg pHSV, pMV, pAdexLcw), expression vector derived from retrovirus (eg pZIPneo), expression vector derived from yeast (eg "Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen)) , PNV11, SP-Q01), expression vectors derived from Escherichia coli (eg, pPL608, pKTH50) and the like.
  • insect cells eg "Bac-to-BAC baculovairus expression system” (Gibco BRL), pBacPAK8)
  • expression vector derived from plants eg pMH1, pMH1, pMH2
  • promoters required for intracellular expression such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have the MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, It is more preferable to have a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of the vector having such characteristics include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 and the like.
  • the transformed cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing a modified L31 protein or a ribosome containing the modified L31 protein.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems.
  • animal cells When using eukaryotic cells, for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • Animal cells include mammalian cells (for example, CHO cells, COS cells, NIH3T3 cells, 3T3, myeloma cells, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc.), amphibian cells (for example, African turkey eggs). Mother cells (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)) or insect cells (for example, cells such as sf9, sf21, Tn5, etc.) are known.
  • CHO cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • CHO cells are particularly preferable for the purpose of large-scale expression.
  • yeast for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger are known. However, it is not limited to these.
  • the modified L31 protein, or ribosome containing the same can also be obtained by purifying from a culture of wild-type Escherichia coli. That is, by suspending the cultured wild-type Escherichia coli in a buffer containing a low concentration of magnesium ions and disrupting the buffer, a lysate containing the modified L31 protein can be obtained. Specifically, the wild-type Escherichia coli is disrupted in a buffer containing magnesium ions of, for example, 5 mM or less (more specifically, 4 mM or less, 3 mM or less, 2 mM or less, 1 mM or less, or 0 mM). A lysate containing the E.
  • coli wild-type L31 protein set forth in SEQ ID NO: 1 described herein and the modified L31 protein in the present disclosure can be obtained.
  • Crushing of Escherichia coli can be performed by a method known to those skilled in the art, such as crushing with a French press, crushing with ultrasonic treatment, crushing with a homogenizer, crushing with galaxy beads, crushing with a mortar, etc. Crushing by press is preferable.
  • a modified L31 protein or a ribosome containing the same can be isolated and obtained.
  • the composition in the present disclosure can be used, for example, as a translation system or a part thereof in the production of peptides containing unnatural amino acids. Therefore, the composition in the present disclosure includes, for example, an aminoacyl-tRNA formed by binding an unnatural amino acid and a tRNA, and a peptide containing one or more unnatural amino acids, in addition to the ribosome containing the modified L31 protein in the present disclosure. It is preferable to further contain the encoding mRNA or the like.
  • the ribosome containing the modified L31 protein in the present disclosure is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 60% or more in terms of the ratio of the number of molecules to the total ribosome contained in the composition. 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more (for example, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) It is preferable to include in.
  • Example 1 Construction of Escherichia coli strain A strain lacking ompT (Protease7) (defined as L31intact strain) and an L31short strain expressing up to 62 amino acids on the N-terminal side of the L31 protein were constructed. During the ribosome purification process, Proteinase 7 is known to degrade between the 62nd and 63rd amino acids of the L31 protein. An E. coli strain was constructed according to the Quick and Easy Conditional Knockout Kit (loxP / Cre) (Gene Bridges).
  • PCR reaction was performed with Prime STAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc., R010A) using the functional cassette loxP-PGK-gb2-neo-loxP (Gene Bridges, A003) as a template. It was.
  • the obtained PCR product was purified using the QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN, 28104). The concentration of the functional cassette was about 200 ng / ⁇ L.
  • the functional cassette Cassette-1 for creating ompT (Protease7) -deficient strains was PCRed using the primers of Oligo1 (SEQ ID NO: 3) and Oligo2 (SEQ ID NO: 4).
  • the functional cassette Cassette-2 for L31short strain preparation was PCRed using the primer sets of Oligo3 (SEQ ID NO: 5) and Oligo4 (SEQ ID NO: 6).
  • Escherichia coli K-12 W3110 was used to transform pRed / ET to prepare competent cells expressing Red / ET.
  • the functional cassette Casette-1 or Casette-2 was electroporated into the prepared competent cells to induce homologous recombination.
  • Colony PCR was performed from the obtained colonies, and the introduction of the kanamycin cassette and the deletion or partial deletion of the target gene were confirmed from the length of the amplified DNA.
  • the kanamycin resistance gene cassette sandwiched between Loxp sequences was deleted from the obtained E. coli strain of interest.
  • the obtained Escherichia coli was made into a single colony, and the completion of the target strain was confirmed by reading the sequence of the genomic DNA at the genetically modified site.
  • Example 2 Ribosome preparation method Culture of Escherichia coli W3110 strain (WT) was cultured. The bacterial cell W3110 strain was inoculated into a preculture medium (Glycerol 5 g / L, Yeast Extract 6 g / L, KH 2 PO 4, 4 g / L, K 2 HPO 4 9.3 g / L) and precultured.
  • a preculture medium Glycerol 5 g / L, Yeast Extract 6 g / L, KH 2 PO 4, 4 g / L, K 2 HPO 4 9.3 g / L
  • the culture solution was dispensed in 500 ml portions and allowed to stand at room temperature for 1 hour and at 4 ° C. for 1 hour. After standing, the mixture was centrifuged at 6000 ⁇ g for 10 minutes, the precipitate was suspended in D-PBS (-) (Takara Bio Inc., T9181), and the centrifugation was performed again at 6000 ⁇ g for 10 minutes. The recovered cells were frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • Bacterial cells were collected by centrifugation at 5000 ⁇ g for 10 minutes. The cells were suspended in PBS (Takara Bio Inc., T9181) in the same amount as the medium, and centrifuged again at 5000 ⁇ g for 10 minutes. The cells were frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • Lysis Buffers with the following composition were prepared.
  • Mg10 Lysis Buffer (10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 10 ⁇ g / mL DNaseI)
  • Mg5 Lysis Buffer (10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 10 ⁇ g / mL DNaseI)
  • Mg0 Lysis Buffer (10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 ⁇ g / mL DNaseI)
  • the cells were suspended in 0.004 mL of Lysis Buffer per 1 OD of recovered cells.
  • ribosomes L31short ribosome, L31intact ribosome, WT-10MG ribosome (using Mg10 Lysis Buffer), WT-5MG ribosome (using Mg5 Lysis Buffer), and WT-0MG ribosome (using Mg0 Lysis Buffer). Preparation was performed.
  • Example 3 Analysis of L31 degradation rate The L31 degradation rate of WT-10MG ribosome, WT-5MG ribosome, and WT-0MG ribosome was analyzed.
  • Example 4 The analytical conditions for synthetic LCMS of pCpA-amino acid (also referred to as aminoacyl pCpA) used in the cell-free translation system are as follows.
  • 2-oxopyrimidine-1 (2H) -yl) -3-(((((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-amino-9H-purine-9-yl) -3,4-dihydroxy) Tetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy) phosphoryl) oxy) -4-((tetra-2-yl) oxy) tetrahydrofuran-2-yl) methyl (28.9 mg, 0.04 mmol) is dissolved to dissolve cyanomethyl N.
  • the buffer solution A was adjusted as follows. Acetic acid was added to an aqueous solution of N, N, N-trimethylhexadecane-1-aminium chloride (6,40 g, 20 mmol) and imidazole (6.81 g, 100 mmol), and pH 7.9, 20 mM N, N, N-trimethyl. A buffer solution A (1 L) of hexadecane-1-aminium and 100 mM imidazole was obtained.
  • (2S) -3- [4- (aminomethyl) phenyl] -2-[[4-[[2- (4-fluorophenyl) acetyl] amino] phenyl] methoxycarbonylamino] propanoic acid 500 mg
  • a solution of 4N HCl in 1,4-dioxane was added to a suspension of dichloromethane (4.5 ml) of 0.968 mmol) at room temperature. After stirring at room temperature for 1 hour, the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Dihydrogen phosphate ((2R, 3R, 4R, 5R) -5- (4-amino-2-oxopyrimidine-1 (2H) -yl) -3-(((((((()) 2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-amino-9H-purine-9-yl) -3,4-dihydroxytetra-2-yl) methoxy) (hydroxy) phosphoryl) oxy) -4-(( Methoxy-2-yl) oxy) tetrahydrofuran-2-yl) methyl (47.7 mg, 0.066 mmol) was dissolved to dissolve (S) -3-(4-((3- (5,5-difluoro-7,,)).
  • tRNAGluCUU (-CA) was prepared by the tRNAGlu (-CA) sequencing method. Sequence TR-1 (SEQ ID NO: 7) tRNAGluCUU (-CA) RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC The following tRNAGluCUG (-CA) was prepared by a conventional method.
  • Sequence TR-2 (SEQ ID NO: 8) tRNAGluCUG (-CA) RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC The following tRNAfMet (CAU) (-CA) was prepared by a conventional method. Sequence TR-3 (SEQ ID NO: 9) GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCGCAAC
  • Aminoacyl-tRNA Synthesis Using Aminoacyl-pCpA Part 1 50 ⁇ M transcribed tRNAGluCUG (-CA) (SEQ ID NO: 8) (20 ⁇ l), 10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl 2 ) (4 ⁇ l), 10 mM ATP (4 ⁇ l), Nuclease free water (5) .6 ⁇ l) was added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then left at room temperature for 5 minutes to refold the tRNA.
  • 10X ligation buffer 500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl 2
  • 10 mM ATP 4 ⁇ l
  • Aminoacyl-tRNA Synthesis Using Aminoacyl-pCpA Part 2 50 ⁇ M transcribed tRNAGluCUU (-CA) (SEQ ID NO: 7) (20 ⁇ l), 10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl 2 ) (4 ⁇ l), 10 mM ATP (4 ⁇ l), Nuclease free water (5) .6 ⁇ l) was added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then left at room temperature for 5 minutes to refold the tRNA.
  • 10X ligation buffer 500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl 2
  • 10 mM ATP 4 ⁇ l
  • Aminoacyl-tRNA Synthesis Using Aminoacyl-pCpA Part 3 50 ⁇ M transcribed tRNAfMetCAU (-CA) (SEQ ID NO: 9) (20 ⁇ l), 10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl 2 ) (4 ⁇ l), 10 mM ATP (4 ⁇ l), Nuclease free water (5) .6 ⁇ l) was added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then left at room temperature for 5 minutes to refold the tRNA.
  • DMSO solution (4 ⁇ L) of 10 unit / ⁇ l T4 RNA ligase (New england biolab.) (2.4 ⁇ L) and 2.5 mM (Acbz-MeCys (StBu) -pCpA (compound nk14 described in Patent Document WO2017150732)).
  • a ligation reaction was carried out at 16 ° C. for 45 minutes.
  • 0.3M sodium acetate was added to the ligation reaction solution to extract phenol and chloroform, and aminoacyl tRNA (compound AAtR-3) was recovered by ethanol precipitation.
  • the obtained residue was dissolved in diethyl ether (50 mL), and then heptane (50 mL) was added. Under controlled reduced pressure ( ⁇ 100 hPa), only diethyl ether was distilled off, and the obtained mixture was filtered to obtain a solid. This washing operation with heptane was repeated twice. The obtained solid was dried under reduced pressure with a pump at 25 ° C. for 2 hours to obtain a sodium salt of Fmoc-Thr (THP) -OH (2.80 g, 6.26 mmol).
  • TFE / DCM (1: 1, v / v, 2 mL) was added to the resin and shaken for 1 hour to cut out the peptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtering the solution in the tube with a synthetic column, and the resin was washed twice with TFE / DCM (1: 1, v / v, 1 mL). All the extracts were mixed, DMF (2 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in NMP (0.5 mL), of which 1/4 (125 ⁇ L) was used for the next reaction.
  • NMP 0.5 mL
  • Example 7 Translational synthesis of peptides Outline of Experiment 1 An experiment was conducted to compare the translational properties of two types of ribosomes, a ribosome prepared from the L31intact strain (L31intact ribosome) and a ribosome prepared from the L31short strain (L31short ribosome). Specifically, the sequence mR-1 (SEQ ID NO: 10) or sequence mR-2 (SEQ ID NO: 11) of the template mRNA is used with the compounds AAtR-1, AAtR-2, and Initiator-tRNA (AAtR-3). It was translated and the peptide compound was translated and synthesized.
  • sequence mR-1 SEQ ID NO: 10
  • sequence mR-2 SEQ ID NO: 11
  • the translation solution includes the following. 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.0 mg / ml E.I. Cori MRE600 (RNase negative) -derived tRNA (Roche) (Non-patent document: (Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010.
  • Peptidyl-tRNA hydrolase Pth was added to 8.58 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • template DNA SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13
  • template mRNA, sequence mR-1 or sequence mR was subjected to an in vitro transcription reaction using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1280).
  • RiboMAX Large Scale RNA production System T7 Promega, P1280
  • -2 was synthesized and purified by RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • the sequence of mR-1 whose second letter from the starting amino acid is MeSer (tBuOH) depends on the L31 short ribosome of the translation amount of the target product at the optimum Mg 2+ concentration compared to the sequence of mR-2 which is Thr.
  • the improvement effect was great.
  • the usefulness of using the L31short ribosome prepared from the L31short strain was shown when translating using the Initiation Suppression (iSup) method.
  • the translation amount of the target product and the translation amount of the iRT peptide when the mR-1 sequence and mR-2 sequence are translated using the L31short ribosome or the L31intact ribosome are shown below.
  • ribosomes were prepared using wild-type Escherichia coli derived from the W3110 strain at three Mg 2+ concentrations of disruption buffer of 10 mM, 5 mM, and 0 mM.
  • the ribosomes prepared by each preparation method are called WT-10MG ribosome, WT-5MG ribosome, and WT-0MG ribosome.
  • the rate at which the L31 protein of each ribosome was degraded during purification was measured using MALDI-MS. As a result, it was shown that the lower the Mg 2+ in the crushed liquid, the more the L31 was decomposed.
  • the translation solution includes the following. 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 4 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.0 mg / ml E.I.
  • Non-Patent Documents (Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010. Nucleic acids research 38: e89) 3 ⁇ M in vitro transcription Escherichia coli tRNA Ala1B, 0.26 ⁇ M EF-G, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myo kinase, 2 unit / ml inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside dilinin.
  • Acid kinase 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 35 ⁇ M EF-Ts, 1 ⁇ M EF-P-Lys, 0.4 unit / ⁇ l RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 0.5 ⁇ M Penicillin G Amidase (PGA), 2.7 ⁇ M AlaRS, 1 ⁇ M GlyRS, 0.4 ⁇ M IleRS, 0.5 ⁇ M variant PheRS (WO2016 / 148044), 0.16 ⁇ M ProRS, 0.09 ⁇ M ThrRS, 1 ⁇ M variant ValRS ( WO2016 / 148044), 1 ⁇ M variant SerRS (WO2016 / 148044).
  • Initiator aminoacyl-tRNA (Compound AAtR-3) was added to the translation reaction mixture to 25 ⁇ M, and aminoacyl-tRNA containing compounds AAtR-1 and AAtR-2 to 10 ⁇ M each. It contains 185 ⁇ M of aminoacyl-tRNA that is not used for translation.
  • the procedure was carried out by adding 1.2 ⁇ M of WT-0MG ribosome, WT-5MG ribosome, or WT-10MG ribosome and allowing it to stand at 37 ° C. for 1 hour. Then, it was heated at 95 ° C. for 3 minutes and allowed to stand until it reached room temperature, then Peptidyl-tRNA hydrolase (Pth) was added to 8.58 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Peptidyl-tRNA hydrolase Peptidyl-tRNA hydrolase
  • the translations of the target products were WT-0MG ribosome, WT-5MG ribosome, and WT-10MG ribosome.
  • the iRT peptides were WT-0MG ribosome, WT-5MG ribosome, and WT-10MG ribosome in ascending order of the ratio to the target product. From the results of Experiment 1 and Example 3, it was shown that the ratio of ribosomes in which L31 is decomposed increases when the Mg 2+ concentration in the crushed solution is low, and the translation amount in the iSup method can be increased. Was done.
  • Example 8 Panning with L31short ribosome Synthesis of Acylated TRNA
  • Acylated tRNA to be used for panning was prepared by the method described in Patent Document (WO2013 / 100132).
  • An Elongator aminoacyl-tRNA mixture was prepared using 15 kinds of amino acids including Pic (2), MeAla (3-pyr), Ser (Ph-2-Cl) and MeGly described in the patent document (WO2018 / 225864).
  • the final concentration of each acylated tRNA in the translation solution was 10 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the Initiator aminoacyl-tRNA was the same compound as the compound AAtR-3 of Example 5, and was added to the translation solution so as to have a final concentration of 25 ⁇ M.
  • a randomized double-stranded DNA library encoding a peptide compound library A DNA library was constructed by the method described in the patent document (WO2013 / 100132). 24 types of triplets including TTT, TTG, CTT, ATT, ATG, GTT, CCG, ACT, GCT, CAT, CAG, AAC, GAA, TGG, CGG, AGT, AGG, GGT are randomly repeated 8 to 9 times. I prepared something that appears.
  • Glutathione S-transferase was used as the target protein used for panning.
  • the GST used was prepared for expression in Escherichia coli.
  • Biotinogenesis was performed according to Non-Patent Document BMC biotechnology, 2008,8,41 and Non-Patent Document Protein Science, 1990; 108 (4): 673-6.
  • the translation solution used for panning contains the following substances. 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithioslatel, 1 mg / ml E.I. Cori MRE600 (RNase negative) -derived tRNA (Roche) (Non-patent document: (Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010.
  • N-methylvaline 5 mM N-methylserine, 5 mM N-methylalanine, 5 mM N-methylphenylalanine, Elongator aminoacyl tRNA mixture, 25 ⁇ M Initiator aminoacyl tRNA, 10 ⁇ M Penicillin G Amidase (PGA).
  • the frequency of appearance is at least 1 round or more, rank A: 0.5% or more, rank B: 0.05% or more, or rank C: NGS has 50 or more reads, and the pool of the previous round is divided and targets are added.
  • a sequence was extracted in which the frequency of appearance increased by 10 times or more when the target was added as compared with the case of panning without panning.
  • rank A was 33 sequences
  • rank B was 253 sequences
  • rank C was 396 sequences.
  • rank A had 32 sequences
  • rank B had 175 sequences
  • rank C had 247 sequences.
  • Example 9 Translation experiment using L31 mutant ribosome Outline of Example 9 As described in Example 14 described later, eight types of L31 mutant strains having different lengths of L31 were constructed. As described in Example 15, ribosomes were prepared from these strains, L31short strain, L31intact strain, and W3110 strain. Peptide translational synthesis was performed using the obtained 11 types of ribosomes, and the translational properties of ribosomes containing the L31 mutant were investigated. Specifically, the following three types of peptides having different amino acids in the second letter were translated and synthesized using 11 types of ribosomes R1 to R11 shown in Table 6. In this specification, amino acids may be separated by colons to indicate the amino acid sequence as follows.
  • the target product (TM) and by-products were quantified using LC-MS.
  • the main by-product observed was the Initiation Readthrough (iRT) peptide whose translation was initiated from the amino acid of the third letter from the starting amino acid.
  • iRT Initiation Readthrough
  • a peptide whose translation is started from the second character may be referred to as 1iRT
  • a peptide whose translation is started from the third character may be referred to as 2iRT.
  • Tables 7 to 9 show TM (SEQ ID NO: 29 to 31) and 1iRT and 2iRT for each.
  • Example 7 In vitro transcribed Escherichia coli tRNA Ala1B, Lys, and aminoacyl-tRNA were removed from the translation solution composition of Experiment 1, and 0.5uM HisRS was added, 6.72 unit / ml myokinase, 59 ⁇ M EF-Ts, 4 mM. Translation conditions of Experiment 1 of Example 7 except that the composition is magnesium acetate, 20 ⁇ M initiator aminoacyl-tRNA (Compound AAtR-3), 10 ⁇ M aminoacyl-tRNA encoding the second letter of each type, 1.2 ⁇ M, various ribosomes, and 1 ⁇ M mRNA.
  • the composition is magnesium acetate, 20 ⁇ M initiator aminoacyl-tRNA (Compound AAtR-3), 10 ⁇ M aminoacyl-tRNA encoding the second letter of each type, 1.2 ⁇ M, various ribosomes, and 1 ⁇ M mRNA.
  • iRT ratio (iRT total concentration [nM]) / (iRT total concentration [nM] + TM concentration [nM]) ⁇ 100
  • Example 10 Effect of L31short ribosome on translational synthesis of various peptides Experiment 1
  • the starting amino acid is AcbzdMeCStBu, and various amino acids are placed in the second letter.
  • Outline of Experiment 1 Using the L31short ribosome and L31intact ribosome purified in Example 2, translational synthesis of 6 types of peptides with different amino acids in the second letter was performed, and translational synthesis of multiple peptides with the dominant translational properties of L31short ribosome. It was confirmed that it was recognized in. Specifically, six types of peptides having different amino acids (X) in the second character of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) were translated and synthesized.
  • X is Nle, S3F5MePyr, SPh2Cl, I, T, or L.
  • AcbzdMeCStBu X: MeF: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 36)
  • the template mRNA sequence mR-1 (SEQ ID NO: 10) and the aminoacyl-tRNA that spins the second letter are Nle-tRNAGlu (CUG), S3F5MePyr-tRNAGlu (CUG), SPh2Cl-tRNAGlu (CUG), and Ile-tRNAGlu (CUG), respectively. , Thr-tRNAGlu (CUG) and Leu-tRNAGlu (CUG) were used.
  • the aminoacyl-tRNA prepared in Example 13 was used.
  • the target product (TM) and by-products were quantified using LC-MS.
  • the main by-products observed were 1iRT and 2iRT.
  • the iRT ratio was calculated by the following formula.
  • iRT ratio (iRT total concentration [nM]) / (iRT total concentration [nM] + TM concentration [nM]) ⁇ 100
  • Example 9 Translation conditions From the translation conditions of Example 9, 8 mM magnesium acetate, 3 ug / ml myokinase, excluding HisRS, The translation conditions of Example 9 were followed except for the composition of 49 ⁇ M EF-Ts, 20 ⁇ M initiator aminoacyl-tRNA (Acbz-D-MeCys (StBu) -tRNAfMetCAU) (Patent Document WO2017150732).
  • Experiment 2 The starting amino acid is AcbzMeCStBu, and various amino acids are placed in the second letter.
  • Outline of Experiment 2 Using the L31short ribosome and L31intact ribosome purified in Example 2, translational synthesis of 12 types of peptides with different amino acids in the second letter was performed, and translational synthesis of multiple peptides with the predominant translational properties of L31short ribosome. It was confirmed that it was recognized in. Specifically, 12 types of peptides having different amino acids (X) in the second character of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 37) were translated and synthesized.
  • X is Nle, MeG, MeF, S3F5MePyr, MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, G, I, T, MeStBuOH, or L.
  • AcbzMeCStBu X: MeF: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 37)
  • MeG-tRNAGlu (CUG), MePhe-tRNAGlu (CUG), MeHph-tRNAGlu (CUG), MeA3Pyr-tRNAGlu (CUG), Gly-tRNAGlu (CUG), and MeSer (tBuOH) -tRNAGlu as aminoacyl-tRNAs that spin the second letter Experiments were carried out according to Experiment 1 of Example 10 except that (CUG) was additionally used. The main by-products observed were 1iRT and 2iRT.
  • Example 10 Experiment 1 The translation conditions of Example 10 Experiment 1 were followed except for 4 mM magnesium acetate and 20 ⁇ M initiator aminoacyl-tRNA (Compound AAtR-3).
  • Experiment 3 The starting amino acid is AcbzCStBu, and various amino acids are placed in the second letter.
  • Outline of Experiment 3 Using the L31short ribosome and L31intact ribosome purified in Example 2, translational synthesis of 12 types of peptides with different amino acids in the second letter was performed, and translational synthesis of multiple peptides with the predominant translational properties of L31short ribosome. It was confirmed that it was recognized in. Specifically, 12 types of peptides having different amino acids (X) in the second character of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 38) were translated and synthesized.
  • X is Nle, MeG, MeF, S3F5MePyr, MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, G, I, T, MeStBuOH, or L.
  • the experiment was carried out by a method according to Experiment 2 of Example 10.
  • AcbzCStBu X: MeF: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 38)
  • the target product (TM) and by-products were quantified using LC-MS.
  • the main by-products observed were 1iRT and 2iRT.
  • Example 9 Translation conditions 0.23 ⁇ M EF-G, 5.92 unit / ml myokinase 2, 1.0 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase 2.4 ⁇ M IF1, 1.3 ⁇ M IF3, 35 ⁇ M EF-Tu, 52 ⁇ M EF-Ts, 20 ⁇ M initiator aminoacyl
  • the translation conditions of Example 9 were followed, except that it was tRNA Acbz-Cys (StBu) -tRNAfMetCAU (WO2017 / 150732).
  • X is Nle, MeG, MeF, S3F5MePyr, Pic (2), MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, G, I, T, MeStBuOH, or L.
  • fMet X: MeF: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 39)
  • Example 10 Experiment 2 The translation conditions of Example 10 Experiment 2 were followed except that 0.03 ⁇ M MetRS, 0.6 ⁇ M methionyl tRNAformyltransferase, 0.25 mM methionine, and 0.1 mM folate were added except for initiator aminoacyl-tRNA (Compound AAtR-3). ..
  • results As shown in Table 14, the amount of TM translation in 12 of the 13 types was 1.2 to 2 times higher when L31short ribosome was used than when L31intact ribosome was used, and in all 13 types of sequences. , The proportion of iRT was lower when the L31short ribosome was used than when the L31intact ribosome was used.
  • Experiment 5 The starting amino acid is AcbzMeCStBu, the second amino acid is Thr, and various amino acids are placed in the third character.
  • Outline of Experiment 5 Using the L31short ribosome and L31intact ribosome purified in Example 15, translational synthesis of 14 types of peptides with different amino acids in the third letter was performed, and translational synthesis of multiple peptides with the predominant translational properties of L31short ribosome. It was confirmed that it was recognized in. Specifically, 14 kinds of peptides having different amino acids (X) in the third character of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 40) were translated and synthesized.
  • X is Nle, MeF, S3F5MePyr, Pic (2), MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, G, I, P, T, MeStBuOH, dA, or L.
  • AcbzMeCStBu T: X: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 40)
  • the template mRNA sequence mR-3 (SEQ ID NO: 28) and the aminoacyl-tRNA that spins the third letter are Nle-tRNAGlu (CUG), MePhe-tRNAGlu (CUG), S3F5MePyr-tRNAGlu (CUG), and Pic (2) -tRNAGlu, respectively.
  • the target product (TM) and by-products were quantified using LC-MS.
  • the main by-products observed were 1iRT and 2iRT.
  • Translation conditions 10 uM The translation conditions of Example 9 were followed, except that aminoacyl-tRNA encoding the third letter of each type was added.
  • X is Nle, MeG, MeF, S3F5MePyr, Pic (2), MeHph, MeA3Pyr, SPh2Cl, G, I, P, T, MeStBuOH, dA, or L.
  • fMet T: X: I: I: G: MeF: Bdp4AMF: I: I: P: I: G (SEQ ID NO: 41)
  • the experiment was carried out according to Experiment 5 of Example 10 except that MeG-tRNAGlu (CUG) was additionally used as the aminoacyl-tRNA that spins the third character.
  • the target product (TM) and by-products were quantified using LC-MS.
  • the main by-products observed were 1iRT and 2iRT.
  • Example 11 Synthesis of LCT-67 A peptide (LCT-67) having BdpFL at the N-terminal used as a standard for LC / MS was synthesized by the following procedure. Using 2-chlorolithyl resin (100 mg) carrying Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH as Fmoc amino acid, Fmoc-Thr (THP) -OH (THP) -OH synthesized by the method described in Patent Document (WO2018225864).
  • Peptides were elongated by a peptide synthesizer using aa01), Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-MePhe-OH, and Fmoc-Pro-OH (amino acid abbreviation). Will be described separately in this specification). Peptides were elongated according to the peptide synthesis method by the Fmoc method (see, for example, WO2013100132). After elongation of the peptide, the N-terminal Fmoc group was removed on a peptide synthesizer, and then the resin was washed with DCM.
  • TFE / DCM (1: 1, v / v, 2 mL) was added to the resin and shaken for 1 hour to cut out the peptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtering the solution in the tube with a synthetic column, and the resin was washed twice with TFE / DCM (1: 1, v / v, 1 mL). All extracts were mixed, DMF (2 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in NMP (1 mL), and 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacen-3-propionic acid N-silica gel was imiji.
  • Example 12 Synthesis of pCpA amino acids
  • Gly or G glycine
  • Ile or I isoleucine
  • Leu or L leucine
  • Phe or F phenylalanine
  • Pro or P proline
  • Thr or T threonine
  • Aminoacyl pCpA (ST04, ST08, ST11, ST14, ST17, ST20, ST23, ST28, ST31, ST32, ST33, ST34) was synthesized according to the following scheme.
  • the buffer solution A was prepared as follows. Acetic acid was added to an aqueous solution of N, N, N-trimethylhexadecane-1-aminium chloride (6.40 g, 20 mmol) and imidazole (6.81 g, 100 mmol), and pH 8, 20 mM N, N, N-trimethylhexadecane- A buffer solution A (1 L) of 1-aminium and 100 mM imidazole was obtained.
  • (2S) -1-[[4-[[2- (4-fluorophenyl) acetyl] amino] phenyl] methoxycarbonyl] pyrrolidine-2-carboxylic acid (Compound ST09, F-Pnaz-Pro-OH) ) (40.0 mg, 0.10 mmol) in acetonitrile solution (0.5 ml), 2-bromoacetonitrile (13.0 ⁇ L, 0.20 mmol) and N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (35. 0 ⁇ L, 0.20 mmol) were added sequentially at room temperature.
  • DIPEA N-ethyl-isopropylpropan-2-amine
  • 2-oxopyrimidine-1 (2H) -yl) -3-(((((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-amino-9H-purine-9-yl) -3,4-dihydroxy) Tetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy) phosphoryl) oxy) -4-((tetrahydro-2-yl) oxy) tetrahydrofuran-2-yl) methyl (72.2 mg, 0.10 mmol) is dissolved to dissolve 2-yl.
  • 2-oxopyrimidine-1 (2H) -yl) -3-(((((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-amino-9H-purine-9-yl) -3,4-dihydroxy) Tetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy) phosphoryl) oxy) -4-((tetra-2-yl) oxy) tetrahydrofuran-2-yl) methyl (72.2 mg, 0.10 mmol) is dissolved to dissolve cyanomethyl 2.
  • (2S) -2-[[4-[[2- (4-fluorophenyl) acetyl] amino] phenyl] methoxycarbonylamino] -3-hydroxybutanoic acid (Compound ST15, F-Pnaz-Thr- 2-Bromoacetonitrile (268 ⁇ L, 4.00 mmol) and N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (69.9 ⁇ L) in an acetonitrile solution (1.0 ml) of OH) (81.0 mg, 0.20 mmol). , 0.40 mmol) in sequence at room temperature.
  • (2S) -2-[[4-[[2- (4-fluorophenyl) acetyl] amino] phenyl] methoxycarbonylamino] -4-methylpentanoic acid (Compound ST18, F-Pnaz-Leu- 2-Bromoacetonitrile (20.0 ⁇ L, 0.30 mmol) and N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (7) in an acetonitrile solution (75.0 ul) of OH) (12.0 mg, 0.03 mmol). .86 ⁇ L, 0.05 mmol) were added sequentially at room temperature.
  • Trifluoroacetic acid (2.3 mL) was added to the reaction solution, the reaction solution was freeze-dried, and then subjected to reverse phase silica gel column chromatography (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution / 0.05% trifluoroacetic acid acetonitrile). Purification gave the title compound (Compound ST23, F-Pnaz-MeG-pCpA) (76.7 mg, 26%).
  • LCMS (ESI) m / z 1007.5 (MH)- Retention time: 0.48 minutes (analysis condition SQDFA05_02)
  • DMSO (2 mL) and triethylamine (128 ⁇ L, 0.92 mmol) were added to the mixture of benzyl (178 mg, 0.42 mmol) at room temperature.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 2.5 days and then purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.1% formic acid aqueous solution / 0.1% formic acid acetonitrile solution) (2S, 3S) -2-[.
  • (2S, 3S) -2-[[4-[[2- (4-fluorophenyl) acetyl] amino] phenyl] methoxycarbonylamino] -3-methylpentanoic acid (Compound ST29, F-Pnaz- Ile-OH) (42 mg, 0.1 mmol) and 2-bromoacetonitrile (13 ⁇ L, 0.200 mmol) were dissolved in acetonitrile (500 ⁇ L) and N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (35 ⁇ L, 0. 200 mmol) was added at room temperature and stirred at room temperature for 16 hours.
  • DIPEA N-ethyl-isopropylpropan-2-amine
  • Example 13 Synthesis of Aminoacyl-tRNA Various aminoacyl-tRNAs were synthesized and recovered according to the method described in "Synthesis of aminoacyl-tRNA using aminoacyl-pCpA: Part 1" of Example 5. The collected various aminoacyl-tRNAs were dissolved in 1 mM sodium acetate. Table 18 shows the correspondence between the names of the completed aminoacyl-tRNAs and the aminoacyl-pCpA amino acids used.
  • Example 14 Preparation of Escherichia coli strains expressing mutants Eight types of L31 mutant strains expressed at various lengths from the N-terminal side of the L31 protein (L31 (1-27), L31 (1-32), L31 (1-37) ), L31 (1-42), L31 (1-47), L31 (1-52), L31 (1-57), L31 (1-67)).
  • An E. coli strain was constructed according to the protocol attached to the Quick and Easy Conditional Knockout Kit (loxP / Cre) (Gene Bridges).
  • a functional cassette was created according to the method described in Example 1.
  • Table 19 shows the correspondence between the length of the L31 expression region of each strain and the primer used for PCR of the functional cassette used to prepare the strain.
  • L31 mutant strain was prepared according to the method described in Example 1.
  • Example 15 Purification of ribosomes Preparation of ribosomes using L31 mutant strain, L31short strain, L31intact strain, and W3110 strain
  • strain culture, Escherichia coli disruption, Escherichia coli purification, Butyl sepharose purification, and ultracentrifugation purification were performed. It was.
  • the Mg10 Lysis Buffer described in Example 2 was used for disruption of Escherichia coli.
  • the final concentration was adjusted to 10 to 20 ⁇ M, and a total of 11 types of ribosomes were prepared, including L31short ribosome, L31intact ribosome, WT ribosome, and 8 types of L31 mutant ribosome.
  • the present invention provides a method for producing a peptide and a peptide library containing an unnatural amino acid, a modified L31 protein for use in the method, and the like.
  • mRNA encoding a peptide containing an unnatural amino acid can be efficiently translated, and the peptide and a library containing the peptide can be efficiently produced.

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Abstract

改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系において、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳させることで、当該ペプチドの翻訳量を増加させることが可能なことが明らかとなった。また、当該リボソームを使用することにより、副生成物の相対的な量も減少させることが可能なことが明らかとなった。本発明における改変されたＬ３１タンパク質は、大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質のアミノ酸配列において、Ｃ末端から６以上のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有する。

Description

非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法
　本発明は、非天然アミノ酸を含むペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリの製造方法に関する。また本発明は、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質等に関する。
　近年、非天然アミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられている。なかでも無細胞翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含有するペプチドのｍＲＮＡディスプレイライブラリなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている。翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含むペプチドの合成法はいくつか報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、これらの文献に記載された方法では翻訳合成の効率が低い。
　生体内では、ペプチドは、ｍＲＮＡが有する塩基配列情報に即してアミノ酸が重合されることによって合成される。このペプチドの合成過程は翻訳と呼ばれる。翻訳の過程で中心的な役割を果たすのがリボソームである。ｍＲＮＡディスプレイライブラリの調製に用いられる無細胞翻訳系には、通常、精製したリボソームが添加されている。
　リボソームを構成するタンパク質として、Ｌ３１タンパク質が知られている。Ｌ３１タンパク質はinter subunit Bridge B1bを形成しているタンパク質で、３０Ｓと５０Ｓとの会合状態（７０Ｓ）を安定化する役割がある（非特許文献３）。
　Ｌ３１タンパク質は、その精製中にプロテアーゼ７によって分解を受けることが知られている。大腸菌野生型株から調製されたリボソーム、プロテアーゼ７を欠損したprotease7 KO株から調製されたリボソーム、およびＬ３１タンパク質を欠損したL31 KO株から調製したリボソームについてこれらの活性を比較すると、プロテアーゼ７欠損株から調製したリボソームは、大腸菌野生型株から調製したリボソームやＬ３１欠損株から調製したリボソームと比較して、その活性が大きいことが報告されている（非特許文献３）。またＬ３１欠損株から調製されたリボソームは、in vivoにおいてinitiation rateが３８％下がること、in vitroにおいて７０Ｓの形成速度が遅くなることも報告されている（非特許文献４）。さらに、Ｌ３１欠損株ではFidelityが下がることも報告されている（非特許文献４）。このように、天然アミノ酸からなるペプチドの翻訳においては、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームやＬ３１タンパク質を含まないリボソームよりもその活性が大きいことが知られていた。
Maini, R., Umemoto, S. & Suga, H. Ribosome-mediated synthesis of natural product-like peptides via cell-free translation. Current opinion in chemical biology 34, 44-52, doi:10.1016/j.cbpa.2016.06.006 (2016). Hartman, M. C., Josephson, K., Lin, C. W. & Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PloS one 2, e972, doi:10.1371/journal.pone.0000972 (2007). Ueta M, Wada C, Bessho Y, Maeda M, Wada A. Genes Cells. 2017 May;22(5):452-471. doi: 10.1111/gtc.12488. Epub 2017 Apr 10. Genes Cells. 2017 Lilleorg S, Reier K, Remme J, Liiv A. J Mol Biol. 2017 Apr 7;429(7):1067-1080. doi: 10.1016/j.jmb.2017.02.015. Epub 2017 Feb 24. J Mol Biol. 2017 Chadani Y, Niwa T, Izumi T, Sugata N, Nagao A, Suzuki T, Chiba S, Ito K, Taguchi H. Mol Cell. 2017 Nov 2;68(3):528-539.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.020. Mol Cell. 2017
　本発明は、一局面において、非天然アミノ酸を含むペプチドの効率的な製造方法、並びに当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームを提供することを課題とする。
　本発明者らは、翻訳系を利用して非天然アミノ酸を含むペプチドを製造するにあたり、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームとプロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームとの間で、ｍＲＮＡの翻訳効率に違いが生じるか検討を試みた。その結果本発明者らは、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression:iSP）法により非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳するときに、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用すると、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用する場合と比較して、目的産物の翻訳量が増加することを見出した。また本発明者らは、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用することにより、副生成物の相対的な量も減少させることが可能なことを見出した。これらの結果は、非天然アミノ酸を含まないペプチドの翻訳において従来知られていた事実とは逆の結果であった。さらに本発明者らは、翻訳系のマグネシウムイオン濃度を変えてペプチドの合成を行ったところ、マグネシウムイオン濃度が一定の濃度範囲にある場合に翻訳量が多く、かつ副生成物の割合も低いことを明らかにした。
　本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下〔１〕～〔３７〕に関する。
〔１〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたL３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。
〔２〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、 欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔３〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔４〕前記（１）に記載の、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記（１）に記載の、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるアミノ酸配列である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記（１）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記翻訳系における、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記翻訳系が２～８ｍＭのマグネシウムイオンをさらに含む、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記ペプチドを環化する工程をさらに含む、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記翻訳が、イニシエーションサプレッションにより行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記翻訳系に含まれる開始tRNAに非天然アミノ酸がアシル化されている、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記翻訳活性が、全翻訳産物に対するアミノ酸の読み飛ばしが生じている翻訳産物の割合（iRT割合）で評価される、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記翻訳活性が、配列番号：１０の鋳型mRNAを用いて、配列番号：２９のペプチドを翻訳することにより評価される、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームのiRT割合と比較して、前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームのiRT割合が15%以上低い、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載の方法により製造されたペプチドまたは当該ペプチドを含む、ライブラリ。
〔２４〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載された方法によって得られるペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリ、もしくは、〔２３〕に記載されたペプチドまたはライブラリに標的物質を接触させる工程、および
（ｂ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程。
〔２５〕〔２〕～〔２４〕のいずれかに記載の、改変されたL31タンパク質。
〔２６〕〔２５〕に記載の、改変されたL31タンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるL31タンパク質を除く）。
〔２７〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたＬ３１タンパク質をコードする単離された核酸。
〔２８〕〔２７〕に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。
〔２９〕以下（ａ）～（ｃ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞の培養物から溶解液を生成する工程、および
（ｃ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３０〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質の製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、および
（ｂ）前記細胞の培養物から発現産物を単離する工程。
〔３１〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、リボソームの製造方法；
（ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、フレンチプレスを使用して、野生型大腸菌の培養物から溶解液を生成する工程、および、
（ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３２〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたL31タンパク質を含むリボソーム。
〔３３〕〔３２〕に記載のリボソームを含む組成物。
〔３４〕〔３３〕に記載の組成物であって、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、組成物。
〔３５〕以下（ａ）および／または（ｂ）をさらに含む、〔３３〕または〔３４〕に記載の組成物；
（ａ）非天然アミノ酸とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ、
（ｂ）１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡ。
〔３６〕非天然アミノ酸がアシル化された開始tRNAをさらに含む、〔３３〕～〔３５〕のいずれかに記載の組成物。
〔３７〕以下の工程を含む、無細胞翻訳系の製造方法；
（ａ）〔２９〕または〔３１〕に記載の方法によりリボソームを製造する工程、および
（ｂ）前記リボソームを、非天然アミノ酸がアシル化された開始tRNAと混合する工程。
　本発明により、非天然アミノ酸を含むペプチドおよび当該ペプチドを含むライブラリの効率的な製造方法が提供された。また本発明により、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームが提供された。本発明の方法を用いることにより、非天然アミノ酸を含むペプチドやそのライブラリを効率的に製造することができる。
　従来、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されていないＬ３１タンパク質を含むリボソームよりもその活性が劣ることが示唆されていた。この事実を踏まえると、本明細書における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを用いることによって非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳できることは驚くべき効果であった。
L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-1配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。 L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-2配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。 WT-0MG リボソーム、WT-5MGリボソームまたはWT-10MGリボソームを用いて、mR-1配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を示すグラフである。
　本発明は、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含む、ペプチドまたはペプチドのライブラリの製造方法に関する。本発明においては、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系と、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとを混合することにより、ペプチドまたはペプチドのライブラリを製造することができる。したがって本発明は、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系と、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとを混合し、当該ｍＲＮＡを翻訳する工程を含む、ペプチドまたはペプチドのライブラリの製造方法に関する。本発明の製造方法は、大腸菌野生型に由来する配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを使用する場合と比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳することが可能な方法である。
　Ｌ３１タンパク質はリボソームを構成するタンパク質の一つであり、５０Ｓサブユニットおよび３０Ｓサブユニットの会合に重要な役割を果たす。本発明者らは、大腸菌野生型に由来する配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ３１タンパク質においてC末端側のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系において、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを合成した場合、大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系において当該ペプチドを合成する場合と比較して、翻訳産物の量が増加することを見出した。さらに本発明者らは、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系を用いた場合、大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系を使用する場合と比較して、副生成物の相対的な生成量を減少させることが可能なことを見出した。
　なお本明細書において、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質」は配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するＬ３１を指し、これを「大腸菌野生型Ｌ３１」、「ｉｎｔａｃｔなＬ３１」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔ」などと称する場合がある。また、本明細書において「改変されたＬ３１タンパク質」は「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質においてC末端から６以上のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」を指す。本明細書においては、このようなタンパク質のうち、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質において６３番目以降のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」、具体的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するＬ３１を、「ｓｈｏｒｔＬ３１」、「Ｌ３１ｓｈｏｒｔ」などと称する場合がある。また、「大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質において（Ｘ＋１）番目以降のアミノ酸残基が欠損した改変されたＬ３１タンパク質」を、「Ｌ３１（１－Ｘ）」と称する場合がある。すなわち、前記ｓｈｏｒｔＬ３１は、「Ｌ３１（１－６２）」とも称する。また本明細書において、あるＬ３１タンパク質を含むリボソームを、該Ｌ３１タンパク質の名称の後に「リボソーム」を付して表記することがある。例えば、「ｉｎｔａｃｔなＬ３１」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔ」、「ｓｈｏｒｔＬ３１」、「Ｌ３１（１－６２）」または「Ｌ３１ｓｈｏｒｔ」を含むリボソームを、それぞれ、「ｉｎｔａｃｔＬ３１リボソーム」、「Ｌ３１ｉｎｔａｃｔリボソーム」、「ｓｈｏｒｔＬ３１リボソーム」、「Ｌ３１（１－６２）リボソーム」または「Ｌ３１ｓｈｏｒｔリボソーム」などと称する場合がある。また、大腸菌野生型株から精製したリボソームを「ＷＴリボソーム」などと称する場合がある。
改変されたＬ３１タンパク質
　本開示における製造方法においては、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用することにより、大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームを使用する場合と比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳することが可能である。本発明の一態様において、改変されたＬ３１タンパク質は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
を例示することができる。
　前記（１）のタンパク質としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基、または9以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよく、例えば、C末端から６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個から選択される下限の値と、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個から選択される上限の値の範囲に含まれる個数のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。また一態様において、前記（１）のタンパクは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から６～５０個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、６～４３個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、８～５０個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数、または８～４３個の範囲に含まれる個数のいずれかの個数のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。さらなる態様において、前記（１）のタンパクとして、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、２７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。より具体的には、本開示における改変されたＬ３１タンパク質には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から８個、４３個、３８個、３３個、２８個、２３個、１８個、または１３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質およびこれらのタンパク質においてアミノ酸残基が改変（欠失、置換、及び／又は挿入）されたタンパク質が含まれる。すなわち、本開示における改変されたＬ３１タンパク質には、
（１）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、および
（３）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
も包含される。
　本発明の改変されたＬ３１タンパク質は、配列番号：２および４２～４８のいずれか、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質であることが好ましい。
　なお本明細書においては、「含む」は「含む」及び「からなる」の両方を意味する。
　いくつかの態様において、本開示の改変されたL３１タンパク質は、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上若しくは8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、または（ｉｉ）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数（例えば１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、若しくは３以下、または、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または１０を超える） のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。アミノ酸の付加、欠失、置換、及び／又は挿入は、当分野で公知の方法により行うことが可能である。例えば、アミノ酸配列をコードする核酸に対して、例えば部位特異的変異誘発法（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)）やOverlap extension PCRを行うことができる。これらを適宜、単独でまたは組み合わせて行ってもよい。
　一般に、タンパク質における１つまたは複数（例えば１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、若しくは３以下、または、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または１０を超える）のアミノ酸の改変（例えば、保存的な置換、欠失、挿入、および／または付加）は、そのペプチドの機能に影響を及ぼさず、または元のタンパク質の機能を強化しさえすることが知られている。アミノ酸は、その側鎖の特徴に応じて、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）に分類される。またアミノ酸の側鎖は、脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）に分類することもできる。配列番号：１、２、および４２～４８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に含まれるアミノ酸を、同じ特徴を有するグループに分類される他のアミノ酸で改変されたタンパク質もまた、本発明の改変されたＬ３１タンパク質に含まれる。ただし、本発明の改変されたＬ３１タンパク質は、配列番号：２および４２～４８のいずれか、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等である限り、非保存的改変も含んでよい。
　また本発明の一態様において、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上、若しくは8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列、または、配列番号：１、２、および４２～４８のいずれかで表されるアミノ酸配列と高い配列の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、本開示における改変されたＬ３１タンパク質に包含される。本開示において高い同一性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本開示において「機能的に同等」とは、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームが、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に関して、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）からなるＬ３１タンパク質を含むリボソームと同等の翻訳活性を示すことをいう。したがって、あるタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）からなるＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に関して同程度の活性を有する場合に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）と機能的に同等なタンパク質」ということができる。本発明者らは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載されたアミノ酸配列）を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きいことを明らかにした。したがって、あるタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい時に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列）からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質」ということができる。あるいは、あるタンパク質が、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含むＬ３１タンパク質と比較して、リボソームを構成した時に、リボソームに対して大きな非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性を提供した時に、当該あるタンパク質は「配列番号：１で表されるアミノ酸配列においてC末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（例えば、配列番号：２および４２～４８のいずれかに記載のアミノ酸配列）からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質」ということができる。
　本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」とは「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳効率」と表現することもでき、具体的には、非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡの取り込みやすさ、非天然アミノ酸をコードするコドンの読み飛ばしの程度、ペプチドの翻訳量、および／または副生成物の生成量が含まれる。
　本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい」とは「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳効率が高い」と表現することもでき、具体的には、非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡが取り込まれやすい、非天然アミノ酸をコードするコドンの読み飛ばしが少ない、目的ペプチドの生成量が多い、および／または副生成物の生成量が少ないことを意味する。
　本開示における「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」は、全翻訳産物に対するアミノ酸の読み飛ばしが生じている翻訳産物の割合を指標として評価することができる。非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳すると、目的産物（TM）の他に、開始アミノ酸が読み飛ばされ開始２文字目のアミノ酸から翻訳されたペプチド（本開示において「1iRT」という）や、開始アミノ酸および開始２文字目のアミノ酸が読み飛ばされ開始３文字目のアミノ酸から翻訳されたペプチド（本開示において「2iRT」という）等のイニシエーションリードスルー（iRT）ペプチドが含まれ得る。本開示においては、イニシエーションリードスルー（iRT）と目的産物（TM）の濃度から以下の式により算出される「iRT割合」を、「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」として採用できる。式中の「iRT total濃度」は、1iRT（開始2文字目から翻訳が開始されたペプチド）濃度と2iRT（開始3文字目から翻訳が開始されたペプチド）濃度の合計値として算出できる。
（数１）
　iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100
　具体的には、iRT割合は実施例に記載のアミノアシルtRNAや翻訳系等を使用し、実施例に記載の方法で評価することができる。一例として、配列番号：１０の鋳型mRNAを用いて、配列番号：２９～３１のいずれか、好ましくは配列番号：２９のペプチドを翻訳させることにより「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性」を評価することができる。
　本開示において「非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳活性が大きい」とは、iRT割合が低いことを意味することができる。「配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい」とは、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームのiRT割合と比較して、本開示の改変されたL31タンパク質を含むリボソームのiRT割合が15%、20%、25%、または30%以上低いことを意味することができる。
　なお、原核細胞のリボソームは５０Ｓのラージサブユニットおよび３０Ｓのスモールサブユニットを含む。５０Ｓサブユニットはさらに２３ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡならびに複数のタンパク質から構成される。また３０Ｓサブユニットは１６ＳｒＲＮＡおよび複数のタンパク質から構成される。一方、真核細胞のリボソームは６０Ｓのラージサブユニットおよび４０Ｓのスモールサブユニットを含む。６０Ｓサブユニットはさらに２８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡならびに複数のタンパク質から構成される。また４０Ｓサブユニットは１８ＳｒＲＮＡおよび複数のタンパク質から構成される。リボソームの構成因子は当業者に公知である。
アミノ酸
　本開示においてペプチドを構成する「アミノ酸」は、α－アミノ酸などの「天然アミノ酸」およびβ－アミノ酸、γ－アミノ酸などの「非天然アミノ酸」を含む。アミノ酸の立体構造は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸のいずれであってもよい。「アミノ酸」、「天然アミノ酸」、「非天然アミノ酸」はそれぞれ、「アミノ酸残基」、「天然アミノ酸残基」、「非天然アミノ酸残基」ということがある。
　特定の態様において、天然アミノ酸は、以下の２０種類のα－アミノ酸：グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、ヒスチジン（His）、グルタミン酸（Glu）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびプロリン（Pro）からなる。あるいは、上述の２０種類のアミノ酸から、任意の１種類以上のアミノ酸を除いたものを、本開示における天然アミノ酸としてもよい。一態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンを除く１９種類のアミノ酸からなる。一態様において、天然アミノ酸は、メチオニンを除く１９種類のアミノ酸からなる。さらなる態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンを除く１８種類のアミノ酸からなる。天然アミノ酸は通常、Ｌ型アミノ酸である。
非天然アミノ酸
　本開示において、非天然アミノ酸とは、上記の２０種類のα－アミノ酸からなる天然アミノ酸を除く全てのアミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例として、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、天然アミノ酸とは側鎖が異なるα－アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、主鎖のアミノ基が置換基を有するアミノ酸（Ｎ置換アミノ酸）などを挙げることができる。非天然アミノ酸の側鎖は、特に限定されないが、水素原子の他に、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどを有していてもよい。また、α，α－二置換アミノ酸の場合、２つの側鎖が環を形成していてもよい。さらに、これらの側鎖は、１つ以上の置換基を有していてもよい。特定の態様において、置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本開示において「ハロゲンを置換基に有するＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アルキルにおける少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子で置換された「Ｃ１－Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタフルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチルなどを含む。また、例えば「置換基を有するＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アリールおよび／またはアルキルにおける少なくとも一つの水素原子が置換基により置換された「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」を意味する。さらに、「置換基を２つ以上有している」とは、ある官能基（例えばＳ原子を含む官能基）を置換基として有し、さらにその官能基が別の置換基（例えばアミノやハロゲンなどの置換基）を有していることも含む。非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。
　非天然アミノ酸の主鎖のアミノ基は、非置換のアミノ基（ＮＨ２基）でもよく、置換されたアミノ基（ＮＨＲ基）であってもよい。ここで、Ｒは、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示す。また、プロリンのように主鎖のアミノ基のＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。アミノ基のアルキル置換の例としては、Ｎ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化などが、アラルキル置換の例としては、Ｎ－ベンジル化などが挙げられる。Ｎ－メチルアミノ酸の具体的な例としては、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸などを挙げることができる。
　ハロゲンを含む置換基としては、ハロゲンを置換基に有するアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。
　Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ基（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）が挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
　カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
　Ｓ原子を含む置換基として、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどが挙げられる。
　スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
　スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子を含む置換基として、アジド（－Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）が挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　Ｂ原子を含む置換基として、ボリル（－ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。
　ペプチドを構成する「アミノ酸」を構成する少なくとも１つの原子は、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子（同位体）であってもよい。当該ペプチドを構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
　本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ１－Ｃ２０、以下「Ｃｐ－Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ１－Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１－Ｃ６アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルケニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルキニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ１－Ｃ６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルケニルオキシ」とは、前記定義の「アルケニル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルオキシが挙げられる。アルケニルオキシとして具体的には、たとえば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－プロペニルオキシ、１－ブテニルオキシ、２－ブテニルオキシ（シス、トランスを含む）、３－ブテニルオキシ、ペンテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールオキシ」とは、前記定義の「アリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールオキシが挙げられる。アリールオキシとして具体的には、たとえば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書における「アミノアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アミノ」で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６アミノアルキルが好ましい。アミノアルキルとして具体的には、たとえば、１－ピリジルメチル、２－（１－ピペリジル）エチル、３－（１－ピペリジル）プロピル、４－アミノブチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。
　非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。
　一態様において、本願発明に係る製造方法により得られる１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを医薬品として使用することができる。ペプチドを医薬品として使用する場合、代謝安定性と膜透過性に優れていることが好ましい。このような性質を本明細書において「ドラッグライクネス」あるいは「ドラッグライク」という。本明細書において「ドラッグライクなアミノ酸」とは、α、β及びγアミノ酸であり、主鎖アミノ基（ＮＨ２基）の水素原子２つのうちの１つ、又は主鎖メチレン基（－ＣＨ２－基）の水素原子のうち１つあるいは２つはアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などで置換されていてもよい。これら置換基は、さらに「ドラッグライクネスに寄与する置換基」で置換されていてもよい。WO2018/225864に開示される「長側鎖」を有するアミノ酸が、ドラッグライクなアミノ酸として好ましく例示される。また、ドラッグライクなアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、α、α－二置換アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸等であってもよい。ドラッグライクなアミノ酸は、翻訳可能である必要は必ずしも無い。「翻訳アミノ酸」から得られたペプチドの側鎖部分（例えばD－チロシンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたD型のアミノ酸、β－アラニンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたβ－アミノ酸）、あるいはNメチルアミノ酸の化学変換によるN置換部分の構造最適化により化学的に合成し得るアミノ酸を含む。これらのアミノ酸はドラッグライクなペプチドの構成要素として機能するため、翻訳後に実施する化学修飾によって得られるペプチドがドラッグライクとなるような範囲から選択される。以下にて述べるとおり、例えばアミノアルキル基を有するリジンは、アミノ基が翻訳後修飾に関与しない場合にはドラッグライクなアミノ酸には含まれない。しかしながら、リジンのアミノ基を翻訳後修飾の反応性官能基として活用する場合（例えば交差ユニット）にはリジンユニットをドラッグライクなアミノ酸のユニットとして含む。このように、「ドラッグライクなアミノ酸」に該当するかどうかは、翻訳後の修飾によって変換された後の官能基にて判断される。このような置換基になり得る例として、別途上で定義した置換基の中から、例えばエステル基（－ＣＯ－ＯＲ）、チオエステル基（－ＣＯ－ＳＲ）、チオール基（－ＳＨ）、あるいは保護されたチオール基、アミノ基（－ＮＨ２）、モノ置換アミノ基（－ＮＨ－Ｒ）あるいはジ置換アミノ基（－ＮＲＲ'）、あるいは保護されたアミノ基、置換スルホニルアミノ基（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アルキルボラン基（－ＢＲＲ'）、アルコキシボラン基（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド基（－Ｎ３）、ケト酸基（－ＣＯ－ＣＯ２Ｈ）、チオカルボン酸基（－ＣＯ－ＳＨ）、ホスホリルエステル基（－ＣＯ－ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、アシルヒドロキシアミノ基（－ＮＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ）などが挙げられる。前記ドラッグライクなアミノ酸の側鎖に含まれる隣接しない１又は２個のメチレン基は、酸素原子、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ２－）で置換されていてもよい。
　本明細書における「ドラッグライクネスに寄与する置換基」としては、例えば、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、ヒドロキシ（－ＯＨ）、アルコキシ基（－ＯＲ）、オキシ（－ＯＲ）、アミド（－ＮＲ－ＣＯＲ'もしくは－ＣＯ－ＮＲＲ'）、スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）、スルフィニル（－ＳＯＲ）、オキシアミノ（－ＮＲ－ＯＲ'）、アミノオキシ（－Ｏ－ＮＲＲ'）、オキシカルボニル（－ＣＯ－ＯＲ）、チオカルボニル（－ＣＯ－ＳＲ）、チオール（－ＳＨ）、チオ（－ＳＲ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨＲ）あるいは３級アミノ（－ＮＲＲ'）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、ボリル（－ＢＲＲ'）、ジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド（－Ｎ３）、カルボキシカルボニル（－ＣＯ－ＣＯ２Ｈ）、ホスホリルカルボニル（－ＣＯ－ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、カルボニルオキシアミノ（－ＮＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ）、ヒドロキシアミノ（－ＮＲ－ＯＲ'）、アミノヒドロキシ（－Ｏ－ＮＲＲ'）等の置換基が例示される。
　また、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを構成する非天然アミノ酸の特に具体的な例として、MeSer(tBuOH)、BODIPYFL-4-AMF、MeCys(StBu)、MeG、MeStBuOH、Nle、S3F5MePyr、SPh2Cl、MeF、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、Pic(2)、MeHph、dA等を例示することができる。これらの非天然アミノ酸は、例えばペプチドの2文字目または3文字目の位置に含まれ得る。
ペプチド
　本開示においてペプチドとは、２以上のアミノ酸がアミド結合及び／又はエステル結合で結合したものをいう。限定を意図しないが、本開示におけるペプチドには、鎖状ペプチド、及び環状ペプチドが含まれる。また、本開示におけるペプチドには、ペプチド、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド－核酸複合体）、ペプチドとリボソームと核酸の複合体等が含まれる。また、本開示における「核酸」にはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡが含まれる。また、本開示における「ペプチド」には、その薬学的に許容される塩が含まれてもよい。
　本開示におけるペプチドは、一態様において、２～１００個、３～５０個、４～３０個、または５～３０個のアミノ酸が、アミド結合及び／又はエステル結合により連結されている。例えば、一態様において、本願発明に係る１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを医薬品として使用する場合、高い膜透過性を獲得するために、ペプチドを構成するアミノ酸の数は２０以下が好ましく、１８以下、１６以下、１５以下、又は１４以下がより好ましく、１３以下が特に好ましく、具体的には、９、１０、１１、１２、１３が例示される。また高い代謝安定性を獲得するためには、ペプチドを構成するアミノ酸の数は８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１０以上が更に好ましく、１１以上が特に好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、ペプチドを構成するアミノ酸の数は５～２０、又は７～２０が好ましく、７～１７、８～１６、９～１６、又は１０～１６がより好ましく、８～１３、１０～１５、１１～１５、１０～１４、１０～１３、又は１１～１４がさらに好ましく、１１～１３が特に好ましい。
　本開示における環状ペプチドの環状部を構成するアミノ酸の数は限定されないが、例えば、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、前記環状部を構成するアミノ酸の数は、５～１５が好ましく、５～１４、７～１４、又は８～１４がより好ましく、８～１３、９～１３、８～１２、８～１１、又は９～１２がさらに好ましく、９～１１が特に好ましい。なお、本明細書においてペプチドの「環状部」とは、２以上のアミノ酸残基が連結され、形成されている環状の部分を意味する。
　非限定の一態様において、本開示における環状ペプチドは直鎖部を有していてもよい。本明細書において、環状ペプチドの部分構造を指す際に使用される「直鎖部」とは、環状部の主鎖構造に含まれない部分であって、該部分の鎖上に少なくとも一つのアミド結合及び／又はエステル結合を有するものをいう。直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０～８であることが好ましく、０～５がより好ましく、０～３がより好ましい。なお、非限定の一態様において、本明細書における直鎖部には天然アミノ酸や非天然アミノ酸（化学修飾や骨格変換されたアミノ酸を含む）が含まれる場合がある。
　非限定の一態様において、本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の数は、２以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の数としては、環状部を構成するアミノ酸の数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。また、本開示におけるペプチドに含まれる非天然アミノ酸の種類は、１以上が好ましく、２以上、３以上、又は４以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。
　本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドにおいて非天然アミノ酸を含む部位は限定されないが、一態様として開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むことができ、更に、２文字目および／または３文字目のアミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むことができる。
　開始アミノ酸の部位にｆＭｅｔ以外のアミノ酸を導入した場合、開始２文字目や３文字目のアミノ酸から翻訳が開始されるInitiation read through（iRT）と定義する現象が観察されることが知られている（以下、このようにして生産されたペプチドを、Initiation read throughペプチド（iRTペプチド）と定義する）。本開示における改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを用いることにより、開始アミノ酸の部位に非天然アミノ酸が導入されているペプチドを合成する場合であってもInitiation read throughの現象を防ぐことができる。また、iRTペプチドは環化されない。そのため、環状ペプチドを含むライブラリを作成する場合において、それをコードするmRNAの大部分がiRTペプチドをコードするものになると、ディスプレイ可能な分子数が限られ、環状ペプチドのディスプレイ数が減少し、ライブラリの多様性が減少してしまう。本開示における改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを用いることにより、このようなライブラリの品質低下を防ぐことができる。
ペプチドをコードするｍＲＮＡ
　本開示においては、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳してペプチドを製造する。ｍＲＮＡとは、タンパク質に翻訳され得る遺伝情報を持ったＲＮＡのことである。遺伝情報はコドンとしてｍＲＮＡ上にコードされており、それらが全２０種類のアミノ酸にそれぞれ対応している。タンパク質の翻訳は開始コドンから始まり、終止コドンで終了する。真核生物における開始コドンは原則としてＡＵＧであるが、原核生物（真正細菌および古細菌）ではＡＵＧの他にＧＵＧやＵＵＧなども開始コドンとして使用されることがある。ＡＵＧはメチオニン（Ｍｅｔ）をコードするコドンであり、真核生物および古細菌ではそのままメチオニンから翻訳が開始される。一方、真正細菌では、開始コドンのＡＵＧ のみＮ－ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ）に対応しているため、ホルミルメチオニンから翻訳が開始される。終止コドンには、ＵＡＡ（オーカー）・ＵＡＧ（アンバー）・ＵＧＡ（オパール）の３種がある。終止コドンが翻訳終結因子（release factor;RF）と呼ばれるタンパク質によって認識されると、それまでに合成されたペプチド鎖がｔＲＮＡから解離し、翻訳工程は終了する。一態様において、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡとして、少なくとも開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするコドンを含むものを例示することができる。
　本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡにおいて非天然アミノ酸を含む部位は限定されないが、一態様として開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸をコードするコドンを含むことができる。
ペプチドの翻訳
　上述の通り、本開示においては、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドを、当該ペプチドをコードするｍＲＮＡから翻訳して製造することができる。本明細書において「翻訳」とは、ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）から、該ペプチドを翻訳して合成することを意味する。翻訳とは、リボソームの作用によってｍＲＮＡを鋳型にアミド結合及び／又はエステル結合反応を繰り返すことによって直鎖ペプチドを得る工程である。
　一局面において、本開示は、非天然アミノ酸を少なくとも１種、２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上含むペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法を提供する。限定はされないが、このような製造方法は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
　(i) 非天然アミノ酸が結合したtRNAを少なくとも１種、２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上用意する工程；
　(ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を翻訳系で翻訳し、前記ペプチドを得る工程。
　ここで該核酸は前記ｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含んでよい。また非限定の一態様において、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡは、少なくとも開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするコドンを含むものであってよい。
　天然のアミノ酸の翻訳では、６４種類のコドンそれぞれに、２０種類のタンパク質性アミノ酸及び翻訳の終止が割り当てられている。翻訳系から特定のアミノ酸を除去すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。そこで、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに所望の非天然アミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行えば、当該アミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに所望の非天然アミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。
　本開示における一態様において、ペプチドの翻訳には、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression：iSP）法を利用することが好ましい。通常の翻訳では、一般的に翻訳開始アミノ酸としてメチオニンがＮ末端アミノ酸として翻訳される。翻訳の開始には専用の「開始ｔＲＮＡ」があり、開始ｔＲＮＡがメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）と結合しリボソームに運ばれることによって、翻訳が開始され、Ｎ末端のアミノ酸がメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）となる。これに対し、翻訳系内からメチオニンがアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを除去し（または生成されないにし）、予め調製した所望のアミノ酸がアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを代わりに翻訳系内に加えることによって、Ｎ末端に所望のアミノ酸を持つペプチドを翻訳することをイニシエーションサプレッション法という。非天然アミノ酸の許容度は、アミノ酸の伸長時よりＮ末端への導入において高く、天然アミノ酸と大きく構造の異なる非天然アミノ酸をＮ末端アミノ酸として利用できることが知られている（非特許文献：J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.）。本開示における一態様において、翻訳系に含まれる開始tRNAには非天然アミノ酸がアシル化されていてもよい。
翻訳系
　本開示において「翻訳系」とは、ペプチドを翻訳するための方法およびペプチドを翻訳するための組成物の両方を含む概念として定義される。本開示において「翻訳系」は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含むものであれば限定されない。本開示における「翻訳系」は、その他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたもので、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものを含むことが好ましい。また、翻訳が進行している間の系も、本明細書における「翻訳系」に含まれてよい。本明細書における翻訳系は、ペプチドを翻訳する際の鋳型となる核酸を含んでいてよく、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ARS）は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。なお、必要に応じて、翻訳系にT7 RNA polymeraseなどのＲＮＡポリメラーゼを加えることで、鋳型ＤＮＡから転写させることもできる。
　本明細書において、「翻訳系がある物質を含む」とは、翻訳の開始時に該物質を含んでいなくても、翻訳の過程において系内で該物質が合成され含まれることになる態様も含む。例えば、翻訳の過程で、アミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡが合成される場合には、翻訳系が該アミノアシルｔＲＮＡを含むと理解される。
　翻訳系の主な種類としては、生細胞を利用した翻訳系や、細胞抽出液を利用した翻訳系（無細胞翻訳系）がある。生細胞を利用した翻訳系としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物細胞などの生細胞に、所望のアミノアシルtRNAおよびmRNAをマイクロインジェクション法やリポフェクション法により導入してペプチド翻訳を行う系が知られている（Nowak et al., Science (1995) 268: 439-442）。無細胞翻訳系の例としては、大腸菌（Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690）、酵母（Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969）、小麦胚芽（Erickson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 38-50）、ウサギ網状赤血球（Jackson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 50-74）、HeLa細胞（Barton et al., Methods Enzymol (1996) 275: 35-57）、あるいは昆虫細胞（Swerdel et al., Comp Biochem Physiol B (1989) 93: 803-806）などからの抽出液を利用した翻訳系が知られている。このような翻訳系は、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。無細胞翻訳系には、ペプチド翻訳に必要な因子をそれぞれ単離・精製して、それらを再構成して構築された翻訳系（再構成型の無細胞翻訳系）も含まれる（Shimizu et al., Nat Biotech (2001) 19: 751-755）。再構成型の無細胞翻訳系には、通常、リボソーム、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えばRF1、RF2、RF3）、リボソーム再生因子（ribosome recycling factor; RRF）、エネルギー源としてのNTP類、エネルギー再生系、および翻訳に必要なその他の因子などが含まれ得る。DNAからの転写反応を併せて行う場合は、さらにRNAポリメラーゼなどが含まれ得る。無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は、当業者に周知の方法によって単離・精製することが可能であり、それらを用いて再構成型の無細胞翻訳系を適宜構築することができる。あるいは、ジーンフロンティア社のPUREfrex（登録商標）や、New England BioLabs社のPURExpress（登録商標）などの市販されている再構成型の無細胞翻訳系を利用することもできる。再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。
　PURESYSTEM（登録商標）(BioComber, Japan)は大腸菌における翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.)。
　例えば、非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、前述のPURESYSTEMを用いることで天然アミノ酸、ARSを除いた合成系を構築できる。これにより、除外する天然アミノ酸をコードするコドンに、非天然アミノ酸を対応付けることが出来る(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらにコドンの縮重を解くことにより天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることが出来る（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003, 125, 7512-3.）。N-メチルアミノ酸を含むペプチドがPURESYSTEMなどの無細胞翻訳系の活用によりリボソームにて合成できる。
　より具体的には、翻訳合成は、例えば、大腸菌における翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを適宜取捨選択して混合したPURESYSTEM等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。また、所望のアミノアシルtRNA群やアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が許容する非天然アミノ酸群（例えばF-Tyr）を系に添加することによって非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。さらに、天然のARSに代えて又はこれらに加えて、ARSの改変体を系に含めるとともに、非天然アミノ酸群を系に含めることによっても、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳することが出来る。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによって、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、およびそれに伴う非天然アミノ酸の導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y, et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
　また本開示における翻訳系は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを、当該翻訳系に含まれる全リボソームに対し、分子数の比率で、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）の割合で含むことが好ましい。「全リボソーム」としては、翻訳系に含まれるリボソームである限り特に限定されないが、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームとそれ以外のリボソーム（例えば、大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームおよびそれと機能的に同等なリボソーム）との合計を例示することができる。
　改変されたＬ３１タンパク質の翻訳系に含まれる全リボソームに対する割合は、例えば質量分析器による改変されたＬ３１タンパク質の強度と全リボソームの強度の比率に基づいて算出することができる。
　また本開示における翻訳系は、マグネシウムイオンを含むことが好ましい。リボソームのスモールサブユニットとラージサブユニットの会合状態の維持にはマグネシウムイオンが必要であることが知られている。Ｌ３１タンパク質はリボソームのラージサブユニットとスモールサブユニットの相互作用を形成するタンパク質の一つである。Ｌ３１タンパク質を欠損しているリボソームや、ｓｈｏｒｔＬ３１を含むリボソームは、会合状態を保つために必要なマグネシウムイオン濃度が、ｉｎｔａｃｔなＬ３１を含むリボソームより高いことが明らかにされている。したがって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームが用いられる本開示における製造方法においては、マグネシウムイオン濃度を、ｉｎｔａｃｔなＬ３１を含むリボソームが用いられる翻訳系におけるマグネシウムイオン濃度よりも高くすることが好ましい。このような翻訳系を調製するために、本発明の方法においては、マグネシウムイオンを本発明における翻訳系に加える工程をさらに含むことができる。あるいは、本発明においては、マグネシウムイオンがあらかじめ加えられた翻訳系を使用することもできる。加えられるマグネシウムの量は特に限定されないが、例えば、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上または７ｍＭ以上の値から選択される下限と、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下から選択される上限との任意の組み合わせによって特定可能な範囲を例示することができる。
ｔＲＮＡ
　非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳することにより非天然アミノ酸をペプチドに導入にするにあっては、直交性を有し効率よくリボソームに取り込まれるｔＲＮＡ（(i)Biochemistry. 2003;42:9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression. Anderson JC, Schultz PG., (ii)Chem Biol. 2003;10:1077-84.Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H, Kourouklis D, Suga H.）のアミノアシル化が必要である。tRNAをアミノアシル化する方法として以下の５つの方法を用いることができる。
　細胞内ではtRNAのアミノアシル化のための酵素として、アミノ酸別にアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が用意されている。そのため第一の方法としては、ある種のARSがN-Me Hisなど非天然アミノ酸を許容することを利用する方法や、非天然アミノ酸を許容する変異アミノアシルtRNA合成酵素を用意し、これを利用する方法が挙げられる（(i)Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translationand its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M, Harada Y, Nakayama H, Takio K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.(ii)Science. 2003;301:964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW, Cropp TA, Anderson JC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz PG. Chin,JW.(iii) Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC, Josephson K, Szostak JW.）。第二に、試験管内でtRNAをアミノアシル化しその後アミノ酸を化学修飾する方法も用いることができる（J Am Chem Soc. 2008;130:6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO, Hartman MC, Szostak JW.）。第三に、tRNAの3'末端のCCA配列からCAを除いたものと別途調製したアミノアシル化したpdCpAとをRNAリガーゼで結合させることでアミノアシルtRNAを得ることが出来る(Biochemistry. 1984;23:1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS.Heckler TG, Chang LH, Zama Y, Naka T, Chorghade MS, Hecht SM.)。種々の非天然アミノ酸の活性エステルをtRNAに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化もある（J Am Chem Soc. 2002;124:6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.Murakami H, Bonzagni NJ, Suga H.)。第四に、tRNAとアミノ酸活性エステルとをカチオン性ミセル中で超音波混合する方法も用いることができる(Chem Commun (Camb). 2005;(34):4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T, Sisido M.)。第五として、tRNAの3'末端付近に相補的なPNAにアミノ酸活性エステルを結合したものをtRNAに加えることによってもアミノアシル化が可能である（J Am Chem Soc. 2004;126:15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K, Minohata T, NishimuraM, Sisido M.）。
　より具体的には、以下のような方法を用いてアミノアシルtRNAを作製することができる。所望のtRNA配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。当該ｔＲＮＡは、ペプチドの製造において有用である。あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々の非天然アミノ酸の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。また、限定を意図しないが、天然のＡＲＳ又はその改変体を用いて、アミノアシルｔＲＮＡを作製することもできる。天然ＡＲＳ又はその改変体を用いると、翻訳系内で一旦消費されたアミノアシルｔＲＮＡが、天然ＡＲＳやその改変体によって再生成され得るため、予め作製したアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系に大量に存在させる必要がない。このようなＡＲＳ改変体は、WO2016/148044に記載される。これらのアミノアシルtRNAの作製方法を適宜組み合わせることもできる。
ペプチドの環化
　非限定的な一態様において、本開示におけるペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法においては、翻訳されたペプチドを環化する工程をさらに含むことができる。環化の態様として、例えば、アミド結合、炭素－炭素結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合等を利用した環化が挙げられる。中でも代謝安定性が高いことから、アミド結合が好ましい。ペプチドの翻訳工程と環化反応の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。環化は、例えばWO2013/100132、WO2008/117833、WO2012/074129等に記載された当業者に公知の方法により行うことができる。
　環形成における結合の態様は、限定されないが、ペプチドのN末端とC末端の結合、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、ペプチドのC末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合のいずれであってもよく、これらの二以上を組み合わせて使用してもよい。
　非限定の一態様において、本発明は、例えば、以下の工程を含むペプチドまたはペプチドを含むライブラリの製造方法に関する：
（１）１種または複数種の非天然アミノ酸を含む非環状のペプチドを、本明細書に記載の方法によって製造する工程であって、該非環状のペプチドは、C末端側に側鎖の１つに反応点を有するアミノ酸残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基を含む、工程；及び
（２）N末端側のアミノ酸残基の反応点と、C末端側の側鎖に反応点有するアミノ酸残基の当該反応点とを結合させ、アミド結合、炭素-炭素結合又はチオエーテル結合を形成させる工程。
　なお、これら（１）と（２）の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。
　具体的には、アミド結合によるペプチドの環化方法の非限定的な一態様として、Ｎ末端のメチオニンのアミノ基と下流（C末端側）に配置したリジンのアミノ基をジスクシンイミジル・グルタレート（ＤＳＧ）でクロスリンクさせることによる環化方法やＮ末端の翻訳開始アミノ酸としてクロロアセチル基を有するアミノ酸誘導体を導入し、下流にＣｙｓを配置することによって分子内環化反応によりチオエーテルを形成させることによる環化方法、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある。
　非限定の一態様において、本開示におけるペプチドのC末端部位はカルボン酸のままではなく、化学修飾されていてよい。例えば、カルボン酸部位をピペリジンなどと反応させ、ピペリジンアミドなどに変換してよい。
ライブラリ
　また本発明は、本明細書に記載されたペプチドの製造方法により製造されたペプチドおよび当該ペプチドを含むライブラリに関する。また本発明は、本明細書に記載されたペプチドの製造方法によってペプチドを製造する工程を含む、当該ペプチドを含むライブラリに関する。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチドを含むライブラリ、及び本開示におけるペプチドをコードする核酸を含むライブラリが含まれる。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチドのライブラリ、ペプチド－核酸複合体のライブラリが含まれる。ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましい。ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。
ディスプレイライブラリ
　ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリである。このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチドを同定することができる。例えば、所望の固定した標的にライブラリを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNAディスプレイ(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。
　Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合したペプチドの配列を明らかにすることが出来る。
　無細胞翻訳系を利用したディスプレイライブラリには、mRNAディスプレイの他に、ペプチドとピューロマイシンの複合体が結合しているペプチドをコードするｃＤＮＡからなるライブラリであるcDNAディスプレイ(Nucleic Acids Res. 2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization ofmRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソームと翻訳産物が比較的安定な複合体であることを利用したリボソームディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、bacteriophage endonuclease P2AがDNAと共有結合を形成することを利用したcovalent display(Nucleic AcidsRes. 2005;33:e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Lobersli I, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、微生物のプラスミドの複製開始蛋白RepAが複製開始点oriに結合することを利用したCIS display(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from librariesof protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, HedererR, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)が知られている。また、DNAライブラリを構成するDNAの1分子毎に転写翻訳系をwater-in-oilエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行うin vitro compartmentalization(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
核酸ライブラリ
　本開示における「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本開示において核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が一本鎖に連結されたキメラ核酸も本開示における核酸に含まれる。
　ペプチドライブラリに含まれるペプチドの鋳型となる核酸のライブラリとしては、mRNAライブラリ、DNAライブラリ等が例示される。ペプチド配列上でアミノ酸残基を固定しない箇所は塩基を混ぜて合成することによって、核酸ライブラリを得ることができる。例えば、DNAライブラリとしては、A, T, G, C、RNAライブラリとしては、A, U, G, Cのそれぞれ4塩基の混合(N)の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はN、三文字目はW, M, K, Sなどの2塩基の混合として合成する、さらに導入するアミノ酸の種類を16以下に抑えるのであれば、三文字目を1種類の塩基にする方法もある。また、コドンの3文字に相当するコドンユニットを用意し、これを任意の割合で混合して合成に用いることによってアミノ酸残基の出現頻度を自由に調整できる。
　無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定されない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。
　本開示におけるライブラリの製造は、本開示におけるペプチドの製造方法に準じて行うことができ、適宜公知の方法と組み合わせることができる。一態様において、上述した本開示における無細胞翻訳系を使用して本開示におけるペプチドのライブラリを製造できる。すなわち、本開示におけるライブラリの製造方法には、本開示における無細胞翻訳系を使用してペプチドを合成する工程を含んでよい。一態様において、本開示における無細胞翻訳系において記述した、例示、好ましい範囲、態様が、本開示におけるライブラリの製造方法においてもそのまま適用できる。
スクリーニング方法
　非限定の一態様において、本開示におけるライブラリを使用したスクリーニングにより、標的分子に特異的に結合できるペプチドを選択することができる。
　非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、本開示における１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドのライブラリと標的分子を接触させ、標的分子に結合しないペプチドを洗い流すことで標的分子に結合するペプチドを濃縮することができる（パニング）。一態様においては、このようにして選択されたペプチドに含まれる塩基配列情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることができる。なお、一態様において、上記で増幅されたｃＤＮＡを転写することによって、ｍＲＮＡライブラリを得てもよく、これらを鋳型として再度ペプチドのライブラリを製造してもよい。このライブラリは標的分子に結合できるペプチドが濃縮されているため、このライブラリを用いて再度パニングを行うことで、標的分子に特異的に結合できるペプチドを、より濃縮することができる。この工程を複数回繰り返すことにより、目的のペプチドを、更に濃縮することができる。一態様において、このようにして濃縮されたペプチドに含まれる塩基配列情報を基にアミノ酸配列を同定し、標的分子に特異的に結合できるペプチドを製造することができる。一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、in vitroで行うことができる。
　非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法により得られたペプチドを公知の方法により化学修飾等することで、ペプチドを最適化してもよい。本明細書において「最適化」とは、翻訳されたペプチド中のそれぞれのアミノ酸の構造を変換させることにより、よりドラッグライクなペプチドとなるように化学修飾する、より薬効標的に強い活性を有するペプチドとなるように化学修飾する、及び/又は、より毒性が回避されたペプチドとなるように化学修飾することを意味する。
　非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本開示におけるライブラリに含まれるペプチドと標的分子を接触させる工程；
（ｂ）前記標的分子に結合できるペプチドを選択する工程。
　本開示におけるスクリーニング方法は、上記工程（ａ）の前に、本明細書に記載の方法によってライブラリを取得する工程を含むことができる。当該ライブラリは、本開示におけるペプチドの製造方法に倣って取得することができる。
　一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、前記の（ａ）及び（ｂ）の工程を２回以上繰り返すことで、標的分子に特異的に結合できるペプチドを濃縮してもよい。
標的分子
　本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は特に限定されず、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質などが例示されるが、中でもタンパク質を標的とすることが好ましい。また生体内における標的分子の存在場所も特に限定されない。一態様において、細胞内のタンパク質を標的とすることもできる。
　非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は、担体に固定して使用される。担体としては、標的分子を固定することができれば特に限定されないが、ビーズ又は樹脂が例示される。標的分子は公知の方法により担体に固定することができる。
　上述のとおり、本開示におけるライブラリ及びスクリーニング方法の標的分子は、特に限定されないが、GTPase KRas (KRAS)、Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1)、Mitogen-sctivated protein kinase 3 (ERK1)、インターロイキン６受容体 (IL-6R) が例示される。実施例に記載されるように、本開示におけるライブラリは、様々な標的分子に対し特異的に結合できるペプチドを含むため、一態様において、これまで創薬が困難とされてきたtough targetへの創薬を可能にし得る。
　非限定の一態様において、本開示におけるペプチドの製造方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（ｉ）本開示におけるライブラリに含まれるペプチドと標的分子を接触させる工程；
（ｉｉ）該標的分子に結合できるペプチドを選択する工程；及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択されたペプチドのアミノ酸配列に基づき、ペプチドを製造する工程。
　上記方法は、本明細書に記載の方法によってライブラリを取得する工程を含むことができる。
　非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造方法、ペプチドの製造方法、及び／又はスクリーニング方法はin vitroで行ってよい。
　一局面において、本開示におけるペプチドは、環化されたものであってもよい。
改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸等
　また本発明は、本開示の改変されたＬ３１タンパク質、当該タンパク質を含むリボソーム、当該タンパク質をコードする単離された核酸に関する。また本発明は、当該核酸を含むベクターまたは細胞に関する。
　本開示の改変されたL31タンパク質としては、例えば、以下（１）～（６）を挙げることができる。
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基、8以上のアミノ酸残基、または9以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
（４）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（５）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、および
（６）配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
　本開示における改変されたＬ３１タンパク質、当該タンパク質を含むリボソーム、当該タンパク質をコードする単離された核酸等は、例えば、本開示における非天然アミノ酸を含むペプチドや当該ペプチドを含むライブラリの製造等に利用することが可能である。
　本開示において「単離された」核酸とは、自然環境の要素から分けられた核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外に存在するか、その天然の染色体位置とは違う位置に存在している。天然の染色体に存在しない核酸の場合には、単離された核酸は、細胞内のいずれの位置に存在していてもよい。本開示における「核酸」にはＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）およびＲＮＡが含まれる。
　本明細書で言い換え可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1～20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1～20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
　本開示における改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸を調製するための方法として、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. and Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。あるいは、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）によっても、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載の改変されたＬ３１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を得ることも可能である。すなわち、本開示における改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸は、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列と高い相同性を有する核酸の単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　これにより単離された核酸は、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載の改変されたL31タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。また塩基配列レベルにおいて、配列番号：２および４２～４８より選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、上述の通り、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を指す。
　本発明の核酸は、例えば、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームの調製などに利用することが可能である。改変されたＬ３１の組み換えタンパク質、またはこれを含むリボソームを調製する場合には、通常、改変されたＬ３１タンパク質をコードする核酸を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して、発現させた改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを単離、精製、培養する。改変されたＬ３１タンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。
　非限定の一態様において、ベクターは、相同組換えによって本発明の核酸がノックインされたノックインベクターであってもよい。すなわち、本発明の改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームは、相同組換えにより本発明の核酸をベクターにノックインすることを通して調製することもできる。このようなベクターは、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを調製するための本発明の核酸が、大腸菌等の宿主中の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入されるように構築されたものであってもよい。一態様において、本発明の核酸は、ノックインベクターにおいてその翻訳開始点が標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子の翻訳開始点の5'側には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。別の一態様において、ノックインベクターの任意の外来遺伝子の5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加されている場合には、当該エクソン・イントロン構造の5'側末端が、標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、前記エクソン・イントロン構造の5'側末端の5'側上流には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。
　またノックインベクターは、宿主細胞内において複製する能力を有することが好ましい。ノックインベクターは遺伝子工学に利用されるベクターであれば特に限定されず、公知のベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（BAC）ベクター、酵母人工染色体（YAC）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターその他のウイルスベクター等が挙げられる。
　宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M., Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた改変されたＬ３１タンパク質は、該宿主細胞またはその細胞培養物もしくは培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。改変されたＬ３１タンパク質を上記のマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
　本開示の一態様において、本発明の核酸はベクターに挿入されたものであってもよい。ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有するベクターが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。改変されたＬ３１タンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また植物体内で発現するベクターとしてpMH1、pMH2、pCAMBIAなどのベクターが挙げられる。
　大腸菌以外にも、例えば、改変されたＬ３１タンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、例えば、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームの製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質の製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、上述のCHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に加え、3T3、ミエローマ細胞、BHK （baby hamster kidney）、HeLa、Vero等の細胞）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340））、あるいは昆虫細胞（例えば、sf9 、sf21、Tn5等の細胞）が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。
　植物細胞としては、後述の植物由来の細胞の他、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。
　また真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られているがこれらに限定されない。
　本開示において、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームは、野生型大腸菌の培養物から精製することによっても取得することもできる。すなわち、培養された野生型大腸菌を低濃度のマグネシウムイオンを含むバッファーに懸濁し、それを破砕することにより、改変されたＬ３１タンパク質を含む溶解液を得ることができる。具体的には、野生型大腸菌を、例えば５ｍＭ以下（より具体的には、例えば４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、または０ｍＭ）のマグネシウムイオンを含むバッファー中で破砕することにより、本明細書に記載の配列番号：１に記載された大腸菌野生型Ｌ３１タンパク質と本開示における改変されたＬ３１タンパク質とを含む溶解液を得ることができる。大腸菌体の破砕は、フレンチプレスによる破砕、超音波処理による破砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラズビーズによる破砕、乳鉢による破砕など、当業者に公知の手法を用いて行うことができるが、本開示においてはフレンチプレスによる破砕が好ましい。このようにして調製される溶解液を当業者に公知の手法により精製すると、改変されたＬ３１タンパク質、またはこれを含むリボソームを単離、取得することができる。
　本発明の別の局面において、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む組成物が提供される。本開示における組成物は、例えば、非天然アミノ酸を含むペプチドの製造等における翻訳系またはその一部として利用することが可能である。したがって本開示における組成物は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームに加え、例えば、非天然アミノ酸とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡ等をさらに含むことが好ましい。本開示における組成物は、本開示における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを、当該組成物に含まれる全リボソームに対し少なくとも、分子数の比率で５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）の割合で含むことが好ましい。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下に、実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の内容は必ずしも以下の実施例にのみ限定されるものではない。なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ　　　　　　酢酸アンモニウム
ＣＨ２ＣＮ　　　 シアノメチル基
ＣＨ３ＣＮ　　　アセトニトリル
ＣＴＡＣｌ　　　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物
ＤＢＵ　　　　　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ　　　　　ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　　　　ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ　　　　ジメチルスルホキシド
ＦＡ　　　　　　ギ酸
Ｆｍｏｃ　　　　９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆ－Ｐｎａｚ　　４－（２－（４－フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
ＭｅＣＮ　　　　アセトニトリル
ＮＭＰ　　　　　N-メチル‐２‐ピロリドン
ＴＥＡ　　　　　トリエチルアミン
ＴＦＡ　　　　　トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ　　　　　テトラヒドロフランＴＭ  　目的産物
　MePheをMeF、Pic(2)をPic2、GlyをG、IleをI、ProをP、ThrをT、MeSer(tBuOH)をMeStBuOH、D-AlaをdA、LeuをL、BODIPYFL-4-AMFをBdp4AMF、Acbz-D-MeCys(StBu)をAcbzdMeCStBu、Acbz-MeCys(StBu)をAcbzMeCStBu、Acbz-Cys(StBu)をAcbzCStBuと省略して記載することがある。
実施例１．大腸菌株の構築
　ompT（Protease7）の欠損株（L31intact株と定義する）および、L31タンパク質のN末端側62アミノ酸までを発現するL31short株を構築した。リボソームの精製過程において、Protease7はL31タンパク質の62番目のアミノ酸と63番目のアミノ酸の間で分解する事が知られている。
　Quick and Easy Conditional Knockout Kit (loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキットに従い、大腸菌株を構築した。
ホモロジーアームが付加した機能カセットの作成
　機能カセットloxP-PGK-gb2-neo-loxP （Gene Bridges 社, A003）を鋳型に用いてPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社, R010A）にてPCR反応をおこなった。得られたPCR産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社, 28104）を用いて精製した。機能カセットの濃度は200ng/μL程度であった。ompT（Protease7）欠損株作成用の機能カセットCassette-1はOligo1（配列番号：３）, Oligo2（配列番号：４）のプライマーを用いてPCRを行った。L31short株作成用の機能カセットCassette-2はOligo3（配列番号：５）、Oligo4（配列番号：６）のプライマーセットを用いてPCRを行った。
大腸菌株の作成
　Quick and Easy Conditional Knockout Kit (loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキットに記載のプロトコルに従って実施した。大腸菌 W3110 株 (Escherichia coli K-12 W3110)を用いて、pRed/ETを形質転換し、Red/ETを発現するコンピテントセルを調製した。機能カセットCasette-1もしくはCasette-2を、調製したコンピテントセルにエレクトロポレーションで導入し、相同組換えを誘導した。得られたコロニーよりコロニーPCRをおこない、増幅されたDNAの長さからカナマイシンカセットの導入かつ目的の遺伝子の欠損あるいは一部欠損を確認した。キット記載のプロトコルに従い、取得した目的の大腸菌株よりLoxp配列で挟まれたカナマイシン耐性遺伝子カセットを欠失させた。取得した大腸菌をシングルコロニー化し、遺伝子組み換え箇所のゲノムDNAの配列を読むことで、目的の株の完成を確認した。
実施例２．リボソームの調製方法
大腸菌の培養
　W3110株（WT）の培養をおこなった。
　前培養培地（Glycerol 5g/L, Yeast Extract 6g/L, KH2PO4, 4g/L, K2HPO4 9.3g/L）に菌体W3110株を植菌し、前培養を行った。前培養菌をOD600=0.1になるように本培養用培地（Glycerol 10 g/L, Yeast Extract 10 g/L, ポリペプトンN 15 g/L, KH2PO4 4 g/L , MgSO4・7H2O 2.4g/L , FeSO4・7H2O 0.04g/L, CaCl2・2H2O 0.04g/L,アデカノールLG-109 0.24g/L）30Lに添加した。培養は50L培養槽で行った。37℃で5.4時間培養し、OD600=33.5になったところで回収した。培養液は、500 mlずつ分注し、室温に1時間、4℃に1時間静置した。静置後 6000×g, 10minで遠心し、沈澱をD-PBS(-)（タカラバイオ社、T9181）で懸濁して再度6000×g、10分で遠心操作を行った。回収した菌体は液体窒素で凍結し、-80℃で保管した。
L31short株、もしくはL31intact株の培養
　培養にはLB培地、Miller（ナカライテスク社、20068-75）を使用した。菌体の前培養を行った。前培養した菌体を、OD600=0.05になるように本培養培地に添加した。培養は3Lバッフル付きフラスコ（コーニング社、431253）に、1LのLB培地を添加しておこなった。Climo-shaker ISF-1-Xを用いて、37℃で、100rpmで、約2時間40分程度培養して、OD600が1.0程度になった事を確認して、室温に取り出し、1時間静置した。その後4℃で1時間静置した。5000×g、10分で遠心操作を行うことで菌体を回収した。培地と等量のPBS（タカラバイオ社、T9181）で菌体を懸濁して再度5000×g、10分で遠心操作を行った。菌体は液体窒素で凍結し、-80℃で保管した。
大腸菌の破砕
L31intact株とL31short株におけるFPを用いた破砕
　回収菌体1ODあたり、0.004mLのLysis Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 5～10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）で懸濁した。FrenchPress（Emulsi Flex B15, AVESTIN）を用いて破砕を行った。圧力設定は40Barであった。破砕速度は約1ml/minになるようにコントロールした。20000×g、30分、4℃で遠心操作を行い、上清を回収した。
WT株におけるFPを用いた破砕
　次の組成の3種類のLysis Bufferを用意した。
　Mg10 Lysis Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）
　Mg5 Lysis Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）
　Mg0 Lysis Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μg/mL DNaseI）
　各種類のLysis Bufferを用いて、回収菌体1ODあたり、0.004mLのLysis Bufferで菌体を懸濁した。 FrenchPress（Emulsi Flex B15, AVESTIN）を用いて破砕を行った。圧力設定は40Barであった。破砕速度は約1ml/minになるようにコントロールした。20000×g、30分、4℃で遠心操作を行い、上清を回収した。
大腸菌の精製
L31short株、もしくはL31intact株の硫安沈殿
　大腸菌破砕液上清に対して等量の2×硫安沈殿用Buffer（10 mM HEPES-KOH, pH7.6, 5～10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 3.24M 硫酸アンモニウム, 1mM DTT）を添加して、4℃で30分間 撹拌した。4℃、20000×g、40分で遠心操作を行い、上清を回収した。0.22μm (Millipore社)のフィルターでろ過した。
WT株の硫安沈殿
　大腸菌破砕液上清1mlに対して、乳鉢で細かく砕いた0.222gの硫酸アンモニウムを、スターラーを用いて撹拌しながら添加した。4℃で30分間 撹拌した。4℃、20380×g、40分で遠心操作を行い、上清を回収した。0.22μm (Millipore社) のフィルターでろ過した。
Butyl sepharose 精製
　Butyl Sepharose 4 FastFlow（GEヘルスケア、17098002）をXK50カラム（GEヘルスケア、28988952）に充填したカラムを使用した。Buffer A(20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 1.5 M (NH4)2SO4, 1mM DTT)で、カラムを置換した。2ml/minで、硫安沈殿後のサンプルをカラムに添加した。Buffer Aでカラムを洗浄後、つづいて30% BufferA、70％ Buffer B(20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 1mM DTT)でさらに洗浄した。その後、50% Buffer Aと50% BufferBで溶出した。
超遠心精製
　30% sucrose Buffer (20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 30mM NH4Cl, 30% Sucrose, 1mM DTT)を超遠心チューブの容量の半量添加し、そこに界面を乱さないようにButyl sepharose精製後の溶出液を添加した。99700×g、20時間、4℃で遠心した。ペレットを保存Buffer（20 mM HEPES-KOH, pH7.6, 6mM Mg(OAc)2, 30mM KCl, 1mM DTT）で懸濁した。
　最終濃度が20～30μMになるように調製した。
　最終的にL31shortリボソーム、L31intactリボソーム、WT-10MGリボソーム（Mg10 Lysis Bufferを使用）、WT-5MGリボソーム（Mg5 Lysis Bufferを使用）、WT-0MGリボソーム（Mg0　Lysis Bufferを使用）の5種類のリボソームの調製をおこなった。
実施例３．L31の分解割合の分析
　WT-10MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-0MGリボソームのL31の分解割合を分析した。
サンプル調製方法
　40pmolのリボソームを38μLの水で希釈した。トリフルオロ酢酸を1%になるように添加し、リボソーマルRNAを沈澱させた。遠心操作を行い、上清をマトリックス（50%アセトニトリル、5 mg/ml シナピン酸）と1:1で混合し、MALDI/MS用のプレートに1μLスポットして結晶化した。
MALDI/MSでの分析
　質量分析器（ABS CIEX・TOF/TOF　5800）を用いて、Liner Positiveモードを用いて測定した。リボソーマルタンパク質を内部スタンダードとしてキャリブレーションを行った。キャリブレーションが正しく行われた測定結果を用いた。IntactなL31の割合は、Intact L31のMS intensityをIntact L31のMSのintensityとShortL31のMS intensityの和で割ることで求めた。N=3 で測定を実施し、平均値をintactなL31の割合とした。
L31分解率の分析の結果
　WT-10MG リボソームでは71％がintactなL31であった。同様にWT-5MG リボソームは20％、WT-0MG リボソームは7%がintactなL31であった。
実施例４．無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸（アミノアシルｐＣｐＡともいう）の合成
　ＬＣＭＳの分析条件は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Pnaz-MeSer(tBuOH)-pCpA (TS01)の合成
化合物ＴＳ０１の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリン（ＴＳ０１－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ＷＯ２０１８２２５８６４に基づいて合成した（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］－３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロポキシ）プロパン酸（ＴＳ０１－１、４１．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．１０ｍＬ）に溶解し、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（３２．０ｕＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５時間撹拌した。ＤＣＭを減圧濃縮により除去し、（２Ｓ）－３－（２－ヒドロキシ－２－メチル－プロポキシ）－２－（メチルアミノ）プロパン酸（ＴＳ０１－２）を粗生成物として得た。得られた（２Ｓ）－３－（２－ヒドロキシ－２－メチル－プロポキシ）－２－（メチルアミノ）プロパン酸（ＴＳ０１－２、粗生成物）とＷＯ２０１８２２５８６４に基づいて合成した炭酸（４－ニトロフェニル）―４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１１０．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（０．５０　ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（４１．８ｕＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１時間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィ（０．１％ＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ／０．１％ＦＡ　ｉｎ　ＣＨ３ＣＮ）で精製し、標題の化合物（ＴＳ０１－３、４０ｍｇ、８４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４７５．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチル　Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリン（ＴＳ０１－３、１９．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（０．２０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（１０．４８ｕＬ，０．０６ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセトニトリル（３．２２ｕＬ，０．０４８ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、表題の化合物（ＴＳ０１－４）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　５１４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル　Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　緩衝液Ａ（１０ｍｌ）に、文献記載（Helv. Chim. Acta, 90, 297- 310）の方法で合成したリン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２８．９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ－メチル－Ｌ－セリナート（ＴＳ０１－４、粗生成物）のアセトニトリル溶液（０．０２１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．５０ｍｌ）を滴下し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却したのちトリフルオロ酢酸（０．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で６０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（ＴＳ０１、８．０ｍｇ、１８．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１０９．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　なお、緩衝液Ａは以下のように調整した。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ７．９、２０ｍＭ　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。
ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ（ＭＴ０１）の合成
（２Ｓ）－３－[４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　窒素雰囲気化、(2S)-3-[4-(アミノメチル)フェニル]-2-[[4-[[2-(4-フルオロフェニル)アセチル]アミノ]フェニル]メトキシカルボニルアミノ]プロパン酸（５００ｍｇ，０．９６８　ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４．５ｍｌ）懸濁液に４Ｎ　ＨＣｌの１，４－ジオキサン溶液を室温で加えた。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣と［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル　（４－ニトロフェニル）　カーボネート（４１１　ｍｇ、０．９６８　ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）懸濁液にＤＩＰＥＡ（４１３　ｍｇ、３．１９　ｍｍｏｌ）を室温で加えた。室温で２時間撹拌した後、ピペリジン（４００　ｍｇ、４．７　ｍｍｏｌ）を室温で加え、１５分撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、（２Ｓ）－３－［４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）（８３．３　ｍｇ、　１８％収率、３ステップ）　を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４８０．３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ４ ，５λ ４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＭＴ０３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　窒素雰囲気化、（２Ｓ）－３－［４－（アミノメチル）フェニル］－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパン酸（化合物ＭＴ０２）（１１．８ｍｇ，０．０３０　ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（５００ｍｌ）溶液３－（３－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニ－４－ニウムのＮＭＰ（５００ｍｌ）溶液を室温で加えた。４０℃で１０分撹拌した後、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＭＴ０３）（１４．６　ｍｇ、　６４％収率）　を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７５２．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ４ ，５λ ４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　窒素雰囲気下、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（２３．２　μＬ，　０．１３３　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（９．０　μＬ，　０．１３３　ｍｍｏｌ）を０℃で加えたのち、４０℃で３．５時間撹拌した。反応液を濃縮し、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０４）を粗生成物として得た。得られた粗生成物は、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　７９１．４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラハイドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル　（２Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ ４ ，５λ ４ －ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパノエート（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　緩衝液Ａ（５５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４７．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）－３－（４－（（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパンアミド）メチル）フェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３）（５２.３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５　ｍＬ）を３回に分けて加えたのち、室温で９０分撹拌した。反応液に０℃でＴＦＡ（３　ｍＬ）を加え、５分撹拌したのち、室温にて４０分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％　ＴＦＡ　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－（４－ＡＭＦ）－ｐＣｐＡ）（８．３　ｍｇ、９．１％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１３８６．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例５．アミノアシルｔＲＮＡの合成
tRNAGlu(-CA)の配列
　定法により以下のtRNAGluCUU（-CA）を調製した。
配列ＴＲ－１（配列番号：７）
tRNAGluCUU(-CA)　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
　定法により以下のtRNAGluCUG（-CA）を調製した。
配列ＴＲ－２（配列番号：８）
tRNAGluCUG(-CA)　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
　定法により以下のtRNAfMet(CAU)(-CA）を調製した。
配列ＴＲ－3（配列番号：９）
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その１
　５０μＭ　転写tRNAGluCUG(-CA)（配列番号：8）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシルｐＣｐＡ（TSO1）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、最終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１
MeSer(tBuOH)- tRNAGluCUG
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その2
　５０μＭ　転写tRNAGluCUU(-CA)( 配列番号：7）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシルｐＣｐＡ（ＭＴ０１）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、最終濃度０．３Ｍになるように 酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－２）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－２
BODIPYFL-4-AMF-tRNAGluCUU
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その3
　５０μＭ　転写tRNAfMetCAU(-CA）（配列番号：９）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭの(Acbz-MeCys(StBu)-pCpA (特許文献WO2017150732に記載の化合物nk14)のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムを添加して、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシルtＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を回収した。回収したアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。）
化合物ＡＡｔＲ－３
Acbz-MeCys(StBu)- tRNAfMetCAU
実施例６．LCT12の合成
ＬＣＴ－１２のペプチド合成機によるペプチド合成に用いる（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．１７５ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２８ｍＬ）と３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（８．８ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５℃まで冷却し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３ｇ）を得た。
　得られた粗生成物のうち、４．６５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調整した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０℃で４時間攪拌した。２５℃まで冷却した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５℃で３０分乾燥させた。
　得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（～１００ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩（２．８０ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を得た。
　得られた全量のＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０ｍＬ）を加えて、２５℃にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５℃で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、２．７０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして得た。得られたＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨは－２５℃の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
ＬＣ／ＭＳの標品として用いるＮ末端にＢｄｐＦＬを持つペプチド（ＬＣＴ－１２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを担持させた２－クロロ卜リチルレジン（１００ｍｇ）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った。Ｆｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った（ＷＯ２０１３１００１３２Ｂ２）。ペプチドの伸長後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＣＭにて洗浄した。
　レジンにＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、２ｍＬ）を加えて１時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）にて２回洗浄した。全ての抽出液を混合し、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解し、そのうち１／４（１２５μＬ）を次の反応に使用した。ペプチドのＮＭＰ溶液に７６．５ｍＭに調製したＢｄｐＦＬスクシンイミドエステル（１４０μＬ）を室温にて加え、４０℃で終夜撹拌した後、減圧下濃縮した。得られた残査を０．０５Ｍ　テトラメチルアンモニウム硫酸水素塩　ｉｎ　ＨＦＩＰ（１．２　ｍｌ，　０．０６０　ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ　ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（ＬＣＴ－１２）（０．３ｍｇ）を得た。ＬＣＴ－１２のアミノ酸配列を配列番号：１７に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１９７２．９　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
実施例７．ペプチドの翻訳合成
実験１の概要
　L31intact株から調製したリボソーム（L31intact リボソーム）、L31short株から調製したリボソーム（L31short リボソーム）の2種類のリボソームの翻訳特性を比較する実験を実施した。
　具体的には、鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）あるいは配列mR-2（配列番号：１１）を化合物AAtR-1、AAtR-2、Initiator-tRNA（AAtR-3）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。翻訳産物としてはmR-1では、Acbz-MeCys(StBu):MeSer(tBuOH):MePhe:Ile:Ile:Gly:MePhe:BODIPYFL-4-AMF:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly（配列番号：１４）、mR-2ではAcbz-MeCys(StBu):T:MePhe:Ile:Ile:Gly:MePhe:BODIPYFL-4-AMF:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly（配列番号：１６）が翻訳されるように設計した。以後アミノ酸をコロンで区切って表記する。
　LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは開始アミノ酸から3文字目のアミノ酸から翻訳が開始されたInitiation Read through (iRT)ペプチドであった。
翻訳条件
　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液には下記のものを含む。１ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　ＡＴＰ、２０ｍＭ　クレアチンリン酸、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６、１００ｍＭ　酢酸カリウム、２ｍＭ　スペルミジン、１ｍＭ　ジチオスレイトール、１．０ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献：(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010. Nucleic acids research 38:e89)に記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ　Ａｌａ１Ｂ、０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．７μＭ　ＩＦ１、０．４μＭ　ＩＦ２、１．５μＭ　ＩＦ３、４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ、35 μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１）、０．４～０．５μＭ　Penicillin G Amidase (ＰＧＡ)、2.7μM AlaRS、1 μＭ　ＧｌｙＲＳ、０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ、０．５ μＭ　変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ、０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ、１μM 変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、 1μM 変異体SerRS（WO2016/148044）、250μM Gly、250μM Lys、100μM Ile、250μM Pro、250μM Thr、5mM N-メチルアラニン、5mM N-メチルフェニルアラニン、5mM N-メチルセリン、５mM Ｎメチルバリン。酢酸マグネシウム濃度を2 mM、4 mM、6 mM、8 mMの4点で調製し、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を25μＭ、化合物 AAtR-1とAAtR-2を含むアミノアシルｔＲＮＡを各10μＭになるように翻訳反応混合物に添加した。また、mRNA (mR-1もしくはmR-2)を1μMになるように翻訳反応混合物に添加した。翻訳には使用されないアミノアシルtRNAを185μM含んでいる。L31shortリボソームまたはL31incactリボソームを1.2μMになるように添加して、３７℃で１時間静置することで行った。その後、95℃で3分間加熱し室温になるまで静置後、Peptidyl-tRNA hydrolase (Pth)を8.58μMになるように添加し37℃で1時間静置した。
mRNAの調製
　鋳型ＤＮＡ（配列番号：１２または、配列番号：１３）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ1280）を用いたin vitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ、配列ｍＲ－１または配列ｍＲ－２を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
分析概要
　非天然アミノ酸を含むペプチド翻訳産物を含む溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳されたペプチドの保持時間を同定し、該当保持時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例６にて合成したLCT12を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の分析条件でおこなった。
分析条件
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
結果
　各リボソームの至適なMg濃度におけるmR-1、mR-2のmRNAの配列の翻訳実験とも、L31short リボソームで翻訳した場合の目的産物の翻訳量がL31intactリボソームを用いて翻訳した場合に比べて多かった。
　各リボソームの至適なMg濃度におけるmR-1、mR-2のmRNAの配列の翻訳とも、副生成物であるiRTペプチドの翻訳量の目的産物に対する割合は、L31short リボソームを用いた場合のほうが、L31intactリボソームを用いた場合に比べて低かった。
　開始アミノ酸から2番目の文字がMeSer(tBuOH)であるmR-1の配列のほうが、 ThrであるmR-2の配列に比べて至適Mg2+濃度での目的産物の翻訳量のL31shortリボソームによる向上効果が大きかった。
　Initiation Suppression (iSup)法を用いた翻訳の際に、L31short株より調製されたL31shortリボソームを用いる事の有用性が示された。
　L31shortリボソームまたはL31intactリボソームを用いて、mR-1配列、mR-2配列を翻訳した時の目的産物の翻訳量とiRTペプチドの翻訳量を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
実験２の概要
　実施例２にて、W3110株由来の野生型大腸菌を用いて、破砕バッファーのMg2+濃度を10mM、5mM、0mMの3点にてリボソームを調製した。それぞれの調製方法で調製したリボソームをWT-10MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-0MGリボソームと呼ぶ。実施例３にて、それぞれのリボソームのL31タンパク質が精製中に分解された割合をMALDI-MSを用いて測定した。その結果、破砕液中のMg2+が低いほどL31が分解されていることを示した。
　これらのリボソームを用いて実験１と同様に、mR-2の配列を用いて翻訳実験を行った。
その結果、最もL31の分解がされていたWT-0MGリボソームを用いた場合が最も目的産物の量が多い事がわかった。
翻訳条件
　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液には下記のものを含む。１ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　ＡＴＰ、２０ｍＭ　クレアチンリン酸、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６、１００ｍＭ　酢酸カリウム、4 mM酢酸マグネシウム、２ｍＭ　スペルミジン、１ｍＭ　ジチオスレイトール、１．０ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献:(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010. Nucleic acids research 38:e89) 記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ　Ａｌａ１Ｂ、０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．７μＭ　ＩＦ１、０．４μＭ　ＩＦ２、１．５μＭ　ＩＦ３、４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ、35μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１）、０．５μＭ　Penicillin G Amidase (ＰＧＡ) 、2.7μM AlaRS、1μＭ ＧｌｙＲＳ、０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ、０．５ μＭ　変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ、０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ、１μM 変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、1μM 変異体SerRS（WO2016/148044）。250μM Gly、250μM Lys、100μM Ile、250μM Pro、250μM Thr、5mM N-メチルアラニン、5mM N-メチルフェニルアラニン、5mM N-メチルセリン、５mM Ｎメチルバリン。ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３）を25μＭ、化合物 AAtR-1とAAtR-2を含むアミノアシルｔＲＮＡを各10μＭになるように翻訳反応混合物に添加した。翻訳には使用されないアミノアシルｔRNAを185μM含んでいる。WT-0MG リボソーム、WT-5MGリボソーム、もしくはWT-10MGリボソームを1.2μM添加して、３７℃で１時間静置することで行った。その後、95℃で3分間加熱し室温になるまで静置後、Peptidyl-tRNA hydrolase (Pth)を8.58μMになるように添加し37℃で1時間静置した。
分析概要
　非天然アミノ酸を含むペプチド翻訳産物を含む溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳されたペプチドの保持時間を同定し、該当保持時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例６にて合成したLCT12を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の分析条件でおこなった。
分析条件
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
結果
　目的産物の翻訳量は多いものから、WT-0MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-10MGリボソームであった。
　また、iRTペプチドの目的産物に対する割合が少ないものから順にWT-0MGリボソーム、WT-5MGリボソーム、WT-10MGリボソームであった。
　実験1の結果と実施例3の結果から、破砕液中のMg2+濃度が低い状態で、L31が分解されているリボソームの比率が多くなり、iSup法における翻訳量を上げることができると示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例８. L31shortリボソームを用いたパニング
アシル化tRNAの合成
　特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。特許文献（WO2018/225864）に記載のPic(2)、MeAla(3-pyr)、Ser(Ph-2-Cl)、MeGlyを含む15種類のアミノ酸を用いて、ＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ混合物を調製した。それぞれのアシル化tRNAの翻訳液中の最終濃度は10μM～20μMであった。Ｐｎａｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。ＩｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡは、実施例５の化合物ＡＡｔＲ－３と同一化合物であり、最終濃度が25μMになるように翻訳液中に添加して用いた。
ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された2本鎖DNAライブラリ
　特許文献（WO2013/100132）に記載の手法でDNAライブラリを構築した。TTT、TTG、CTT、ATT、ATG、GTT、CCG、ACT、GCT、CAT、CAG、AAC、GAA、TGG、CGG、AGT、AGG、GGTを含む24種類のトリプレットがランダムに8回ないし9回繰り返して出現するものを用意した。
ビオチン化標的蛋白質の調製
　パニングに使用する標的蛋白質として、Glutathione S-transferase (GST)を用いた。GSTは大腸菌で発現調製したものを使用した。ビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41 及び非特許文献Protein Science, 1990;108(4):673-6.に従って行った。
パニングに使用する翻訳液
　翻訳液は以下の物質を含む。１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのクレアチンリン酸、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム、6 ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）（非特許文献：(Yokogawa T, Kitamura Y, Nakamura D, Ohno S, Nishikawa K. 2010. Nucleic acids research 38:e89）に記載の方法で、一部のtRNAを除去している）、４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ、２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ、１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、０．２６μＭのＥＦ－Ｇ、２．７μＭのＩＦ１、０．４μＭのＩＦ２、１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ－Ｔｕ、４９μＭのＥＦ－Ｔｓ、１μＭのＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ、１．２μＭのリボソーム（L31short もしくは L31 intact）、２．７３μＭのＡｌａＲＳ、1 μＭのＧｌｙＲＳ、０．４μＭのＩｌｅＲＳ、０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ（WO2016/148044）、０．１６μＭのＰｒｏＲＳ、１μＭの変異体ＳｅｒＲＳ（WO2016/148044）、０．０９μＭのＴｈｒＲＳ、１μＭの変異体ＶａｌＲＳ（WO2016/148044）、０．１１μＭのＬｙｓＲＳ、３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ　Ａｌａ１Ｂ、２５０μＭのグリシン、100μＭのイソロイシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、２５０μＭのリジン、５ｍＭのＮ－メチルバリン、５ｍＭのＮ－メチルセリン、５ｍＭのＮ－メチルアラニン、５ｍＭのＮ－メチルフェニルアラニン、ＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ混合物、25 μM InitiatorアミノアシルtRNA、10μM Penicillin G Amidase (ＰＧＡ)。
パニングの実施
　前述の二本鎖ＤＮＡライブラリとL31shortを含む翻訳液、もしくはL31intactを含む翻訳液を使用し、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に倣ってパニングを実施した。GSTとビオチンとの間にＴＥＶプロテアーゼ認識配列を導入し、ＴＥＶプロテアーゼによる溶出を行った。ペプチドライブラリをビオチン化タンパク質と相互作用させた後に、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズで回収後、洗浄作業を行った後、ビーズにＴＥＶ溶出液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ　ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、製品番号１２５７５０１５））を添加し反応させた。反応後、上清を回収しＰＣＲを行った。
濃縮配列の解析
　最低１ラウンド以上で出現頻度がランクA：0.5 ％以上 またはランクB：0.05%以上または、ランクC：NGSのリード数が50以上、かつ直前のラウンドのプールを分割し標的を添加せずにパニングした場合に比べ、標的を添加した場合に出現頻度が１０倍以上増加する配列を抽出した。その結果、L31short リボソームを用いた翻訳系を用いた場合では、ランクAが33配列、ランクBが253配列 ランクCが396配列であった。一方でL31intact リボソームを用いた翻訳系を用いた場合では、ランクAが32配列、ランクBが175配列、ランクCが247配列であった。L31short リボソームを用いてパニングを実施した場合のほうがL31intactに比べてより多くの種類の配列を濃縮させる事ができた。
実施例９．L31変異体リボソームを用いた翻訳実験
実施例9の概要
　後述の実施例14に記載のとおり、L31の長さがそれぞれ異なる8種類のL31変異体株を構築した。実施例15に記載のとおり、それらの株と、L31short株、L31intact株、W3110株よりリボソームを調製した。得られた11種類のリボソームを用いてペプチドの翻訳合成を行い、L31変異体を含むリボソームの翻訳特性を調べた。
　具体的には、表６にある、R1～R11の11種類のリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる以下の3種類のペプチドを翻訳合成した。なお、本明細書において、以下のようにアミノ酸をコロンで区切ってアミノ酸配列を表記することがある。
　AcbzMeCStBu:MeG:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：２９）
　AcbzMeCStBu:MeStBuOH:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３０）
　AcbzMeCStBu:L:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３１）
　鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）と2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれMeG-tRNAGlu(CUG), MeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG), Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは開始アミノ酸から3文字目のアミノ酸から翻訳が開始されたInitiation Read through (iRT)ペプチドであった。本明細書において、開始2文字目から翻訳が開始させるペプチドを1iRT、開始3文字目から翻訳が開始させるペプチドを2iRTと呼ぶことがある。TM（配列番号：29～31）とそれぞれに対する1iRTおよび2iRTを表７～表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
翻訳条件
　実施例7実験1の翻訳液組成から、in vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ　Ａｌａ１Ｂ、Lys、アミノアシルtRNAを除き、0.5uM HisRSを添加している点、6.72unit/ml　ミオキナーゼ、59μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、4 mM酢酸マグネシウム、20μＭ ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）、10μM各種2文字目をコードするアミノアシルtRNA、1.2μM、各種リボソーム、1μM mRNAの組成である点を除き、実施例７の実験１の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例11にて合成したＬＣＴ67を標品として用いて検量線を作成し定量評価を行った以外は、実施例７の実験２の方法に従い分析を行った。
結果
　表１０の通り、3種類のいずれの配列においても、R1～R7とR11のリボソームを用いた翻訳ではTMの翻訳量が高く、Initiation Read through (iRT)ペプチドの割合が少ないという翻訳特性を示した。N末端からのアミノ酸残基数が62以下のL31変異体を含むリボソームは、翻訳活性が高くInitiation Read through (iRT)ペプチドの割合が少ないという特性を持つことが示された。なお、iRT割合は次の式で算出した。
（数１）
　iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
実施例１０．様々なペプチドの翻訳合成におけるL31shortリボソームの効果
実験１ 開始アミノ酸をAcbzdMeCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験1の概要
　実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる6種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３６）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる6種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、S3F5MePyr、SPh2Cl、I、T、またはLとした。
　AcbzdMeCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３６）
　鋳型mRNAの配列mR-1（配列番号：１０）と2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれNle-tRNAGlu(CUG)、S3F5MePyr-tRNAGlu(CUG)、SPh2Cl-tRNAGlu(CUG)、Ile-tRNAGlu(CUG)、Thr-tRNAGlu(CUG)、Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。
　LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。iRT割合は次の式で算出した。
（数１）
　iRT割合 = (iRT total濃度 [nM]) / (iRT total濃度 [nM] + TM 濃度[nM]) ×100
翻訳条件
　実施例9の翻訳条件より、HisRSを除き、8 mM酢酸マグネシウム、3ug/ml　ミオキナーゼ、
49μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、20μＭ　ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU）（特許文献WO2017150732）の組成である点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１１の通り、6種類中4配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、2.8倍から3.9倍上昇しており、6種類中全ての配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
実験2 開始アミノ酸をAcbzMeCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験2の概要
　実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる12種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３７）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる12種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。
　AcbzMeCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３７）
　2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてMeG-tRNAGlu(CUG)、MePhe-tRNAGlu(CUG)、MeHph-tRNAGlu(CUG)、MeA3Pyr-tRNAGlu(CUG)、Gly-tRNAGlu(CUG)、およびMeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG)を追加で用いた以外は、実施例10の実験1に準じた方法で実験を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。
翻訳条件
　4 mM酢酸マグネシウム、20μＭ ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）である点を除き実施例10実験1の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１２の通り、12種類中11配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.6倍から3.7倍上昇しており、12種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
実験3 開始アミノ酸をAcbzCStBuとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験3の概要
　実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる12種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３８）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる12種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。実験は、実施例10の実験2に準じた方法で行った。
　AcbzCStBu:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号３８）
　LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。
翻訳条件
　０．２３μＭ　ＥＦ－Ｇ、5.92unit/ml ミオキナーゼ2、１．0μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、２．4μＭ　ＩＦ１、１．3μＭ　ＩＦ３、35μＭ　ＥＦ－Ｔｕ、52μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、20μＭ　ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（WO2017/150732）である点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１３の通り、12種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.7倍から3.8倍上昇しており、12種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
実験4 開始アミノ酸をfMetとし、2文字目に各種アミノ酸を配置
実験4の概要
　実施例2で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、2文字目のアミノ酸が異なる13種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：３９）の2文字目のアミノ酸（X）が異なる13種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、T、MeStBuOH、またはLとした。
　fMet:X:MeF:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：３９）
　2文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてPic(2)-tRNAGlu(CUG) を追加で用いた以外は、実施例10の実験2に準じた方法で実験を行った。LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。
翻訳条件
　ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－3）を除き、0.03μM MetRS、0.6μM メチオニルtRNAホルミルトランスフェラーゼ、0.25mM メチオニン、0.1mM folateを添加した点以外は、実施例10実験2の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１４の通り、13種類中12配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.2倍から2倍上昇しており、13種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
実験5 開始アミノ酸をAcbzMeCStBu、2文字目のアミノ酸をThrとし、3文字目に各種アミノ酸を配置
実験5の概要
　実施例15で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、3文字目のアミノ酸が異なる14種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：４０）の3文字目のアミノ酸（X）が異なる14種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、P、T、MeStBuOH、dA、またはLとした。
　AcbzMeCStBu:T:X:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：４０）
　鋳型mRNAの配列mR-3（配列番号：２８）と3文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてそれぞれNle-tRNAGlu(CUG)、MePhe-tRNAGlu(CUG)、S3F5MePyr-tRNAGlu(CUG)、Pic(2)-tRNAGlu(CUG)、MeHph-tRNAGlu(CUG)、MeA3Pyr-tRNAGlu(CUG)、SPh2Cl-tRNAGlu(CUG)、Gly-tRNAGlu(CUG)、Ile-tRNAGlu(CUG) 、Pro-tRNAGlu(CUG)、Thr-tRNAGlu(CUG)、MeSer(tBuOH)-tRNAGlu(CUG)、D-Ala-tRNAGlu(CUG) 、Leu-tRNAGlu(CUG)を用いた。アミノアシルtRNAは実施例13で調製したものを用いた。
　LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。
mRNAの調製
　鋳型ＤＮＡ(配列番号：２７)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ1280）を用いたin vitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ、配列ｍＲ－3(配列番号：２８）を調製し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
翻訳条件
　10uM 各種3文字目をコードするアミノアシルtRNAを添加する点を除き、実施例9の翻訳条件に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１５の通り、14種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて、1.1倍から20.9倍上昇しており、14種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。表中の「1iRT+2iRT濃度」は、クロマトグラムにおいて1iRTおよび2iRTのそれぞれに相当するピークが分離しなかった場合に、各ピークの合算値から定量した1iRTおよび2iRTの合算濃度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
実験6 開始アミノ酸をfMet、2文字目のアミノ酸をThrとし、3文字目に各種アミノ酸を配置
実験6の概要
　実施例15で精製したL31shortリボソーム、L31intactリボソームを用いて、3文字目のアミノ酸が異なる15種類のペプチドの翻訳合成を行い、L31shortリボソームの優位な翻訳特性が複数のペプチドの翻訳合成で認められる事を確認した。
　具体的には、以下のアミノ酸配列（配列番号：４１）の3文字目のアミノ酸（X）が異なる15種類のペプチドを翻訳合成した。ここでXは、Nle、MeG、MeF、S3F5MePyr、Pic(2)、MeHph、MeA3Pyr、SPh2Cl、G、I、P、T、MeStBuOH、dA、またはLとした。
 fMet:T:X:I:I:G:MeF:Bdp4AMF:I:I:P:I:G（配列番号：４１）
　3文字目を紡ぐアミノアシルtRNAとしてMeG-tRNAGlu(CUG)を追加で用いた以外は、実施例10の実験5に準じた方法で実験を行った。LC-MSを用いて目的産物（TM）と、副生成物の定量を行った。副生成物として主に観測されたのは、1iRTと2iRTであった。
翻訳条件
　6.72unit/ml　ミオキナーゼ、59μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、0.09μＭ ＧｌｙＲＳである点を除き、実施例10実験4に従った。
分析概要
　実施例9の方法に従い分析を行った。
結果
　表１６の通り、15種類中全配列においてTMの翻訳量はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて上昇しており、L31intactを用いた時のTMの翻訳量は検出限界以下であった。15種類中全配列において、iRTの割合はL31shortリボソームを用いた時に、L31intactリボソームを用いた場合に比べて減少していた。表中の「1iRT+2iRT濃度」は、クロマトグラムにおいて1iRTおよび2iRTのそれぞれに相当するピークが分離しなかった場合に、各ピークの合算値から定量した1iRTおよび2iRTの合算濃度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
実施例１１．LCT-67の合成
　LC/MSの標品として用いるN末端にBdpFLを持つペプチド(LCT-67)を以下の手順で合成した。
　Fmoc-Gly-OHを担持させた2-クロロ卜リチルレジン(100 mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc-Gly-OH、特許文献(WO2018225864)記載の方法で合成したFmoc-Thr(THP)-OH(aa01)、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-Pro-OHを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載)。Fmoc法によるペプチド合成法(例えばWO2013100132を参照)に従い、ペプチドの伸長を行った。ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上で行った後、レジンをDCMにて洗浄した。
　レジンにTFE/DCM(1:1、v/v、2 mL)を加えて1時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをTFE/DCM(1:1、v/v、1 mL)にて2回洗浄した。全ての抽出液を混合し、DMF(2 mL)を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をNMP(1 mL)に溶解し、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸N-スクシンイミジルエステル(5 mg、0.013 mmol)を室温にて加え、19時間撹拌した後、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)に通し、中間体を含むフラクションを減圧下濃縮した。得られた残査を5％TFA in DCM(2 mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1％FA MeCN/H2O)にて精製し、表題化合物(LCT-67)(13 mg)を得た。LCT-67のアミノ酸配列を配列番号：223に示す。
LCMS(ESI) m/z ＝ 1751.2(M-H)-
保持時間：0.97分(分析条件SQDFA05_02)
実施例１２．pCpAアミノ酸の合成 
　本実施例では、以下の略号を用いた。ＧｌｙまたはＧ（グリシン）、ＩｌｅまたはＩ（イソロイシン）、ＬｅｕまたはＬ（ロイシン）、ＰｈｅまたはＦ（フェニルアラニン）、ＰｒｏまたはＰ（プロリン）、ＴｈｒまたはＴ（トレオニン）。
　ＬＣＭＳの分析条件を、下記の表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　以下のスキームに従い、アミノアシルｐＣｐＡ（ＳＴ０４、ＳＴ０８、ＳＴ１１、ＳＴ１４、ＳＴ１７、ＳＴ２０、ＳＴ２３、ＳＴ２８、ＳＴ３１、ＳＴ３２、ＳＴ３３、ＳＴ３４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８５１Ａ１）記載の方法で合成した（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（３５．３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）にＤＣＭ（０．２ｍｌ）Ｈ２Ｏ（０．８ｍｌ）を室温にて加えた後、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（０．２１２ｍｌ、１．００ｍｍｏｌ）を室温にて加えて３０分撹拌した。反応混合物を静置し水層を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）（１０ｍｇ、７６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１３０．０　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－アミノヘキサン酸（化合物ＳＴ０１、Ｎｌｅ－ＯＨ）（３．９４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１２．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５０ｕＬ）、トリエチルアミン（９．６２ｕｌ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）（９ｍｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１５．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＨ）（８．３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２．０μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．４５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４５４．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　緩衝液Ａ（９ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサノアト（化合物ＳＴ０３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．４５ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．４５ｍＬ）を加えた。反応液を室温にて３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ０４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｎｌｅ－ｐＣｐＡ）（５．７ｍｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０４９．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
　なお、緩衝液Ａは以下のように調製した。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物（６．４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。
（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４Ａ１）記載の方法で合成した（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（４３．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）にＤＣＭ（０．２ｍｌ）Ｈ２Ｏ（０．２ｍｌ）を室温にて加えた後、４－（３－フェニルプロピル）ピペリジン（６３．５ｕｌ、０．３ｍｍｏｌ）を室温にて加えて１時間撹拌した。反応混合物を静置し水層を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（１４ｍｇ、６６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２１３．０　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０５、Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（１０．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（２１．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２５０ｕＬ）、トリエチルアミン（１６．０ｕｌ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（２３ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４９８．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパン酸（化合物ＳＴ０６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＨ）（９．９９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２．０μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．４５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５３７．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　緩衝液Ａ（９ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（２２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－［（５－フルオロピリジン－３－イル）メトキシ］プロパノエート（化合物ＳＴ０７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．４５ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を投与し、室温で４０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．４５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で１時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ０８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｓ３Ｆ５ＭｅＰｙｒ－ｐＣｐＡ）（６．５ｍｇ、２９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１３２．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
　窒素雰囲気下、Ｌ－プロリン（４６．１ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）（１５７ｍｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９９．２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
２－Ｏ－（シアノメチル）　１－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］　（２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－１－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＴ０９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＨ）（４０．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（１３．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物２－Ｏ－（シアノメチル）　１－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］　（２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３８．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
２－Ｏ－［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　１－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］　（２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、２－Ｏ－（シアノメチル）　１－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］　（２Ｓ）－ピロリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ１０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で２０時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｒｏ－ｐＣｐＡ）（１１ｍｇ、１１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　窒素雰囲気下、グリシン（３０．０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）（５７ｍｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３５９．２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　窒素雰囲気下、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ１２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＨ）（３６．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（１３．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５．０μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１６時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９８．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ１３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｇｌｙ－ｐＣｐＡ）（１６ｍｇ、１６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９９３．６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　窒素雰囲気下、Ｌ－トレオニン（４７．６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．００ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８ｕｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において２日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）（１４１ｍｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４０３．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタン酸（化合物ＳＴ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＨ）（８１．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２６８μＬ、４．００ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（６９．９μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて３時間撹拌したのち逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）（７２．０ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４４２．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－ヒドロキシブタノアト（化合物ＳＴ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｔｈｒ－ｐＣｐＡ）（７ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３７．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　窒素雰囲気下、Ｌ－ロイシン（１３．１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（４２．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（０．５０ｍＬ）、トリエチルアミン（３２．１ｕｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）（２８ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１５．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＨ）（１２．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（７５．０ｕｌ）に、２－ブロモアセトニトリル（２０．０μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．８６μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温にて順番に加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌したのち反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４５４．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　緩衝液Ａ（１５ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－４－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｌｅｕ－ｐＣｐＡ）（９．６ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０４９．６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　窒素雰囲気下、サルコシン（４８３ｍｇ、５．４２ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）（２.０ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（９５３．４ｍｇ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）（１．４ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ３）
シアノメチル　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　窒素雰囲気下、２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］酢酸（化合物ＳＴ２１、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＨ）（１．３８ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．９５ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２８ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１．７４ｇ、１４．７５ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３６　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ４）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート化合物ＳＴ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４２２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］アセテート（化合物ＳＴ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１２０．７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で５時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＧ－ｐＣｐＡ）（７６．７ｍｇ、２６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１００７．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
　化合物ＳＴ２８の合成中間体は、以下のスキームに従って合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸　２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（１５ｇ、３８．６２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（２７ｍＬ、３４８ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（（ＣＨ２Ｏ）ｎ）（３．４８ｇ、１１６ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下、４０℃で１６時間撹拌した。室温へと冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣をＤＣＭに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過および減圧濃縮することで溶媒を除去し、(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸 (9H-フルオレン-9-イル)メチルを粗生成物として得た。
　得られた粗生成物である(S)-5-オキソ-4-(ピリジン-3-イルメチル)オキサゾリジン-3-カルボン酸 (9H-フルオレン-9-イル)（１８ｇ、４４．９５ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１００ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（４７ｇ、４０４．２０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）を室温で加えた。反応液を窒素雰囲気下、７０℃で１６時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸イソプロピルに溶解し、ｔ－ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液（９：１）を加えた。その溶液を室温で２０分間撹拌した後、４℃にて１時間静置した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、冷却したｔ－ブチルメチルエーテルとヘキサンの混合溶液（９：１）で洗浄し、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸　２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）（１９ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４０３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ１）
（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸；　２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＴ２４、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ・ＴＦＡ）（１９ｇ、４７．２１ｍｍｏｌ）に室温にてＤＭＦ（７２ｍＬ）およびピペリジン（２８．５ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温において３時間撹拌した。ジエチルエーテル（１４０ｍＬ）およびヘキサン（２８０ｍＬ）を加え、室温においてさらに３時間撹拌した。生じた沈殿物をろ過にて回収し、（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（７ｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１８１　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１５分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ２）
（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２５、ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（９７０ｍｇ、５．３８ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（９５０ｍｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（１．０ｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４６６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９８分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ３）
シアノメチル（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（化合物ＳＴ２６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＨ）（８００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（４４４ｍｇ、３．４４ｍｍｏｌ）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（８１８ｍｇ、６．８２ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で６時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２２１ｍｇ、２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５０５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ４）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２８、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパノエート（化合物ＳＴ２７、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１４６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ２８、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＡ３Ｐｙｒ－ｐＣｐＡ）（６４．４ｍｇ、５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０９８．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　窒素雰囲気下、Ｌ－イソロイシン（５２．５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（１７８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２ｍＬ）、トリエチルアミン（１２８μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にて２．５日間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）（１２５ｍｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１５．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
シアノメチル（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　窒素雰囲気下、（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタン酸（化合物ＳＴ２９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＨ）（４２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセトニトリル（１３μＬ、０．２００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解し、Ｎ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５μＬ、０．２００ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル　（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４５４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（７２．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル　（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］－３－メチルペンタノアト（化合物ＳＴ３０、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）（４５．５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ）を投与し、室温で２０時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＴ３１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｉｌｅ－ｐＣｐＡ）（１２ｍｇ、１１．４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０４９．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－３－フェニルプロパノエート（化合物ＳＴ３２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＰｈｅ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
　ＷＯ２０１８／２２５８６４に記載の方法で合成した。
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｒ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］プロパノエート（化合物ＳＴ３３、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｄ－Ａｌａ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　ＷＯ２０１８／１４３１４５に記載の方法で合成した。
２－Ｏ－［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　１－Ｏ－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メチル］　（２Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボキシラート（化合物ＳＴ３４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ（２）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　ＷＯ２０２０／１３８３３６に記載の方法で合成した。
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－４－フェニルブタノアト（化合物ＳＴ３５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　特許文献（ＷＯ２０２０１３８３３６Ａ１）記載の方法で合成した。
［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ－ヒドロキシホスホリル］オキシメチル］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシオキソラン－３－イル］　（２Ｓ）－２－［［４－［［２－（４－フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル－メチルアミノ］－４－フェニルブタノアト（化合物ＳＴ３６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
　特許文献（ＷＯ２０２０１３８３３６Ａ１）記載の方法で合成した。
実施例１３．アミノアシルtRNAの合成
　実施例５の「アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その１」に記載の方法に準じ、各種アミノアシルtＲＮＡを合成し、回収した。回収した各種アミノアシルｔＲＮＡは１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。完成したアミノアシルtRNAの名称と、用いるアミノアシルpCpAアミノ酸の対応は表１８の通り。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
実施例１４．変異体を発現する大腸菌株の作製
　L31タンパク質のN末端側から様々な長さで発現するL31変異体株を8種類（L31(1-27)、L31(1-32)、L31(1-37)、L31(1-42)、L31(1-47)、L31(1-52)、L31(1-57)、L31(1-67)）構築した。Quick and Easy Conditional Knockout Kit (loxP/Cre)（Gene Bridges 社）のキット付属のプロトコルに従い、大腸菌株を構築した。
ホモロジーアームが付加した機能カセットの作成
　実施例１に記載の方法に準じて、機能カセットを作成した。各株のL31の発現領域の長さと、株を作製するのに用いた機能カセットのPCRに用いたprimerとの対応を表１９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
L31変異体株の作成
　実施例１に記載の方法に準じL31変異体株を作成した。
実施例１５．リボソームの精製
L31変異体株、L31short株、L31intact株、W3110株を用いたリボソームの調製
　実施例２に記載の方法に準じ、株の培養、大腸菌の破砕、大腸菌の精製、Butyl sepharose精製、超遠心精製を行った。全ての株に関して、実施例２のL31intact株およびL31short株に関する記載に準じた。大腸菌の破砕には、実施例２に記載のMg10 Lysis Bufferを使用した。最終濃度が10～20μMになるように調製し、L31shortリボソーム、L31intactリボソーム、WTリボソーム、L31変異体リボソーム8種類、の合計11種類のリボソームを調製した。
　本発明は、非天然アミノ酸を含むペプチドおよびペプチドライブラリの製造方法、および、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質等を提供する。本発明の製造方法を用いることにより、非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを効率よく翻訳し、当該ペプチドやそれを含むライブラリを効率的に製造することができる。

Claims (15)

  1. 　ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたL３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。
  2. 　ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
    （１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
    （２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
    （３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
  3. 　前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記翻訳系における、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記ペプチドを環化する工程をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法；
    （ａ）請求項１～６のいずれかに記載された方法によって得られるペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリに標的物質を接触させる工程、および
    （ｂ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程。
  8. 　請求項２～７のいずれかに記載の、改変されたL31タンパク質。
  9. 　請求項８に記載の改変されたＬ３１タンパク質をコードする単離された核酸。
  10. 　請求項９に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。
  11. 　以下（ａ）～（ｃ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの製造方法；
    （ａ）請求項１０に記載の細胞を培養する工程、
    （ｂ）前記細胞の培養物から溶解液を生成する工程、および
    （ｃ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
  12. 　以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、リボソームの製造方法；
    （ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、フレンチプレスを使用して、野生型大腸菌の培養物から溶解液を生成する工程、および、
    （ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
  13. 　請求項８に記載の改変されたL31タンパク質を含むリボソーム。
  14. 　請求項１３に記載のリボソームを含む組成物。
  15. 　以下の工程を含む、無細胞翻訳系の製造方法；
    （ａ）請求項１１または１２に記載の方法によりリボソームを製造する工程、および
    （ｂ）前記リボソームを、非天然アミノ酸がアシル化された開始tRNAと混合する工程。
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