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WO2021260087A1 - Procédé de culture de microorganismes pour l'accumulation de lipides - Google Patents

Procédé de culture de microorganismes pour l'accumulation de lipides Download PDF

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Publication number
WO2021260087A1
WO2021260087A1 PCT/EP2021/067279 EP2021067279W WO2021260087A1 WO 2021260087 A1 WO2021260087 A1 WO 2021260087A1 EP 2021067279 W EP2021067279 W EP 2021067279W WO 2021260087 A1 WO2021260087 A1 WO 2021260087A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lighting
biomass
culture
protists
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2021/067279
Other languages
English (en)
Inventor
Saïd IHAMMOUINE
François GODART
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fermentalg SA
Original Assignee
Fermentalg SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fermentalg SA filed Critical Fermentalg SA
Priority to US18/002,357 priority Critical patent/US20230235371A1/en
Publication of WO2021260087A1 publication Critical patent/WO2021260087A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • the present invention relates to the industrial cultivation of protists for the production of lipids containing polyunsaturated fatty acids (PUFA), in particular eicosapentaenoic acid (EPA) and arachidonic acid (ARA).
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • Protists of the genus Pythium are filamentous microorganisms belonging to the class of Oomycetes having similarities with fungi. Pythium has the particularity of synthesizing and accumulating reserve lipids containing Poly-Unsaturated Fatty Acids (PUFA or PUFA) such as Eicosapentaenoic Acid (EPA) and Arachidonic Acid (ARA). The interest of this protist lies in the majority accumulation of EPA among other PUFAs, in particular the ARA.
  • PUFA or PUFA Poly-Unsaturated Fatty Acids
  • EPA Eicosapentaenoic Acid
  • ARA Arachidonic Acid
  • Pythium is a non-photosynthetic microorganism which develops in aqueous medium or in the soil, often as a parasite of wild or cultivated plants (cereals and vegetable crops). Pythium culture is carried out heterotrophically, ie in the absence of light. This is one of the advantages identified in the prior art of not having to depend on light (WO 2009/143007).
  • the present invention solves this problem with a new cultivation process which makes it possible to increase the fat content to percentage levels of dry matter compatible with industrial exploitation.
  • the present invention relates to a method for preparing a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, said method comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, and ( b) recovering the biomass from the culture medium, the culture step comprising a lighting phase.
  • the invention also relates to a process for the preparation of lipid compositions rich in PUFA which comprises culturing from a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, (b) recovering the biomass from the culture medium and (c) extracting the PUFA-rich lipids from the recovered biomass, the culture step (a) comprising a lighting phase.
  • the invention also relates to a process for preparing a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition
  • a process for preparing a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition comprising a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, said process comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, (b) recovering the biomass from the culture medium and (d) formulating a composition by adding the biomass recovered in (b) to the usual components of pharmaceutical and cosmetic compositions , nutraceutical or food, the culture step (a) comprising a lighting phase.
  • the invention also relates to a process for preparing a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition comprising a lipid composition rich in PUFA, said process comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a source of carbon, (b) recovering the biomass from the culture medium, (c) extracting PUFA-rich lipids from the recovered biomass and (d) formulating a composition by adding the lipid composition extracted in (c ) with usual components of pharmaceutical, cosmetic, nutraceutical or food compositions, the culture step (a) comprising an illumination phase.
  • the invention also relates to a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, the lipid content being at least 30% relative to the dry matter (% DM), preferably at least 50% DM. , more preferably, at least 55% DM, in particular at least 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65% DM.
  • Protists of the genus Pythium are advantageously protists of the species Pythium irregulare.
  • biomass is meant a set of protist cells of the genus Pythium produced by their culture and separated from the culture medium (also called fermentation juice). The cells may or may not have retained their physical integrity. It is therefore understood that said biomass can comprise a quantity of degraded protist cells ranging from 0% to 100%.
  • degraded is understood to mean that the physical integrity of said microorganism cells may have been altered, for example lysed microorganisms, resulting for example from a process of homogenization or enzymatic lysis.
  • this biomass can be raw, just separated from its culture medium, dried or not, degraded or not.
  • Raw biomass extracted from the culture medium can have a humidity level of 70% to 90%, generally 80% to 85%.
  • Dried biomass or "dry biomass” has a moisture content of 1% to 10%, generally 2% to 7%.
  • protists of the genus Pythium is meant all the protists designated under the class of Oomycetes and of the genus Pythium, producer of EPA, and capable of being cultured industrially. This also includes strains with improved performance obtained by mutagenesis and selection, or by modification of the genome.
  • This set of designated protists comprises in particular the species Pythium insidiuosum, Pythium irregulare, Pythium intermedium, Pythium splendens, Pythium ultimum.
  • the protists of the genus Pythium are of the species Pythium irregulare.
  • industrial By “industrial”, “industrial culture” or “industrially cultivated” is meant a culture of protists in a culture medium suitable for their growth and for the production of PU FA and in a volume suitable for the production. sufficient quantities to address a market. These industrial cultures are produced by fermentation in so-called “batch” discontinuous mode, in semi-continuous mode called “fed batch” or in continuous mode. Fermenters have volumes that can range from 1000 L to over 200 m 3 .
  • culture medium an aqueous composition
  • aqueous composition comprising the nutrients necessary for the growth of protists of the genus Pythium, in particular a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, but also mineral salts, and / or vitamins, trace elements, etc. well known to those skilled in the art.
  • the culture medium can be a chemically defined medium, of known and reproducible composition, in which the content of each element is known and not comprising rich or complex organic and / or mineral materials.
  • the culture medium can alternatively comprise components of variable composition, such as rich or complex organic and / or mineral materials.
  • rich or complex organic materials unpurified organic materials, in the form of mixtures for which the exact composition and the concentrations of the various components of the mixture are not known with exactitude, not controlled, and may exhibit significant variability. from one lot to another.
  • rich or complex organic material mention may be made of yeast extracts or peptones which are products of a protein hydrolysis reaction or even infusions of plants such as potatoes or rich mineral materials such as example marine mineral salts or other complex growth agents, not having a fixed concentration of each of their components.
  • the composition of the culture medium can vary over time with the consumption of nutrients by the protist strains of the genus Pythium. According to the cultivation method chosen, it is possible to supplement the culture medium during the culture by feeding it with one or more complementary culture media which contain all or part of the nutrients present in the initial culture medium.
  • carbon source more particularly means a complex carbon source which is not CO 2, in particular chosen from sugars, organic acids or polyols, such as glucose, cellulose derivatives, lactate, sugar. starch, lactose, sucrose, acetate, glycerol, fructose, xylose, any product or co-product rich in one or more of the aforementioned compounds and their mixtures.
  • PUFA abbreviation of “Poly Unsaturated Fatty Acide” or Poly Unsaturated Fatty Acids, are polyunsaturated fatty acids comprising at least 16 carbon atoms and at least 2 unsaturations, in particular fatty acids identified by the signs co3 and co6, such as ⁇ -linolenic acid (ALA or C18: 3n3), g-linolenic acid (AGA or (C18: 3n3), arachidonic acid (ARA or C20: 4n6), eicosapentaenoic acid (EPA or C20 : 5n3), docosahexaenoic acid (DHA or C22: 6n3) or docosapentanoic acid (DPA or C22: 5n6).
  • ⁇ -linolenic acid ALA or C18: 3n3
  • AGA or (C18: 3n3) g-linolenic acid
  • ARA or C20: 4n6 arachidonic acid
  • lipids rich in PUFA an oil rich in PUFA comprising at least 10% of PUFA chosen from I ⁇ RA and ARA relative to the total mass of lipids, preferably at least 15%.
  • the total mass of lipids represents at least 50% of the dry biomass, advantageously at least 60%, more advantageously at least 65%,
  • the oils rich in PUFA according to the invention are essentially in the form of triglycerides.
  • the triglycerides represent at least 80% of the total mass of fat, advantageously at least 90%, more advantageously at least 93% of the total mass of fat.
  • the triglyceride content is for example analyzed by thin layer chromatography (Jouet et al., 2003).
  • a so-called “crude” oil is an oil extracted from the biomass after separation of the lipids from the aqueous phase and the insolubles, in particular proteins.
  • the methods for extracting lipids from a biomass are well known to those skilled in the art, described in particular WO 2020/053375, WO 2001/053512, WO 2011/153246, US 2014/350222, WO 2015/095694, WO 01/53512, WO 2010/096002.
  • a so-called “refined” oil is a purified oil obtained after purification of the crude oil, in particular refined according to its intended use.
  • the methods for refining crude lipid compositions are well known to those skilled in the art, described in particular by Manjula et al. (2006), GB 2,031,290, US 5,310,487 or US 4,971,660.
  • the term “modified oil” is understood to mean a crude or refined oil whose fatty acid composition has been modified. This modification can comprise a concentration of PU FA, by elimination of other saturated or unsaturated fatty acids, or else a dilution by addition of oils of different lipid profile.
  • lipid composition is meant a mixture of lipids comprising at least one oil rich in PUFA according to the invention, extracted from biomass, crude, refined and / or modified.
  • the present invention relates to a method for preparing a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, said method comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, and ( b) recovering the biomass from the culture medium, the culture step comprising a lighting phase.
  • the culture of protists of the genus Pythium in heterotrophy on a culture medium comprising a carbon source is well known to those skilled in the art. These cultures can be in so-called “batch” discontinuous mode, in so-called “fed batch” semi-continuous mode or in continuous mode.
  • the method according to the invention is advantageously implemented for industrial production of biomass.
  • stage (a) of culture consists in producing a fermentation must comprising the fermentation juice and the biomass, with a density of at least 20 g / L of material. dried.
  • the culture will be carried out so as to achieve a density of at least 30 g / L, advantageously of at least 40 g / L.
  • the biomass is recovered from the culture medium, separated from the fermentation juice.
  • protists of the genus Pythium is well known to those skilled in the art who will be able to determine the conditions for implementing these cultures in aerobic mode to obtain the desired density. Mention will in particular be made of the culture methods described in Stinson et al. (1991), US2014256973, which a person skilled in the art can adapt to an industrial culture.
  • the inocula used for the cultivation of Pythium can be obtained by two methods.
  • the first consists in carrying out a culture on agar favorable to the production of spores, for example the PDA medium (Potato Dextrose Agar) or Czapek Dox agar.
  • agar favorable to the production of spores
  • the spores are harvested in liquid medium according to a method known to those skilled in the art. For example, water or a suitable saline medium is used to flood the aerial part of the mycelium that has grown on the agar. The spore-laden liquid is then collected and the spores counted.
  • Inoculation takes place in a liquid culture in a baffled Erlenmeyer flask containing a suitable medium for growth such as PDB (Potato Dextrose Broth) or Czapek Dox. From 100 to 10,000 spores per milliliter of medium are added to the culture medium. Inoculation with a suitable number of spores limits the growth in the form of balls which is a characteristic of the growth of filamentous microorganisms.
  • a second method consists of recovering the wet biomass from a flask culture and then homogenizing this biomass.
  • This biomass can be in the form of balls.
  • Homogenization is carried out in a device such as a blender or other homogenizer. 5 to 15% of this homogenate is used to inoculate a culture in a flask of the baffled Erlenmeyer type and in a medium suitable for growth such as PDB (Potato Dextrose Broth) or Czapek Dox. Homogenization makes it possible to limit the formation of balls during the culture thus inoculated.
  • Growth is carried out in a shaking incubator at a temperature generally ranging from 20 to 30 ° C.
  • Orbital agitation is set between 100 and 200 revolutions per minute.
  • the biomass can be collected to inoculate another culture of a larger volume, such as a fermenter, or be harvested or analyzed.
  • the invention consists in illuminating the culture thinking all or part of the culture stage (mixotrophy).
  • the culture of Pythium is carried out heterotrophically, that is, without a light source, since this microorganism is not photosynthetic and therefore does not need it for its growth.
  • Such cultures under heterotrophic conditions are described in particular in the references cited above and in WO 2009/143007, by Cheng & al (1999) or also by Stinson & al (1991).
  • the inventors unexpectedly found that the lighting of the culture made it possible to increase the lipid content in the cells of protists of the genus Pythium compared with a heterotrophic culture described in the state of the art.
  • This lighting consists of illuminating the protists in the culture medium in a controlled manner at an illumination intensity of between 50 and 2000 pmoles of photons / m 2 / sec. In this sense, it is indeed a particular lighting, generally by means of lighting appropriate to illuminate the culture medium and motivated to promote the production of PUFA which is distinguished from any indirect lighting which would come from the culture. light used to illuminate the place where the cultivation step is carried out, such as a laboratory, whether natural or artificial.
  • the wavelengths suitable for the illumination of the Pythium cultures according to the invention are preferably in a spectrum which goes from UV to near infrared via the visible, generally between 300 nm and 750 nm. It may be a so-called "white” light whose radiation spectrum generally ranges from 400 to 750 nm, Ultra-Violet (UV) radiation whose radiation spectrum is between 300 and 430 nm, d '' a so-called “blue” light whose radiation spectrum generally ranges from 430 to 500 nm, a "green” light whose radiation spectrum generally ranges from 500 to 570 nm, a so-called “yellow” light including the radiation spectrum generally ranges from 570 to 590 nm, or also of so-called “red” light, the radiation spectrum of which generally ranges from 590 to 750 nm.
  • UV Ultra-Violet
  • the light intensity can be between 20 and 5000 pmoles / photons / second, preferably between 50 and 3000 pmoles / photons / second, more preferably between 50 and 2000 pmoles / photons / second.
  • the light intensity can be at least 200 pmoles / photons / second, 200 to 1000 pmoles / photons / second, in particular about 500 pmoles / photons / second.
  • the light intensity used for so-called “white” light illumination is advantageously between 100 and 1000 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the light intensity used for UV lighting is advantageously between 50 and 500 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the light intensity used for illumination in blue light is advantageously between 50 and 500 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the light intensity used for illumination with green light is advantageously between 50 and 500 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the light intensity used for illumination with yellow light is advantageously between 100 and 1000 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the light intensity used for illumination in red light is advantageously between 50 and 1000 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • composition of the light spectrum will depend in particular on the lamps used for lighting crops. These are in particular lamps of the fluorescent tube or neon type, of the sodium lamp type or of the LED type, preferably of the LED type.
  • LED type lamps For lighting in so-called “white” light, LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 400 and 750 nm. These white LED-type sources generally have a primary emission peak in the blue around 470 nm and a more diffuse secondary emission between 500 and 700 nm.
  • LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 380 and 400 nm.
  • LED type lamps For lighting in so-called “blue” light, LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 450 and 500 nm. For so-called “green” lighting, LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 500 and 570 nm.
  • LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 570 and 590 nm.
  • LED type lamps will advantageously be used, the emission spectrum of which is between 590 and 750 nm.
  • the lighting can be applied throughout the duration of step (a) of cultivation, or even partially. Those skilled in the art will know when to start lighting and when to stop lighting at the end of cultivation before step (b) of recovering the biomass.
  • the duration of the lighting can range from 10 to 100% of the time for implementing step (a) of culture, preferably between 30 and 100%, more preferably between 50 and 100%.
  • Partial lighting can be provided during a phase conducive to lipid accumulation, usually from the middle or end of the exponential growth phase.
  • Lighting may be continuous, or discontinuous with alternating periods of lighting and periods of darkness.
  • the successive lighting phases can be between 1 second and 10 minutes, for example between 10 seconds and 2 minutes, or between 20 seconds and 1 minute. They are spaced apart by dark phases of a duration equal to or different from the duration of each lighting phase.
  • the electrical consumption and the release of heat can be limited by supplying the light in the form of a flash at high frequency, generally between 0.5 and 150 kHz, advantageously between 1 and 100 kHz, which results in an alternation of illuminated phases and black phases in a period of between 0.001 and 0.00001 seconds.
  • the duration of the illuminated phase can be from 1 to 90% of each period, depending on the desired reductions in power consumption and heat release. The use of electrical equipment and the parameterization of the latter are known to those skilled in the art.
  • the lighting will be provided by a light source of the LED type delivering red lighting, the emission spectrum of which will be between 600 and 750 nm and the duration of which will be between 50 and 100% of culture step iii. Biomass recovery
  • Step (b) of recovering the biomass from the culture medium comprises separating the biomass from the fermentation juice.
  • the recovery methods are well known to those skilled in the art, in particular by centrifugation (plate centrifuge or sedicanter), or by filtration (plate filter, filter press, ceramic or organic tangential filtration).
  • the raw biomass recovered can be washed to remove certain soluble materials (for example by filtration to remove the fermentation medium and washing with water).
  • the raw or washed biomass can also be dried by usual methods, in particular by atomization or lyophilization.
  • components useful for its preservation and storage such as antioxidants, before or after drying, or sugars to prevent spontaneous heating of the biomass.
  • the invention also relates to a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, the lipid content being at least 30% relative to the dry matter (% DM), preferably at least 50% DM. , more preferably, at least 55% DM, in particular at least 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65% DM, up to 75% DM.
  • % DM dry matter
  • PUFAs are basically made up of a mixture of ARA and EPA.
  • the ARA / EPA weight ratio is advantageously 0.5 to 1, more particularly 0.6 to 0.9, in particular about 0.7.
  • the content of PUFA is at least 10% of the sum of fatty acids, preferably at least 15%, especially 15-40%. According to a particular method, the total content of ARA and EPA is at least 20%.
  • the ARA content is at least 5%, preferably at least 6%, more preferably 7.5% or more than 7.5%, in particular at least 7.7%, at least 8% or at least. minus 9%.
  • the EPA content is preferably at least 12% of the sum of the fatty acids, more preferably at least 13%, in particular at least 14%, at least 15%, at least 16% or at least 17 %.
  • the fatty acid content in the oils according to the invention, crude or refined, is advantageously the following myristic acid (C14: 0) 5% to 10% palmitic acid (C16: 0) 10% to 20% palmitoleic acid (C16: 1 n-7) 6% to 10% oleic acid (C18: 1 n-9c) 15% to 25% linoleic acid (C18: 2 n-6c) 10% to 25% arachidonic acid (C20: 4 n-6) 5% to 15% eicosapentaemoic acid (C20: 5 n-3) 7% to 20%
  • the fatty acid content in the oils according to the invention is as follows myristic acid (C14: 0) 6% to 7% palmitic acid (C16: 0) 11% to 16% palmitoleic acid (C16: 1 n-7) 6% to 8.5% oleic acid (C18: 1 n-9c ) 16% to 25% linoleic acid (C18: 2 n-6c) 13% to 22% arachidonic acid (C20: 4 n-6) 6% to 10% eicosapentaemoic acid (C20: 5 n-3) 10% to 20 %
  • the content of the main fatty acids is around 9% for myristic acid (C14: 0); 12% for palmitic acid (C16: 0); 7% for palmitoleic acid (C16: 1 n-7); 17% for oleic acid (C18: 1 n-9c); 20% for linoleic acid (C18: 2 n-6c); 9% for arachidonic acid or ARA (C20: 4 n-6) and 18% for eicosapentaemoic acid or EPA (C20: 5 n-3).
  • the biomass according to the invention has been "stabilized” for its conservation, storage and / or transport.
  • stabilizing components that are not found associated with protist cells in nature, such as sugars (WO 2020/036814), antioxidants such as tocopherol, rosemary extract or ascorbic acid.
  • the biomass is no longer able to develop on a culture medium, the vital functions of the cells being impaired. This is particularly the case for degraded biomass, in particular degraded and dry biomass iv. Lipid extraction
  • the invention also relates to a process for preparing lipid compositions rich in PUFA which comprises culturing from a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, (b) recovering the biomass of the culture medium and (c) the extraction of lipids rich in PUFA from the recovered biomass, the culture step (a) comprising an illumination phase.
  • Lipid extraction involves lysis of the biomass cells to release the PUFA-rich oils they contain, followed by separating the lipids from the solid and water-soluble fractions.
  • Lysis can be mechanical (pressing or grinding) or enzymatic with proteases or cellulases.
  • the enzymes capable of being used are known, in particular described in WO2015 / 095688, WO2011 / 153246, US6750048 and WO2015 / 095694, in particular proteases or cellulases such as the enzymes marketed by the company Novozyme under the names Alcalase 2,5. L, Alcalase 2.4 L, Alcalase 3.0 T, Novozym 37071, Flavourzyme 1000 L, Novozym FM 2.4 L, Protamex, Viscozyme.
  • the processing conditions are those recommended by the supplier, the temperature being that recommended for optimal activity of the enzymes, at least 50 ° C and up to 70 ° C, preferably around 65 ° C.
  • the enzymatic lysis is carried out under an atmosphere poor in oxygen. Generally, the oxygen concentration is less than 1% by mass.
  • the extraction of oils from the lysed biomass can be done by various known methods, such as the addition of sodium in the form of sodium sulfate or sodium chloride (WO 2011/153246), extraction by solvents ( US 2014/350222) and / or high temperatures for several hours (WO 2015/095694), or by many other methods described in the literature (WO 2019/219396, WO 2019/219443, WO 2019/121752, WO 2018 / 122057, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2015/095696, WO 2011/153246, WO 2002/010423).
  • the extraction of oils from lysed biomass is carried out by mechanical separation, also well known to those skilled in the art, such as gravity separation, in particular by centrifugation as described in patent application WO 01/53512 .
  • Continuous separation can also be used, in particular by a centrifugal plate separator.
  • Such separators are known for continuously extracting oils from complex media comprising solid residues and water, as described in patent application WO 2010/096002, in particular sold by the companies Alfa Laval, Flottweg or GEA Westfalia, especially. This continuous separation step is preferred in the process used to obtain the oil according to the invention.
  • the lysis and extraction steps are simultaneous, under mechanical action, generally by one or more centrifugations (WO 2019/032880), in particular with the centrifugation devices described above.
  • the extraction of the oil from the biomass can promote the extraction of these PU FAs over the saturated fatty acids of lower molecular weight.
  • this concentration does not substantially modify the intrinsic properties of the oil contained in the biomass, in particular the triglyceride content.
  • the oil according to the invention is an oil which has not undergone substantial modifications in its fatty acid content by the addition of PU FA, for example in the form of esters, by concentration and / or by elimination of saturated fatty acids such as palmitic acid.
  • the oil obtained is generally an oil called crude oil, which can be used as it is or be the subject of refining, in particular to facilitate its conservation, by preventing it from going rancid, or to modify its color or its odor. so as to make it more acceptable to a consumer.
  • crude oil which can be used as it is or be the subject of refining, in particular to facilitate its conservation, by preventing it from going rancid, or to modify its color or its odor. so as to make it more acceptable to a consumer.
  • These purification and refining steps are well known to those skilled in the art, described in patent applications (WO 2002/010322, WO 2017/035403), in particular steps of degumming, neutralization of free fatty acids, decoloration and deodorization. They make it possible to eliminate (all or in part) phospholipids, pigments, volatiles and free fatty acids. In fact, these methods do not substantially modify the relative content of fatty acids, saturated or unsaturated, or the triglyceride content of the refined oil obtained compared
  • the process according to the invention can also include a step of modifying the oils obtained previously and described above, whether they are crude, purified or refined.
  • Certain processes comprise a modification of the oils recovered from the biomass, for example to modify the composition thereof in certain saturated or unsaturated fatty acids, in particular to promote the concentration of PUFA.
  • Such methods known to those skilled in the art include in particular enzymatic treatments with enzymes such as lipases (CN 105349587, WO 2019/219904, WO 2019/219903).
  • antioxidants in particular those described in applications WO 2019/185942, WO 2019/185940, WO 2019/185939, WO 2019/185910, WO 2019/185894, WO 2019/185889 and WO 2019/185888.
  • Crude or refined oils, or oils of modified composition can also be diluted for later use.
  • the oils used to dilute the oil rich in PUFA obtained by the process according to the invention are generally and preferably oils. plants suitable for human or animal food consumption. Mention will in particular be made of sunflower, colza, soybean, walnut, sesame, hemp, hazelnut, argan, olive, linseed, or any other oil suitable for food use.
  • the oil added can also be an oil comprising other PUFAs, in particular DHA, in particular other oils of microbial origin or also fish oils.
  • the method according to the invention can further comprise such a step of diluting a crude or refined oil obtained previously.
  • the invention also relates to an oil rich in PUFA obtained by the process according to the invention, crude or refined or obtainable by the process according to the invention.
  • compositions in particular the content of PUFA and other fatty acids is given above for the composition of the oil contained in the biomass v.
  • the invention also relates to a process for preparing a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition
  • a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition comprising a biomass of protists of the genus Pythium comprising lipids rich in PUFA, said process comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a carbon source, (b) recovering the biomass from the culture medium and (d) formulating a composition by adding the biomass recovered in (b) to the usual components of pharmaceutical and cosmetic compositions , nutraceutical or food, step (a) of culture comprising a lighting phase as defined above.
  • the invention also relates to a process for preparing a pharmaceutical, cosmetic, neutraceutical or food composition comprising a lipid composition rich in PUFA, said process comprising (a) culturing protists of the genus Pythium on a culture medium comprising a source of carbon, (b) recovering the biomass from the culture medium, (c) extracting PUFA-rich lipids from the recovered biomass and (d) formulating a composition by adding the lipid composition extracted in (c ) with usual components of pharmaceutical, cosmetic, nutraceutical or food compositions, the culture step (a) comprising a lighting phase as defined above.
  • the invention also relates to a composition which comprises a biomass or an oil rich in PUFA which may be obtained by the process according to the invention as described above.
  • a composition according to the invention can comprise one or more excipients.
  • An excipient is a component, or mixture of components, which is used in the present invention to impart desirable characteristics to the composition for its storage and use, including foods and pharmaceutical, cosmetic and industrial compositions.
  • An excipient can be described as an excipient "pharmaceutically acceptable” when added to a pharmaceutical composition whose properties are known from the pharmacopoeia for use in contact with human and animal tissues without excessive toxicity, irritation, allergic reaction or other complications.
  • excipients can be used such as organic or inorganic base, organic or inorganic acid, pH buffer, stabilizer, antioxidant, adhesion agent, release agent, coating agent, outer phase component , a controlled release component, a surfactant, a humectant, a filler, an emollient, or combinations thereof.
  • compositions according to the invention are in particular pharmaceutical, cosmetic, nutraceutical or food compositions.
  • the foods are intended for both humans and animals and include solid, pasty or liquid compositions. These include, in particular, common foods, liquid products, including milk, beverages, therapeutic drinks and nutritional drinks, functional foods, supplements, nutraceuticals, infant formulas, including formulas for premature infants, infant foods. pregnant or breastfeeding women, adult foods, geriatric foods and animal feed.
  • the oil rich in PUFA obtained by the process according to the invention can be used directly as or added as an additive in an oil, a spread, a other fatty ingredient, a drink, a soy or soy-based sauce, dairy products (milk, yogurt, cheese, ice cream), baked goods, nutritional products, for example as a nutritional supplement ( in capsule or tablet form), vitamin supplements, food supplements, powder for powder for beverages, such as energy drinks or milk powders for infant formulations, finished or semi-finished powdered food products, etc. ., according to the uses known to those skilled in the art.
  • Animal feeds are also known to those skilled in the art. They are intended in particular for farm animals, such as cows, pigs, chickens, sheep, goats or in fish farming for crustaceans or farmed fish.
  • compositions comprising an oil rich in PUFA are also known to those skilled in the art, the oil being used alone or in combination with other medicaments.
  • the oil rich in PUFA obtained by the process according to the invention can be formulated in the form of single-dose compositions, in particular in the form of tablets, capsules, capsules, powders, granules, suitable for oral administration.
  • the invention also relates to the use of an oil rich in PUFA obtained by process according to the invention, crude, refined or diluted, for human or animal food, in particular for the food of newborns, children, or pregnant or lactating women.
  • the Pythium irregulare strain originating from the NBRC collection n ° 30346 is cultivated in a 250 mL baffled Erlenmeyer flask in 50 mL of the PDB culture medium (Potato Dextrose Broth) composed of 200 g of potato infusion and 20 g dextrose.
  • the wet biomass is recovered by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and then homogenized by vortexing in the presence of glass beads with a diameter of 1 mm and an amount representing a volume of 1 to 2 mL. 5 mL of this homogenate are used to inoculate a 250 mL flask containing 45 mL of PDB medium.
  • the flasks are incubated at a temperature of 26 ° C. and with magnetic stirring by a bar magnet at 150 revolutions per minute.
  • the light is supplied from below via a device comprising several LEDs of identical nature and this continuously throughout the duration of the cultivation stage.
  • Each of the culture stations by magnetic stirring can be equipped with a lighting device of a different nature.
  • the intensity of the illumination is set at 200 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • a heterotrophic growth control is carried out under the same experimental conditions except for the light which is absent.
  • the cultures are incubated under these conditions for 7 days.
  • the biomass is harvested by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and the supernatant discarded. After washing the biomass with distilled water, the latter is lyophilized.
  • the lipid content of the biomass is analyzed by GC-FID after a transesterification step on an aliquot of approximately 2 mg of this lyophilized biomass.
  • a production of ARA relative to the dry matter multiplied by a factor of at least 1.5, averaging a factor of about 2.4, up to a factor of about 3.7.
  • EPA production relative to dry matter is multiplied by a factor of at least 2.5, on average by a factor of about 3.6, up to a factor of about 4.7.
  • the total ARA and EPA production relative to dry matter is multiplied by a factor of at least 2.1, on average by a factor of about 3.1, up to a factor of about 4, 2.
  • the Pythium irregulare strain originating from the NBRC collection n ° 100109 is cultivated in a 250 mL baffled Erlenmeyer flask in 50 mL of the PDB (Potato Dextrose Broth) culture medium composed of 200 g of potato infusion and 20 g dextrose.
  • the wet biomass is recovered by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and then homogenized by vortexing in the presence of glass beads with a diameter of approximately 1 mm and an amount representing a volume of 1 to 2 mL. 5 mL of this homogenate are used to inoculate a 250 mL flask containing 45 mL of PDB medium.
  • the flasks are incubated at a temperature of 26 ° C. and with magnetic stirring by a bar magnet at 150 revolutions per minute.
  • the light is supplied from below via a device comprising several LEDs having an emission peak at 660 nm and this continuously throughout the duration of the culture step.
  • the intensity of the lighting is fixed at 200, 500 or 2000 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • a heterotrophic growth control is carried out under the same experimental conditions except for the light which is absent.
  • the cultures are incubated under these conditions for 7 days.
  • the biomass is harvested after 7 days by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and the supernatant discarded. After washing the biomass with distilled water, the latter is lyophilized.
  • the lipid content of the biomass is analyzed by GC-FID after a transesterification step on an aliquot of approximately 2 mg of this lyophilized biomass.
  • a production of ARA relative to the dry matter multiplied by a factor of d. at least 3.4, averaging a factor of about 3.9, up to a factor of about 4.
  • EPA production relative to dry matter is multiplied by a factor of at least 3.3, on average by a factor of about 3.7, up to a factor of about 4.3.
  • the total ARA and EPA production relative to dry matter is multiplied by a factor of at least 3.3, on average by a factor of about 3.8, up to a factor of about 4, 2.
  • the Pythium irregulare strain originating from the NBRC collection n ° 100109 is cultivated in a 250 mL baffled Erlenmeyer flask in 50 mL of the PDB (Potato Dextrose Broth) culture medium composed of 200 g of potato infusion and 20 g dextrose.
  • the wet biomass is recovered by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and then homogenized by vortexing in the presence of glass beads with a diameter of approximately 1 mm and an amount representing a volume of 1 to 2 mL. 5 mL of this homogenate are used to inoculate a 250 mL flask containing 45 mL of PDB medium.
  • the flasks are incubated at a temperature of 26 ° C. in an incubator whose agitation is set at 140 revolutions per minute.
  • the light is provided by a series of fluorescent tubes of the daylight type at 6000 ° K.
  • the intensity of the illumination is of the order of 50 pmoles of photons / m 2 / sec.
  • the cultures are incubated under these conditions for 7 days.
  • the biomass is harvested after 7 days by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes and the supernatant discarded. After washing the biomass with distilled water, the latter is lyophilized.
  • the lipid content of the biomass is analyzed by GC-FID after a transesterification step on an aliquot of approximately 2 mg of this lyophilized biomass.

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Abstract

La présente invention concerne la culture industrielle de protistes pour la production de lipides contenant des acides gras polyinsaturés (PUFA), en particulier l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide arachidonique (ARA).

Description

PROCÉDÉ DE CULTURE DE MICROORGANISMES POUR L’ACCUMULATION DE
LIPIDES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la culture industrielle de protistes pour la production de lipides contenant des acides gras polyinsaturés (PUFA), en particulier l’acide eicosapentaénoïque (EPA) et l’acide arachidonique (ARA).
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les protistes du genre Pythium sont des microorganismes filamenteux appartenant à la classe des Oomycetes ayant des similitudes avec les champignons. Pythium présente la particularité de synthétiser et d’accumuler des lipides de réserve contenant des Acides Gras Poly-lnsaturés (AGPI ou PUFA) comme l’Acide Eicosapentaénoïque (EPA) et l’Acide Arachidonique (ARA). L’intérêt de ce protiste réside dans l’accumulation majoritaire d’EPA parmi les autres PUFA, en particulier l’ARA.
Certains ont donc envisagé d’employer Pythium comme souche industrielle pour la production d’huile riche en EPA (EP 1 001 034 ; WO 2014/137894 ; Lio J, Wang T. (2013); Liang Y, Zhao X, Strait M, Wen Z. (2012) ; Athalye SK, Garcia RA, Wen Z. (2009) ; Stinson EE, Kwoczak R, Kurantz MJ. (1991) ; Gandhi SR, Weete JD. (1991)).
Pythium est un microorganisme non photosynthétique qui se développe en milieu aqueux ou dans le sol, souvent comme parasite de végétaux sauvages ou de culture (céréales et cultures potagères). La culture de Pythium est réalisée en hétérotrophie, c’est à dire en absence de lumière. C’est d’ailleurs l’un des avantages identifiés dans l’état de la technique de ne pas avoir à dépendre de la lumière (WO 2009/143007).
Toutefois, la teneur en matière grasse dans les souches cultivées par ces méthodes de culture, inférieure à 30% de la matière sèche, reste trop faible pour une exploitation industrielle.
La présente invention permet de résoudre ce problème avec un nouveau procédé de culture qui permet d’augmenter la teneur de matière grasse à des niveaux de pourcentages de la matière sèche compatibles avec une exploitation industrielle.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de préparation d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, et (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, l’étape de culture comprenant une phase d’éclairage.
L’invention concerne également un procédé de préparation de compositions lipidiques riches en PUFA qui comprend la culture à partir d’une a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.
L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (d) la formulation d’une composition par addition de la biomasse récupérée en (b) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.
L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une composition lipidique riche en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée et (d) la formulation d’une composition par addition de la composition lipidique extraite en (c) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.
L’invention concerne aussi une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, la teneur en lipides étant d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS), de préférence d’au moins 50% MS, plus préférentiellement, d’au moins 55% MS, en particulier au moins 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 % MS.
Les protistes du genre Pythium sont avantageusement des protistes de l’espèce Pythium irregulare.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION i. Définitions
Par « biomasse », on entend un ensemble de cellules de protistes du genre Pythium produits par leur culture et séparée du milieu de culture (également appelé jus de fermentation). Les cellules peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de protistes dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que l’intégrité physique desdites cellules de microorganismes a pu être altérée comme par exemple des microorganismes lysés, résultant par exemple d’un procédé d’homogénéisation ou lyse enzymatique. Une fois produite, cette biomasse pourra être brute, juste séparée de son milieu de culture, séchée ou non, dégradée ou non. Une biomasse brute extraite du milieu de culture peut avoir un taux d’humidité de 70% à 90 %, généralement 80% à 85 %.
Une biomasse séchée ou « biomasse sèche » présente un taux d’humidité de 1% à 10%, généralement de 2% à 7%.
Par « protistes du genre Pythium », on entend l’ensemble des protistes désignées sous la classe des Oomycetes et du Genre Pythium, producteur d’EPA, et capables d’être cultivées de manière industrielle. Cela inclus également les souches aux performances améliorées obtenues par mutagénèse et sélection, ou par modification du génome. Cet ensemble des protistes désignés comprend notamment les espèces Pythium insidiuosum, Pythium irregulare, Pythium intermedium, Pythium splendens, Pythium ultimum. Selon une alternative préférée de l’invention, les protistes du genre Pythium sont de l’espèce Pythium irregulare.
Par « industriel(le) », « culture industrielle » ou « cultivée de manière industrielle », on entend une culture des protistes dans un milieu de culture approprié à leur croissance et à la production de PU FA et dans un volume approprié pour la production des quantités suffisantes pour adresser un marché. Ces cultures industrielles sont réalisées par fermentation en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu. Les fermenteurs ont des volumes qui peuvent aller de 1000 L à plus de 200 m3.
Par« milieu de culture » on entend une composition aqueuse comprenant les nutriments nécessaires à la croissance des protistes du genre Pythium, en particulier une source de carbone, une source d’azote, une source de phosphore, mais aussi des sels minéraux, et/ou des vitamines, oligoéléments, etc. bien connus de l’homme du métier.
Le milieu de culture peut être un milieu chimiquement défini, de composition connue et reproductible, dans lequel la teneur de chaque élément est connue et ne comprenant pas de matières organiques et/ou minérales riches ou complexes.
Le milieu de culture peut alternativement comprendre des composants de composition variable, comme des matières organiques et/ou minérales riches ou complexes.
Par matières organiques riches ou complexes on entend des matières organiques non purifiées, se présentant sous la forme de mélanges pour lesquels la composition exacte et les concentrations des divers composants du mélange ne sont pas connues avec exactitude, pas maîtrisées, et peuvent présenter une variabilité significative d’un lot à un autre. Comme exemple de matière organique riche ou complexe, on peut citer les extraits de levure ou les peptones qui sont des produits d'une réaction d'hydrolyse de protéines ou encore les infusions de végétaux comme la pomme de terre ou les matières minérales riches comme par exemple les sels minéraux marins ou autres agents de croissance complexes, n’ayant pas de concentration fixe de chacun de leurs composants.
La composition du milieu de culture peut varier dans le temps avec la consommation des nutriments par les souches de protistes du genre Pythium. Selon le mode de culture choisi, il est possible de compléter le milieu de culture au cours de la culture en l’alimentant avec un ou plusieurs milieux de culture complémentaire qui contiennent tout ou une partie des nutriments présents dans le milieu de culture initial.
Par « source de carbone » on entend plus particulièrement une source de carbone complexe qui n’est pas le C02, en particulier choisie parmi les sucres, les acides organiques ou les polyols, comme du glucose, des dérivés de cellulose, du lactate, de l’amidon, du lactose, du saccharose, de l’acétate, du glycérol, du fructose, du xylose, tout produit ou coproduit riche en un ou plusieurs des composés susmentionnés et leurs mélanges.
Les « PUFA », abréviation de « Poly Unsaturated Fatty Acide » ou Acides Gras Poly Insaturés, sont des acides gras polyinsaturés comprenant au moins 16 atomes de carbones et au moins 2 insaturations, en particulier les acides gras identifiés par les signes co3 et co6, comme l’acide a-linolénique (ALA ou C18:3n3), l’acide g-linolénique (AGA ou (C18 :3n3), l’acide arachidonique (ARA ou C20:4n6), l’acide eicosapentaénoïque (EPA ou C20:5n3), l’acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6n3) ou l’acide acide docosapentanoïque (DPA ou C22:5n6).
Par « lipides riches en PUFA », on entend une huile riche en PUFA comprenant au moins 10 % de PUFA choisis parmi IΈRA et l’ARA par rapport à la masse totale de lipides, préférentiellement au moins 15 %. La masse totale de lipides représente au moins 50% de la biomasse sèche, de manière avantageuse au moins 60%, de manière plus avantageuse au moins 65%,
Les huiles riches en PUFA selon l’invention sont essentiellement sous la forme de triglycérides. Les triglycérides représentent au moins 80% de la masse totale de matière grasse, de manière avantageuse au moins 90%, de manière plus avantageuse au moins 93% de la masse totale de matière grasse. La teneur en triglycérides est par exemple analysée par chromatographie sur couche mince (Jouet et al., 2003). Ces caractéristiques de l’huile selon l’invention concernent tant l’huile telle que présente dans la biomasse de microorganismes que dans l’huile extraite de cette biomasse, qu’elle soit brute ou purifiée.
Une huile dite « brute » est une huile extraite de la biomasse après séparation des lipides de la phase aqueuse et des insolubles, en particulier des protéines. Les méthodes d’extraction des lipides à partir d’une biomasse sont bien connues de l’homme du métier, décrites notamment WO 2020/053375, WO 2001/053512, WO 2011/153246, US 2014/350222, WO 2015/095694, WO 01/53512, WO 2010/096002.
Une huile dite « raffinée » est une huile purifiée obtenue après purification de l’huile brute, notamment raffinée en fonction de sa destination d’usage. Les méthodes de raffinage des compositions lipidiques brutes sont bien connues de l’homme du métier, décrites notamment par Manjula et al. (2006), GB 2 031 290, US 5,310,487 ou US 4,971,660. Par « huile modifiée », on entend une huile brute ou raffinée dont la composition en acides gras a été modifiée. Cette modification peut comprendre une concentration en PU FA, par élimination d’autres acides gras saturés ou insaturés, ou encore une dilution par ajout d’huiles de profil lipidique différent.
Par « composition lipidique », on entend un mélange de lipides comprenant au moins une huile riche en PUFA selon l’invention, extraite de la biomasse, brute, raffinée et/ou modifiée.
Sauf indications contraires, les pourcentages sont donnés en masse. ii. Culture de la biomasse
La présente invention concerne un procédé de préparation d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, et (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, l’étape de culture comprenant une phase d’éclairage.
La culture de protistes du genre Pythium en hétérotrophie sur un milieu de culture comprenant une source de carbone est bien connue de l’homme du métier. Ces cultures peuvent être en mode en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu.
Le procédé selon l’invention est avantageusement mis en œuvre pour une production industrielle de biomasse.
Que ce soit en mode discontinu, semi-continu ou continu, l’étape (a) de culture consiste à produire un moût de fermentation comprenant le jus de fermentation et la biomasse, avec une densité d’au moins 20 g/L de Matière sèche. Avantageusement la culture sera menée de manière à atteindre une densité d’au moins 30 g/L, de manière avantageuse d’au moins 40 g/L.
Une fois la densité de culture recherchée atteinte, la biomasse est récupérée du milieu de culture, séparée du jus de fermentation.
La culture des protistes du genre Pythium est bien connue de l’homme du métier qui saura déterminer les conditions de mise en œuvre de ces cultures en mode aérobie pour obtenir la densité recherchée. On citera en particulier les méthodes de cultures décrites dans Stinson et al. (1991), US2014256973, que l’homme du métier pourra adapter à une culture industrielle.
Les inocula utilisés pour la culture de Pythium peuvent être obtenue par deux méthodes.
La première consiste à la réalisation d’une culture sur gélose favorable à la production de spores, par exemple le milieu PDA (Potato Dextrose Agar) ou Czapek Dox agar. Après un temps de croissance adapté, les spores sont récoltées en milieu liquide selon une méthode connue de l’homme de métier. Par exemple, de l’eau ou un milieu salin adapté est utilisé pour inonder la partie aérienne du mycélium qui s’est développé sur la gélose. Le liquide chargé de spores est ensuite récupéré et les spores dénombrées.
L’inoculation a lieu dans une culture liquide en fiole de type d’Erlenmeyer bafflée contenant un milieu approprié à la croissance comme le PDB (Potato Dextrose Broth) ou Czapek Dox. De 100 à 10000 spores par millilitre de milieu sont ajoutés au milieu de culture. L’inoculation avec un nombre de spores adapté permet de limiter la croissance sous forme de pelotes qui est une caractéristique de la croissance des microorganismes filamenteux.
Une deuxième méthode consiste à la récupération de la biomasse humide d’une culture en fiole puis homogénéisation de cette biomasse. Cette biomasse peut se présenter sous forme de pelotes. L’homogénéisation se pratique dans un dispositif de type blender ou autre homogénéisateur. 5 à 15% de cet homogénat est utilisé pour inoculer une culture en fiole de type d’Erlenmeyer bafflée et dans un milieu adapté à la croissance comme le PDB (Potato Dextrose Broth) ou le Czapek Dox. L’homogénéisation permet de limiter la formation de pelotes lors de la culture ainsi inoculée.
La croissance est réalisée dans un incubateur agitant à une température allant généralement de 20 à 30°C. L’agitation orbitale est paramétrée entre 100 et 200 tours par minutes. Après un temps de croissance de l’ordre de 5 à 15 jours, généralement 7 jours, la biomasse peut être récupérée pour inoculer une autre culture d’un volume plus grand, comme un fermenteur, ou être récoltée ou analysée.
L’invention consiste à éclairer la culture pensant tout ou partie de l’étape de culture (mixotrophie).
Habituellement, la culture de Pythium est réalisée en hétérotrophie, c’est-à-dire sans source de lumière, puisque ce microorganisme n’est pas photosynthétique et n’en a donc pas besoin pour sa croissance. De telles cultures en conditions hétérotrophes sont décrites notamment dans les références citées précédemment et dans WO 2009/143007, par Cheng & al (1999) ou encore par Stinson & al (1991). Les inventeurs ont constaté de manière inattendue que l’éclairage de la culture permettait d’augmenter la teneur en lipides dans les cellules de protistes du genre Pythium par rapport à une culture hétérotrophe décrite dans l’état de la technique.
Cet éclairage consiste à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m2/sec. En ce sens, il s’agit bien d’un éclairage particulier, généralement par des moyens d’éclairage appropriés pour éclairer le milieu de culture et motivé pour favoriser la production de PUFA qui se distingue d’un éventuel éclairage indirect qui proviendrait de la lumière employée pour éclairer le lieux où est mise en œuvre l’étape de culture, tel qu’un laboratoire, qu’elle soit naturelle ou artificielle.
Les longueurs d’ondes adaptées à l’éclairage des cultures de Pythium selon l’invention sont de préférence dans un spectre qui va de l’UV jusqu’au proche infra-rouge via le visible, généralement comprises entre 300 nm et 750 nm. Il peut s’agir d’une lumière dite « blanche » dont le spectre de rayonnement va généralement de 400 à 750 nm, d’un rayonnement Ultra- Violet (UV) dont le spectre de rayonnement est compris entre 300 et 430 nm, d’une lumière dite « bleue » dont le spectre de rayonnement va généralement de 430 à 500 nm, d’une lumière dite « verte » dont le spectre de rayonnement va généralement de 500 à 570 nm, d’une lumière dite « jaune » dont le spectre de rayonnement va généralement de 570 à 590 nm, ou encore de lumière dite « rouge » dont le spectre de rayonnement va généralement de 590 à 750 nm.
L’intensité lumineuse peut être comprise entre 20 et 5000 pmoles/photons/secondes, préférentiellement entre 50 et 3000 pmoles/photons/secondes, plus préférentiellement entre 50 et 2000 pmoles/photons/secondes. En particulier, l’intensité lumineuse peut être d’au moins 200 pmoles/photons/secondes, de 200 à 1000 pmoles/photons/secondes, en particulier d’environ 500 pmoles/photons/secondes.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière dite « blanche » est avantageusement comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m2/sec.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage UV est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m2/sec.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière bleue est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m2/sec.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière verte est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m2/sec.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière jaune est avantageusement comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m2/sec.
L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière rouge est avantageusement comprise entre 50 et 1000 pmoles de photons/m2/sec.
La composition du spectre lumineux dépendra notamment des lampes employées pour l’éclairage des cultures. Il s’agit en particulier de lampes de type tubes fluorescents ou néons, de type lampe à sodium ou encore de type LED, de préférence de type LED.
Pour un éclairage en lumière dite « blanche » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 400 et 750 nm. Ces sources de type LED de couleur blanche ont généralement un pic d’émission principal dans le bleu vers 470 nm et une émission secondaire plus diffuse entre 500 et 700 nm.
Pour un éclairage en lumière dite « UV » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 380 et 400 nm.
Pour un éclairage en lumière dite « bleue » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 450 et 500 nm. Pour un éclairage en lumière dite « verte » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 500 et 570 nm.
Pour un éclairage en lumière dite « jaune » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 570 et 590 nm.
Pour un éclairage en lumière dite « rouge » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission compris entre 590 et 750 nm.
L’éclairage peut être mise en œuvre pendant toute la durée de l’étape (a) de culture, ou bien partiellement. L’homme du métier saura déterminer quand débuter l’éclairage et quand l’arrêter en fin de culture avant l’étape (b) de récupération de la biomasse.
La durée de l’éclairage peut aller de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture, préférentiellement entre 30 et 100%, plus préférentiellement entre 50 et 100%.
Un éclairage partiel peut être apporté durant une phase propice à l’accumulation de lipides, généralement à partir du milieu ou de la fin de la phase exponentielle de croissance.
L’éclairage pourra être continu, ou discontinu avec une alternance de périodes d’éclairage et de périodes d’obscurité. Les phases successives d’éclairement peuvent être comprises entre 1 secondes et 10 minutes, par exemple entre 10 secondes et 2 minutes, ou encore entre 20 secondes et 1 minute. Elles sont espacées par des phases d’obscurité d’une durée égale ou différente à la durée de chaque phase d’éclairage.
Les dispositifs industriels de culture en mixotrophie permettant de varier les éclairages, tant en longueur d’onde, qu’en intensité et en durée, sont par exemple décrits dans les demandes de brevets WO 2009/069967, US 2010/005711, WO 2014/174182 ou WO 2019/034792.
Lorsque l’intensité lumineuse à délivrer est choisie à une valeur élevée, notamment au- delà de 500 pmoles de photons/m2/sec, la consommation électrique et le dégagement de chaleur peuvent être limités en apportant la lumière sous forme de flash à haute fréquence, généralement comprise entre 0,5 et 150 kHz, avantageusement entre 1 et 100 kHz, ce qui se traduit par une alternance de phases éclairées et de phase noires dans une période comprise entre 0,001 et 0,00001 secondes. La durée de la phase éclairée peut être de 1 à 90% de chaque période, selon les diminutions de consommation électrique et de dégagement de chaleur souhaitées. L’utilisation des équipements électriques et le paramétrage de ces derniers sont connus de l’homme de métier.
Selon un mode préféré de l’invention, l’éclairage sera assuré par une source lumineuse de type LED délivrant un éclairage rouge dont le spectre d’émission sera compris entre 600 et 750 nm et dont la durée sera comprise entre 50 et 100% de l’étape de culture iii. Récupération de la biomasse
L’étape (b) de récupération de la biomasse du milieu de culture comprend la séparation de la biomasse du jus de fermentation. Les méthodes de récupération sont bien connues de l’homme du métier, en particulier par centrifugation (centrifugeuse à assiettes ou sedicanteur), ou par filtration (filtre plaque, filtre presse, filtration tangentielle céramique ou organique).
La biomasse brute récupérée peut être lavée pour éliminer certains solubles (par exemple par filtration pour éliminer le milieu de fermentation et lavage à l’eau).
La biomasse brute ou lavée peut aussi être séchée par des méthodes usuelles, notamment par atomisation ou lyophilisée.
Elle peut également être traitée par l’ajout de composants utiles à sa conservation et son stockage, comme par exemple des agents antioxydants, avant ou après le séchage, ou des sucres pour éviter un réchauffement spontané de la biomasse.
L’invention concerne aussi une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, la teneur en lipides étant d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS), de préférence d’au moins 50% MS, plus préférentiellement, d’au moins 55% MS, en particulier au moins 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 ou 65 % MS, jusqu’à 75% MS.
Les PUFA sont essentiellement constitués d’un mélange d’ARA et d’EPA. Le rapport pondéral ARA/EPA est avantageusement de 0,5 à 1, plus particulièrement de 0,6 à 0,9, en particulier d’environ 0,7.
La teneur en PUFA (ARA + EPA) est d’au moins 10% de la somme des acides gras, avantageusement d’au moins 15%, en particulier de 15 à 40 %. Selon un mode particulier, la teneur totale en ARA et en EPA est d’au moins 20%.
La teneur en ARA est d’au moins 5%, de préférence d’au moins 6%, plus préférentiellement de 7,5% ou plus de 7,5%, en particulier au moins7,7%, au moins 8% ou au moins 9%.
La teneur en EPA est de préférence d’au moins 12% de de la somme des acides gras, plus préférentiellement d’au moins 13 %, en particulier au moins 14%, au moins 15%, au moins 16% ou au moins 17%.
La teneur en acides gras dans les huiles selon l’invention, brutes ou raffinées, est avantageusement la suivante acide myristique (C14 :0) 5% à 10% acide palmitique (C16 :0) 10% à 20% acide palmitoléique (C16 :1 n-7) 6% à 10% acide oléique (C18 :1 n-9c) 15% à 25% acide linoléique (C18 :2 n-6c) 10% à 25% acide arachidonique (C20 :4 n-6) 5% à 15% acide eicosapentaémoïque (C20 :5 n-3) 7% à 20%
Plus avantageusement, la teneur en acides gras dans les huiles selon l’invention, brutes ou rafinées, est la suivante acide myristique (C14 :0) 6% à 7% acide palmitique (C16 :0) 11% à 16% acide palmitoléique (C16 :1 n-7) 6% à 8,5% acide oléique (C18 :1 n-9c) 16% à 25% acide linoléique (C18 :2 n-6c) 13% à 22% acide arachidonique (C20 :4 n-6) 6% à 10% acide eicosapentaémoïque (C20 :5 n-3) 10% à 20%
En particulier, la teneur des principaux acides gras est de l’ordre de 9% pour l’acide myristique (C14 :0) ; 12% pour l’acide palmitique (C16 :0) ; 7% pour l’acide palmitoléique (C16 :1 n-7) ; 17% pour l’acide oléique (C18 :1 n-9c) ; 20% pour l’acide linoléique (C18 :2 n- 6c) ; 9% pour l’acide arachidonique ou ARA (C20 :4 n-6) et 18% pour l’acide eicosapentaémoïque ou EPA (C20 :5 n-3).
Selon un mode particulier, la biomasse selon l’invention a été « stabilisée » pour sa conservation, son stockage et/ou son transport.
Il peut s’agir d’ajout de composants stabilisants que l’on ne trouve pas associées aux cellules de protistes dans la nature, comme des sucres (WO 2020/036814), des antioxydants comme du tocophérol, de l’extrait de romarin ou de l’acide ascorbique.
Selon un mode particulier, la biomasse n’est plus apte à se développer sur un milieu de culture, les fonctions vitales des cellules étant altérées. C’est en particulier le cas pour une biomasse dégradée, en particulier une biomasse dégradée et sèche iv. Extraction des lipides
L’invention concerne également un procédé de préparation de compositions lipidiques riches en PUFA qui comprend la culture à partir d’une a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.
Plusieurs méthodes industrielles d’extraction de lipides riches en PUFA à partir d’une biomasse de microalgues cultivées pour produire lesdites huiles sont décrites dans la littérature et connues de l’homme du métier. L’extraction des lipides comprend la lyse des cellules de biomasse pour libérer les huiles riches en PUFA qu’elles contiennent, puis la séparation des lipides des fractions solides et des fractions solubles dans l’eau.
La lyse peut être mécanique (pressage ou broyage) ou enzymatique avec des protéases ou des cellulases.
Les méthodes de lyse mécaniques sont bien connues, notamment par broyeur à billes, mélangeur-disperseur, homogénéisateur haute pression, broyeur à broches ou broyeur à impact, ultra-sons, champs électrique pulsés. Comme dispositifs pour la mise en œuvre de ces méthodes de lyse mécanique, on citera notamment (nom du constructeur entre parenthèses) pour le broyeur à billes : Discus-1000 (Netzsch); ECM-AP60 (WAB) ; pour l’homogénéisateur haute pression: Ariete (GEA) ; pour le mélangeur-disperseur : 700-X (Silverson), pour le broyeur à broche : Contraplex (Hosakawa); pour le broyeur à impact : Condux (Netzsch).
On connaît les enzymes susceptibles d’être employées, notamment décrites dans WO2015/095688, WO2011/153246, US6750048 et WO2015/095694, en particulier des proteases ou des cellulases telles que les enzymes commercialisées par la société Novozyme sous les appellations Alcalase 2,5 L, Alcalase 2,4 L, Alcalase 3,0 T, Novozym 37071 , Flavourzyme 1000 L, Novozym FM 2,4 L, Protamex, Viscozyme. Les conditions de mise en œuvre sont celles préconisées par le fournisseur, la température étant celle préconisée pour une activité optimale des enzymes, d’au moins 50°C et jusqu’à 70 °C, de préférence d’environ 65°C. Avantageusement la lyse enzymatique est mise en œuvre sous une atmosphère pauvre en oxygène. Généralement, la concentration en oxygène est inférieure à 1% en masse.
On citera notamment les méthodes de lyse décrites dans la demande WO 2020/053375, WO 2001/053512.
L’extraction des huiles à partir de la biomasse lysée peut se faire par différentes méthodes connues, comme l’ajout de sodium sous forme de sulfate de sodium ou bien de chlorure de sodium (WO 2011/153246), l’extraction par solvants (US 2014/350222) et/ou des températures élevées durant plusieurs heures (WO 2015/095694), ou encore par de nombreuses autres méthodes décrites dans la littérature (WO 2019/219396, WO 2019/219443, WO 2019/121752, WO 2018/122057, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2015/095696, WO 2011/153246, WO 2002/010423).
De préférence, l’extraction des huiles à partir de biomasse lysée est mise en œuvre par séparation mécanique, également bien connue de l’homme du métier, comme une séparation gravitaire, notamment par centrifugation comme décrite dans la demande de brevet WO 01/53512. On peut aussi employer une séparation continue, en particulier par séparateur centrifuge à assiettes. De tels séparateurs sont connus pour extraire en continu des huiles de milieux complexes comprenant des résidus solides et de l’eau, tels que décrits dans la demande de brevet WO 2010/096002, notamment commercialisés par les sociétés Alfa Laval, Flottweg ou GEA Westfalia, notamment. Cette étape de séparation continue est préférée dans le procédé employé pour obtenir l’huile selon l’invention.
Dans certains cas, les étapes de lyse et d’extraction sont simultanées, sous une action mécanique, généralement par une ou plusieurs centrifugations (WO 2019/032880) notamment avec les dispositifs de centrifugation décrit plus haut.
L’extraction de l’huile à partir de la biomasse peut favoriser l’extraction de ces PU FA par rapport aux acides gras saturés de plus bas poids moléculaire. Avantageusement, cette concentration ne modifie pas de manière substantielle les propriétés intrinsèques de l’huile contenue dans la biomasse, notamment la teneur en triglycérides. Préférentiellement, l’huile selon l’invention est une huile qui n’a pas subi de modifications substantielles de sa teneur en acides gras par l’ajout de PU FA, par exemple sous forme d’esters, par concentration et/ou par l’élimination d’acides gras saturés comme l’acide palmitique.
L’huile obtenue est généralement une huile appelée huile brute, qui peut être employée telle quelle ou faire l’objet d’un raffinage, notamment pour faciliter sa conservation, en évitant qu’elle ne rancisse, ou pour modifier sa couleur ou son odeur de manière à la rendre plus acceptable pour un consommateur. Ces étapes de purification et raffinage sont bien connues de l’homme du métier, décrites dans des demandes de brevets (WO 2002/010322, WO 2017/035403), notamment des étapes de dégommage, de neutralisation des acides gras libres, de décoloration et de désodorisation. Elles permettent d’éliminer (tout ou bien en partie) les phospholipides, les pigments, les volatiles et les acides gras libres. De fait, ces méthodes ne viennent pas modifier substantiellement la teneur relative en acides gras, saturés ou insaturés, ni la teneur en triglycérides de l’huile raffinée obtenue par rapport à l’huile purifiée.
Le procédé selon l’invention peut aussi comprendre une étape de modification des huiles obtenues précédemment et décrites plus haut, qu’elles soient brutes, purifiées ou raffinées.
Certains procédés de l’état de la technique présentent une étape dite de « winterisation » mise en œuvre sur les huiles brutes ou purifiées, notamment pour éliminer les acides gras saturés, avec pour effet d’augmenter la teneur en PUFA (WO 02/10322). Les huiles extraites selon l’invention, brutes ou raffinées, ne nécessitent a priori pas de « winterization » pour être exploitées. Toutefois, l’homme du métier pourra choisir d’ajouter une telle étape de « winteriation » s’il y trouve un quelconque avantage commercial pour son produit final.
Certains procédés comprennent une modification des huiles récupérées de la biomasse, par exemple pour en modifier la composition en certains acides gras saturés ou insaturés, notamment pour favoriser la concentration en PUFA. De telles méthodes connues de l’homme du métier comprennent notamment des traitements enzymatiques par des enzymes telles que les lipases (CN 105349587, WO 2019/219904, WO 2019/219903).
D’autres composants peuvent être ajoutés aux huiles brutes, purifiées ou raffinées selon l’invention, comme des agents antioxydants, notamment ceux décrits dans les demandes WO 2019/185942, WO 2019/185940, WO 2019/185939, WO 2019/185910, WO 2019/185894, WO 2019/185889 et WO 2019/185888.
Les huiles brutes ou raffinées, ou les huiles de composition modifiée peuvent aussi être diluées pour leur usage ultérieur. Les huiles employées pour diluer l’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention sont généralement et de préférence des huiles végétales adaptées à une consommation alimentaire humaine ou animale. On citera en particulier les huiles de tournesol, de colza, de soja, de noix, de sésame, de chanvre, de noisette, d’argan, d’olive, de lin, ou de toute autre huile adaptée à un usage alimentaire. L’huile ajoutée peut aussi être une huile comprenant d’autres PUFA, en particulier du DHA, en particulier d’autres huiles d’origine microbienne ou encore des huiles de poisson.
Le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une telle étape de dilution d’une huile brute ou raffinée obtenue précédemment.
L’invention concerne aussi une huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute ou raffinée ou susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’invention.
La composition de l’huile selon l’invention, notamment la teneur en PUFA et en autres acides gras est donnée plus haut pour la composition de l’huile contenue dans la biomasse v. Compositions
L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (d) la formulation d’une composition par addition de la biomasse récupérée en (b) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage telle que définie auparavant.
L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une composiiton lipidique riche en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée et (d) la formulation d’une composition par addition de la composition lipidique extraite en (c) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage telle que définie auparavant.
L’invention concerne aussi une composition qui comprend une biomasse ou une huile riche en PUFA susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention telles que décrites plus haut.
Une composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs excipients. Un excipient est un composant, ou mélange de composants, qui est utilisé dans la présente invention pour donner des caractéristiques souhaitables à la composition pour sa conservation et son usage, y compris des aliments et des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et industrielles. Un excipient peut être décrit comme un excipient "pharmaceutiquement acceptable" lorsqu'il est ajouté à une composition pharmaceutique dont les propriétés sont connues de la pharmacopée pour être employés au contact des tissus humains et animaux sans toxicité excessive, irritation, réaction allergique ou autres complications. Différents excipients peuvent être utilisés comme une base organique ou minérale, un acide organique ou minéral, un tampon de pH, un stabilisant, un antioxydant, un agent d'adhésion, un agent de séparation, un agent de revêtement, un composant de phase extérieure, un composant à libération contrôlée, un agent tensioactif, un humectant, une charge, un émollient ou des combinaisons de ceux-ci.
Selon leur destination, les compositions selon l’invention sont en particulier des compositions pharmaceutiques, cosmétiques, neutraceutiques ou des aliments.
Les aliments sont destinés tant aux humains qu’aux animaux et comprennent des compositions solides, pâteuses ou liquides. On citera en particulier les aliments courants, les produits liquides, y compris laits, boissons, boissons thérapeutiques et boissons nutritionnelles, les aliments fonctionnels, les suppléments, les neutraceutiques, les préparations pour nourrissons, y compris les préparations pour nourrissons prématurés, les aliments pour femmes enceintes ou allaitantes, les aliments pour adultes, les aliments gériatriques et aliments pour animaux.
L’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, qu’elle soit brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient peut être utilisée directement comme ou ajouté en tant qu'additif dans une huile, une pâte à tartiner, un autre ingrédient gras, une boisson, une sauce à base de soya ou à base de soja, des produits laitiers (lait, yaourt, fromage, crème glacée), des produits de boulangerie, des produits nutritionnels, par exemple sous forme de complément nutritionnel (sous forme de gélule ou de comprimé), des suppléments vitaminiques, des compléments alimentaires, des poudres à diluer pour boissons, comme des boissons énergétiques ou des poudres de laits pour des formulations infantiles, des produits alimentaires en poudre fini ou semi-fini, etc., selon les usages connus de l’homme du métier.
Les aliments pour animaux sont également connus de l’homme du métier. Ils sont en particulier destinés aux animaux d’élevage, comme les vaches, cochons, poulets, moutons, chèvres ou dans la pisciculture pour les crustacés ou les poissons d’élevage.
Les compositions pharmaceutiques comprenant une huile riche en PUFA sont également connues de l’homme du métier, l’huile étant employée seule ou en combinaison avec d’autres médicaments.
L’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient, peut être formulée sous la forme de compositions unidoses, notamment sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, de poudres, de granulés, adaptés à une administration per os.
L’invention concerne également l’utilisation d’une huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute, raffinée ou diluée, pour l’alimentation humaine ou animale, en particulier pour l’alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes.
De tels usages sont bien connus de l’homme du métier, notamment décrits dans la demande de brevet WO 2010/107415 et sur le site Web de la société DSM (https://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/products/nutritional-lipids/life- dha.html)
EXEMPLES
Exemple 1
La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 30346 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre de 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C et avec une agitation magnétique par un barreau aimanté à 150 tours par minute. La lumière est apportée par le dessous via un dispositif comprenant plusieurs LED de nature identique et ce en continu pendant toute la durée de l’étape de culture. Chacun des postes de culture par agitation magnétique peut être équipé avec un dispositif d’éclairage de nature différente. L’intensité de l’éclairage est fixée à 200 pmoles de photons/m2/sec. Un témoin de croissance en hétérotrophie est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales hormis la lumière qui est absente. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.
Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 1. Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras
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Selon la lumière employée, on observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport à une culture en hétérotrophie (sans lumière) de l’état de la technique une production en ARA par rapport à la matière sèche multipliée par un facteur d’au moins 1,5, en moyenne d’un facteur d’environ 2,4, jusqu’à un facteur d’environ 3,7.
La production en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 2,5, en moyenne d’un facteur d’environ 3,6, jusqu’à un facteur d’environ 4,7.
La production totale en ARA et en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 2,1 , en moyenne d’un facteur d’environ 3,1, jusqu’à un facteur d’environ 4,2.
Exemple 2
La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 100109 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre d’environ 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C et avec une agitation magnétique par un barreau aimanté à 150 tours par minute. La lumière est apportée par le dessous via un dispositif comprenant plusieurs LED ayant un pic d’émission à 660 nm et ce en continu pendant toute la durée de l’étape de culture. L’intensité de l’éclairage est fixé à 200, 500 ou 2000 pmoles de photons/m2/sec. Un témoin de croissance en hétérotrophie est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales hormis la lumière qui est absente. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée au bout des 7 jours par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.
Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 2.
Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras
Figure imgf000018_0001
Selon l’intensité lumineuse, on observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport à une culture en hétérotrophie (sans lumière) de l’état de la technique une production en ARA par rapport à la matière sèche multipliée par un facteur d’au moins 3,4, en moyenne d’un facteur d’environ 3,9, jusqu’à un facteur d’environ 4.
La production en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 3,3, en moyenne d’un facteur d’environ 3,7, jusqu’à un facteur d’environ 4,3.
La production totale en ARA et en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 3,3, en moyenne d’un facteur d’environ 3,8, jusqu’à un facteur d’environ 4,2.
Exemple 3
La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 100109 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre d’environ 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C dans un incubateur dont l’agitation est réglée à 140 tours par minute. La lumière est apportée par une série de tubes fluorescent de type lumière du jour à 6000°K. L’intensité de l’éclairage est de l’ordre de 50 pmoles de photons/m2/sec. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée au bout des 7 jours par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.
Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 3. Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras.
Figure imgf000019_0001
On observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport aux cultures en hétérotrophie (sans lumière) généralement constatées une nette augmentation de la teneur en lipide dans la biomasse sèche. On observe, par rapport à la matière sèche, une augmentation de plus de 60% des PUFA en comparaison avec les valeurs généralement constatées en culture hétérotrophe.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, et (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, caractérisé en ce que l’étape de culture comprend une phase d’éclairage, ladite phase consistant à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m2/sec.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les protistes du genre Pythium sont des protistes de l’espèce Pythium irregulare.
3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre pendant tout ou partie de l’étape (a) de culture.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 50 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.
6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’intensité d’éclairage est comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m2/sec.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière blanche.
8. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière UV.
9. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière bleue.
10. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière verte.
11. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière jaune.
12. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière rouge.
13. Procédé de préparation de PUFA à partir d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant
(a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone,
(b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, et (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée en (b), caractérisé en ce que l’étape a) de culture comprend une phase d’éclairage, ladite phase consistant à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m2/sec.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les protistes du genre Pythium sont des protistes de l’espèce Pythium irregulare.
15. Procédé selon l’une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre pendant tout ou partie de l’étape (a) de culture.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.
17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 50 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.
18. Procédé selon l’une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que l’intensité d’éclairage est comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m2/sec.
19. Procédé selon l’une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière blanche.
20. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière UV.
21. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière bleue.
22. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière verte.
23. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière jaune.
24. Procédé selon l’une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière rouge.
25. Biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la teneur en lipides est d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS) et au moins 15 % de PUFA choisis parmi IΈRA et l’ARA.
26. Huile susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une des revendications 13 à 24, caractérisé en ce que la teneur en PUFA est d’au moins 15% choisis parmi IΈRA et l’ARA et dont la teneur en triglycérides est supérieure à 90%.
27. Huile selon la revendication 26, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi les huiles brutes, raffinées et modifiées.
28. Composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, caractérisée en ce qu’elle comprend une biomasse selon la revendication 25 ou une huile selon l’une des revendications 26 ou 27.
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