FR3031985A1 - Procede d'obtention d'un isolat peptidique issu de la biomasse de microalgues enrichies en proteines - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à un isolat peptidique isolé à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines, caractérisé en ce qu'il comprend : - des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa, - une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, - essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique.

Description

1 PROCEDE D'OBTENTION D'UN ISOLAT PEPTIDIQUE ISSU DE LA BIOMASSE DE MICROALGUES ENRICHIES EN PROTEINES La présente invention se rapporte à un isolat peptidique issu d'une biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorelle, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorelle protothecoides. Les algues, macro et micro, ont une richesse spécifique en grande partie inexplorée. Leur exploitation à des fins alimentaire, chimique ou bioénergétique est encore très marginale. Elles recèlent cependant des composants de grande valeur, en richesse comme en abondance. Les microalgues sont en effet des sources de vitamines, lipides, protéines, sucres, pigments et antioxydants. Les algues et microalgues intéressent ainsi le secteur industriel qui les utilise pour la fabrication de compléments alimentaires, d'aliments fonctionnels, de cosmétiques, de médicaments ou pour l'aquaculture. Les microalgues sont avant tout des microorganismes photosynthétiques qui colonisent tous les biotopes exposés à la lumière. A l'échelle industrielle, leur culture monoclonale est réalisée dans des photobioréacteurs (conditions autotrophiques : à la lumière avec du CO2) ou pour certaines d'entre elles, également dans des fermenteurs (conditions hétérotrophiques : à l'obscurité en présence d'une source carbonée). Quelques espèces de microalgues sont en effet capables de pousser en absence de lumière : Chlorelle, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.

Il est d'ailleurs estimé que la culture en conditions hétérotrophiques coûte 10 fois moins chère qu'en conditions phototrophiques car, pour l'Homme du métier, ces conditions hétérotrophiques autorisent : - l'utilisation de fermenteurs identiques à ceux utilisés pour les bactéries et les levures et permettent le contrôle de tous les paramètres de culture. - la production de biomasses en quantité bien plus élevée que ce qui est obtenu par culture basée sur la lumière. L'exploitation rentable des microalgues nécessite généralement la maîtrise des conditions de fermentation permettant d'accumuler ses composants d'intérêt, tels que : - les pigments (chlorophylle a, b et c, B-carotène, astaxanthine, lutéine, phycocyanine, xanthophylles, phycoérythrine...) dont la demande est croissante, tant pour leurs remarquables propriétés antioxydantes, que pour leur apport de couleurs naturelles dans l'alimentation, 3031985 2 - les lipides, ceci afin d'optimiser leur contenu en acides gras (jusqu'à 60 %, voire 80 % en poids de leur matière sèche) notamment pour : - les applications biocarburants, mais aussi - les applications en Alimentation humaine ou animale, lorsque les 5 microalgues sélectionnées produisent des acides gras polyinsaturés ou PUFAs dits "essentiels" (i.e. apportés par l'alimentation car ne sont pas naturellement produits par l'homme ou l'animal), ou - les protéines, ceci afin d'en optimiser les qualités nutritives ou par exemple de favoriser l'apport en acides aminés d'intérêt par le biais de la préparation de fractions riches 10 en peptides. Les fractions peptidiques peuvent être valorisées comme agents fonctionnels ou compléments alimentaires dans de nombreux domaines. Dans le cadre de l'apport en acides aminés d'intérêt, il peut être en effet 15 avantageux de disposer de sources de peptides riches en arginine et en acide glutamique. L'arginine est un acide aminé qui présente de nombreuses fonctions dans le règne animal. L'arginine peut être dégradée et ainsi servir de source d'énergie, de carbone et d'azote à la cellule qui l'assimile.

20 Chez divers animaux, dont les mammifères, l'arginine est décomposée en ornithine et en urée. Cette dernière est une molécule azotée qui peut être éliminée (par excrétion dans les urines) de manière à réguler la quantité de composés azotés présente dans les cellules des organismes animaux. L'arginine permet la synthèse du monoxyde d'azote (NO) par la NO synthétase, 25 intervenant ainsi dans la vasodilatation des artères, ce qui réduit la rigidité des vaisseaux sanguins, augmente le flux sanguin et améliore ainsi le fonctionnement des vaisseaux sanguins. Les compléments alimentaires qui contiennent l'arginine sont recommandés pour promouvoir la santé du coeur, la fonction vasculaire, pour prévenir « l'agrégation des 30 plaquettes » (risque de formation de caillots sanguins) et pour abaisser la pression artérielle. L'implication de l'arginine dans la cicatrisation des plaies est liée à son rôle dans la formation de la proline, un autre acide aminé important pour la synthèse de collagène. L'arginine est enfin un composant fréquemment utilisé, notamment par les sportifs, dans les boissons énergisantes.

35 L'acide glutamique quant à lui n'est pas seulement l'une des briques élémentaires utilisées pour la synthèse des protéines, mais est aussi le neurotransmetteur excitateur le 3031985 3 plus répandu dans le système nerveux central (encéphale + moelle épinière) et est un précurseur du GABA dans les neurones GABAergiques. Sous le code de « E620 », le glutamate est utilisé comme exhausteur de goût des aliments. Il est additionné aux préparations alimentaires pour renforcer leur goût.

5 Outre le glutamate, le Codex Alimentarius a reconnu aussi comme exhausteurs de goût ses sels de sodium (E621), de potassium (E622), calcium (E623), ammonium (E624) et magnésium (E625). Le glutamate (ou ses sels) est souvent présent dans les plats tout prêts (soupes, sauces, chips, plats cuisinés). Il est aussi couramment utilisé en cuisine asiatique.

10 Il est actuellement fréquemment utilisé en combinaison avec des arômes dans les apéritifs (goût bacon, goût fromage). Cela permet de rehausser le goût de bacon, du fromage, etc. Il est rare de trouver un apéritif qui n'en contienne pas. On en trouve aussi dans certaines capsules de médicaments mais pas pour ses fonctions gustatives.

15 Enfin, il est le composant majoritaire des auxiliaires de cuisine (bouillons cubes, fonds de sauces, sauces, etc.). Cependant, les développements en applications alimentaires des fractions peptidiques de microalgues n'ont pas été significatifs à cause de la présence dans lesdites 20 fractions de composés indésirables (pigments...). Ces composés conduisent à des changements non souhaités de couleur, goût et structure des compositions alimentaires en contenant. Pour augmenter leur potentialité en applications alimentaires et pour augmenter également leur valeur commerciale, ces peptides doivent donc être extraits des 25 microalgues présentant les compositions requises, en termes de : richesse en azote, richesse en acides aminés d'intérêt, faible teneur en pigments 30 Objet de l'invention La présente invention se rapporte à un isolat peptidique issu d'une biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorelle, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorelle protothecoides. Plus particulièrement, la présente invention concerne un isolat de microalgues 35 caractérisé par sa teneur remarquablement élevée en arginine et en acide glutamique.

3031985 4 La présente invention se rapporte également à la biomasse de microalgues riches en protéines en tant que telle, biomasse particulièrement adaptée à la préparation dudit isolat peptidique. La présente invention est également relative au procédé d'enrichissement et de 5 dépigmentation de la biomasse de microalgues, plus particulièrement du genre Chlorelle, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorelle protothecoides. La présente invention concerne enfin le procédé de préparation de cet isolat peptidique à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines et dépigmentées. En effet, pour parvenir à exploiter les richesses métaboliques des microalgues, et 10 plus particulièrement leurs fractions peptidiques, la société Demanderesse propose de mettre à disposition un isolat peptidique présentant : des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa, d'une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, essentiellement de 1"arginine et de l'acide glutamique.

15 On entend au sens de l'invention par « essentiellement composés d'arginine et d'acide glutamique », une richesse en arginine et acide glutamique pouvant s'entendre par une teneur en arginine et acide glutamique de plus de 80, 85, 90 ou 95 % en poids exprimée par rapport aux acides aminés totaux. En particulier, ces deux acides aminés représentent 85 à 99 % rapport aux acides aminés totaux, de préférence entre 90 entre 98 % rapport 20 aux acides aminés totaux, et en particulier entre 95 et 98 `Vo. Plus précisément, entend au sens de l'invention par « essentiellement composés d'arginine et d'acide glutamique », une richesse en arginine et acide glutamique pouvant s'entendre par une teneur : d'au moins 40% d'arginine, notamment comprise entre 40% et 60 %, de 25 préférence d'environ 50 % ; et d'au moins 40% d'acide glutamique, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 % exprimée sur acides aminés totaux. En particulier, la teneur en acides aminés autres qu'arginine et acide glutamique 30 est de moins de 10 %, de préférence de moins de 5 %, notamment de moins de 3 `Vo. Dans un mode de réalisation spécifique, la teneur de l'isolat est la suivante : une teneur comprise entre 47 et 48 % d'arginine ; une teneur comprise entre 49 à 50 % d'acide glutamique ; exprimée sur acides aminés totaux, ce qui se traduit par une teneur en acides 35 aminés autres qu'arginine et acide glutamique de moins de 3 `Vo.

3031985 5 Par « environ » est entendu une gamme de valeur comprenant + ou - 10 % de la valeur indiquée, de préférence + ou - 5 % de celle-ci. Par exemple, environ 10 signifie entre 9 et 11, de préférence entre 9,5 et 10,5. Cet isolat de peptides peut être préparé à partir d'une biomasse de microalgues 5 du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides, microalgues décolorées et présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 %, par exemple de plus de 65%. Le procédé préféré de fermentation des microalgues est un procédé en deux étapes, comprenant : 10 une première étape de fermentation, carencée en azote, où la régulation du pH est réalisée par un mélange NH3/KOH puis, une deuxième étape de levée de cette carence en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul. Ces conditions opératoires permettent ainsi d'obtenir rapidement une biomasse 15 présentant une teneur en protéines supérieure à 60 % en N.6,25, de l'ordre de ou d'environ 65 % en N.6,25, et une faible coloration. Le rendement est de 45 à 50 % en poids de matière sèche, et la concentration finale en biomasse est comprise entre 80 et 120 g/I. Par ailleurs, le teneur en sels résiduels de la fraction soluble du moût de fermentation ne dépasse pas 6 g/I.

20 La biomasse ainsi préparée est ensuite lavée pour la purifier de ses solubles interstitiels (notamment des sels solubles), amenée à une matière sèche comprise entre 15 et 30 %, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %, puis est traitée thermiquement à une température comprise entre 50 et 150°C, pendant une durée comprise entre 5 secondes et 5 minutes.

25 A l'issu de ce traitement, qui perméabilise la membrane cellulaire et permet le relargage des composants solubles du compartiment intracellulaire par diffusion libre, la biomasse résiduelle est éliminée, et la fraction soluble récupérée est alors clarifiée, précipitée, concentrée puis séchée pour constituer l'isolat peptidique conforme à l'invention. La présente invention concerne donc un isolat obtenu ou susceptible d'être obtenu 30 à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines préparée par un procédé fermentaire décrit dans le présent document. Elle est également relative à un isolat obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines par un procédé de traitement de la biomasse tel que décrit dans le présent document.

35 Description détaillée de l'invention Caractérisation de l'isolat peptidique selon l'invention 3031985 6 L'invention porte sur un isolat peptidique préparé à partir d'une biomasse de microalgues cultivées de manière à l'enrichir en protéines, microalgues du genre Chlorelle, plus particulièrement Chlorelle protothecoides. L'isolat peptidique conforme à l'invention, obtenu à partir de cette biomasse riche 5 en protéines est caractérisé en ce qu'il comprend : des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa, une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique. Dans ce contexte de définition de l'isolat, le terme « comprend » signifie que l'isolat 10 est essentiellement constitué par ces peptides mais peu comprendre d'autres composants minoritaires. Ainsi, « essentiellement constitué » signifie au moins 90, 95 ou 99 % en poids sec de l'isolat. Le poids moléculaires desdits peptides est mesuré par chromatographie selon la méthode suivante : 15 Conditions chromatographiques : 2 colonnes montées en série : Colonne SUPERDEX® 200HR10/30 avec une Colonne SUPERDEX® Peptide HR10/30 (de Pharmacia Biotech) Débit : 0,3 ml/min Détecteur UV à 214 nm 20 Eluant : NaCI 0,05 M Temps d'analyse : 240 min L'échantillon est mis en solution à 0,5% dans l'eau de qualité HPLC. Les colonnes sont calibrées avec un mélange témoin Biorad ref 151-1901 composé de : 25 Thyroglubuline : Mw = 670 KDa Globuline bovine: Mw = 158 KDa Ovalbumine : Mw = 44 KDa Myoglobine : Mw = 17 KDa Vitamine B12 : Mw = 1.35 KDa 30 Le % des différentes fractions est alors calculé sur la base des temps de rétention de chaque témoin. La mesure de la teneur en protéines est classiquement déterminée par la mesure du N.6.25, connue en toute généralité Enfin la composition en acides aminés est déterminée selon la NF EN ISO 13903 35 (novembre 2005). Les teneurs en arginine et acide glutamique de l'isolat sont telles que précisées plus haut dans ce document.

3031985 7 La teneur élevée en arginine et acide glutamique s'entend par exemple ici par une teneur : - comprise entre 47 et 48 % d'arginine - comprise entre 49 à 50 % d'acide glutamique 5 exprimée sur acides aminés totaux, ce qui se traduit par une teneur en acides aminés autres qu'arginine et acide glutamique de moins de 3 `Vo. Facultativement, l'isolat peptidique comprend moins de 3 % de sucres totaux (hydrates de carbones).

10 Procédé de préparation de l'isolat peptidique conforme à l'invention L'isolat de peptides conforme à l'invention peut être préparé à partir d'une biomasse de microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides, microalgues décolorées et présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 `Vo.

15 Pour obtenir des rendements et productivités maximales en protéines, la société demanderesse a mis en oeuvre un procédé original qu'elle a par ailleurs protégé dans une de ses demandes de brevet récemment déposée. Dans l'état de l'art, de premiers procédés de fermentation permettant d'obtenir de hautes densités cellulaires (acronyme anglais : HCD pour High-Cell-Density) avaient été 20 beaucoup travaillés. L'objectif de ces cultures HCD était l'obtention de la concentration la plus élevée possible du produit souhaité dans le laps de temps le plus court. Cependant, le fait de maintenir la croissance à son taux maximal en h-') n'est pas toujours corrélé avec la production élevée du produit d'intérêt.

25 De ce fait, dans les cas où la formation des produits n'est pas corrélée avec une croissance cellulaire élevée ou maximale, il est judicieux de maîtriser le taux de croissance cellulaire. En général, l'homme du métier choisit de contrôler la croissance des microalgues par la maîtrise des conditions de fermentation (Tp, pH...), ou par l'alimentation régulée en 30 composants nutritionnels (sources azotées ou carbonées) du milieu de fermentation, dans des conditions semi continues dites « fed-batch ». Chlorella protothecoides est justement reconnue comme une des meilleures microalgues productrices d'huile. En conditions hétérotrophiques, elle transforme rapidement les hydrates de 35 carbone en triglycérides (plus de 50 % de sa matière sèche).

3031985 8 Pour optimiser cette production en triglycérides, l'homme du métier est amené à optimiser le flux carboné vers la production d'huile, en agissant sur l'environnement nutritionnel du milieu de fermentation. Il est ainsi connu que l'accumulation en huile se produit lors d'un apport carboné 5 suffisant, mais dans des conditions de carence en azote. Le rapport C/N est donc ici déterminant, et il est admis que les meilleurs résultats sont obtenus en agissant directement sur la teneur en azote, la teneur en glucose n'étant pas limitante. Mais Chlorelle protothecoides peut être également utilisée pour sa capacité à 10 produire des protéines. Pour la production de biomasses riches en protéines, l'homme du métier est donc amené à prendre l'opposé du contrôle métabolique permettant à la microalgue de produire naturellement des lipides de réserve, c'est-à-dire travailler les conditions de fermentation en favorisant plutôt un rapport C/N faible, et ainsi : 15 réaliser un apport important en source d'azote au milieu de fermentation, tout en maintenant constant la charge en source carbonée qui sera convertie en protéines, et stimuler la croissance de la microalgue. Il s'agit de modifier le flux carboné vers la production de protéines (et donc de 20 biomasses), au détriment de la production des lipides de réserve. Dans le cadre de l'invention, la société Demanderesse a au contraire choisi d'explorer une voie originale en proposant des solutions alternatives à celles classiquement envisagées par l'homme du métier. Le procédé de culture hétérotrophique desdites microalgues mis au point par la 25 société Demanderesse pour augmenter la teneur en protéines de la biomasse comporte alors : une phase dite de fermentation « batch » caractérisée après ensemencement du fermenteur, par l'apport en une seule fois d'une quantité de glucose comprise entre 15 et 25 g/I, de préférence de l'ordre de 20 g/I 30 une phase de fed batch exponentiel durant laquelle le glucose est apporté progressivement et la régulation de pH faite initialement par le mélange NH3/KOH est remplacée par une régulation avec NH3 seul. Comme il sera exemplifié ci-après, l'apport en NH3 induit de manière remarquablement rapide une élévation du taux de protéines synthétisées dans la cellule, 35 ce qui se traduit par une élévation du taux de N.6,25 intracellulaire à une valeur dépassant les 60 `Vo.

3031985 9 Une analyse complète des acides aminés présents dans la biomasse a été ensuite réalisée sur un échantillon prélevé juste avant le changement de régulation de pH, et sur plusieurs autres échantillons prélevés après ledit changement. Il est observé que, avant le changement, la somme des acides aminés est faible 5 (de l'ordre de 15 à 25 %) et qu'il n'y a pas de prédominance parmi les différents acides aminés. Après le changement de régulation, on note que : la somme des acides aminés dépasse les 40 %, au total, la teneur en acide glutamique et arginine sur acides aminés totaux est 10 de plus de 45 °A, l'acide aminé qui connait l'augmentation la plus forte est l'acide glutamique, suivi de l'arginine. Le taux des autres aminés augmente également, mais de manière beaucoup plus faible. L'augmentation du N.6,25 est donc directement corrélé avec l'augmentation de la 15 synthèse d'acide glutamique et d'arginine. Par ailleurs, ce mode de régulation du pH permet : de limiter l'apport en sels du milieu de fermentation, et d'influer sur la couleur de la biomasse, qui sera d'autant plus jaune que la teneur en NH3 aura été limitée initialement.

20 En conclusion, la biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorelle, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorelle protothecoides présente : une concentration de 80 à 90 g/I, une teneur en N.6,25 de plus de 60 %, 25 une quantité de sels inférieure à 6 g/I dans son surnageant de culture, une coloration faible, et une teneur en acide aminé et glutamine de plus de 45 % en poids sur acides aminés totaux. Cette biomasse est particulièrement bien adaptée à la préparation de l'isolat 30 peptique selon l'invention, par la mise en oeuvre du procédé suivant : de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels, perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150C, pendant une durée 35 comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute, 3031985 o élimination de la biomasse ainsi perméabilisée par une technique de séparation solide-liquide, de préférence choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale ou tangentielle, la floculation et la centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, pour obtenir une fraction 5 soluble, de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, purification de la fraction soluble par précipitation, afin d'obtenir un isolat 10 peptidique, et évaporation, pasteurisation et atomisation dudit isolat peptidique. Après fermentation dans les conditions énoncées ci-dessus, la biomasse est collectée par séparation solide-liquide, par filtration frontale ou tangentielle ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.

15 De manière optionnelle, la société Demanderesse recommande de laver la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels par une succession de concentration (par centrifugation) / dilution de la biomasse. Au sens de l'invention, on entend par « composés solubles interstitiels » tous les contaminants organiques solubles du milieu de fermentation, par exemple les composés 20 hydrosolubles tels les sels solubles, le glucose résiduel, les oligosaccharides de degré de polymérisation (ou DP) 2 ou 3 ou les peptides. Cette biomasse ainsi purifiée de ses composés solubles interstitiels est ensuite ajustée préférentiellement à une matière sèche comprise entre 15 et 30 % en poids, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %.

25 On réalise alors le traitement thermique à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150°C, perlant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute. De préférence, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 140°C, pendant une durée d'environ 10 secondes. Dans une autre 30 alternative préférée, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C, pendant une durée d'environ 1 minute. Ce traitement permet de laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel. Enfin, au terme de ces étapes, la biomasse est refroidie à une température 35 inférieure à 40°C, de préférence réfrigérée à une température de l'ordre de 4°C. Sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse considère que le traitement thermique, réalisé dans ces conditions opératoires, pourrait agir ainsi 3031985 11 comme un procédé de fragilisation membranaire qui autorise le relargage spontané des composants solubles du compartiment intracellulaire, voire de la matrice extracellulaire. En plus des substances ioniques, des substances organiques tels que les hydrates de carbone (majoritairement DP1 et DP2), les peptides et les polypeptides sont drainés 5 hors de la cellule. Au contraire, les lipides et composés organiques hydrophobes restent dans les cellules, ce qui démontre bien que les cellules sont perméabilisées et non lysées ou détruites. Le procédé selon l'invention ne conduit donc pas à la formation d'une émulsion, 10 mais bien à une suspension aqueuse. Le relargage de toutes ces substances solubles à travers la membrane perméabilisée s'apparente à un procédé de diffusion libre de type dialyse. Par voie de conséquence, un temps de latence peut être nécessaire pour permettre une diffusion suffisante après le traitement thermique qui perméabilise la 15 membrane. Dans la littérature, le procédé de perméabilisation par champ pulsé des membranes de levures pour en extraire les protéines demande de 4 h à 6 h (Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84). Selon l'invention, un temps de réaction beaucoup plus court est mis en oeuvre, 20 compris entre 5 secondes et 5 minutes. L'élévation du barème (temps /température) conduit alors à une augmentation du taux de solubilisation et du rendement d'extraction des solubles. Le procédé de l'invention exploite avantageusement le phénomène de perméabilisation thermique pour extraire la fraction peptidique ainsi solubilisée de la 25 biomasse résiduelle. Ainsi, la biomasse résiduelle est ensuite éliminée par une technique de séparation solide-liquide par filtration frontale ou tangentielle, par floculation, par centrifugation, ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier, ce qui permet de récupérer aisément la fraction soluble débarrassée des cellules de microalgues.

30 Le rendement et la qualité de cette étape de séparation peut être amélioré en procédant à une dilution des cellules perméabilisées (par exemple par dilution/centrifugation multiétagée). Si nécessaire, la fraction soluble ainsi obtenue peut être clarifiée par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels et selon sa matière sèche, une 35 concentration par évaporation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier peut être réalisée avant la purification qui s'en suit.

3031985 12 La fraction soluble résultante est finalement composée essentiellement de protéines (50 - 80 % p/p) et d'hydrates de carbone (10 - 25 % p/p). Les procédés classiques de récupération des protéines solubles reposent généralement sur une étape de précipitation desdites protéines par l'acide trichloracétique 5 (10 % poids/volume) ou au sulfate d'ammonium. Cependant, ces isolements par précipitation font suite à des procédés de cassage cellulaire très destructeurs (le plus souvent par sonication ou homogénéisation) qui, s'ils permettent en effet d'augmenter les rendements d'extraction, conduisent surtout à des protéines de faible solubilité et dénaturées.

10 Leur refonctionnalisation ne peut alors être envisagée que par le biais de leur produit d'hydrolyse (en peptides) par des moyens chimiques (lyse à la soude), physiques (traitement à haute température) ou enzymatiques (enzymes protéolytiques). Le procédé de l'invention conduit ensuite à l'isolement des protéines d'intérêt, par précipitation en modulant les propriétés du milieu.

15 La société Demanderesse recommande ainsi de procéder comme suit : favoriser la précipitation de tout ou partie de la fraction protéique en modulant les propriétés physico-chimiques du milieu. Le refroidissement des solubles bruts, obtenus comme décrit dans les étapes précédentes, enclenche un phénomène de précipitation d'une partie des 20 peptides solubles. Il est observé que la précipitation est plutôt sélective sur les plus hauts poids moléculaires. La température de refroidissement est inférieure à 10°C, de préférence, inférieure à 4°C. Certaines conditions opératoires permettent de favoriser ce phénomène : outre la température, le pH doit être situé entre 2,5 et 6,5 et de préférence être 25 proche du pHi, soit entre 3 et 5. De la même manière la force ionique du milieu peut être adaptée pour favoriser la précipitation. Ainsi, en diminuant fortement la force ionique, on peut atténuer le phénomène de prise en sels (terme anglais de « Salting-in ») et ainsi diminuer la solubilité des protéines (par diminution de la couche de 30 solvatation). Ainsi, une opération de déminéralisation préalable à la précipitation peut être ajoutée. Celle-ci est réalisée sur résines cationiques et anioniques, dialyse, filtration ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. Inversement, en augmentant fortement la force ionique, l'eau disponible 35 diminue par le phénomène de relargage (terme anglais de « Salting out »), de cette manière les protéines ont tendance à précipiter. Ce mode n'est pas 3031985 13 préféré puisqu'une déminéralisation prononcée serait ensuite nécessaire sur l'isolât protéique ainsi extrait. Dans la même optique de modulation de la couche de solvatation, la polarité du milieu peut être diminuée (avec déshydratation du milieu) par ajout d'un 5 solvant de type éthanol qui permettra de générer une précipitation plus quantitative de la fraction protéique en diminuant fortement sa solubilité. en récupérant la fraction précipitée qui est ensuite éventuellement concentrée avant séchage. La séparation de la fraction précipitée est réalisée par simple décantation et 10 récupération de la phase lourde ou éventuellement par centrifugation dans les conditions de température optimales. Le pH peut éventuellement être réajusté avant séchage. Le séchage est effectuée par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.

15 Préalablement au séchage, l'incorporation d'une étape de concentration par évaporation peut permettre d'optimiser énergétiquement l'opération. Elle peut être notamment justifiée si un solvant du type éthanol est utilisé pour permettre son recyclage. L'exploitation de ces voies permet de purifier une fraction à haute teneur en 20 peptides et polypeptides des sels et sucres résiduels. On obtient alors un isolat de protéines solubles supérieur à 90 % en poids, riches en arginine et acide glutamique. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se 25 veulent illustratifs et non limitatifs. Exemples Exemple 1 : Préparation d'une biomasse de C. protothecoides riche en 30 protéines à haute teneur en acide glutamique et arginine La souche utilisée est une Chlorella protothecoides (souche CCAP211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK). Préculture : 35 - 150 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ; - Composition du milieu : 40 g/L de glucose + 10 g/L d'extrait de levure. L'incubation se déroule dans les conditions suivantes : - durée : 72 h ; 3031985 14 - température : 28°C ; - agitation : 110 rpm (Incubateur Infors Multitron). Culture en mode batch puis fed batch Préparation et milieu batch initial 5 préparer et filtrer un mélange KOH à 400 g/I (41 %) / NH3 à 20 % v/v (59 %) ; stériliser fermenteur 20 L à 121 °C/ 20 min ; inoculer avec 2 erlenmeyers de préculture de 500 ml (D0600 nm de 15) ; mise au pH de 4,5 avec NH3 20% v/v ; agitation de 300 rpm départ ; 10 aération : 20 L/min d'air ; régulation p02 à 30 (3/0 ; Alimentation glucose : 500 g/I sulfate d'ammonium : 5 g/I 15 phosphate de diammonium : 20 g/I acide phosphorique : 16 g/I sulfate de magnésium heptahydrate : 12 g/I sulfate de fer : 170 mg/I calcium nitrate : 610 mg/I 20 solution d'oligoéléments : 45 m1/1 solution de vitamines : 4,5 m1/1 Il est important de noter que la charge en sels d'ammonium, sels de magnésium et acide phosphorique a été élaborée de manière à limiter la teneur en sels du milieu de fermentation et a été optimisée de manière à maintenir la teneur en N.6,25 de la biomasse 25 finale décolorée. Solution d'oligoéléments Ingrédients (g/1) CuSO4 0,22 ZnSO4 7 MnSO4 4 Acide citrique 30 Solution de vitamines Ingrédients (g/1) Thiamine HCI 13,4 Biotine 0,2 B12 0,16 3031985 15 Calcium panthothenate 0,4 Acide p-aminobenzoïque 0,8 Conduite de la fermentation - apporter l'équivalent de 20 g/I avant inoculation - quand la concentration en glucose est = 0 g/I, démarrer l'alimentation en profil 5 exponentiel (i = 0,07 h-1) ; régulation du pH à 5,2 avec le mélange 41 % KOH / 59 % NH3 quand 2 kg de glucose sont consommés par la microalgue, on passe en régulation du pH par NH3 seul Résultats : 10 Cette conduite de fermentation permet d'obtenir une biomasse présentant plus de 65 % de protéines exprimées en N.6,25. Exemple 2 : Procédé de perméabilisation thermique de la biomasse enrichie en protéines et récupération de solubles « bruts » 15 La biomasse obtenue selon l'exemple 1 est récoltée à une matière sèche cellulaire de 105g/L avec une pureté de 80% (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale). Elle est alors : 20 - lavée et concentrée par dilution en ligne [1 :1] (V',Vmoût), - centrifugée sur centrifugeuse à assiette Alfa Laval FEUX 510 et amenée à une matière sèche de 220 g/I et à une pureté de 93 % (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale). Le pH est ajusté à 7 à la potasse et la biomasse est traitée thermiquement par 25 UHT avec préchauffage à 70°C puis injection vapeurdirect sur un barème d'une dizaine de secondes à 140°C et refroidissement à 40°C par flat au vide. Le traitement thermique est poussé à un barème élevé afin de maximiser la solubilisation partielle de la biomasse qui voit sa pureté diminuer à 53%. Par définition, le relargage de solubles dans le milieu extracellulaire entraine une 30 diminution de la fraction de matière sèche cellulaire par rapport à la matière sèche totale. A ce stade, la composition de la biomasse est la suivante : Acides aminés totaux : 48,4 (3/0 Sucres totaux : 27,2 Acides gras totaux : 15,1 (3/0 35 Cendres : 2,5 (3/0 Autres résidus : 6,8 %.

3031985 16 La séparation des solubles issus du relargage par perméabilisation thermique de biomasse est effectuée par séparation centrifuge. Afin d'optimiser le rendement et la qualité de la séparation, une légère dilution 5 [0,5 :1] (V''V'oût) est effectuée en ligne sur le deuxième étage (sur une configuration à deux centrifugeuses Alfa Laval FEUX 510 en série) avec recyclage du surnageant du deuxième étage vers le premier. Le surnageant du premier étage est ainsi récupéré et concentre les solubles clarifiés.

10 Ces solubles « brut » ont la composition suivante : Acides aminés totaux : 77,3 (3/0 Sucres totaux : 17,6 % Cendres : 4,3 (3/0 Autres résidus : 0,8 %.

15 Exemple 3 : Purification et obtention de l'isolat protéique Afin de précipiter sélectivement la fraction protéique, 5kg de solubles brut à une matière sèche de 11,4% sont placés dans un réacteur double enveloppe sous agitation.

20 Le pH des solubles bruts est ajusté à 4,5 à l'acide phosphorique. Après arrêt de l'agitation, la température est abaissée à 4°C. Ces conditions sont maintenues pendant 8h. Ainsi s'opère la décantation de la phase lourde enrichie en peptides de plus haut poids moléculaire.

25 La phase lourde est alors extraite par simple séparation de phase en ampoule à décanter avec un rendement massique de 26% et présente une matière sèche de 36,3%. Cet extrait est lyophilisé à une matière sèche de 97%. La composition de cet isolat est la suivante : acides aminés totaux : 95 ,9 (3/0 30 sucres totaux : 2,44 cendres : 1,66 (3/0 L'analyse de la répartition en acides aminés dans les acides aminés totaux est la suivante : acide glutamique : 49,78 (3/0 35 arginine : 47,21 autres acides aminés : 3,01 (3/0 3031985 17 L'isolat est caractérisé par une richesse de l'ordre de 95% en acides aminés essentiellement constitué d'arginine et d'acide glutamique (sur la base de l'analyse de répartition des acides aminés totaux). Le poids moléculaire de cette fraction est essentiellement compris entre 1 kDa et 5 20kDa.

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Isolat peptidique isolé à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines, caractérisé en ce qu'il présente : des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa, une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique.
2. 2. Isolat selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microalgues sont des microalgues du genre Chlorelle, plus particulièrement Chlorelle protothecoides.
3. 3. Isolat selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est de plus de 80, 85, 90 ou 95 % en poids exprimée par rapport aux acides aminés totaux.
4. 4. Isolat selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est d'au moins 40% d'arginine, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 % ; et d'au moins 40% d'acide glutamique, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 (3/0 exprimée sur acides aminés totaux.
5. 5. Isolat selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est : comprise entre 47 et 48 % pour l'arginine comprise entre 49 à 50 % pour l'acide glutamique exprimée sur acides aminés totaux.
6. 6. Isolat selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines préparée par un procédé fermentaire qui comporte : une phase dite de fermentation « batch » caractérisée après ensemencement du fermenteur, par l'apport en une seule fois d'une quantité de glucose comprise entre 15 et 25 g/I, de préférence de l'ordre de 20 g/I une phase de fed batch exponentiel durant laquelle le glucose est apporté progressivement et la régulation de pH faite initialement par le mélange NH3/KOH est remplacée par une régulation avec NH3 seul. 3031985 19
7. 7. Isolat selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines par un procédé qui comporte : 5 de manière optionnelle, le lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels, la perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence environ 80 et 150C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence 10 pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute, l'élimination de la biomasse ainsi perméabilisée par une technique de séparation solide-liquide de préférence choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale ou tangentielle, la floculation et la centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, pour obtenir une fraction 15 soluble, de manière optionnelle, la récupération et la clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, purification de la fraction soluble par précipitation, afin d'obtenir un isolat 20 peptidique, et l'évaporation, la pasteurisation et l'atomisation dudit isolat protéique. 25