WO2021241668A1 - 均一なサイズの細胞凝集体の大量製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、実質的に均一なサイズの細胞凝集体を簡便かつ大量に製造することが可能な新たな手段を提供することを目的とするものであり、細胞培養バッグを用いた細胞凝集体の製造方法であって、細胞培養バッグが複数の凹部を備える下面を有し、（１）細胞培養バッグに細胞と培地を加えて撹拌し、細胞培養バッグに圧力を印加しながら培養する工程、（２）培養終了後、形成された細胞凝集体を回収する工程、を含む方法を提供する。

Description

均一なサイズの細胞凝集体の大量製造方法

　本発明は、実質的に均一なサイズの細胞凝集体を簡便かつ大量に製造するための方法に関する。

［発明の背景］
　近年、遺伝子治療や再生医療等の分野において、目的とする細胞を人工的な環境下で大量に培養することが行われている。例えば、１又は複数個の凹部が形成されたプレート（一般的に「ウェルプレート」と称される）を用いて、細胞と培養培地とを個々の凹部内に導入し培養を行う手法がある。しかしながら、この手法では凹部が大気解放されているため異物が混入するリスクがあり、また凹部毎に細胞や培養培地を注入及び回収しなければならず作業が煩雑であり、大規模に大量培養することは作業者にとって大きな負担となっていた。

　これに対し、下面に複数の凹部が形成されたガス透過性の袋状容器（「バッグ」とも称される）を用いて閉鎖的に大量培養を行う手法が開発され報告されている（例えば、後述の特許文献３等）。この手法によれば、前述のウェルプレートを用いた場合と比べて密閉性が改善されており異物の混入リスクを低減できるというメリットがある。
一方で、このようなバッグを用いた閉鎖的培養においては各凹部内に入る細胞の数や位置等を調整することができないために、凹部間で形成される培養物（より詳細には、細胞凝集体）のサイズや数等にばらつきを生じる場合があった。このため培養中に凹部間の移動を制限した上で、各凹部内の細胞を剥離して適切な位置に細胞を配置する等の煩雑な作業を要し、大規模に大量培養することは作業者にとって大きな負担となっていた。
　このため当該分野においては、実質的に均一な細胞培養物を簡便かつ大量に製造することが可能な閉鎖的培養方法が切望されていた。

　従来、ガス透過性の袋状容器を用いた閉鎖的培養方法としては以下の手法が開発・報告されている。
　特許文献１には、細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に接着性細胞及び培養培地を加え、当該袋状容器を押圧して内圧を上昇させることで内容物の流動を抑制し、細胞が細胞培養面に接着することを促す、又は接着した細胞が剥離することを抑制することを含む、接着性細胞の培養方法が開示される。

　特許文献２には、細胞と培養培地を加えた可撓性培養容器を載置面に載置し、当該可撓性培養容器に対し圧力を印加することによって載置面と接する可撓性培養容器の外面を変形させ複数の凹部を形成させた状態で培養を継続し、凹部内で細胞凝集塊が形成された後に、可撓性培養容器に対する圧力を開放することによって容器外面に形成された凹部を平坦化しさらに培養することを含む細胞培養方法が開示される。特許文献２には、培養中に凹部を維持したままでは、培地の循環やガスの拡散に不都合が生じる虞があることから、培養中に印加した圧力を開放して凹部を平坦化することが記載されており、また、凹部を平坦化することによって細胞培養に使用される領域（面積）を拡大できることが述べられている。

　特許文献３には、下面に複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用した細胞凝集塊（スフェロイド）の培養方法が開示されており、当該方法においては、各凹部に一つのスフェロイドを形成させるために、及び細胞の増殖・分化誘導効率を向上させるために、凹部内面に接着したスフェロイドを剥離する作業を要し、その剥離工程の際に、スフェロイドの凹部間の移動を防止するために前記複数の凹部を閉塞することが記載されている。

特開２０１６－８６７７４号公報 ＷＯ２０１６／２０８５２６ 特開２０１９－１１８３１９号公報

　上記従来技術はいずれも、実質的に均一なサイズの細胞凝集体を簡便かつ大量に製造することについて何ら開示・示唆するものではない。

　そこで本発明は、実質的に均一なサイズの細胞凝集体を簡便かつ大量に製造することが可能な新たな手段を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞と培養培地を下面に複数の凹部を備えたガス透過性の可撓性細胞培養バッグに加えて、当該細胞培養バッグに圧力を印加しながら培養することによって、各凹部内において実質的に均一なサイズの細胞凝集体が形成されることを見出した。また、培養終了後、形成された大量の細胞凝集体を各凹部より簡便な操作により取り出すことが可能であり、細胞培養バッグより簡便に回収できることを見出した。本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。

［１］　細胞培養バッグを用いた細胞凝集体の製造方法であって、
細胞培養バッグが上面と下面とを有し、下面に複数の凹部を備えており、
（１）細胞培養バッグに細胞と培地を加えて撹拌し、細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程、
（２）培養終了後、形成された細胞凝集体を回収する工程、
を含む方法。
［２］　１０万個～１００万個の細胞凝集体を回収する、［１］の方法。
［３］　回収された細胞凝集体が実質的に均一な粒子径を有する、［１］又は［２］の方法。
［４］　回収された細胞凝集体の７０％以上が、細胞凝集体の粒子径の中央値から±１０％以内の粒子径を有する、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　回収された細胞凝集体の７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］　回収された細胞凝集体の一つにつき、２００個～２０００個の細胞が含まれる、［１］～［５］のいずれかの方法。
［７］　細胞が凍結融解された細胞である、［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］　細胞がインスリン分泌細胞である、［１］～［７］のいずれかの方法。
［８ａ］　インスリン分泌細胞がインスリン産生細胞である、［８］の方法。
［９］　細胞培養バッグを上下反転させ細胞凝集体を回収する、［１］～［８］のいずれかの方法。
［１０］　細胞培養バッグにエアーを注入して細胞凝集体を回収する、［１］～［９］のいずれかの方法。

［１１］　細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程が、細胞培養バッグの上方、下方または上下両方から圧力を印加しながら培養する工程である、［１］～［１０］のいずれかの方法。
［１２］　細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程が、細胞培養バッグの上方から圧力を印加しながら培養する工程である、［１１］の方法。
［１３］　凹部の深さ：直径の比が１：１．５～２．５である、［１］～［１２］のいずれかの方法。
［１４］　凹部が球冠状である、［１］～［１３］のいずれかの方法。
［１５］　凹部のピッチが０．３５ｍｍ～０．４９ｍｍである、［１］～［１４］のいずれかの方法。
［１６］　凹部の深さが１５０μｍ～２２０μｍである、［１］～［１５］のいずれかの方法。
［１７］　細胞培養バッグにおける液深が１．５ｍｍ～６ｍｍである、［１］～［１６］のいずれかの方法。
［１８］　細胞培養バッグに細胞を１×１０⁵～１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬの量で加える、［１］～［１７］のいずれかの方法。
［１９］　細胞培養バッグに細胞を１×１０⁴～５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の量で加える、［１］～［１８］のいずれかの方法。
［２０］　細胞凝集体形成後に培地を追加する、［１］～［１９］のいずれかの方法。

［２１］　下面が１０万個～１００万個の凹部を備える、［１］～［２０］のいずれかの方法。
［２２］　凹部を下面単位面積当たり１～１０００個／ｃｍ²備える、［１］～［２１］のいずれかの方法。
［２３］　移植用の細胞凝集体集団であって、その７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、細胞凝集体集団。
［２４］　１０万個～１００万個の細胞凝集体を含む、［２３］の細胞凝集体集団。
［２５］　インスリン分泌細胞を含む、［２３］又は［２４］の細胞凝集体集団。
［２５ａ］　インスリン分泌細胞がインスリン産生細胞である、［２５］の細胞凝集体集団。
［２６］　実質的に均一な粒子径を有する１０万個～１００万個の細胞凝集体を含む、細胞培養バッグ。
［２７］　細胞凝集体の７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、［２６］の細胞培養バッグ。
［２８］　細胞凝集体がインスリン分泌細胞を含む、［２６］又は［２７］の細胞培養バッグ。
［２８ａ］　インスリン分泌細胞がインスリン産生細胞である、［２８］の細胞培養バッグ。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２０年５月２８日に出願された日本国特許出願２０２０－９３４４７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。

　本発明によれば、実質的に均一なサイズの細胞凝集体を簡便かつ大量に製造することが可能な新たな手段を提供することができる。

図１は本発明において利用可能な細胞培養バッグの一例を示す模式図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は透視斜視図である。 図２は本発明において利用可能な細胞培養バッグの別の一例を示す模式図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は透視斜視図である。 図３（１）は本発明において利用可能な細胞培養バッグを載置するための載置台の一例を示す斜視図であり、図３（２）は細胞培養バッグを当該載置台に載置して押圧部材と挟んで圧力を印加することにより細胞培養バッグの下面に凹部が形成されること示す模式図である。 図４は本発明において利用可能な培養装置の断面模式図であり、（ａ）は細胞培養バッグの凹部を受け入れる開口部が形成された載置面を備える例を示し、（ｂ）は載置面が平面である例を示す。 図５は本発明において利用可能な培養装置の別の一例を示す斜視図である。 図６は本発明方法により製造された細胞凝集体の写真図である。 図７は回収されたインスリン産生細胞より製造された細胞凝集体の直径分布を示すグラフ図である。 図８は回収されたヒトｉＰＳ細胞より製造された細胞凝集体の直径分布を示すグラフ図であり、（Ａ）培養中に圧力を印加せず製造したもの（対照）、（Ｂ）培養中に圧力を印加して製造したものを示す。

１．細胞培養バッグ
　本発明において「細胞培養バッグ」とは、ガス透過性の可撓性フィルム材料を用いて袋状に形成された培養容器を意味する。細胞培養バッグは凹部を備える下面を少なくとも備える形状を有し、さらに下面に対向する上面を備える形状を有することが好ましい。

　「ガス透過性」とは、可撓性フィルム材料を通して気体を通過させる性質を意味し、本発明における細胞培養バッグにおいては、ＪＩＳ　Ｋ　７１２６のガス透過度試験方法において試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ²・ｄａｙ／ａｔｍ）以上であることが好ましい。

　細胞培養バッグに利用可能な可撓性フィルム材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）等の樹脂フィルムが挙げられるが、これらに限定はされない。これらは単層フィルムの形態で用いても、同種又は異種の材料を積層して多層（例えば、二層又は三層）フィルムの形態で用いてもよい。２枚のフィルムを重ねヒートシールして細胞培養バッグを形成する場合には、熱融着性を考慮してシーラント層として機能する層を有していることが好ましい。たとえば、可撓性フィルム材料は、細胞培養バッグ内側より内層、基層、外層の３層からなる構成を有することができる。基層及び内層は、高ガス透過性、ヒートシール性、及び透明性を備えた材料を用いて構成されることが好ましい。また、内層は上記特性に加え、低細胞毒性を備える材料で構成されることが好ましい。このような材料としては、例えば直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ，Ｌｉｎｅａｒ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）や、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ，Ｖｅｒｙ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ／ＵＬＤＰＥ，Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ，Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、あるいはこれらのブレンドなどのポリエチレン系樹脂を好適に用いることができる。外層は密度０．８８６ｇ／ｃｍ³～０．９３ｇ／ｃｍ³のポリエチレン系樹脂が好適である。なお、外層は適宜省略してもよい。また、細胞培養バッグの内面となる表面（少なくとも下面表面）は、凹部の底部中央に細胞が集まりやすくするために、細胞の低接着処理を施すことが好ましい。細胞の低接着処理としては、例えば、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、界面活性剤、アルブミン等によるコーティングが挙げられる。フィルムの厚みは５０～３００μｍ、好ましくは８０～１６０μｍ程度とすることができ、細胞培養バッグの上面と下面で同じ厚みであってもよいし、異なる厚みであってもよい。

　細胞培養バッグの下面に備える凹部の数は、細胞培養バッグのサイズや所望する細胞凝集体の数に応じて決定することが可能であり、例えば１０個～１００万個、１００個～１００万個、１０００個～１００万個、又は１万個～１００万個の範囲、好ましく１０万個～１００万個、又は３０万個～１００万個の範囲より適宜選択することができる。

　凹部の形状は特に限定されないが、凹部の底部に細胞が集まりやすい形状が好ましい。例えば、凹部の形状としては、球冠状、擂り鉢状（円錐状）に窪んだ形状等が挙げられる。また、凹部の底部に細胞が集まり易くするには、凹部の深さ：直径の比が１：１～４とするのが好ましく、より好ましくは１：１．５～２．５とするのが好ましく、さらに好ましくは１：１．８～２．２である。例えば、一実施形態において、凹部は深さを１００μｍ～１０００μｍ、例えば、１５０μｍ～２２０μｍ、開口径（直径）を３００μｍ～１５００μｍ、例えば、２２５μｍ～５５０μｍとすることができる。

　凹部の配列は、千鳥状として、下面に占める凹部の占有面積ができるだけ大きくなるようにするのが好ましいが、必要に応じて格子状に配列してもよい。隣り合う凹部４の中心間隔（ピッチ）は０．３５ｍｍ～０．４９ｍｍ、好ましくは０．３８ｍｍ～０．４５ｍｍとすることができる。あるいは、隣り合う凹部の輪郭間を０よりも大きく～１ｍｍ、好ましくは０．０５～０．１ｍｍとなるよう設定することができる。下面単位面積当たり、凹部を１～１０００個／ｃｍ²、例えば、３０～８００個／ｃｍ²、又は６０～７００個／ｃｍ²設けることができる。

　細胞培養バッグの大きさは特に限定されないが、例えば、縦１０～１０００ｍｍ、例えば、縦５０～５００ｍｍ、横１０～１０００ｍｍ、例えば、横５０～５００ｍｍとすることができる。細胞培養バッグの厚みは特に限定されないが、培養培地を加えた細胞培養バッグに圧力を印加した際の液深（培養液と接触する下面フィルム平坦面（凹部を除く部位）の内表面から上面フィルム内表面までの距離）が１ｍｍ～２０ｍｍ、好ましくは２ｍｍ～８ｍｍ程度となることを可能にする厚みがあればよい。

　細胞培養バッグには、培地や細胞等が流通可能な管状の部材（以下、本部材を「ポート」と呼ぶ場合がある）を備えることができる。ポートは、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリエチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）等の熱可塑性樹脂で成形することができる。

　本発明における「細胞培養バッグ」の形態は、従来公知のガス透過性の可撓性フィルム材料を用いて形成された袋状培養容器（特許第５３４４０９４号公報、ＷＯ２０１６／２０８５２６号公報、特開２０１６－８６７７４号公報、特開２０１９－１１８３１９号公報等）の形態を参照することができる。

　図１に本発明における細胞培養バッグの一例を示す。細胞培養バッグ１は、上面を構成する上面フィルム２１と下面を構成する下面フィルム２２を重ねて周辺部２０をシールすることにより形成されたバッグ本体２と、ポート３を備える袋状の構成を有し、下面フィルム２２には千鳥状に配列された複数の凹部４が熱圧成形等の成形技術により形成され保持される。上面を構成する上面フィルム２１は、複数の凹部４全体の上方を覆う実質的に平坦な天面部分２１ａと、天面部分２１ａの周囲に傾斜部分２１ｂを有する膨出形状とすることにより、下面フィルム２２とシールして厚みを有する細胞培養バッグ形成することができ、当該バッグを培地で満たした際、あるいは当該バッグに圧力を印加した際に、下面フィルム２２の周囲が持ち上がる変形を抑制することができる。

　図２に、本発明における細胞培養バッグの別の一例を示す。細胞培養バッグ１’において凹部は下面フィルム２２’に直接形成されず、細胞培養バッグ１’を載置台に載置した後に、下面フィルム２２’と接する載置台の載置面の形状に倣って形成される。

　細胞培養バッグ１’の載置台は、細胞培養バッグを載置するための平坦な載置面と、細胞培養バッグの下面に凹部を形成するための窪みとを有する板状部材である。載置台は金属や硬質樹脂等から形成することができ、載置面の窪みは、押し付けられた細胞培養バッグの下面が上述の凹部を形成することが可能な形状であればよく、対応した凹部及び／又は凸部を載置面に設けて窪みを形成してもよいし、あるいは、載置面に適宜配置した貫通孔を窪みとして利用することもできる。

　図３（１）に細胞培養バッグ１’に凹部を形成する載置台５’の一例を示す。載置台５’は細胞培養バッグ１’を載置するための平坦な載置面５ａ’と、細胞培養バッグ１’の下面に凹部を形成するための窪み５ｂ’を貫通孔の形態で備える。図３（２）に示すとおり、細胞と所定の培養液とが充填された細胞培養バッグ１’を載置台５’に載置した後、後述する押圧部材６と載置台５’とで当該細胞培養バッグ１’を挟んで圧力を印加することによって、下面フィルム２２’は載置面５ａに押し付けられ、窪み５ｂ’の部分から一部が突出することによって凹部４’が形成される。

２．培養装置
　本発明においては、細胞と所定の培養培地とが充填された細胞培養バッグに圧力を印加することが可能な構成を有する培養装置を利用することができる。培養装置は少なくとも、細胞培養バッグを載置する載置台と細胞培養バッグの上面を押さえる押圧部材、ならびに、それらの一又は両方の上下運動を支持する支持機構及びそれらの一又は両方を細胞培養バッグに向けて押し付ける圧力印加手段と、細胞培養バッグのポートを介して細胞や培地の注入、排出を行う送液手段とを備える。押圧部材の自重により、細胞培養バッグに圧力を印加する場合には、圧力印加手段は省略してもよい。送液手段としては、ペリスタポンプ等のポンプやシリンジ等が挙げられるがこれらに限定はされない。培養装置は、持ち運びできインキュベータ内に移動させて利用するものであってもよいし、あるいはインキュベータ内に設置されていてもよい。

　本発明において「圧力を印加」するとは、細胞と所定の培養培地とが充填された細胞培養バッグにおける液深を均一にすることを意味する。圧力を印加していない、細胞と所定の培養培地とが充填された細胞培養バッグにおいては、可撓性の上面フィルム及び／又は下面フィルムに形成された「ヨレ」、「シワ」「折曲がり」、「たわみ」等により、液深が比較的高い部分と比較的低い部分とが混在し、液深は均一ではない。「圧力を印加」することによって、この上面フィルム及び／又は下面フィルムに形成された「ヨレ」、「シワ」「折曲がり」、「たわみ」等を伸ばすことができ、当該細胞培養バッグにおける液深を均一にすることができる。「圧力を印加」する工程は、細胞と所定の培養培地とが充填された細胞培養バッグを載置台の上面（載置面）と押圧部材の下面とで挟むことにより行うことができる。すなわち、押圧部材を支持機構と圧力印加手段とを利用して細胞培養バッグに向かって押し下げ細胞培養バッグの上方から圧力を印加することにより、及び／又は、載置台を支持機構と圧力印加手段とを利用して細胞培養バッグに向かって押し上げ細胞培養バッグの下方から圧力を印加することにより行うことができる。あるいは、圧力印加を省略し、押圧部材の自重により、細胞培養バッグに圧力を印加してもよい。これらの手段により、少なくとも押圧部材の下面に接する領域の上面フィルム及び／又は下面フィルムに形成された「ヨレ」、「シワ」「折曲がり」、「たわみ」等を伸ばすことができ、細胞培養バッグにおける液深を均一にすることができる。

　図４に、本発明において利用可能な培養装置の一例の断面模式図を示す。図４の培養装置１００、１００’’は、載置台５に載置した細胞培養バッグ１に押圧部材６を上から押し下げて圧力を印加する構成を有する。

　培養装置１００、１００’’は、細胞培養バッグ１が載置される載置台５と、上面フィルム２１の天面部分２１ａを押圧する底面６ａを有する押圧部材６と、押圧部材６を支持する支持機構７とを備える。

　なお、図４では、細胞培養バッグ１のポート３から細胞や培地の注入、排出を行う送液手段の図示を省略する。

　載置台５は、細胞培養バッグ１が水平に載置される載置面５ａを有する。この載置面５ａは平面であってよいし（図４（ｂ））、細胞培養バッグ１の下面フィルム２２に形成された複数の凹部４を受け入れる開口部５ｂが形成されていてもよい（図４（ａ））。開口部５ｂがある場合、載置面５ａが下面フィルム２２を凹部４に非接触で支持するので、凹部４の潰れ、変形が回避されて凹部４内の細胞の流出が防止され、さらに、下面フィルム２２からのガス透過性が高まる。開口部５ｂの形状は、開口部に限定されず、例えば、凹部であってもよいし、金網状であってもよく、また、凹部４の各々を受け入れる形状だけでなく、凹部４の潰れや変形が回避できる限り、複数の凹部４を受け入れ可能な形状であってもよい。

　押圧部材６は、細胞培養バッグ１の天面部分２１ａに合わせた平面形状を有する板状部材であり、平坦な底面６ａを有している。

　支持機構７は、載置面５上に設けたフレーム７１と、押圧部材６の上面の四隅から上方に延びてフレーム７１を上下動可能に貫通しているガイドピン７２と、押圧部材６を下方へ押し下げる圧力印加手段７３とから構成されている。圧力印加手段７３は、押圧部材６を細胞培養バッグ１に向けて押し下げ、細胞培養バッグ１に圧力を印加する。印加する圧力の調整は、圧力印加手段７３が押圧部材６を押し下げる力や押し下げる高さを調節することにより行うことができる。圧力印加手段７３は、所定の力でもしくは所定の高さまで押圧部材６を押し下げることを可能とする構成であればよく、ネジ、バネ、磁石又はそれらの組み合わせからなる構成を有することができる。

　図５に、本発明において利用可能な培養装置の別の一例の斜視図を示す。図５の培養装置１００’は、載置面５ａを備える載置台５と、この載置台５とヒンジ９’を介して接続された上蓋８’を備え、上蓋８’はヒンジ９’を軸に開閉できるように構成されている。上蓋８’は細胞培養バッグ１の天面部分２１ａに合わせた平坦な底面６ａを有する押圧部材６と、押圧部材６の上面の四隅から上方に延びて上蓋８’を上下動可能に貫通しているガイドピン（不図示）と、押圧部材６を細胞培養バッグ１に向けて押し下げる圧力印加手段（不図示）とから構成されている。

　細胞培養バッグ１を培養装置１００’に収容する際には、まずヒンジ９’を介して上蓋８’を開いた状態（図５の（ａ））とし、そして複数の凹部を受け入れる開口部（不図示）を有する載置面５ａに細胞培養バッグ１が載置された後は、図５の（ｂ）に示されるように、上蓋８’を閉じてロック機構１０’により維持される。細胞培養バッグ１への圧力の印加は圧力印加手段により押圧部材６を、所定の圧力が印加されるまで下方へ押し下げることにより行うことができる。

　なお、上記図４～５はいずれも、細胞培養バッグ１を使用した例を示すが、細胞培養バッグ１’を使用する場合には、載置台として載置台５’のような細胞培養バッグ１’に凹部を形成することが可能な載置面５ａ’を備える載置台を利用すればよく、それ以外はそれぞれ上述した培養装置と同様の構成を有する培養装置を用いることができる。

３．細胞
　本発明において、細胞凝集体を製造するために用いられる細胞は特に限定されるものではないが、例えば、多能性幹細胞もしくはその分化誘導細胞、神経幹細胞、肝細胞、角膜幹細胞、膵島細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。また、複数の細胞を混ぜて用いて、細胞凝集体をオルガノイドとして形成してもよい。

　本発明において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。

　また、上述の多能性幹細胞の「分化誘導細胞」とは、多能性幹細胞を分化誘導して得られた所定の表現型やマーカーの発現により特徴付けられる細胞を意味する。「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。

　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリー等）を利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法（ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等）を利用して行うことができる。例えば、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ－ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。

　本発明において利用可能な分化誘導細胞としては、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン分泌細胞が挙げられる。インスリン分泌細胞には、インスリン産生細胞、及び／又は膵β細胞が含まれる。

　「インスリン産生細胞」、「膵β細胞」とは多能性幹細胞から公知の手法（ＷＯ２００９／０１２４２８，ＷＯ２０１６／０２１７３４，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７））に準じて分化誘導された細胞である。インスリン産生細胞はインスリン及びＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）の少なくとも一つのマーカーの発現により特徴付けられる細胞である。膵β細胞はインスリン産生細胞より成熟した細胞であり、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーの発現により特徴付けられる。

　本発明において利用可能な細胞は、生体より採取された細胞であってもよいし、培養細胞であってもよく、さらにこれら細胞を凍結融解した細胞であってもよい。細胞は、解離又は分散した状態のものを使用する。

４．細胞の培養及び細胞凝集体の回収
　細胞は培養培地と細胞培養バッグに加えて撹拌し、当該バッグ内で、当該バッグに圧力を印加した状態で培養することを特徴とする。

　培養培地は、用いる細胞に対応した好適なものを適宜選択して利用することができる。細胞及び培養培地は、ペリスタポンプ等のポンプやシリンジ等の送液手段を用いて細胞培養バッグが備えるポートより投入し、攪拌する。攪拌することで、後の工程において、細胞培養バッグ下面の各凹部に入る細胞の数をおよそ均一にすることができる。攪拌は細胞培養バッグに圧力を印加するまでのいずれかのタイミングで一又は複数回行うことができる。例えば、攪拌は細胞培養バッグを、培養装置の載置台に載置する前もしくは載置した後に、又は細胞培養バッグに培養装置にて圧力を印加する直前に行うことができる。攪拌は、人手やロボットアームによって行ってもよいし、ならびに／あるいは、振動子（バイブレータ）を使用して行うことができる。

　細胞培養バッグに加える細胞の数は、細胞培養バッグのサイズ、細胞培養バッグ下面の凹部のサイズや数、用いた細胞の種類、所望する細胞凝集体のサイズ等の要因に応じて適宜調整可能であり、特に限定されるものではないが、好ましくは１×１０⁵～１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは５×１０⁵～５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲、ならびに／あるいは、１×１０⁴～５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、より好ましくは１×１０⁵～２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の範囲、より選択される量とすることができる。加える細胞数がこの範囲より少なすぎても、また多すぎても細胞凝集体を均一なサイズで大量に製造することができない場合がある。

　細胞培養バッグに加える培養培地の量は、細胞培養バッグのサイズ、細胞培養バッグに加える細胞の数、培養期間、所望する細胞凝集体のサイズ等の要因に応じて適宜調整可能であり、特に限定されるものではないが、細胞培養バッグに圧力を印加した際の細胞培養バッグに加えた培養培地の液深（培養液と接触する下面フィルム平坦面（凹部を除く部位）の内表面から上面フィルム内表面までの距離）が好ましくは１ｍｍ～２０ｍｍ程度、より好ましくは２ｍｍ～８ｍｍ程度となる量とすることができる。細胞の播種時に細胞培養バッグに加えた培養培地が多いと液深が高くなり、液深さが高くなる分、細胞は沈降により多くの時間を要しその間に熱対流等により水平方向への移動を生じ、均一な濃度で沈降しない場合があり、各凹部に入る細胞の数をおよそ均一にすることができない場合がある。その場合には、細胞の播種時に加える培養培地の量を少なくし、細胞凝集体の形成後に培養培地を追加してもよい。

　細胞培養バッグへの圧力の印加は、上述の培養装置を用いて行うことができ、細胞培養バッグを載置した載置台と細胞培養バッグの天面部分に面する押圧部材とで細胞培養バッグを挟むことにより行うことができる。

　培養装置にて細胞培養バッグに加える圧力の大きさは、押圧部材に面する可撓性の上面フィルム及び／又は下面フィルムに形成された「ヨレ」、「シワ」「折曲がり」、「たわみ」等を伸ばすことができ、細胞培養バッグにおける液深を均一にすることが可能であればよく、細胞培養バッグの大きさや深さ、細胞培養バッグの材質、細胞培養バッグに加える培養培地の量等の要因に応じて適宜調節することが可能であり、特に限定されないが、好ましくは、０．００１～０．１ｋｇｆ／ｃｍ²、より好ましくは０．００２～０．０５ｋｇｆ／ｃｍ²の範囲より選択される値とすることができる。加える圧力の大きさが小さすぎると、上面フィルム及び／又は下面フィルムに形成された「ヨレ」、「シワ」「折曲がり」、「たわみ」等を伸ばすことができず、細胞培養バッグにおける液深を均一にすることができない場合があり、最終的に得られる細胞凝集体の粒子径を実質的に均一にすることができない場合がある。一方、加える圧力の大きさが大きすぎると、細胞培養バッグの破損や、細胞の生存・増殖に影響を及ぼす場合がある。

　細胞の培養は、培養装置にて細胞培養バッグへの圧力の印加を維持したまま行う。これにより液深が均一に保たれ、液深の均一性のために、凹部内に入る細胞数をおよそ均一にすることができる、及び／又は培地成分をおよそ均一にすることができる。細胞が凹部内に入ると、そこで細胞の凝集が進行し、細胞凝集体が形成される。培養の条件は用いる細胞に応じて、適切な温度（３０～４０℃、例えば３７℃）、ＣＯ₂濃度（５～１０％、例えば５％）、及び湿度（９０～９５％、例えば９５％）に調整されたインキュベータ内で行うことができる。細胞培養バッグを備える培養装置をインキュベータ内へと移動させる場合には、人手やロボットアームによって行ってもよい。培養の期間は、所望の細胞凝集体のサイズ、細胞の種類等の要因に応じて適宜決定することができ特に限定されるものではないが、例えば、１～１０日間、好ましくは２～７日間である。また、必要に応じて、培養培地の交換を行ってもよい。

　次いで、培養終了後、印加した圧力を開放した後、形成された細胞凝集体を回収する。形成された細胞凝集体の回収は、細胞凝集体を凹部より培養培地中に浮かせて取り出すことが可能な任意の手段を用いることができる。このような手段としては物理的手段を用いることができ、細胞培養バッグを上下反転させる、細胞培養バッグに振動を加える、細胞培養バッグの外側から例えば、突起状の部材を利用して凹部を突き上げる（特開２０１９－１１８３１９）、細胞培養バッグを載置面より取り上げ凹部を平坦化する（凹部が載置面の窪みにより形成されている場合）等の手段を利用することができる。これらの手段は人手やロボットアームによって行ってもよいし、ならびに／あるいは、振動子（バイブレータ）を使用して行うことができる。あるいは、細胞培養バッグのポートを介して細胞培養バッグにエアー又は培養培地もしくは生理食塩水等の適当な緩衝液を注入して生じる噴流によって、細胞凝集体を凹部より浮かせて取り出すこともできる。培養液中に浮かせた細胞凝集体は、細胞培養バッグが備えるポートより培養培地等と共に回収することができる。

５．細胞凝集体
　本発明方法によれば、実質的に均一な粒子径を有する細胞凝集体を、簡便かつ大量に製造することができる。

　製造される細胞凝集体の数は、細胞培養バッグの下面に備える凹部の数に基づいて調整することができ、特に限定されないが、好ましくは、１０万個～１００万個、又は３０万個～１００万個とすることができる。

　「実質的に均一な粒子径を有する」とは、製造された細胞凝集体の７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が、細胞凝集体の粒子径の中央値から±１０％以内、好ましくは±５％以内の粒子径を有することを意味する。細胞凝集体の粒子径及び粒子径分布の測定は、例えば、顕微鏡観察を利用した計測、動的光散乱法、レーザー回折法、遠心沈降法、ＦＦＦ法、電気的検知体法等の従来公知の手法の一又は複数を組み合わせて行うことができる。

　製造される細胞凝集体の大きさは、用いた細胞の種類や数、細胞培養バッグのサイズ、細胞培養バッグ下面の凹部のサイズや数、培養期間等の要因により変化し得るが、例えば、一実施形態において、製造された細胞凝集体の７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が、１００μｍ～２００μｍ、好ましくは１２０μｍ～１８０μｍ、より好ましくは１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有するものとすることができる。細胞凝集体の大きさがこの範囲よりも大きくなる場合には、細胞に大きなストレスがかかる場合や、アポトーシスの数が増える場合があり、細胞凝集体の形成を妨げる可能性がある。

　細胞凝集体に含まれる細胞の数は、用いた細胞の種類や数、細胞培養バッグのサイズ、細胞培養バッグ下面の凹部のサイズや数、培養期間等の要因により変化し得るが、細胞凝集体一つにつき２００個～２０００個程度である。

　製造された細胞凝集体は、動物生体内に移植して細胞移植治療に用いることができる。製造された細胞凝集体は、そのままあるいはカプセル化又は生分解性ハイドロゲルと共にゲル化して患部に移植することで、疾患を治療するための細胞医薬として有用である。

　また、製造された細胞凝集体は、プロドラッグとして用いることも可能である。「プロドラッグ」とは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。

　また、製造された細胞凝集体は、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物として、治療対象に投与することも可能である。

　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：インスリン産生細胞を用いた細胞凝集体の製造
１．インスリン産生細胞の調製
　インスリン産生細胞は、従来公知の手法（ＷＯ２００９／０１２４２８，ＷＯ２０１６／０２１７３４，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７））に従って、ヒトｉＰＳ細胞より分化誘導して調製した。

　ヒトｉＰＳ細胞は京都大学が樹立したＦｆ―Ｉ１４ｓ０４株を使用した。

　分化誘導を行う際には、まず未分化なｉＰＳ細胞をバイオリアクターに播種した。培養皿上で維持していたｉＰＳ細胞をＥＤＴＡ溶液で処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を、バイオリアクターに１本あたり６×１０⁶個の密度で播種し、３７℃で浮遊攪拌培養を行った。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ－２７６３２を添加したＳｔｅｍ　ＦｉｔＡＫ０３Ｎ培地を使用し、１日間培養し細胞凝集塊を形成させた。

　次にｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化を誘導した。アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）（Ａｘｏｎ　Ｍｅｄｃｈｅｍ）、１％ジメチルスルホキシド（富士フィルム和光純薬）１％Ｂ－２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８（Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換し１日間培養し、続いて、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１％ジメチルスルホキシド（富士フィルム和光純薬）インスリン不含Ｂ－２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１％プルロニックＦ６８（Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ変法イーグル培地を用いて２日間培養した。

　次に内胚葉細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導を従来公知の手法（ＷＯ２００９／０１２４２８，ＷＯ２０１６／０２１７３４，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７）,（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３））に準じて実施した。

　次に内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を行った。内分泌前駆細胞を１％のＢ－２７（登録商標）、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（５８ｍｇ／Ｌ）（富士フィルム和光純薬）、アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤ＩＩ（１０μＭ）（Ｓａｎｔａ　Ｃｕｒｚ）、ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ）（Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ）、トリヨードサイロニン（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＯ４９２９０９７（１μＭ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ）および０．１％プルロニックＦ６８（Ｓｉｇｍａ）を含むイスコブ変法イーグル培地－ｏｐｔｉｏｎ　Ｚｎ⁺⁺中で４日間、さらにＰＤ－１６６８６６（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ）添加した培地中で３日間培養し、インスリン産生細胞を得た。得られたインスリン産生細胞はＴｒｙｐＬＥ　（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いて単一細胞に分散した。

２．細胞凝集体の製造
　細胞培養バッグは、図１に示す細胞培養バッグと同様の構成を有する細胞培養バッグを作製して使用した。すなわち、ガス透過性の厚さ１００μｍのポリエチレンからなる可撓性フィルム２枚を重ねて周囲を融着してなり、ポートを備える構成を有する。細胞培養バッグの下面フィルムは、７００ｃｍ²の下面に深さ１５０μｍ、直径３５０μｍの凹部を４．５×１０⁵個備え（下面単位面積当たり凹部を６４２個／ｃｍ²備える）、上面フィルムは４ｍｍの高さで膨出した膨出形状を有する。フィルムの内面はリン脂質ポリマーによる細胞低接着コーティングを施した。
　培養装置は、図５に示す培養装置を使用した。

　細胞培養バッグに、従来公知の手法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３））の分化因子（トリヨードサイロニン、アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤阻害剤ＩＩ、硫酸亜鉛、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８、）にロックインヒビター（Ｙ２７６３２等）、線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤（ＰＤ－１６６８６６等）等を含む培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　グルコース／炭酸水素ナトリウム／脂肪酸不含ウシ血清由来アルブミン／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／ペニシリン・ストレプトマイシン））と共に上述の調製されたインスリン産生細胞（１．２５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を封入してポートを閉じ、凹部が上になるよう細胞培養バッグを逆さに平置きし、上から両手で押さえて交互に押圧してバッグ内を攪拌した。次いで、攪拌直後に凹部が下になるよう細胞培養バッグを反転させ培養装置の載置台に載置し、押圧部材でバッグ上面より２ｋｇｆの圧力を印加した。この形態で培養装置をインキュベータ内に移して、３７℃、５％ＣＯ₂条件下にて４日培養した。

　培養終了後、培養装置より細胞培養バッグを取り出して裏返し、各凹部にて形成された各細胞凝集体を凹部より培養用培地へと浮遊させた。シリンジをポートに接続し、ポートより培養用培地と共に、細胞凝集体を回収した。細胞培養バッグ内に残った細胞凝集体はわずかであり、ほとんどの細胞凝集体を回収できた。
回収した細胞凝集体の写真図を図６に示す。回収した細胞凝集体の細胞について、マーカータンパク質の発現をフローサイトメトリー解析した結果、インスリン及びＮＫＸ６．１を共に発現する細胞が４１．６％含まれることが示され、インスリン産生細胞の製造が確認された。

　回収した細胞凝集体を含む培養用培地を、全量１７５ｃｍ²フラスコに移し、位相差顕微鏡に取り付けたカメラで細胞凝集体を撮影し、その画像から各細胞凝集体の粒子径を計測した。その結果を図７に示す。

　回収した細胞凝集体の７０％以上が、細胞凝集体の粒子径の中央値から±１０％以内の粒子径を有し、１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有するものであった。

　この結果より、本発明方法によれば、実質的に均一な粒子径を有する細胞凝集体を大量に、かつ簡易に製造できることが確認された。

実施例２：ｉＰＳ細胞を用いた細胞凝集体の製造
１．ｉＰＳ細胞の調製
　ヒトｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）から公開されているプロトコールに従って、継代培養しＴｒｙｐＬＥ＋ＥＤＴＡで剥離して、ロックインヒビター（Ｙ２７６３２）を１％添加したＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素）に懸濁した。

２．細胞凝集体の製造
　細胞培養バッグは、図１に示す細胞培養バッグと同様の構成を有する細胞培養バッグを作製して使用した。すなわち、ガス透過性の厚さ１００μｍのポリエチレンからなる可撓性フィルム２枚を重ねて周囲を融着してなり、ポートを備える構成を有する。細胞培養バッグの下面フィルムは、５０ｃｍ²の下面に深さ２００μｍ、直径５００μｍの凹部を１．８×１０⁴個備え（下面単位面積当たり凹部を３６０個／ｃｍ²備える）、上面フィルムは４ｍｍの高さで膨出した膨出形状を有する。フィルムの内面はリン脂質ポリマーによる細胞低接着コーティングを施した。

　細胞培養バッグに、上述の細胞懸濁液２０ｍＬ（２．２５×１０⁵個ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を封入してポートを閉じ、凹部が上になるよう細胞培養バッグを逆さに平置きし、上から両手で押さえて交互に押圧してバッグ内の懸濁液を攪拌した。次いで、攪拌直後に凹部が下になるよう細胞培養バッグを反転し培養装置の載置台に載置し、押圧部材でバッグ上面より２ｋｇｆの圧力を印加した。一方、圧力を印加しない対照については、この２ｋｇｆの圧力を印加しないことを除いて、同様に操作した。この形態で培養装置をインキュベータ内に移して、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下にて２日間培養した。

　培養終了後、培養装置より細胞培養バッグを取り出して裏返し、各凹部に形成された各細胞凝集体を凹部より培養用培地へと浮遊させた。シリンジをポートに接続し、ポートより細胞凝集体を含む培養用培地を回収した。

　回収した細胞凝集体を含む培養用培地を、全量１０ｃｍシャーレに移し、位相差顕微鏡に取り付けたカメラで細胞凝集体を撮影し、その画像から各細胞凝集体の粒子径を計測した。その結果を図８に示す。

　回収した細胞凝集体の粒子径の偏差を比較すると、圧力を印加せず培養して製造され細胞凝集体については粒子径中心値の±１０％程度であったのに対し、圧力を印加しながら培養して得られた細胞凝集体については粒子径中心値の±５％程度であった。

　この結果より、本発明方法によれば、実質的に均一な粒子径を有する細胞凝集体を大量に、かつ簡易に製造できることが確認された。

１、１’　細胞培養バッグ
２、２’　バッグ本体
２０、２０’　周辺部
２１、２１’　上面フィルム
２１ａ、２１ａ’　天面部分
２１ｂ、２１ｂ’　傾斜部分
２２、２２’　下面フィルム
３、３’　ポート
４、４’　凹部
５、５’　載置台
５ａ、５ａ’　載置面
５ｂ　開口部
５ｂ’　窪み
６　押圧部材
６ａ　底面
７　支持機構
７１　フレーム
７２　ガイドピン
７３　圧力印加手段
８’　上蓋
９’　ヒンジ
１０’　ロック機構
１００、１００’、１００’’　培養装置
１１　細胞凝集体

Claims (28)

1. 　細胞培養バッグを用いた細胞凝集体の製造方法であって、
   細胞培養バッグが上面と下面とを有し、下面に複数の凹部を備えており、
   （１）細胞培養バッグに細胞と培地を加えて撹拌し、細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程、
   （２）培養終了後、形成された細胞凝集体を回収する工程、
   を含む方法。
2. 　１０万個～１００万個の細胞凝集体を回収する、請求項１に記載の方法。
3. 　回収された細胞凝集体が実質的に均一な粒子径を有する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 　回収された細胞凝集体の７０％以上が、細胞凝集体の粒子径の中央値から±１０％以内の粒子径を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 　回収された細胞凝集体の７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 　回収された細胞凝集体の一つにつき、２００個～２０００個の細胞が含まれる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 　細胞が凍結融解された細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 　細胞がインスリン分泌細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 　細胞培養バッグを上下反転させ細胞凝集体を回収する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 　細胞培養バッグにエアーを注入して細胞凝集体を回収する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 　細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程が、細胞培養バッグの上方、下方または上下両方から圧力を印加しながら培養する工程である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 　細胞培養バッグを少なくとも一方向から圧力を印加しながら培養する工程が、上方から圧力を印加しながら培養する工程である、請求項１１に記載の方法。
13. 　凹部の深さ：直径の比が１：１．５～２．５である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 　凹部が球冠状である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 　凹部のピッチが０．３５ｍｍ～０．４９ｍｍである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 　凹部の深さが１５０μｍ～２２０μｍである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 　細胞培養バッグにおける液深が１．５ｍｍ～６ｍｍである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 　細胞培養バッグに細胞を１×１０⁵～１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬの量で加える、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 　細胞培養バッグに細胞を１×１０⁴～５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の量で加える、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 　細胞凝集体形成後に培地を追加する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 　下面が１０万個～１００万個の凹部を備える、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 　凹部を下面単位面積当たり１～１０００個／ｃｍ²備える、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 　移植用の細胞凝集体集団であって、その７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、細胞凝集体集団。
24. 　１０万個～１００万個の細胞凝集体を含む、請求項２３に記載の細胞凝集体集団。
25. 　インスリン分泌細胞を含む、請求項２３又は２４に記載の細胞凝集体集団。
26. 　実質的に均一な粒子径を有する１０万個～１００万個の細胞凝集体を含む、細胞培養バッグ。
27. 　細胞凝集体の７０％以上が１４０μｍ～１６０μｍの粒子径を有する、請求項２６に記載の細胞培養バッグ。
28. 　細胞凝集体がインスリン分泌細胞を含む、請求項２６又は２７に記載の細胞培養バッグ。
    
    
     

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