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WO2021125279A1 - 化学架橋アルギン酸ゲルファイバ - Google Patents

化学架橋アルギン酸ゲルファイバ Download PDF

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Publication number
WO2021125279A1
WO2021125279A1 PCT/JP2020/047203 JP2020047203W WO2021125279A1 WO 2021125279 A1 WO2021125279 A1 WO 2021125279A1 JP 2020047203 W JP2020047203 W JP 2020047203W WO 2021125279 A1 WO2021125279 A1 WO 2021125279A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
cells
producing
alginic acid
alginate gel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2020/047203
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
古迫　正司
佐藤　勉
智裕 鳴海
彬 ▲高▼橋
和行 中山
昌治 竹内
佑 柳沢
池田　和弘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
University of Tokyo NUC
CellFiber Co Ltd
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
University of Tokyo NUC
CellFiber Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co Ltd, University of Tokyo NUC, CellFiber Co Ltd filed Critical Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Publication of WO2021125279A1 publication Critical patent/WO2021125279A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a chemically crosslinked alginate gel fiber for antibody production, a method for producing the gel fiber, and a method for producing an antibody using the gel fiber.
  • Antibody production using genetic recombination technology is being carried out. So far, as antibody-producing cells, CHO cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells, Escherichia coli and the like have been used as host cells, and various antibodies have been produced.
  • CHO cells derived from Chinese hamster ovary
  • CHO cells are cells capable of suspension culture, have a high cell proliferation rate, and can easily produce a target protein in large quantities by mass culture of CHO cells. It is frequently used in the production of antibodies.
  • the antibody-producing cell line is expanded and cultured while controlling the culture conditions such as medium composition, temperature, stirring conditions, gas exchange, and pH, and finally. Culturing is carried out in a large-scale production culture tank on the scale of several thousand to 10,000 L.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2011/046105 Pamphlet.
  • Patent Document 2 International Publication No. 2015/178427 Pamphlet
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-236698
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-77229)
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2017-77473
  • Patent Document 6 Japanese Patent No. 6601931
  • Non-Patent Document 1 A method for producing meter-length core-shell hydrogel microfibers in which extracellular matrix (ECM) protein and differentiated cells or somatic cell stem cells are encapsulated using a microfluidic device having a double coaxial laminar flow is known. .. (Non-Patent Document 1)
  • Non-Patent Document 2 A cell-containing hydrogel microfiber having improved mechanical properties and handleability by using a double network (DN) hydrogel composed of alginate and polyacrylamide is known.
  • Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Documents 1 and 2 do not disclose a chemically crosslinked alginate gel fiber for producing an antibody of the present invention, a method for producing the gel fiber, and a method for producing an antibody using the gel fiber. , No suggestion.
  • Patent Document 7 International Publication No. 2020/0322221 Pamphlet.
  • the core layer containing antibody-producing cells eg, CHO cells incorporating an antibody gene, etc.
  • substrates eg, collagen, medium, solutions of alginic acid, etc., gels thereof, or mixtures thereof
  • a shell layer containing a chemically crosslinked alginate gel formed from modified alginic acid, or a crosslinked alginate gel having both an ion crosslinked formed by a divalent metal such as calcium ion and a chemically crosslinked formed from chemically modified alginic acid It has not been known to produce a recombinant antibody using the alginate gel fiber for producing an antibody and the gel fiber. Further, until now, there is no known method for forming the alginate gel fiber having a certain length or for producing a continuous antibody using the alginate gel fiber.
  • a base material for example, a base material such as hydrogel, specifically, a collagen solution, a collagen gel, a medium, a culture solution, a methyl cellulose, etc.
  • a core layer containing a gel of a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II) or a base material selected from the group consisting of a mixture thereof) is provided with a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) described later.
  • the chemistry for antibody production by coating the crosslinked alginate gel obtained by forming a bridge between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II) as a coating layer (shell layer). It has been found that a crosslinked alginate gel fiber (the chemically crosslinked alginate gel fiber is preferably an alginate gel fiber having a higher mechanical strength than the core layer) can be produced. Further, when antibody-producing cells were cultured using the chemically crosslinked alginate gel fiber thus prepared, it was found that the antibody could be continuously produced for a long period of time, and the present invention was completed.
  • a crosslinked alginate gel (preferably higher than the core layer) obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber was prepared by coating with a shell layer containing a strong crosslinked alginate gel), and the gel fiber was cultured for a long period of time (up to 11 weeks in the examples described later).
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber thus produced provides an environment suitable for continuous antibody production for antibody-producing CHO cells, and the antibody produced in the core layer continuously permeates the shell layer and gels. It was released out of the fiber.
  • the present invention provides a further method of producing an antibody.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate is placed between the two alginic acid derivatives using a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II).
  • a shell layer containing a cross-linked alginate gel preferably a cross-linked alginate gel having a higher mechanical strength than the core layer
  • an antibody is continuously produced for a long period of time.
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber having a high mechanical strength capable of the above.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber of the preferred embodiment provides an environment suitable for antibody production. Since the antibody-producing cells are encapsulated in the core layer, there is little physical stress on the cells, and it is expected that the encapsulated antibody-producing cells will continue to produce antibodies for a long period of time. Therefore, such a method for producing an antibody using a chemically crosslinked alginate gel fiber can be expected to dramatically improve the production efficiency of the antibody. For example, unlike the suspension culture of an antibody that requires a large-scale culture tank, it is expected that the antibody will be produced in a small-scale production facility. It is also expected as a continuous production technology for next-generation antibody drugs suitable for the production of small-quantity and various items of antibody drugs.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a chemically crosslinked alginate gel fiber containing antibody-producing cells in the core layer. It is a schematic diagram explaining one aspect of the manufacturing process of the chemically crosslinked alginate gel fiber containing the antibody-producing cell in the core layer. It is a schematic diagram explaining one aspect of the manufacturing process of a chemical alginate gel fiber containing an antibody-producing cell in a core layer. A schematic diagram illustrating the cross-section of an alginate gel fiber containing antibody-producing cells in the core layer, the antibodies produced, metabolites, waste products, culture medium (nutrient source), and oxygen permeating the shell layer. is there. It is a graph which shows the number of viable cells in the fiber in the culture of Example F3-3.
  • the first aspect is as follows.
  • Crosslinked alginic acid formed by cross-linking the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate with a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II).
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing gel.
  • [Chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I)] The following formula (I): [In formula (I), (ALG) represents alginic acid; -NHCO- represents an amide bond via any carboxyl group of alginic acid; -L 1- represents the table below: Represents a linker selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the outside of the broken line at both ends is not included]; Akn is shown in the table below: A chemically modified alginic acid derivative represented by the partial structural formula [representing a cyclic alkyne group selected from the group consisting of the right side of the broken line in each formula] described in.
  • -L 1 - is preferably the following table: It is a linker selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the outside of the broken line at both ends is not included];
  • Akn is preferably described in the following table: A cyclic alkyne group selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the right side of the broken line is not included];
  • a cyclic alkyne group selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the right side of the broken line is not included];
  • a cyclic alkyne group selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the right side of the broken line is not included];
  • the table below It is a cyclic alkyne group selected from the group consisting of the partial structural formulas [in each formula, the right side of the broken line is not included] described in.
  • -L 2- is preferably specified in the table below: It is a linker selected from the group consisting of the partial structural formulas described in [In each formula, the outside of the broken line at both ends is not included];
  • the combination of Akn-L 1- is based on the formula in the table below: It is as represented by the partial structure selected from the group of (Akn in Table, -L 1 - Each formula is as described in the aspect [1-1]);
  • the combination of Akn-L 1- is based on the formula in the table below: It is as represented by the partial structure selected from the group of (Akn in Table, -L 1 - Each formula is as described in the aspect [1-1]);
  • the combination of Akn-L 1- is based on the formula in the table below: It is as represented by the partial structure selected from the group of (Akn in Table, -L 1 - Each formula is as described in the aspect [1-1]);
  • the combination of Akn-L 1- has the following partial structural formula: As shown by the substructure selected from the group of; Most preferably, Akn-L 1 - is a combination of, the following partial structural formula: As shown in the partial structure selected from.
  • the antibody-producing cells contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber are, for example, cultured cells transformed with an antibody expression vector.
  • Cultured cells include, for example, CHO cells, CHO cell substrains, COS cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells, SP2 cells, PERC6 cells, YB2 / 0 cells, YE2 / 0 cells, 1R983F cells, Namalwa cells, Will-2.
  • the antibody-producing cells contained in the core layer of the chemically cross-linked alginate gel fiber are, for example, antibody-producing CHO cells, and the CHO cells are, for example, mromonab.
  • -CD3-producing CHO cells trastuzumab-producing CHO cells, rituximab-producing CHO cells, paribismab-producing CHO cells, infliximab-producing CHO cells, baciliximab-producing CHO cells, tosirizumab-producing CHO cells, gemtuzumab ozogamycin-producing CHO cells, bebashizumab-producing CHO cells, bebashizumab-producing CHO cells CHO cells, adalimumab-producing CHO cells, setuximab-producing CHO cells, ranibizumab-producing CHO cells, omalizumab-producing CHO cells, ecrizumab-producing CHO cells, panitumumab-producing CHO cells, ustequinumab-producing CHO cells, golimumab-producing CHO cells, canaquinumab-producing CHO cells, canaquinumab-producing CHO cells CHO cells, mogamuri
  • CHO cells infliximab-producing CHO cells, tosirizumab-producing CHO cells, adalimumab-producing CHO cells, and CHO cells selected from the group consisting of nivolumab-producing CHO cells; more preferably tocilizumab-producing CHO cells.
  • the substrate contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, hydrogel or the like, and a collagen solution, collagen gel, medium, etc.
  • It is a base material selected from the group consisting of gels of chemically modified alginic acid derivatives represented by (I) or formula (II), or mixtures thereof; preferably, collagen solutions, collagen gels, media (or culture solutions).
  • Methylcellulose alginate solution (sodium alginate solution), or a base material selected from the group consisting of alginate gel; more preferably, the group consisting of medium (or culture solution), alginic acid solution (sodium alginate solution), or methylcellulose. It is a base material selected from.
  • the substrate contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, a collagen solution, a medium, a culture solution, a methyl cellulose, a sucrose solution, or an alginic acid solution.
  • a substrate selected from the group consisting of, medium (or culture solution), methylcellulose, or alginic acid solution (sodium alginate solution), or a mixture thereof; more preferably, alginic acid solution (sodium alginate solution), or methylcellulose. It is a base material selected from the group consisting of.
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, a hydrogel, and a collagen gel, an alginate gel, and the above-mentioned embodiment [1-7b]. It is a base material selected from the group consisting of a gel of a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II) described in 1], or a mixture thereof; preferably, an alginate gel or the above-mentioned embodiment. It is a base material selected from the gel of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and / or the formula (II) described in [1].
  • a gel of a chemically modified alginate derivative represented by the formula (I) used for forming a crosslinked alginate gel contained in a shell layer of a chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 100,000 Da to about 3 million Da; preferably in the range of about 300,000 Da to about 2.5 million Da, more preferably about 500,000 Da. The range is from Da to about 2 million Da.
  • a gel of a chemically modified alginate derivative represented by the formula (II) used for forming a crosslinked alginate gel contained in a shell layer of a chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 100,000 Da to about 3 million Da; preferably in the range of about 300,000 Da to about 2.5 million Da, more preferably about 500,000 Da. The range is from Da to about 2 million Da.
  • the reaction of the chemically modified alginate derivative represented by the formula (I) used for forming the crosslinked alginate gel contained in the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, about 0.1% to about 30%. It is preferably in the range of about 0.3% to about 20%; more preferably in the range of about 0.5 to about 10%.
  • reaction of the chemically modified alginate derivative represented by the formula (II) used for forming the crosslinked alginate gel contained in the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 0.1% to about 30%. It is preferably in the range of about 0.3% to about 20%; more preferably in the range of about 0.5 to about 15%.
  • the crosslinked alginate gel contained in the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, the following formula (III-L): [In formula (III-L), -CONH- and -NHCO- at both ends represent an amide bond via any carboxyl group of alginic acid; -L 1- is the same as the definition in the above aspect [1]; -L 2- is the same as the definition in the above aspect [1]; X is the table below: It is a cyclic group selected from the group of partial structural formulas described in (In each formula, the outside of the broken line at both ends is not included)] is chemically crosslinked.
  • X is preferably the partial structural formula (TZ-1) described in the above aspect [1-12].
  • the combination of -L 2- X-L 1- is based on the formula in the table below: As shown by the partial structure selected from the group of (-L 1- in the table is as described in the above aspect [1-1]; -L 2- is as described in the above aspect [1-3]. Street; -X- is as described in the above aspect [1-2]);
  • the combination of -L 2- X-L 1- is based on the formula in the table below: As shown by the partial structure selected from the group of (-L 1- in the table is as described in the above aspect [1-1]; -L 2- is as described in the above aspect [1-3]. Street; -X- is as described in the above aspect [1-2]);
  • the combination of -L 2- X-L 1- is based on the formula in the table below. As shown by the partial structure selected from the group of (-L 1- in the table is as described in the above aspect [1-1]; -L 2- is as described in the above aspect [1-3]. Street; -X- is as described in the above aspect [1-2]);
  • the combination of -L 2- X-L 1- has the following partial structural formula [in the formula, the outside of the broken lines at both ends is not included]: As shown by the substructure selected from the group of;
  • the combination of -L 2- X-L 1- has the following partial structural formula [in the formula, the outside of the broken lines at both ends is not included]: As shown by the partial structure selected from the group of.
  • the crosslinked alginate gel contained in the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is preferably the formula (1-12A) described in the above aspect [1-12].
  • III-L) [In formula (III-L), each definition is the same as the definition in aspect [1-12]] is chemically crosslinked via a group represented by a divalent metal ion (eg, eg). , Calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion, and an ion selected from the group consisting of zinc ion).
  • the divalent metal ion used for forming the ion bridge is preferably selected from the group of calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion or zinc ion. It is a divalent metal ion; more preferably a calcium ion or a barium ion; still more preferably a calcium ion.
  • the divalent metal ion used for forming the ion bridge is composed of, for example, an aqueous solution of calcium chloride, an aqueous solution of calcium carbonate, an aqueous solution of calcium gluconate, an aqueous solution of barium chloride, or the like.
  • An aqueous solution containing a divalent metal ion selected from the group can be used as a source; preferably an aqueous solution of calcium chloride or an aqueous solution of barium chloride; more preferably an aqueous solution of calcium chloride.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 300 ⁇ m to about 750 ⁇ m.
  • the diameter of the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 100 ⁇ m to about 400 ⁇ m.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is in the range of about 300 ⁇ m to about 750 ⁇ m, and the diameter of the core layer of the alginate gel fiber is about 100 ⁇ m to about 100 ⁇ m. The range is 400 ⁇ m.
  • the aspect of the first A-1 is as follows.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the base material has the following formula (III-L): [In formula (III-L), -CONH- and -NHCO- at both ends represent an amide bond via any carboxyl group of alginic acid; -L 1- is the same as the definition in the above aspect [1]; -L 2- is the same as the definition in the above aspect [1]; -X-is the same as the definition in the above aspect [1-12]], which is a chemically crosslinked alginate gel fiber coated with a shell layer containing a crosslinked alginate gel chemically crosslinked via a group represented by the above aspect [1-12].
  • the aspect of the first A-2 is as follows.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the base material has the following formula (III-L): [In formula (III-L), -CONH- and -NHCO- at both ends represent an amide bond via any carboxyl group of alginic acid; -L 1- is the same as the definition in the above aspect [1]; -L 2- is the same as the definition in the above aspect [1]; -X- is the same as the definition in the above aspect [1-12]], a crosslinked alginate gel chemically crosslinked via a group represented by the above aspect [1-12], and a crosslinked alginate gel ionically crosslinked via a divalent metal ion. Chemically crosslinked alginate gel fiber coated with a shell layer containing.
  • the antibody-producing cells contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber are the above-mentioned aspect [1-5] or [1-6]. It is the same as the cell described in.
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is the above aspect [1-7] to [1-7b]. It is the same as the described base material.
  • the divalent metal ion is an ion selected from the group consisting of, for example, calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion, and zinc ion, and is more preferable. Is a calcium ion or barium ion; more preferably a calcium ion.
  • the divalent metal ion is a divalent metal selected from the group consisting of, for example, an aqueous solution of calcium chloride, an aqueous solution of calcium carbonate, an aqueous solution of calcium gluconate, an aqueous solution of barium chloride, and the like.
  • An aqueous solution containing ions can be used as a source; preferably an aqueous solution of calcium chloride or an aqueous solution of barium chloride; more preferably an aqueous solution of calcium chloride.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 300 ⁇ m to about 750 ⁇ m.
  • the diameter of the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 100 ⁇ m to about 400 ⁇ m.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is in the range of about 300 ⁇ m to about 750 ⁇ m, and the diameter of the core layer of the alginate gel fiber is about. The range is from 100 ⁇ m to about 400 ⁇ m.
  • a preferred embodiment of the crosslinked alginate gel in the crosslinked alginate gel fiber can be optionally formed.
  • the second aspect is as follows.
  • a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and the formula (II) according to any one of the above aspects [1] to [1-4] is used for the core layer containing the antibody-producing cells and the base material.
  • microfluidic device 10 including the outlet 50 of the introduction tube 40 located at (1) A step of introducing an antibody-producing cell 6 and a base material from an introduction port 1 and injecting the antibody-producing cell 6 and a base material to form a first laminar flow of the antibody-producing cell 6 and the base material in the introduction tube 40.
  • a mixed solution of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and the formula (II) according to the above aspect [1] is introduced from the introduction port 2 and injected, and the outer periphery of the first laminar flow is injected.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate, which is ejected from the outlet 50, is represented by the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and the formula (II) according to the above embodiment [1].
  • This is a method for producing the chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • the second aspect of the second A is as follows.
  • a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and the formula (II) according to any one of the above aspects [1] to [1-4] is used for the core layer containing the antibody-producing cells and the base material.
  • a method for producing a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives which is shown in FIG.
  • T-shaped fluid device XX including the introduction port 1 of the introduction pipe AA, the introduction port 2 of the introduction pipe BB and the introduction pipe BB, and the discharge pipe CC and its outlet 3 located downstream of the introduction pipe AA and the introduction pipe BB.
  • the method for producing a chemically crosslinked alginate gel fiber which comprises a step of obtaining a chemically crosslinked alginate gel fiber CFB formed by coating with a layer.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber according to the above aspect [2] or [2A] is the chemically crosslinked according to any one of the above aspects [1], [1A-1] or [1A-2]. It is an alginate gel fiber.
  • the antibody-producing cells contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber are, for example, cultured cells transformed with an antibody expression vector.
  • the cultured cells are, for example, CHO cells, CHO cell substrains, COS cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells, SP2 cells, PERC6 cells, YB2 / 0 cells, YE2 / 0 cells, 1R983F cells, Namalwa cells, Will.
  • CHO cells preferably selected from the group consisting of CHO cells, CHO cell substrains, COS cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells, SP2 cells, and PERC6 cells. It is a cell to be used; more preferably a cell selected from the group consisting of CHO cells, Sp2 / 0 cells, and NS0; still more preferably a CHO cell.
  • the antibody-producing cells contained in the core layer of the chemically cross-linked alginate gel fiber are, for example, antibody-producing CHO cells
  • the CHO cells are, for example, , Muromonab-CD3 producing CHO cells, trussumab producing CHO cells, rituximab producing CHO cells, paribismab producing CHO cells, infliximab producing CHO cells, baciliximab producing CHO cells, tosirizumab producing CHO cells, gemtuzumab producing CHO cells, gemtuzumab ozomab CHO cells Chiuxetan-producing CHO cells, adalimumab-producing CHO cells, setuximab-producing CHO cells, ranibizumab-producing CHO cells, omalizumab-producing CHO cells, eculizumab-producing CHO cells, panitumumab-producing CHO cells
  • the substrate contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, hydrogel or the like, and a collagen solution, collagen gel, etc.
  • the substrate contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, a collagen solution, a medium, a culture solution, a methyl cellulose, a sucrose solution, and the like. It is a base material selected from the group consisting of an alginic acid solution, a solution of a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II) according to the above aspect [1], or a mixture thereof; preferably.
  • a substrate selected from the group consisting of collagen solution, medium (or culture solution), methylcellulose, or alginic acid solution (sodium alginate solution), or a mixture thereof; more preferably, alginate solution (sodium alginate solution),.
  • it is a base material selected from the group consisting of methyl cellulose.
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, hydrogel, collagen gel, alginate gel, the above.
  • the divalent metal ion is selected from the group consisting of, for example, calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion, zinc ion and the like. It is an ion; preferably a calcium ion or a barium ion; more preferably a calcium ion.
  • the solution containing the divalent metal ion is, for example, from an aqueous solution of calcium chloride, an aqueous solution of calcium carbonate, an aqueous solution of calcium gluconate, an aqueous solution of barium chloride, or the like. It is an aqueous solution containing a divalent metal ion selected from the above group; preferably an aqueous solution of calcium chloride or an aqueous solution of barium chloride; more preferably an aqueous solution of calcium chloride.
  • the concentration of divalent metal ions in the solution containing divalent metal ions is, for example, in the range of about 1 mM to about 1 M, or about 20 to. It is in the range of about 500 mM; preferably 100 mM.
  • the flow velocities of the antibody-producing cells 6 and the substrate ejected from the introduction port 1 of the microfluidic device 10 are, for example, in the range of about 50 to about 100 ⁇ L / min. Is.
  • the flow velocities of the antibody-producing cells 6 and the substrate ejected from the introduction port 1 of the microfluidic apparatus XX are, for example, in the range of about 50 to about 100 ⁇ L / min. Is.
  • the flow velocity of the solution containing divalent metal ions ejected from the introduction port 3 of the microfluidic device 10 is, for example, in the range of about 2 to about 6 mL / min. Is.
  • the flow velocities of the antibody-producing cells 6 and the substrate ejected from the introduction port 1 of the microfluidic device 10 are in the range of about 50 to about 100 ⁇ L / min.
  • the flow velocity of the mixed solution is in the range of about 200 to about 400 ⁇ L / min, and the flow velocity of the solution containing divalent metal ions ejected from the inlet 3 of the microfluidic device 10 is about 2 to about 6 mL / min. The range.
  • the flow velocities of the antibody-producing cells 6 and the substrate ejected from the introduction port 1 of the microfluidic device XX are in the range of about 50 to about 100 ⁇ L / min.
  • the flow rate of the mixed solution of is in the range of about 200 to about 400 ⁇ L / min.
  • the temperature during the production of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 4 to about 37 ° C.
  • the third aspect is as follows.
  • a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) and the formula (II) according to any one of the above aspects [1] to [1-4] is used for the core layer containing the antibody-producing cells and the base material.
  • This is a method for producing an antibody using a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a crosslinked alginate gel obtained by forming a bridge between the two alginate derivatives. It is a method for producing an antibody by putting it in a culture vessel, adding a medium, impregnating the chemically crosslinked gelate alginate gel fiber, and culturing.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber in the above aspect [3] is the chemically crosslinked alginate gel fiber according to any one of the above aspects [1], [1A-1] or [1A-2]. ..
  • the culture vessel is a vessel selected from the group consisting of, for example, a tissue culture plate, an Erlenmeyer flask, a T-flask, a spinner flask, a culture bag, an animal cell culture tank, and the like. Yes; preferably an Erlenmeyer flask or an animal cell culture tank.
  • any method such as static culture or shaking culture may be selected, and any method such as batch culture (batch culture), fed-batch culture (fed-batch culture), or continuous culture may be used. It is good, but fed-batch culture or continuous culture is preferable.
  • the temperature condition of the culture is 28 ° C. to 38 ° C., for example, the culture temperature is 37 ° C. or 30 ° C., 5 Incubate under a% CO 2 atmosphere under a condition of 125 rpm in a culture device (for example, a culture device of Panasonic Healthcare Co., Ltd., MIR-S100C, but not limited to this).
  • a culture device for example, a culture device of Panasonic Healthcare Co., Ltd., MIR-S100C, but not limited to this.
  • the culturing period is, for example, 14 days; or 28 days; or 33 days.
  • the culturing period is, for example, 10 days or more, 20 days or more, or 30 days or more. Yes, or more than 40 days, or more than 50 days, or more than 60 days, or more than 70 days.
  • the culturing period is, for example, 14 days; or 28 days; or 33 days; or 42 days; or 56 days; or 61 days; or 77 days.
  • the culture temperature is, for example, in the range of about 30 to about 38 ° C.
  • the culture temperature is preferably about 36 ° C. to about 38 ° C., more preferably about 37 ° C. from the start to the end of the culture. ..
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about 1.
  • the temperature from the time when 0.0 ⁇ 10 8 cells / mL to about 8.0 ⁇ 10 8 cells / mL is reached to the end of culturing is about 30 ° C.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about 3.
  • the temperature from the time when 0.0 ⁇ 10 8 cells / mL to about 8.0 ⁇ 10 8 cells / mL is reached to the end of culturing is about 30 ° C.
  • the culture temperature is more preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about.
  • the temperature from the time when 4.0 ⁇ 10 8 cells / mL to about 8.0 ⁇ 10 8 cells / mL is reached to the end of culturing is about 30 ° C.
  • the antibody-producing cell is, for example, a cultured cell transformed with an antibody expression vector
  • the cultured cell is, for example, a cultured cell.
  • the cell according to the above aspect [1-1] that is, for example, CHO cell, CHO cell substrain, COS cell, Sp2 / 0 cell, NS0 cell, SP2 cell, PERC6 cell, YB2 / 0 cell, and the like.
  • YE2 / 0 cells 1R983F cells, Namalwa cells, Will-2 cells, Jurkat cells, Vero cells, Molt-4 cells, HEK293 cells, BHK cells, KGH6 cells, P3X63Ag8.653 cells, C127 cells, JC cells, LA7 cells, A cell selected from the group consisting of ZR-45-30 cells, hTERT cells, NM2C5 cells, UACC-812 cells, etc .; preferably, CHO cells, CHO cell substrains, COS cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells. , SP2 cells, and PERC6 cells; more preferably CHO cells, Sp2 / 0 cells, and NS0; more preferably CHO cells. is there.
  • the antibody-producing cell is, for example, an antibody-producing CHO cell
  • the CHO cell is, for example, a muromonab-CD3-producing CHO cell.
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, a hydrogel or the like, and is a collagen solution.
  • the substrate contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, a collagen solution, a medium, a culture solution, methyl cellulose, and the like.
  • a substrate selected from the group consisting of a sucrose solution, an alginic acid solution, a solution of a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II) according to the above aspect [1], or a mixture thereof; It is preferably a substrate selected from the group consisting of collagen solution, medium (or culture solution), methylcellulose, or alginic acid solution (sodium alginate solution), or a mixture thereof; more preferably, alginate solution (sodium alginate).
  • a base material selected from the group consisting of (solution) or methyl cellulose.
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, hydrogel, collagen gel, or alginate.
  • a cell growth inhibitor may be added to the culture solution, or a cell growth inhibitor that can be added to the culture solution.
  • an additive selected from the group consisting of dimethylsulfoxide, sodium butyrate, valproic acid, lithium chloride and valeric acid; preferably valproic acid or valeric acid; more preferably valeric acid.
  • the fourth aspect is an antibody produced in the core layer of an alginate gel fiber obtained by the method for producing an antibody according to any one of the above aspects [3] to [3-7b] and permeating the shell layer.
  • the isotype possessed by the antibody produced in the core layer and permeating the shell layer is preferably IgG or IgE; more preferably IgG.
  • the fifth aspect is produced in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber obtained by the method for producing an antibody according to any one of the above aspects [3] to [3-7b] and permeates the shell layer.
  • the molecular weight of the antibody produced in the core layer and permeating the shell layer is preferably in the range of 45,000 to 160,000; more preferably 140,000 to 150. It is in the range of 000.
  • the antibody obtained by the method for producing an antibody according to any one of the above aspects [3] to [3-7b] can be obtained.
  • mromonab-CD3 using mromonab-CD3-producing CHO cells trussumab using trussumab-producing CHO cells
  • rituximab using rituximab-producing CHO cells paribismab using paribizmab-producing CHO cells
  • infliximab using infliximab-producing CHO cells.
  • alginic acid for the raw material alginic acid used when synthesizing the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II), and the alginic acid used as the base material of the core layer
  • alginic acid means at least one alginic acid (sometimes referred to as "alginic acids") selected from the group consisting of alginic acid, alginic acid esters, and salts thereof (for example, sodium alginate).
  • alginic acid used may be of natural origin or synthetic, but is preferably of natural origin.
  • Preferred alginates are bioabsorbable polysaccharides extracted from brown algae such as Lessonia, Macrocystis, Laminaria, Ascophyllum, Derbilia, Kadika, Arame, and Kombu, D-mannuronic acid (M). It is a polymer in which two types of uronic acid, L-gluuronic acid (G), are linearly polymerized. More specifically, the homopolymer fraction of D-mannuronic acid (MM fraction), the homopolymer fraction of L-glulonic acid (GG fraction), and D-mannuronic acid and L-gluuronic acid are randomly arranged. It is a block copolymer in which the obtained fractions (M / G fractions) are arbitrarily bonded.
  • Alginic acid is a kind of natural polysaccharide produced by extracting from seaweed of brown algae and purifying it, and is a polymer obtained by polymerizing D-mannuronic acid (M) and L-gluuronic acid (G).
  • the composition ratio (M / G ratio) of alginic acid between D-mannuronic acid and L-gluuronic acid, that is, the gel strength differs mainly depending on the type of organism from which seaweed is derived, and also depends on the place of growth and season of the organism. Affected, it ranges from a high G type with an M / G ratio of about 0.2 to a high M type with an M / G ratio of about 5.
  • the physicochemical properties of alginic acid may differ depending on the M / G ratio of alginic acid, the arrangement of M and G, etc., and the preferred use may differ. It is known that the gelling ability of alginic acids and the properties of the produced gel are affected by the M / G ratio, and that the gel strength generally increases when the G ratio is high. The M / G ratio also affects the hardness, brittleness, water absorption, flexibility, etc. of the gel. Therefore, it is preferable to use alginic acid used in the present invention having an appropriate M / G ratio and an appropriate viscosity according to the final intended use.
  • the industrial production method of alginic acid includes an acid method and a calcium method, but in the present invention, any production method can be used.
  • the quantitative value by the HPLC method is preferably contained in the range of 80 to 120% by mass, more preferably contained in the range of 90 to 110% by mass, and contained in the range of 95 to 105% by mass. More preferred.
  • those whose quantitative values by the HPLC method are included in the above range are referred to as high-purity alginic acid.
  • the alginic acid or a salt thereof used in the present invention is preferably high-purity alginic acid.
  • a commercially available product for example, as the Kimika algin series, a product sold by Kimika Co., Ltd., preferably a high-purity food / pharmaceutical grade product can be purchased and used. It is also possible to further purify and use a commercially available product as appropriate. For example, low endotoxin treatment is preferred. As the purification method or the low endotoxin treatment method, for example, the method described in JP-A-2007-7425 can be adopted.
  • the salt of alginic acid in "arginic acid” used in the present invention is "monovalent metal salt of alginic acid", and hydrogen ions of D-mannuronic acid of alginic acid or carboxylic acid of L-gluuronic acid can be used as Na + or K +. It is a salt produced by ion exchange with monovalent metal ions such as. Specific examples of the monovalent metal salt of alginic acid include sodium alginate and potassium alginate, but sodium alginate is particularly preferable.
  • alginic acid may be referred to as (ALG) -COOH, with alginic acid as (ALG) and one of any carboxyl groups of alginic acid as -COOH.
  • the alginic acid used in the present invention should have an appropriate weight average molecular weight according to its final intended use. For example, those having a weight average molecular weight of 10,000 to 10 million are preferably used, more preferably 100,000 or more and 5 million or less, and further preferably 150,000 or more and 3 million or less.
  • the alginic acid is sodium alginate.
  • the sodium alginate a commercially available sodium alginate can be used.
  • the sodium alginate is the sodium alginate of A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, and B-3 described in the table below (publisher: Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.). Co., Ltd.) is used.
  • the viscosity, weight average molecular weight and M / G lamp of each 1 w / w% aqueous solution of sodium alginate are shown in the table below.
  • the physical property values of the sodium alginate A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, and B-3 were measured by the following various methods.
  • the measuring method is not limited to the method, but each physical property value may differ from the above depending on the measuring method.
  • Pretreatment method An eluent was added to the sample to dissolve it, and then filtered through a 0.45 ⁇ m membrane filter to obtain a measurement solution.
  • Da (Dalton) may be added as a unit in the molecular weights of alginic acid, alginic acid derivatives, crosslinked alginic acid, and crosslinked alginic acid.
  • the composition ratio (M / G ratio) of D-mannuronic acid and L-gluuronic acid of alginic acids differs mainly depending on the type of organism from which seaweeds are derived, and is also affected by the habitat and season of the organism. , From a high G type with an M / G ratio of about 0.2 to a high M type with an M / G ratio of about 5. It is known that the gelling ability of alginic acids and the properties of the produced gel are affected by the M / G ratio, and that the gel strength generally increases when the G ratio is high. The M / G ratio also affects the hardness, brittleness, water absorption, flexibility, etc. of the gel.
  • the M / G ratio of the alginates and / or salts thereof used is usually 0.1-4.0, in some embodiments 0.1-3.0, and in some embodiments 0.1-2. It is .0, 0.5 to 1.8 in some embodiments, and 0.8 to 1.2 in some embodiments. In another aspect, it is 0.1 to 0.5.
  • alginic acid used in the present invention should have an appropriate viscosity and an appropriate M / G ratio according to the final intended use.
  • the numerical range indicated by using “-” indicates a range including the numerical values before and after "-" as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • alginic acid ester and “alginate” used are not particularly limited, but in order to react with a cross-linking agent, it is necessary that they do not have a functional group that inhibits the cross-linking reaction.
  • alginate ester propylene glycol alginate and the like are preferable.
  • examples of the alginate include a monovalent salt of alginic acid and a divalent salt of alginic acid.
  • the monovalent salt of alginic acid is preferably sodium alginate, potassium alginate, ammonium alginate, etc., more preferably sodium alginate or potassium alginate, and particularly preferably sodium alginate.
  • Preferred examples of the divalent salt of alginic acid include calcium alginate, magnesium alginate, barium alginate, strontium alginate, and the like.
  • Alginic acid is a high molecular weight polysaccharide and it is difficult to accurately determine its molecular weight, but it generally has a weight average molecular weight of 10 to 10 million, preferably 10,000 to 8 million, and more preferably 20,000 to 3 million. Is the range of. It is known that in the measurement of the molecular weight of a polymer substance derived from a natural product, the value may differ depending on the measurement method.
  • the molecular weight of the alginic acid derivative of the present invention or alginic acid or a salt thereof in the present specification is the weight average molecular weight calculated by size exclusion chromatography (SEC) unless otherwise specified.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the alginic acid or a salt thereof used in the present invention it is desirable to use one having an appropriate molecular weight distribution according to its final intended use.
  • the temperature is preferably 100,000 to 5 million. Yes, more preferably 150,000 to 3 million. In some embodiments, it is in the range of 500,000 to 3 million, more preferably 1 million to 2.5 million, and even more preferably 1 million to 2 million.
  • the absolute weight average molecular weight can be measured.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) measured by the GPC-MALS method is preferably 10,000 or more, more preferably 50,000 or more, still more preferably 60,000 or more, and preferably 1 million or less, more preferably 80. It is 10,000 or less, more preferably 700,000 or less, and particularly preferably 500,000 or less. The preferred range is 10,000 to 1,000,000, more preferably 50,000 to 800,000, and even more preferably 60,000 to 500,000.
  • a measurement error of about 10% to about 30% can occur. For example, if it is 500,000, the value may fluctuate in the range of 350,000 to 650,000, and if it is 1 million, the value may fluctuate in the range of 700,000 to 1.3 million. In the present specification, when "about” is described in the description of molecular weight measurement, a value up to ⁇ 10% of the value, and in some embodiments up to ⁇ 20% of the value may be included.
  • a polymer substance derived from a natural product does not have a single molecular weight, but is an aggregate of molecules having various molecular weights, so that it is measured as a molecular weight distribution having a certain width.
  • a typical measurement method is gel filtration chromatography.
  • Typical information on the molecular weight distribution obtained by gel filtration chromatography includes weight average molecular weight (Mw), number average molecular weight (Mn), and dispersion ratio (Mw / Mn).
  • the weight average molecular weight emphasizes the contribution of a polymer having a large molecular weight to the average molecular weight, and is expressed by the following formula.
  • the number average molecular weight is calculated by dividing the total weight of the macromolecules by the total number of macromolecules.
  • W is the total weight of the polymer
  • Wi is the weight of the i-th polymer
  • Mi is the molecular weight at the i-th elution time
  • Ni is the number of molecular weight Mi
  • Hi is the height at the i-th elution time. ..
  • the weight average molecular weight is a value calculated by measuring the molecular weight by, for example, size exclusion chromatography (SEC) and using a calibration curve using pullulan as a standard substance by a conventional method as shown in the above literature. can do.
  • the weight average molecular weight can be an absolute molecular weight measured by, for example, size exclusion chromatography (SEC) -MALS by a conventional method as shown in the above-mentioned literature.
  • the molecular weight of alginic acids can be measured according to a conventional method.
  • the molecular weight of alginic acid or a salt thereof in the present specification is the weight average molecular weight calculated by gel filtration chromatography unless otherwise specified.
  • a typical condition when gel filtration chromatography is used for molecular weight measurement for example, the condition of this example described later can be adopted.
  • the column for example, Superose6 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare Science Co., Ltd.) can be used, and as a developing solvent, for example, a 10 mmol / L phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.15 mol / L NaCl.
  • bluedextran, tyroglobulin, ferritin, aldolase, conalbumin, ovalbumin, ribonuclease A and aprotinin can be used as molecular weight standards.
  • the viscosity of alginic acid used in the present specification is not particularly limited, but when the viscosity is measured as an aqueous solution of 1 w / w% alginic acid, it is preferably 10 mPa ⁇ s to 1000 mPa ⁇ s, more preferably 50 mPa ⁇ s. It is s to 800 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of an aqueous solution of alginic acid can be measured according to a conventional method.
  • a co-axis double-cylindrical rotational viscometer, a single cylindrical rotational viscometer (Brookfield type viscometer), a cone-plate type rotational viscometer (cone plate type viscometer), etc. of the rotational viscometer method are used.
  • Alginic acids initially have a large molecular weight and high viscosity when extracted from brown algae, but in the process of drying and purification by heat, the molecular weight becomes small and the viscosity becomes low.
  • Alginic acids having different molecular weights can be produced by methods such as controlling conditions such as temperature in the production process, selecting brown algae as a raw material, and fractionating the molecular weight in the production process. Further, by mixing with different lots of alginic acids having different molecular weights or viscosities, it is possible to obtain alginic acids having a desired molecular weight.
  • the alginic acid used herein is alginic acid that has not been treated with low endotoxin in some embodiments, or alginic acid that has been treated with low endotoxin in some other embodiments.
  • Low endotoxin means that the endotoxin level is low enough not to cause inflammation or fever. More preferably, it is alginates treated with low endotoxin.
  • the low endotoxin treatment can be performed by a known method or a method similar thereto.
  • William et al.'S method for purifying biopolymer salts such as alginate and gellan gum see, eg, JP-A-2002-530440
  • James et al.'S method for purifying polysaccharides eg, international publication.
  • the method of Lewis et al. See, eg, US Pat. No.
  • Low endotoxin treatment is not limited to these, but uses cleaning, filtration with filters (endotoxin removal filter, charged filter, etc.), extrafiltration, and columns (endotoxin adsorption affinity column, gel filtration column, column with ion exchange resin, etc.).
  • the endotoxin level can be confirmed by a known method, for example, it can be measured by a method using Limulus reagent (LAL), a method using Endospecy (registered trademark) ES-24S set (Seikagaku Corporation), or the like. ..
  • LAL Limulus reagent
  • Endospecy registered trademark
  • ES-24S set Seikagaku Corporation
  • the method for treating endotoxin used is not particularly limited, but as a result, the endotoxin content of alginates should be 500 endotoxin units (EU) / g or less when endotoxin measurement with Limulus reagent (LAL) is performed. Is more preferable, and more preferably 100 EU / g or less, particularly preferably 50 EU / g or less, and particularly preferably 30 EU / g or less.
  • "substantially free of endotoxin” means that the endotoxin value measured by the Japanese Pharmacopoeia endotoxin test is within the above numerical range.
  • the low endotoxin-treated sodium alginate is available from commercial products such as Sea Matrix (registered trademark) (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) and PRONOVA TM UP LVG (FMCBioPolymer).
  • alginic acid used in synthesizing a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or (II) used for forming a core layer or shell layer of a chemically crosslinked alginic acid gel fiber.
  • (Sodium) is not particularly limited, but is selected from, for example, sodium alginate A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, or B-3 shown in Table 21. It is possible.
  • the concentration of the sodium alginate solution prepared using the sodium alginate is, for example, in the range of 0.1 to 2.0% by mass (w / w%) or (w / v%).
  • the sodium alginate used in synthesizing the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or (II) used for forming the core layer or shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is preferably A-. 2 or B-2, and the concentration of the sodium alginate solution prepared using the sodium alginate is preferably 1.5% by mass (w / w%) or (w / v%).
  • the alginic acid (sodium alginate) used to form the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is not particularly limited, but a collagen solution, a medium (or a culture solution), or the like is mixed. It is also possible to use it.
  • the solvents used for the sodium alginate solution, collagen solution, etc. are as described below.
  • the chemically modified alginic acid derivative herein is a reactive group in the Huisgen reaction or complementation of the reactive group via an amide bond and a divalent linker to any one or more carboxyl groups of alginic acid. Reactive groups have been introduced.
  • plurality e.g., 1 to 10, or 1 to 5
  • the -CH 2 - hydrogen atoms, oxo group ( O)
  • C 1-6 alkyl group e.g., methyl From groups such as groups, ethyl groups, n-propyl groups, iso-propyl groups, etc.
  • halogen atoms eg, fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms, iodine atoms, etc.
  • hydroxyl groups -OH
  • a plurality (for example, 1 to 10 or 1 to 5) may be substituted with the selected group.
  • the hydrogen atom of the imino group (-NH-) is replaced with a methyl group to form an -N (Me) -CO- group. It is possible.
  • the bonding mode between the linker (-L 1- , -L 2- ) and alginic acid is -NH-CO- bond or -N (Me)-. There is CO-; preferably a -NH-CO- bond.
  • the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) in the present specification can be produced, for example, by the method of the following formula (for details, refer to the general production method described later). ..
  • the weight average molecular weight of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) of the present specification measured by the gel filtration chromatography method is in the range of about 100,000 Da to about 3 million Da; preferably about 300,000 Da to about 300,000 Da. It is in the range of about 2.5 million Da, more preferably in the range of about 500,000 Da to about 2 million Da. Further, the weight average molecular weight of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II) measured by the gel filtration chromatography method is in the range of about 100,000 Da to about 3 million Da; preferably about 300,000 Da to about 250. It is in the range of 10,000 Da, more preferably in the range of about 500,000 Da to about 2 million Da.
  • the Akn-L 1 -NH-group of the formula (I) does not have to be bonded to all the carboxyl groups of the alginic acid structural unit, and the N 3- L 2-N of the formula (II).
  • the NH-group need not be attached to all the carboxyl groups of the alginate building block.
  • the N 3- L 2 -NH- group of the formula (II) is a complementary reactive group.
  • Akn-L 1 -NH- group of formula (I) is the complementary reactive groups.
  • the introduction rate of the reactive group of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) is, for example, in the range of about 0.1% to about 30%; preferably from about 0.3% to. It is in the range of about 20%; more preferably in the range of about 0.5 to about 10%.
  • the introduction rate of the reactive group of the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (II) is, for example, in the range of about 0.1% to about 30%; preferably about 0.3% to about 20%. More preferably, it is in the range of about 0.5 to about 15%.
  • the introduction rate of the reactive group or the complementary reactive group is expressed as a percentage of the number of uronic acid monosaccharide units into which each reactive group has been introduced among the uronic acid monosaccharide units which are repeating units of alginic acids. It is the value that was set.
  • % used for the introduction rate of a reactive group or a complementary reactive group in an alginic acid derivative means mol%.
  • the introduction rate of each reactive group or complementary reactive group can be determined by the method described in Examples described later.
  • the cyclic alkyne group (Akn) in the formula (I) and the azide group in the formula (II) form a triazole ring by the Huisgen reaction, thereby forming a crosslink.
  • the Huisgen reaction (1,3-dipolar addition cyclization reaction) is a condensation reaction between compounds having a terminal azide group and a terminal alkyne group as shown in the following formula.
  • a disubstituted 1,2,3-triazole ring is obtained in good yield, and it is characterized in that no extra by-product is generated. It is considered that a 1,4- or 1,5-disubstituted triazole ring can be formed in the reaction, but a regioselective triazole ring can be obtained by using a copper catalyst.
  • the Huisgen reaction is an azide compound having a substituted primary azide, secondary azide, tertiary azide, aromatic azide, etc., and a terminal or cyclic alkyne which is a complementary reactive group of the azide group.
  • a compound having a group can be used.
  • various functional groups for example, ester group, carboxyl group, alkenyl group, hydroxyl group, amino group, etc. should be substituted in the reaction substrate. Is possible.
  • 1,2,3-triazole is short-term, easily, and efficiently without the use of copper catalysts to produce unwanted by-products and avoid copper-catalyzed cytotoxicity.
  • the cyclic alkyne group (cyclooctyl group) described in the above aspect [1] is used as the alkyne group of the Huisgen reaction.
  • the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formula (I) or the formula (II) are H 2 N-L 1- Akn (in the formula, -L 1- and Akn, respectively. Is the same as the definition in the above aspect [1]), or the amine derivative (AM-1) or H 2 N-L 2- N 3 (in the formula, -L 2- ) is the above-mentioned embodiment [1].
  • the amine derivative (AM-2) represented by (1) is the same as the definition in 1) can be produced by a condensation reaction using an arbitrary condensing agent with any carboxyl group of alginic acids.
  • DCC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • WSC ⁇ HCl benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate
  • BOP reagent bis ( 2-Oxo-3-oxazolidinyl) phosphinic chloride (BOP-Cl)
  • BOP-Cl 2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate
  • CIP 2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate
  • a condensing agent selected from 3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM), etc., tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, etc.
  • argylic acid does not precipitate.
  • a mixed solvent of water and a solvent selected from an ether solvent an alcohol solvent such as methanol, ethanol, 2-propanol, a polar solvent such as N, N-dimethylformamide, etc., sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, etc.
  • the chemically modified argylic acid derivative of the formula (I) is produced by carrying out a condensation reaction at a temperature between 0 ° C. and 50 ° C. in the presence or absence of an inorganic base of the above or an organic base such as triethylamine or pyridine. be able to.
  • the introduction rate of the amine of the formula (AM-1) or the formula (AM-2) is the property of the amine and the like.
  • the following shows a more specific method for producing an amine among the amines represented by the formula (AM-1) or the formula (AM-2).
  • protection and deprotection of protecting group P 1 and P 2 known methods described in the literature, for example, "Protective Groups in Organic Synthesis (Protective Groups in Organic Synthesis 4thEdition) first The protection / deprotection can be performed according to the deprotection method described in the textbook of "John Wiley & Sons, Greene et al.”, 4th edition, 2007.
  • the compound of formula (SM-1) [the compound of formula (SM-1) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and the compound of formula (RG-1) [formula (RG-).
  • the compound of 1) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and described in a method known in the literature, for example, "Carbohydrate Composers 169, p332-340, 2017" and the like.
  • the compound of the formula (SM-2) [the compound of the formula (SM-2) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and the formula (RG-2) [formula (RG-2).
  • the compound of is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], and a method known in the literature, for example, "European Journal of Organic Chemistry, 2014 (6), p1280-1286; According to the method described in "2014", etc.
  • the Mitsunobu reaction was carried out in the presence of (i) PPh 3 and N 2 (CO 2 CHMe 2 ) 2 solvents in a solvent not involved in the reaction such as tetrahydrofuran, followed by a Mitsunobu reaction.
  • a base such as sodium hydroxide
  • a solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, water, etc.
  • ⁇ Step 1> Compounds of formula (SM-B1) and compounds of formula (RB-B1-1) [Compounds of formula (SM-B1) and formula (RB-B1-1) are commercially available compounds or compounds of formula (RB-B1-1) by a production method known in the literature. A compound that can be produced] is used to produce a compound represented by the formula (IM-B1-1) by carrying out a reaction according to a method known in the literature, for example, a method described in US2009 / 0068738 and the like. ..
  • the compound of the formula (RB-B1-1) is referred to as the compound of the formula (RB-B2-1)
  • the compound of the formula (RB-B2-1) is known from commercially available compounds or commercially available compounds. It is a compound that can be produced by the production method]
  • the reaction is carried out according to the method described in [Production method B1] to produce an amine represented by the formula (AM-OL-2b) or a salt thereof. ..
  • the compound of the formula (SM-B3) and the compound of the formula (RB-B3-1) [The compound of the formula (SM-B3) and the formula (RB-B3-1) is a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. A compound that can be produced] is used to produce a compound represented by the formula (IM-B3-1) by carrying out a reaction according to a method known in the literature, for example, a method described in US2009 / 0068738 and the like. ..
  • the compound of the formula (RB-B3-1) is used as the compound of the formula (RB-B4-1) [the compound of the formula (RB-B4-1) is known from commercially available compounds or commercially available compounds. It is a compound that can be produced by the production method], and the reaction is carried out according to the method described in [Production method B3] to produce an amine represented by the formula (AM-OL-2d) or a salt thereof. ..
  • the compound of the formula (SM-B5) and the compound of the formula (RB-B5-1) [The compound of the formula (SM-B5) and the formula (RB-B5-1) is a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. It is a compound that can be produced], and the reaction is carried out according to a method known in the literature, for example, the method described in Journal of Organic Chemistry, 54 (23), pp5411-13, 1989, etc., according to the formula (IM). -The compound represented by B5-1) is produced.
  • ⁇ Step 3> Using the compound of formula (IM-B5-2), for example, according to the method described in Tetrahedron Letters, 55 (33), pp4576-4580, 2014, etc., bromine was added, and then tert-BuOK.
  • the compound represented by the formula (IM-B5-3) is produced by carrying out a dehydrogenation reaction using a base such as.
  • Step 4> With a compound of formula (IM-b5-3), after hydrolysis of the ester group, perform condensation reaction with a compound of formula (RG-7x), followed by the protecting group P 1 expression by deprotecting ( An amine represented by AM-OL-2e) or a salt thereof is produced.
  • the compound of the formula (RB-B5-1) is referred to as the compound of the formula (RB-B6-1)
  • the compound of the formula (RB-B6-1) is known from commercially available compounds or commercially available compounds. It is a compound that can be produced by the production method]
  • the reaction is carried out according to the method described in [Production method B5] to produce an amine represented by the formula (AM-OL-2f) or a salt thereof. ..
  • the compound of the formula (SM-1) and the compound of the formula (RG-4) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], known method, for example, "Journal of the American Chemical Society, 126 (46), p15046-15047, 2004 year” in accordance with the method described in such as, (i) AgClO 4 presence, participate in the reaction such as toluene Alkin groups are formed by substituting the compound of formula (RG-4) in a solvent not provided, and subsequently performing a debromination reaction using (ii) NaOMe, and (iii) lithium hydroxide, sodium hydroxide, etc.
  • the compound represented by the formula (IM-2) can be produced by hydrolyzing in a solvent that does not participate in the reaction such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, and water or a mixed solvent thereof in the presence of the base.
  • Compound of formula (SM-C1) and compound of formula (RG-C1-1) are from commercially available compounds or commercially available compounds. It is a compound that can be produced by a production method known in the literature], and a Grignard reaction is carried out according to a method known in the literature, for example, the method described in WO2004 / 035017, etc., followed by an oxidation reaction. The compound of the formula (IM-C1-1) is obtained.
  • Step 2> After protecting the carbonyl group of the compound of the formula (IM-C1-1) (for example, an acetal group, etc.), bromine is added to the cyclooctene ring, and debromination is performed using a base such as tert-BuOK. the reaction carried out, followed by deprotecting the protecting groups and protecting groups P 1 carbonyl group, an amine of the formula (AM-OL-3A1), or salt thereof.
  • Step 3> Amine of formula (AM-OL-3A1) or a salt thereof and a compound of formula (RG-C1-2) [The compound of formula (RG-C1-2) is a commercially available compound or a production known in the literature from a commercially available compound. with there] with a compound which can be produced by a process, performs a condensation reaction, by a protecting group P 1 deprotection, to produce an amine of formula (AM-OL-3A2), or a salt thereof.
  • the compound of the formula (SM-C1) is used as the compound of the formula (SM-C2)
  • the compound of the formula (SM-C2) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature. Is replaced with]
  • the reaction is carried out according to the method described in [Manufacturing method, Manufacturing method C1], whereby the amine represented by the formula (AM-OL-3B1) and the formula (AM-OL-3B2), Or manufacture the salt thereof.
  • the reaction was carried out by replacing the aldehyde used in ⁇ Step 1> of the above [Production Method C1] and [Production Method C2] with the aldehyde of the following formula [each aldehyde can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature]. By doing so, an amine having a corresponding linker, or a salt thereof, is produced.
  • the corresponding linker is carried out by replacing the compound used in ⁇ Step 1> of the above [Production Method C3] with a compound of the following formula [each compound can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature]. To produce an amine having, or a salt thereof.
  • SM-3 the compound of the formula (SM-3) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature
  • a method known in the literature for example, "Faming Zhunli” (I)
  • a base such as pyridine
  • H 2 NOH-HCl is reacted in a solvent not involved in the reaction such as ethanol to form an oxime according to the method described in "Shenqing, 1045299898, 22 Apr 2015” and the like.
  • the compound represented by the formula (IM-3) can be produced by reducing the amide group with a reducing agent such as BH 3 or LiAl H 4 in a solvent not involved in the above.
  • the compound of the formula (IM-4) and the compound of the formula (RG-7) obtained in (ii) of ⁇ Step 1> is a commercially available compound or a commercially available compound. It is a compound that can be produced by a known production method], and sodium hydroxide according to a method known in the literature, for example, the method described in "Synthesis, 46 (5), p669-677, 2014" and the like.
  • the compound represented by the formula (IM-5) can be produced by reacting in the presence of a base such as the above and an interphase transfer catalyst such as tetrabutylammonium bromide in a solvent not involved in the reaction such as toluene.
  • a base such as the above
  • an interphase transfer catalyst such as tetrabutylammonium bromide
  • SM-4 the compound of the formula (SM-4) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] a method known in the literature, for example, "Synthesis, (9), p1191-1194; 2002, etc., by adding bromine and then performing a debromination reaction using tert-BuOK to form an alkyne group.
  • IM-7 A compound represented by the formula (IM-7) can be produced.
  • SM-5 the compound of the formula (SM-5) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] a method known in the literature, for example, "US Patent.
  • P-nitrophenyl chloroformate is reacted in the presence / absence of a base such as pyridine in a solvent such as dichloromethane that is not involved in the reaction, according to the method described in "Application Publication No. 2013-0137861" and the like. This gives a carbonate compound.
  • the compound of the formula (RG-9) [the compound of the formula (RG-9) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature.
  • a carbamoyl compound can be obtained by reacting with].
  • the protecting group P 1 can be prepared amine represented by the formula (AM-OL-9), or a salt thereof.
  • a compound of the formula (SM-G2) [the compound of the formula (SM-G2) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], a method known in the literature, for example. , Angewandte Chemie, International Edition, 51 (17), p4112-4116, 2012, etc., by performing a Grignard reaction followed by an oxidation reaction, the formula (IM-G2-1).
  • formula (IM-G2-1) a protecting group P 1 of the compound of the deprotecting, to produce an amine of formula (AM-OL-9a), or a salt thereof.
  • the compound of the formula (SM-6) [the compound of the formula (SM-6) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and the compound of the formula (RG-10) [the compound of the formula (RG-RG-).
  • the compound of 10) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], and the same condensation reaction as the above [method for producing a chemically modified alginate derivative of formula (I)] is carried out.
  • Formula (IM-8) can be produced.
  • the compound of the formula (SM-7) [the compound of the formula (SM-7) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and the compound of the formula (RG-11) [the compound of the formula (RG-RG-).
  • the compound of 11) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], and a Mitsunobu reaction according to [Production Method B] ⁇ Step 1> is carried out, followed by sodium hydroxide and the like.
  • SM-8 the compound of the formula (SM-8) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], a method known in the literature, for example, "International publication”.
  • the compound of formula (IM-11) is obtained by adding bromine and then debrominating using LiN (i-Pr) 2 according to the method described in "Pamphlet No. 2009/067663” and the like. Can be manufactured.
  • ⁇ Step 1> Compounds of formula (SM-M) and compounds of formula (RG-M-1) [Compounds of formula (SM-M) and compounds of formula (RG-M-1) are manufactured from commercially available compounds or commercially known compounds.
  • a compound represented by the formula (IM-M-1) is produced by carrying out a condensation reaction similar to the above [Method for producing a chemically modified alginic acid derivative of the formula (I)] using [a compound that can be produced by the method]. be able to.
  • a carboxylic acid represented by the formula (SM-M) can be used in a method known in the literature, for example, "Experimental Chemistry Course 5th Edition 16, Carboxylic Acids and Derivatives, Acid Halides, Acid Anhydrous, pp. 99-118, According to the method described in “2007, Maruzen”, etc., it is converted to an acid halide or an acid anhydride, and the compound of the formula (RG-M-1) is used in the presence of a base such as triethylamine or pyridine.
  • a base such as triethylamine or pyridine.
  • Halogen-based solvents such as dichloromethane and chloroform
  • ether-based solvents such as diethyl ether and tetrahydrofuran
  • aromatic hydrocarbon-based solvents such as toluene and benzene
  • polar solvents such as N, N-dimethylformamide.
  • the compound of the formula (IM-M-1) can be similarly produced by reacting at a temperature at which the solvent refluxes from 0 ° C.
  • the compound of the formula (SM-R) [the compound of the formula (SM-R) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature] and the compound of the formula (RG-R-1) [formula ( The compound of RG-R-1) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], and the same condensation reaction as in the above [Production method M] ⁇ Step 1> is carried out.
  • a compound represented by the formula (IM-R-1) can be produced.
  • reaction is carried out using a solvent that does not participate in the reaction, such as a system solvent, or a mixed solvent thereof, or at a temperature at which the solvent returns from ⁇ 78 ° C., and the compound represented by the formula (IM-S-1). Can be manufactured.
  • bases such as ethylamine and pyridine
  • halogen-based solvents such as dichloromethane and chloroform
  • ether-based solvents such as diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane and 1,4-dioxane
  • aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene
  • a solvent that does not participate in the reaction such as a system solvent, or a mixed solvent thereof, or at a temperature at which the solvent returns from ⁇ 78 ° C., and the compound represented by the formula (IM-S-1). Can be manufactured.
  • E chlorine>
  • chlorinating agents hydrogen chloride / zinc chloride (HCl / ZnCl 2 ), hydrogen chloride / hexamethylphosphate triamide (HCl / HMPA), thionyl chloride (SOCl 2 ), carbon tetrachloride / triphenylphosphine (CCl 4 / PPh) 3 ), Triphosgen / Triphenylphosphine ((CCl 3 ) 2 CO / PPh 3 ), Triphosgen / N, N-dimethylformamide (POCl 3 / DMF) and other reagents to produce the desired chlorinated product. Can be done.
  • ⁇ In the case of X bromine>
  • a brominating agent 48% hydrobromic acid (48% HBr), 48% hydrobromic acid / sulfuric acid (48% HBr / H 2 SO 4 ), hydrogen bromide / lithium bromide (HBr / LiBr), odor.
  • a desired chlorinated product can be produced by using a reagent such as sodium bromide / sulfuric acid (NaBr / H 2 SO 4 ) and phosphorus tribromide (PBr 3).
  • PBr 3 phosphorus tribromide
  • a carboxylic acid represented by the formula (SM-M) can be used in a method known in the literature, for example, "Experimental Chemistry Course 5th Edition 16, Carboxylic Acids and Derivatives, Acid Halides, Acid Anhydrous, p. 99-118, According to the method described in “2007, Maruzen”, etc., it is converted to an acid halide or an acid anhydride, and the compound of the formula (RG-T-1) is used in the presence of a base such as triethylamine or pyridine.
  • a base such as triethylamine or pyridine.
  • Halogen-based solvents such as dichloromethane and chloroform
  • ether-based solvents such as diethyl ether and tetrahydrofuran
  • aromatic hydrocarbon-based solvents such as toluene and benzene
  • polar solvents such as N, N-dimethylformamide.
  • the compound of the formula (IM-T-1) can be similarly produced by reacting at a temperature at which the solvent refluxes from 0 ° C.
  • ⁇ Process 2> [Production Method T] Using the compound of the formula (IM-T-1) obtained in ⁇ Step 1>, a method known in the literature, for example, "Protective Groups in Organic" by Greene et al.
  • the compound of the formula (SM-B1) and the compound of the formula (RG-B1) [The compound of the formula (SM-B1) and the compound of the formula (RG-B1) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. a compound] with the [equation performs the same condensation reaction as in Production method] chemically modified alginic acid derivative of (I), followed by the protecting group P 1 expression by deprotecting (AM-1-B1)
  • the amine represented by, or a salt thereof can be produced.
  • the compound of the formula (SM-B2a) and the compound of the formula (RG-B2a) [The compound of the formula (SM-B2a) and the compound of the formula (RG-B2b) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. It is a compound] and can be reacted in the same manner as in [Production Method AM-A] to produce an amine represented by the formula (AM-1-B2a) or a salt thereof.
  • the compound of the formula (SM-B2b) and the compound of the formula (RG-B2b) [the compound of the formula (SM-B2b) and the compound of the formula (RG-B2b) are manufactured from commercially available compounds or commercially known compounds.
  • an amine represented by the formula (AM-1-B2b) or a salt thereof can be produced.
  • the reaction is carried out according to the above synthesis scheme (The reaction of each step is based on the reaction described in [Production Method AM-A]), the amine represented by the formula (AM-1-B3), or a salt thereof can be produced.
  • the compounds of the formula (RG-B3), the formula (RG-B3-1), and the formula (RG-B3-2) are commercially available compounds or compounds that can be produced from commercially available compounds by a production method known in the literature.
  • the reaction of each step conforms to the reaction described in [Production method AM-A]
  • it is represented by the formulas (AM-1-B6a) and (AM-1-B6b).
  • Amine, or a salt thereof can be produced.
  • the compounds of the formula (SM-B6a), the formula (RG-B6a), the formula (SM-B6b), and the formula (RG-B6b) are commercially available compounds or compounds that can be produced from commercially available compounds by a production method known in the literature. Is.
  • the reaction in each step conforms to the reaction described in [Production Method AM-A]
  • the amine represented by the formula (AM-1-B10) or a salt thereof is produced.
  • the compounds of the formula (SM-B10), the formula (RG-B10), the formula (RG-B10-1), and the formula (RG-B10-2) are commercially available compounds or production methods known in the literature from commercially available compounds. It is a compound that can be produced by.
  • the compound of the formula (SM-B4) and the compound of the formula (RG-B4a) [The compound of the formula (SM-B4) and the compound of the formula (RG-B4a) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. Using a compound], according to a method known in the literature, for example, the method described in "Journal of the American Chemical Society, 126 (46), p15046-15547, 2004", etc., ⁇ Step 1a> Trifluo A compound of the formula (IM-B4a-1) was obtained by reacting in a solvent not involved in the reaction of toluene, dichloromethane, etc.
  • the reaction of each step conforms to the reaction described in [Production method AM-A]
  • it is represented by the formulas (AM-1-B8a) and (AM-1-B8b).
  • Amine, or a salt thereof can be produced.
  • the formula (SM-B8a) or the formula (SM-B8b) is a commercially available compound or a compound that can be produced according to the reaction described in [Production Method AM-G], and is the formula (RG-B8a) or The compound of the formula (RG-B8b) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature.
  • the compound of the formula (SM-B7) and the compound of the formula (RG-B7) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature.
  • a compound] with the [equation performs the same condensation reaction as in Production method] chemically modified alginic acid derivative of (I), followed by the protecting group P 1 expression by deprotecting (AM-1-B7) It can be produced as an amine represented by, or a salt thereof.
  • Compounds of formula (SM-B7) and compounds of formula (RG-B7-2) are manufactured from commercially available compounds or commercially known compounds. with a compound which can be produced by the method, the [performing the same condensation reaction with alginic acid derivative production method] of the formula (I) ( ⁇ step 1> and ⁇ step 2>), followed by protecting group P 1 After deprotection, a condensation reaction similar to the above ⁇ Step 1> is carried out using a compound of the formula (RG-B7-3) (a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature). It was carried out, followed by the protecting group P 1 amine represented by the formula (AM-1-B7) by deprotecting, or can be prepared as a salt thereof.
  • a compound of the formula (RG-B7-3) a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature. It was carried out, followed by the protecting group P 1 amine
  • the reaction of each step conforms to the reaction described in [Production Method AM-J]
  • the reaction of each step conforms to the reaction described in [Production Method AM-J]
  • the reaction of each step conforms to the reaction described in [Production Method AM-J]
  • Amine or a salt thereof can be produced.
  • the compound of formula (SM-B7), formula (RG-B9a) or formula (RG-B9b) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature.
  • a compound of the formula (SM-Z1) [the compound of the formula (SM-Z1) is a commercially available compound or a compound that can be produced from a commercially available compound by a production method known in the literature], a method known in the literature, for example, "Organometallics, 29 (23), p6619-6622; according to the method described in 2010 "or the like, in a solvent which does not participate in the reaction such as dimethyl sulfoxide, after the introduction of the azide group was reacted with NaN 3, the protecting group P 1 By deprotecting, an amine represented by the formula (AM-2-Z1) or a salt thereof can be produced.
  • the amine represented by the formula (AM-2-Z1) or a salt thereof may be available as a commercially available compound.
  • the compound of the formula (SM-Z2a) or the compound of the formula (SM-Z2b) [The compound of the formula (SM-Z2a) and the compound of the formula (SM-Z2b) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. with there] with compound [in the same manner as in production method AM-L], after introducing an azide group was reacted with NaN 3, wherein by deprotecting the protecting group P 1 (AM-2-Z2a ) Alternatively, an amine represented by the formula (AM-2-Z2b) or a salt thereof can be produced.
  • the amine represented by the formula (AM-2-Z2a) or the formula (AM-2-Z2b), or a salt thereof may be available as a commercially available compound.
  • the compound of the formula (SM-Z3) and the compound of the formula (RG-Z3) [The compound of the formula (SM-Z3) and the compound of the formula (RG-Z3) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. a compound] with the [equation performs the same condensation reaction as in Production method] chemically modified alginic acid derivative of (I), followed by the protecting group P 1 expression by deprotecting (AM-2-Z3) The amine represented by, or a salt thereof can be produced.
  • the compound of the formula (SM-Z4) and the compound of the formula (RG-Z4) [The compound of the formula (SM-Z4) and the compound of the formula (RG-Z4) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. using the compounds of there] with compound, the same condensation reaction with the [preparation of chemically modified alginic acid derivative of formula (I)], followed by expression by a protecting group P 1 deprotection (AM-2- The amine represented by Z4) or a salt thereof can be produced.
  • the compound of the formula (SM-Z5a) and the compound of the formula (RG-Z5a) can be produced from a commercially available compound or a commercially available compound by a production method known in the literature. By reacting with a compound such as sodium hydride, potassium carbonate, etc. in the presence of a base such as tetrahydrofuran, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide, etc. in a solvent not involved in the reaction. , A compound having a side chain introduced is obtained.
  • the protective group P 1 is deprotected, it can be prepared amine represented by the formula (AM-2-Z5a), or a salt thereof.
  • the compound of the formula (SM-Z5b) and the compound of the formula (RG-Z5b) [the compound of the formula (SM-Z5b) and the compound of the formula (RG-Z5b) are manufactured from commercially available compounds or commercially known compounds. By carrying out the same reaction using [a compound that can be produced by the method], the amine represented by the formula (AM-2-Z5b) or a salt thereof can be produced.
  • Formula (AM-2-Z6a), Formula (AM-2-Z6b), Formula (AM-2-Z7a), Formula (AM-2-Z7b), Formula (AM-2-Z8a), Formula (AM-2) -Z8b), the amino compounds represented by the formulas (AM-2-Z9a), and the formula (AM-2-Z9b), or salts thereof, are described in the above-mentioned [Manufacturing method AM-A] to [Manufacturing method AM-P]. According to the above, it can be manufactured by the manufacturing method shown in the following scheme.
  • the amine represented by the formula (AM-1) or the formula (AM-2) is a pharmaceutically acceptable salt (for example, an acid addition salt).
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and examples thereof include a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and a salt with an acidic amino acid.
  • Preferable examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, enanthic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, lactic acid, sorbic acid, etc.
  • Salts with aliphatic monocarboxylic acids such as mandelic acid
  • salts with aliphatic dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, tartaric acid, and aliphatic tricarboxylic acids such as citric acid.
  • Salts with acids salts with aromatic monocarboxylic acids such as benzoic acid and salicylic acid, salts of aromatic dicarboxylic acids such as phthalic acid, cinnamic acid, glycolic acid, pyruvate, oxylic acid, salicylic acid, N-acetylcysteine, etc.
  • examples thereof include salts with organic carboxylic acids, salts with organic sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid, and acid addition salts with acidic amino acids such as aspartic acid and glutamate.
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. Of these, pharmaceutically acceptable salts are preferable.
  • the salt is separated and collected by filtration according to a conventional method, for example, by mixing a solution containing an appropriate amount of acid or base with the compound of the present invention to form a desired salt, or distilling off the mixed solvent.
  • a solution containing an appropriate amount of acid or base with the compound of the present invention to form a desired salt, or distilling off the mixed solvent.
  • the amine represented by the formula (AM-1) or the formula (AM-2) (including the formulas lower than each formula) or a salt thereof is a solvate with a solvent such as water, ethanol or glycerol. Can be formed.
  • variable substituent when a cyclic substituent is substituted with a variable substituent, it means that the variable substituent is not bonded to a specific carbon atom of the cyclic group.
  • the variable substituent Rs in the following formula A means that it can be substituted with any of the carbon atoms i, ii, iii, iv or v in the formula A.
  • the configuration of the carbon substituted by the R 1 group is the S form (L1-8a-MS) and the configuration of the carbon substituted by the benzyl group is the R form (L1-).
  • 8a-MR (In any equation, both outer sides of the broken line are not included): It means that the linker represented by is included.
  • ordinary optical resolution means from the racemic body.
  • step of synthesizing the formula (AM-1) or the formula (AM-2) which is an amine derivative corresponding to the formula (I) which can be separated into each optically active substance by the (separation method).
  • Cross-linked alginate gels are either (i) cross-linked via a divalent metal ionic bond, (ii) cross-linked via a chemical bond, or (iii) via both a divalent metal ionic bond and a chemical bond. Some have crosslinks.
  • the crosslinked alginate gels of some embodiments provided herein are chemically crosslinked by a triazole ring formed by performing a Huisgen reaction (crosslinking reaction) as a crosslink and / or a divalent metal ion (eg, calcium ion). It is a crosslinked alginate gel containing an ion crosslink formed by coexisting with the above. Further, the crosslinked alginate gel of some embodiments is a crosslinked alginate gel containing a chemical crosslink by a triazole ring formed by carrying out a Huisgen reaction (crosslinking reaction) as a crosslink.
  • the crosslinked alginic acid gel is chemically formed between the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II) by using the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II). It is obtained by carrying out a Huisgen reaction (crosslinking reaction) that forms a crosslink.
  • the alginic acid derivative of the formula (I) and / or the alginic acid derivative of the formula (II) is obtained by forming an ion bridge between each derivative of the derivative.
  • the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II) are used to carry out a Huisgen reaction (cross-linking reaction), and chemistry is performed between the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II).
  • forming a crosslink or “performing a cross-linking reaction” means that a Huisgen reaction is carried out using the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II).
  • a chemical crosslink is formed between the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II), or the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (II).
  • an ionic crosslink (ion bond) is formed between the alginic acid derivative of the formula (I) and / or the alginic acid derivative of the formula (II), or the Huisgen reaction. It means that both chemical cross-linking by and ionic cross-linking by divalent metal ions are formed.
  • the time for forming the ion-crosslinked alginate gel by contact with the divalent metal ion is, for example, instantaneous (for example, 1 to 5 seconds) to several hours (for example, 1 to 3 hours).
  • the time for forming a chemically crosslinked alginate gel by advancing the Huisugen reaction is, for example, several seconds to 24 hours, several seconds to 12 hours, or several seconds to 30 minutes.
  • the divalent metal ion used to obtain the alginate gel is not particularly limited, and examples thereof include calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion, zinc ion and the like, and calcium ion or barium ion is preferable. Yes, more preferably calcium ions.
  • the solution containing divalent metal ions is not particularly limited, but for example, a solution containing calcium ions (for example, an aqueous solution containing a calcium chloride aqueous solution, a calcium carbonate aqueous solution, a calcium gluconate aqueous solution, etc.) and a solution containing barium ions (for example).
  • a solution containing calcium ions for example, an aqueous solution containing a calcium chloride aqueous solution, a calcium carbonate aqueous solution, a calcium gluconate aqueous solution, etc.
  • a solution containing barium ions for example.
  • An aqueous solution such as a barium chloride aqueous solution
  • a calcium chloride aqueous solution is preferable.
  • the divalent metal ion concentration (for example, calcium ion or barium ion concentration) of the solution containing the divalent metal ion is not particularly limited, but is, for example, in the range of 1 mM to 1 M, or more preferably in the range of 5 mM to 500 mM. It is 20 mM to 100 mM.
  • the solvent used when preparing the solution of the chemically modified alginate derivative represented by the formulas (I) and (II), the solvent used when preparing the solution containing divalent metal ions, and the like is not particularly limited. Independently, for example, tap water, pure water (for example, distilled water, ion-exchanged water, RO water, RO-EDI water, etc.), ultrapure water (MilliQ water), solvent (that is, cell culture medium (that is, cell culture medium). Alternatively, the culture solution)), phosphate buffered physiological saline (PBS), physiological saline and the like can be mentioned, and ultrapure water is preferable.
  • tap water pure water (for example, distilled water, ion-exchanged water, RO water, RO-EDI water, etc.), ultrapure water (MilliQ water), solvent (that is, cell culture medium (that is, cell culture medium).
  • the culture solution) phosphate buffered physiological saline (PBS), physiological saline and
  • the cross-linked alginate gel via a divalent metal ionic bond is obtained by proceeding the reaction at an ultra-high speed and is reversible, whereas the cross-linked alginate gel via a chemical bond has relatively mild conditions. The reaction proceeds slowly and is irreversible.
  • the physical characteristics of the crosslinked alginate gel include, for example, changing the concentration of the aqueous solution containing the divalent metal ion to be used (for example, calcium chloride aqueous solution) or the introduction rate of the reactive group introduced into the chemically modified alginic acid derivative. The method can be adjusted.
  • a high machine can be obtained by adjusting the concentration of the aqueous solution containing the divalent metal ion to be used, or by adjusting the introduction rate of the reactive group introduced into the chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II). It is possible to produce a desired crosslinked alginate gel having a target strength, for example, a desired chemically crosslinked alginate gel fiber having a higher mechanical strength than the core layer.
  • a chemically cross-linked alginate gel fiber (alginic acid structure).
  • a fibrous structure can be instantly formed from a mixed solution of chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) by an ionic cross-linking reaction, and the structure of the structure is strengthened (for example, for a long period of time).
  • a cross-linking reaction by chemical bonding (Huisugen reaction in the case of the present invention) for the purpose of obtaining stability, etc.).
  • the crosslinked alginic acid gel of a certain aspect can be obtained by mixing the alginic acid derivatives of the formula (I) and the formula (II) and carrying out the Huisgen reaction.
  • a cross-linked alginate gel of a certain aspect forms a three-dimensional network structure via a chemical cross-link (cross-linking by a triazole ring formed from an alkyne group and an azide group).
  • a preferred alginic acid derivative is one in which the stability of the crosslinked alginate gel after cross-linking is improved.
  • the cross-linked alginate gel of some embodiments has the following formula (III-L): [In formula (III-L), -CONH- and -NHCO- at both ends represent amide bonds via any carboxyl group of alginic acid; -L 1- , -L 2- , and X are the above-mentioned embodiments. It is a crosslinked alginate gel crosslinked via a group represented by [same as the definition of [1-12]].
  • the mixing ratio of the alginic acid derivative of the formula (I) to the alginic acid derivative of the formula (II) in preparing the crosslinked alginic acid gel is the mixture ratio of the derivative of the formula (I) and the derivative of the formula (II).
  • weight ratio for example, 1: 1.0 to 4.0, or 1: 1.0 to 3.0, or 1: 1.0 to 2.0, or 1: 1.0 to 1.5, Or 1: 1; preferably 1: 1.0 to 3.0.
  • the mixing ratio of the alginic acid derivative of the formula (II) to the alginic acid derivative of the formula (I) in preparing the crosslinked alginic acid gel is the mixture of the derivative of the formula (II) and the derivative of the formula (I).
  • weight ratio for example, 1: 1.0 to 4.0, or 1: 1.0 to 3.0, or 1: 1.0 to 2.0, or 1: 1.0 to 1.5, Or 1: 1.
  • the mixing ratio of the alginic acid derivative of the formula (I) to the alginic acid derivative of the formula (II) in preparing the crosslinked alginic acid gel is more preferably the alginic acid derivative of the formula (I) and the alginic acid derivative of the formula (I).
  • the introduction rate (mol%) ratio of the reactive group of the alginic acid derivative of II for example, 1: 1.0 to 4.0, or 1: 1.0 to 3.0, or 1: 1.0 to It is 2.0, or 1: 1.0 to 1.5, or 1: 1; preferably 1: 1.0 to 3.0.
  • the mixing ratio of the alginic acid derivative of the formula (II) to the alginic acid derivative of the formula (I) in preparing the crosslinked alginic acid gel is more preferably the alginic acid derivative of the formula (II) and the alginic acid derivative of the formula (II).
  • the introduction rate (mol%) ratio of the reactive group of the alginic acid derivative of I for example, 1: 1.0 to 4.0, or 1: 1.0 to 3.0, or 1: 1.0 to 2.0, or 1: 1.0 to 1.5, or 1: 1.
  • the crosslinked alginate gel does not need to have all the carboxyl groups of the constituent units of alginic acid having the crosslink of the above formula (III-L).
  • the introduction rate (also referred to as the cross-linking rate) of the cross-linking represented by the above formula (III-L) in the cross-linked alginic acid is, for example, about 0.1 to about 80%, about 0.3 to about 60%, and about 0.5. It ranges from about 30%, or about 1.0 to about 10%.
  • the concentration of the alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II) in the Huisgen reaction for obtaining a crosslinked alginate gel is usually about 1 to 500 mg / mL, preferably in the range of about 5 to 100 mg / mL. is there.
  • the reaction temperature of the Huisgen reaction (the temperature at which the chemically crosslinked alginate gel fiber is produced) is usually an outside temperature of about 4 to about 60 ° C, preferably an outside temperature of about 15 to about 37 ° C.
  • the "chemically bridged alginate gel fiber” is obtained by forming a bridge between the two alginic acid derivatives using the core layer and the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II). It means a fibrous (fibrous) structure composed of a shell layer containing a crosslinked alginate gel.
  • FIG. 1 shows a cross-sectional view of an example of a chemically crosslinked alginate gel fiber formed as a fiber having a core-shell structure.
  • This chemically crosslinked alginate gel fiber has an outer diameter of c, includes a core layer 5 having a diameter a and a shell layer 4 having a thickness b, and the core layer 5 contains an antibody-producing cell 6 and a substrate.
  • the shell layer 4 contains a crosslinked alginate gel formed by carrying out a crosslinking reaction using chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • the base material contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber and the base material constituting the shell layer that is, the chemically modified alginate derivative represented by the formula (I) or the formula (II), the formula (I) and the formula
  • the crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivative represented by (II) may be a different base material or the same base material. good.
  • a core layer containing antibody-producing cells, collagen (solvent or gel), cell culture medium (or culture solution), or alginate (solution or gel) is represented by formula (I).
  • the base material contained and the base material constituting the shell layer are different.
  • the “chemically crosslinked alginate gel fiber” has the above-mentioned core-shell structure (hollow partial structure passing through the central axis), and the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, about 0.2 ⁇ m to 2000 ⁇ m (however, the outside). Since the diameter is not limited to the diameter) and is a fibrous structure, it may be referred to as “chemically crosslinked alginate hollow microfiber" here.
  • the cross-sectional shape of the chemically crosslinked alginate gel fiber in the direction perpendicular to the central axis may be various shapes such as a circular shape, an elliptical system, or a polygonal shape (for example, a quadrangle, a pentagon, etc.), and is preferably shown in FIG. It has a circular cross-sectional shape as shown.
  • the diameter of the core layer (hollow portion) of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, about 100 to 400 ⁇ m.
  • the thickness of the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber can be determined by "(outer diameter of alginate gel fiber-diameter of core layer) / 2" for the thickness of the shell layer.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber is such that the outer diameter of the alginate gel fiber is in the range of about 300 ⁇ m to about 750 ⁇ m, and the diameter of the core layer of the alginate gel fiber is in the range of about 100 ⁇ m to about 400 ⁇ m.
  • the diameter of the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, about 100 ⁇ m
  • the outer diameter of the alginate gel fiber is, for example, about 300 ⁇ m.
  • the thickness of the shell layer is, for example, about 100 ⁇ m.
  • the diameter of the core layer (hollow portion) of the chemically crosslinked gelate alginate gel fiber, the inner diameter of the shell layer, and the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber are, for example, measured values from an image obtained by a retardation optical microscope, and the chemistry thereof. It is expressed as the average value of the measured values at several points of the crosslinked alginate gel fiber.
  • the core layer and shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber usually have a substantially uniform thickness, and preferably each layer has a thickness uniformity within the range of ⁇ 5%.
  • the length of the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, about 2 to about 50 m.
  • the base material forming the core layer is not particularly limited as long as it does not have cytotoxicity, but for example, hydrogel or the like, such as a collagen solution or collagen.
  • a base material selected from the group consisting of a solution, a gel of a chemically modified alginic acid derivative represented by the formula (I) or the formula (II) according to the above aspect [1], a mixture thereof, or the like; preferably collagen.
  • a substrate selected from the group consisting of solution, collagen gel, medium (or culture solution), methyl cellulose, alginate solution (sodium alginate solution), or alginate gel; more preferably medium (or culture solution), alginate solution.
  • the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber of some embodiments is formed from a solution in which antibody-producing cells are contained in the base material and the whole is made into a solution having an appropriate concentration.
  • a sodium alginate solution it is, for example, about 0.1 to about 2.0% by mass (w / w%) or (w / v%) solution, preferably about 1.5% by mass (w). / W%) or (w / v%) solution; when using a collagen solution, for example, about 0.1 to about 2.0% by weight (w / w%) or (w / v%) solution. , Preferably about 0.2 to about 1.5 (w / w%) or (w / v%) solution.
  • the solvent used for the base material of the core layer is also not particularly limited, and for example, a cell culture medium (or culture medium), a medium containing sodium alginate, an isotonic buffer solution, a phosphate buffered saline solution (PBS), and physiological saline are used. Examples thereof include water, and a medium containing sodium alginate or an isotonic buffer solution is preferable.
  • the cell culture medium a commercially available medium base material, a prepared medium, or a self-made medium can be used. It is also possible to use a natural medium (for example, a soybean-casein digest medium (SCD medium) or the like) or a synthetic medium (a medium in which all the various nutrients necessary for growth are supplemented with chemicals).
  • the medium is not particularly limited, but may be a basal medium containing components necessary for cell survival and proliferation (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins, etc.).
  • DMEM Minimum Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • Dulvecco's Modified Eagle's Medium Natural MixMedium (MentureMedium) Glasgo MEM
  • G016 medium DMEM (High Glucose) and the like
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • Dulvecco's Modified Eagle's Medium Natural MixMedium (MentureMedium) Glasgo MEM
  • G016 medium G016 medium
  • DMEM High Glucose
  • the medium may further contain serum.
  • the serum is not particularly limited, and examples thereof include FBS / FCS (Fetal Bovine / Calf Serum), NCS (Newborn Calf Serum), CS (Calf Serum), HS (Horse Serum), and the like.
  • the concentration of serum contained in the medium is, for example, 2% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the antibody-producing cells that can be contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber are cultured cells transformed with an antibody expression vector, and the cultured cells are not particularly limited, but for example, CHO cells, etc. CHO cell substrain, COS cell, Sp2 / 0 cell, NS0 cell, SP2 cell, PERC6 cell, YB2 / 0 cell, YE2 / 0 cell, 1R983F cell, Namalwa cell, Will-2 cell, Jurkat cell, Vero cell, Molt -4 cells, HEK293 cells, BHK cells, KGH6 cells, P3X63Ag8.653 cells, C127 cells, JC cells, LA7 cells, ZR-45-30 cells, hTERT cells, NM2C5 cells, UACC-812 cells, etc. (these cells) Can be appropriately selected from (some of which are listed in the ATCC cell lineage catalog available from the American Type Culture Collection).
  • the antibody-producing cells that can be contained in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber are preferably CHO cells, CHO cell substrains, COS cells, Sp2 / 0 cells, NS0 cells, and SP2 cells transformed with an antibody expression vector. , Or PERC6 cells, more preferably CHO cells transformed with an antibody expression vector, Sp2 / 0 cells, or NS0, and even more preferably CHO cells.
  • the antibody-producing CHO cells that can be contained in the core layer of the chemically cross-linked alginate gel fiber are not particularly limited, but for example, muromonab-CD3-producing CHO cells, trussumab-producing CHO cells, and rituximab-producing cells.
  • CHO cells paribismab-producing CHO cells, infliximab-producing CHO cells, baciliximab-producing CHO cells, tosirizumab-producing CHO cells, gemtuzumab ozogamicin-producing CHO cells, bebashizumab-producing CHO cells, ibritsumomab thiuxetan-producing CHO cells, adalimumab-producing CHO cells, adalimumab-producing CHO cells Ranibizumab-producing CHO cells, Omarizumab-producing CHO cells, Ecrizumab-producing CHO cells, Panitumumab-producing CHO cells, Ustequinumab-producing CHO cells, Golimumab-producing CHO cells, Kanakinumab-producing CHO cells, Denosumab-producing CHO cells, Mogamurizumab-producing CHO cells, Celltrizumab-producing CHO cells, Celltrizumab-producing CHO cells, Cell
  • antibody-producing CHO cells that can be contained in the core layer of chemically cross-linked alginate gel fiber, more preferably, trussumab-producing CHO cells, rituximab-producing CHO cells, infliximab-producing CHO cells, tosirizumab-producing CHO cells, and adalimumab-producing CHO cells selected from the group consisting of CHO cells and nivolumab-producing CHO cells, more preferably tosirizumab-producing CHO cells.
  • the shell layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is crosslinked by forming a crosslink between the two alginate derivatives using a crosslinked alginate gel (for example, a chemically modified alginate derivative represented by the formulas (I) and (II)).
  • a crosslinked alginate gel for example, a chemically modified alginate derivative represented by the formulas (I) and (II)
  • Alginate gel is included.
  • the cross-linked alginate gel may be a gel having higher or equivalent mechanical strength as compared with the core layer containing the antibody-producing cells to be coated, and preferably, the cross-linked alginate gel is a coated antibody. It is a gel having higher mechanical strength than the core layer containing producing cells. Further, it has sufficient permeability to components such as a culture solution (nutrient source) and oxygen existing outside the chemically crosslinked alginate gel fiber during culturing.
  • the tensile strength, load strength, etc. can be measured by a method using a tensile tester in water or the like according to a method well known to those skilled in the art.
  • Biological components and non-biological components can be added to the crosslinked alginate gel as needed.
  • the crosslinked alginate gel of some aspects provided here is a crosslinked alginate gel that gels by an external stimulus.
  • the external stimulus include, but are not limited to, addition of divalent metal ions (addition of a solution containing divalent metal ions), enzyme treatment, pH fluctuation, heating, UV irradiation, irradiation, and the like. It is preferably a divalent metal ion.
  • the divalent metal ion is not particularly limited, and examples thereof include calcium ion, magnesium ion, barium ion, strontium ion, zinc ion and the like, preferably calcium ion or barium ion, and more preferably calcium ion. is there.
  • the solution containing calcium ions or barium ions is not particularly limited, and examples thereof include aqueous solutions such as an aqueous solution of calcium chloride, an aqueous solution of calcium carbonate, an aqueous solution of calcium gluconate, and an aqueous solution of barium chloride, and an aqueous solution of calcium chloride is preferable. ..
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber means that, in some embodiments, the crosslinked alginate gel in the shell layer is chemically crosslinked by a triazole ring formed as a crosslink by the Huisgen reaction, and a divalent metal ion (for example, calcium). It is a gel fiber which is a crosslinked alginate gel containing an ion crosslink partially formed by ions, etc.), and in some embodiments, a triazole formed by a Huisgen reaction as a crosslinked alginate gel in the shell layer. It is a gel fiber which is a crosslinked alginate gel containing a chemical crosslink by a ring.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber can be infiltrated into the culture solution and started culturing at an early stage after the gel fiber is formed. More preferably, it is possible to provide a gel fiber having a large core layer diameter without necrosis of antibody-producing cells contained in the core layer. That is, the chemically crosslinked alginate gel fiber can easily obtain a chemically crosslinked alginate gel fiber having a core layer containing a certain number of antibody-producing cells.
  • the shell layer may be crushed or broken at the stage of covering the core layer due to insufficient mechanical strength.
  • the present inventors used chemically modified alginic acid derivatives represented by the above formulas (I) and (II) in the shell layer covering the core layer, and used divalent metal ions (for example, calcium ions) and Huisgen.
  • divalent metal ions for example, calcium ions
  • Huisgen used divalent metal ions (for example, calcium ions) and Huisgen.
  • the crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) forming a shell layer is a core layer. It is a cross-linked alginate gel with higher mechanical strength.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the base material is subjected to the above-mentioned both alginates by using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) having high mechanical strength.
  • It is a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between derivatives.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber is referred to as "the core layer containing the antibody-producing cells and the base material, using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II). It may also be referred to as "chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between them".
  • the "chemically cross-linked alginate gel fiber having a higher mechanical strength than the core layer” is a base material (for example, collagen solution, collagen) that forms a core layer to be coated on the shell layer of the chemically cross-linked alginate gel fiber.
  • a gel having the same or higher mechanical strength eg, alginate gel, agarose gel, but not limited to these
  • the shell layer is crushed at the stage of coating the core layer. It means an alginate gel that is less likely to break or break.
  • the gel that forms the shell layer is preferably an alginate gel having the property of gelling in the presence of divalent metal ions such as calcium ions and further gelling by a chemical reaction (for example, formulas (I) and (II)).
  • a crosslinked alginate gel obtained by forming a bridge between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivative represented by (2), and a crosslinked alginate gel having an ion crosslinked by a divalent metal ion and a chemical crosslinked by a Huisgen reaction). Therefore, a chemically crosslinked gelate alginate gel fiber having a higher mechanical strength than the core layer can also be obtained.
  • the mechanical strength of the gel the tensile strength, load strength and the like can be measured by a method of using a tensile tester in water or the like according to a method well known to those skilled in the art.
  • the chemically cross-linked alginate gel fiber is a cross-linked alginate gel obtained by forming a bridge between the two alginic acid derivatives using an alginate gel at both ends or a chemically modified alginic acid derivative represented by the formulas (I) and (II). It may be a gel fiber sealed with or the like. By sealing both ends of the gel fiber, it is possible to prevent the core layer from leaking out of the chemically crosslinked alginate gel fiber during the culture period.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber includes the case where it is formed as a fiber having a core-shell structure by two different types of gels, and the case where it has a multiple structure.
  • the coating of the shell layer may also be a coating composed of a multilayer coating, and for example, two or more coatings may be formed by two or more types of shell layers having different strengths.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate is obtained by forming a bridge between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • a method for producing a chemically cross-linked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a cross-linked alginate gel, which comprises using, for example, the microfluidic apparatus shown in FIG. 2 or FIG. 3 is provided.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate is obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • a method for producing a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing a crosslinked alginate gel will be described.
  • the method for producing the chemically crosslinked alginate gel fiber is not particularly limited, but for example, it is carried out using the microfluidic apparatus shown in FIG. 2 or FIG.
  • the microfluidic device here is a device preferably used for producing a chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • the microfluidic device is, for example, a device for creating a fine flow path having three inlets and one outlet, and has a first liquid at the first inlet and a second liquid at the second inlet. And when the third liquid is flowed through the third inlet at an appropriate speed, the first liquid and the second liquid are used in the flow path where the first liquid and the second liquid intersect and become one. In the flow path where the liquids do not mix and a two-layer clean laminar flow is formed, and the three liquids intersect with the third liquid downstream to form a single flow, the first liquid and the second liquid are formed. And the third liquid do not mix, resulting in a three-layer clean laminar flow. Examples of the microfluidic device include a dual coaxial microfluidic device 10 as shown in FIG.
  • the microfluidic device is a device for creating a fine flow path having two inlets and one outlet, and a first liquid is suitable for the first inlet and a second liquid is suitable for the second inlet. When flowed at a high speed, the first liquid and the second liquid do not mix, resulting in a two-layer clean laminar flow.
  • the microfluidic device include a T-shaped microfluidic device XX as shown in FIG.
  • the microfluidic device 10 capable of injecting two fluids separately into a core portion and a shell portion so as to be coaxial is described in, for example, Wonje Jong, et al. , Hydrodynamic microfabrication via "on the fly” photopolymation of microscale fibers and tubes, Lab Chip, 2004, 4, p576-580 1. Or, for example, those specifically described in FIG. 1 or FIG. 2 of JP-A-2016-77229 (applicant: National University Corporation, The University of Tokyo) can be mentioned. In some embodiments, alginate gel fibers can be produced under similar fabrication conditions using the specific examples of the microfluidic apparatus 10 described herein or similar apparatus.
  • the microfluidic device 10 is provided at the introduction pipe 40, the introduction port 1 of the introduction pipe 40, the introduction port 2 of the introduction pipe 40 located downstream of the introduction port 1, and the downstream of the introduction port 2. It includes an introduction port 3 of the introduction pipe 40 located and an outlet 50 of the introduction pipe 40 located downstream of the introduction port 2.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating one aspect of the manufacturing process of the chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • a production method using a sodium alginate solution as the base material of the core layer and a mixed solution of the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) as the base material of the shell portion will be described.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber can be produced, for example, by a method including the following steps (1) to (4).
  • the shell layer 4 contains a crosslinked alginate gel composed of a calcium crosslink and a chemical crosslink formed by the Huisgen reaction, and the core layer 5 contains antibody-producing cells.
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber 20 containing 6 and a base material can be produced.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber obtained by the above method may be heated at, for example, about 37 ° C. for several minutes (for example, 2 to 5 minutes) to about 1 hour, for example, antibody-producing cells in the core layer 5.
  • the base material containing 6 is a collagen solution, it can be gelled.
  • the microfluidic device XX (hereinafter, also referred to as T-shaped fluid device XX) includes the introduction port 1 of the introduction pipe AA and the introduction pipe AA, the introduction port 2 of the introduction pipe BB and the introduction pipe BB, and the introduction. It includes a discharge pipe CC located downstream of the pipe AA and the introduction pipe BB, an outlet 3 thereof, and caps Cap1 to Cap3. Further, as a container for receiving the fibrous material discharged from the discharge pipe CC, a container DD such as a beaker containing a solution containing divalent metal ions is used.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating one aspect of the manufacturing process of the chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • a production method using a sodium alginate solution as the base material of the core layer and a mixed solution of the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) as the base material of the shell portion will be described.
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber can be produced, for example, by a method including the following steps (1) to (4).
  • a step of injecting a fibrous material coated with a shell layer into a solution containing divalent metal ions (4) Includes a crosslinked alginate gel obtained by forming a crosslink between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) described in the above aspect [1].
  • the steps (1) to (4) of obtaining a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer the chemically modified alginate represented by the above formulas (I) and (II) of the shell layer is carried out.
  • the mixed solution of the derivative gels, and the shell layer contains a crosslinked alginate gel composed of a calcium crosslink and a chemical crosslink formed by the Huisgen reaction, and the core layer 5 contains a chemically crosslinked alginate gel fiber containing an antibody-producing cell 6 and a substrate. Can be manufactured.
  • the discharge pipe CC is not particularly limited as long as it has a thickness that can be introduced into the microfluidic device XX.
  • the introduction pipe AA is not particularly limited as long as it has a thickness that can be introduced into the microfluidic device XX.
  • the injection speed of the solution at the introduction ports 2 and 3 is not particularly limited, but may be, for example, about 200 to about 400 ⁇ L / min.
  • the diameter of the core layer and the coating thickness of the shell layer can be appropriately adjusted. For example, when the injection rate of the solution at the introduction ports 2 and 3 is increased, the diameter of the core layer and the coating thickness of the shell layer are reduced, while when the injection rate is decreased, the diameter of the core layer and the coating thickness of the shell layer are increased. Become.
  • the collagen solution containing the antibody-producing cells 6 ejected from the introduction port 1 is prepared, for example, as follows.
  • a buffer composed of HBSS, Hepes, and NaHCO 3 is added to the collagen acidic solution I-PC (Koken Co., Ltd., cat # .IPC-50) at a ratio of 4: 1 to adjust the collagen concentration to 4 mg / mL.
  • the cells are mixed 1: 1 with the cell suspension prepared to a predetermined concentration in the medium to prepare a collagen solution containing the antibody-producing cells 6 having a final collagen concentration of 2 mg / mL (0.2%).
  • the flow velocity (injection rate) between the antibody-producing cells 6 ejected from the introduction port 1 of the microfluidic apparatus 10 and the base material is not particularly limited, but may be, for example, about 50 to about 100 ⁇ L / min.
  • the mixed solution of the chemically modified alginate derivative represented by the formula (I) and the formula (II) ejected from the introduction port 2 of the microfluidic device 10 is, for example, the formula (I) and the formula (I) described in the above aspect [1].
  • a solvent for example, MilliQ water, etc.
  • a predetermined concentration for example, a solution of each chemically modified alginic acid derivative is 1.5% by mass (w / w). %)
  • the flow velocity of the mixed solution of the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) ejected from the introduction port 2 of the microfluidic device 10 is not particularly limited, but is, for example, about 200 to about 400 ⁇ L / min. It may be in the range of.
  • the solution containing divalent metal ions ejected from the introduction port 3 of the microfluidic device 10 is, for example, calcium chloride, and MilliQ water is added to obtain a calcium chloride aqueous solution having a predetermined concentration (for example, about 100 mM).
  • a predetermined concentration for example, about 100 mM.
  • the flow velocity of the solution containing divalent metal ions ejected from the introduction port 3 of the microfluidic device 10 is not particularly limited, but may be in the range of, for example, about 2 to about 6 mL / min.
  • the injection speed of the solution at the introduction ports 1 and 2 is not particularly limited, but may be, for example, about 50 to about 400 ⁇ L / min.
  • the diameter of the core layer and the coating thickness of the shell layer can be appropriately adjusted.
  • the collagen solution containing the antibody-producing cells 6 ejected from the introduction port 1 is prepared, for example, as follows.
  • a buffer composed of HBSS, Hepes, and NaHCO 3 is added to the collagen acidic solution I-PC (Koken Co., Ltd., cat # .IPC-50) at a ratio of 4: 1 to adjust the collagen concentration to 4 mg / mL.
  • the cells are mixed 1: 1 with the cell suspension prepared to a predetermined concentration in the medium to prepare a collagen solution containing the antibody-producing cells 6 having a final collagen concentration of 2 mg / mL (0.2%).
  • the flow velocity (injection rate) of the antibody-producing cells 6 and the base material ejected from the introduction port 1 of the T-shaped fluid device XX shown in FIG. 3 is not particularly limited, but is, for example, about 50 to about 100 ⁇ L / min. May be good.
  • the mixed solution of the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) ejected from the introduction port 2 of the T-shaped fluid device XX shown in FIG. 3 is, for example, the formula according to the above aspect [1].
  • a solvent for example, MilliQ water, etc.
  • a mixed solution of chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) of (w / w%) or (w / v%)) is prepared.
  • the flow velocity of the mixed solution of the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II) ejected from the introduction port 2 of the T-shaped fluid device XX is not particularly limited, but is, for example, about 200 to about 400 ⁇ L /. It may be in the range of about a minute.
  • the outer diameter of the chemically crosslinked alginate gel fiber 20 to be produced is not particularly limited, but is as described above, and may be, for example, in the range of about 0.2 ⁇ m to about 2000 ⁇ m, or in the range of about 50 ⁇ m to about 1000 ⁇ m. , Preferably in the range of about 200 ⁇ m to about 800 ⁇ m.
  • the length of the chemically crosslinked alginate gel fiber 20 is not particularly limited and is as described above, and may be, for example, about several mm to several m.
  • the cross-sectional shape of the fiber is as described above, and examples thereof include a circular shape, an elliptical system, a polygonal shape such as a quadrangle and a pentagon, and the like.
  • the temperature during the process of producing the chemically crosslinked alginate gel fiber is, for example, in the range of about 4 to about 37 ° C, preferably about 35 ° C.
  • antibody-producing cells can be cultured to produce antibodies.
  • the alginate gel fiber enables continuous culture of antibody-producing cells for several months by appropriately exchanging the culture medium.
  • a method for producing an antibody comprises using a chemically crosslinked alginate gel fiber formed by coating with a shell layer containing an alginate gel.
  • the “method for producing an antibody” may be referred to as a “method for culturing antibody-producing cells”.
  • the core layer containing the antibody-producing cells and the substrate is placed between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • the culture of antibody-producing cells is started.
  • the culture solution (nutrient source) and oxygen can be immediately supplied to the core layer.
  • the antibody can be produced while sufficiently preventing necrosis of antibody-producing cells in the core layer.
  • a chemically cross-linked alginate gel fiber containing antibody-producing cells in the core layer was placed in an Erlenmeyer flask with a vent cap (Corning, Cat. 431143), and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 33 in Example F3-8 described later.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment are performed after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution does not change.
  • remove 2 mL of the culture solution from the flask culture solution (30 mL) add 28 mL of fresh medium, and then remove 26 mL of the culture solution.
  • the feed solution may be added in a timely manner.
  • the antibody production technique using the chemically crosslinked alginate gel fiber of a preferred embodiment is encapsulated because the antibody-producing cells contained in the core layer do not proliferate above a certain number and therefore there is less physical stress on the cells. It is excellent in that antibody-producing cells have the potential to continue producing antibodies for a long period of time.
  • antibody production and purification efficiency may be dramatically improved (for example, by using the microgel fiber of the preferred embodiment, small scale unlike suspension culture requiring a large culture tank. It is also possible to cultivate antibodies in the production equipment of the above), and it is expected as a continuous production technology of next-generation antibody drugs suitable for manufacturing small quantities and various kinds of antibody drugs (specifically, antibody drugs, etc.) it can.
  • the antibody produced by the culture may be stored in the core layer of the alginate gel fiber, and preferably permeates the shell layer of the alginate gel fiber and is stored in the culture solution outside the alginate gel fiber. ..
  • the antibody can be recovered and purified by referring to the description below.
  • the antibody produced in the core layer permeates the shell layer and is sequentially released to the outside of the chemically crosslinked alginate gel fiber, forming a cycle in which the antibody can be continuously cultured. It is possible. At this time, metabolites and waste products may also be released to the outside of the chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • a compound (EX1- (I) -B-2b) and a compound (EX1-) are added to the chemically modified alginate derivative of the formula (I).
  • (I) -A-2c) compound (EX8- (I) -B-2), compound (EX8- (I) -A-2b), (EX8- (I) -A-2c) or compound (EX8).
  • the core layer containing the antibody-producing cells is coated with a cross-linked alginate gel obtained by forming a cross-link between the two alginic acid derivatives using the chemically modified alginic acid derivatives represented by the formulas (I) and (II).
  • the culture container for culturing the chemically crosslinked alginate gel fiber to be formed is, for example, a container selected from the group consisting of a tissue culture plate, an Erlenmeyer flask, a T-flask, a spinner flask, a culture bag, an animal cell culture tank, and the like. It is preferably an Erlenmeyer flask or an animal cell culture tank.
  • any method such as static culture, shaking / shaking culture, etc. may be selected.
  • the number of antibody-producing cells per culture is effective for improving antibody productivity, but on the other hand, excessive proliferation may occur, the culture environment may deteriorate, and the culture period may be shortened.
  • the antibody production method for example, as a method for reducing physical stress on cells caused by proliferation of antibody-producing cells contained in the core layer of chemically crosslinked alginate gel fiber, for example, core.
  • Examples of the method in which the antibody-producing cells contained in the layer do not proliferate beyond a certain number include methods such as controlling the culture temperature during culturing and adding a cell proliferation inhibitor to the culture broth.
  • the culture temperature is, for example, in the range of about 30 to about 38 ° C.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. from the start to the end of the culture.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about 1.0 ⁇ 10. 8 cells / mL to about 10 ⁇ 10 The temperature from the time when 8 cells / mL is reached to the end of culturing is about 30 ° C.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration in the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about 3.0 ⁇ 10. 8 cells / mL to about 8.0 ⁇ 10 The temperature from the time when 8 cells / mL is reached to the end of culturing is about 30 ° C.
  • the culture temperature is more preferably about 37 ° C. at the start of the culture, and the cell concentration of the core layer of the chemically crosslinked alginate gel fiber is about 4.0 ⁇ . temperatures up to 10 8 cells / mL ⁇ about 8.0 ⁇ 10 8 at the time - the end of the culture reaching the cells / mL of about 30 ° C..
  • the culture period is, for example, 10 days or longer, 20 days or longer, or 30 days or longer, or 40 days or longer, or 50 days or longer. Yes, or more than 60 days, or more than 70 days.
  • the culture period is, for example, 14 days, or 28 days, or 33 days, or 42 days, or 56 days, or 61 days. Or 77 days.
  • the cell proliferation inhibitor is an agent capable of suppressing excessive cell proliferation during the culture period.
  • the cell proliferation inhibitor that can be added to the culture medium in the method for producing an antibody of some embodiments is an additive selected from the group consisting of, for example, dimethylsulfoxide, sodium butyrate, valproic acid, lithium chloride and valeric acid. (Preferably valproic acid or valeric acid; more preferably valeric acid.
  • the timing of adding the cell proliferation inhibitor to the culture medium can be either at the start of the culture or during the culture period (when the cells can grow to the required number of cells).
  • Antibodies are classified into classes (isotypes) and subclasses as shown in the table below, depending on the structural differences in the constant region.
  • the antibody produced in the core layer of the alginate gel fiber and capable of permeating the shell layer by culturing the antibody-producing cells in some aspects of the antibody production method is not particularly limited, but for example, Examples thereof include antibodies having a class (isotype) selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgD, IgE and the like.
  • the antibody produced in the core layer of the alginate gel fiber and capable of permeating the shell layer by culturing antibody-producing cells is preferably an IgG or IgE class (isotype) antibody, more preferably an IgG class. (Isotype) antibody.
  • the molecular weight of the antibody produced in the core layer of the alginate gel fiber and capable of permeating the shell layer by culturing the antibody-producing cells by the method for producing an antibody of some embodiments is not particularly limited.
  • the molecular weight of the antibody produced in the core layer of the alginate gel fiber and capable of permeating the shell layer in some methods of producing the antibody is preferably in the range of 45,000 to 160,000, more preferably. It ranges from 140,000 to 150,000.
  • an antibody corresponding to the antibody-producing CHO cells used is produced.
  • muromonab-CD3-producing CHO cells when muromonab-CD3 are used, muromonab-CD3 is produced as an antibody.
  • Examples of the antibody produced include mromonab-CD3 (IgG; 150,000) using mromonab-CD3-producing CHO cells, trusszumab (IgG; 148,000) using trussumab-producing CHO cells, and rituximab-producing CHO cells.
  • mromonab-CD3 IgG; 150,000
  • trusszumab IgG; 148,000
  • trussumab-producing CHO cells trussumab-producing CHO cells
  • rituximab-producing CHO cells Using rituximab (IgG; 144,510), using paribismab-producing CHO cells, using paribismab (IgG; "147,700”), using infliximab-producing CHO cells, using infliximab (IgG; "149,000”), basiliximab-producing CHO.
  • Baciliximab (IgG; 147,000) using cells, tosirizumab (IgG; 148,000) using tosirizumab-producing CHO cells, gemtuzumab gemtuzumab ozogamicin (IgG; "153,000") using gemtuzumab ozogamicin-producing CHO cells, bebashizumab Bebasizumab (IgG; 149,000) using producing CHO cells, ibritsumomab thiuxetan using CHO cells producing HIBUTSUMOMAb tyuxetan (IgG; 148,000), adalimumab (IgG; 148,000) using ADO cells producing adalimumab, setuximab Setuximab (IgG; 151,800) using CHO cells producing, ranibizumab (IgG; 48,000) using CHO cells producing ranibizumab, omalizumab (IgE; 149,000) using
  • Ecrizumab (IgG; 145,235) using cells, panitumumab (IgG; 147,000) using panitumumab-producing CHO cells, ustequinumab (IgG; 148,079-149,690) using ustequinumab-producing CHO cells, golimumab Golimumab (IgG; 149,802 to 151,064) using producing CHO cells, canaquinumab (IgG; 148,000) using canaquinumab producing CHO cells, denosumab (IgG; 150,000) using denosumab producing CHO cells , Mogamurizumab (IgG; 149,000) using mogamurizumab-producing CHO cells, Sertrizumab pegol (IgG; 90,000) using sertrizumab pegol-producing CHO cells, and ofatumumab (IgG; 149,000) using ofatumumab-producing CHO cells.
  • Pertuzumab (IgG; 148,000) using Pertuzumab-producing CHO cells
  • Trustuzumab emtancin-producing C Trastuzumab emtansine (IgG; 151,000) using HO cells
  • Brentuximab vedotin (IgG; 153,000) using Brentuximab vedotin-producing CHO cells
  • Natarizumab IgG; 146; 146) using natarizumab-producing CHO cells.
  • nivorumab (IgG; 145,000) using nivolumab-producing CHO cells
  • alemtuzumab IgG; 150,000
  • sexualumab IgG; 151,000
  • Ramsylumab (IgG; 147,000) using ramsylumab-producing CHO cells, ipilimumab (IgG; 148,000) using ipilimumab-producing CHO cells, Eborokumab (IgG; 141,789) using evolocumab-producing CHO cells, Mepolizumab Mepolizumab (IgG; 149,000) using producing CHO cells, allylocumab (IgG; 145892.049.) Using arillokumab producing CHO cells.
  • Ixekizumab (IgG; 149,000) using Ixekizumab-producing CHO cells Brodalmab (IgG; 147,000) using bladrumab-producing CHO cells, Idalsizumab (IgG; 47,782) using Idalsizumab-producing CHO cells, Erotzumab (IgG; 148,000) using erotuzumab-producing CHO cells, pembrolizumab (IgG; 149,000) using pembrolizumab-producing CHO cells, salilumab (IgG; 150,000) using salilumab-producing CHO cells, bezrotoxumab production Bezlotoxumab (IgG; 148,000) using CHO cells, berimumab (IgG; 147,000) using berimumab-producing CHO cells, daratumumab (IgG; 148,000) using daratumumab-producing CHO cells, avelumab-
  • Benlarizumab (IgG; 148,000), inotzumab ozogamicin-producing CHO cells, inotsumab ozogamycin (IgG; 159,000), emicizumab-producing CHO cells, emicizumab (IgG; 148,000), guselkumab-producing CHO cells.
  • Guserkumab (IgG; 146,000), durvalumab (IgG; 149,000) using durvalumab-producing CHO cells, obinutuzumab (IgG; 148,000 to 150,000) using obinutuzumab-producing CHO cells, or vedrizumab-producing CHO.
  • Beddrizumab (IgG; 150,000) can be mentioned using cells (the parentheses after the antibody name indicate the class (isotype) and molecular weight of the antibody).
  • the produced antibody is purified, for example, through the following three steps.
  • Step 1 In order to substantially remove proteins and solids other than antibodies contained in the medium, centrifugation or filtration with a filter is performed.
  • Step 2 For example, the target antibody is taken out by chromatography such as affinity chromatography using Protein A or Protein G or ion exchange chromatography.
  • Step 3 In order to remove the contaminants mixed in the step 2, gel filtration chromatography is performed to purify the target antibody with high purity.
  • Affinity chromatography with Protein A or Protein G As a method for purifying IgG, for example, a method for purifying an antibody using Protein A or Protein G is known. As an example of the antibody purification method using Protein A, the following method can be mentioned. (1) Using a column filled with beads on which Protein A is fixed, IgG is added to the beads in the column by filtering the solution obtained by adding serum to the solution obtained by the method of [Step 1] above. And other serum components are spilled out of the column. (2) After that, by passing an acidic solution through the column, the IgG bound to the beads is cut off and eluted to the outside of the column to obtain IgG. Since the binding force of Ig to Protein A and Protein G differs depending on the animal species and subclass, Protein A or Protein G can be used properly depending on the purpose.
  • Ion exchange chromatography This is a method of separating proteins by utilizing the electrical properties (charges) of proteins.
  • a basic protein that exhibits a positive charge ion-bonds to a negatively charged cation exchanger (carrier), and an acidic protein that exhibits a negative charge binds to an anion exchanger that has a positive charge.
  • the protein By passing the contained sample through a column packed with an ion exchanger, the protein binds to the ion exchanger. After that, by increasing the salt concentration of the solvent that passes through the column, the ionic bond between the protein and the ion exchanger becomes weaker, and the protein with the weakest binding force is removed from the ion exchanger in order and flows out of the column.
  • the selection of the cation exchanger or the anion exchanger shall be selected from the charge of the protein used as the sample.
  • Gel filtration chromatography This is a method for separating proteins by utilizing the difference in the molecular weight of proteins.
  • proteins having a small molecular weight flow out while entering the small pores, and proteins having a large molecular weight flow out without entering the small pores. Therefore, the protein having a small molecular weight has a slower time to pass through the column, and the protein having a large molecular weight has a faster time, so that the protein can be separated with a time lag.
  • M means molecular weight
  • RT means retention time
  • [M + H] + and [M + Na] + mean molecular ion peaks.
  • the "room temperature” in the examples usually indicates a temperature of about 0 ° C to about 35 ° C.
  • Reactive substituent introduction rate in Example (mol%) is for 1 H-NMR (D 2 O ) monosaccharide constituting the calculated alginate from the area ratio of the number of moles of (guluronic acid and mannuronic acid) units It shall indicate the ratio of the number of moles of the introduced reactive substituent.
  • sodium alginate showing the physical property values shown in Table 21 was used as the sodium alginate before the reactive group or the complementary reactive group was introduced.
  • Reactive groups obtained in (Example A-1) to (Example A-15) and (Example 1) to (Example 17) are introduced into Tables 23-1 to 23-2.
  • the physical property values of the alginic acid derivative (specifically, the reactive group introduction rate (mol%), the molecular weight, and the weight average molecular weight (10,000 Da)) are shown.
  • Tables 24-1 to 24-6 show 1 H-NMR of each intermediate in (Example A-1) to (Example A-15) and (Example 1) to (Example 17).
  • Table 25 shows LC-Mass of each intermediate in (Example A-1) to (Example A-15) and (Example 1) to (Example 17).
  • Example A-1a Dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (Example A-1a, Example A-1b, Example A-1c, Example A-1d, Example A-1e, Example A-1f, Example A-1g , And Synthesis of Example A-1h):
  • Example A-1a Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -A-2): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (43.6 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-2) prepared to 1% by weight. 4-Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (111.65 mg), 1 molar concentration-sodium alginate aqueous solution (403.5 ⁇ L) was added.
  • DMT-MM 4-Methylmorpholinium chloride
  • Example A-1b Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -A-1): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (19.32 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-1) prepared to 1% by weight. 4-Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (49.47 mg) and 1 molar aqueous solution of sodium alginate (178.8 ⁇ L) were added.
  • DMT-MM 4-Methylmorpholinium chloride
  • Example A-1c Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -A-3): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (15.06 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-3) prepared to 1% by weight. 4-Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (38.57 mg), 1 molar concentration-sodium alginate aqueous solution (139.4 ⁇ L) was added.
  • DMT-MM 4-Methylmorpholinium chloride
  • Example A-1d Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -B-2a): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (53.0 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) prepared to 1% by weight.
  • DMT-MM 4-methylmorpholinium chloride
  • EX1-SM dibenzocyclooctin-amine
  • Example A-1e Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -B-2b): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (35.0 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) prepared to 1% by weight.
  • Example A-1f Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -B-2c): 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-in an aqueous solution (60.0 mL) of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) prepared to 1% by weight.
  • Example A-1g Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -A-2b): The title compound EX1- (I) -A-2b (1.174 g) was obtained as a white solid by the same method as in Example A-1a.
  • Example A-1h Synthesis of dibenzocyclooctyne-amine group-introduced alginic acid (EX1- (I) -A-2c): The title compound EX1- (I) -A-2c (1.138 g) was obtained as a white solid by the same method as in Example A-1a.
  • Example A-3 4- (2-Aminoethoxy) -N- (3-azidopropyl) benzamide group-introduced alginic acid (Example A-3a, Example A-3b, Example A-3c, Example A) Synthesis of -3d, Example A-3e, Example A-3f, Example A-3g, Example A-3h and Example A-3i):
  • Example A-3 Lithium hydroxide monohydrate (0.25 g) in a methanol (4.4 mL) solution of the compound EX3-IM-1 (0.44 g) obtained in ⁇ Step 1>. was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 3 hours and 30 minutes. 1N-hydrochloric acid (5 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted 3 times with ethyl acetate (10 mL). The organic layer was washed successively with water (5 mL) and saturated brine (5 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Example A-3g Synthesis of 4- (2-aminoethoxy) -N- (3-azidopropyl) benzamide group-introduced alginic acid (EX3- (II) -A-2b): The title compound EX3- (II) -A-2b (1.171 g) was obtained as a white solid by the same method as in Example A-3a.
  • Example A-3h Synthesis of 4- (2-aminoethoxy) -N- (3-azidopropyl) benzamide group-introduced alginic acid (EX3- (II) -A-2c): A compound synthesis operation was carried out in the same manner as in (Example A-3a) to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX3- (II) -A-2c (1.169 g) as a white solid.
  • Example A-3i Synthesis of 4- (2-aminoethoxy) -N- (3-azidopropyl) benzamide group-introduced alginic acid (EX3- (II) -B-2d): A compound synthesis operation was carried out in the same manner as in (Example A-3d) to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX3- (II) -B-2d (2.42 g) as a white solid.
  • Diisopropyl azodicarboxylate (40% toluene solution, 4.15 mL) was added to a solution of triphenylphosphine (2.07 g) in tetrahydrofuran (7 mL), and the mixture was stirred until a precipitate was formed.
  • Lithium hydroxide monohydrate (1.06 g) was added to a solution of fraction (2.94 g) containing compound EX4-IM-1 in methanol (15.6 mL) with stirring at room temperature, and 60 The mixture was stirred at ° C. for 3 hours. After cooling to room temperature, the solvent was distilled off under reduced pressure. Water (20 mL) was added to this residue, and the mixture was extracted twice with methyl tert-butyl ether (20 mL). The aqueous layer was acidified with 1N-hydrochloric acid (25 mL), extracted 3 times with ethyl acetate (20 mL) and washed successively with water (10 mL) and saturated brine (10 mL).
  • Example A-4 Compound EX4-IM-2 (1 g) obtained in ⁇ Step 1>, commercially available 2- (2- (2-azidoethoxy) ethoxy) ethane-1-amine [CAS REGISTRY NO] .: 166388-57-4] (0.62 g) and O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (1) N, N-diisopropylethylamine (1.24 mL) was added dropwise to a solution of .35 g) of acetonitrile (20 mL) under ice-cooling stirring, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • 1,4-dioxane (9.58 mL) was added to the fraction (1.37 g) containing the compound EX4-IM-3.
  • 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (9.58 mL) was added under water-cooled stirring, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • diisopropyl ether 100 mL was added to the reaction mixture, the suspension was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was triturated with ethyl acetate (20 mL) and methyl tert-butyl ether (10 mL). The obtained solid was filtered and dried under reduced pressure to obtain the title compound EX4-IM-4 (1.23 g) as a white solid.
  • Example A-5a Synthesis of N- (2-aminoethyl) -4- (azidomethyl) benzamide group-introduced alginic acid (Example A-5a, Example A-5b and Example A-5c):
  • Example A-5 To the compound EX5-IM-2 (250 mg) obtained in ⁇ Step 2>, 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (1.75 mL) was added under ice-water cooling. In addition, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Diisopropyl ether (5.25 mL) was added to the reaction solution, the obtained precipitate was collected by filtration, washed with diisopropyl ether, and dried under reduced pressure to obtain the title compound EX5-IM-3 (192 mg) as a white solid. It was.
  • Example A-6 Thionyl chloride (440 ⁇ L) and N, N-dimethylformamide (2 ⁇ L) were added to the compound EX6-IM-1 (617 mg) obtained in ⁇ Step 1> at 80 ° C. The mixture was stirred for 1.5 hours, and the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. Compound EX6-combined from the remaining methylene chloride (1.0 mL) solution from 5-dibenzosverenone [CAS REGISTRY NO .: 2222-33-5] according to the method described in [Production Method D] ⁇ Step 1>.
  • SM2 [CAS REGISTRY NO .: 23294-93-6] (500 mg) and pyridine (585 ⁇ L) were added to a solution of methylene chloride (5.0 mL) under ice-water cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction mixture is diluted with tert-butyl methyl ether (20 mL), washed successively with water (10 mL), 1N-hydrochloric acid (10 mL), water (10 mL), saturated brine (5 mL), and anhydrous. After drying over sodium sulfate, the mixture was concentrated under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (n-heptane-60% ethyl acetate / n-heptane), and the obtained solid was triturated with tert-butylmethyl ether / n-heptane. The solid was filtered and washed with n-heptane to give the title compound EX6-IM-2 (840 mg) as a white solid.
  • Example A-6 Pyridine bromide perbromid (612 mg) was added to a solution of compound EX6-IM-2 (700 mg) in methylene chloride (2.8 mL) obtained in ⁇ Step 2> under ice-water cooling. In addition, after stirring at room temperature for 1.5 hours, pyridinium bromide perbromid (111 mg) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate (20 mL) and washed successively with 2N-hydrochloric acid (10 mL) and saturated brine (5 mL). The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to give the title crude compound EX6-IM-3 (1.03 g) as a yellow amorphous substance.
  • Example A-6 Tert-butoxypotassium (100 mg) was added to a solution of the crude compound EX6-IM-3 (100 mg) obtained in ⁇ Step 3> in tetrahydrofuran (1.5 mL) at room temperature with stirring. , In small portions over 8 hours.
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (15 mL) and washed successively with water (3 mL) and saturated brine (2 mL). The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to give the title crude compound EX6-IM-4 (58 mg) as a light brown gum-like substance.
  • Example A-6 Potassium carbonate (40 mg) of water (0.25 mL) was added to a solution of the crude compound EX6-IM-4 (58 mg) obtained in ⁇ Step 4> in methanol (1.2 mL). ) The solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 23 hours. The reaction mixture was concentrated, ethyl acetate (10 mL), methylene chloride (1 mL) and semi-saturated saline (2 mL) were added, and the layers were separated. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure. The obtained gum was purified by silica gel chromatography (ethyl acetate-50% methanol / ethyl acetate) to obtain the title compound EX6-IM-5 (22 mg) as a colorless gum-like substance.
  • Example A-7 Synthesis of N- (2-aminoethyl) -4-azidobenzamide group-introduced alginic acid (Example A-7a, Example A-7b, and Example A-7c):
  • Example A-7 The compound (EX7-IM-1,500 mg) obtained in ⁇ Step 1> was suspended in 1,4-dioxane (1.5 mL). A 4-hydrogen chloride / dioxane solution (3.5 mL) was added under ice-water cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Diisopropyl ether (10.5 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 50 minutes. The solid was filtered, washed with diisopropyl ether, and dried under reduced pressure to give the title compound EX7-IM-2 (365 mg) as a light beige solid.
  • Example A-7c Synthesis of N- (2-aminoethyl) -4-azidobenzamide group-introduced alginic acid (EX7- (II) -A-2): Alginic acid was changed to A-2 and the title compound EX7- (II) -A-2 (271 mg) was obtained as a white solid by the same method as in (Example A-7a).
  • Example A-8 N- (4- (aminoethyl) benzyl) -2- (cyclooct-2-in-1-yloxy) acetamide group-introduced alginic acid (Example A-8a, Example A-8b, Example) Synthesis of Examples A-8c, Examples A-8d and Examples A-8e):
  • Example A-8 The compound EX8-IM-1 (0.5 g) obtained in ⁇ Step 1> was added to a 1,4-dioxane solution (3.5 mL) under water-cooled stirring under 4 specifications. Hydrogen chloride / 1,4-dioxane (3.5 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After adding diisopropyl ether (40 mL) to the reaction solution, the precipitate was filtered to obtain the title compound EX8-IM-2 (0.36 g) as a white solid.
  • Carboxylic acid [CAS REGISTRY NO .: 917756-42] synthesized from cycloheptene [CAS REGISTRY NO .: 628-92-2] according to a method known in the literature (Org. Process Res. Dev. (2016) 22: 108-110).
  • EX8-SM2, 0.17 g and O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.
  • Example A-8 With respect to the mixture of the compound EX8-IM-3 (0.18 g) and methanol (1.8 mL) obtained in ⁇ Step 3>, potassium carbonate (0) was stirred under ice-cooling. .126 g) Aqueous solution (0.9 mL) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 17 hours and 30 minutes. Methanol was distilled off under reduced pressure, and the mixture was extracted 3 times with ethyl acetate (5 mL). The organic layer was washed with saturated brine (5 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate. After filtering the organic layer, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title crude compound EX8-IM-4 (0.13 g) as a pale yellow oil.
  • Example A-8b Synthesis of N- (4- (aminoethyl) benzyl) -2- (cyclooct-2-in-1-yloxy) acetamide group-introduced alginic acid (EX8- (I) -A-2): Alginic acid was changed to A-2 (Example A-8), and the title compound EX8- (I) -A-2 (285 mg) was obtained as a white solid by the same method as in ⁇ Step 5>.
  • Example A-8c Synthesis of N- (4- (aminoethyl) benzyl) -2- (cyclooct-2-in-1-yloxy) acetamide group-introduced alginic acid (EX8- (I) -B-2b): (Example A-8) A compound synthesis operation was carried out in the same manner as in ⁇ Step 5> to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX8- (I) -B-2b (1.96 g) as a white solid.
  • Example A-8d Synthesis of N- (4- (aminoethyl) benzyl) -2- (cyclooct-2-in-1-yloxy) acetamide group-introduced alginic acid (EX8- (I) -A-2b): Alginic acid was changed to A-2, and the compound synthesis operation was carried out in the same manner as in (Example A-8) ⁇ Step 5> to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX8- (I) -A-2b (1.10 g) as a white solid.
  • EX9-SM1 Ethyl trifluoroacetate (12.0 mL) solution of commercially available tert-butyl (2-aminoethyl) carbamate [CAS REGISTRY NO .: 57260-73-8] (EX9-SM1, 3.00 g) in tetrahydrofuran (12.0 mL). 2.24 mL) was added dropwise. The reaction mixture was stirred at room temperature for 14.5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and tert-butyl methyl ether (5 mL) and n-heptane (25 mL) were added to the residue for trituration. The solid was filtered and washed with n-heptane to give the title compound EX9-IM-1 (4.36 g) as a white solid.
  • Example A-9a Formic acid (3.1 mL) was added to the compound EX9-IM-1 (0.50 g) obtained in ⁇ Step 1>, and the mixture was stirred at room temperature for 22.5 hours. Formic acid was distilled off and azeotroped with toluene. Hydrogen chloride / methanol was added to the obtained oil, and the mixture was concentrated under reduced pressure. After azeotropically boiling with ethyl acetate and tert-butyl methyl ether, the mixture was dried under reduced pressure to give the title crude compound EX9-IM-2 (0.35 g) as a colorless oil.
  • Ethanol (1.0 mL), 4- (4,6-) to carboxylic acid (EX8-SM2, 100 mg) synthesized according to a method known in the literature (Org. Process Res. Dev. (2016) 22: 108-110).
  • Dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (304 mg)
  • DMT-MM Dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride
  • Example A-9a Compound EX9- obtained in ⁇ Step 2> IM-2 (159 mg) and triethylamine (153 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours. Water (4 mL) was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate (15 mL, 5 mL).
  • Example A-9a A solution of potassium carbonate (89 mg) in water (515 ⁇ L) was added to a solution of compound EX9-IM-3 (103 mg) in methanol (1.55 mL) obtained in ⁇ Step 3>. In addition, the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. Methanol was distilled off under reduced pressure, water (2 mL) was added, and the mixture was saturated with sodium chloride. Extracted with ethyl acetate (15 mL, 10 mL ⁇ 5), dried over anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure to prepare the title compound EX9-IM-4 (75 mg) as a colorless oil. Obtained.
  • Example A-9a The compound EX9-IM-1 (0.50 g) obtained in ⁇ Step 1> was suspended in 1,4-dioxane (3.0 mL). Under ice-water cooling, 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (7.0 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Diisopropyl ether (30.0 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 50 minutes. The solid was collected by filtration, washed with diisopropyl ether, and dried under reduced pressure to give the title compound EX9-IM-2 (0.70 g) as a white solid.
  • Example A-9b The compound EX9-IM-3 (322 mg) obtained in ⁇ Step 2> was subjected to the same operation as in (Example A-9a) ⁇ Step 4>, and the title compound EX9-IM- 4 (238 mg) was obtained as a colorless oil.
  • EX5-SM (4- (chloromethyl) benzoyl chloride, 0.50 g) was dissolved in tetrahydrofuran (5.0 mL), and tert-butyl (2- (2-aminoethoxy) ethyl) carbamate (0.54 g) was dissolved.
  • tert-butyl (2- (2-aminoethoxy) ethyl) carbamate (0.54 g) was dissolved.
  • [CASREGISTRY NO .: 127828-22-2]) and a solution of diisopropylethylamine (0.92 mL) in tetrahydrofuran (5.0 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • Ethyl acetate (25 mL) and water (10 mL) were added to the reaction solution, and the layers were separated.
  • Example A-10 To the compound EX10-IM-2 (400 mg) obtained in ⁇ Step 2>, 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (2.8 mL) was added under ice-water cooling. In addition, the mixture was stirred at room temperature for 1.75 hours. Diisopropyl ether (8.4 mL) was added to the reaction solution to obtain a gum-like product. The supernatant was removed with a decant, washed with diisopropyl ether, and then dried under reduced pressure to give the title compound EX10-IM-3 (298 mg) as a beige solid.
  • Example A-10b Synthesis of N- (2- (2-aminoethoxy) ethyl) -4- (azidomethyl) benzamide group-introduced alginic acid (EX10- (II) -A-2b): (Example A-10) A compound synthesis operation was carried out in the same manner as in ⁇ Step 4-1> to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX10- (II) -A-2b (1.32 g) as a white solid.
  • Example A-11 Sodium azide (152 mg) was added to a solution of compound EX11-IM-1 (0.82 g) obtained in ⁇ Step 1> in dimethyl sulfoxide (11.7 mL) at room temperature. Was stirred for 3.5 hours. Water (23 mL) was added to the reaction solution under ice-water cooling, and the mixture was stirred at the same temperature for 30 minutes. Extraction was performed with ethyl acetate (30 mL, 10 mL), and the organic layer was washed successively with water (10 mL ⁇ 3) and saturated brine (5 mL). The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, the precipitated solid was filtered, and dried under reduced pressure to give the title compound EX11-IM-2 (0.80 g) as a colorless oil.
  • Example A-11 Compound EX11-IM-2 (0.80 g) obtained in ⁇ Step 2> was mixed with 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (5.3 mL) under ice-water cooling. ) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.75 hours. Diisopropyl ether (16.0 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 30 minutes. The solvent was removed by decant and the residue was washed with diisopropyl ether. The obtained residue was dried under reduced pressure to obtain the title compound EX11-IM-3 (0.73 g) as a colorless gum.
  • Methylmorpholinium chloride (112 mg), (Example A-11), a solution of the compound EX11-IM-3 (38 mg) obtained in ⁇ Step 3> in ethanol (4.0 mL), 1 molar concentration-sodium alginate solution (151 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 3 hours. After adding sodium chloride (0.4 g), ethanol (80 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The obtained precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried under reduced pressure to give the title compound EX11- (II) -A-2 (416 mg) as a white solid.
  • Example A-12 1 molar concentration-lithium hydroxide / water with respect to the mixture of the compound EX12-IM-1 (0.342 g) and methanol (6.84 mL) obtained in ⁇ Step 1>.
  • Japanese product (5.34 mL) was added at room temperature, and the mixture was stirred at the same temperature for 30 minutes. After completion of the reaction, acetic acid (0.41 mL) was added, and the reaction solution was concentrated under reduced pressure.
  • Example A-12 Compound EX12-IM-2 (100 mg) obtained in ⁇ Step 2>, commercially available N- (tert-butoxycarbonyl) -2- (2-aminoethoxy) ethylamine [CAS REGISTRY NO .: 127828-22-2] (108.07 ⁇ L) and acetonitrile (2000 ⁇ L) with ice-cooled stirring, O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -N, N, N' , N'-Tetramethyluronium hexafluorophosphate (213.43 mg) and triethylamine (156.48 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour and 45 minutes.
  • N- (tert-butoxycarbonyl) -2- (2-aminoethoxy) ethylamine (54 ⁇ L) and O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-Tetramethyluronium hexafluorophosphate (106.7 mg) was added, and the mixture was stirred at the same temperature for 17 hours.
  • Water (5 mL) was added to stop the reaction, and ethyl acetate (10 mL) was added. The aqueous layer was extracted 3 times with ethyl acetate (10 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example A-12 A mixture of the compound EX12-IM-3 (0.187 g) and the 1,4-dioxane solution (1.31 mL) obtained in ⁇ Step 3> was subjected to water-cooled stirring under water-cooled stirring, 4 Regulation-Hydrogen chloride / 1,4-dioxane (1.31 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After adding diisopropyl ether (20 mL) to the reaction solution, the precipitate was filtered to obtain the title compound EX12-IM-4 (0.16 g) as an off-white solid.
  • Example A-13 Synthesis of N- (2- (2-aminoethoxy) ethyl) -4-azidobenzamide group-introduced alginic acid (Example A-13a and Example A-13b):
  • Example A-13 To the compound EX13-IM-1,670 mg obtained in ⁇ Step 1>), 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (4.7 mL) was added under ice-water cooling. , Stirred for 2 hours at room temperature. Diisopropyl ether (14.0 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 30 minutes. The obtained solid was collected by filtration, washed with diisopropyl ether, and dried under reduced pressure to give the title compound EX13-IM-2 (604 mg) as a light beige solid.
  • Example A-13b Synthesis of N- (2- (2-aminoethoxy) ethyl) -4-azidobenzamide group-introduced alginic acid (EX13- (II) -A-2b): (Example A-13) A compound synthesis operation was carried out in the same manner as in ⁇ Step 3> to obtain a solid. The obtained solid was dissolved in water and freeze-dried to obtain the title compound EX13- (II) -A-2b (1.31 g) as a white solid.
  • Example A-14 The compound (EX14-IM-1, 600 mg) obtained in ⁇ Step 1> was mixed with a 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane solution (4.2 mL) under ice-water cooling. Was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Diisopropyl ether (12.0 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The solvent was removed by decant and the residue was washed with diisopropyl ether. The obtained residue was dried under reduced pressure to obtain the title compound EX14-IM-2 (596 mg) as a beige gum.
  • Methylmorpholinium chloride (112 mg), a solution of compound EX14-IM-2 (45 mg) obtained in (Example A-14) ⁇ Step 2> in ethanol (4.0 mL), 1 molar concentration-sodium alginate solution (151 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 3 hours. After adding sodium chloride (0.4 g), ethanol (80 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The obtained precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried under reduced pressure to give the title compound EX14- (II) -A-2 (408 mg) as a white solid.
  • Ethyl trifluoroacetate (0.) In a solution of tert-butyl (2-aminoethyl) carbamate [CAS REGISTRY NO .: 57260-73-8] (EX9-SM1, 1.0 g) in tetrahydrofuran (4.0 mL). 6 mL was added dropwise. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give the title crude compound EX15-IM-1 (1.5 g) as a colorless oil.
  • Example A-15 Compound EX15-IM-1 (1.5 g) obtained in ⁇ Step 1> was mixed with a 4N-hydrogen chloride / 1,4-dioxane solution (10.3 mL) under ice-water cooling. ) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Diisopropyl ether (30 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The solvent was distilled off under reduced pressure, the mixture was azeotropically boiled with diisopropyl ether, and then dried under reduced pressure to obtain the title compound EX15-IM-2 (1.3 g) as a colorless oil.
  • Example A-15 In a solution of the compound EX15-IM-3 (220 mg) obtained in ⁇ Step 3> in methanol (3.0 mL), water (0.99 mL) of potassium carbonate (103 mg) was added. The solution was added and stirred at room temperature for 4.5 hours. Methanol was distilled off under reduced pressure, water (2 mL) was added, and the mixture was saturated with salt. Ethyl acetate (15 mL, 10 mL ⁇ 4) was extracted, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (10 mL), the insoluble material was filtered off, and the mixture was concentrated under reduced pressure to give the title crude compound EX15-IM-4 (140 mg) as a pale yellow gum.
  • Example 3 To the compound (3-2, 95 mg) obtained in ⁇ Step 1>, 4-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (665 ⁇ L) under ice-water cooling was added, and then 1 at room temperature. Stirred for hours. Diisopropyl ether (2.0 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained oil was decanted with methyl-tert-butyl ether and concentrated under reduced pressure to give the title compound 3-3 (62 mg) as a colorless gum.
  • Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) 56 mg
  • (Example 3) ⁇ Step 2> in ethanol (2 mL) solution of the compound (3-3, 10.6 mg), 1 molar concentration -Aqueous sodium alginate (76 ⁇ L) was added.
  • sodium chloride (0.2 g) and ethanol (40 mL) were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the obtained precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried under reduced pressure.
  • the obtained solid was dissolved in water and then freeze-dried to obtain the title compound EX3-A2 (207 mg) as a white solid.
  • Example 4 To the compound (4-2, 124 mg) obtained in ⁇ Step 1>, 4N hydrogen chloride / 1,4-dioxane (868 ⁇ L) was added under ice-water cooling, and then 1 at room temperature. Stirred for hours. Diisopropyl ether (2.6 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained oil was decanted with methyl-tert-butyl ether and concentrated under reduced pressure to give the title compound 4-3 (93 mg) as a colorless gum.
  • Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) 56 mg
  • Example 4 ⁇ Step 2> in ethanol (2 mL) solution of the compound (4-3, 12.6 mg) obtained in ⁇ Step 2>, 1 molar concentration -Aqueous sodium alginate (76 ⁇ L) was added.
  • sodium chloride (0.2 g) and ethanol (40 mL) were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the obtained precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried under reduced pressure.
  • the obtained solid was dissolved in water and then freeze-dried to obtain the title compound EX4-A2 (211 mg) as a white solid.
  • Example 5 To the compound (5-2, 91 mg) obtained in ⁇ Step 1>, 4-hydrogen chloride / 1,4-dioxane (637 ⁇ L) under ice-water cooling was added, and then 1,4. -After adding dioxane (627 ⁇ L), the mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours. Diisopropyl ether (3.8 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 10 minutes. The obtained solid was filtered to obtain the title compound 5-3 (62 mg) as a beige solid.
  • Example 6 A mixture of the compound (6-3, 0.41 g) and 1,4-dioxane (2.87 mL) obtained in ⁇ Step 1> was subjected to water-cooled stirring under 4N-hydrogen chloride. After adding / 1,4-dioxane (2.87 mL), the mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Diisopropyl ether (40 mL) was added to the reaction mixture, and the suspension was stirred at room temperature for 30 minutes. The precipitate was filtered and the recovered solid was dried under reduced pressure to give the title compound 6-4 (0.2834 g) as a pale purple solid.
  • Example 9 To the compound (9-1,180 mg) obtained in ⁇ Step 1>, 4N hydrogen chloride / 1,4-dioxane (1.2 mL) was added under ice-water cooling, and then room temperature. Was stirred for 0.8 hours. Diisopropyl ether (3.6 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 30 minutes. The obtained solid was filtered to obtain the title compound 9-2 (114 mg) as a white solid.
  • Example 9 To a solution of the compound (9-3, 60 mg) obtained in ⁇ Step 3> in methanol (1.8 mL), a solution of potassium carbonate (59 mg) in water (0.3 mL) was added. , Stirred at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, water (2 mL) was added, and the mixture was saturated with sodium chloride. Extraction was performed with ethyl acetate (15 mL, 10 mL ⁇ 4), and the extraction layer was concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (10 mL) and ethanol (1 mL) were added to the residue, and the insoluble material was filtered off. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to give the title compound 9-4 (49 mg) as a colorless gum.
  • Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) 64 mg
  • Compound (9-4, 18.2 mg) obtained in ⁇ Step 4> 1 molar concentration-sodium alginate aqueous solution (58 ⁇ L) was added.
  • sodium chloride (0.38 g) and ethanol (76 mL) were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the obtained precipitate was collected by filtration, washed with ethanol, and dried under reduced pressure.
  • the obtained solid was dissolved in water and then freeze-dried to obtain the title compound EX9b-B2 (366 mg) as a white solid.
  • Example 10 To the compound (10-1, 80 mg) obtained in ⁇ Step 1>, 4N hydrogen chloride / 1,4-dioxane (1.1 mL) was added under ice-water cooling, and then room temperature. Was stirred for 2 hours. Diisopropyl ether (3.4 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 1.5 hours. The obtained solid was filtered to obtain the title compound 10-2 (61 mg) as a white solid.
  • Example 10 To a solution of the compound (10-3, 60 mg) obtained in ⁇ Step 3> in methanol (3.0 mL), a solution of potassium carbonate (42 mg) in water (0.3 mL) was added. After stirring at room temperature for 3 hours, a solution of potassium carbonate (42 mg) in water (0.3 mL) was further added, and the mixture was further stirred at room temperature for 16.5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, saturated brine (2 mL) was added, and the mixture was further saturated with sodium chloride. Extraction was performed with ethyl acetate (15 mL, 10 mL ⁇ 4), and the extraction layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • dibromo form (11-1, 1 g) synthesized according to the method known in the literature (Org. Process Res. Dev. (2016) 22: 108-110) and the method known in the literature (Pamphlet No. 2015/140807).
  • Dichloromethane (2 mL) was added to the mixture of the synthesized alcohol (11-2, 5.28 g) at room temperature.
  • the reaction vessel was wrapped in aluminum foil to protect it from light while keeping the internal temperature at room temperature.
  • silver trifluoromethanesulfonate (1.92 g) was added at one time at room temperature, and the mixture was stirred at the same temperature for 1 hour.
  • Example 11 28% sodium methoxide was added to a mixture containing the compound (11-3, 0.46 g) obtained in ⁇ Step 1> and dimethyl sulfoxide (1.38 mL) under water-cooled stirring. A methoxide solution (1.82 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Water (10 mL) was added to stop the reaction, and methanol was concentrated under reduced pressure. The resulting solution was extracted 3 times with methyl tert-butyl ether (10 mL). The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give a crude product of the title compound 11-4 (0.196 g) as a brown oil.
  • Aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) (70.1 mL), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4 prepared to 1% by weight.
  • -Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (216.4 mg) and the compound (11-4, 27.14 mg) obtained in (Example 11) ⁇ Step 2> were used (Example 11).
  • the same operation as in ⁇ Step 3-1> was carried out to obtain the title compound EX11b-B2 (648 mg) as a white solid.
  • Example 12 The compound (12-3, 100 mg) obtained in ⁇ Step 2> was dissolved in tetrahydrofuran (0.7 mL) and N, N-dimethylformamide (0.7 mL). 60% sodium hydride (21 mg) was added under ice water, and the mixture was stirred at the same temperature for 3 hours. 60% sodium hydride (10 mg) was added, and the mixture was further added at room temperature for 1 hour, and further 60% sodium hydride (10 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 hours. Water (3 mL) was added, the mixture was extracted with ethyl acetate (15 mL, 10 mL), and the organic layer was washed successively with water and saturated brine.
  • Example 12 To a solution of the compound (12-4, 37 mg) obtained in ⁇ Step 3> in methanol (555 ⁇ L), a solution of potassium carbonate (50 mg) in water (185 ⁇ L) was added, and the solution was 17 at room temperature. Stirred for hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, water (1 mL) was added, and the mixture was saturated with sodium chloride. Extraction was performed with ethyl acetate (10 mL ⁇ 4), and the extraction layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (10 mL) and a few drops of methanol were added to the residue, and the insoluble material was removed by filtration. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to give the title compound 12-5 (30 mg) as a colorless oil.
  • Example 13 The compound (13-2, 400 mg) obtained in ⁇ Step 1> and tert-butyl (2-aminoethyl) carbamate [CAS REGISTRY NO .: 57260-73-8] (8-1). , 441 mg) in ethanol (4.0 mL) solution, 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) ( 897 mg) was added, and the mixture was stirred for 3.5 hours. Water (5 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was extracted with ethyl acetate (20 mL, 10 mL), and then the organic layer was washed successively with water and saturated brine.
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride
  • Example 13 To the compound (13-3,451 mg) obtained in ⁇ Step 2>, 4N hydrogen chloride / 1,4-dioxane (3.16 mL) was added under ice-water cooling, and 3 at room temperature. Stirred for hours. Diisopropyl ether (6.4 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was concentrated under reduced pressure to give the title compound 13-4 (433 mg) as a colorless gum.
  • Example 13 To a solution of the compound (13-5, 35 mg) obtained in ⁇ Step 4> in methanol (700 ⁇ L), a solution of potassium carbonate (33 mg) in water (175 ⁇ L) was added, and 16 at room temperature. . Stirred for 5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, water (2 mL) was added, and the mixture was saturated with sodium chloride. Extraction was performed with ethyl acetate (10 mL ⁇ 5), and the extraction layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (10 mL) and a few drops of methanol were added to the residue, and the insoluble material was removed by filtration. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain the title compound 13-6 (24 mg) as a colorless gum.
  • Example 14 By using the compound (14-4, 0.2 g) obtained in ⁇ Step 2> and carrying out the same operation as in (Example 6) ⁇ Step 2>, the title compound 14- 5 (0.147 g) was obtained as a white solid.
  • DMT-MM) (137.22 mg) and triethylamine (38.25 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour and 30 minutes.
  • Aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-2) (49.44 mL), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4 prepared to 1% by weight.
  • -Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (152.54 mg) and the compound (14-7, 37.79 mg) obtained in (Example 14) ⁇ Step 5> were used (Example 11).
  • the same operation as in ⁇ Step 3-1> was carried out to obtain the title compound EX14a-A2 (479 mg) as a white solid.
  • Aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) (40.08 mL), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4 prepared to 1% by weight.
  • -Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (123.66 mg) and the compound (14-7, 30.64 mg) obtained in (Example 14) ⁇ Step 5> were used (Example 11).
  • the same operation as in ⁇ Step 3-1> was carried out to obtain the title compound EX14b-B2 (356 mg) as a white solid.
  • Example 15 A solution of piperidine (56 ⁇ L) in N, N-dimethylformamide (315 ⁇ L) was added to the compound (15-2, 63 mg) obtained in ⁇ Step 1>, and the mixture was added to the compound (15-2, 63 mg) at room temperature for 30 minutes. Stirred. Ethyl acetate (15 mL) and water (5 mL) were added to the reaction solution, and after separation, the organic layer was washed successively with water and saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • Glycine (16-1, 2 g) was suspended in methanol (10 mL) and cooled to 4 ° C. At the same temperature, ethyl trifluoroacetate (3.5 mL) and triethylamine (3.71 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 23 hours. After completion of the reaction, 1N-hydrochloric acid (20 mL) was gradually added until pH 2 was reached, the mixture was extracted 3 times with ethyl acetate (10 mL), and washed successively with water (5 mL) and saturated brine (5 mL). .. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give a pale yellow oil.
  • Example 16 Using the compound (16-3, 60 mg), methanol (900 ⁇ L), potassium carbonate (51.78 mg) and water (300 ⁇ L) obtained in ⁇ Step 2> (Example 14). ) By carrying out the same operation as in ⁇ Step 5>, the title compound 16-4 (15 mg) was obtained as a pale yellow oil.
  • Aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-2) (29.66 mL), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4 prepared to 1% by weight.
  • -Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (91.52 mg) and the compound (16-4, 15 mg) obtained in (Example 16) ⁇ Step 3> were used in (Example 11) ⁇ Step.
  • the same operation as in 3-1> was carried out to obtain the title compound EX16-A2 (279 mg) as a white solid.
  • Example 17 Using the compound (17-3, 57 mg), methanol (855 ⁇ L), potassium carbonate (38.39 mg) and water (285 ⁇ L) obtained in ⁇ Step 2> (Example 14). ) By carrying out the same operation as in ⁇ Step 5>, the title compound 17-4 (35 mg) was obtained as a pale yellow oil.
  • Aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: A-2) (47.46 mL), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4 prepared to 1% by weight.
  • -Methylmorpholinium chloride (DMT-MM) (146.44 mg) and the compound (17-4, 34.53 mg) obtained in (Example 17) ⁇ Step 3> were used (Example 11).
  • the same operation as in ⁇ Step 3-1> was carried out to obtain the title compound EX17-A2 (383 mg) as a white solid.
  • Examples P1 to P7 The alginic acid derivatives of (Example P1) to (Example P7) shown below are subjected to the corresponding amino compounds (the pharmaceutically acceptable salts thereof, or solvates thereof) according to the method shown in the above Examples. It may be a product) and alginic acid.
  • Example F1-1 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber A1
  • Chemically crosslinked alginate gel fiber A1 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • As cells tocilizumab-producing CHO cells were used. From the inlet 1 of the microfluidic device 10, it introduced antibody production medium solution (Irvine Co.) containing cells of the cell concentration 5 ⁇ 10 6 cells / mL (1 ⁇ 10 7 cells / 25 m fiber one), inlet From 2, 1.5% by mass (w / w%) chemically modified alginate EX3- (II) -B-2a and 1.5% by mass (w / w%) chemically modified alginate EX1- (I) -B An aqueous solution of -2b (chemically modified alginate EX3- (II) -B-2a / chemically modified alginate EX1- (I) -B-2b ratio 1/1) was introduced, and 100 mM calcium chloride (CaCl 2) was introduced
  • An aqueous solution was introduced and injected to obtain a chemically crosslinked alginate gel fiber having a core layer diameter of about 100 ⁇ m, an outer diameter of about 300 ⁇ m, and a total length of 25 m.
  • the inflow rate is the inflow rate of the core layer from the introduction port of the microfluidic device 10: 0.05 mL / min; the inflow rate of the shell layer from the introduction port of the microfluidic device 2: 0.4 mL / min; the microfluidic device 3
  • the inflow rate of the CaCl 2 solution from the inlet of the above was set to 5 mL / min.
  • Example F1-2 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber A2
  • chemically crosslinked alginate gel fiber A2 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • An antibody-producing medium solution manufactured by Irvine
  • tosirizumab-producing CHO cells having a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (1 ⁇ 10 8 cells / 25 m fiber) was introduced from the introduction port 1 of the microfluidic device 10.
  • Example F1-1 was carried out to obtain a chemically cross-linked alginate gel fiber having a core layer diameter of about 100 ⁇ m, an outer diameter of about 300 ⁇ m, and a total length of 25 m.
  • Example F1-3 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber A3
  • chemically crosslinked alginate gel fiber A3 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • An antibody-producing medium solution manufactured by Irvine
  • tosirizumab-producing CHO cells having a cell concentration of 2 ⁇ 10 8 cells / mL (4 ⁇ 10 8 cells / 25 m fiber) was introduced from the introduction port 1 of the microfluidic device 10.
  • Example F1-1 was carried out to obtain a chemically cross-linked alginate gel fiber having a core layer diameter of about 100 ⁇ m, an outer diameter of about 300 ⁇ m, and a total length of 25 m.
  • Example F1-4 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber A4
  • chemically crosslinked alginate gel fiber A4 was produced according to the production process schematically shown in FIG. From the inlet 1 of the microfluidic device 10, cell concentration 5 ⁇ 10 7 cells / mL 1.5 wt% sodium alginate solution containing tocilizumab producing CHO cells (2 ⁇ 10 7 cells / 50 m fiber one) (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Example F2-1 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B1
  • Chemically crosslinked alginate gel fiber B1 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • As cells tocilizumab-producing CHO cells were used.
  • 1.5 wt% sodium alginate solution containing cells having a cell concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / mL (2 ⁇ 10 7 cells / 3 m fiber) from the inlet 1 of the T-shaped fluid device XX (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) Company-made: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a base material are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5% by mass (w / w%) of chemically modified alginate EX3 is injected from the introduction port 2.
  • the core layer By injecting a fibrous substance in which a core layer containing antibody-producing cells and a substrate is coated with a shell layer containing a chemically modified alginic acid derivative into a 100 mM calcium chloride aqueous solution, the core layer has a diameter of about 300 ⁇ m and an outer diameter.
  • the inflow rate is the inflow rate of the core layer from the introduction port 1 of the T-shaped fluid device XX: 0.05 mL / min; the inflow rate of the shell layer from the introduction port 2 of the T-shaped fluid device XX: 0.2 mL / min. It was min.
  • Example F2-2 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B2
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B2 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 wt% sodium alginate solution containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (2 ⁇ 10 7 cells / 3 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) Made by Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a base material are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5% by mass (w / w%) of chemically modified alginic acid is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-3 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B3
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B3 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (2 ⁇ 10 7 cells / 3 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-4 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B4
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B4 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (2 ⁇ 10 7 cells / 7 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-5 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B5
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B5 was produced according to the production process schematically shown in FIG. 0.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-6 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B6
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B6 was produced according to the production process schematically shown in FIG. 1.0% methylcellulose solution containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic apparatus XX (manufactured by R & D SYSTEMS) ) Is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) -B-2a and 1.
  • Example F2-7 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B7
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B7 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F2-8 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B8
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B8 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F2-9 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B9
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B9 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (2 ⁇ 10 7 cells / 6 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-10 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B10
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B10 was produced according to the production process schematically shown in FIG. From the inlet 1 of a microfluidic device XX, sodium alginate solution 1.5 w / v% comprising tocilizumab producing CHO cells of cell concentration 5 ⁇ 10 7 cells /ML(2.5 ⁇ 10 7 cells / 7m Fiber one) (Manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) was introduced, antibody-producing cells and a substrate were injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- was injected from the introduction port 2.
  • Example F2-11 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B11
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B11 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F2-12 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B12
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber B12 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F2-13 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B13
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B13 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F2-14 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B14
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B14 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (1 ⁇ 10 7 cells / 2 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-15 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B15
  • chemically crosslinked alginate gel fiber B15 was produced according to the production process schematically shown in FIG.
  • a 1.5 w / v% sodium alginate solution containing tosilizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (1 ⁇ 10 7 cells / 2 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX (Mochida) Pharmaceutical Co., Ltd .: B-2) is introduced, antibody-producing cells and a substrate are injected from the cutting-edge ZZ of the introduction tube AA, and 1.5 w / v% chemically modified alginate EX3- (II) is injected from the introduction port 2.
  • Example F2-16 Method for producing chemically crosslinked alginate gel fiber B16
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber B16 was produced according to the production process schematically shown in FIG. A 1.5 w / v% sodium alginate solution (Mochida) containing tosirizumab-producing CHO cells at a cell concentration of 5 ⁇ 10 7 cells / mL (5 ⁇ 10 6 cells / 1 m fiber) from the inlet 1 of the microfluidic device XX.
  • Example F3-1 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber: Medium composition: Prepared by adding various additives shown in the table below to G016 medium.
  • the chemically crosslinked alginate gel fibers B3 or B4 obtained in Example F2-3 or Example F2-4 were placed in a 125 mL polycarbonate Erlenmeyer flask, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added. Culturing was carried out in an incubator under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 weeks while shaking at 125 rpm. Once every 2-3 days, 1.8 mL of medium was withdrawn and 1.8 mL of Feed solution (JX Feed 003 manufactured by Irvine) was added to maintain the total volume of the medium at 30 mL.
  • Feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the number of tocilizumab-producing cells in the fiber and the cell viability were measured, and the tocilizumab concentration in the culture medium was measured.
  • the tocilizumab concentration was measured by the ELISA method using human IL-6 Receptor, Cat # 200-06RC).
  • the number of living cells after the fiber culture 28 days of chemical crosslinking alginate gel fiber B3 is 4.8 ⁇ 10 7 cells, the survival rate was 59%, tocilizumab concentration in the culture solution was 0.3 mg / mL.
  • FIG. 9 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B3 prepared in Example F2-3 after culturing (28 days), and FIG. 10 is a photograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber prepared in Example F2-4. It is a micrograph after culturing B4 (29 days).
  • Example F3-2 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fibers composed of various core materials:
  • the chemically crosslinked alginate gel fibers B5 or B6 obtained in Example F2-5 or Example F2-6 were placed in a 125 mL polycarbonate Erlenmeyer flask, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added.
  • Culturing was carried out in an incubator under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 while shaking at 125 rpm.
  • FIG. 11 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B5 prepared in Example F2-5 after culturing (14 days)
  • FIG. 12 is a photograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber prepared in Example F2-6. It is a micrograph after culturing B6 (14 days).
  • Example F3-3 Culture of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber under temperature-shifted conditions:
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber B7 obtained in Example F2-7 was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added to create a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere.
  • the culture was carried out in an incubator while shaking at 125 rpm. Once every 2-3 days, 1.8 mL of medium was withdrawn and 1.8 mL of Feed solution (JX Feed 003 manufactured by Irvine) was added to maintain the total volume of the medium at 30 mL.
  • Feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the culture temperature was set to 30 ° C. 2 days, 5 days or 7 days after the start of the culture, and the culture was continued at the same temperature.
  • the number of tocilizumab-producing cells in the fiber and the cell viability were measured, and the tocilizumab concentration in the culture medium was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bio analyzer (Roche Diagnostics).
  • the concentration of tocilizumab-producing cells detected in the culture medium was less than 1 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • FIG. 5 shows the number of living cells in the chemically crosslinked alginate gel fiber B7.
  • FIG. 6 shows the cell viability in the chemically crosslinked alginate gel fiber B7.
  • FIG. 7 shows the antibody concentration produced.
  • FIG. 13 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B7 produced in Example F2-7 after culturing (28 days).
  • Example F3-4 Culturing of tosirizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber (culture in which the amount of fiber in the culture system was changed): One chemically cross-linked alginate gel fiber B9 obtained in Example F2-9 or two chemically cross-linked alginate gel fibers B10 obtained in Example F2-10 containing tosirizumab-producing CHO cells in a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate. Add the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above , start culturing in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere while shaking at 125 rpm, and set the culture temperature 5 days later.
  • the temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature. During this period, once every 2 to 3 days, a feed solution (JX Feed 00 manufactured by Irvine) was added or half of the culture solution was replaced with fresh medium within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L. .. The feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 8 shows the cumulative amount of antibody production with one chemically crosslinked alginate gel fiber B9 and two chemically crosslinked alginate gel fibers B10.
  • FIG. 14 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B9 prepared in Example F2-9 after culturing (33 days)
  • FIG. 15 is a photograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber prepared in Example F2-10. It is a micrograph after culturing B10 (33 days).
  • Example F3-5 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells in hollow microfiber alginate (addition of cell cycle inhibitor):
  • the chemically crosslinked alginate gel fiber B8 obtained in Example F2-8 was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added to create a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere.
  • the culture was started in an incubator with shaking at 125 rpm, and alginic acid was added to a final concentration of 1.5 mM or 3 mM after 3 or 5 days.
  • FIG. 16 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B8 prepared in Example F2-8 after culturing (14 days).
  • Example F3-6 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber: In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked gelite alginate gel fibers B11 obtained in Example F2-11 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added, and the temperature was 37 ° C., 5%. In a CO 2 atmosphere, the culture was started while shaking at 125 rpm in the incubator, and after 5 days, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature.
  • the feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the fresh medium was added (1.8 mL) within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • half of the culture medium was replaced with fresh medium.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 18 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B11 prepared in Example F2-11 after culturing (42 days).
  • Example F3-7 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber: In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked gelite alginate gel fibers B12 obtained in Example F2-12 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 above was added, and the temperature was 37 ° C. and 5%. In a CO 2 atmosphere, the culture was started while shaking at 125 rpm in the incubator, and after 5 days, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature.
  • the feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the fresh medium was added (1.8 mL) within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • half of the culture medium was replaced with fresh medium.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 20 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B12 prepared in Example F2-12 after culturing (56 days).
  • Example F3-8 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber (gradual replacement with DMEM HG at medium study sampling):
  • Example F2-13 In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked gelite alginate gel fibers B13 obtained in Example F2-13 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 33 above was added to the mixture at 37 ° C. and 5%. In a CO 2 atmosphere, the culture was started while shaking at 125 rpm in the incubator, and after 5 days, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature. During this period, once every 2 to 3 days, the medium having the composition shown in the above table ** was added or half the amount of the culture medium was replaced with a fresh medium within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • the concentration of tocilizumab-producing cells detected in the culture medium was 1 ⁇ 10 4 cells / mL or less.
  • FIG. FIG. 22 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B13 produced in Example F2-13 after culturing (77 days).
  • Example F3-9 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber (Example of long-term culture): In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked alginate gel fibers B14 obtained in Example F2-14 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 in the above Example F3-1 was added. Then, the culture was started in an incubator under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 while shaking at 125 rpm, and two days later, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature.
  • the feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the fresh medium was added (1.8 mL) within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • half of the culture medium was replaced with fresh medium.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 24 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B14 prepared in Example F2-14 after culturing (56 days).
  • Example F3-10 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber (Example of long-term culture): In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked gelite alginate gel fibers B15 obtained in Example F2-15 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 in the above Example F3-1 was added. Then, the culture was started in an incubator under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 while shaking at 125 rpm, and two days later, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature.
  • the feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the fresh medium was added (1.8 mL) within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • half of the culture medium was replaced with fresh medium.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 26 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B15 produced in Example F2-15 after culturing (56 days).
  • Example F3-11 Culturing of tocilizumab-producing CHO cells using chemically crosslinked alginate gel fiber (Example of long-term culture): In a 125 mL Erlenmeyer flask made of polycarbonate, one of the chemically crosslinked gelite alginate gel fibers B16 obtained in Example F2-16 was placed, and the medium (30 mL) having the composition shown in Table 31 in the above Example F3-1 was added. Then, the culture was started in an incubator under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 while shaking at 125 rpm, and after 5 days, the culture temperature was set to 30 ° C., and the culture was continued at the same temperature.
  • the feed solution JX Feed 003 manufactured by Irvine
  • the fresh medium was added (1.8 mL) within the range where the glucose concentration of the culture solution did not exceed 50 mmol / L.
  • half of the culture medium was replaced with fresh medium.
  • the feed solution addition and the medium exchange treatment were carried out after removing the culture solution equivalent to the amount of the added solution from the culture system before the treatment so that the total amount of the culture solution did not change.
  • the tocilizumab concentration in the culture medium over time was measured as a human IgG concentration by a Cedex Bioanalyzer (Roche Diagnostics).
  • FIG. 28 is a photomicrograph of the chemically crosslinked alginate gel fiber B16 prepared in Example F2-16 after culturing (61 days).
  • a chemically crosslinked alginate gel fiber (chemically crosslinked alginate hollow microfiber) for producing an antibody in which antibody-producing cells are contained in a core layer is provided. Further, it is possible to provide a method for producing the chemically crosslinked alginate gel fiber and a method for culturing an antibody using the chemically crosslinked alginate gel fiber.
  • a Diameter of the core layer (hollow part) of the alginate gel fiber b: Thickness of the shell layer of the alginate gel fiber c: Outer diameter of the alginate gel fiber 4: Shell layer 5: Core layer 6: Antibody-producing cells
  • Microfluidic device 1 Introduction port of a base material containing antibody-producing cells 6: Introduction port of a mixed solution of chemically modified alginic acid derivatives of formulas (I) and (II) 3: Introduction port of calcium chloride solution 20: Chemically crosslinked alginate gel fiber 40: Introductory tube 50: Outlet
  • T-shaped fluid device 1 Introduction port of a base material containing antibody-producing cells 6: Introduction port of a mixed solution of chemically modified alginic acid derivatives of formulas (I) and (II) 3: Outlet DD: Calcium chloride solution
  • CFB Chemically cross-linked alginate gel fiber
  • AA Introductory tube / glass capillary
  • BB Introductory pipe / ETFE tube
  • CC Discharge pipe / Glass capillary
  • C ZZ Tip of glass capillary A (injection port)
  • Cap1 Silicon Cap Cap2: Silicon Cap Cap Cap3: Silicon Cap

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Abstract

さらなる抗体の生産方法が求められていた。抗体産生細胞（例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞）をコア層に含ませた抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法。

Description

化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
　本発明は、抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術を利用した抗体生産が行われている。これ迄に、抗体産生細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞又は大腸菌等が宿主細胞として用いられ種々の抗体が産生されている。
　とりわけ、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）は、浮遊培養が可能な細胞であり、又細胞の増殖速度が速く、ＣＨＯ細胞の大量培養により、目的のタンパク質を大量生産することが容易なことから、抗体の製造に頻用されている。
　近年、抗体医薬品の開発・製造において、抗体医薬品の安定生産、低コスト化への取組みが求められており、それらを達成するべく、より生産性の高い効率的な生産システム（例えば、連続生産方法、小規模生産設備による必要な量の抗体産生の為の新規な培養技術、等）の開発が注目されている。
　抗体産生細胞の培養は、抗体産生細胞株をスピナーフラスコ等で細胞を起こした後に、培地組成・温度・攪拌条件・ガス交換・ｐＨ等の培養条件を制御しながら拡大培養を行い、最終的に数千から１万Ｌスケールの大規模な生産培養タンクにて培養が行われる。
　抗体産生細胞を高密度で連続培養する場合、細胞と培養液の分離方法、効果的な酸素の供給方法等が問題になる場合がある。前者に関しては、重力沈降管や連続遠心分離機を用いて分離する方法等が検討されており、後者に関しては、培養タンク内に入れた多孔質のチューブを通した酸素拡散法、酸素溶解度の高いフッ素化炭素を培養液に添加する等の種々の方法が検討されており、種々の改善が図られている。しかし、抗体を効率的に生産させるためには、未だ種々の問題を解決することが必要とされている。
　コア部に各種細胞が含まれるコア・シェル構造を有するマイクロファイバが知られている（特許文献１：国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット）。
　細胞層を含む中空マイクロファイバ、当該マイクロファイバの製造方法が知られている。（特許文献２：国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット）
　アルギン酸ゲル中空ファイバの中空部にて、生体適合性ポリマー含有水溶液中に懸濁した細胞を培養することにより線状細胞凝集塊の作製方法が知られている。（特許文献３：特開２０１４－２３６６９８号公報）
　培養液を組織の隅々にまで供給することが可能な３次元細胞構造体の製造方法及び培養方法が知られている。（特許文献４：特開２０１６－７７２２９号公報）
　内部に細胞又は水溶性化学物質を含み、最外層に疎水性ポリマーを含む半透膜を備えることを特徴とするマイクロチューブが知られている。（特許文献５：特開２０１７－７７４７３号公報）
　細胞と細胞の周りを覆うハイドロゲルとを含む細胞ファイバが知られている。（特許文献６：特許６６０１９３１号公報）
　二重同軸層流を有するマイクロ流体装置を用いて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と分化細胞又は体細胞幹細胞をカプセル化したメーター長のコア－シェルハイドロゲル微小繊維の製造方法が知られている。（非特許文献１）
　アルギン酸塩とポリアクリルアミドからなるダブルネットワーク（ＤＮ）ハイドロゲルを用いて、機械的特性と取扱性を向上させた、細胞含有ハイドロゲルマイクロファイバーが知られている。（非特許文献２）
　特許文献１～６及び非特許文献１及び２には、本発明の抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法が開示されていないし、示唆もされていない。
　コア部に抗体産生細胞が含まれるコア・シェル構造を有するアルギン酸中空マイクロファイバが知られている（特許文献７：国際公開第２０２０／０３２２２１号パンフレット）。
アルギン酸の任意の１つ以上のカルボキシル基に、アミド結合及び２価のリンカーを介して環状アルキン基又はアジド基が導入された化学修飾アルギン酸誘導体が知られている（特許文献８：国際公開第２０１９／２４０２１９号パンフレット）。
国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット 国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット 特開２０１４－２３６６９８号公報 特開２０１６－７７２２９号公報 特開２０１７－７７４７３号公報 特許６６０１９３１号公報 国際公開第２０２０／０３２２２１号パンフレット 国際公開第２０１９／２４０２１９号パンフレット
Nature Materials.,12, p584－590, 2013年. ACS Biomater. Sci. Eng., 3 (3), p392－398, 2017年.
　これまで、抗体産生細胞（例えば、抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞等）及び基材（例えば、コラーゲン、培地、アルギン酸等の溶液、それらのゲル、又はそれらの混合物）が含まれるコア層を、化学修飾アルギン酸から形成される化学架橋アルギン酸ゲル、又はカルシウムイオン等の２価金属により形成されるイオン架橋及び化学修飾アルギン酸から形成される化学架橋の両方の架橋を有する架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆した抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ、及び当該ゲルファイバを用いて、遺伝子組換え抗体生産を行うことは知られていなかった。又、これまで、一定の長さを有する前記アルギン酸ゲルファイバを形成することや、当該アルギン酸ゲルファイバを用いた連続的な抗体の生産方法も知られていない。
　このような状況の下、さらなる抗体の生産方法が求められていた。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、抗体産生細胞及び基材（例えば、ハイドロゲル等の基材であって、具体的には、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、後述の態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、後述の態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材）が含まれるコア層を、後述する式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを被覆層（シェル層）として被覆することにより、抗体産生用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（当該、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバである）を作製できることを見出した。又、このように作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いて抗体産生細胞の培養を行ったところ、抗体を長期間連続して産生できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　後述の実施例から、抗体産生細胞として抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞及び基材として、培地（培養液）、メチルセルロース、又はアルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）からなる群から選択される基材を含むコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆し、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製し、当該ゲルファイバを培養したところ、長期間（後述の実施例において、最長で１１週の期間）連続して抗体（遺伝子組換え）を産生できることが分かった。このように、作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体産生ＣＨＯ細胞にとって抗体の連続産生に適した環境を提供しており、コア層で産生された抗体は、シェル層を連続的に透過しゲルファイバ外に放出された。
　本発明により、さらなる抗体の生産方法が提供される。
　いくつかの態様では、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆することで、長期間連続して抗体を産生することが可能な高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバが提供される。後述の実施例では、抗体産生細胞を含むコア層を、高い機械的強度を有するシェル層を形成するために、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（当該架橋アルギン酸ゲルは、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応により形成される化学架橋及び２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン等）より形成されるイオン架橋の両方の架橋、又は、前記化学架橋のいずれかを有している）で被覆した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製し、抗体産生細胞を培養することにより、コア層で長期間抗体が連続産生され、その抗体がシェル層を透過して、アルギン酸ゲルファイバ外に連続的に放出される特徴を有する。
　好ましい態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体の生産に適した環境を提供する。抗体産生細胞がコア層に封入されているため、細胞への物理的ストレスが少なく、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続けることが期待される。従って、このような化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の製造方法は、抗体の生産効率を飛躍的に向上させることが期待できる。例えば、大規模な培養タンクを要する抗体の浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を製造することも期待される。少量・多種品目の抗体医薬品製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術としても期待される。
コア層に抗体産生細胞が含有される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの断面図である。 コア層に抗体産生細胞が含有される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。 コア層に抗体産生細胞が含有される化学アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。 コア層に抗体産生細胞が含有されるアルギン酸ゲルファイバの横断面、産生された抗体、代謝物、老廃物、培養液（栄養源）、及び酸素がシェル層を透過することを説明する模式図である。 実施例Ｆ３－３の培養におけるファイバ中の生細胞数を示すグラフである。 実施例Ｆ３－３の培養におけるファイバ中の細胞生存率を示すグラフである。 実施例Ｆ３－３の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ３－４の培養における抗体生産累積量を示すグラフである。 実施例Ｆ２－３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２８日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２９日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－７で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２８日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－９で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（３３日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－１０で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（３３日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－８で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－６の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１１で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１１の培養後（４２日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－７の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１２で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１２の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－８の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１３の培養後（７７日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－９の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１４の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－１０の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１５の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ３－１１の培養における産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ２－１６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１６の培養後（６１日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。
［具体的態様］
　ここでは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法の具体的態様について説明する。より具体的には、以下の態様［１］～［６－１］に記載の通りである。
［１］第１の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて架橋反応を行うことにより形成される架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
［式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）は、アルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－は、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わし；
Ａｋｎは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
［式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
　下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）はアルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ２－は、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
［１－１］前記態様［１］の式（Ｉ）において、－Ｌ１－は、好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
より好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
更に好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
特に好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーである。
［１－２］前記態様［１］の式（Ｉ）において、Ａｋｎは、好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
 に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基であり；
より好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
 に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基であり；
更に好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
 に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基であり；
特に好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
 に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基である。
［１－３］前記態様［１］の式（ＩＩ）において、－Ｌ２－は、好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
より好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
更に好ましくは、下記表： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
特に好ましくは、下記表： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
 に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーである。
［１－４］前記態様［１］の式（Ｉ）において、Ａｋｎ及び－Ｌ２－の組み合わせは、好ましくは、下記表：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１］に記載の通りである）；
より好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
より好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
更に好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
特に好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 の群から選択される部分構造で示される通りであり；
最も好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 から選択される部分構造で示される通りである。
［１－５］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒo細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０細胞からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［１－６］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［１－７］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［１－７a］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、コラーゲン溶液、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、培地（または培養液）、メチルセルロース、又はアルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；より好ましくは、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［１－７ｂ］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲルであって、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、アルギン酸ゲル、又は前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルから選択される基材である。
［１－８］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、例えば、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
［１－９］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、例えば、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
［１－１０］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基（Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２基：Ａｋｎ、及び－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じである）の導入率が、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１０％の範囲である。
［１－１１］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基（Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２基：－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じである）の導入率が、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１５％の範囲である。
［１－１２］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、例えば、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
Ｘは、下記表： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
 に記載された部分構造式の群から選択される環状基である（各式中、両端の破線外側は含まない）］で表わされる基を介して化学架橋する。
［１－１２－１］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ１－は、前記態様［１－１］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ１－の定義と同じである。
［１－１２－２］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ２－は、前記態様［１－２］に記載された好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ２－の定義と同じである。
［１－１２－３］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、Ｘは、好ましくは、前記態様［１－１２］に記載された部分構造式（ＴＺ－１）、式（ＴＺ－１－ｒ）、式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－３）、式（ＴＺ－３－ｒ）、式（ＴＺ－４）、式（ＴＺ－４－ｒ）、式（ＴＺ－５）、式（ＴＺ－５－ｒ）、式（ＴＺ－６）、式（ＴＺ－６－ｒ）、式（ＴＺ－１０）、及び式（ＴＺ－１０－ｒ）からなる群より選択される基であり；より好ましくは、部分構造式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－３）、式（ＴＺ－３－ｒ）、式（ＴＺ－５）、式（ＴＺ－５－ｒ）、式（ＴＺ－６）、式（ＴＺ－６－ｒ）、式（ＴＺ－１０）、及び式（ＴＺ－１０－ｒ）からなる群より選択される基であり；更に好ましくは、部分構造式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－６）、及び式（ＴＺ－６－ｒ）からなる群より選択される基である。
［１－１２－４］前記態様［１－１２］において、式（ＩＩＩ－Ｌ）で表わされる基の－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の好ましい組み合わせは、下記表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
より好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下記表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
　より好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
　更に好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
特に好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式［式中、両端の破線外側は含まない］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 の群から選択される部分構造で示される通りであり；
最も好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式［式中、両端の破線外側は含まない］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 の群から選択される部分構造で示される通りである。
［１－１２Ａ］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、好ましくは、前記態様［１－１２］に記載された式（ＩＩＩ－Ｌ）［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、各定義は、前記態様［１－１２］中の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋され、更に２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオン）を介してイオン架橋されている。
［１－１２Ａ－１］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ１－は、前記態様［１－１２－１］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ１－の定義と同じである。
［１－１２Ａ－２］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ２－は、前記態様［１－１２－２］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい－Ｌ２－の定義と同じである。
［１－１２Ａ－３］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましいＸは、前記態様［１－１２－３］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましいＸの定義と同じである。
［１－１２Ａ－４］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい、最も好ましい－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、前記態様［１－１２－４］に記載の、好ましい、より好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい、最も好ましい－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせの定義と同じである。
［１－１２Ａ－５］前記態様［１－１２Ａ］において、イオン架橋形成に用いられる２価金属イオンは、好ましくは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン又は亜鉛イオンの群から選択される２価金属イオンであり；より好ましくは、カルシウムイオン又はバリウムイオンであり；更に好ましくは、カルシウムイオンである。
［１－１２Ａ－６］前記態様［１－１２Ａ］において、イオン架橋形成に用いられる２価金属イオンは、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、等からなる群から選択される２価金属イオンを含む水溶液を供給源とすることができ；好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であり；より好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
［１－１３］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が、例えば、約３００μｍ～約７５０μｍの範囲である。
［１－１４］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、例えば、約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
［１－１５］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が約３００μｍ～約７５０μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
［１Ａ－１］第１Ａ－１の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層が、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｘ－は、前記態様［１－１２］中の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋した架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆された化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
［１Ａ－２］第１Ａ－２の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層が、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｘ－は、前記態様［１－１２］中の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋した架橋アルギン酸ゲルと、２価金属イオンを介してイオン架橋した架橋アルギン酸ゲルとを含むシェル層で被覆された化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
［１Ａ－３］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、－Ｌ１－の好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい基は、前記態様［１－１］に記載の、－Ｌ１－の好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい基と同じである。
［１Ａ－４］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、－Ｌ２－の好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい基は、前記態様［１－３］に記載の、－Ｌ２－の好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい基と同じである。
［１Ａ－５］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、－Ｘ－の好ましい、より好ましい、更に好ましい基は、態様［１－１２－３］に記載の－Ｘ－の好ましい、より好ましい、更に好ましい基と同じである。
［１Ａ－６］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－の好ましい、より好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい、最も好ましい組合せは、態様［１－１２－４］に記載の－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－の好ましい、より好ましい、より好ましい、更に好ましい、特に好ましい、最も好ましい組合せと同じである。
［１Ａ－７］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞は、前記態様［１－５］または［１－６］に記載の細胞と同じである。
［１Ａ－８］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材は、前記態様［１－７］～［１－７ｂ］に記載の基材と同じである。
［１Ａ－９］前記態様［１Ａ－２］において、２価金属イオンは、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオンであり、より好ましくは、カルシウムイオン又はバリウムイオンであり；更に好ましくは、カルシウムイオンである。
［１Ａ－１０］前記態様［１Ａ－２］において、２価金属イオンは、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、等からなる群から選択される２価金属イオンを含む水溶液を供給源とすることができ；好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であり；より好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
［１Ａ－１１］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が、例えば、約３００μｍ～約７５０μｍの範囲である。
［１Ａ－１２］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、例えば、約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
［１Ａ－１３］前記態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が約３００μｍ～約７５０μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
　前記態様に記載されたＡｋｎ、－Ｌ１－、－Ｌ２－、Ｘの定義を適宜組み合わせた式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いることにより、前記態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバにおける、架橋アルギン酸ゲルの好ましい態様を任意に形成し得る。
［２］第２の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、図２に示される、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０を得る工程
を含むことを特徴とする、前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法である。
［２Ａ］第２Ａの態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、図３に示される、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、及び導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３を含む、Ｔ字型流体装置ＸＸを用い、
（１）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
（２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
（３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
（４）前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバＣＦＢを得る工程
を含むことを特徴とする、前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法である。
［２Ｂ］前記態様［２］または態様［２Ａ］における化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、前記態様［１］、態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバである。
［２－１］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［２－２］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［２－３］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［２－３ａ］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、コラーゲン溶液、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、培地（または培養液）、メチルセルロース、又はアルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；より好ましくは、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［２－３ｂ］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲルであって、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、アルギン酸ゲル、又は前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルから選択される基材である。
［２－４］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、２価金属イオンが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等からなる群から選択されるイオンであり；好ましくは、カルシウムイオン又はバリウムイオンであり；より好ましくは、カルシウムイオンである。
［２－５］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、等からなる群から選択される２価金属イオンを含む水溶液であり；好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であり；より好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
［２－６］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオンの濃度が、例えば、約１ｍＭ～約１Ｍの範囲、又は約２０～約５００ｍＭの範囲であり；好ましくは、１００ｍＭである。
［２－７］前記態様［２］又は［２Ｂ］において、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速は、例えば、約５０～約１００μＬ／分の範囲である。
［２－７Ａ］前記態様［２Ａ］又は［２Ｂ］において、マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速は、例えば、約５０～約１００μＬ／分の範囲である。
［２－８］前記態様［２］又は［２Ｂ］において、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、例えば、約２００～約４００μＬ／分の範囲である。
［２－８Ａ］前記態様［２Ａ］又は［２Ｂ］において、マイクロ流体装置ＸＸの導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、例えば、２００～４００μＬ／分の範囲である。
［２－９］前記態様［２］又は［２Ｂ］において、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、例えば、約２～約６ｍＬ／分の範囲である。
［２－１０］前記態様［２］又は［２Ｂ］において、例えば、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速が、約５０～約１００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速が、約２００～約４００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速が、約２～約６ｍＬ／分の範囲である。
［２－１０Ａ］前記態様［２Ａ］又は［２Ｂ］において、例えば、マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速が、約５０～約１００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置ＸＸの導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速が、約２００～約４００μＬ／分の範囲である。
［２－１１］前記態様［２］、［２Ａ］又は［２Ｂ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度は、例えば、約４～約３７℃の範囲である。
［３］第３の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、培養を行うことによる、抗体の製造方法である。
［３Ａ］前記態様［３］における化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、前記態様［１］、態様［１Ａ－１］または態様［１Ａ－２］のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバである。
［３－１］前記態様［３］において、培養容器は、例えば、組織培養用プレート、三角フラスコ、Ｔ－フラスコ、スピナーフラスコ、培養バッグ、動物細胞培養槽等からなる群から選択される容器であり；好ましくは三角フラスコ又は動物細胞培養槽である。培養は、例えば、静置培養または振とう培養などのいずれの方法を選択してもよく、回分培養（バッチ培養）、流加培養（フェドバッチ培養）、連続培養などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養または連続培養が好ましい。
［３－２］前記態様［３］～［３－１］のいずれか１つにおいて、培養の温度条件は、２８℃～３８℃であり、例えば、培養温度を３７℃または３０℃とし、５％ＣＯ２雰囲気下に培養装置（例えば、パナソニックヘルスケア（株），　ＭＩＲ－Ｓ１００Ｃの培養装置が挙げられるが、これに限定されるものでない）で１２５ｒｐｍの条件にて培養する。
［３－３］前記態様［３］～［３－２］のいずれか１つにおいて、培養する期間は、例えば、１４日であり；又は２８日であり；又は３３日である。
［３－３－１］前記態様［３］～［３－２］のいずれか１つにおいて、培養する期間は、例えば、１０日以上であり、又は２０日以上であり、又は３０日以上であり、又は４０日以上であり、又は５０日以上であり、又は６０日以上であり、又は７０日以上である。
［３－３－２］前記態様［３］～［３－２］のいずれか１つにおいて、培養する期間は、例えば、１４日であり；又は２８日であり；又は３３日であり；又は４２日であり；又は５６日であり；又は６１日であり；又は７７日である。
［３－４］前記態様［３］～［３－３－２］のいずれか１つにおいて、培養温度は、例えば、約３０～約３８℃の範囲である。
［３－４－１］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始から終了時までの温度が約３６℃～約３８℃であり、より好ましくは約３７℃である。
［３－４－２］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約１．０×１０8細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
［３－４－３］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約３．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
［３－４－４］前記態様［３－４］において、培養温度は、より好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約４．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
本明細書中、培養温度又は細胞濃度において、「約」と記載した場合、当該数値の±１０％迄、ある態様では当該数値の±２０％迄の値も含み得るものである。
［３－５］前記態様［３］～［３－４－４］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞は、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、前記態様[１－１]に記載の細胞であり、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［３－６］前記態様［３］～［３－５］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［３－７］前記態様［３］～［３－６］のいずれか１つにおいて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［３－７a］前記態様［３］～［３－６］のいずれか１つにおいて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、コラーゲン溶液、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、培地（または培養液）、メチルセルロース、又はアルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；より好ましくは、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［３－７ｂ］前記態様［３］～［３－６］のいずれか１つにおいて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲルであって、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、アルギン酸ゲル、又は前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルから選択される基材である。
［３－８］前記態様［３］～［３－７ｂ］のいずれか１つにおいて、培養液に、例えば、細胞増殖抑制剤を添加してもよく、培養液中に添加できる細胞増殖抑制剤が、例えば、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、塩化リチウム及び吉草酸からなる群から選択される添加剤であり；好ましくは、バルプロ酸又は吉草酸であり；より好ましくは、吉草酸である。
［４］第４の態様は、前記態様［３］～［３－７ｂ］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られるアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ等からなる群から選択されるアイソタイプを有する抗体である。
［４－１］前記態様［４］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体が有するアイソタイプが、好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＥであり；より好ましくは、ＩｇＧである。
［５］第５の態様は、前記態様［３］～［３－７ｂ］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られる化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、４５，０００～９００，０００の範囲である抗体である。
［５－１］前記態様［５］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、好ましくは、４５，０００～１６０，０００の範囲であり；より好ましくは１４０，０００～１５０，０００の範囲である。
［６］第６の態様は、前記態様［３］～［３－７ｂ］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて得られる抗体が、
　例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ－ＣＤ３、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ　オゾガマイシン、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ　チウキセタン、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ　ペゴル、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ　エムタンシン、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ　ベドチン、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ　オゾガマイシン、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブである。
［６－１］前記態様［６］において、前記態様［３］～［３－７ｂ］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて産生可能な抗体として、好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、アダリムマブ産生ＣＨＯを用いてアダリムマブ、又はニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブであり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブである。
以下、各態様についてより詳細に説明する。
１．アルギン酸（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いる原料のアルギン酸、及びコア層の基材に用いられるアルギン酸について）：
　本明細書中、アルギン酸と記載する場合、アルギン酸、アルギン酸エステル、及びそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）からなる群から選択される少なくとも１種のアルギン酸（「アルギン酸類」という場合がある）を意味する。用いられるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。好ましく用いられるアルギン酸類は、レッソニア、マクロシスティス、ラミナリア、アスコフィラム、ダービリア、カジカ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される生体内吸収性の多糖類であって、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ－グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸がランダムに配列した画分（Ｍ／Ｇ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。
　アルギン酸は、褐藻類の海藻から抽出し、精製して製造される天然多糖類の一種であり、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）が重合したポリマーである。アルギン酸のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）、すなわちゲル強度は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸のＭ／Ｇ比、ＭとＧの配列の仕方等によってアルギン酸の物理化学的性質が異なり、また好ましい用途が異なる場合がある。アルギン酸類のゲル化能力および生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。したがって、本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切なＭ／Ｇ比や適切な粘度のものを用いるのがよい。
　アルギン酸の工業的な製造方法には、酸法とカルシウム法などがあるが、本発明ではいずれの製法で製造されたものも使用することができる。精製により、ＨＰＬＣ法による定量値が８０～１２０質量％の範囲に含まれるものが好ましく、９０～１１０質量％の範囲に含まれるものがより好ましく、９５～１０５質量％の範囲に含まれるものがさらに好ましい。本発明においては、ＨＰＬＣ法による定量値が前記の範囲に含まれるものを高純度のアルギン酸と称する。本発明で使用するアルギン酸又はその塩は、高純度アルギン酸であることが好ましい。市販品としては、例えば、キミカアルギンシリーズとして、（株）キミカより販売されているもの、好ましくは、高純度食品・医薬品用グレードのものを購入して使用することができる。市販品を、さらに適宜精製して使用することも可能である。例えば、低エンドトキシン処理することが好ましい。精製法や低エンドトキシン処理方法は、例えば特開２００７－７５４２５号公報に記載されている方法を採用することができる。
　本発明で使用する「アルギン酸」におけるアルギン酸の塩としては、「アルギン酸の１価金属塩」であり、アルギン酸のＤ－マンヌロン酸またはＬ－グルロン酸のカルボン酸の水素イオンを、Ｎａ+やＫ+などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特に、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
　本明細書中、アルギン酸は、アルギン酸を（ＡＬＧ）として、アルギン酸の任意のカルボキシル基の１つを－ＣＯＯＨとして、（ＡＬＧ）－ＣＯＯＨと表記する場合がある。
　本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切な重量平均分子量のものを用いるのがよい。例えば、重量平均分子量が１万～１，０００万のものを用いるのが好ましく、より好ましくは１０万以上５００万以下、さらに好ましくは１５万以上３００万以下である。　
　いくつかの態様では、アルギン酸は、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸ナトリウムは、市販品のアルギン酸ナトリウムを用いることができる。ここで、後述の実施例では、アルギン酸ナトリウムは、下表に記載したＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、及びＢ－３のアルギン酸ナトリウム（発売元　持田製薬株式会社）を用いている。各アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％の水溶液の粘度、重量平均分子量及びＭ／Ｇ灯を下記の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
　前記アルギン酸ナトリウムＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、及びＢ－３の各物性値は、下記の各種方法により測定した。測定方法は、当該方法に限定されるものではないが、測定方法により各物性値が上記のものと異なる場合がある。
［アルギン酸ナトリウムの粘度測定］
　日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性測定装置レオストレスRS600（Thermo Haake GmbH）センサー：３５／１）を用いた。回転数は、１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍとした。読み取り時間は、２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値とした。測定温度は２０℃とした。
［アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量測定］
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と、（２）ＧＰＣ－ＭＡＬＳの２種類の測定法で測定した。測定条件は以下のとおりである。
［前処理方法］
　試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターろ過したものを測定溶液とした。
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定
［測定条件（相対分子量分布測定）］
　カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
　　溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
　　流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　　濃度：０．０５％
　　検出器：ＲＩ検出器
　　カラム温度：４０℃
　　注入量：２００μＬ
　　分子量標準：標準プルラン、グルコース
（２）ＧＰＣ－ＭＡＬＳ測定
［屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定（測定条件）］
　示差屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ　Ｔ－ｒＥＸ
　測定波長：６５８ｎｍ
　測定温度：４０℃
　溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
　試料濃度：０．５～２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
　カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
　　溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
　　流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　　濃度：０．０５％
　　検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
　　カラム温度：４０℃
　　注入量：２００μＬ
　本明細書中、アルギン酸、アルギン酸誘導体、架橋アルギン酸、及び架橋アルギン酸の分子量において、単位としてＤａ（ダルトン）を付記する場合がある。
　アルギン酸類のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸類のゲル化能力および生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。用いるアルギン酸類および／またはその塩のＭ／Ｇ比は、通常、０．１～４．０であり、ある態様では、０．１～３．０であり、ある態様では、０．１～２．０であり、ある態様では０．５～１．８であり、ある態様では０．８～１．２である。又、別の態様では、０．１～０．５である。
　また、本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切な粘度や、適切なＭ／Ｇ比のものを用いるのがよい。
　本明細書中、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
　本明細書中、用いられる「アルギン酸エステル」、「アルギン酸塩」とは、特に限定されないが、架橋剤と反応させるため、架橋反応を阻害する官能基を有していないことが必要である。アルギン酸エステルとしては、好ましくは、アルギン酸プロピレングリコール、等が挙げられる。
　本明細書中、アルギン酸塩としては、例えば、アルギン酸の１価の塩、アルギン酸の２価の塩が挙げられる。アルギン酸の１価の塩としては、好ましくは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、等が挙げられ、より好ましくは、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムであり、特に好ましくは、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸の２価の塩としては、好ましくは、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウム、等が挙げられる。
　アルギン酸は、高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１０００～１０００万、好ましくは１万～８００万、より好ましくは２万～３００万の範囲である。天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
　本明細書において本発明のアルギン酸誘導体またはアルギン酸又はその塩の分子量を特定する場合は、特段のことわりがない限り、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により算出される重量平均分子量である。本発明で使用するアルギン酸又はその塩としても、その最終使用用途に応じて、適切な分子量分布のものを用いることが望ましい。
　例えば、後記実施例に記載したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ともいう）の測定条件にて、好ましくは、１０万～５００万であり、より好ましくは１５万～３００万である。また、ある態様では、５０万～３００万の範囲であり、より好ましくは、１００万～２５０万であり、さらに好ましくは、１００万～２００万の範囲である。
　また、例えば、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、好ましくは１万以上、より好ましくは５万以上、さらに好ましくは６万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは５万～８０万であり、さらに好ましくは６万～５０万である。
　通常、高分子多糖類の分子量を上記のようなＳＥＣ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いた手法で算出する場合、約１０％～約３０％の測定誤差を生じうる。例えば、５０万であれば３５万～６５万、１００万であれば７０万～１３０万程度の範囲で値の変動が生じうる。本明細書中、分子量測定の記載において「約」と記載した場合、当該数値の±１０％迄、ある態様では当該数値の±２０％迄の値も含み得るものである。
　ここで、一般に天然物由来の高分子物質は、単一の分子量を持つのではなく、種々の分子量を持つ分子の集合体であるため、ある一定の幅を持った分子量分布として測定される。代表的な測定手法はゲルろ過クロマトグラフィーである。ゲルろ過クロマトグラフィーにより得られる分子量分布の代表的な情報としては、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、分散比（Ｍｗ／Ｍｎ）があげられる。
　分子量の大きい高分子の平均分子量への寄与を重視したのが重量平均分子量であり、下記式で表される。
　　Ｍｗ＝Σ（ＷｉＭｉ）／Ｗ＝Σ（ＨｉＭｉ）／Σ（Ｈｉ）
　数平均分子量は、高分子の総重量を高分子の総数で除して算出される。
　　Ｍｎ＝Ｗ／ΣＮｉ＝Σ（ＭｉＮｉ）／ΣＮｉ＝Σ（Ｈｉ）／Σ（Ｈｉ／Ｍｉ）
　ここで、Ｗは高分子の総重量、Ｗｉはｉ番目の高分子の重量、Ｍｉはｉ番目の溶出時間における分子量、Ｎｉは分子量Ｍｉの個数、Ｈｉはｉ番目の溶出時間における高さである。
　天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている（ヒアルロン酸の例：Ｃｈｉｋａｋｏ　ＹＯＭＯＴＡ　ｅｔ．ａｌ．　Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉ．，　Ｖｏｌ．１１７，　ｐｐ１３５－１３９（１９９９）、Ｃｈｉｋａｋｏ　ＹＯＭＯＴＡ　ｅｔ．ａｌ．　Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉ．，　Ｖｏｌ．１２１，　ｐｐ３０－３３（２００３））。アルギン酸の分子量測定については、固有粘度（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）から算出する方法、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ（Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ａｎｇｌｅ　Ｌａｓｅｒ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）により算出する方法が記載された文献がある（ＡＳＴＭ　Ｆ２０６４－００（２００６），ＡＳＴＭ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ発行）。本発明においては、重量平均分子量は、上記文献に示されるような常法にて、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子量を測定し、プルランを標準物質として用いた較正曲線により算出した値とすることができる。
　又、本発明においては、重量平均分子量は、上記文献に示されるような常法にて、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）―ＭＡＬＳにより測定した絶対分子量とすることができる。
アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
　本明細書中においてアルギン酸又はその塩の分子量を特定する場合は、特段のことわりがない限り、ゲルろ過クロマトグラフィーにより算出される重量平均分子量である。分子量測定にゲルろ過クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、例えば、後述する本実施例の条件を採用することができる。カラムは、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６　Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）を用いることができ、展開溶媒として、例えば、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用することができ、分子量標準としてブルーデキストラン、チログロブリン、フェリチン、アルドラーゼ、コンアルブミン、オブアルブミン、リボヌクレアーゼＡおよびアプロチニンを用いることができる。
　本明細書中で用いられるアルギン酸の粘度は、特に限定されないが、１ｗ／ｗ％のアルギン酸類の水溶液として粘度を測定した場合、好ましくは、１０ｍＰａ・ｓ～１０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、５０ｍＰａ・ｓ～８００ｍＰａ・ｓである。
　アルギン酸の水溶液の粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい－平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。より好ましくは、コーンプレート型粘度計を用いる。
　アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
　本明細書中で用いられるアルギン酸は、いくつかの態様においては、低エンドトキシン処理されていないアルギン酸あり、又は別のいくつかの態様においては、低エンドトキシン処理されたアルギン酸である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理されたアルギン酸類であることが望ましい。
　低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９－３２４００１号公報など参照）、β１，３－グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８－２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２－５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８－６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５－０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
　エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ－２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
　用いられるエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、アルギン酸類のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは、５０ＥＵ／ｇ以下、特に好ましくは、３０ＥＵ／ｇ以下である。本発明において、「実質的にエンドトキシンを含まない」とは、日局エンドトキシン試験により測定したエンドトキシン値が前記の数値範囲にあるものを意味する。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ　Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ　ＵＰ　ＬＶＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
　別のいくつかの態様において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられる前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、例えば、前記表２１に記載のアルギン酸ナトリウムＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、又はＢ－３から選択することが可能である。前記アルギン酸ナトリウムを用いて調製されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、例えば、０．１～２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）の範囲である。
又、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられる前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いられるアルギン酸ナトリウムは、好ましくは、Ａ－２又はＢ－２であり、又、当該アルギン酸ナトリウムを用いて調製されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、好ましくは、１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）である。
　いくつかの態様において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の形成に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、コラーゲン溶液、又は培地（または培養液）等を、混合して用いることも可能である。尚、アルギン酸ナトリウム溶液、コラーゲン溶液等に用いられる溶媒は、後述の通りである。
２．化学修飾アルギン酸誘導体
　本明細書中の化学修飾アルギン酸誘導体は、アルギン酸の任意の１つ以上のカルボキシル基にアミド結合及び２価のリンカーを介して、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応における反応性基又は当該反応性基の相補的な反応性基が導入されたものである。
　より具体的には、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）、－Ｌ１－、Ａｋｎ及び－ＮＨ－ＣＯ－の定義は、前述の第１の態様中の定義と同じである］で表されるアルギン酸誘導体、及び下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 ［式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）、－Ｌ２－、及び－ＮＨ－ＣＯ－の定義は、前述の第１の態様中の定義と同じである］で表されるアルギン酸誘導体である。
　前記の２価のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）は、反応性基と当該反応性基と相補的な反応性基との反応を阻害しない限り、任意の直鎖状基の使用が可能である。具体的には、直鎖のアルキレン基（－（ＣＨ２）ｎ－、ｎ＝１～３０）（当該基中の－ＣＨ２－は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＯＮＨ－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、ベンゼン環、複素環（ピリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、等の５～６員芳香族複素環又は５～６員非芳香族複素環）、等の基で複数個（例えば、１～１０個、又は１～５個）置き換えられても良く、当該－ＣＨ２－の水素原子は、オキソ基（＝Ｏ）、Ｃ１－６アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉｓｏ－プロピル基、等の基）、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、等）、水酸基（－ＯＨ）、等の基から選択される基で複数個（例えば、１～１０個、又は１～５個）置換されていても良い）が挙げられる。
　前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体の－ＮＨ－ＣＯ－基における、イミノ基（－ＮＨ－）の水素原子をメチル基に置換し－Ｎ（Ｍｅ）－ＣＯ－基することが可能である。
　前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体における、リンカー（－Ｌ１－、－Ｌ２－）とアルギン酸の結合様式は、－ＮＨ－ＣＯ－結合、又は－Ｎ（Ｍｅ）－ＣＯ－があり；好ましくは、－ＮＨ－ＣＯ－結合である。　
　本明細書中の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体は、例えば、下記式の方法（詳細は、後述の一般的製造方法を参照）により製造することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　本明細書の式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。又、式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
　本明細書中、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基は、アルギン酸構成単位の全てのカルボキシル基に結合している必要はなく、又、式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基は、アルギン酸構成単位の全てのカルボキシル基に結合している必要はない。
　本明細書中、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基を反応性基と言う場合、式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基が相補的な反応性基となる。又、逆に式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基を反応性基と言う場合、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基が相補的な反応性基となる。
　本明細書中、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基の導入率は、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１０％の範囲である。又、式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基の導入率は、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１５％の範囲である。
　前記反応性基又は相補的な反応性基の導入率は、アルギン酸類の繰り返し単位であるウロン酸単糖単位のうち、各反応性基が導入されたウロン酸単糖単位の数を百分率で表した値である。本明細書中、特に断らない限り、アルギン酸誘導体（式（Ｉ）または式（ＩＩ））における反応性基又は相補的な反応性基の導入率に用いられる％は、ｍｏｌ％を意味する。各反応性基又は相補的な反応性基の導入率は、後述の実施例に記載の方法により求めることができる。
　本明細書中、式（Ｉ）中の環状アルキン基（Ａｋｎ）及び式（ＩＩ）中のアジド基が、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応によりトリアゾール環を形成し、これにより架橋が形成される。
３．Ｈｕｉｓｇｅｎ反応
　Ｈｕｉｓｇｅｎ反応（１，３－双極子付加環化反応）は、下記式に示される様に末端アジド基及び末端アルキン基を有する化合物間の縮合反応である。反応の結果、二置換１，２，３－トリアゾール環が収率良く得られ、余計な副生成物が生じないという特徴を有している。当該反応は、１，４－又は１，５－二置換トリアゾール環が生成し得ると考えられるが、銅触媒を用いることで位置選択的にトリアゾール環を得ることが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　又、銅触媒を用いないＨｕｉｓｇｅｎ反応がＷｉｔｔｉｇとＫｒｅｂｓにより報告がなされている。即ち、シクロオクチンとフェニルアジドを混合するだけで環化付加体が得られる反応である（下記式中、Ｒ３＝フェニルである）。本反応は、シクロオクチンの三重結合が大きく歪んでいるため、フェニルアジドとの反応による歪みの解消が駆動力となり、反応が自発的に進行することにより、触媒が不要となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　以上の様に、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応は、置換された１級アジド、２級アジド、３級アジド、芳香族アジド、等を有するアジド化合物、及びアジド基の相補的な反応性基である末端又は環状アルキン基を有する化合物を用いることができる。又、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応では、ほぼアジド基及びアルキン基のみが反応することから、反応基質中に種々の官能基（例えば、エステル基、カルボキシル基、アルケニル基、水酸基、アミノ基、等）を置換させることが可能である。
　いくつかの態様では、望ましくない副生成物を生じさせず、銅触媒による細胞毒性を回避させる為に銅触媒を用いずに、短時間、容易に、且つ効率的に１，２，３－トリアゾール環による架橋をアルギン酸分子間に形成させる為に、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応のアルキン基としては、例えば、前記態様［１］に記載した環状アルキン基（シクロオクチル基）を用いる。
　好ましい態様の化学修飾アルギン酸誘導体の架橋方法においては、当該反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）にて望ましくない副生成物がほとんど形成されない。
４．化学修飾アルギン酸誘導体の合成方法
　本明細書において、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体は、各々、Ｈ２Ｎ－Ｌ１－Ａｋｎ（式中、－Ｌ１－及びＡｋｎは、前記態様［１］中の定義と同じである）で表わされるアミン誘導体（ＡＭ－１）、又は、Ｈ２Ｎ－Ｌ２－Ｎ３（式中、－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じである）で表わされるアミン誘導体（ＡＭ－２）を、アルギン酸類の任意のカルボキシル基とを、縮合剤を用いる縮合反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］
　０．５重量％～１重量％のアルギン酸水溶液及び式（ＡＭ－１）で表わされるアミンを用いて、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座　第５版　１６、有機化合物の合成ＩＶ、カルボン酸および誘導体、エステル類、ｐ３５－７０、酸アミドおよび酸イミド、ｐ１１８－１５４、アミノ酸・ペプチド、ｐ２５８－２８３、２００７年、丸善』等に記載された方法に準じて、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＢＯＰ試薬）、ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィニッククロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＣＩＰ）、又は４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、等から選択される縮合剤の存在下、アルギン酸が析出しない程度の、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、メタノール、エタノール、２－プロパノール、等のアルコール系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒と水との混合溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、又はトリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下又は非存在下にて、０℃から５０℃間の温度で縮合反応を行うことにより、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体を製造することができる。
［式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］
　０．５重量％～１重量％のアルギン酸水溶液及び式（ＡＭ－２）で表わされるアミンを用いて、前述の［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］に準じて反応をおこなうことにより、式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体を製造することができる。
　前記、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体又は式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法において、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）のアミンの導入率は、当該アミンの性質等を考慮することで、下記（ｉ）～（ｖ）等の反応条件を適宜選択して組み合わせることにより調節が可能になる。（ｉ）縮合剤の等量の増減、（ｉｉ）反応温度の上昇・下降、（ｉｉｉ）反応時間の延長・短縮、（ｉｖ）反応基質のアルギン酸の濃度の調整、（ｖ）式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）のアミンの溶解度を上げる為に水に混和する有機溶媒を添加する、等。
　以下に、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミンのうち、より具体的なアミンの製造方法を示す。
　尚、以下の各製造方法中、ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４、ｓ５、ｓ６、ｓ７、ｓ８、ｓ９、ｓ１０、ｓ１１、ｓ１２、ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４、ｔ５、ｔ６、ｔ７、ｔ８、ｔ９、ｔ１０、ｔ１１、ｔ１２、ｍ１、ｎ１、ｍ２ａ、ｎ２ａ、ｐ２ａ、ｍ２ｂ、ｎ２ｂ、ｐ２ｂ、ｍ３、ｎ３、ｐ３、ｍ４ａ、ｎ４ａ、ｍ４ｂ、ｎ４ｂ、ｍ５ａ、ｎ５ａ、ｐ５ａ、ｑ５ａ、ｍ５ｂ、ｎ５ｂ、ｐ５ｂ、ｑ５ｂ、ｍ６ａ、ｎ６ａ、ｐ６ａ、ｍ６ｂ、ｎ６ｂ、ｐ６ｂ、ｍ７、ｎ７、ｍ８ａ、ｎ８ａ、ｍ８ｂ、ｎ８ｂ、ｍ９ａ、ｎ９ａ、ｐ９ａ、ｍ９ｂ、ｎ９ｂ、ｐ９ｂ、ｍ１０、ｎ１０、ｐ１０、ｘ１、ｘ２、ｘ２ａ、ｙ２ａ、ｘ２ｂ、ｙ２ｂ、ｘ３、ｙ３、ｘ４、ｙ４、ｚ４、ｘ５ａ、ｙ５ａ、ｘ５ｂ、ｙ５ｂ、ｘ６ａ、ｙ６ａ、ｚ６ａ、ｖ６ａ、ｘ６ｂ、ｙ６ｂ、ｚ６ｂ、ｖ６ｂ、ｘ７ａ、ｙ７ａ、ｚ７ａ、ｘ７ｂ、ｙ７ｂ、ｚ７ｂ、ｘ８ａ、ｙ８ａ、ｚ８ａ、ｘ８ｂ、ｙ８ｂ、ｚ８ｂ、ｘ９ａ、ｙ９ａ、ｚ９ａ、ｘ９ｂ、ｙ９ｂ、及びｚ９ｂの定義は前記態様［１］中の記載と同じ定義であり；ＲＡ＝メチル基、エチル基、等のＣ１～６アルキル基であり；Ｐ１又はＰ２は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ｔｅｒｔＢｕ基、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｂｎ基、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３基、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３基、等から選択されるアミノ基の保護基であり；　Ｐ２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ｔｅｒｔＢｕ基、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｂｎ基、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３基、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３基、－ＳＯ２Ｐｈ、－ＳＯ２ＰｈＭｅ基、－ＳＯ２Ｐｈ（ＮＯ２）基、等から選択されるアミノ基の保護基であり；Ｅ＝ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、等）、－ＯＴｓ基、－ＯＭｓ基、等の脱離基であり、Ｘ＝ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、等）である。
　又、以下の各製造方法中、保護基Ｐ１及びＰ２の保護・脱保護は、文献公知の方法、例えば、『プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）　第４版、２００７年、ジョン　ウィリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら』の成書に記載された脱保護の方法に準じて、保護・脱保護を行うことができる。
［製造方法Ａ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－１）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　式（ＳＭ－１）の化合物［式（ＳＭ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－１）の化合物［式（ＲＧ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１６９、ｐ３３２－３４０、２０１７年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＡｇＯ３ＳＣＦ３存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中（ＲＧ－１）を置換させ、続いて（ｉｉ）ＤＢＵを用いて脱臭素化反応を行うことでアルキン基を形成し、更に（ｉｉｉ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－１）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｂ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
＜工程１＞
　式（ＳＭ－２）の化合物［式（ＳＭ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－２）［式（ＲＧ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０１４（６），　ｐ１２８０－１２８６；　２０１４年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＰＰｈ３、及びＮ２（ＣＯ２ＣＨＭｅ２）２の試薬存在下、テトラヒドロフラン等の反応に関与しない溶媒中、光延反応を行い、続いて（ｉｉ）水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、加水分解を行うことにより式（ＩＭ－１）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｂ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－１）の化合物及び式（ＲＧ－３）［式（ＲＧ－３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、（ｉｉｉ）前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて（ｉｖ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－２）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｂ１］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２ａ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｂ１）の化合物及び式（ＲＢ－Ｂ１－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ１）及び式（ＲＢ－Ｂ１－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］を用いて、文献公知の方法、例えば、ＵＳ２００９／００６８７３８等に記載された方法に準じて反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ１－１）で表される化合物を製造する。
＜工程２＞
　式（ＩＭ－Ｂ１－１）の化合物及び式（ＲＧ－７ｘ）［式（ＲＧ－７ｘ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－２ａ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｂ２］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
前記［製造方法Ｂ１］において、式（ＲＢ－Ｂ１－１）の化合物を式（ＲＢ－Ｂ２－１）の化合物［式（ＲＢ－Ｂ２－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］に置き換えて、［製造方法Ｂ１］に記載の方法に準じて反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－２ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｂ３］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２ｃ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｂ３）の化合物及び式（ＲＢ－Ｂ３－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ３）及び式（ＲＢ－Ｂ３－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］を用いて、文献公知の方法、例えば、ＵＳ２００９／００６８７３８等に記載された方法に準じて反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ３－１）で表される化合物を製造する。
＜工程２＞
　式（ＩＭ－Ｂ３－１）の化合物及び式（ＲＧ－７ｘ）［式（ＲＧ－７ｘ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－２ｃ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｂ４］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２ｄ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
前記［製造方法Ｂ３］において、式（ＲＢ－Ｂ３－１）の化合物を式（ＲＢ－Ｂ４－１）の化合物［式（ＲＢ－Ｂ４－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］に置き換えて、［製造方法Ｂ３］に記載の方法に準じて反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－２ｄ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｂ５］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２e）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｂ５）の化合物及び式（ＲＢ－Ｂ５－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ５）及び式（ＲＢ－Ｂ５－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］を用いて、文献公知の方法、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　５４（２３），　ｐｐ５４１１－１３，１９８９年等に記載された方法に準じて反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ５－１）で表される化合物を製造する。
＜工程２＞
式（ＩＭ－Ｂ５－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　５４（２３），　ｐｐ５４１１－１３，１９８９年等に記載された方法に準じて、ＯＨ基の除去を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ５－２）で表される化合物を製造する。
＜工程３＞
　式（ＩＭ－Ｂ５－２）の化合物を用いて、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　５５（３３），　ｐｐ４５７６－４５８０，２０１４年等に記載された方法に準じて、臭素を付加させた後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ５－３）で表される化合物を製造する。
＜工程４＞
　式（ＩＭ－Ｂ５－３）の化合物を用いて、エステル基の加水分解後、式（ＲＧ－７ｘ）の化合物との縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－２e）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｂ６］
　式（ＡＭ－ＯＬ－２ｆ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
前記［製造方法Ｂ５］において、式（ＲＢ－Ｂ５－１）の化合物を式（ＲＢ－Ｂ６－１）の化合物［式（ＲＢ－Ｂ６－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］に置き換えて、［製造方法Ｂ５］に記載の方法に準じて反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－２ｆ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｃ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－３）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
＜工程１＞
　式（ＳＭ－１）の化合物及び式（ＲＧ－４）の化合物［式（ＲＧ－４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ、１２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＡｇＣｌＯ４存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中、式（ＲＧ－４）の化合物を置換させ、続いて（ｉｉ）ＮａＯＭｅを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、（ｉｉｉ）水酸化リチウム、水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、加水分解を行うことにより式（ＩＭ－２）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｃ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－２）の化合物及び式（ＲＧ－５）の化合物［式（ＲＧ－５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－３）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｃ１］
　式（ＡＭ－ＯＬ－３Ａ１）及び式（ＡＭ－ＯＬ－３Ａ２）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
＜工程１＞　式（ＳＭ－Ｃ１）の化合物および式（ＲＧ－Ｃ１－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｃ１）の化合物および式（ＲＧ－Ｃ１－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、ＷＯ２００４／０３５０１７等に記載された方法に準じて、グリニャール反応を行い、続いて酸化反応を行うことで、式（ＩＭ－Ｃ１－１）の化合物を得る。
＜工程２＞　式（ＩＭ－Ｃ１－１）の化合物のカルボニル基を保護した後（例えば、アセタール基等）、シクロオクテン環に臭素を付加させ、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行い、続いてカルボニル基の保護基及び保護基Ｐ１を脱保護することで、式（ＡＭ－ＯＬ－３Ａ１）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
＜工程３＞　式（ＡＭ－ＯＬ－３Ａ１）のアミン又はその塩と式（ＲＧ－Ｃ１－２）の化合物［式（ＲＧ－Ｃ１－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、縮合反応を行い、保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－ＯＬ－３Ａ２）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｃ２］
　式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｂ１）及び式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｂ２）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
前記［製造方法Ｃ１］において、式（ＳＭ－Ｃ１）の化合物を式（ＳＭ－Ｃ２）の化合物［式（ＳＭ－Ｃ２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］に置き換えて、［製造方法製造方法Ｃ１］に記載の方法に準じて反応を行うことにより、式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｂ１）及び式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｂ２）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
前記［製造方法Ｃ１］及び［製造方法Ｃ２］の＜工程１＞で用いるアルデヒドを、下記式のアルデヒド［各アルデヒドは市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる］に置き換えて反応を行うことにより対応するリンカーを有するアミン、又はその塩を製造する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
［製造方法Ｃ３］
　式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｃ１）及び式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｃ２）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
＜工程１＞　式（ＳＭ－Ｃ３）の化合物［式（ＳＭ－Ｃ３）の化合物は市販化合物又は文献公知の方法、例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３（２２），ｐ７１５０－７１５７，２０１５年等に記載された方法により製造できる］を用いて、常法に従い酸クロライドに変換した後、式（ＲＧ－Ｃ３－１）の化合物［式（ＲＧ－Ｃ３－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いてグリニャール反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することで、式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｃ１）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
＜工程２＞　式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｃ１）のアミン又はその塩と式（ＲＧ－Ｃ１－２）の化合物を用いて、縮合反応を行い、保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－ＯＬ－３Ｃ２）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
前記［製造方法Ｃ３］の＜工程１＞で用いる化合物を、下記式の化合物［各化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる］に置き換えて反応を行うことにより対応するリンカーを有するアミン、又はその塩を製造する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
［製造方法Ｄ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－５）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
＜工程１＞
　式（ＳＭ－３）の化合物［式（ＳＭ－３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｆａｍｉｎｇ　Ｚｈｕａｎｌｉ　Ｓｈｅｎｑｉｎｇ，　１０４５２９８９８，　２２　Ａｐｒ　２０１５年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ピリジン等の塩基存在下、エタノール等の反応に関与しない溶媒中、Ｈ２ＮＯＨ－ＨＣｌを反応させオキシムを形成させ、続いて（ｉｉ）Ｐ２Ｏ５，　メタンスルホン酸中、五酸化二リンを反応させ、ベックマン転移を行うことにより８員環ラクタムを形成させる、続いて（ｉｉｉ）ジエチルエーテール等の反応に関与しない溶媒中、ＢＨ３、ＬｉＡｌＨ４等の還元剤を用いてアミド基の還元を行ことにより、式（ＩＭ－３）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｄ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－３）及び式（ＲＧ－６）［式（ＲＧ－６）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、（iｖ）前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い縮合体が得られる、続いて（ｖ）臭素を付加させて後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、続いて（ｖｉ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－５）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。　　
［製造方法Ｅ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－６）及び式（ＡＭ－ＯＬ－７）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
＜工程１＞
　［製造方法Ｄ］＜工程１＞の（ｉｉ）で得られる式（ＩＭ－４）の化合物及び式（ＲＧ－７）の化合物［式（ＲＧ－７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４６（５）、ｐ６６９－６７７、２０１４年』等に記載された方法に準じて、水酸化ナトリウム等の塩基及びテトラブチルアンモニウムブロマイド等の相間移動触媒の存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中で、反応することにより式（ＩＭ－５）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｅ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－５）の化合物に、臭素を付加させて後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、続いて保護基Ｐ２を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－６）で表されるアミン、又は式（ＡＭ－ＯＬ－６）の塩として製造することができる。
＜工程３＞
　［製造方法Ｅ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－５）の化合物を用いて、［製造方法Ｄ］＜工程１＞の（ｉｉｉ）の還元法に準じて反応を行うことで、式（ＩＭ－６）の化合物を製造することができる。
＜工程４＞
　［製造方法Ｅ］＜工程３＞で得られる式（ＩＭ－６）の化合物を用いて［製造方法Ｅ］＜工程２＞と同様に反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－７）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｅ２］
　式（ＡＭ－ＯＬ－６ａ）、式（ＡＭ－ＯＬ－６ｂ）、式（ＡＭ－ＯＬ－７ａ）及び式（ＡＭ－ＯＬ－７ｂ）で表されるアミンの製造方法：
前記［製造方法Ｅ］において、式（ＲＧ－７）の化合物を（ｉ）式（ＲＧ－７ａ）の化合物または（ｉｉ）式（ＲＧ－７ｂ）の化合物［式（ＲＧ－７ａ）の化合物および式（ＲＧ－７ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］に置き換えて、［製造方法Ｅ］に記載の方法に準じて反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－６ａ）、式（ＡＭ－ＯＬ－６ｂ）、式（ＡＭ－ＯＬ－７ａ）及び式（ＡＭ－ＯＬ－７ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
［製造方法Ｆ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－８）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
＜工程１＞
　式（ＳＭ－４）の化合物［式（ＳＭ－４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　（９），　ｐ１１９１－１１９４；　２００２年』等に記載された方法に準じて、臭素を付加させた後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成することで、式（ＩＭ－７）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｆ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－７）の化合物及び式（ＲＧ－８）の化合物［式（ＲＧ－８）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり（詳細は後述の製造方法Ｈを参照）］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ、　１２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』又は『Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９４、ｐ３２６０－３２７５、１９６１年』等に記載された方法に準じて、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－８）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｇ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－９）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
　式（ＳＭ－５）の化合物［式（ＳＭ－５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『米国特許出願公開２０１３－０１３７８６１号明細書』等に記載された方法に準じて、ジクロロメタン等の反応に関与しない溶媒中で、ピリジン等の塩基存在下／非存在下、クロロギ酸ｐ－ニトロフェニルを反応させることでカーボネート体が得られる。続いて、トリエチルアミン存在下、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶媒中、式（ＲＧ－９）の化合物［式（ＲＧ－９）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を反応させることでカルバモイル体が得られる。更に、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－９）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｇ２］
　式（ＡＭ－ＯＬ－９ａ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
＜工程１＞　式（ＳＭ－Ｇ２）の化合物［式（ＳＭ－Ｇ２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，５１（１７），ｐ４１１２－４１１６，２０１２年　等に記載された方法に準じて、グリニャール反応を行い、続いて酸化反応を行うことで、式（ＩＭ－Ｇ２－１）の化合物を得る。
＜工程２＞　式（ＩＭ－Ｇ２－１）の化合物の保護基Ｐ１を脱保護することで、式（ＡＭ－ＯＬ－９ａ）で表されるアミン、又はその塩を製造する。
［製造方法Ｈ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－１）で表されるアミンの製造方法［式（ＡＭ－ＬＫ－１）のうち、ｔ１＝１，ｔ２＝３のｐ置換アミンは、国際公開第２０１６／１５２９８０号パンフレット等に記載された方法に準じて、製造することもできる。］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
＜工程１＞
　式（ＳＭ－６）の化合物［式（ＳＭ－６）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及び式（ＲＧ－１０）の化合物［式（ＲＧ－１０）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－８）を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｈ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－８）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，２９（２３），ｐ６６１９－６６２２；２０１０年』等に記載された方法に準じて、ジメチルスルホキシド等の反応に関与しない溶媒中、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－１）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｊ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－２）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
＜工程１＞
　式（ＳＭ－７）の化合物［式（ＳＭ－７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－１１）の化合物［式（ＲＧ－１１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法Ｂ］＜工程１＞に準じる光延反応を行い、続いて水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、エステル基の加水分解を行うことにより、式（ＩＭ－９）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｊ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－９）の化合物及び式（ＲＧ－１２）［式（ＲＧ－１２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより縮合体が得られ、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－２）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｋ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－３）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
＜工程１＞
　［製造方法Ｊ］＜工程１＞の式（ＳＭ－７）の化合物及び式（ＲＧ－１３）の化合物［式（ＲＧ－１３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法Ｂ］＜工程１＞に準じる光延反応を行い、続いて水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、エステル基の加水分解を行うことにより、式（ＩＭ－１０）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｋ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－１０）の化合物及び式（ＲＧ－１４）［式（ＲＧ－１４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより縮合体が得られ、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－３）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｌ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－４）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
＜工程１＞
　式（ＳＭ－８）の化合物［式（ＳＭ－８）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『国際公開第２００９／０６７６６３号パンフレット』等に記載された方法に準じて、臭素を付加させて後、ＬｉＮ（ｉ－Ｐｒ）２を用いて脱臭素化を行うことで式（ＩＭ－１１）の化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｌ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－１１）の化合物及び式（ＲＧ－１５）で表わされる化合物［式（ＲＧ－１５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、水素化ナトリウム等の塩基存在下、テトラヒドロフラン等の反応に関与しない溶媒中で反応させることで、側鎖が導入された化合物が得られる。続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－ＯＬ－４）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｍ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－４）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｍ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
　また、式（ＳＭ－Ｍ）で表されるカルボン酸を、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座　第５版　１６、カルボン酸および誘導体、酸ハロゲン化物、酸無水物、９９－１１８頁、２００７年、丸善』、等に記載された方法に準じて、酸ハロゲン化物や酸無水物に変換し、式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物を用いて、トリエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、トルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒中、０℃から溶媒が還流する温度で反応させることにより、式（ＩＭ－Ｍ－１）の化合物を同様に製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｍ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｍ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　第４版、２００７年、ジョン　ウィリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＬＫ－４）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｎ］
　式（ＡＭ－ＯＬ－１７）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｎ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｎ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｎ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｎ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｎ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｎ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｎ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　第４版、２００７年、ジョン　ウィリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＯＬ－１７）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｒ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－５）で表されるアミンの製造方法［式（ＡＭ－ＬＫ－５）のうち、ｔ８＝１、ｔ９＝２のアミンは、国際公開第２０１６／１５２９８０号パンフレット等に記載された方法に準じて、製造することもできる。］：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｒ）の化合物［式（ＳＭ－Ｒ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及び式（ＲＧ－Ｒ－１）の化合物［式（ＲＧ－Ｒ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｒ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｒ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｒ－１）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｈ］＜工程２＞と同様にＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－５）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｓ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－６）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
＜工程１＞
［Ｅ＝ＯＴｓ基又はＯＭｓ基の場合］：
　式（ＳＭ－Ｓ）の化合物［式（ＳＭ－Ｓ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及びメタンスルホン酸クロライド、トシル酸クロライド、無水トシル酸等の試薬を用いて、文献公知の方法、例えば、『Journal of the American Chemical Society、136(29)、ｐ10450-10459、2014年』等に記載された方法に準じて、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒など反応に関与しない溶媒、もしくはこれらの混合溶媒を用いて又は無溶媒にて、－７８℃から溶媒が還流する温度で反応を行い、式（ＩＭ－Ｓ－１）で表される化合物を製造することができる。
［Ｅ＝ハロゲン（塩素、臭素、ヨウ素の場合）］：
　式（ＳＭ－Ｓ）の化合物を用い、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座　第４版　１９、有機合成Ｉ、炭化水素・ハロゲン化合物、３６３－４８２頁、１９９２年、丸善』等に記載された方法に準じて、下記に示す各種ハロゲン化剤（塩素化剤、臭素化剤、ヨウ素化剤）及び反応に関与しない溶媒を適宜選択し、０℃から溶媒が還流する温度で反応を行うことで、式（ＩＭ－Ｓ－１）で表わされるハロゲン化化合物（Ｅ＝塩素、臭素、ヨウ素）を製造することができる。
＜Ｅ＝塩素の場合＞
　塩素化剤として、塩化水素／塩化亜鉛（ＨＣｌ／ＺｎＣｌ２）、塩化水素／ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＣｌ／ＨＭＰＡ）、塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）、四塩化炭素／トリフェニルホスフィン（ＣＣｌ４／ＰＰｈ３）、トリホスゲン／トリフェニルホスフィン（（ＣＣｌ３）２ＣＯ／ＰＰｈ３）、トリホスゲン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＰＯＣl３／ＤＭＦ）等の試薬を用いることで、所望の塩素化物を製造することができる。
＜Ｘ＝臭素の場合＞
　臭素化剤として、４８％臭化水素酸（４８％ＨＢｒ）、４８％臭化水素酸／硫酸（４８％ＨＢｒ／Ｈ２ＳＯ４）、臭化水素／臭化リチウム（ＨＢｒ／ＬｉＢｒ）、臭化ナトリウム／硫酸（ＮａＢｒ／Ｈ２ＳＯ４）、三臭化リン（ＰＢｒ３）等の試薬を用いることで、所望の塩素化物を製造することができる。また、式（ＩＭ－Ｓ－１）において、Ｅ＝ＯＴｓ又はＯＭｓの化合物に、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）を反応させることでも、所望の臭素化物を製造することができる。
＜Ｘ＝ヨウ素の場合＞
　ヨウ素化剤として、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、ヨウ素／トリフェニルホスフィン（Ｉ２／ＰＰｈ３）等の試薬を用いることで、所望のヨウ素化物を製造することができる。また、　式（ＩＭ－Ｓ－１）において、Ｅ＝ＯＴｓ又はＯＭｓの化合物に、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を反応させることでも、所望のヨウ素化物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｓ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－１）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｈ］＜工程２＞と同様にＮａＮ３を反応させることで、式（ＩＭ－Ｓ－２）の化合物を製造することができる。
＜工程３＞
［製造方法Ｓ］＜工程２＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－２）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｂ］＜工程１＞のエステル基の加水分解反応と同様にして、加水分解を行うことで、式（ＩＭ－Ｓ－３）の化合物を製造することができる。
＜工程４＞
［製造方法Ｓ］＜工程３＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－３）及び式（ＲＧ－Ｓ－１）の化合物［式（ＲＧ－Ｓ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｓ－４）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程５＞
［製造方法Ｓ］＜工程４＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－４）の化合物の保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－６）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｔ］
　式（ＡＭ－ＬＫ－７）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
＜工程１＞
　式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｔ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
　また、式（ＳＭ－Ｍ）で表されるカルボン酸を、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座　第５版　１６、カルボン酸および誘導体、酸ハロゲン化物、酸無水物、９９－１１８頁、２００７年、丸善』、等に記載された方法に準じて、酸ハロゲン化物や酸無水物に変換し、式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物を用いて、トリエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、トルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒中、０℃から溶媒が還流する温度で反応させることにより、式（ＩＭ－Ｔ－１）の化合物を同様に製造することができる。
＜工程２＞
　［製造方法Ｔ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｔ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　第４版、２００７年、ジョン　ウィリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＬＫ－７）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ａ］式（ＡＭ－１－Ｂ１）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
　式（ＳＭ－Ｂ１）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ１）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ１）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ１）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｂ］式（ＡＭ－１－Ｂ２ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ２ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
　式（ＳＭ－Ｂ２ａ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ａ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ２ａ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法ＡＭ－Ａ］と同様にして、反応させることで式（ＡＭ－１－Ｂ２ａ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。同様にして、式（ＳＭ－Ｂ２ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ２ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて同様に反応を行うことで、式（ＡＭ－１－Ｂ２ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｃ］式（ＡＭ－１－Ｂ３）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
　式（ＳＭ－Ｂ３）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ３）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＲＧ－Ｂ３）、式（ＲＧ－Ｂ３－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ３－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｄ］式（ＡＭ－１－Ｂ５a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ５ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
　上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ５ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ５ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ５ａ）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ－１）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ－２）、式（ＳＭ－Ｂ５ｂ）、式（ＲＧ－Ｂ５ｂ）、式（ＲＧ－Ｂ５ｂ－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ５ｂ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｅ］式（ＡＭ－１－Ｂ６a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ６ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
　上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ６ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ６ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ６ａ）、式（ＲＧ－Ｂ６ａ）、式（ＳＭ－Ｂ６ｂ）、及び式（ＲＧ－Ｂ６ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｆ］式（ＡＭ－１－Ｂ１０）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
　上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ１０）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ１０）、式（ＲＧ－Ｂ１０）、式（ＲＧ－Ｂ１０－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ１０－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｇ］式（ＡＭ－１－Ｂ４a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ４ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
　式（ＳＭ－Ｂ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ、１２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』等に記載された方法に準じて、＜工程１a＞トリフルオロメタンスルホン酸銀、ＡｇＣｌＯ４等の試薬存在下、トルエン、ジクロロメタン等の反応に関与しない溶媒中反応させることで、式（ＩＭ－Ｂ４ａ－１）の化合物が得られ、＜工程２a＞続いて水素化ナトリウム、ＮａＯＭｅ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ４ａ－２）の化合物が得られ、＜工程3a＞更に、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ４a）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
　同様にして、式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の代わりに、式（ＲＧ－Ｂ４b）を用いて、上記スキームに従い反応を行うことにより式（ＡＭ－１－Ｂ４b）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｈ］式（ＡＭ－１－Ｂ８a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ８ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
　上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ８ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ８ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ８ａ）又は式（ＳＭ－Ｂ８ｂ）は、市販化合物又は［製造方法ＡＭ－Ｇ］に記載の反応に準じて製造ができる化合物であり、式（ＲＧ－Ｂ８ａ）又は式（ＲＧ－Ｂ８ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｊ］式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
　式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミン、又はその塩として製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｊ－２］式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
　式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７－２）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い（＜工程１＞及び＜工程２＞）、続いて保護基Ｐ１を脱保護し、続いて、式（ＲＧ－Ｂ７－３）の化合物（市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり）を用いて、前記＜工程１＞と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミン、又はその塩として製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｋ］式（ＡＭ－１－Ｂ９a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ９ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
　上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ｊ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ９ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ９ｂ）で表されるアミンえ、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ７）、式（ＲＧ－Ｂ９ａ）又は式（ＲＧ－Ｂ９ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｌ］式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
　式（ＳＭ－Ｚ１）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，２９（２３），ｐ６６１９－６６２２；２０１０年』等に記載された方法に準じて、ジメチルスルホキシド等の反応に関与しない溶媒中、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
尚、式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミン、又はその塩は、市販化合物として入手可能なものもある。
［製造方法ＡＭ－Ｍ］式（ＡＭ－２－Ｚ２ａ）及び式（ＡＭ－２－Ｚ２ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
式（ＳＭ－Ｚ２a）の化合物又は式（ＳＭ－Ｚ２ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ２a）の化合物及び式（ＳＭ－Ｚ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法ＡＭ－Ｌ］と同様にして、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ２a）又は式（ＡＭ－２－Ｚ２b）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。尚、式（ＡＭ－２－Ｚ２a）又は式（ＡＭ－２－Ｚ２b）で表されるアミン、又はその塩は、市販化合物として入手可能なものもある。
［製造方法ＡＭ－Ｎ］式（ＡＭ－２－Ｚ３）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
式（ＳＭ－Ｚ３）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ３）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ３）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ３）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｏ］式（ＡＭ－２－Ｚ４）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
式（ＳＭ－Ｚ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ４）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ４）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｐ］式（ＡＭ－２－Ｚ５a）及び式（ＡＭ－２－Ｚ５b）で表されるアミンの製造方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
　式（ＳＭ－Ｚ５a）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５a）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ５a）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５a）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、水素化ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基存在下、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、等の反応に関与しない溶媒中で反応させることで、側鎖が導入された化合物が得られる。続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－２－Ｚ５ａ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
　同様にして、式（ＳＭ－Ｚ５ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ５ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて同様に反応を行うことで、式（ＡＭ－２－Ｚ５ｂ）で表されるアミン、又はその塩を製造することができる。
式（ＡＭ－２－Ｚ６ａ）、式　（ＡＭ－２－Ｚ６ｂ）、式（ＡＭ－２－Ｚ７ａ）、式　（ＡＭ－２－Ｚ７ｂ）、式　（ＡＭ－２－Ｚ８ａ）、式（ＡＭ－２－Ｚ８ｂ）、式（ＡＭ－２－Ｚ９ａ）、及び式（ＡＭ－２－Ｚ９ｂ）で表わされるアミノ化合物、又はそれらの塩は、前記［製造方法ＡＭ－Ａ］～［製造方法ＡＭ－Ｐ］に準じて、下記スキームに示す製造方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
　式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を製造する為に用いられる、アルキン基が導入されたアミン（Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２）又はアジド基が導入されたアミン（Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２）については、前記［製造方法Ａ］～［製造方法Ｎ］、［製造方法Ｐ］～［製造方法Ｔ］及び［製造方法ＡＭ－Ａ］～［製造方法ＡＭ－Ｐ］に記載される各反応、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座　第５版、各本、２００７年、丸善』、『Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (Edited by Richard C. Larock), 2018年』、『Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis, (Edited by Laszlo Kurti, Barbara Czako), Academic Press, 2005年』等に記載の方法を適宜組み合わせることにより、所望のアミンを製造することができる。
　本明細書中、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミン（各々の式の下位の式も含む）は、製薬学的に許容される塩（例えば、酸付加塩）を形成する場合がある。かかる塩としては、製薬学的に許容し得る塩であれば特に限定されないが、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、よう化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、エナント酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、乳酸、ソルビン酸、マンデル酸等の脂肪族モノカルボン酸等との塩、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸等の脂肪族ジカルボン酸との塩、クエン酸等の脂肪族トリカルボン酸との塩、安息香酸、サリチル酸等の芳香族モノカルボン酸との塩、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸の塩、桂皮酸、グリコール酸、ピルビン酸、オキシル酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステイン等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸類との酸付加塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。
　前記塩は、常法に従い、例えば、本発明の化合物と適量の酸もしくは塩基を含む溶液を混合することにより目的の塩を形成させた後に分別濾取するか、もしくは該混合溶媒を留去することにより得ることができる。塩に関する総説として、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，　ａｎｄ　Ｕｓｅ、Ｓｔａｈｌ＆Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００２）が出版されており、本書に詳細な記載がなされている。
　本明細書中、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミン（各々の式の下位の式も含む）又はその塩は、水、エタノール、グリセロール等の溶媒と溶媒和物を形成し得る。
　本明細書中、特に断りのない限り、環状基に可変置換基が置換している場合、該可変置換基は環状基の特定の炭素原子に結合されていない事を意味する。例えば、下記式Ａにおける可変置換基Ｒｓは、該式Ａにおける炭素原子ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ又はｖの何れかに置換する事ができる事を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
　本明細書中、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）、及び式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のＡｋｎ基において不斉炭素が存在する場合には、その各光学異性体も包含されることを意味する。
　例えば、式（Ｉ）中の－Ｌ１－が、式（Ｌ１－８ａ）であり、ｍ８ａ＝２、ｎ８ａ＝１、Ｒ１＝Ｍｅの場合の下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ）（式中、破線両外側は含まない）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
 である場合、Ｒ１基が置換する炭素の立体配置がＳ体である下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ－Ｓ）及びベンジル基が置換する炭素の立体配置がＲ体である下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ－Ｒ）（いずれの式中、破線両外側は含まない）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
 で表わされるリンカーが含まれることを意味する。
　式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）、及び式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のＡｋｎ基において不斉炭素が存在する場合（光学活性体である場合）には、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）に対応するアミン誘導体（ＡＭ－１）を合成する工程において、そのラセミ体から通常の光学分割手段（分離手法）により、各光学活性体に分離することが可能であり、又、式（Ｉ）に対応するアミン誘導体である式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）を合成する工程において、不斉合成を用いることで光学異性体の一方を選択的に合成でき、各光学活性体を合成することが可能である。
５．架橋アルギン酸ゲル
　架橋アルギン酸ゲルは、（ｉ）２価の金属イオン結合を介した架橋、（ｉｉ）化学結合を介した架橋、又は（ｉｉｉ）２価の金属イオン結合及び化学結合の両方を介した架橋を有するものがある。ここで提供される、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応（架橋反応）を行うことにより形成されるトリアゾール環による化学架橋、及び／又は２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を共存させることにより形成されるイオン架橋を含む架橋アルギン酸ゲルである。又、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応（架橋反応）を行うことにより形成されるトリアゾール環による化学架橋を含む、架橋アルギン酸ゲルである。
本明細書中、架橋アルギン酸ゲルは、前記式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を用いて、当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体間に化学架橋を形成させるＨｕｉｓｇｅｎ反応（架橋反応）を行うことで得られる。又は、前記式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び／又は前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体に２価の金属イオンを共存させることにより、当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び／又は式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の各誘導体間にイオン架橋を形成させることで得られる。又は、前記式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を用いて、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応（架橋反応）を行い当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体間に化学架橋を形成させ、更に２価の金属イオンを共存させることにより、当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び／又は式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の各誘導体間にイオン架橋を形成させることでも得られる。
　本明細書中、「架橋を形成する」、又は「架橋反応を行う」とは、前記式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を用いて、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応を行うことにより、当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体間で化学架橋（化学結合）が形成されること、又は、前記式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体に２価の金属イオンを共存させることにより当該式（Ｉ）のアルギン酸誘導体及び／又は式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の各誘導体間でイオン架橋（イオン結合）が形成されること、又は、前記Ｈｕｉｓｇｅｎ反応による化学架橋及び２価の金属イオンによるイオン架橋の両方が形成されることを意味する。
　２価金属イオンと接触することにより、イオン架橋アルギン酸ゲルが形成される時間は、例えば、瞬時（例えば、１～５秒）～数時間（例えば、１～３時間）である。Ｈｕｉｓｕｇｅｎ反応を進行させることにより、化学架橋アルギン酸ゲルが形成される時間は、例えば、数秒～２４時間、数秒～１２時間、又は数秒～３０分間である。
　前記アルギン酸ゲルを得る為に用いられる２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオン又はバリウムイオンであり、より好ましくはカルシウムイオンである。
　２価金属イオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを含む溶液（例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、等の水溶液）、バリウムイオンを含む溶液（例えば、塩化バリウム水溶液等の水溶液）が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
　２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオン濃度（例えば、カルシウムイオン又はバリウムイオン濃度）は、特に限定されないが、例えば、１ｍＭ～１Ｍの範囲、又は５ｍＭ～５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２０ｍＭ～１００ｍＭである。
　前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液を調製する際に用いる溶媒、又は、２価金属イオンを含む溶液等を調製する際に用いる溶媒は、特に限定されないが、それぞれ独立して、例えば、水道水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水、ＲＯ－ＥＤＩ水、等）、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、培地（すなわち、細胞培養用培地（または培養液））、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは超純水である。
　２価の金属イオン結合を介した架橋アルギン酸ゲルは、超高速にて反応が進行して得られ、可逆的であるのに対して、化学結合を介した架橋アルギン酸ゲルは、比較的温和な条件でゆっくり反応が進行して得られ、非可逆的である。架橋アルギン酸ゲルの物性は、例えば、使用する２価金属イオンが含まれる水溶液（例えば、塩化カルシウム水溶液）の濃度、若しくは、化学修飾アルギン酸誘導体に導入される反応性基の導入率を変化させる等の方法で、調整が可能である。
　即ち、使用する２価金属イオンが含まれる水溶液の濃度の調整、又は式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体に導入された反応性基の導入率の調整により、高い機械的強度を有する所望の架橋アルギン酸ゲル、例えばコア層よりも高い機械的強度を有する所望の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
　前記の架橋反応を利用し、前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いることで、化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（アルギン酸構造体）を作成することが可能となる。例えば、イオン架橋反応により、前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液から瞬時にファイバ状の構造体を作ることができ、当該構造体の構造強化（例えば、長期安定性の獲得、等）の為に、化学結合による架橋反応（本発明の場合、Huisugen反応）を利用すること可能である。又、例えば、２価の金属イオン結合及び化学結合の両方を介して作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、、イオン架橋により取り込まれた２価金属イオンは可逆的に放出されて、化学結合による架橋のみが残ったゲルファイバを作ることも可能である。
　ある態様の架橋アルギン酸ゲルは、前記式（Ｉ）及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を混合してＨｕｉｓｇｅｎ反応を行うことにより、得ることができる。
　ある態様の架橋アルギン酸ゲルは、化学架橋（アルキン基及びアジド基から形成されるトリアゾール環による架橋）を介して三次元の網目構造を形成する。好ましいアルギン酸誘導体は、架橋後の架橋アルギン酸ゲルの安定性が改善したものである。
　いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－、－Ｌ２－、及びＸは、前記態様[１－１２]の定義と同じである］で表わされる基を介して架橋された架橋アルギン酸ゲルである。
　いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の混合比は、式（Ｉ）の誘導体と式（ＩＩ）誘導体の重量比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１であり；好ましくは１：１．０～３．０である。
　いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の混合比は、式（ＩＩ）の誘導体と式（Ｉ）誘導体の重量比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１である。
　いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の混合比は、より好ましくは式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の反応性基の導入率（ｍｏｌ％）比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１であり；好ましくは１：１．０～３．０である。
　いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の混合比は、より好ましくは式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の反応性基の導入率（ｍｏｌ％）比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１である。
　尚、前記混合比において、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体を式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体に、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を式（Ｉ）の誘導体に、それぞれ置き換えることも可能である。
　架橋アルギン酸ゲルは、アルギン酸の構成単位の全てのカルボキシル基が上記式（ＩＩＩ－Ｌ）の架橋を有している必要はない。架橋アルギン酸における、上記式（ＩＩＩ－Ｌ）で表わされる架橋の導入率（架橋率とも言う）は、例えば、約０．１～約８０％、約０．３～約６０％、約０．５～約３０％、または約１．０～約１０％の範囲である。
　架橋アルギン酸ゲルを得るためのＨｕｉｓｇｅｎ反応における前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体の濃度は、通常約１～５００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約５～１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
　Ｈｕｉｓｇｅｎ反応の反応温度（化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製する際の温度）は、通常、外温約４～約６０℃であり、好ましくは外温約１５～約３７℃の範囲である。
６．化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
　「化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」は、コア層及び前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層からなる線維状（ファイバ状）の構造体を意味する。図１に、コア・シェル構造を有するファイバとして形成された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの一例の断面図を示す。この化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、その外径がｃであり、直径ａのコア層５と厚さｂのシェル層４を含み、コア層５には、抗体産生細胞６と基材が含まれ、シェル層４には式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて架橋反応を行うことにより形成された架橋アルギン酸ゲルを含む。
　ここで、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材（すなわち、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル）は、異なる基材であっても良く又は同一の基材であっても良い。
　いくつかの態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバでは、抗体産生細胞、コラーゲン（溶媒又はゲル）、細胞培養用培地（または培養液）、又はアルギン酸（溶液又はゲル）を含むコア層が、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層により被覆して形成されたもの、すなわち、コア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材が異なるものである。
　「化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」は、上記のコア・シェル構造（中心軸を通る中空部分構造）を有し、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が例えば０．２μｍ～２０００μｍ程度であり（但し、外径は当該径に限定されない）、繊維状の構造体で有ることから、ここでは、「化学架橋アルギン酸中空マイクロファイバ」と言うこともある。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバの中心軸に対する垂直方向の断面形状としては、円形、楕円系、又は多角形（例えば、四角形、五角形等）等の多様な形状であっても良く、好ましくは、図１に示されるような円形の断面形状である。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径は、例えば、約１００～４００μｍである。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さは、シェル層の厚さは、「（アルギン酸ゲルファイバの外径－コア層の直径）／２」により求めることができる。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径は、アルギン酸ゲルファイバの外径が、約３００μｍ～約７５０μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
　いくつかの形態において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径は、例えば、約１００μｍであり、そしてアルギン酸ゲルファイバの外径は、例えば、約３００μｍである。このとき、シェル層の厚さは、例えば、約１００μｍである。
　上記の化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径、並びにシェル層の内径及び化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外径は、例えば、位相差光学顕微鏡による画像からの計測値であって、当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバの数カ所における計測値の平均値として表される。上記の化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層及びシェル層は、通常、実質的に均一な厚みを有しており、好ましくは、各層は、±５％の範囲内の厚さ均一性を有する。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバの長さは、例えば、約２～約５０ｍである。
　本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバにおいて、コア層を形成する基材としては、細胞毒性を有さないものであれば特に限定されないが、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
　本明細書中、いくつかの態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層は、前記基材に抗体産生細胞を含ませ、全体を適切な濃度の溶液としたものから形成される。例えば、アルギン酸ナトリウム溶液を用いる場合、例えば、約０．１～約２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり、好ましくは、約１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり；コラーゲン溶液を用いる場合、例えば、約０．１～約２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり、好ましくは約０．２～約１．５（ｗ／ｗ％）または（ｗ／ｖ％）溶液である。
　コア層の基材に用いる溶媒も特に限定されないが、例えば、細胞培養用培地（または培養液）、アルギン酸ナトリウムを含む培地、等張緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは、アルギン酸ナトリウムを含む培地、または等張緩衝液である。
　本明細書中、細胞培養用培地には、市販の培地基材又は調製済み培地、若しくは自製した培地を使用することができる。又、天然培地（例えば、ソイビーン－カゼインダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）等がある）又は合成培地（増殖に必要な各種栄養素を全て化学薬品にて補う培地である）を使用することもできる。又、当該培地は、特に限定されることは無いが、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン等）が含まれる基本培地であれば良く、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、Ｇ０１６培地、ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）等が挙げられる。
　又、前記培地には、更に血清が含まれていても良い。前記血清としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ　Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられる。培地に含まれる血清の濃度は、例えば、２質量％以上１０質量％以下である。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞としては、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が特に限定されることは無いが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、又はＵＡＣＣ－８１２細胞等（これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＡＴＣＣ細胞系カタログに記載されているものもある）から、適宜選択することができる。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞は、好ましくは、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、又はＰＥＲＣ６細胞であり、より好ましくは、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＮＳ０であり、更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
　本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生ＣＨＯ細胞としては、特に限定されることは無いが、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等が挙げられる。
　本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生ＣＨＯ細胞として、より好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり、更に好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層は、架橋アルギン酸ゲル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル）を含む。当該架橋アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い又は同等な機械的強度を有するゲルであっても良く、好ましくは、当該架橋アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い機械的強度を有するゲルである。又、培養時に化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外に存在している培養液（栄養源）及び酸素等の成分に対して十分な透過性を有しているものである。
　前記架橋アルギン酸ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。前記架橋アルギン酸ゲル中には、生体成分や非生体成分を必要に応じて添加することもできる。
　ここで提供される、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、外的刺激によりゲル化する架橋アルギン酸ゲルである。外的刺激としては、例えば、２価金属イオンの添加（２価金属イオンを含む溶液の添加）、酵素処理、ｐＨ変動、加熱、ＵＶ照射、放射線照射などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、２価金属イオンである。
　前記２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオン又はバリウムイオンであり、より好ましくはカルシウムイオンである。
　前記カルシウムイオン又はバリウムイオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、、塩化バリウム水溶液等の水溶液が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
　本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバとは、いくつかの態様において、シェル層の架橋アルギン酸ゲルが、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋、及び２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン、等）により部分的に形成されるイオン架橋を含む架橋アルギン酸ゲルであるゲルファイバであり、又、いくつかの態様において、シェル層の架橋アルギン酸ゲルが、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋を含む架橋アルギン酸ゲルであるゲルファイバである。
　好ましくは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、当該ゲルファイバを形成した後の早い段階で、培養液に浸潤させ培養を開始することができる。より好ましくは、コア層に含まれる、抗体産生細胞を壊死させることなく、コア層の直径が大きなゲルファイバを提供することができる。即ち、化学架橋アルギン酸ゲルファイバにより、抗体産生細胞がある一定数含まれたコア層を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバを容易に得ることができる。
　コア層を被覆するシェル層によっては、十分な機械的強度が得られないことにより、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れる場合や、壊れてしまう場合があり得る。しかし、本発明者らは、コア層を被覆するシェル層に、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン）及びＨｕｉｓｇｅｎ反応により架橋し硬化させることで、コア層を被覆するのに十分な強度を有しており、又、培養液（栄養源）及び酸素を供給することができる化学架橋アルギン酸ゲルファイバが得られることを見出した。好ましい態様では、シェル層を形成する、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲルとなっている。
　従って、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、高い機械的強度を有する式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバである。又、ここでは、この化学架橋アルギン酸ゲルファイバを、「抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」と言うこともある。
　ここで、「コア層よりも高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」とは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に、被覆されるコア層を形成する基材（例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、又は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル、及びそれらの混合物等からなる群から選択される基材）と比べて実質的に同一又はより高い機械的強度を有するゲル（例えば、アルギン酸ゲルやアガロースゲルを挙げることができるが、これらに限定されることはない）を用いることで、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れたり、壊れたりする恐れが少ない、アルギン酸ゲルを意味する。
　シェル層を形成するゲルとして、好ましくは、カルシウムイオンなどの２価金属イオンの存在下でゲル化し、更に化学反応によりゲル化する性質を有するアルギン酸ゲル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル、２価金属イオンによるイオン架橋及びＨｕｉｓｇｅｎ反応による化学架橋を有する架橋アルギン酸ゲル）を用いることで、コア層よりも高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得ることもできる。
　ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、その両端がアルギン酸ゲル、又は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル等で封止されたゲルファイバであっても良い。当該ゲルファイバの両端を封止することにより、培養期間中にコア層が化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ漏れだすことの防止に繋がる。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、２種類の異なるゲルによりコア・シェル構造を有するファイバとして形成されている場合や、さらに多重構造を有している場合も包含される。又、シェル層の被覆も多層被覆からなる被覆であってもよく、例えば、２種類以上の異なる強度を有するシェル層により、２層以上の被覆が形成されていてもよい。
［アルギン酸ゲルファイバの製造方法］
　ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、例えば、図２又は図３に示されるマイクロ流体装置を用いることを含む方法が提供される。
　以下に、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの作製方法について説明する。
　前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバの作製方法は特に限定されないが、例えば、図２又は図３に示されるマイクロ流体装置を用いて行う。ここでのマイクロ流体装置は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製するのに好ましく用いられる装置である。
　マイクロ流体装置は、例えば、導入口が３つ、出口が１つの微細流路を作るための装置であり、第１の導入口に第１の液、第２の導入口に第２の液、及び第３の導入口に第３の液を適当な速さで流すと、第１の液と第２の液が交差して一本となった流路では、第１の液と第２の液が混ざることなく、２層のきれいな層流になり、さらに、その下流で第３の液と交差して３つの液が一本となった流路では、第１の液と第２の液と第３の液が混ざることなく、３層のきれいな層流になる。マイクロ流体装置としては、例えば、図２に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ）１０を挙げることができる。
　又、例えば、導入口が２つ、出口が１つの微細流路を作るための装置であり、第１の導入口に第１の液、及び第２の導入口に第２の液を適当な速さで流すと、第１の液と第２の液が混ざることなく、２層のきれいな層流になる。マイクロ流体装置としては、例えば、図３に示すようなＴ字型マイクロ流体装置ＸＸを挙げることができる。
　２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置１０は、例えば、Ｗｏｎｊｅ　Ｊｅｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｖｉａ　“ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｌｙ”　ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ　ｆｉｂｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｕｂｅｓ，　Ｌａｂ　Ｃｈｉｐ，　２００４，　４，　ｐ５７６－５８０　のＦｉｇ．１、又は、例えば、特開２０１６－７７２２９号公報（出願人：国立大学法人　東京大学）の図１又は図２に具体的に記載されているものを挙げることができる。いくつかの態様では、これらに記載されているマイクロ流体装置１０の具体例またはそれと同様な装置を用いて、同様な作製条件にて、アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
　図２に示すように、マイクロ流体装置１０は、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む。
　図２は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。一例として、コア層の基材にアルギン酸ナトリウム溶液を用い、シェル部の基材に前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を用いる作製方法について説明する。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、例えば下記工程（１）～（４）を含む方法により製造することができる。
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、アルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、アルギン酸ナトリウム溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
（１）～（４）の工程を行うことにより、シェル層の前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液がゲル化し、シェル層４にカルシウム架橋及びHuisgen反応により形成される化学架橋からなる架橋アルギン酸ゲルを含み、またコア層５に抗体産生細胞６と基材を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０を製造することができる。
　また、前記方法により得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバを、例えば３７℃程度で数分（例えば、２～５分）～約１時間程度加熱してもよく、例えば、コア層５の抗体産生細胞６を含む基材がコラーゲン溶液の場合には、ゲル化させることが可能となる。
　図３に示すように、マイクロ流体装置ＸＸ（以下、Ｔ字型流体装置ＸＸとも言う）は、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３、及びキャツプであるＣａｐ１～Ｃａｐ３を含む。又、排出管ＣＣより排出されるファイバ状物質を受ける容器として、２価金属イオンを含む溶液を含むビーカー等の容器ＤＤが用いられる。
　図３は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。一例として、コア層の基材にアルギン酸ナトリウム溶液を用い、シェル部の基材に前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を用いる作製方法について説明する。
　化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、例えば下記工程（１）～（４）を含む方法により製造することができる。
（１）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
（２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
（３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
（４）前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
　（１）～（４）の工程を行うことにより、シェル層の前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液がゲル化し、シェル層にカルシウム架橋及びHuisgen反応により形成される化学架橋からなる架橋アルギン酸ゲルを含み、またコア層５に抗体産生細胞６と基材を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
　マイクロ流体装置ＸＸにおいて、排出管ＣＣは、マイクロ流体装置ＸＸに導入できる太さのものであれば特に限定はされない。
　マイクロ流体装置ＸＸにおいて、導入管ＡＡは、マイクロ流体装置ＸＸのに導入できる太さのものであれば特に限定はされない。
　図２に示すマイクロ流体装置１０を用いる場合、導入口２及び３における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度であってもよい。導入口２及び３における溶液の射出速度を調節することにより、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みを適宜調節できる。例えば、導入口２及び３における溶液の射出速度を速くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが小さくなり、一方、射出速度を遅くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが大きくなる。
　図２に示すマイクロ流体装置１０を用いる場合、導入口１から射出される抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液は、例えば、以下の通り調製する。
　コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ－５０）にＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３で構成されるバッファーを４：１で添加し、コラーゲン濃度を４ｍｇ／ｍＬに調製する。その後、培地で所定の濃度に調製した細胞懸濁液と１：１で混合し、コラーゲン終濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速（射出速度）は特に限定されないが、例えば、約５０～約１００μＬ／分程度であってもよい。
　マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液は、例えば、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、溶媒（例えば、ＭｉｌｌｉＱ水、等）を添加して、所定の濃度（例えば、各化学修飾アルギン酸誘導体の溶液が１．５質量％（ｗ／ｗ％））の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度の範囲であってもよい。
マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウムを用いて、ＭｉｌｌｉＱ水を添加して、所定の濃度（例えば、約１００ｍＭ）の塩化カルシウム水溶液を調製する。マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、特に限定されないが、例えば約２～約６ｍＬ／分程度の範囲であってもよい。
図３に示すＴ字型流体装置ＸＸを用いる場合、　導入口１及び２における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば、約５０～約４００μＬ／分程度であってもよい。導入口１及び導入口２における溶液の射出速度を調節することにより、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みを適宜調節できる。
　図３に示すＴ字型流体装置ＸＸを用いる場合、導入口１から射出される抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液は、例えば、以下の通り調製する。
　コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ－５０）にＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３で構成されるバッファーを４：１で添加し、コラーゲン濃度を４ｍｇ／ｍＬに調製する。その後、培地で所定の濃度に調製した細胞懸濁液と１：１で混合し、コラーゲン終濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液を調製する。
　図３に示すＴ字型流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速（射出速度）は特に限定されないが、例えば、約５０～約１００μＬ／分程度であってもよい。
　図３に示すＴ字型流体装置ＸＸの導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液は、例えば、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、溶媒（例えば、ＭｉｌｌｉＱ水、等）を添加して、所定の濃度（例えば、各化学修飾アルギン酸誘導体の溶液が１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％））の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を調製する。
　Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度の範囲であってもよい。
　作製される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０の外径は、特に限定されないが、前述の通りであり、例えば、約０．２μｍ～約２０００μｍの範囲、又は約５０μｍ～約１０００μｍの範囲であっても良く、好ましくは、約２００μｍ～約８００μｍの範囲である。化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０の長さは特に限定されず、前述の通りであり、例えば数ｍｍ～数ｍ程度であってもよい。当該ファイバの断面形状としては、前述の通りであり、例えば、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。
　いくつかの態様では、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度は、例えば、約４～約３７℃の範囲であり、好ましくは約３５℃である。
　いくつかの態様では、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養液中で培養することにより、抗体産生細胞が培養され、抗体を産生することができる。アルギン酸ゲルファイバは、培養液を適切に交換することにより、抗体産生細胞を数か月の連続培養することが可能となる。
　本明細書中の記載において「約」と記載した場合、特に断りが無い場合には、当該数値の±２０％迄、好ましくは当該数値の±１０％迄の値も含み得るものである。
［抗体産生細胞の培養方法］
　ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いることを含む、抗体の製造方法が提供される。以下、「抗体の製造方法」を「抗体産生細胞の培養方法」という場合がある。
　好ましい態様の抗体産生細胞の培養方法によれば、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを製造した後、直ぐに抗体産生細胞の培養を開始する。これにより、図４に示すように、コア層への培養液（栄養源）及び酸素の供給をすぐに行うことができる。特に好ましい態様では、コア層での抗体産生細胞の壊死を十分に防ぎつつ、抗体を産生することができる。
　以下に、抗体産生細胞の培養方法の一例について、具体的に説明するが、これに限定されない。ベントキャップ付三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、　Ｃａｔ．４３１１４３）に、コア層に抗体産生細胞を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバを入れ、後述する表２６の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、ゲルファイバを含浸させた後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にインキュベータ内で培養装置（パナソニックヘルスケア（株）ＭＩＲ－Ｓ１００Ｃ）を用いた１２５　ｒｐｍの条件で振とうしながら培養を行う。培養期間中、２～３日に一回、培地１．８　ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）又は抗体産生用培地（Ｆ３－１中の表３１）を１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０　ｍＬに保つ。
　又、別の抗体産生細胞の培養方法の一例として、以下に具体的に説明するが、これに限定されない。ベントキャップ付三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、　Ｃａｔ．４３１１４３）に、コア層に抗体産生細胞を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバを入れ、後述する実施例Ｆ３－８中の表３３の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、ゲルファイバを含浸させた後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にインキュベータ内で培養装置（パナソニックヘルスケア（株）ＭＩＲ－Ｓ１００Ｃ）を用いた１２５　ｒｐｍの条件で振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を行う。培養期間中、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が６５ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、実施例Ｆ３－８中の表３３の組成である培地の添加、または培養液半量を新鮮培地に交換する。培養液を半量交換しない場合は、Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行う。半量交換する場合は、フラスコ培養液（３０　ｍＬ）から培養液２　ｍＬを抜きとり、新鮮培地２８　ｍＬを加えた後、培養液２６　ｍＬを抜きとるようにして交換を行う。尚、培養期間中、Ｆｅｅｄ液を適時添加する場合もある。
　又、好ましい態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造技術は、コア層に含まれる抗体産生細胞がある一定数以上には増殖しないことにより、細胞への物理的ストレスが少ないため、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続ける可能性を有している点で優れている。
　特に好ましい態様では、抗体の生産・精製効率を飛躍的に向上させる可能性があり（例えば、好ましい態様のマイクロゲルファイバを用いることで、大規模な培養タンクを要する浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を培養することも可能となる）、少量・多種品目の抗体医薬品（具体的には、抗体医薬品等）の製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術として期待できる。
　培養により産生された抗体（例えば、トシリズマブ）は、アルギン酸ゲルファイバのコア層に貯留されても良く、好ましくは、アルギン酸ゲルファイバのシェル層を透過しアルギン酸ゲルファイバ外の培養液中に貯留される。尚、抗体の回収・精製は、後述の記載を参照し、行うことが可能である。
　好ましい態様では、図４に示すように、コア層内で産生された抗体がシェル層を透過して化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ順次放出されることとなり、抗体の連続培養が可能なサイクルが形成可能である。尚、このとき、代謝物及び老廃物も化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ放出されてもよい。
　実際に、後述の実施例では、シェル層の架橋アルギン酸ゲルを形成する為の原料として、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体に化合物（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）、化合物（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）、化合物（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２）、化合物（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂ）、（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）又は化合物（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）から選択される化学修飾アルギン酸誘導体、式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体に化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）、化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）、化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ）、化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｄ）、化合物（ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）又は化合物（ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）から選択される化学修飾アルギン酸誘導体を用いて作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの場合、産生された抗体（トシリズマブ）がコア層及び培養液中に貯留された事が確認できた。
　抗体産生細胞が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルで被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養する、培養容器としては、例えば、組織培養用プレート、三角フラスコ、Ｔ－フラスコ、スピナーフラスコ、培養バッグ、動物細胞培養槽等からなる群から選択される容器であり；好ましくは三角フラスコ又は動物細胞培養槽である。 培養は、静置培養、振とう・揺動培養などのいずれの方法を選択してもよい。
　抗体の生産性向上には、培養当たりの抗体産生細胞数の増大化が有効であるが、一方で過剰な増殖が起こり、培養環境が悪化し、培養期間の短縮が起こりうる。いくつかの態様の抗体の製造方法にて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる、抗体産生細胞の過剰増殖に起因する細胞への物理的ストレスを少なくする為の方法として、例えば、コア層に含まれる抗体産生細胞がある一定数以上に増殖しない方法としては、培養中の培養温度のコントロール、培養液中に細胞増殖抑制剤を添加する、等の方法が挙げられる。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、例えば、約３０～約３８℃の範囲である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始から終了時までの温度が約３７℃である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約１．０×１０８細胞／ｍＬ～約１０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約３．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、より好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約４．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養期間は、例えば、１０日以上であり、又は２０日以上であり、又は３０日以上であり、又は４０日以上であり、又は５０日以上であり、又は６０日以上であり、又は７０日以上である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養期間は、例えば、１４日であり、又は２８日であり、又は３３日であり、又は４２日であり、又は５６日であり、又は６１日であり、又は７７日である。
　細胞増殖抑制剤とは、培養期間中、過剰な細胞増殖を抑制することが可能な剤である。いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養液中に添加できる細胞増殖抑制剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、塩化リチウム及び吉草酸からなる群から選択される添加剤であり；好ましくは、バルプロ酸又は吉草酸であり；より好ましくは、吉草酸である。細胞増殖抑制剤を培養液に添加するタイミングは、培養開始時点、又は培養期間中（必要な細胞数まで増殖できた時点）のいずれでも可能である。
　抗体は、定常領域の構造上の違いにより、下記表に示されるようなクラス（アイソタイプ）やサブクラスに分類される。
ヒトＩｇの分類
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することよってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等からなる群から選択されるクラス（アイソタイプ）を有する抗体が挙げられる。抗体産生細胞を培養することによってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体は、好ましくは、ＩｇＧ、又はＩｇＥのクラス（アイソタイプ）の抗体であり、より好ましくは、ＩｇＧのクラス（アイソタイプ）の抗体である。
　いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することによって、アルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、特に限定されることは無いが、例えば、４５，０００～９００，０００の範囲にある抗体である。いくつかの態様の抗体の製造方法にてアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、好ましくは、４５，０００～１６０，０００の範囲であり、より好ましくは、１４０，０００～１５０，０００の範囲である。
　本明細書中、前記記載の各抗体産生ＣＨＯ細胞を用いて前記記載の抗体の製造方法にて培養を行う場合、用いた抗体産生ＣＨＯ細胞に対応する抗体が産生される。例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いる場合、抗体としてムロモナブ－ＣＤ３が産生される。
　産生される抗体としては、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ－ＣＤ３（ＩｇＧ；１５０，０００）、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ（ＩｇＧ；１４４，５１０）、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ（ＩｇＧ；“１４７，７００”）、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ（ＩｇＧ；“１４９，０００”）、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ゲムツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ　オゾガマイシン（ＩｇＧ；“１５３，０００”）、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、イブリツモマブ　チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ　チウキセタン（ＩｇＧ；１４８，０００）、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ（ＩｇＧ；１５１，８００）、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ（ＩｇＧ；４８，０００）、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ（ＩｇＥ；１４９，０００）、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ（ＩｇＧ；１４５，２３５）、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０７９～１４９，６９０）、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ（ＩｇＧ；１４９，８０２～１５１，０６４）、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、セルトリズマブ　ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ　ペゴル（ＩｇＧ；９０，０００）、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、トラスツズマブ　エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ　エムタンシン（ＩｇＧ；１５１，０００）、ブレンツキシマブ　ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ　ベドチン（ＩｇＧ；１５３，０００）、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ（ＩｇＧ；１４６，１７８）、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ（ＩｇＧ；１４５，０００）、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ（ＩｇＧ；１５１，０００）、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ（ＩｇＧ；１４１，７８９）、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ（ＩｇＧ；１４５８９２．０４９．）、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ（ＩｇＧ；４７，７８２）、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ（ＩｇＧ；１５２，０００）、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ（ＩｇＧ；１４４，６１１）、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、イノツズマブ　オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ　オゾガマイシン（ＩｇＧ；１５９，０００）、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ（ＩｇＧ；１４６，０００）、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００～１５０，０００）、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）が挙げられる（抗体名後のカッコ内は、当該抗体のクラス（アイソタイプ）及び分子量を示す）。
　産生された抗体は、例えば、下記の３工程を経て精製が行われる。
〔工程１〕培地中に含まれる、抗体以外のタンパク質及び固形物をほぼ取り除く為に、遠心分離法又はフィルターによる濾過等を行う。
〔工程２〕例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにて目的とする抗体を取り出す。
〔工程３〕工程２で混入してきた夾雑物を除去する為に、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、目的とする抗体を高純度精製する。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー：
　ＩｇＧの精製法としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いた抗体の精製方法が知られている。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いた抗体の精製法として、下記方法が１例として挙げられる。（１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが固定されたビーズが充填されたカラムを用いて、前記〔ステップ１〕の方法で得られてくる溶液に血清を添加した溶液をろ過することで、ＩｇＧがカラム中のビーズに結合して、他の血清成分がカラム外へ流出がされる。（２）その後、カラムに酸性溶液を通過させることにより、ビーズに結合していたＩｇＧが切れて、カラム外へ溶出されてＩｇＧが得られる。尚、ＩｇのＰｒｏｔｅｉｎ ＡとＰｒｏｔｅｉｎ Ｇへの結合力が、動物種やサブクラスによって違うことから、目的によって、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを使い分けることができる。
イオン交換クロマトグラフィー：
　タンパク質が有する電気的な性質（電荷）を利用してタンパク質を分離する方法である。正電荷を示す塩基性タンパク質は、負電荷をもつ陽イオン交換体（担体）にイオン結合し、負電荷を示す酸性タ ンパク質は正電荷を持つ陰イオン交換体に結合することから、タンパク質が含まれる試料をイオン交換体が充填されたカラムを通すことで、タンパク質がイオン交換体に結合する。その後、カラムを通す溶媒の塩濃度を高濃度にすることで、タンパク質とイオン交換体とのイオン結合が弱くなり、結合力の弱いタンパク質から順番に、イオン交換体から外れて、カラム外へ流出してくる。陽イオン交換体又は陰イオン交換体の選択は、試料として用いるタンパク質の電荷から選択するものとする。
ゲルろ過クロマトグラフィー：
　タンパク質の分子量の違いを利用してタンパク質を分離する方法である。小孔が付いている担体が充填されたカラムに試料を流すことで、分子量の小さいタンパク質は、前記小孔に入り込みながら流出してき、分子量の大きいタンパク質は前記小孔に入らずに流出してくる為、カラムを通過する時間が分子量の小さいタンパク質は遅く、分子量の大きいタンパク質は早くなることから、時間差的にタンパク質を分離することが可能となる。
　尚、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報、その他の特許文献は、その目的にかかわらず参照として本明細書に組み込むものとする。
　また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
 
[化学修飾アルギン酸誘導体の合成法]
　核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）の測定には、ＪＥＯＬ　ＪＮＭ－ＥＣＸ４００　ＦＴ－ＮＭＲ（日本電子）を用いた。液体クロマトグラフィー－質量分析スペクトル（ＬＣ－Ｍａｓｓ）は以下の方法で測定した。［ＵＰＬＣ］Ｗａｔｅｒｓ　ＡＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣシステムおよびＢＥＨ　Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．７μｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝５：９５（０分）～９５：５（１．０分）～９５：５（１．６分）～５：９５（２．０分）の移動相およびグラジエント条件を用いた。
　１Ｈ－ＮＭＲデータ中、ＮＭＲシグナルのパターンで、ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレット、ｂｒはブロード、Ｊはカップリング定数、Ｈｚはヘルツ、ＣＤＣｌ３は重クロロホルム、ＤＭＳＯ－ｄ６は重ジメチルスルホキシド、Ｄ２Ｏは重水、ＣＤ３ＯＤは重メタノールを意味する。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、水酸基（ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）のプロトン等、ブロードバンドであるため確認ができないシグナルについては、データに記載していない。
　ＬＣ－Ｍａｓｓデータ中、Ｍは分子量、ＲＴは保持時間、［Ｍ＋Ｈ］＋，［Ｍ＋Ｎａ］＋は分子イオンピークを意味する。
　実施例中の「室温」は、通常約０℃から約３５℃の温度を示すものとする。
実施例中の反応性置換基導入率（モル％）は、１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）の積分比から算出されたアルギン酸を構成する単糖（グルロン酸およびマンヌロン酸）単位のモル数に対する導入された反応性置換基のモル数の割合を示すものとする。
　実施例において、反応性基又は相補的な反応性基が導入される前のアルギン酸ナトリウムは、前記表２１に記される物性値を示すアルギン酸ナトリウムを用いた。
　表２３－１～表２３－２には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）で得られた、反応性基が導入されたアルギン酸誘導体の物性値（具体的には、反応性基導入率（ｍｏｌ％）、分子量、及び重量平均分子量（万Ｄａ））を示す。
　表２４－１～表２４－６には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）中の各中間体の１Ｈ－ＮＭＲを示す。
　表２５には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）中の各中間体のＬＣ－Ｍａｓｓを示す。
（実施例Ａ－１）
　ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（実施例Ａ－１ａ、実施例Ａ－１ｂ、実施例Ａ－１ｃ、実施例Ａ－１ｄ、実施例Ａ－１ｅ、実施例Ａ－１ｆ、実施例Ａ－１ｇ、及び実施例Ａ－１ｈ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
（実施例Ａ－１ａ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４３．６　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１１．６５　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（４０３．５　μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン（３－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－　１－プロパノン）［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、８３．６２　ｍｇ）のエタノール溶液（２　ｍＬ）を滴下し、室温で１８時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（８７．２　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２（３７６　ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｂ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－１）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－１）水溶液（１９．３２　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（４９．４７　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７８．８　μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、３７．０５　ｍｇ）のエタノール溶液（４　ｍＬ）を滴下し、室温で２０時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（３８．６４　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－１（１８４　ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｃ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－３）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－３）水溶液（１５．０６　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３８．５７　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１３９．４　μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、２８．８８　ｍｇ）のエタノール溶液（２　ｍＬ）を滴下し、室温で２３時間攪拌した。塩化ナトリウム（１５０　ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０．２４　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－３（１６４　ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｄ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（５３．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１１．０　ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、３６．９　ｍｇ）のエタノール（５．３　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１１３．７　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（５３０　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１０１　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ａ（４６５　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｅ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３５．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４．７　ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、４．９　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７．７　μＬ）、エタノール（３．５　ｍＬ）を加え、３０℃で３．５時間攪拌した。塩化ナトリウム（３５０　ｍｇ）を加えた後、エタノール（７０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ（３２９　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｆ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｃ）の合成：
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７．０　ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、１６．７　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（６０．５　μＬ）、エタノール（６．０　ｍＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｃ（５５８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｇ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｂ）の合成：
　（実施例Ａ－１ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｂ（１．１７４　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｈ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）の合成：
　（実施例Ａ－１ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ（１．１３８　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－２）Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン基導入アルギン酸（化合物ＥＸ２－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１０．９　ｍＬ）に、室温で、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２７．９１　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１００．９　μＬ）を加えた。この溶液に、市販のＮ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン［CAS REGISTRY NO.：１２６３１６６－９３－３］（ＥＸ２－ＳＭ、２４．５４　ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）及び水（１　ｍＬ）溶液を、室温で滴下し、同温度で２１時間攪拌した。塩化ナトリウム（１００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（２１．８　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ２－（Ｉ）－Ａ－２（１００　ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－３）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－３ａ、実施例Ａ－３ｂ、実施例Ａ－３ｃ、実施例Ａ－３ｄ、実施例Ａ－３ｅ、実施例Ａ－３ｆ、実施例Ａ－３ｇ、実施例Ａ－３ｈ及び実施例Ａ－３ｉ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
＜工程１＞メチル　４－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）ベンゾエート（化合物ＥＸ３－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
　トリフェニルホスフィン（０．９６　ｇ）のテトラヒドロフラン（２．５９　ｍＬ）溶液に、氷冷撹拌下、アゾジカルボン酸ジエチル（４０％トルエン溶液，１．９２　ｍＬ）溶液を加え、室温で２０分間撹拌した。この溶液に対し、氷冷撹拌下、市販の４－ヒドロキシ安息香酸　メチル［CAS REGISTRY NO.：９９－７６－３］（化合物ＥＸ３－ＳＭ、０．３７　ｇ）及び２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）エタノールアミン［CAS REGISTRY NO.：２６６９０－８０－２］（０．３９　ｇ）のテトラヒドロフラン（１．１　ｍＬ）溶液を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）により精製し、化合物１と化合物２の混合物を得た。この混合物をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５　ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ３－ＩＭ－１（０．４５　ｇ）をピンク色のオイル状物質として得た。
＜工程２＞４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド塩酸塩（化合物ＥＸ３－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
　（実施例Ａ－３）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－１（０．４４　ｇ）のメタノール（４．４　ｍＬ）溶液に水酸化リチウム一水和物（０．２５　ｇ）を加え、６０度で３時間３０分撹拌した。反応液に１規定－塩酸（５　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１０　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をアセトニトリル（４．４　ｍＬ）に溶解させ、３－アジドプロパン－１－アミン［CAS REGISTRY NO.：８８１９２－１９－２］（０．１５　ｇ）とＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．５７　ｇ）を加えた。続いて、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５２　ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応液に対し水（１０　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５　ｍＬ）で３回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、化合物ＥＸ３－ＩＭ－２（０．７１　ｇ）を含む画分を得た。
　化合物ＥＸ３－ＩＭ－２を含む画分（０．７１　ｇ）に対し、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（４．９　ｍＬ）を加え、室温で２０分間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテルを加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（０．４９　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ａ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９．６　ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５０．１９　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５４．３７　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１８１．４　μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（３９．２　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２（１９８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｂ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－１）水溶液（１９．３２　ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（４９．４７　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５３．３９　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７８．８　μＬ）を加え、室温で２０時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（３８．６４　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－１（２２１　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｃ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－３）水溶液（１５．０６　ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３８．５７　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（４１．７８　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１３９．４　μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（１５０　ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０．２４　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－３（１５５　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｄ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１２５．６　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（４５．４　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２１１．８　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ（５５３　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｅ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３５．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４．７　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５．３　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２６．５　μＬ）を加え、３０℃で３．５時間攪拌した。塩化ナトリウム（３５０　ｍｇ）を加えた後、エタノール（７０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ（３０４　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｆ）　４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｃ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７．０　ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（１８．１　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９０．８　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｃ（５６８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｇ）４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－３ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（１．１７１　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｈ）４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ）の合成：
（実施例Ａ－３ａ）と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ（１．１６９　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｉ）４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｄ）の合成：
（実施例Ａ－３ｄ）と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｄ（２．４２　ｇ）を白色固体として得た。　
　（実施例Ａ－４）４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
＜工程１＞　４－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロポキシ）安息香酸（化合物ＥＸ４－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
　トリフェニルホスフィン（２．０７　ｇ）のテトラヒドロフラン（７　ｍＬ）溶液に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（４０％トルエン溶液，４．１５　ｍＬ）を加え、析出物が形成するまで撹拌した。更に１時間撹拌後、市販のｔｅｒｔ－ブチル（３－ヒドロキシプロピル）カルバマート［CAS REGISTRY NO.：５８８８５－５８－８］（１．１５　ｇ）及び４－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル［CAS REGISTRY NO.:９９－７６－３］（化合物ＥＸ４－ＳＭ、１　ｇ）のテトラヒドロフラン（３　ｍＬ）溶液を加え、３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～６６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）により精製した。この精製物をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５　ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－１（２．９４　ｇ）を含む画分を白色固体として得た。
　化合物ＥＸ４－ＩＭ－１を含む画分（２．９４　ｇ）のメタノール（１５．６　ｍＬ）溶液に対し、室温撹拌下、水酸化リチウム・一水和物（１．０６　ｇ）を加え、６０℃で３時間撹拌した。室温に冷却後、減圧下で溶媒を留去した。この残留物に対し、水（２０　ｍＬ）を加え、メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）で２回抽出した。水層を１規定－塩酸（２５　ｍＬ）を用い酸性にし、酢酸エチル（２０　ｍＬ）で３回抽出し、水（１０　ｍＬ）及び飽和食塩水（１０　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残留物にメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３０　ｍＬ）及び１規定－水酸化ナトリウム水溶液（２０　ｍ）を加え、メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）で２回抽出した。水層を１規定－塩酸（２０　ｍＬ）を用い酸性にし、酢酸エチル（２０　ｍＬ）で２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－２（１．４　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞　４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド塩酸塩（化合物ＥＸ４－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
　（実施例Ａ－４）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ４－ＩＭ－２（１　ｇ）、市販の２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン［CAS REGISTRY NO.：１６６３８８－５７－４］（０．６２　ｇ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（１．３５　ｇ）のアセトニトリル（２０　ｍＬ）溶液に対し、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．２４　ｍＬ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応液に対し水（２０　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０　ｍＬ）で３回抽出し、水（１０　ｍＬ）及び飽和食塩水（１０　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－３（１．３７　ｇ）を含む画分を得た。
　化合物ＥＸ４－ＩＭ－３を含む画分（１．３７　ｇ）に対し、１，４－ジオキサン（９．５８　ｍＬ）を加えた。この溶液に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（９．５８　ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１００　ｍＬ）を加えた後、懸濁液を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、残留物を酢酸エチル（２０　ｍＬ）及びメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）でトリチュレートした。得られた固体を濾過し、減圧下乾燥することで、標記化合物ＥＸ４－ＩＭ－４（１．２３　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞　４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９．６　ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５０．１９　ｍｇ）、（実施例Ａ－４）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ４－ＩＭ－４（７０．３５　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１８１．４　μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（３９．２　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２（１９９　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－５）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－５ａ、、実施例Ａ－５ｂ及び実施例Ａ－５ｃ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
＜工程１＞　ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エチル）カルバメート（化合物ＥＸ５－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
　４－（クロロメチル）ベンゾイル　クロリド、［CAS REGISTRY NO.：８７６－０８－４］（ＥＸ５－ＳＭ、２．０　ｇ）をテトラヒドロフラン（１０．０　ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：５７２６０－７３－８］（１．７　ｇ）とＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（３．７　ｍＬ）のテトラヒドロフラン（１０．０　ｍＬ）溶液を、氷水冷下滴下し、室温で１．５時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（３０　ｍＬ）と水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を半飽和重曹水（１０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルでトリチュレートした後、得られた固体をろ取し、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－１（２．９　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞　ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エチル）カルバメート（ＥＸ－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
　アジ化ナトリウム（１００　ｍｇ）をジメチルスルホキシド（６．０　ｍＬ）に溶かし、（実施例Ａ－５）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－１（４００　ｍｇ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（１２　ｍＬ）を加え、析出した固体をろ過し、水洗した。得られた固体を、５０℃で減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－２（３８０　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド　塩酸塩（化合物ＥＸ５－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000139
　（実施例Ａ－５）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－２（２５０　ｍｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．７５　ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（５．２５　ｍＬ）を加え、得られた沈殿をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（１９２　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４－１＞（実施例Ａ－５ａ）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000140
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４　ｍｇ）、（実施例Ａ－５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（５２　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２５２　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（４０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２（１８５　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４－２＞（実施例Ａ－５ｂ）　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ｂ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000141
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（２０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４　ｍｇ）、（実施例Ａ－５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（２６　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（４０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ｂ－２（１８７　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－５ｃ）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
　（実施例Ａ－５ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（２７６　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－６）　５－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１－ペンタノン基（ＡＤＩＢＯ－Ｃ５－アミン）導入アルギン酸（化合物ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000142
＜工程１＞　Ｎ－トリフルオロアセチル－５－アミノペンタン酸（ＥＸ６－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000143
　５－アミノペンタン酸［CAS REGISTRY NO.：６６０－８８－８］（ＥＸ６－ＳＭ１、２．０　ｇ）、トリフルオロ酢酸　エチルエステル（３．１ｍＬ）、トリエチルアミン（３．６　ｍＬ）をメタノール（９０．０　ｍＬ）に溶解し、４０℃で５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残さにエタノール（１０　ｍＬ）を加え減圧濃縮する操作を２回行った。濃縮残さを酢酸エチル（２００　ｍＬ）に溶解し、０．１モル濃度のリン酸２水素ナトリウム水溶液（７０　ｍＬ）で３回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－１（１．８　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞　（Ｚ）－Ｎ－（５－（ジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－５－オキソペンチル－トリフルオロアセタミド（化合物ＥＸ６－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000144
　（実施例Ａ－６）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－１（６１７　ｍｇ）に、塩化チオニル（４４０　μＬ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２　μＬ）を加え、８０℃で１．５時間撹拌し、反応液を減圧濃縮した。残さの塩化メチレン（１．０　ｍＬ）溶液を、［製造法Ｄ］＜工程１＞記載の方法に従い，５－ジベンゾスベレノン［CAS REGISTRY NO.:２２２２－３３－５］から合成した化合物ＥＸ６－ＳＭ２［CAS REGISTRY NO.:２３２９４－９３－６］（５００　ｍｇ）、ピリジン（５８５　μＬ）の塩化メチレン（５．０　ｍＬ）溶液に氷水冷下で加え、室温で３０分間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（２０　ｍＬ）で希釈し、水（１０　ｍＬ）、１規定－塩酸（１０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られた残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン～６０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製した後、得られた固体をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートした。固体をろ過後、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－２（８４０　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞　Ｎ－（５－（１１，１２－ジブロモ－１１，１２－ジヒドロジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－５－オキソペンチル－トリフルオロアセタミド（化合物ＥＸ６－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000145
　（実施例Ａ－６）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－２（７００　ｍｇ）の塩化メチレン（２．８　ｍＬ）溶液に、ピリジニウムブロミドペルブロミド（６１２　ｍｇ）を氷水冷下で加え、室温で１．５時間撹拌した後、ピリジニウムブロミドペルブロミド（１１１　ｍｇ）を加え、室温でさらに１時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（２０　ｍＬ）で希釈し、２規定－塩酸（１０　ｍＬ）、飽和食塩水（５ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－３（１．０３　ｇ）を黄色アモルファスとして得た。
＜工程４＞　Ｎ－　［５－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－５－オキソペンチル］　－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（ＥＸ６－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000146
　（実施例Ａ－６）＜工程３＞で得られた粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－３（１００　ｍｇ）のテトラヒドロフラン（１．５　ｍＬ）溶液に、ｔeｒｔ－ブトキシカリウム（１００　ｍｇ）を、室温撹拌下、少量ずつ、８時間かけて加えた。反応液を酢酸エチル（１５　ｍＬ）で希釈し、水（３　ｍL）、飽和食塩水（２　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－４（５８　ｍｇ）を淡茶色ガム状物質として得た。
＜工程５＞　５－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１－ペンタノン（化合物ＥＸ６－ＩＭ－５）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000147
　（実施例Ａ－６）＜工程４＞で得られた粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－４（５８　ｍｇ）のメタノール（１．２　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４０　ｍｇ）の水（０．２５　ｍＬ）溶液を加え、室温で２３時間撹拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル（１０　ｍＬ）、塩化メチレン（１　ｍL）、半飽和食塩水（２　ｍL）を加え、分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られたガムをシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル～５０％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－５（２２　ｍｇ）を無色ガム状物質として得た。
＜工程６＞　５－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１－ペンタノン（ＡＤＩＢＯ－Ｃ５－アミノ）基導入アルギン酸（ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000148
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（２８．５　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６０　ｍｇ）、（実施例Ａ－６）＜工程５＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－５（２２　ｍｇ）のエタノール（２．９　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７２　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２８５　ｍｇ）を加えた後、エタノール（５７　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２（２７７　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－７）　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－７ａ、実施例Ａ－７ｂ、及び実施例Ａ－７ｃ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000149
＜工程１＞　ｔeｒｔ－ブチル（２－（４－アジドベンザミド）エチル）カルバメート（化合物ＥＸ７－ＩＭ－1）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000150
　４－アジド安息香酸［CAS REGISTRY NO.：６４２７－６６－３］（ＥＸ７－ＳＭ、７００　ｍｇ）に、塩化チオニル（７８３　μＬ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３　μＬ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残さに塩化メチレン（１　ｍＬ）をｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：５７２６０－７３－８］（８２５　ｍｇ）、ピリジン（１．０４　ｍＬ）の塩化メチレン（７．０　ｍＬ）溶液に氷水冷下で加え、室温で１時間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（３０　ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍL）、飽和重曹水（５　ｍＬ）、０．５規定－クエン酸（５ｍＬで２回）、水（５ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残さをｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートし、固体をろ過した後、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ７－ＩＭ－１（１．１　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド　塩酸塩（化合物ＥＸ７－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000151
　（実施例Ａ－７）＜工程１＞で得られた化合物（ＥＸ７－ＩＭ－１、５００　ｍｇ）を、１，４－ジオキサン（１．５　ｍＬ）に懸濁した。氷水冷下４規定－塩化水素／ジオキサン溶液（３．５　ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１０．５　ｍＬ）を加え、室温で５０分間撹拌した。固体をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（３６５　ｍｇ）を淡ベージュ色固体として得た。
＜工程３－１＞（実施例Ａ－７ａ）　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000152
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３０．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６３　ｍｇ）、（実施例Ａ－７）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（１８　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１１４　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（３００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ（２８２　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３－２＞（実施例Ａ－７ｂ）　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000153
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７　ｍｇ）、（実施例Ａ－７）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（１５　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ（５６０　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－７ｃ）　Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
　アルギン酸をＡ－２に変えて（実施例Ａ－７ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ａ－２（２７１　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－８ａ、実施例Ａ－８ｂ、実施例Ａ－８ｃ、実施例Ａ－８ｄ及び実施例Ａ－８ｅ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000154
＜工程１＞　ｔｅｒｔ－ブチル（４－（4（（２，２，２－トリフルオロアセタミド）メチル）ベンジル）カルバメート（化合物ＥＸ８－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000155
　文献公知の方法（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）１１：４１８９－４２０６）を参考に，１，４－ビス（アミノメチル）ベンゼン［CAS REGISTRY NO.：５３９－４８－０］から合成したｔｅｒｔ－ブチル（４－（アミノエチル）ベンジル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.:１０８４６８－８０－４］（ＥＸ８－ＳＭ１、０．６７　ｇ）、トリエチルアミン（０．３９　ｍＬ）及びメタノール（６．６７　ｍＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、トリフルオロ酢酸エチル（０．４４　ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温に昇温し、同温で５時間撹拌した。反応を水（１０　ｍＬ）で停止し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で３回抽出した。回収した有機層を飽和食塩水（５　ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層を濾過後、濃縮し、標記粗化合物ＥＸ８－ＩＭ－１（０．６７１　ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程２＞　Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド塩酸塩（化合物ＥＸ８－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000156
　（実施例Ａ－８）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－１（０．５　ｇ）の１，４－ジオキサン溶液（３．５　ｍＬ）に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（３．５　ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（４０　ｍＬ）を加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ８－ＩＭ－２（０．３６　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞　Ｎ－（４－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）メチル）ベンジル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（化合物ＥＸ８－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000157
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い、シクロヘプテン［CAS REGISTRY NO.:６２８－９２－２］から合成したカルボン酸［CAS REGISTRY NO.:９１７７５６－４２－４］（ＥＸ８－ＳＭ２、０．１７　ｇ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．２６　ｇ）のアセトニトリル（１．７　ｍＬ）溶液に対し、氷冷撹拌下、（実施例Ａ－８）＜工程２＞で得られたＥＸ８－ＩＭ－２（０．２６　ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５１　ｍＬ）を滴下し、室温で１時間３０分撹拌した。水（５　ｍＬ）を加え反応を停止させた後、酢酸エチル（５　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を飽和食塩水（３　ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層を濾過後、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１２％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、標記化合物ＥＸ８－ＩＭ－３（０．１８９　ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程４＞　Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド（化合物ＥＸ８－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000158
　（実施例Ａ－８）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－３（０．１８　ｇ）及びメタノール（１．８　ｍＬ）の混合物に対して、氷冷撹拌下、炭酸カリウム（０．１２６　ｇ）水溶液（０．９　ｍＬ）を滴下し、室温で１７時間３０分撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、酢酸エチル（５　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を飽和食塩水（５　ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で溶媒を留去し、標記粗化合物ＥＸ８－ＩＭ－４（０．１３　ｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程５＞　Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000159
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（５０．８６　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（０．１１８　ｇ）を加えた。続いて、（実施例Ａ－８）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－４（０．０３５　ｇ）のエタノール（３　ｍＬ）溶液を同温で滴下し、４０度で４時間攪拌した。室温に冷却後、塩化ナトリウム（５００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（１０１．７２　ｍＬ）を加え、３０分間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２　ｍＬ）で３回洗浄後、減圧下乾燥し、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２（５２１　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８ｂ）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
　アルギン酸をＡ－２に変えて（実施例Ａ－８）＜工程５＞と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２（２８５　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８ｃ）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－８）＜工程５＞と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ（１．９６　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８ｄ）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂ）の合成：
アルギン酸をＡ－２に変えて、（実施例Ａ－８）＜工程５＞と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂ（１．１０　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８ｅ）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）の合成：
アルギン酸をＡ－２に、水溶液を２重量％に変えて、（実施例Ａ－８）＜工程５＞と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂ（１．１０　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－オキシ）アセタミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－９ａ、実施例Ａ－９ｂ及び実施例Ａ－９ｃ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000160
（実施例Ａ－９ａ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
＜工程１＞　ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）カルバメート（ＥＸ９－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000161
　市販のｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：５７２６０－７３－８］（ＥＸ９－ＳＭ１、３．００　ｇ）のテトラヒドロフラン（１２．０　ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（２．２４　ｍＬ）を滴下した。反応混合物を、室温で１４．５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣にｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５　ｍＬ）とｎ－ヘプタン（２５　ｍＬ）を加え、トリチュレートした。固体を濾過後、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（４．３６　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞　Ｎ－（２－アミノエチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド塩酸塩（ＥＸ９－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000162
　（実施例Ａ－９ａ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（０．５０　ｇ）に、ギ酸（３．１　ｍＬ）を加え、室温で２２．５時間撹拌した。ギ酸を留去し、トルエンで共沸した。得られた油状物に塩化水素／メタノールを加え、減圧濃縮した。酢酸エチル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで順次共沸した後、減圧乾燥して、標記粗化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（０．３５　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（ＥＸ９－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000163
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、１００　ｍｇ）にエタノール（１．０　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３０４　ｍｇ）、（実施例Ａ－９ａ）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（１５９　ｍｇ）、トリエチルアミン（１５３　μＬ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。水（４　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５　ｍＬ、５　ｍＬ）で抽出した。有機層を、０．５規定－クエン酸（５　ｍＬ）、水（５　ｍＬ×２）、飽和食塩水（３　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～６０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（１０３　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド（ＥＸ９－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000164
　（実施例Ａ－９ａ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（１０３　ｍｇ）のメタノール（１．５５　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（８９　ｍｇ）の水（５１５　μＬ）溶液を加え、室温で６時間撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、水（２　ｍＬ）を加えた後、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５　ｍＬ、１０　ｍＬ×５）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（７５　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000165
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ａ－２）水溶液（３０　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４　ｍｇ）、（実施例Ａ－９ａ）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（１７　ｍｇ）のエタノール（３　ｍＬ）溶液、１モル濃度重曹水（７６　μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（０．３　ｇ）を加えた後、エタノール（６０　ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（１０　ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２（２９０　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９ｂ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
＜工程１＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド　塩酸塩（ＥＸ９－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000166
　（実施例Ａ－９ａ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（０．５０　ｇ）を、１，４－ジオキサン（３．０　ｍＬ）に懸濁した。氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（７．０　ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３０．０　ｍＬ）を加え、室温で５０分間撹拌した。固体をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（０．７０　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（ＥＸ９－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000167
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、３００　ｍｇ）と（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（３８０　ｍｇ）を用い、（実施例Ａ－９ａ）＜工程３＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（３２２　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド（ＥＸ９－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000168
　（実施例Ａ－９ｂ）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（３２２　ｍｇ）を（実施例Ａ－９ａ）＜工程４＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（２３８　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000169
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（１２０　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３３５　ｍｇ）、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（６８　ｍｇ）のエタノール（１２　ｍＬ）溶液、１モル濃度重曹水（３０３　μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（１．２　ｇ）を加えた後、エタノール（２４０　ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２０　ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ（１．１６　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９ｃ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000170
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（１２０　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１６７　ｍｇ）、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（３４　ｍｇ）のエタノール（１２　ｍＬ）溶液、１モル濃度重曹水（１５１　μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（１．２　ｇ）を加えた後、エタノール（２４０　ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２０　ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ（１．１２　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１０）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－１０ａ及び実施例Ａ－１０ｂ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000171
＜工程１＞　ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１０－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000172
　ＥＸ５－ＳＭ（４－（クロロメチル）ベンゾイル　クロリド、０．５０　ｇ）をテトラヒドロフラン（５．０　ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－アミノエトキシ）エチル）カルバメート（０．５４　ｇ、［CAS REGISTRY NO.：１２７８２８－２２－２］）とジイソプロピルエチルアミン（０．９２　ｍＬ）のテトラヒドロフラン（５．０　ｍＬ）溶液を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（２５　ｍＬ）と水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンの混合溶媒でトリチュレートした後、得られた固体をろ取し、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－１（０．７９　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１０－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000173
　アジ化ナトリウム（１０９　ｍｇ）をジメチルスルホキシド（７．５　ｍＬ）に溶かし、（実施例Ａ－１０）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－１（５００　ｍｇ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（１５　ｍＬ）を加え、析出した固体をろ過し、水洗した。得られた固体を乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－２（４７８　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド　塩酸塩（ＥＸ１０－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000174
　（実施例Ａ－１０）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－２（４００　ｍｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（２．８　ｍＬ）を加え、室温で１．７５時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（８．４　ｍＬ）を加え、ガム状物を得た。上清をデカントにて除き、ジイソプロピルエーテルでデカント洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－３（２９８　ｍｇ）をベージュ色固体として得た。
＜工程４－１＞（実施例Ａ－１０ａ）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000175
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２　ｍｇ）、（実施例Ａ－１０）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－３（３０　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（８０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２（４０８　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４－２＞（実施例Ａ－１０ｂ）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－１０）＜工程４－１＞と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（１．３２　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１１）Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000176
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１１－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000177
　４－（クロロメチル）ベンゾイル　クロリド（ＥＸ５－ＳＭ、０．５０　ｇ）をテトラヒドロフラン（５．０　ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（０．６６　ｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．９２　ｍＬ）のテトラヒドロフラン（５．０　ｍＬ）溶液を滴下し、室温で４．７時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（２５　ｍＬ）と水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を半飽和重曹水（１０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣にｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルを加え、固体をろ過にて除いた。得られたろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～酢酸エチル）で精製して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－１（０．８２　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１１－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000178
　（実施例Ａ－１１）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－１（０．８２　ｇ）のジメチルスルホキシド（１１．７　ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（１５２　ｍｇ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（２３　ｍＬ）を加え、同温にて３０分撹拌した。酢酸エチル（３０　ｍＬ、１０　ｍＬ）で抽出し、有機層を水（１０　ｍＬ×３）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、析出した固体をろ過し、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－２（０．８０　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド　塩酸塩（ＥＸ１１－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000179
　（実施例Ａ－１１）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－２（０．８０　ｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（５．３　ｍＬ）を加え、室温で１．７５時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１６．０　ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。溶媒をデカントにより除き、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた残渣を減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－３（０．７３　ｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000180
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２　ｍｇ）、（実施例Ａ－１１）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－３（３８　ｍｇ）のエタノール（４．０　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１５１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４　ｇ）を加えた後、エタノール（８０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２（４１６　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１２）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－（アジドメチル）ニコチンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000181
＜工程１＞ メチル　６－（アジドメチル）ニコチナート（ＥＸ１２－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000182
　文献公知の方法（Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．（２０１２）５１：５８５２－５８５６）を参考に、市販のメチル　６－（ヒドロキシメチル）ニコチナート［CAS REGISTRY NO.：５６０２６－３６－９］（ＥＸ１２－ＳＭ１、０．５　ｇ）及びテトラヒドロフラン（５　ｍＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（０．６８　ｇ）及びトリエチルアミン（０．６３　ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で２０時間３０分撹拌した後、同温で、アジ化ナトリウム（０．２９　ｇ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチル（１０　ｍＬ）及び水（１０　ｍＬ）を加え、反応液を希釈した後、水層を酢酸エチル（１０　ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で生成することで、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－１（０．３４　ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程２＞６－（アジドメチル）ニコチン酸（ＥＸ１２－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000183
　（実施例Ａ－１２）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－１（０．３４２　ｇ）及びメタノール（６．８４　ｍＬ）の混合物に対し、１モル濃度－水酸化リチウム・一水和物（５．３４　ｍＬ）を室温で加え、同温で３０分撹拌した。反応終了後、酢酸（０．４１　ｍＬ）を加え、反応液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル～酢酸エチル／メタノール）で精製し、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－２（０．２８　ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程３＞ ｔｅｒｔ－ブチル　（２－（２－（６－（アジドメチル）ニコチンアミド）エトキシ）エチル）カルバマート（ＥＸ１２－ＩＭ－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000184
　（実施例Ａ－１２）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－２（１００　ｍｇ）、市販のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（２－アミノエトキシ）エチルアミン［CAS REGISTRY NO.：１２７８２８－２２－２］（１０８．０７　μＬ）及びアセトニトリル（２０００　μＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２１３．４３　ｍｇ）及びトリエチルアミン（１５６．４８　μＬ）を加え、室温で１時間４５分撹拌した。その後、室温撹拌下、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（２－アミノエトキシ）エチルアミン（５４　μＬ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（１０６．７　ｍｇ）を加え、同温にて１７時間撹拌した。水（５　ｍＬ）を加え反応を停止させ、酢酸エチル（１０　ｍＬ）を加えた。水層を酢酸エチル（１０　ｍＬ）で３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－３（１８７　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）６－（アジドメチル）ニコチンアミド　２塩酸塩（ＥＸ１２－ＩＭ－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000185
　（実施例Ａ－１２）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－３（０．１８７　ｇ）及び１，４－ジオキサン溶液（１．３１　ｍＬ）の混合物に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．３１　ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（２０　ｍＬ）を加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－４（０．１６　ｇ）をオフホワイト色固体として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－（アジドメチル）ニコチンアミド基導入アルギン酸の合成（ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000186
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（３９．５５　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２　ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（１８３　μＬ）を加えた。続いて、（実施例Ａ－１２）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－４（３０　ｍｇ）、水（１　ｍＬ）及びエタノール（１　ｍＬ）の混合物を同温で加え、４０℃で４時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００　ｍｇ）を加えた後、エタノール（７９．１　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２（３７８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１３）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－１３ａ及び実施例Ａ－１３ｂ）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000187
＜工程１＞ ｔeｒｔ－ブチル（２－（２－（４－アジドベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１３－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000188
　４－アジド安息香酸（ＥＸ７－ＳＭ、３００　ｍｇ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－アミノエトキシ）エチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：１２７８２８－２２－２］（３７６　ｍｇ）をアセトニトリル（６．０　ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７７　ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０７　μＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～７０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１３－ＩＭ－１（６７３　ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程２＞　Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド　塩酸塩（ＥＸ１３－ＩＭ－2）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000189
　（実施例Ａ－１３）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１３－ＩＭ－１、６７０　ｍｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（４．７　ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１４．０　ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。得られた固体をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－ＩＭ－２（６０４　ｍｇ）を淡ベージュ色固体として得た。
＜工程３－１＞（実施例Ａ－１３ａ） Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000190
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２　ｍｇ）、（実施例Ａ－１３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１３－ＩＭ－２（３１　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４　ｇ）を加えた後、エタノール（８０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２（４００　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３－２＞（実施例Ａ－１３ｂ）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－１３）＜工程３＞と同様の方法にて化合物の合成操作を行い、固体を得た。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（１．３１　ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１４）Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000191
　＜工程１＞ ｔeｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－アジドベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１４－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000192
　４－アジド安息香酸（ＥＸ７－ＳＭ、３００　ｍｇ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４５７　ｍｇ）をアセトニトリル（６．０　ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７７　ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０７　μＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～９０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１４－ＩＭ－１（６０３　ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程２＞　Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド　塩酸塩（ＥＸ１４－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000193
　（実施例Ａ－１４）＜工程１＞で得られた化合物（ＥＸ１４－ＩＭ－１、６００　ｍｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン溶液（４．２　ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１２．０　ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。溶媒をデカントにより除き、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた残渣を減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１４－ＩＭ－２（５９６　ｍｇ）をベージュ色ガム状物として得た。
＜工程３＞　Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000194
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２　ｍｇ）、（実施例Ａ－１４）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１４－ＩＭ－２（４５　ｍｇ）のエタノール（４．０　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１５１　μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４　ｇ）を加えた後、エタノール（８０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２（４０８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１５）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－オキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000195
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エトキシ）エチルカルバメート（ＥＸ１５－ＩＭ－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000196
　ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：５７２６０－７３－８］（ＥＸ９－ＳＭ１、１．０　ｇ）のテトラヒドロフラン（４．０　ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（０．６　ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で、３．５時間撹拌した。反応液を、減圧下濃縮して、標記粗化合物ＥＸ１５－ＩＭ－１（１．５　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド　塩酸塩（ＥＸ１５－ＩＭ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000197
　（実施例Ａ－１５）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－１（１．５　ｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン溶液（１０．３　ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３０　ｍＬ）を加え、３０分間室温で撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、ジイソプロピルエーテルで共沸した後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－ＩＭ－２（１．３　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（ＥＸ１５－ＩＭ－３）の合成： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000198
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、３００　ｍｇ）、（実施例Ａ－１５）＜工程２＞で得られた化合物（４４３　ｍｇ）をアセトニトリル（６．０　ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７５　ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９２０　μＬ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～７０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１５－ＩＭ－３（４６９　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド（ＥＸ１５－ＩＭ－４）の合成： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000199
　（実施例Ａ－１５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－３（２２０　ｍｇ）のメタノール（３．０　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１０３　ｍｇ）の水（０．９９　ｍＬ）溶液を加え、室温で４．５時間撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、水（２　ｍＬ）を加えた後、食塩で飽和させた。酢酸エチル（１５　ｍＬ、１０　ｍＬ×４）抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（１０　ｍＬ）に溶かし、不溶物をろ過して除いた後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ１５－ＩＭ－４（１４０　ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000200
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ａ－２）水溶液（４０　ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２　ｍｇ）、（実施例Ａ－１５）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－４（３０　ｍｇ）のエタノール（４．０　ｍＬ）溶液、１モル濃度重曹水（１０１　μＬ）を順次加え、３０℃で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（０．４　ｇ）を加えた後、エタノール（８０　ｍＬ）を加え、３０分間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２（４１０　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１）
３－アジドプロピルアミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000201
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６　ｍｇ）、市販の３-アジドプロピルアミン［CAS REGISTRY NO.：８８１９２－１９－２］（１－１、５．１　ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（５０　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２　ｇ）、エタノール（４０　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１－Ａ２（１８７　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例２）
２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ２－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000202
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１０．９　ｍＬ）に、氷冷攪拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５５．８３　ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（２５２．１７　μＬ）を加えた。続いて、市販の２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン［CAS REGISTRY NO.：１６６３８８－５７－４］（２－１、２６．３６　ｍｇ）のエタノール（１　ｍＬ）及び水（１　ｍＬ）溶液を加え、室温で１５時間攪拌した後、塩化ナトリウム（１００　ｍｇ）、エタノール（２１．８　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、標記化合物ＥＸ２－Ａ２（９９　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例３）
２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000203
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（３－アジドプロピル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（３－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000204
　市販の３-アジドプロピルアミン［CAS REGISTRY NO.：８８１９２－１９－２］（１－１、４１　μＬ）、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)グリシン［CAS REGISTRY NO.：４５３０－２０－５］（３－１、１００　ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）１９７　ｍｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた油状物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）に溶解し、飽和重曹水、水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物３－２（９５　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセタミド　塩酸塩（３－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000205
　（実施例３）＜工程１＞で得られた化合物（３－２、９５　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（６６５　μＬ）を加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（２．０　ｍＬ）を加え、減圧濃縮した。得られた油状物を、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルでデカント洗浄後、減圧濃縮して、標記化合物３－３（６２　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程３＞
２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000206
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６　ｍｇ）、（実施例３）＜工程２＞で得られた化合物（３－３、１０．６　ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７６　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２　ｇ）、エタノール（４０　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ３－Ａ２（２０７　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例４）
３－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ４－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000207
＜工程１＞
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（（３－アジドプロピル）アミノ）－３－オキソプロピル）カルバメート（４－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000208
　市販の３-アジドプロピルアミン［CAS REGISTRY NO.：８８１９２－１９－２］（１－１、３８　μＬ）、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β－アラニン［CAS REGISTRY NO.：３３０３－８４－２］（４－１、１００ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）１４６　ｍｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物４－２（１２４　ｍｇ）を白色ワックス状物として得た。
＜工程２＞３－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド　塩酸塩（４－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000209
　（実施例４）＜工程１＞で得られた化合物（４－２、１２４　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（８６８　μＬ）を加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（２．６　ｍＬ）を加え、減圧濃縮した。得られた油状物を、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルでデカント洗浄後、減圧濃縮して、標記化合物４－３（９３　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程３＞３－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ４－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000210
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６　ｍｇ）、（実施例４）＜工程２＞で得られた化合物（４－３、１２．６　ｍｇ）のエタノール（２　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７６　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２　ｇ）、エタノール（４０　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ４－Ａ２（２１１　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例５）
Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000211
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（４－（（２－アジドアセタミド）メチル）ベンジル）カルバメート（５－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000212
　市販の２-アジド酢酸［CAS REGISTRY NO.：１８５２３－４８－３］（１－１、４１　μＬ）から、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（２０１７），　１９（２３），　６４００－６４０３に記載の方法と同様に調製したアジド酢酸クロリドの塩化メチレン（１．０ｍＬ）溶液を、市販の１－（Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチトキシカルボニル－アミノメチル）－４－（アミノメチル）ベンゼン［CAS REGISTRY NO.：１０８４６８－００－４］（５－１、１００　ｍｇ）、トリエチルアミン（１１８　μＬ）の塩化メチレン（１．０　ｍＬ）溶液に、氷水冷下で加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０　ｍＬ）、水（５　ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和重曹水、水、飽和食塩水で順次洗浄した。不溶物をろ去し、ろ液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートした。得られた固体をろ取し、標記化合物５－２（９１　ｍｇ）を薄いベージュ固体として得た。
＜工程２＞Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセタミド塩酸塩（５－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000213
　（実施例５）＜工程１＞で得られた化合物（５－２、９１　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（６３７　μＬ）を加えた後、１，４－ジオキサン（６２７　μＬ）を追加した後、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．８　ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物５－３（６２　ｍｇ）をベージュ固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000214
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２５　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（７０　ｍｇ）、（実施例５）＜工程２＞で得られた化合物（５－３、１６．１　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９５　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２５　ｇ）、エタノール（５０　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ５－Ａ２（２３９　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例６）
２－（４－アジドフェノキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ６－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000215
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アジドフェノキシ）エチル）カルバメート（６－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000216
　市販の４－アジドフェノール［CAS REGISTRY NO.：２４５４１－４３－３］（６－１、０．３　ｇ）、市販のｔｅｒｔ－ブチル　（２－ブロモエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：３９６８４－８０－５］（６－２、０．６　ｇ）及びＮ－メチルピロリドン（３　ｍＬ）の混合物に対し、室温で炭酸カリウム（０．６１　ｇ）を加えた。反応混合物を８０℃で６時間３０分攪拌し、室温まで冷却した後、水（１０　ｍＬ）及びメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）を加えた。生じた懸濁液をセライトろ過し、残留物をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５　ｍＬ）で２回洗浄した。ろ液を分離し、有機層を減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５　ｍＬ）で２回、水（５　ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで標記化合物６－３（０．４１１　ｇ）を紫色の油状物として得た。
＜工程２＞２－（４－アジドフェノキシ）エタン－１－アミン　塩酸塩（６－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000217
　（実施例６）＜工程１＞で得られた化合物（６－３、０．４１　ｇ）及び１，４－ジオキサン（２．８７　ｍＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（２．８７　ｍＬ）を加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（４０　ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で３０分攪拌した。析出物をろ過し、回収した固体を減圧乾燥して、標記化合物６－４（０．２８３４　ｇ）を淡い紫色固体として得た。
＜工程３＞２－（４－アジドフェノキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ６－Ａ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000218
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２９．６６　ｍＬ）に、室温で４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２　ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（６８．６３　μＬ）を加えた。続いて、（実施例６）＜工程２＞で得られた化合物（６－４、１４．７３　ｍｇ）の水（１　ｍＬ）及びエタノール（１　ｍＬ）溶液を室温にて加え、同温で４２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（３００　ｍｇ）、エタノール（５９．３　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ６－Ａ２（２６９　ｍｇ）をピンク色固体として得た。
（実施例９ａ、９ｂ）
Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ａ－Ａ２、ＥＸ９ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000219
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－オキソ－２－（（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）アミノ）エチル）カルバメート（９－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000220
　Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）グリシン［CAS REGISTRY NO.：４５３０－２０－５］（９１　ｍｇ）、及び（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞と同様な方法で得られた化合物（ＥＸ９－ＩＭ－２、１００　ｍｇ）をアセトニトリル（３．０　ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２１７　ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２８１　μＬ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５　ｍＬ）、水（５　ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル）で精製し、標記化合物９－１（１８０　ｍｇ）を薄いベージュアモルファスとして得た。
＜工程２＞Ｎ－（２－（２－アミノアセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド　塩酸塩（９－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000221
　（実施例９）＜工程１＞で得られた化合物（９－１、１８０　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．２　ｍＬ）を加えた後、室温で０．８時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．６　ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物９－２（１１４　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（９－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000222
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、８０　ｍｇ）、（実施例９）＜工程２＞で得られた化合物（９－２、１１０　ｍｇ）に、エタノール（１．６　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１９　ｍｇ）、トリエチルアミン（６７　μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、水（３．２　ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した後、固体をろ過し、水で洗浄した。得られた固体に、酢酸エチル／エタノール（１／１、１０　ｍＬ）を加え、不溶物をろ去した。ろ液を減圧濃縮して、標記化合物９－３（１０１　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（アミノエチル）－２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド（９－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000223
　（実施例９）＜工程３＞で得られた化合物（９－３、６０　ｍｇ）のメタノール（１．８　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（５９　ｍｇ）の水（０．３　ｍＬ）溶液を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（２ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５ｍＬ，１０　ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０　ｍＬ）、エタノール（１ｍＬ）を加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物９－４（４９　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程５－１＞Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ａ－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000224
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（３８　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１０６　ｍｇ）、（実施例９）＜工程４＞で得られた化合物（９－４、３０．３　ｍｇ）のエタノール（３．８　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（９６　μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．３８　ｇ）、エタノール（７６　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ９ａ－Ａ２（３８１　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程５－２＞Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000225
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３８　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６４　ｍｇ）、（実施例９）＜工程４＞で得られた化合物（９－４、１８．２　ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（５８　μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．３８　ｇ）、エタノール（７６　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ９ｂ－Ｂ２（３６６　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１０）
　Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000226
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（３－オキソ－３－（（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）アミノ）プロピル）カルバメート（１０－１）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000227
化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（１００　ｍｇ、ＥＸ９－ＩＭ－２は、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞と同様な方法で得られた）及びＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)-β-アラニン［CAS REGISTRY NO.：３３０３－８４－２］（１１３　ｍｇ）をアセトニトリル（３．３　ｍＬ）に溶解し、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２６１　ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３１９　μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５　ｍＬ）、水（５　ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０　ｍＬ）でトリチュレートした。固体をろ取し、酢酸エチル（２０　ｍＬ）に溶解した。有機層を、１規定－クエン酸、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）でトリチュレートした後、固体をろ取し、標記化合物１０－１（８０　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）プロパンアミド　塩酸塩（１０－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000228
　（実施例１０）＜工程１＞で得られた化合物（１０－１、８０　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．１　ｍＬ）を加えた後、室温で２時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．４　ｍＬ）を加え、１．５時間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物１０－２（６１　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）－Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）プロパンアミド（１０－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000229
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、４４　ｍｇ）、（実施例１０）＜工程２＞で得られた化合物（１０－２、６１　ｍｇ）に、エタノール（１．２　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１５　ｍｇ）、トリエチルアミン（３９　μＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液に、水（３．７　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５　ｍL, ５　ｍL）で抽出した。有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム乾燥後、減圧濃縮した。得られた固体に、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（１０　ｍＬ）を加え、トリチュレートし、ろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（８０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル→２０％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物１０－３（６０　ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパンアミド（１０－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000230
　（実施例１０）＜工程３＞で得られた化合物（１０－３、６０　ｍｇ）のメタノール（３．０　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４２　ｍｇ）の水（０．３　ｍＬ）溶液を加え、室温で３時間撹拌後、さらに、炭酸カリウム（４２　ｍｇ）の水（０．３　ｍＬ）溶液を加え、室温で１６．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、飽和食塩水（２ｍＬ）を加え、さらに塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５ｍＬ，１０　ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（５　ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１０－４（３１　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000231
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４１　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１４　ｍｇ）、（実施例１０）＜工程４＞で得られた化合物（１０－４、３０．５　ｍｇ）のエタノール（４．１　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１０３　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．４１　ｇ）、エタノール（８２　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－Ａ２（４０６　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１１ａ、１１ｂ）
２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ａ－Ａ２、ＥＸ１１ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000232
＜工程１＞（Ｅ）－Ｎ－（２－（（２－ブロモシクロオクト－２－エン－１－イル）オキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１１－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000233
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したジブロモ体（１１－１、１　ｇ）及び文献公知の方法（国際公開第２０１５／１４０８０７号パンフレット）に従い合成したアルコール体（１１－２、５．２８　ｇ）の混合物に対し、室温でジクロロメタン（２　ｍＬ）を加えた。内温を室温に保ちながら、反応容器をアルミホイルで包み、光から保護した。続いて、室温でトリフルオロメタンスルホン酸銀（１．９２　ｇ）を一度に加え、同温にて１時間攪拌した。攪拌後、氷冷下で飽和食塩水（５　ｍＬ）を加え、析出した銀塩をセライトろ過により除去し、残留物をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）で洗浄した。ろ液を分離し、有機層を水（５　ｍＬ）で２回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－へプタン／酢酸エチル）で精製し、化合物１１－３（０．４６　ｇ）を含む画分を得た。
＜工程２＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミン（１１－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000234
　（実施例１１）＜工程１＞で得られた化合物（１１－３、０．４６　ｇ）を含む画分及びジメチルスルホキシド（１．３８　ｍＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、２８％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（１．８２　ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。水（１０　ｍＬ）を加え反応を停止させ、メタノールを減圧下で濃縮した。生じた溶液をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで標記化合物１１－４（０．１９６　ｇ）の粗生成物を褐色油状物として得た。
＜工程３－１＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ａ－Ａ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000235
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（６９．２　ｍＬ）に、室温で４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１３．５５　ｍｇ）を加えた。続いて、（実施例１１）＜工程２＞で得られた化合物（１１－４、２６．７８　ｍｇ）の水（１　ｍＬ）及びエタノール（１　ｍＬ）溶液を室温にて加え、同温で２４時間攪拌した後、塩化ナトリウム（７００　ｍｇ）、エタノール（１３８．４　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１１ａ－Ａ２（６６１　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３－２＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ｂ－Ｂ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000236
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（７０．１　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１６．４　ｍｇ）及び（実施例１１）＜工程２＞で得られた化合物（１１－４、２７．１４　ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１１ｂ－Ｂ２（６４８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１２）
２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１２－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000237
＜工程１＞２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）アセタミド（１２－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000238
　市販の２－（２－アミノエトキシ）エタノール［CAS REGISTRY NO.：９２９－０６－６］（１２－１、２．０　ｍＬ）のテトラヒドロフラン（８．０　ｍＬ）溶液に、２，２，２－トリフルオロ酢酸エチル（２．５　ｍＬ）を、５分かけて滴下した後、室温で２０時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチル（３０　ｍＬ）、水（１０　ｍＬ）を加え、分液した。水層を酢酸エチル（１０　ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１２－２（３．７　ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞（Ｅ）－Ｎ－（２－（２－（（２－ブロモシクロオクト－２－エン－１－イル）オキシ）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１２－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000239
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したジブロモ体（１１－１、０．３　ｇ）を塩化メチレン（０．５４　ｍＬ）に溶解し、アルミホイル遮光下、（実施例１２）＜工程１＞で得られた化合物（１２－２、１．８６　ｇ）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（０．５２　ｇ）を加えた。遮光下、室温で１．５時間撹拌後、反応液に、氷水冷下、飽和重曹水（２．０　ｍＬ）、飽和食塩水（３．０　ｍＬ）を順次加えた。固体をセライトにてろ去し、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（１０　ｍＬ×３）洗浄した。ろ液を分液し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１２－３（４２４　ｍｇ）を薄い茶色油状物として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１２－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000240
　（実施例１２）＜工程２＞で得られた化合物（１２－３、１００　ｍｇ）を、テトラヒドロフラン（０．７　ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．７　ｍＬ）に溶解した。６０％水素化ナトリウム（２１　ｍｇ）を、氷水下で加え、同温で３時間撹拌した。６０％水素化ナトリウム（１０　ｍｇ）を加え、室温で１時間、さらに６０％水素化ナトリウム（１０　ｍｇ）を加え、室温で２０時間撹拌した。水（３　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５　ｍＬ、１０　ｍＬ）で抽出し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物１２－４（３７　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（１２－５）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000241
　（実施例１２）＜工程３＞で得られた化合物（１２－４、３７　ｍｇ）のメタノール（５５５　μＬ）溶液に、炭酸カリウム（５０　ｍｇ）の水（１８５　μＬ）溶液を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（１　ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１０　ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０　ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１２－５（３０　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１２－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000242
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（５２　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４５　ｍｇ）、（実施例１２）＜工程４＞で得られた化合物（１２－５、２９　ｍｇ）のエタノール（５．２　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１３１　μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．５２　ｇ）、エタノール（１０４　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１２－Ａ２（５２２　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１３）
３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000243
＜工程１＞３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパン酸（１３－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000244
　市販のβ－アラニン［CAS REGISTRY NO.：１０７－９５－９］（１３－１、２．０　ｇ）をメタノール（４０．０　ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３．３　ｍＬ）を加えた。水冷下で２，２，２－トリフルオロ酢酸（３．４　ｍＬ）を５分間で滴下後、室温で２０．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、水（２０　ｍＬ）を加え、１規定－塩酸でｐＨ４に調整した。酢酸エチル（１００　ｍＬ×２、５０　ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１３－２（２．９　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパンアミド）エトキシ）エチル）カルバメート（１３－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000245
　（実施例１３）＜工程１＞で得られた化合物（１３－２、４００　ｍｇ）、及びｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：５７２６０－７３－８］（８－１、４４１　ｍｇ）のエタノール（４．０　ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８９７　ｍｇ）を加え、３．５時間撹拌した。反応液に、水（５　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０　ｍＬ、１０　ｍＬ）で抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル）で精製して、標記化合物１３－３（４５１　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパンアミド　塩酸塩（１３－４）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000246
　（実施例１３）＜工程２＞で得られた化合物（１３－３、４５１　ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（３．１６　ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（６．４　ｍＬ）を加え、減圧濃縮して、標記化合物１３－４（４３３　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル－３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパンアミド（１３－５）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000247
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、１１１　ｍｇ）、（実施例１３）＜工程３＞で得られた化合物（１３－４、２１５　ｍｇ）に、エタノール（１．７　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２５３　ｍｇ）、トリエチルアミン（１０２　μＬ）を加え、室温で２１時間撹拌した。反応液に、水（５　ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５　ｍL）で抽出した。有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル→１５％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物１３－５（３５　ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパンアミド（１３－６）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000248
　（実施例１３）＜工程４＞で得られた化合物（１３－５、３５　ｍｇ）のメタノール（７００　μＬ）溶液に、炭酸カリウム（３３　ｍｇ）の水（１７５　μＬ）溶液を加え、室温で１６．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（２　ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１０　ｍＬ×５）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０　ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１３－６（２４　ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程６＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000249
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２８　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（７８　ｍｇ）、（実施例１３）＜工程５＞で得られた化合物（１３－６、２４　ｍｇ）のエタノール（２．８　ｍL）溶液、１モル濃度－重曹水（７１　μＬ）を加えた。３０℃で３．５時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２８　ｇ）、エタノール（５６　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－Ａ２（２７２　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１４ａ、１４ｂ）
Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ａ－Ａ２、ＥＸ１４ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000250
＜工程１＞Ｎ－（２－ブロモエチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１４－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000251
　市販の２－ブロモエチルアミン臭化水素酸塩［CAS REGISTRY NO.：２５７６－４７－８］（１４－１、３　ｇ）のメタノール（３０　ｍＬ）溶液に対し、氷冷攪拌下、トリエチルアミン（４．２９　ｍＬ）を加えた。この混合物に対し、同温でトリフルオロ酢酸エチル （１．９２　ｍＬ）を徐々に加え、室温で４２時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧下で濃縮し、水（１０　ｍＬ）を加えた。酢酸エチル（１０　ｍＬ）で３回抽出し、有機層を水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで、標記化合物１４－２（２．４５７　ｇ）を淡い褐色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル　（４－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エトキシ）ベンジル）カルバメート（１４－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000252
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　（４－ヒドロキシベンジル）カルバメート［CAS REGISTRY NO.：１４９５０５－９４－２］（１４－３、０．３６　ｇ）、（実施例１４）＜工程１＞で得られた化合物（１４－２、０．４６　ｇ）、ヨウ化カリウム（０．３５　ｇ）及びＮ－メチルピロリドン（３．６　ｍＬ）の混合物に対し、室温で炭酸カリウム（０．４５　ｇ）を加え、１４０℃で５時間攪拌した。反応終了後、室温まで冷却し、水（１０　ｍＬ）で希釈した。メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０　ｍＬ）で３回抽出し、有機層を１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５　ｍＬ）で２回、水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物１４－４（０．２０２　ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（４－（アミノメチル）フェノキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド塩酸塩（１４－５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000253
　（実施例１４）＜工程２＞で得られた化合物（１４－４、０．２　ｇ）を用い、（実施例６）＜工程２＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１４－５（０．１４７　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（４－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）メチル）フェノキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１４－６）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000254
　文献公知の方法（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、５０　ｍｇ）、（実施例１４）＜工程３＞で合成した化合物（１４－５、８１．９６　ｍｇ）及びエタノールの混合物に対し、氷冷攪拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１３７．２２　ｍｇ）及びトリエチルアミン（３８．２５　μＬ）を加え、室温で１時間３０分攪拌した。反応終了後、水（２　ｍＬ）を加え、懸濁液を攪拌し、メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（０．５　ｍＬ）を加えた。分離した水層をメチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５　ｍＬ）で２回抽出し、水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥した有機層をろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－へプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物１４－６（９９　ｍｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程５＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド（１４－７）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000255
　（実施例１４）＜工程４＞で得られた化合物（１４－６、９９　ｍｇ）及びメタノール（１４８５　μＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、炭酸カリウム（６４．１７　ｍｇ）及び水（４９５　μＬ）を加え、室温で１５時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧下で濃縮し、生じた水層を酢酸エチル（５　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５　ｍＬ）及び飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、標記化合物１４－７（６８　ｍｇ）の粗生成物を黄色油状物として得た。
＜工程６－１＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ａ－Ａ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000256
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４９．４４　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１５２．５４　ｍｇ）及び（実施例１４）＜工程５＞で得られた化合物（１４－７、３７．７９　ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１４ａ－Ａ２（４７９　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程６－２＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ｂ－Ｂ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000257
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（４０．０８　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１２３．６６　ｍｇ）及び（実施例１４）＜工程５＞で得られた化合物（１４－７、３０．６４　ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１４ｂ－Ｂ２（３５６　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１５）
２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000258
＜工程１＞
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル－Ｎ－［３－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド－２－カルバメート基（１５－２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000259
　市販の３－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１－プロパノン［CAS REGISTRY NO.：１２５５９４２－０６－３］（１５－１、５０　ｍｇ）、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシン［CAS REGISTRY NO.：２９０２２－１１－５］（５４　ｍｇ）をアセトニトリル（１．５　ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（７６　ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０　μＬ）を加え、室温で４．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５　ｍＬ）、水（５　ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、標記化合物１５－２（６３　ｍｇ）を薄いベージュアモルファスとして得た。
＜工程２＞２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド（１５－３）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000260
　（実施例１５）＜工程１＞で得られた化合物（１５－２、６３　ｍｇ）に、ピぺリジン（５６　μＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３１５　μＬ）溶液を加え、室温で３０分間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（１５　ｍＬ）、水（５　ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた固体に、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５　ｍＬ）を加え、トリチュレートした後、ろ取し、標記化合物１５－３（１０　ｍｇ）を薄いベージュ固体として得た。ろ液から回収し、追加で、標記化合物１５－３（１１　ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程３＞
２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000261
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９　ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１０６　ｍｇ）、（実施例１５）＜工程２＞で得られた化合物（１５－３、２１　ｍｇ）のエタノール（１．９　ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（４８　μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．１９　ｇ）、エタノール（３８　ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－Ａ２（１８８　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１６）
２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１６－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000262
＜工程１＞（２，２，２－トリフルオロアセチル）グリシン（１６－２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000263
　グリシン（１６－１、２　ｇ）をメタノール（１０　ｍＬ）に懸濁させ、４℃まで冷却した。同温にて、トリフルオロ酢酸エチル（３．５　ｍＬ）及びトリエチルアミン（３．７１　ｍＬ）を加え、室温で２３時間攪拌した。反応終了後、１規定－塩酸（２０　ｍＬ）をｐＨ２になるまで徐々に加え、酢酸エチル（１０　ｍＬ）で３回抽出し、水（５　ｍＬ）及び飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮し、淡黄色油状物を得た。得られた油状物を酢酸エチル（２０　ｍＬ）に溶解させ、ｎ－へプタン（１０　ｍＬ）を加えた。この溶液を減圧下で濃縮することで標記化合物１６－２（３．２２　ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程２＞
Ｎ－（２－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１６－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000264
　化合物１１－４（８０　ｍｇ）及び（実施例１６）＜工程１＞で得られた化合物（１６－２、８１．８３　ｍｇ）の混合物に対し、氷冷攪拌下、エタノール（１６００　μＬ）及び４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２３９．２１　ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。水（２　ｍＬ）を加え反応を停止させ、メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。この粗生成物をｎ-ヘプタン（１０　ｍＬ）でトリチュレートし、ろ過及び減圧下で乾燥させることで標記化合物１６－３（９５．１　ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセタミド（１６－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000265
　（実施例１６）＜工程２＞で得られた化合物（１６－３、６０　ｍｇ）、メタノール（９００　μＬ）、炭酸カリウム（５１．７８　ｍｇ）及び水（３００　μＬ）を用い、（実施例１４）＜工程５＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１６－４（１５　ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程４＞２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１６－Ａ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000266
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２９．６６　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２　ｍｇ）及び（実施例１６）＜工程３＞で得られた化合物（１６－４、１５　ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１６－Ａ２（２７９　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１７）
（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１７－Ａ２）の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000267
＜工程１＞（２，２，２－トリフルオロアセチル）－Ｌ－フェニルアラニン（１７－２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000268
　Ｌ－フェニルアラニン［CAS REGISTRY NO.：６３－９１－２］（１７－１、２　ｇ）をメタノール（１０　ｍＬ）に溶解させ、４℃まで冷却した。続いて、同温にて、トリフルオロ酢酸エチル（１．５９　ｍＬ）及びトリエチルアミン（１．６９　ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応終了後、１規定－塩酸（１０　ｍＬ）をｐＨ１になるまで徐々に加え、懸濁液を３０分攪拌した。懸濁液をろ過し、回収した固体を減圧下で乾燥させることで標記化合物１７－２（２．５３　ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞（２Ｓ）－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニル－２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパンアミド（１７－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000269
　化合物１１－４（６０　ｍｇ）及び（実施例１７）＜工程１＞で得られた化合物（１７－２、９３．７　ｍｇ）の混合物に対し、氷冷下、エタノール（１２００　μＬ）及び４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１７９．４１　ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。水（２　ｍＬ）を加え反応を停止させ、メチル　ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５　ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５　ｍＬ）、飽和食塩水（５　ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製することで、標記化合物１７－３（５７　ｍｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程３＞（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド（１７－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000270
　（実施例１７）＜工程２＞で得られた化合物（１７－３、５７　ｍｇ）、メタノール（８５５　μＬ）、炭酸カリウム（３８．３９　ｍｇ）及び水（２８５　μＬ）を用い、（実施例１４）＜工程５＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１７－４（３５　ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程４＞（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１７－Ａ２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000271
　１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４７．４６　ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４６．４４　ｍｇ）及び（実施例１７）＜工程３＞で得られた化合物（１７－４、３４．５３　ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１７－Ａ２（３８３　ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ｐ１～Ｐ７）
　下記に示される（実施例Ｐ１）～（実施例Ｐ７）のアルギン酸誘導体を前記実施例に示される方法に準じて、対応するアミノ化合物（製薬学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物であっても良い）とアルギン酸を用いて製造する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000272
アルギン酸誘導体の物性データ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000273
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000274
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000275
中間体化合物のNMRデータ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000276
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000277
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000278
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000279
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000280
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000281
中間体化合物のLC-Massデータ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000282
［実施例Ｆ１－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ１の製法
　図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ１を作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０６細胞／ｍＬ（１×１０７細胞／２５ｍファイバ１本）の細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を導入して射出することにより、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。流入速度は、マイクロ流体装置１０の導入口からのコア層の流入速度：０．０５ｍＬ／ｍｉｎ；マイクロ流体装置２の導入口からのシェル層の流入速度：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；マイクロ流体装置３の導入口からのＣａＣｌ２溶液の流入速度：５ｍＬ／ｍｉｎとした。
［実施例Ｆ１－２］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ２の製法
　実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ２を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（１×１０８細胞／２５ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ１－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ３の製法
　実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ３を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度２×１０８細胞／ｍＬ（４×１０８細胞／２５ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ１－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ４の製法
　実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ４を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／５０ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長５０ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１の製法
　図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１を作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度１×１０８細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）の細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液中に射出することにより、コア層直径約３００μｍ、外径約５５０μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。流入速度は、Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口１からのコア層の流入速度：０．０５ｍＬ／ｍｉｎ；Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口２からのシェル層の流入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。
［実施例Ｆ２－２］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ２の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ２を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約４００μｍ、外径約７５０μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約４００μｍ、外径約７００μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／７ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約２８０μｍ、外径約５８０μｍ、全長７ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－５］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む０．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３３０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－６］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．０％のメチルセルロース溶液（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３５０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－７］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３３０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－８］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－９］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／６ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約６５０μｍ、全長６ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１０］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０の製法
　実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２．５×１０７細胞／７ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約６００μｍ、全長７ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１１の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１１を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３４０μｍ、外径約７３０μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１２］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１２の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１２を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１３の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１３を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３３０μｍ、外径約７４０μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１４の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１４を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（１×１０７細胞／２ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３２０μｍ、外径約７６０μｍ、全長２ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１５］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１５の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１５を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（１×１０７細胞／２ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｄ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｄ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３４０μｍ、外径約７２０μｍ、全長２ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１６］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１６の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１６を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｃ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２ｂの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３６０μｍ、外径約７４０μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ３－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：
培地組成： G016 培地に下表の各種添加物を加え調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000283
　１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－３または実施例Ｆ２－４で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３またはＢ４を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を４週間実施した。２～３日に一回、培地１．８　ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０　ｍＬに保った。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測するともに培養液のトシリズマブ濃度を測定した。トシリズマブ濃度はヒトＩＬ－６　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｃａｔ＃２００－０６ＲＣ）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３のファイバ培養２８日後の生細胞数は４．８×１０７個、生存率は５９％であり、培養液のトシリズマブ濃度は０．３ｍｇ／ｍＬであった。また、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４ファイバの培養２９日後の生細胞数は１．７×１０７個、生存率は５１％、培養液のトシリズマブ濃度は０．３ｍｇ／ｍＬであった。化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３及びＢ４を用いた培養において、培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。図９は、実施例Ｆ２－３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３の培養後（２８日間）の顕微鏡写真であり、図１０は、実施例Ｆ２－４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４の培養後（２９日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－２］各種コア材料で構成した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：
　１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－５または実施例Ｆ２－６で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５またはＢ６を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を実施した。２～３日に一回、培地１．８　ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０　ｍＬに保った。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測した。実施例Ｆ２－５で作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の培養１４日後の生細胞数は１．６×１０７個、生存率は７０％であり、また、実施例Ｆ２－６で作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の培養１４日後の生細胞数は１．８×１０７個、生存率は５７％であった。図１１は、実施例Ｆ２－５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の培養後（１４日間）の顕微鏡写真であり、図１２は、実施例Ｆ２－６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の培養後（１４日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養温度シフト条件下の培養：
　１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－７で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を実施した。２～３日に一回、培地１．８　ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０　ｍＬに保った。一部の培養フラスコは、培養開始２日後、５日後または７日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測するともに培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。
　その結果を図５～図７に示す。図５に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７中の生細胞数を示す。図６に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７中の細胞生存率を示す。図７に産生された抗体濃度を示す。図１３は、実施例Ｆ２－７で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７の培養後（２８日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（培養系のファイバ量を変えた培養）：
　１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコにトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む実施例Ｆ２－９で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を１本、または実施例Ｆ２－１０で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を２本入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養容液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００）の添加、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。その結果を図８に示す。図８に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を１本、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を２本での抗体生産累積量を示す。図１４は、実施例Ｆ２－９で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９の培養後（３３日間）の顕微鏡写真であり、図１５は、実施例Ｆ２－１０で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０の培養後（３３日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－５］アルギン酸中空マイクロファイバ中でのトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（細胞周期抑制剤添加）：
　１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－８で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、３日後または５日後に吉草酸を終濃度１．５ｍＭまたは３ｍＭ　となるように添加した。この培養において、２～３日に一回、培地１．８　ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０　ｍＬに保った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定し、培養開始から７日後及び１４日後にファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数、細胞生存率を計測した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。図１６は、実施例Ｆ２－８で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８の培養後（１４日間）の顕微鏡写真である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000284
［実施例Ｆ３－６］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１１で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１１を１本を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）の添加、または新鮮培地の添加（１．８　ｍＬ）、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ以下であった。その結果を図１７に示す。図１８は、実施例Ｆ２－１１で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１１の培養後（４２日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－７］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１２で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１２を１本を入れ、上記表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）の添加、または新鮮培地の添加（１．８　ｍＬ）、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は２．５×１０４細胞／ｍＬ以下であった。その結果を図１９に示す。図２０は、実施例Ｆ２－１２で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１２の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－８］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（培地検討サンプリング時にDMEM HGで徐々に置換）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000285
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１３で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１３を１本を入れ、上記表３３の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、上記表＊＊の組成である培地の添加、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ以下であった。その結果を図２１に示す。図２２は、実施例Ｆ２－１３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１３の培養後（７７日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－９］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（長期培養の実施例）：
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１４で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１４を１本を入れ、上記実施例Ｆ３－１中の表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、２日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）の添加、または新鮮培地の添加（１．８　ｍＬ）、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。その結果を図２３に示す。図２４は、実施例Ｆ２－１４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１４の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－１０］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（長期培養の実施例）：
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１５で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１５を１本を入れ、上記実施例Ｆ３－１中の表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、２日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）の添加、または新鮮培地の添加（１．８　ｍＬ）、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。その結果を図２５に示す。図２６は、実施例Ｆ２－１５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１５の培養後（５６日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－１１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（長期培養の実施例）：
１２５　ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－１６で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１６を１本を入れ、上記実施例Ｆ３－１中の表３１の組成である培地（３０　ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５　ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ　Ｆｅｅｄ　００３）の添加、または新鮮培地の添加（１．８　ｍＬ）、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は３．５×１０５細胞／ｍＬ以下であった。その結果を図２７に示す。図２８は、実施例Ｆ２－１６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１６の培養後（６１日間）の顕微鏡写真である。
　ここでは、抗体産生細胞がコア層に含まれた抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（化学架橋アルギン酸中空マイクロファイバ）が提供される。また、当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法、及び当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の培養方法を提供することができる。
ａ：アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径
ｂ：アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さ
ｃ：アルギン酸ゲルファイバの外径
４：シェル層
５：コア層
６：抗体産生細胞
１０：マイクロ流体装置
１：抗体産生細胞６を含む基材の導入口
２：式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の導入口
３：塩化カルシウム溶液の導入口
２０：化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
４０：導入管
５０：出口
ＸＸ：Ｔ字型流体装置
１：抗体産生細胞６を含む基材の導入口
２：式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の導入口
３：出口
ＤＤ：塩化カルシウム溶液を含むビーカー等
ＣＦＢ：　化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
ＡＡ：導入管・ガラスキャピラリＡ
ＢＢ：導入管・ＥＴＦＥチューブ
ＣＣ：排出管・ガラスキャピラリＣ
ＺＺ：ガラスキャピラリＡの先端部（射出口）
Ｃａｐ１：シリコンキャツプ
Ｃａｐ２：シリコンキャツプ
Ｃａｐ３：シリコンキャツプ

Claims (23)

  1. 　抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて架橋反応を行うことにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ：
    ［式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
    　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）は、アルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－は、下記表：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
     に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わし；
    Ａｋｎは、下記表：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
     に記載された部分構造式［各式中、破線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体；
    ［式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
    　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）はアルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ２－は、下記表：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
     に記載された部分構造式［各式中、両端の破線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
  2. 　コア層に含まれる抗体産生細胞が、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、及びＵＡＣＣ－８１２細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  3. 　コア層に含まれる基材が、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材である、請求項１又は２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  4. 　シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  5. 　シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  6. 　シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基：Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２基（Ａｋｎ、及び－Ｌ１－は、請求項１の定義と同じである）の導入率が、約０．１％～約３０％の範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  7. 　シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基：Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２基（－Ｌ２－は、請求項１の定義と同じである）の導入率が、約０．１％～約３０％の範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  8. 　化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が３００μｍ～７５０μｍの範囲であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が１００μｍ～４００μｍの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
  9. 　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
    －Ｌ１－は、請求項１の定義と同じであり；
    －Ｌ２－は、請求項１の定義と同じであり；
    Ｘは、下記表：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
     に記載された部分構造式の群から選択される環状基である（各式中、両端の破線外側は含まない）］で表わされる基を介して化学架橋する、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  10. 　化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、請求項９の式（ＩＩＩ－Ｌ）［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、各定義は、請求項９の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋され、更に２価金属イオンを介してイオン架橋されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  11. 　抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
    （１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
    （２）導入口２から、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、前記式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の第２の層流を形成する工程、
    （３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
    （４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
    を含むことを特徴とする、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  12. 　抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、及び導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３を含む、Ｔ字型流体装置ＸＸを用い、
    （１）導入口２から、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
    （２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
    （３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
    （４）前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
    を含むことを特徴とする、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  13. 　コア層に含まれる抗体産生細胞が、請求項２に記載の細胞である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  14. 　コア層に含まれる基材が、請求項３に記載の基材である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  15. 　２価金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオンである、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  16. 　２価金属イオンを含む溶液が、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、及び塩化バリウム水溶液なる群から選択される水溶液である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  17. 　化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度が、４～３７℃の範囲である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  18. 　抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、培養を行うことによる、抗体の製造方法。
  19. 　コア層に含まれる抗体産生細胞が、請求項２に記載の細胞である、請求項１８に記載の抗体の製造方法。
  20. 　コア層に含まれる基材が、請求項３に記載の基材である、請求項１８に記載の抗体の製造方法。
  21. 　培養温度が、３０℃～３８℃の範囲である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
  22. 　培養温度が、培養開始時の温度が３７℃であり、コア層の細胞濃度が、１．０×１０８細胞／ｍＬ～１０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が３０℃である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
  23. 　細胞増殖抑制剤を添加する、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
     
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