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WO2020040307A1 - イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents

イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 Download PDF

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WO2020040307A1
WO2020040307A1 PCT/JP2019/033138 JP2019033138W WO2020040307A1 WO 2020040307 A1 WO2020040307 A1 WO 2020040307A1 JP 2019033138 W JP2019033138 W JP 2019033138W WO 2020040307 A1 WO2020040307 A1 WO 2020040307A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
seq
acid sequence
substitution
position corresponding
Prior art date
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PCT/JP2019/033138
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English (en)
French (fr)
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智亮 芳賀
敬 市居
俊介 小野木
中村　聡
俊成 本田
倫敬 上出
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JSR Micro NV
JSR Corp
JSR Micro Inc
Original Assignee
JSR Micro NV
JSR Corp
JSR Micro Inc
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Publication date
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Priority to EP19851068.7A priority patent/EP3842536A4/en
Priority to JP2020538498A priority patent/JP7335881B2/ja
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G or L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
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    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin binding protein, an affinity carrier using the same, and a method for isolating an antibody using the affinity carrier.
  • reagents and antibodies for pharmaceuticals are generally produced through purification by affinity chromatography.
  • affinity purification of the antibody a column on which a ligand that is a substance that specifically binds to immunoglobulin is immobilized, and an immunoglobulin binding protein such as protein A is generally used as the ligand.
  • Protein A is a cell wall protein derived from the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus. Protein A has five immunoglobulin binding domains called E, D, A, B, and C domains, each of which can independently bind to immunoglobulins. In addition to the natural immunoglobulin binding domains of protein A, modified immunoglobulin binding domains obtained by subjecting them to protein engineering modification have also been used as ligands for affinity purification.
  • the antibody affinity purification column is usually washed with an alkaline solution and used repeatedly.
  • the affinity purification column in which the natural domain is immobilized has a significantly reduced antibody binding property during repeated use.
  • modified protein A domains with improved alkali resistance have been developed.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A improves chemical stability by replacing Gly at position 29 of its amino acid sequence with Ala (Non-patent Document 1).
  • Patent Literature 1 discloses a technique for improving the alkali resistance of an immunoglobulin binding domain by substituting or deleting Asn in the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain with an amino acid other than Gln and Cys.
  • Patent Document 2 discloses a method for improving the alkali resistance of a C, B or Z domain of protein A by deleting three or more consecutive amino acids starting from position 1 or 2 from the N-terminus in the domain. Is disclosed.
  • the present invention provides an immunoglobulin-binding protein containing a mutant polypeptide chain derived from an immunoglobulin-binding domain and having improved alkali resistance, and an affinity carrier using the same.
  • the present invention also provides a method for isolating an antibody using the affinity carrier.
  • An immunoglobulin-binding protein comprising a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence having at least one mutation: (A) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 3, 6, and 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue Or insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (B) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 24 and 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or Insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (C) substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of
  • substitution or deletion, or insertion of another amino acid residue at a position before or after the position is an amino acid sequence in which the polypeptide chain has at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and has at least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f);
  • At least one mutation selected from the group consisting of the above (a) to (f) is at positions 3, 6, 11, 24, 25, 39, and 39 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to at least two of positions 46, 4, 49, 58 and 23 with another amino acid residue, or before or after the position;
  • the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [4], which comprises insertion of another amino acid residue at the position of (1).
  • the at least one kind of mutation is any one of the above (a 23 ) to (a 28 ), or any one of the above (a 1 ) to (a 28 ) and the above (b 1 )
  • [12] A transformant comprising the vector of [11].
  • An affinity carrier comprising a solid support and the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [9] bound to the solid support.
  • a chromatography column comprising the affinity carrier of [13].
  • [15] A method for isolating an antibody or a fragment thereof using the affinity carrier according to [13] or the chromatography column according to [14].
  • [16] including expressing the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [9] in the transformant according to [12] or a cell-free protein synthesis system, or chemically synthesizing the protein.
  • a method for producing an immunoglobulin binding protein A method for producing an immunoglobulin binding protein.
  • [17] a method for producing a mutant polypeptide chain, With respect to a polypeptide chain consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 57 to 62 or an amino acid sequence having at least 85% identity thereto and having an immunoglobulin binding activity,
  • a method comprising introducing at least one mutation selected from the group consisting of: (f): (A) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 3, 6, and 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue Or insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (B) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 24 and 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or Insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (C) substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 39 of
  • a method for producing an affinity carrier comprising immobilizing the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [9] on a solid support.
  • the mutant polypeptide chain of the present invention and the immunoglobulin-binding protein containing the same have immunoglobulin binding and improved alkali resistance. Therefore, the immunoglobulin binding protein of the present invention is useful as an affinity ligand.
  • the affinity carrier of the present invention on which the immunoglobulin-binding protein is immobilized can maintain its immunoglobulin-binding activity even after repeated washing (Cleaning-in-place, hereinafter also referred to as CIP) using an alkaline solution. it can.
  • the identity of the amino acid sequence or nucleotide sequence can be determined using the algorithm BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-5877) by Carlin and Arthur. Based on this BLAST algorithm, programs called BLASTN, BLASTX, BLASTP, TBLASTN, and TBLASTX have been developed (J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410). When these programs are used, default parameters of each program can be used. Specific methods of these analysis methods are known (see [www.ncbi.nlm.nih.gov]).
  • At least 85% identity with respect to amino acid sequences and nucleotide sequences refers to 85% or more identity, preferably 90% or more identity, more preferably 95% or more identity, and even more preferably. Refers to 97% or more identity, more preferably 98% or more identity, and even more preferably 99% or more identity.
  • At least 90% identity with respect to amino acid sequences and nucleotide sequences refers to 90% or more identities, preferably 95% or more identities, more preferably 97% or more identities, and even more preferably 98% or more. The above identity, more preferably 99% or more identity.
  • corresponding position on an amino acid sequence or nucleotide sequence refers to the conserved amino acid residue present in each amino acid sequence or nucleotide sequence between the target sequence and a reference sequence (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3). It can be determined by aligning the groups or nucleotides to give maximum homology. The alignment can be performed using a known algorithm, and the procedure is known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J. D. et. Al, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680) with default settings.
  • amino acid residues are also described by the following abbreviations: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or Cys).
  • amino acid sequence of the peptide is described according to a conventional method such that the amino terminus (hereinafter, referred to as N-terminus) is located on the left and the carboxyl terminus (hereinafter, referred to as C-terminus) is located on the right.
  • the terms "before” and “after” with respect to a specific position in the amino acid sequence refer to positions adjacent to the N-terminal side and the C-terminal side of the specific position, respectively.
  • the amino acid residue after insertion is placed at a position adjacent to the N-terminal side and the C-terminal side of the specific position. Is done.
  • immunoglobulin binding protein refers to a protein having an activity of binding to an antibody or a fragment thereof.
  • the “antibody” in the present specification may include, for example, immunoglobulins of any class such as IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, and subclasses thereof, fragments thereof, and variants thereof.
  • the “antibody” in the present specification may be a chimeric antibody such as a humanized antibody, an antibody complex, or another modified immunoglobulin containing an antigen recognition site.
  • the “antibody fragment” in the present specification may be an antibody fragment containing an antigen recognition site or an antibody fragment not containing an antigen recognition site. Antibody fragments that do not contain an antigen recognition site include, for example, proteins consisting only of the Fc region of immunoglobulins, Fc fusion proteins, and mutants and modifications thereof.
  • immunoglobulin-binding domain refers to a functional unit of a polypeptide contained in an immunoglobulin-binding protein and having an immunoglobulin (or antibody or antibody fragment) -binding activity alone.
  • Preferred examples of the “immunoglobulin binding domain” include an immunoglobulin binding domain of protein A, and a mutant thereof having immunoglobulin binding activity.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention contains at least one mutant polypeptide chain derived from an immunoglobulin-binding domain of Staphylococcus aureus protein A (hereinafter also referred to as SpA). .
  • the mutant polypeptide chain contained in the immunoglobulin-binding protein of the present invention is a polypeptide chain having immunoglobulin-binding activity, and is also referred to as “the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention” in the following specification.
  • the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention can be obtained by subjecting a parent domain, SpA-derived immunoglobulin-binding domain or a mutant thereof to a predetermined mutation.
  • the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention has immunoglobulin-binding activity, and has improved alkali resistance as compared with the parent domain.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention containing the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention can be used as a ligand for an affinity carrier.
  • Examples of the parent domain of the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention include an immunoglobulin binding domain of SpA, for example, an A domain, a B domain, a C domain, a D domain, an E domain, or a Z domain which is a modified domain of a B domain; And their variants.
  • the B domain, the Z domain, the C domain and its variants are preferred, and the C domain and its variants are more preferred.
  • the B, Z, C, D, A, and E domains of SpA, and variants thereof, can be used as parent domains for the mutant immunoglobulin binding domains of the invention.
  • the B domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the mutant of the B domain include a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an immunoglobulin binding activity.
  • the Z domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the Z domain variant includes a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having immunoglobulin binding activity.
  • the C domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the C domain variant includes a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having immunoglobulin binding activity.
  • the D domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Examples of the mutant of the D domain include a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having immunoglobulin binding activity.
  • the A domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • mutant of the A domain examples include a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and having immunoglobulin binding activity.
  • the E domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the E domain variant includes a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having immunoglobulin binding activity.
  • examples of preferred parent domains in the present invention include a polypeptide chain consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6, and at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence having an immunoglobulin-binding activity More preferred examples of the parent domain include a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • a polypeptide chain having immunoglobulin binding activity are examples of immunoglobulin binding activity.
  • Examples of more preferred parent domains include a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having immunoglobulin binding activity. Peptide chains.
  • the parent domain may include an Ala to Val substitution at a position corresponding to position 1 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the parent domain further comprises a substitution of Gly for Ala at a position corresponding to position 29 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. May be included (Non-Patent Document 1).
  • the parent domain has at least 2 residues (for example, 2 residues, 4 residues, 6 residues or Immunoglobulin binding domain mutant in which the amino acid residue corresponding to (7 residues) is deleted.
  • Examples of such parent domains include polypeptide chains consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 57-62, which lack the N-terminal 2-7 residues of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-6, respectively. Mutated immunoglobulin binding domain.
  • the amino acid sequence having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 for the parent domain described above is the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 57 to 62, or at least 85% May be amino acid sequences having the same identity. Furthermore, the amino acid sequence having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 contains Val at a position corresponding to position 1 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and / or Ala may be contained at a position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of No. 3.
  • the variant of the immunoglobulin binding domain of SpA is capable of modifying the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of SpA by inserting, deleting, substituting or deleting amino acid residues, or chemically modifying amino acid residues. It can be produced by applying.
  • means for inserting, deleting, substituting or deleting amino acid residues include known means such as site-specific mutation (Site-specific mutation) for a polynucleotide encoding the domain.
  • the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention has the following (a) to (f) relative to the parent domain described above: (A) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 3, 6, and 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue Or insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (B) substitution or deletion of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 24 and 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or Insertion of another amino acid residue at a position before or after the position; (C) substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or another amino acid residue at a position before or after the position Insertion of (D) substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • the mutation of (a) is performed by changing an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 3, 6, and 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to another amino acid residue Or the insertion of another amino acid residue at a position before or after that position.
  • the amino acid residue before the substitution is preferably Asn
  • the other amino acid residue substituted therewith is preferably an amino acid residue other than Ser.
  • Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr or Val and still more preferably Gln.
  • the mutation of (a) may be a single mutation of an amino acid residue at a position corresponding to position 3, 6, or 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but the positions 3, 6, and 11 May be a multiple mutation in which two or three of the amino acid residues at the position corresponding to are mutated.
  • the mutation of (a) may be a single substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 3, 6 or 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, It may be a multiple substitution in which two or three of the amino acid residues at the position corresponding to position 11 are substituted.
  • the mutation of (a) is (a 1 ) a substitution of Asn for Gln at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (a 2 ) a substitution at position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the mutation (b) is the substitution of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 24 and 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue or A deletion, or insertion of another amino acid residue at a position before or after that position.
  • the amino acid residue before the substitution is preferably Glu
  • the other amino acid residue substituted with these is preferably Asp.
  • the mutation of (b) may be a single mutation of an amino acid residue at a position corresponding to position 24 or 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but may be an amino acid at a position corresponding to position 24 or 25. It may be a double mutation in which both of the residues are mutated.
  • the mutation (b) may be a single substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 24 or 25 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but may be a position corresponding to position 24 or 25. May be a double substitution in which both amino acid residues are substituted.
  • mutations in the (b) is (b 1) substitution of Glu to Asp at a position corresponding to position 24 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (b 2) 25 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 At the position corresponding to Glu to Asp.
  • the mutation of (c) is a substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or a substitution at a position before or after the position Insertion of another amino acid residue.
  • the amino acid residue before substitution is preferably Ser
  • the other amino acid residue substituted with this is preferably Lys or Arg.
  • the mutation of (c) is (c 1 ) a substitution of Ser for Lys at a position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (c 2 ) a position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the mutation of (c) is (c 1 ) a substitution of Ser for Lys at a position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (c 2 ) a position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the mutation of (d) is a substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or a substitution at a position before or after the position. Insertion of another amino acid residue.
  • the amino acid residue before substitution is preferably Ala
  • the other amino acid residue substituted with this is preferably Asp, Glu, Lys or Arg, and Preferably, it is Asp, Glu or Arg.
  • mutations in the (d) are, (d 1) substitution of Ala at position corresponding to position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to Asp, in position 46 of the amino acid sequence of (d 2) SEQ ID NO: 3 Substitution of Ala for Glu at the corresponding position, (d 3 ) substitution of Ala for Lys at the position corresponding to position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (d 4 ) position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Ala to Arg substitution at the position corresponding to
  • the mutation of (e) is that the amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 4, 49 and 58 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is linked to another amino acid residue A substitution or deletion, or insertion of another amino acid residue at a position before or after the position.
  • the deleted amino acid residue at the position corresponding to the positions 4, 49 and 58 is preferably Lys.
  • the amino acid residue before the substitution is preferably Lys, and the other amino acid residue substituted with these is preferably Arg.
  • the mutation of (e) may be a single mutation of an amino acid residue at a position corresponding to position 4, 49 or 58 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, May be a multiple mutation in which two or three of the amino acid residues at the position corresponding to are mutated.
  • the mutation of (e) may be deletion or substitution of an amino acid residue alone at a position corresponding to position 4, 49 or 58 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, , 49 or 58 may be a multiple mutation in which two or three of the amino acid residues at positions corresponding to positions 49 or 58 are deleted or substituted.
  • the mutation of (e) is (e 1 ) a deletion of Lys at a position corresponding to position 4 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (e 2 ) corresponds to position 49 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Substitution of Lys for Arg at position, (e 3 ) deletion of Lys at position corresponding to position 58 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (e 4 ) position corresponding to position 58 of amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Is the substitution of Lys for Arg.
  • the mutation of (f) is a substitution or deletion of an amino acid residue at a position corresponding to position 23 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with another amino acid residue, or a substitution at a position before or after the position. Insertion of another amino acid residue.
  • the amino acid residue before the substitution is preferably Thr
  • the other amino acid residue substituted therewith is preferably Arg, Leu or Ser.
  • the mutation of (f) is (f 1 ) a substitution of Thr for Arg at a position corresponding to position 23 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (f 2 ) a substitution at position 23 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Substitution of Thr to Leu at the corresponding position or (f 3 ) substitution of Thr to Ser at the position corresponding to position 23 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention is selected from the group consisting of (a) to (f) with respect to a polypeptide chain consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6. It is produced by introducing at least one mutation.
  • the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention comprises an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, and has an immunoglobulin-binding activity. It is produced by introducing at least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) into a peptide chain.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention is selected from the group consisting of (a) to (f) with respect to a polypeptide chain consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3. It is produced by introducing at least one kind of mutation.
  • the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention comprises an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has immunoglobulin-binding activity. It is produced by introducing at least one kind of mutation selected from the group consisting of (a) to (f) into a polypeptide chain.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention comprises a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence having at least 85% identity thereto, and has an immunoglobulin binding activity. It is produced by introducing at least one kind of mutation selected from the group consisting of (a) to (f) into a polypeptide chain. Even if the introduced mutation is any one of (a) to (f), a combination of two or more (ie, positions 3, 6, 11 and 24 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) Position, 25, 39, 46, 4, 49, 58, and 23).
  • combinations of the two or more mutations the (a 23) ⁇ (a 28 ) and the like.
  • a combination of the two or more mutations a combination of any one of the above (a 1 ) to (a 28 ) and one or more of the above (b 1 ) to (f 3 ) And preferably a combination of any one of the above (a 1 ) to (a 22 ) with any one or more of the above (e 1 ) to (f 3 ), and more preferably the above (a 7) ) To (a 22 ) and a combination of any one or more of the above (e 2 ), (e 4 ), (f 1 ), (f 2 ) and (f 3 ).
  • a combination of the above (a 7 ) with any one or more of the above (e 2 ), (e 4 ), (f 1 ), (f 2 ) and (f 3 ) is mentioned, and more preferably, These include: The combination of (g 1) above and (a 7) (f 1) ; The combination of (g 2) above and (a 7) (f 2) ; (G 3) combination of the above (a 7) and (f 3); The combination of (g 4) above (a 7) and (e 2); The combination of (g 5) above and (a 7) (e 4) ; The combination of (g 6) above and (a 7) (f 1) and (e 2); The combination of and (g 8) above (a 7) and (f 3) (e 2) ; (g 7) above (a 7) a combination of (f 2) and (e 2).
  • At least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) includes any one of the mutations (a 1 ) to (g 8 ), It does not include other mutations among the mutations (a 1 ) to (g 8 ).
  • at least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) is only the single mutation of (e 2 ), (e 3 ) or (e 4 ), Or, it may not include the case of only the double mutation of (e 2 ) and (e 3 ) or (e 2 ) and (e 4 ).
  • a method for mutating a polynucleotide encoding the parent domain such that substitution, deletion, insertion, or the like of a desired amino acid residue occurs.
  • Specific techniques for introducing a mutation into a polynucleotide include site-directed mutagenesis, homologous recombination, and SOE (splicing by overlap extension) -PCR (Gene, 1989, 77: 61-68). These detailed procedures are well known to those skilled in the art.
  • the produced mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention has immunoglobulin-binding activity and functions as an immunoglobulin-binding domain.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention has improved alkali resistance compared to the domain before mutation (parent domain). Therefore, these mutant immunoglobulin binding domains of the present invention can be suitably used as affinity ligands.
  • mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention obtained by the above procedure include those having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 and from (a) to (f) above.
  • a polypeptide chain consisting of an amino acid sequence having at least one mutation selected from the group consisting of immunoglobulin-binding activity is exemplified.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention has at least 85% identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and is selected from the group consisting of the above (a) to (f).
  • a polypeptide chain having an immunoglobulin-binding activity are examples of the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention obtained by the above procedure.
  • mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention include at least one selected from the group consisting of (a) to (f) having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. And a polypeptide chain having an immunoglobulin-binding activity.
  • the at least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) is preferably the above-mentioned (a 1 ), (a 2 ), (a 3 ), (a 4 ), (a 5 ) , (A 6 ), (a 7 ), (a 8 ), (a 9 ), (a 10 ), (a 11 ), (a 12 ), (a 13 ), (a 14 ), (a 15 ) , (A 16 ), (a 17 ), (a 18 ), (a 19 ), (a 20 ), (a 21 ), (a 22 ), (b 1 ), (b 2 ), (c 1 ) , (C 2 ), (d 1 ), (d 2 ), (d 3 ), (d 4 ), (e 1 ), (e 2 ), (e 3 ), (e 4 ), (f 1 ) , (F 2 ) and (f 3 ), more preferably at least one selected from the group consisting of (a 1 ), (a 2 ), (a 3 ), (a 4
  • At least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) includes any one of the mutations (a 1 ) to (g 8 ), It does not include other mutations among the mutations (a 1 ) to (g 8 ).
  • at least one mutation selected from the group consisting of (a) to (f) is only the single mutation of (e 2 ), (e 3 ) or (e 4 ), Or, it may not include the case of only the double mutation of (e 2 ) and (e 3 ) or (e 2 ) and (e 4 ).
  • mutant immunoglobulin binding domain of the present invention include at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6, and (A 1 ) to (F 3 ): (A 1 ) Gln at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 2 ) Ala at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 3 ) Asp at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 4 ) Gln at a position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 5) Ala at position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 6 ) Asp at a position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 7) Gln at position corresponding to position 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • the amino acid sequence having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 is preferably an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 3 And more preferably an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Examples of the combination of two or more amino acid residues include the following (A 23 ) to (A 28 ): (A 23) 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, Gln at position corresponding to position 6 and 11 position; (A 24 ) Ala at a position corresponding to position 3, Asp at a position corresponding to position 6, and Gln at a position corresponding to position 11 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 25 ) Asp at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and Gln at a position corresponding to position 11; (A 26) Gln at Asp, and position 11 corresponds to position in the position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 27) Gln at position corresponding to Asp, and 11 of the position corresponding to Asp, 6-position at the position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 28 ) Ala at a position corresponding
  • Another example of the combination of the two or more amino acid residues is a combination of any one of the above (A 1 ) to (A 28 ) and any one or more of the above (B 1 ) to (F 3 )
  • Combinations are preferred, preferably combinations of any one of the above (A 1 ) to (A 22 ) with one or more of the above (E 1 ) to (F 3 ), and more preferably the above ( A combination of any one of A 7 ) to (A 22 ) with one or more of the above (E 2 ), (E 4 ), (F 1 ), (F 2 ) and (F 3 ) may be mentioned.
  • a combination of the above (A 7 ) with any one or more of the above (E 2 ), (E 4 ), (F 1 ), (F 2 ) and (F 3 ) is more preferable.
  • mutant immunoglobulin binding domain of the present invention include those having at least 85% identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 6, and (A 1 ) Gln at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 2 ) Ala at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 3 ) Asp at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 4 ) Gln at a position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 5) Ala at position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 6 ) Asp at a position corresponding to position 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 7) Gln at position corresponding to position 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (A 8 ) Ala at a
  • mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention the (A 1) ⁇ including amino acid residues or any one of its deletion (G 8), the (A 1) ⁇ It does not include other amino acid residues or deletions among the amino acid residues or deletions of (G 8 ).
  • at least one amino acid residue selected from the group consisting of (A 1 ) to (F 3 ) of the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention or a deletion thereof is (E 2 ) K49R, It may not contain a single mutation of (E 3 ) ⁇ K58 or (E 4 ) K58R, or a double mutation of K49R ⁇ K58 or K49RK58R.
  • an amino acid sequence having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 is at least 85% identical to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 57 to 62. May be amino acid sequences having the same identity. Further, in the mutant immunoglobulin binding domain of the present invention, the amino acid sequence having at least 85% identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 is at least the same as any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 57 to 59. It may be an amino acid sequence having 85% identity.
  • mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention comprising an amino acid sequence having at least 85% identity to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 57 to 62 is the same as the above-mentioned mutations (a) to (f).
  • the amino acid sequence may not include a mutation of an amino acid residue at a position corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence of No. 3.
  • the mutant immunoglobulin binding domain of the invention comprises Val at the position corresponding to position 1 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and / or Ala at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. including.
  • mutant immunoglobulin binding domain of the present invention include a polypeptide chain comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 7 to 53.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention may contain at least one of the above-described mutant immunoglobulin-binding domains of the present invention.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises two or more, more preferably three or more, still more preferably four or more, still more preferably five or more, even more preferably six or more mutant immunoglobulin binding domains of the present invention. Contains more than one.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention preferably contains 12 or less, more preferably 8 or less, and still more preferably 7 or less, the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention preferably contains 2 to 12, more preferably 3 to 8, and even more preferably 4 to 7 mutant immunoglobulin-binding domains of the present invention.
  • those mutant immunoglobulin-binding domains may be of the same type or of different types. Good, but preferably of the same type.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention may contain another immunoglobulin-binding domain other than the above-described mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention.
  • other domains include naturally occurring SpA immunoglobulin binding domains (eg, B, Z, C, or D domains of SpA), or variants thereof other than the mutant immunoglobulin binding domains of the present invention. No.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention include polypeptides in which two or more amino acid sequences of the mutant immunoglobulin-binding domain of the present invention are linearly linked.
  • the number of the mutant immunoglobulin binding domains contained in the immunoglobulin binding protein of the present invention is preferably 2 to 12, more preferably 3 to 8, and still more preferably 4 to 7.
  • More preferred examples of the immunoglobulin binding protein of the present invention include polypeptides each consisting of an amino acid sequence in which two or more amino acid sequences selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 7 to 53 are linearly linked.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention include 2 to 12, more preferably 3 to 8, and still more preferably 4 to 7 amino acids, each selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 7 to 53.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the sequences are linearly linked is exemplified.
  • a more preferred example is a poly-amino acid sequence comprising 2 to 12, more preferably 3 to 8, and still more preferably 4 to 7 amino acid sequences of any of SEQ ID NOs: 7 to 53.
  • Peptides are not limited to these.
  • linearly linked in the amino acid sequence means a structure in which two or more amino acid sequences are connected in series via a linker or without a linker.
  • linearly linked means a structure in which the C-terminal of one amino acid sequence and the N-terminal of another amino acid sequence are connected in series via a linker
  • linearly linked means a structure in which the C-terminal of one amino acid sequence and the N-terminal of another amino acid sequence are connected in series by a peptide bond.
  • the N of the immunoglobulin-binding domain contained in the immunoglobulin-binding protein of the present invention is An arbitrary amino acid residue or peptide may be added or inserted at any one or more of the terminal, C-terminal, and between the domains.
  • Preferred examples of the added or inserted amino acid residue or peptide include Cys, Lys, Pro, (Pro) m, (Ala-Pro) n, and (Glu-Ala-Ala-Ala-Lys) p (m Is an integer of 2 to 300, preferably 12 to 24, n is an integer of 4 or more, preferably 4 to 10 and p is an integer of 2 or more, preferably 2 to 6) No.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be produced by a method known in the art, for example, a chemical synthesis method based on an amino acid sequence, a recombinant method, or the like.
  • the immunoglobulin binding proteins of the present invention can be obtained from Frederick M. et al.
  • Known methods such as the methods described in Ausbel et al., Current Protocols In Molecular Biology, and Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) by Sambrook et al.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding the immunoglobulin binding protein of the present invention into a host such as Escherichia coli, and culturing the obtained recombinant in an appropriate liquid medium, the cells after culturing
  • the target protein can be obtained in a large amount and economically.
  • any known vector capable of replicating in a host cell can be used.
  • the host for transformation is not particularly limited, and a known host used for expressing a recombinant protein such as bacteria such as Escherichia coli, fungi, insect cells, and mammalian cells can be used.
  • a known host used for expressing a recombinant protein such as bacteria such as Escherichia coli, fungi, insect cells, and mammalian cells
  • any method known in the art may be used depending on each host.
  • Methods for culturing the obtained transformant (preferably cells such as bacteria) and recovering the expressed protein are well known to those skilled in the art.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may be expressed using a cell-free protein synthesis system.
  • the present invention also provides a polynucleotide (DNA or the like) encoding the immunoglobulin-binding protein of the present invention, a vector containing the same, and a transformant containing them.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be used as an affinity ligand.
  • an affinity carrier using the immunoglobulin-binding protein of the present invention as a ligand can be produced.
  • the affinity carrier is a carrier having the immunoglobulin binding protein of the present invention as a ligand, and has an immunoglobulin binding activity. Further, the affinity carrier has improved alkali resistance as compared with a carrier using wild-type protein A or a domain thereof as a ligand.
  • the shape of the solid phase carrier contained in the affinity carrier of the present invention may be any form such as particles, membranes, plates, tubes, needles, fibers and the like.
  • the carrier may be porous or non-porous. These carriers can be used as packed beds or can be used in suspended form. Suspended forms include those known as expanded @ bed and pure suspensions, in which the particles are free to move. For monoliths, packed beds and fluidized beds, the separation procedure generally follows conventional chromatographic methods with concentration gradients. For pure suspensions, the batch method is used.
  • the carrier is a filler.
  • the carrier may be in the form of a chip, capillary or filter.
  • the particle size is preferably 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the particle size is preferably 20 ⁇ m or more, more preferably 30 ⁇ m or more, and preferably 100 ⁇ m or less, more preferably 80 ⁇ m or less, for example, preferably 20 to 100 ⁇ m, more preferably 30 to 80 ⁇ m. is there.
  • the particle size is preferably 50 ⁇ m or more, more preferably 60 ⁇ m or more, and preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 150 ⁇ m or less, for example, preferably 50 to 200 ⁇ m, more preferably 60 to 150 ⁇ m. . If the particle size is less than 20 ⁇ m, the column pressure will be high under a high flow rate, which is not practical. If the particle size exceeds 200 ⁇ m, the amount (binding capacity) of the immunoglobulin bound to the affinity carrier may be poor.
  • the term "particle size” means a volume average particle size measured by a laser diffraction method according to ISO 13320 and JIS Z 8882-1.
  • the particle size distribution was measured by a laser scattering diffraction particle size distribution analyzer (for example, LS # 13 320 (Beckman Coulter Co., Ltd., etc.), and Fluid RI Real 1.333, Sample RI I.
  • the average particle diameter determined by measuring a volume-based particle size distribution using Real ⁇ 1.54 ⁇ Imaginary 0 or the like as an optical model.
  • the solid support is porous, preferably at least 50 m 2 / g, more preferably at least 80 m 2 / g, and preferably at most 150 m 2 / g, more preferably at most 130 m 2 / g.
  • it preferably has a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, more preferably 80 to 130 m 2 / g.
  • the specific surface area is less than 50 m 2 / g, sometimes coupling capacitance poor, while when it exceeds 150 meters 2 / g, and the carrier is destroyed at a high flow rate under to the strength of the carrier is poor, Column pressure may increase.
  • the “specific surface area” in the present specification is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter by the dry weight of particles.
  • the solid support preferably has a volume average pore diameter of 100 nm or more and 1500 nm or less.
  • the volume average pore diameter is preferably 100 nm or more, more preferably 200 nm or more, and preferably 400 nm or less, more preferably 300 nm or less, for example, preferably 100 to 400 nm, more preferably It is 200 to 300 nm.
  • the volume average pore diameter is preferably 500 nm or more, more preferably 800 nm or more, and preferably 1500 nm or less, more preferably 1400 nm or less, for example, preferably 500 to 1500 nm, more preferably 800 nm or less. ⁇ 1400 nm.
  • the volume average pore diameter is less than 100 nm, the binding capacity at a high flow rate may decrease significantly, while if it exceeds 1500 nm, the binding capacity may decrease regardless of the flow rate.
  • the “volume average pore size” in the present specification is a volume average pore size of pores having a pore size of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter.
  • the solid phase carrier satisfies the particle size, specific surface area, and pore size distribution in the above ranges, the gap between the particles serving as a flow path of the solution to be purified and the relatively large pore size in the particles, the binding of the molecule to be purified.
  • the surface area balance is optimized and the binding capacity under high flow rates is maintained at a high level.
  • the material of the solid support is, for example, a polymer having a hydrophilic surface.
  • a polymer having a hydrophilic surface For example, a hydroxy group (—OH), a carboxy group (—COOH), a polymer having an aminocarbonyl group (—CONH 2 or N-substituted), an amino group (—NH 2 or substituted), or an oligo or polyethyleneoxy group.
  • the polymer may be a synthetic polymer such as a polymethacrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, or the like, preferably a copolymer crosslinked with a polyfunctional monomer such as a polyfunctional (meth) acrylate or divinylbenzene. It is a synthetic polymer such as a polymer.
  • Such synthetic polymers are readily produced by known methods (see, for example, the method described in J. MATER. CHEM 1991, 1 (3): 371-374). Alternatively, a commercially available product such as Toyopearl (Tosoh Corporation) is also used.
  • the polymer is a polysaccharide such as dextran, starch, cellulose, pullulan, agarose, and the like. Such polysaccharides are easily produced by known methods (see, for example, the method described in Japanese Patent No. 4081143).
  • a commercially available product such as Sepharose (GE Healthcare Bioscience) is used.
  • it may be an inorganic carrier such as silica or zirconium oxide.
  • porous particles used as the solid support include, for example, 20 to 50% by mass of a crosslinkable vinyl monomer and 3 to 80% by mass of an epoxy group-containing vinyl monomer. Containing 20 to 80% by mass of a copolymer with a diol group-containing vinyl monomer, having a particle size of 20 to 80 ⁇ m, a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, and a volume average pore diameter of Porous organic polymer particles having a diameter of 100 to 400 nm are exemplified.
  • the penetration volume (pore volume) of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm when the solid phase carrier is measured by a mercury porosimeter is preferably 1.3 mL / g or more and 7.0 mL / g or less.
  • the pore volume is preferably 1.3 mL / g or more, and preferably 7.0 mL / g or less, more preferably 5.0 mL / g or less, and still more preferably 2.5 mL / g or less.
  • the pore volume is preferably 3.0 to 6.0 mL / g.
  • the ligand (that is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention) can be bound to the solid phase carrier by a general method for immobilizing the protein on the carrier.
  • a general method for immobilizing the protein on the carrier For example, a method using a carrier having a carboxy group and activating the carboxy group with N-hydroxysuccinimide to react with the amino group of the ligand; dehydration of a water-soluble carbodiimide or the like using a carrier having an amino group or a carboxy group A method of reacting with a carboxy group or an amino group of a ligand in the presence of a condensing agent to form an amide bond; a method of using a carrier having a hydroxyl group and activating with a cyanogen halide such as cyanogen bromide to react with an amino group of the ligand.
  • a method in which a hydroxyl group of a carrier is tosylated or tresylated and reacted with an amino group of a ligand a method of introducing an epoxy group into a carrier with bisepoxide, epichlorohydrin or the like, and reacting with an amino group, a hydroxyl group or a thiol group of the ligand; Using a carrier having an epoxy group, the amino group, hydroxyl group or thiol A method of reacting a group, and the like.
  • a method in which a ligand is bound via an epoxy group is desirable.
  • Hydroxyl groups which are ring-opening epoxy groups generated by ring-opening of epoxy groups, hydrophilize the carrier surface, prevent non-specific adsorption of proteins and the like, improve the toughness of the carrier in water, and improve the carrier at high flow rates. Plays a role in preventing destruction. Therefore, when there is a residual epoxy group not bound to the ligand in the carrier after immobilizing the ligand, it is preferable to open the ring of the residual epoxy group.
  • the method for opening the epoxy group in the carrier include a method of heating or stirring the carrier at room temperature with an acid or alkali in a water solvent.
  • the epoxy group may be opened with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • a more preferred ring-opened epoxy group is a ring-opened epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in a carrier with thioglycerol.
  • Thioglycerol is less toxic than mercaptoethanol or the like as a raw material, and the epoxy ring-opening group to which thioglycerol is added has lower nonspecific adsorption than a ring-opening group with a blocking agent having an amino group, and also has a dynamic bond. This has the advantage that the amount is high.
  • a molecule (spacer) of any length may be introduced between the solid support and the ligand.
  • the spacer include a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, and a saccharide.
  • the affinity carrier of the present invention has a ligand with improved alkali resistance, for example, washing under alkaline conditions for repeated use of the carrier in affinity purification (for example, 0.01 to 1.0 M hydroxylation) There is no remarkable decrease in performance with respect to washing using an alkaline solution such as sodium.
  • the method for isolating an antibody or a fragment thereof is preferably a step in which a sample containing an antibody is passed through an affinity carrier on which the immunoglobulin-binding protein of the present invention is immobilized, and the antibody is adsorbed to the carrier. (A first step) and a step of eluting the antibody from the carrier (a second step). Preferably, after the second step, a step of washing the carrier with an alkaline liquid (a third step) Step).
  • a sample containing an antibody is allowed to flow in a column or the like packed with the affinity carrier of the present invention under conditions where the antibody is adsorbed to the ligand (the immunoglobulin-binding protein of the present invention).
  • the carrier may be washed with a neutral buffer containing a salt such as NaCl to remove a part of the substance weakly retained by the ligand.
  • an appropriate buffer solution of pH 2 to 5 is flowed to elute the antibody adsorbed on the ligand.
  • the antibody can be isolated from the sample by collecting the eluate.
  • the antibody contained in the eluate obtained in the second step may be further purified.
  • Antibody purification for example, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, mixed mode chromatography, hydrophilic interaction chromatography, hydrophobic interaction chromatography, size exclusion chromatography and the like alone or in combination as appropriate
  • the antibody can be purified by subjecting the eluate obtained in the second step to cation exchange chromatography followed by anion exchange chromatography.
  • Cation exchange chromatography can be performed using SP-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Bioscience), BioPro IEX S (manufactured by YMC), BioPro IEX SmartSep S (manufactured by YMC), or the like.
  • Anion exchange chromatography can be performed using Q-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Bioscience), BioPro IEX Q (manufactured by YMC), BioPro IEX SmartSep Q (manufactured by YMC), or the like.
  • the third step is performed following the second step.
  • the affinity carrier is washed with an alkaline solution (CIP washing).
  • alkaline solution used in the third step include an aqueous solution of sodium hydroxide, an aqueous solution of potassium hydroxide, triethylamine, and tetrabutylammonium hydroxide.
  • the lower limit of the molar concentration of the alkali salt in the alkaline solution used in the third step is at least 0.001 M, preferably at least 0.01 M, more preferably at least 0.1 M, and the upper limit is However, it is 6.0M or less, preferably 4.0M or less, more preferably 2.0M or less.
  • the pH of the alkaline solution to be used the lower limit is pH 11.0 or higher, preferably pH 12.0 or higher, more preferably pH 12.5 or higher, and the upper limit is pH 16.0 or lower, preferably pH 15. It is 5 or less, more preferably pH 15.0 or less.
  • the affinity carrier of the present invention stably retains the antibody binding activity even after the washing in the third step due to the improvement of the alkali resistance of the protein ligand, and thus can be repeatedly used for antibody isolation.
  • the isolated antibody is used as an antibody drug. Therefore, in one embodiment, the present invention provides a method for producing an antibody drug using the affinity carrier of the present invention.
  • the procedure of the method is basically the same as the procedure of the above-described antibody isolation method except that a sample containing the desired antibody drug is used.
  • Reference Example 1 Synthesis of porous particles (1) 3.58 g of polyvinyl alcohol (PVA-217 manufactured by Kuraray Co., Ltd.) was added to 360 g of pure water, the polyvinyl alcohol was dissolved by heating and stirring, and after cooling, sodium dodecyl sulfate was added. An aqueous solution S was prepared by adding 0.36 g (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.36 g of sodium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and 0.18 g of sodium nitrite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), followed by stirring. .
  • PVA-217 manufactured by Kuraray Co., Ltd.
  • the whole amount of the monomer solution obtained in (2) was charged into a separable flask, and heated in a hot water bath. When the internal temperature reached 85 ° C., 0.53 g of 2,2′-azoisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. (4) The reaction solution obtained in (3) was stirred for 3 hours while maintaining the temperature at 86 ° C. Next, the reaction solution was cooled, filtered, and washed with pure water and ethanol. The washed particles were dispersed in pure water and decanted three times to remove small particles. Next, the particles were dispersed in pure water such that the concentration of the particles became 10% by mass, to obtain a porous particle (PB) dispersion.
  • PB porous particle
  • PrAt-0 is an immunoglobulin-binding protein containing a homotetramer in which an A1V / G29A mutant (alkaline tolerance-improved mutant; non-patent document 1) of the C domain of protein A (SEQ ID NO: 3) is connected in series by peptide bonds. is there.
  • PrAt-1 to 32 are mutants in which the mutations shown in Table 1 have been introduced into each of the immunoglobulin binding domains of PrAt-0.
  • PrAt-0 to 32 were performed as follows, respectively. Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by New England Biolabs) was transformed with a plasmid encoding PrAt-0 to 32, and the resulting transformant was cultured at 37 ° C. in an enriched medium until the exponential growth phase. Thereafter, the target protein was expressed by adding 1 mM isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the medium and further culturing at 37 ° C. for 4 hours.
  • the culture solution was centrifuged to remove the supernatant, and lysozyme derived from egg white (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) were added to the obtained cells.
  • the cells were disrupted by the addition of 30 mM Tris buffer containing pH 9.5.
  • recombinant immunoassay was performed by cation exchange chromatography (SP-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience) and anion exchange chromatography (Q-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • SP-Sepharose FF cation exchange chromatography
  • Q-Sepharose FF anion exchange chromatography
  • the globulin binding protein was purified.
  • the purified immunoglobulin binding protein was dialyzed against 10 mM citrate buffer pH 6.0.
  • PrAp-0 is an immunoglobulin binding protein containing a homopentamer in which A1V / G29A mutants of the C domain of protein A (SEQ ID NO: 3) are connected in series by peptide bonds
  • PrAp-21 is a C domain of protein A
  • An A1V / G29A mutant of SEQ ID NO: 3 is an immunoglobulin binding protein in which cysteine (C) is linked to the C-terminus of a homopentamer linked in series by peptide bonds.
  • PrAp-1 to 20 are mutants in which the mutations shown in Table 2 have been introduced into each of the immunoglobulin binding domains of PrAp-0, and PrAp-22 to 41 are those which have each of the immunoglobulin binding domains of PrAp-21. In this case, the mutant shown in Table 3 is introduced.
  • PrAp-0 to 41 were performed in the same manner as PrAt-0 to 32.
  • the purity of the recombinant immunoglobulin binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or more.
  • PrAh-0 is an immunoglobulin-binding protein containing homohexamers in which A1V / G29A mutants of the C domain of protein A (SEQ ID NO: 3) are connected in series by peptide bonds, and PrAh-21 is a C domain of protein A (
  • An A1V / G29A mutant of SEQ ID NO: 3 is an immunoglobulin binding protein in which cysteine (C) is linked to the C-terminal of a homohexamer linked in series by peptide bonds.
  • PrAh-1 to 20 are mutants obtained by introducing the mutations shown in Table 4 into each of the immunoglobulin-binding domains of PrAh-0, and PrAh-22 to 41 are each a mutant of each of the immunoglobulin-binding domains of PrAh-21. In this case, the mutant shown in Table 5 is introduced.
  • PrAh-0 to 41 were performed in the same manner as for PrAt-0 to 32.
  • the purity of the recombinant immunoglobulin binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or more.
  • Example 4 Preparation of Ligand-Immobilized Particles 1.16 mg of PrAt-0 prepared in Example 1 was dissolved in 8 mg of the porous particles (PB) obtained in Reference Example 1 and contained 0,1 M sodium sulfate. 450 ⁇ L of 1 M carbonate buffer (pH 8.8) was added and the mixture was shaken at 25 ° C. for 5 hours to bind PrAt-0 to PB. After blocking the epoxy groups remaining on the particles with thioglycerol, the particles were washed with 0.5 M NaOH and 0.1 M citrate buffer (pH 3.2), and the ligand-immobilized particles (PrAt-0 / PB ) Got.
  • PB porous particles
  • 450 ⁇ L of 1 M carbonate buffer (pH 8.8) was added and the mixture was shaken at 25 ° C. for 5 hours to bind PrAt-0 to PB. After blocking the epoxy groups remaining on the particles with thioglycerol, the particles were washed with 0.5
  • Ligand-immobilized particles (PrAt-1 / PB to PrAt-32 / PB) to which any of PrAt-1 to 32 was bound were obtained in the same procedure. Further, ligand-immobilized particles (PrAp-0 / PB to PrAp-41 / PB) to which any of PrAp-0 to 41 were bound were obtained in the same procedure. Furthermore, ligand-immobilized particles (PrAh-0 / PB to PrAh-41 / PB) to which any of PrAh-0 to 41 were bound were obtained in the same procedure.
  • PrAs-0 to 22 Immunoglobulin binding proteins PrAs-0 to 22 were obtained.
  • PrAs-0 is an immunoglobulin binding protein in which a histidine tag (HHHHHH sequence) is linked six times to the N-terminal of the A1V / G29A mutant of the C domain of protein A (SEQ ID NO: 3).
  • PrAs-1 to 22 are mutants obtained by introducing the mutations shown in Table 6 into each immunoglobulin binding domain of PrAs-0.
  • PrAs-0 to 22 were performed in the same manner as PrAt-0 to 32 except that the recombinant immunoglobulin-binding protein was purified by affinity chromatography (HisTrap FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience). The purity of the recombinant immunoglobulin binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or more.
  • Test example 1 The relative alkali resistance of the ligand-immobilized particles PrAt-1 / PB to PrAt-29 / PB containing the mutant domain prepared in Example 4 to the ligand-immobilized particles PrAt-0 containing the parent domain was evaluated.
  • PrAt-1 to 29 After 2 mg of ligand-immobilized particles (PrAt-0 / PB) were equilibrated with 1.0 M NaOH, they were incubated for 24 hours. Then, after equilibrating the particles with 20 mM phosphate buffer (pH 7.5), 400 ⁇ L of 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 2.0 mg of IgG was added, and the mixture was incubated for 30 minutes. Next, after washing with 400 ⁇ L of 20 mM phosphate buffer (pH 7.5), 400 ⁇ L of 50 mM sodium citrate buffer (pH 2.5) was added, and an eluate containing IgG was collected.
  • the amount of IgG in the eluate was calculated by absorbance measurement, and the SBC of PrAt-0 / PB exposed to alkali was determined from the amount of eluted IgG and the volume of the carrier. By the same procedure, the SBC of PrAt-1 to 29 / PB exposed to the alkali was determined.
  • SBC maintenance ratio the relative value of the SBC after alkali exposure to SBC
  • PrAt-1 to 29 were calculated according to the following equation.
  • PrAh-39 to 41 The ligand-immobilized particles (PrAh-21 / PB and PrAh-39-41 / PB) were equilibrated with 0.5 M NaOH instead of 1.0 M NaOH in the same procedure as (2), Incubated for hours. Thereafter, in the same manner as in (2), PrAh-21 exposed to the alkali and SBC of 39 to 41 / PB were determined, and the relative alkali resistance (%) of PrAh-39 to 41 to PrAh-21 was calculated. .
  • Tables 7 to 9 show the measurement results of the SBC measured in (1) and the relative alkali resistance measured in (2) to (4).
  • the SBC of PrAt-1 to 29 / PB showed no significant difference compared to PrAt-0 / PB.
  • the relative alkali resistance of PrAt-1 to 29 / PB was improved by 14 to 64% as compared with PrAt-0 / PB.
  • PrAh-22 to 38 / PB showed no significant difference in SBC compared to PrAh-21 / PB, while the relative alkali resistance was improved by 28 to 69% compared to PrAh-21 / PB.
  • Test example 2 With respect to the immunoglobulin-binding proteins PrAs-1 to PrAs-19 containing the mutant domain prepared in Example 5, the relative alkali resistance to the immunoglobulin-binding protein PrAs-0 containing the parent domain was evaluated.
  • sample solution 0.13 mg of immunoglobulin binding proteins (PrAs-0 and PrAs-1 to 19) were incubated in a 1.0 M aqueous sodium hydroxide solution. Immediately after the start of the incubation or 24 hours after the start of the incubation, the solution was neutralized with 1.0 M citric acid. Next, the neutralized solution was subjected to protein concentration using a D-PBS buffer containing 0.1% bovine serum-derived albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 0.02% Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). After dilution to 10 ⁇ g / mL, a sample solution was prepared.
  • D-PBS buffer containing 0.1% bovine serum-derived albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 0.02% Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). After dilution to 10 ⁇ g / mL, a sample solution was
  • Table 10 shows the measurement results of the relative alkali resistance. While the relative alkali resistance of PrAs-17 to 19 was reduced as compared with PrAs-0, the relative alkali resistance of PrAs-1 to 16 was improved by 60 to 338% as compared with PrAs-0. From these results, the immunoglobulin-binding proteins PrAs-1 to 16 containing the mutated domain have higher alkali tolerance than before the mutagenesis, and were subjected to relatively harsh conditions of exposure to 1.0 M sodium hydroxide for 24 hours. After that, it was shown that the antibody binding activity can be maintained.
  • Test example 3 The alkali tolerance of the immunoglobulin-binding proteins (PrAs-0 and PrAs-20 to 22) prepared in Example 5 was calculated in the same procedure as in Test Example 2 except that the proteins were incubated in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution. did. Table 11 shows the measurement results of the relative alkali resistance. The relative alkali resistance of PrAs-20 to 22 was improved by 21 to 31% as compared with PrAs-0, indicating that the alkali resistance was higher than that before mutation introduction.

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Abstract

アルカリ耐性の向上したアフィニティー担体の提供。変異ポリペプチド鎖を含むイムノグロブリン結合タンパク質、及び当該イムノグロブリン結合タンパク質を結合した固相担体を含むアフィニティー担体。該変異ポリペプチド鎖は、配列番号１～６及び５７～６２のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ所与の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有する。

Description

イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
　本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質、それを用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いた抗体の単離方法に関する。
　抗体は近年、研究用試薬、抗体医薬などに広く利用されている。これら試薬や医薬用の抗体は、一般に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を経て製造される。抗体のアフィニティー精製には、イムノグロブリンと特異的に結合する物質であるリガンドを固定化したカラムが用いられ、該リガンドには、一般に、プロテインＡなどのイムノグロブリン結合タンパク質が用いられる。
　プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来の細胞壁タンパク質である。プロテインＡは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインと呼ばれる５つのイムノグロブリン結合ドメインを有し、各ドメインは単独でイムノグロブリンに結合することができる。プロテインＡの天然型イムノグロブリン結合ドメインとならんで、これらにタンパク質工学的改変を加えた改変イムノグロブリン結合ドメインもまた、アフィニティー精製用のリガンドとして利用されている。
　抗体のアフィニティー精製用カラムは、通常、アルカリ溶液で洗浄されて繰り返し使用される。しかし、プロテインＡの天然型イムノグロブリン結合ドメインはアルカリ耐性が低いため、該天然型ドメインを固定化したアフィニティー精製用カラムは、繰り返し使用の間に抗体結合性が大きく低下する。そこで、アルカリ耐性を向上させた改変プロテインＡドメインが開発されてきた。例えば、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、そのアミノ酸配列の２９位のＧｌｙをＡｌａに置換することで、化学的な安定性が向上することは広く知られている（非特許文献１）。特許文献１には、イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列中のＡｓｎをＧｌｎ及びＣｙｓ以外のアミノ酸に置換するか、又は欠失させることにより、該ドメインのアルカリ耐性を向上させる手法が開示されている。さらに、特許文献２には、プロテインＡのＣ、Ｂ又はＺドメインにおいて、Ｎ末端から位置１又は２で始まる３以上の連続したアミノ酸を欠失させることにより、該ドメインのアルカリ耐性を向上させる手法が開示されている。
国際公開公報第２０００／０２３５８０号 国際公開公報第２０１３／１０９３０２号
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｂ，２００７，８４８（１）：４０－４７
　アルカリ耐性がより向上したアフィニティー担体が求められている。本発明は、イムノグロブリン結合ドメイン由来のアルカリ耐性が向上した変異ポリペプチド鎖を含有する、イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体を提供する。また本発明は、該アフィニティー担体を用いた抗体の単離方法を提供する。
　本発明は、以下を提供する。
〔１〕　配列番号１～６及び５７～６２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む、イムノグロブリン結合タンパク質：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
〔２〕前記ポリペプチド鎖が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である、〔１〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔３〕前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、
（ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｒｇへの置換；
（ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＣｙｓへの置換；
（ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｕへの置換；
（ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＨｉｓへの置換；
（ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＩｌｅへの置換；
（ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｅｕへの置換；
（ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｙｓへの置換；
（ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＭｅｔへの置換；
（ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＰｈｅへの置換；
（ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｈｒへの置換；
（ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｒｐへの置換；
（ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｙｒへの置換；
（ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＶａｌへの置換；
（ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
（ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
（ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＬｙｓへの置換；
（ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＡｒｇへの置換；
（ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｓｐへの置換；
（ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＧｌｕへの置換；
（ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＬｙｓへの置換；
（ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｒｇへの置換；
（ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
（ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換、
（ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換；
（ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＬｅｕへの置換；及び
（ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけＴｈｒからＳｅｒへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１種の変異である、〔１〕又は〔２〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔４〕前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、
（ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
（ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｒｇへの置換；
（ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
（ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＣｙｓへの置換；
（ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｕへの置換；
（ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＨｉｓへの置換；
（ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＩｌｅへの置換；
（ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｅｕへの置換；
（ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｙｓへの置換；
（ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＭｅｔへの置換；
（ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＰｈｅへの置換；
（ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｈｒへの置換；
（ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｒｐへの置換；
（ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｙｒへの置換；
（ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＶａｌへの置換；
（ａ23）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ24）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ25）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ26）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ27）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ａ28）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
（ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
（ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
（ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＬｙｓへの置換；
（ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＡｒｇへの置換；
（ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｓｐへの置換；
（ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＧｌｕへの置換；
（ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＬｙｓへの置換；
（ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｒｇへの置換；
（ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
（ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
（ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換；
（ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＬｅｕへの置換；
（ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけＴｈｒからＳｅｒへの置換；
（ｇ1）　（ａ7）と（ｆ1）の組み合わせ；
（ｇ2）　（ａ7）と（ｆ2）の組み合わせ；
（ｇ3）　（ａ7）と（ｆ3）の組み合わせ；
（ｇ4）　（ａ7）と（ｅ2）の組み合わせ；
（ｇ5）　（ａ7）と（ｅ4）の組み合わせ；
（ｇ6）　（ａ7）と（ｆ1）と（ｅ2）の組み合わせ；
（ｇ7）　（ａ7）と（ｆ2）と（ｅ2）の組み合わせ；及び
（ｇ8）　（ａ7）と（ｆ3）と（ｅ2）の組み合わせ、
のいずれか１種である、〔３〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔５〕前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位、２４位、２５位、３９位、４６位、４位、４９位、５８位及び２３位のうちの少なくとも２つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔６〕前記少なくとも１種の変異が、前記（ａ23）～（ａ28）のいずれかであるか、又は前記（ａ1）～（ａ28）のいずれか１つと前記（ｂ1）～（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせである、〔５〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔７〕前記アミノ酸配列の同一性が少なくとも９０％である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔８〕前記ポリペプチド鎖が、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＶａｌへの置換、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｌａへの置換をさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔９〕前記ポリペプチド鎖を２個以上含む、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕〔１０〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１２〕〔１１〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔１３〕固相担体と、該固相担体に結合した〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
〔１４〕〔１３〕のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
〔１５〕〔１３〕記載のアフィニティー担体又は〔１４〕記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
〔１６〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、〔１２〕記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
〔１７〕変異ポリペプチド鎖の製造方法であって、
　配列番号１～６及び５７～６２のいずれかのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することを含む、方法：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
〔１８〕固相担体に、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
　本発明の変異ポリペプチド鎖、及びそれを含有するイムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合を有し、且つアルカリ耐性が向上している。したがって本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして有用である。該イムノグロブリン結合タンパク質を固定化した本発明のアフィニティー担体は、アルカリ性溶液を使用した繰り返しの洗浄（Cleaning-in-place、以降ＣＩＰとも呼ぶ）を実施後においてもイムノグロブリン結合活性を維持することができる。
　本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３－５８７７）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３－４１０）。これらのプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（[www.ncbi.nlm.nih.gov]参照）。
　本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/index.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
　本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
　本明細書において、アミノ酸配列の特定の位置に対する「前」及び「後」の位置とは、それぞれ、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置をいう。例えば、特定の位置の「前」及び「後」の位置へアミノ酸残基を挿入する場合、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置に、挿入後のアミノ酸残基が配置される。
　本明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、抗体もしくはその断片に対する結合活性を有するタンパク質をいう。本明細書における「抗体」は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、その断片、それらの変異体を含み得る。また本明細書における「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、及び抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。また本明細書における「抗体の断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体の断片としては、例えばイムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。
　本明細書において「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、単独でイムノグロブリン（又は抗体もしくは抗体の断片）結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいう。該「イムノグロブリン結合ドメイン」の好ましい例としては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、ならびにイムノグロブリン結合活性を有するその変異体が挙げられる。
１．イムノグロブリン結合タンパク質
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ（以下、ＳｐＡともいう）のイムノグロブリン結合ドメインに由来する変異ポリペプチド鎖を、少なくとも１つ含む。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該変異ポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖であり、以下の本明細書において、「本発明の変異イムノグロブリン結合ドメイン」とも称される。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、親ドメインであるＳｐＡ由来のイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体に、所定の変異を加えることによって得ることができる。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性を有し、且つ親ドメインと比べてアルカリ耐性が向上している。当該本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを含有する本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティー担体のリガンドとして使用することができる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの親ドメインとしては、ＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメイン、例えば、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、またはＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン、及びそれらの変異体が挙げられる。このうち、Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン及びその変異体が好ましく、Ｃドメイン及びその変異体がより好ましい。
　ＳｐＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、及びＥドメイン、ならびにそれらの変異体は、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの親ドメインとして使用され得る。ＳｐＡのＢドメインは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｂドメインの変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。ＳｐＡのＺドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｚドメインの変異体としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。ＳｐＡのＣドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃドメインの変異体としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。ＳｐＡのＤドメインは、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｄドメインの変異体としては、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。ＳｐＡのＡドメインは、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ａドメインの変異体としては、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。ＳｐＡのＥドメインは、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｅドメインの変異体としては、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
　したがって、本発明における好ましい親ドメインの例としては、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、及び配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。より好ましい親ドメインの例としては、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、及び配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。さらに好ましい親ドメインの例としては、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、及び配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
　形質転換体におけるタンパク質の発現量の増加の観点（ＰＮＡＳ，１９８９，８６：８２４７－８２５１，Ｆｉｇ．２）や、複数のドメインを連結したイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製が容易となる観点（ＷＯ２０１０／１１０２８８）から、当該親ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＡｌａからＶａｌへの置換を含んでいてもよい。また、イムノグロブリン結合タンパク質の化学的な安定性が向上しアルカリ耐性が増大する観点から、当該親ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＧｌｙからＡｌａへの置換をさらに含んでいてもよい（非特許文献１）。
　天然イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端領域が欠失した、当該天然イムノグロブリン結合ドメインより安定性の高いタンパク質構造を有する、イムノグロブリン結合ドメイン変異体が報告されている（ＷＯ２０１３／１０９３０２、ＷＯ２０１７／１９４５９６等）。したがって、当該親ドメインは、イムノグロブリン結合活性を有する限りにおいて、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２残基（例えば、２残基、４残基、６残基又は７残基）に相当するアミノ酸残基を欠失したイムノグロブリン結合ドメイン変異体であってもよい。そのような親ドメインの例としては、配列番号５７～６２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられ、これらは、それぞれ配列番号１～６のアミノ酸配列のＮ末端２～７残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインである。
　したがって、上述した親ドメインについての配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号５７～６２のいずれかのアミノ酸配列、又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。さらに、該配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌを含むか、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを含んでいてもよい。
　当該ＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメインの変異体は、ＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失の手段としては、該ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上述した親ドメインに対して、以下の（ａ）～（ｆ）：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入して得られたポリペプチド鎖である。
　当該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該３位、６位及び１１位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＡｓｎであり、これらと置換される該他のアミノ酸残基は、好ましくはＳｅｒ以外のアミノ酸残基であり、より好ましくは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、さらに好ましくは、Ｇｌｎである。当該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位又は１１位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であってもよいが、該３位、６位及び１１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のうちの２つ又は３つが変異した多重変異であってもよい。例えば、当該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位又は１１位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独置換であってもよいが、該３位、６位及び１１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のうちの２つ又は３つを置換した多重置換であってもよい。好ましくは、当該（ａ）の変異は、（ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、（ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、（ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、（ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、（ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、（ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｒｇへの置換、（ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、（ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＣｙｓへの置換、（ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｕへの置換、（ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＨｉｓへの置換、（ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＩｌｅへの置換、（ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｅｕへの置換、（ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｙｓへの置換、（ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＭｅｔへの置換、（ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＰｈｅへの置換、（ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｈｒへの置換、（ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｒｐへの置換、（ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｙｒへの置換、（ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＶａｌへの置換、（ａ23）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ24）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ25）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ26）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、（ａ27）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換、又は（ａ28）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換である。
　当該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該２４位及び２５位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＧｌｕであり、これらと置換される該他のアミノ酸残基は、好ましくはＡｓｐである。当該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の２４位又は２５位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であってもよいが、該２４位及び２５位に相当する位置におけるアミノ酸残基の両方が変異した二重変異であってもよい。例えば、当該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の２４位又は２５位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独置換であってもよいが、該２４位及び２５位に相当する位置におけるアミノ酸残基の両方を置換した二重置換であってもよい。好ましくは、当該（ｂ）の変異は、（ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換、又は（ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換である。
　当該（ｃ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該３９位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＳｅｒであり、これと置換される当該他のアミノ酸残基は、好ましくはＬｙｓ又はＡｒｇである。好ましくは、当該（ｃ）の変異は、（ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＬｙｓへの置換、又は（ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＡｒｇへの置換である。
　当該（ｄ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該４６位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＡｌａであり、これと置換される当該他のアミノ酸残基は、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、より好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｒｇである。好ましくは、当該（ｄ）の変異は、（ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｓｐへの置換、（ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＧｌｕへの置換、（ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＬｙｓへの置換、又は（ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｒｇへの置換である。
　当該（ｅ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該４位、４９位及び５８位に相当する位置における欠失アミノ酸残基は、好ましくはＬｙｓである。該４位、４９位及び５８位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＬｙｓであり、これらと置換される当該他のアミノ酸残基は、好ましくはＡｒｇである。当該（ｅ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位又は５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であってもよいが、該４位、４９位及び５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のうちの２つ又は３つが変異した多重変異であってもよい。例えば、当該（ｅ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位又は５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基単独での欠失又は置換であってもよいが、該４位、４９位又は５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のうちの２つ又は３つを欠失又は置換した多重変異であってもよい。好ましくは、当該（ｅ）の変異は、（ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失、（ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換、（ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失、又は（ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換である。
　当該（ｆ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該２３位に相当する位置において、該置換前のアミノ酸残基は、好ましくはＴｈｒであり、これと置換される当該他のアミノ酸残基は、好ましくはＡｒｇ、Ｌｅｕ又はＳｅｒである。好ましくは、当該（ｆ）の変異は、（ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換、（ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＬｅｕへの置換、又は（ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけＴｈｒからＳｅｒへの置換である。
　好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖に対して、当該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。別の好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、当該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
　より好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖に対して、当該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
　別のより好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、当該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
　さらに好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、当該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
　該導入される変異は、該（ａ）～（ｆ）のいずれか１種であっても、２種以上の組み合わせ（すなわち、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位、２４位、２５位、３９位、４６位、４位、４９位、５８位及び２３位のうちの少なくとも２つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の変異）であってもよく、好ましくは、上記（ａ1）、（ａ2）、（ａ3）、（ａ4）、（ａ5）、（ａ6）、（ａ7）、（ａ8）、（ａ9）、（ａ10）、（ａ11）、（ａ12）、（ａ13）、（ａ14）、（ａ15）、（ａ16）、（ａ17）、（ａ18）、（ａ19）、（ａ20）、（ａ21）、（ａ22）、（ｂ1）、（ｂ2）、（ｃ1）、（ｃ2）、（ｄ1）、（ｄ2）、（ｄ3）、（ｄ4）、（ｅ1）、（ｅ2）、（ｅ3）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）及び（ｆ3）からなる群より選択される少なくとも１種、又は２種以上の変異の組み合わせである。該２種以上の変異の組み合わせの例としては、上記（ａ23）～（ａ28）が挙げられる。該２種以上の変異の組み合わせの別の例としては、上記（ａ1）～（ａ28）のいずれか１つと上記（ｂ1）～（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、好ましくは上記（ａ1）～（ａ22）のいずれか１つと上記（ｅ1）～（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、より好ましくは上記（ａ7）～（ａ22）のいずれか１つと上記（ｅ2）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）及び（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは上記（ａ7）と上記（ｅ2）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）及び（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは、以下が挙げられる：
（ｇ1）　上記（ａ7）と（ｆ1）の組み合わせ；
（ｇ2）　上記（ａ7）と（ｆ2）の組み合わせ；
（ｇ3）　上記（ａ7）と（ｆ3）の組み合わせ；
（ｇ4）　上記（ａ7）と（ｅ2）の組み合わせ；
（ｇ5）　上記（ａ7）と（ｅ4）の組み合わせ；
（ｇ6）　上記（ａ7）と（ｆ1）と（ｅ2）の組み合わせ；
（ｇ7）　上記（ａ7）と（ｆ2）と（ｅ2）の組み合わせ；及び
（ｇ8）　上記（ａ7）と（ｆ3）と（ｅ2）の組み合わせ。
　好ましい実施形態において、該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、上記（ａ1）、（ａ2）、（ａ3）、（ａ4）、（ａ5）、（ａ6）、（ａ7）、（ａ8）、（ａ9）、（ａ10）、（ａ11）、（ａ12）、（ａ13）、（ａ14）、（ａ15）、（ａ16）、（ａ17）、（ａ18）、（ａ19）、（ａ20）、（ａ21）、（ａ22）、（ａ23）、（ａ24）、（ａ25）、（ａ26）、（ａ27）、（ａ28）、（ｂ1）、（ｂ2）、（ｃ1）、（ｃ2）、（ｄ1）、（ｄ2）、（ｄ3）、（ｄ4）、（ｅ1）、（ｅ2）、（ｅ3）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）、（ｆ3）、（ｇ1）、（ｇ2）、（ｇ3）、（ｇ4）、（ｇ5）、（ｇ6）、（ｇ7）、又は（ｇ8）である。別の一例において、該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、該（ａ1）～（ｇ8）の変異のうちのいずれか１種を含むが、該（ａ1）～（ｇ8）の変異のうちの他の変異を含まない。さらに別の一例において、該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、該（ｅ2）、（ｅ3）もしくは（ｅ4）の単独変異のみの場合、又は（ｅ2）と（ｅ3）もしくは（ｅ2）と（ｅ4）の二重変異のみの場合を含まないことがある。
　親ドメインを変異させる手段としては、該親ドメインをコードするポリヌクレオチドに対して、所望のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入等が生じるように変異導入する方法が挙げられる。ポリヌクレオチドに対する変異導入のための具体的な手法としては、部位特異的突然変異、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などを挙げることができ、これらの詳細な手順は当業者に周知である。
　製造された本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性を有し、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。また本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、変異前のドメイン（親ドメイン）と比べてアルカリ耐性が向上している。したがって、これらの本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、アフィニティーリガンドとして好適に使用することができる。
　上記手順で得られる本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの好ましい例としては、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのより好ましい例としては、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのさらに好ましい例としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
　該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、好ましくは、上記（ａ1）、（ａ2）、（ａ3）、（ａ4）、（ａ5）、（ａ6）、（ａ7）、（ａ8）、（ａ9）、（ａ10）、（ａ11）、（ａ12）、（ａ13）、（ａ14）、（ａ15）、（ａ16）、（ａ17）、（ａ18）、（ａ19）、（ａ20）、（ａ21）、（ａ22）、（ｂ1）、（ｂ2）、（ｃ1）、（ｃ2）、（ｄ1）、（ｄ2）、（ｄ3）、（ｄ4）、（ｅ1）、（ｅ2）、（ｅ3）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）及び（ｆ3）からなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくは、上記（ａ1）、（ａ2）、（ａ3）、（ａ4）、（ａ5）、（ａ6）、（ａ7）、（ａ8）、（ａ9）、（ａ10）、（ａ11）、（ａ12）、（ａ13）、（ａ14）、（ａ15）、（ａ16）、（ａ17）、（ａ18）、（ａ19）、（ａ20）、（ａ21）、（ａ22）、（ａ23）、（ａ24）、（ａ25）、（ａ26）、（ａ27）、（ａ28）、（ｂ1）、（ｂ2）、（ｃ1）、（ｃ2）、（ｄ1）、（ｄ2）、（ｄ3）、（ｄ4）、（ｅ1）、（ｅ2）、（ｅ3）、（ｅ4）、（ｆ1）、（ｆ2）、（ｆ3）、（ｇ1）、（ｇ2）、（ｇ3）、（ｇ4）、（ｇ5）、（ｇ6）、（ｇ7）、又は（ｇ8）である。別の一例において、該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、該（ａ1）～（ｇ8）の変異のうちのいずれか１種を含むが、該（ａ1）～（ｇ8）の変異のうちの他の変異を含まない。さらに別の一例において、該（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、該（ｅ2）、（ｅ3）もしくは（ｅ4）の単独変異のみの場合、又は（ｅ2）と（ｅ3）もしくは（ｅ2）と（ｅ4）の二重変異のみの場合を含まないことがある。
　あるいは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの好ましい例としては、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、且つ下記（Ａ1）～（Ｆ3）：
（Ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＣｙｓ；
（Ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＧｌｕ；
（Ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＨｉｓ；
（Ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＩｌｅ；
（Ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＬｅｕ；
（Ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＭｅｔ；
（Ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＰｈｅ；
（Ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｈｒ；
（Ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｒｐ；
（Ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｙｒ；
（Ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＶａｌ；
（Ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＧｌｕ；
（Ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（Ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（Ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＬｅｕ；及び
（Ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＳｅｒ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、又はこれらのアミノ酸残基の２種以上の組み合わせを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。該配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
　該２種以上のアミノ酸残基の組み合わせの例としては、下記（Ａ23）～（Ａ28）が挙げられる：
（Ａ23）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ24）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ、６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ25）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ26）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ27）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ、６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ28）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ、６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ。
　該２種以上のアミノ酸残基の組み合わせの別の例としては、上記（Ａ1）～（Ａ28）のいずれか１つと上記（Ｂ1）～（Ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、好ましくは上記（Ａ1）～（Ａ22）のいずれか１つと上記（Ｅ1）～（Ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、より好ましくは上記（Ａ7）～（Ａ22）のいずれか１つと上記（Ｅ2）、（Ｅ4）、（Ｆ1）、（Ｆ2）及び（Ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは上記（Ａ7）と上記（Ｅ2）、（Ｅ4）、（Ｆ1）、（Ｆ2）及び（Ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせが挙げられ、さらに好ましくは、以下が挙げられる：
（Ｇ1）　上記（Ａ7）及び（Ｆ1）；
（Ｇ2）　上記（Ａ7）及び（Ｆ2）；
（Ｇ3）　上記（Ａ7）及び（Ｆ3）；
（Ｇ4）　上記（Ａ7）及び（Ｅ2）；
（Ｇ5）　上記（Ａ7）及び（Ｅ4）；
（Ｇ6）　上記（Ａ7）、（Ｆ1）及び（Ｅ2）；
（Ｇ7）　上記（Ａ7）、（Ｆ2）及び（Ｅ2）；又は
（Ｇ8）　上記（Ａ7）、（Ｆ3）及び（Ｅ2）。
　あるいは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのより好ましい例としては、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、且つ下記：
（Ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｌａ；
（Ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＣｙｓ；
（Ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＧｌｕ；
（Ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＨｉｓ；
（Ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＩｌｅ；
（Ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＬｅｕ；
（Ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＭｅｔ；
（Ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＰｈｅ；
（Ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｈｒ；
（Ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｒｐ；
（Ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＴｙｒ；
（Ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＶａｌ；
（Ａ23）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ24）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ25）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ26）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ27）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｐ、６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ａ28）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｌａ、６位に相当する位置におけるＡｓｐ、及び１１位に相当する位置におけるＧｌｎ；
（Ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｓｐ；
（Ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＧｌｕ；
（Ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＬｙｓ；
（Ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（Ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
（Ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＬｅｕ； 
（Ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＳｅｒ；
（Ｇ1）　上記（Ａ7）及び（Ｆ1）；
（Ｇ2）　上記（Ａ7）及び（Ｆ2）；
（Ｇ3）　上記（Ａ7）及び（Ｆ3）；
（Ｇ4）　上記（Ａ7）及び（Ｅ2）；
（Ｇ5）　上記（Ａ7）及び（Ｅ4）；
（Ｇ6）　上記（Ａ7）、（Ｆ1）及び（Ｅ2）；
（Ｇ7）　上記（Ａ7）、（Ｆ2）及び（Ｅ2）；又は
（Ｇ8）　上記（Ａ7）、（Ｆ3）及び（Ｅ2）、
を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。該配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。別の一例において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上記（Ａ1）～（Ｇ8）のアミノ酸残基又はその欠失のうちのいずれか１種を含むが、該（Ａ1）～（Ｇ8）のアミノ酸残基又は欠失のうちの他のアミノ酸残基又は欠失を含まない。さらに別の一例において、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの有する（Ａ1）～（Ｆ3）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基もしくはその欠失は、（Ｅ2）Ｋ４９Ｒ、（Ｅ3）ΔＫ５８、又は（Ｅ4）Ｋ５８Ｒの単独変異、又はＫ４９ＲΔＫ５８、もしくはＫ４９ＲＫ５８Ｒの二重変異を含まないことがある。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインにおいて、当該配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号５７～６２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。また、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインにおいて、当該配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号５７～５９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。ただし、これら配列番号５７～６２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上述した（ａ）～（ｆ）の変異のうち、配列番号３のアミノ酸配列の３位及び４位に相当する位置におけるアミノ酸残基の変異を含まないことがある。
　好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＶａｌを含むか、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＡｌａを含む。
　本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのさらに好ましい例としては、配列番号７～５３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、上述した本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを１つ以上含んでいればよい。好ましくは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上、さらに好ましくは６個以上含む。一方、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを、好ましくは１２個以下、より好ましくは８個以下、さらに好ましくは７個以下含む。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを、好ましくは２～１２個、より好ましくは３～８個、さらに好ましくは４～７個含む。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質が２個以上の本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを含む場合、それらの変異イムノグロブリン結合ドメインは、同じ種類のものであっても、異なる種類のものであってもよいが、好ましくは同じ種類である。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、上述した本発明の変異イムノグロブリン結合ドメイン以外の、他のイムノグロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。当該他のドメインの例としては、天然型ＳｐＡイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、ＳｐＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン又はＤドメイン）、又は本発明の変異イムノグロブリン結合ドメイン以外のそれらの変異体が挙げられる。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例としては、２個以上の本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が直鎖状に連結されたポリペプチドが挙げられる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該変異イムノグロブリン結合ドメインの数は、好ましくは２～１２個、より好ましくは３～８個、さらに好ましくは４～７個である。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質のより好ましい例としては、各々が配列番号７～５３のアミノ酸配列から選択される２個以上のアミノ酸配列が直鎖状に連結されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質のさらに好ましい例としては、各々が配列番号７～５３のアミノ酸配列から選択される２～１２個、さらに好ましくは３～８個、なお好ましくは４～７個のアミノ酸配列が直鎖状に連結されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。さらに好ましい例としては、配列番号７～５３のいずれかのアミノ酸配列が２～１２個、さらに好ましくは３～８個、なお好ましくは４～７個直鎖状に連結されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。しかしながら、本発明のタンパク質の好ましい例は、これらに限定されない。なお、本発明において、アミノ酸配列が「直鎖状に連結」とは、２個以上のアミノ酸配列がリンカーを介して又はリンカーを介さずに直列に連結された構造を意味する。例えば、リンカーを介する場合、「直鎖状に連結」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがリンカーを介して直列に連結された構造を意味し、一方、リンカーを介さない場合、「直鎖状に連結」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがペプチド結合によって直列に連結された構造を意味する。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の担体への固定化量増大、担体への結合点の増加、抗体結合容量の増大などの観点から、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれるイムノグロブリン結合ドメインのＮ末端、Ｃ末端、及びドメイン間のいずれか１箇所以上に、任意のアミノ酸残基又はペプチドを付加又は挿入してもよい。当該付加又は挿入されるアミノ酸残基又はペプチドの好ましい例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、（Ｐｒｏ）ｍ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、及び（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ）ｐ（ｍは２～３００、好ましくは１２～２４の整数であり、ｎは４以上の整数、好ましくは４～１０の整数であり、ｐは２以上の整数、好ましくは２～６の整数である）が挙げられる。
２．イムノグロブリン結合タンパク質の製造
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。すなわち、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体（好ましくは細菌等の細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
　したがって、本発明はまた、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）、それを含むベクター、及びそれらを含む形質転換体を提供する。
３．アフィニティー担体
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、該本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティー担体を製造することができる。当該アフィニティー担体は、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとする担体であり、イムノグロブリン結合活性を有する。また当該アフィニティー担体は、野生型プロテインＡやそのドメインをリガンドとする担体に比べて、アルカリ耐性が向上している。
　本発明のアフィニティー担体に含まれる固相担体の形状としては、粒子、膜、プレート、チューブ、針状、繊維状等の任意の形態であることができる。該担体は、多孔性でも非多孔性でもよい。これらの担体は充填ベッドとして使用することもでき、又は懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂｅｄ）及び純然たる懸濁物として知られるものが包含され、該形態中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床及び流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリー又はフィルターのような形態であってもよい。
　一実施形態において、当該固相担体は、粒子の場合、粒径が好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、粒径は好ましくは２０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、且つ好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは８０μｍ以下、例えば、好ましくは２０～１００μｍ、より好ましくは３０～８０μｍである。例えば、担体が多糖の場合、粒径が好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは６０μｍ以上、且つ好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、例えば、好ましくは５０～２００μｍ、より好ましくは６０～１５０μｍである。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が２００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティー担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、ＩＳＯ　１３３２０及びＪＩＳ　Ｚ　８８２５－１に準じたレーザー回折法で測定した体積平均粒子径を意味する。具体的には、レーザー散乱回折法粒度分布測定装置（例えば、ＬＳ　１３　３２０（（株）ベックマン・コールター等）により粒径分布を測定し、Ｆｌｕｉｄ　Ｒ．Ｉ．Ｒｅａｌ　１．３３３、Ｓａｍｐｌｅ　Ｒ．Ｉ．Ｒｅａｌ　１．５４　Ｉｍａｇｉｎａｒｙ　０等を光学モデルとして使用し、体積基準の粒度分布を測定して求められる平均粒子径のことをいう。
　一実施形態において、当該固相担体は、多孔質であり、好ましくは５０ｍ2／ｇ以上、より好ましくは８０ｍ2／ｇ以上、且つ好ましくは１５０ｍ2／ｇ以下、より好ましくは１３０ｍ2／ｇ以下、例えば、好ましくは５０～１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０～１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
　一実施形態において、当該固相担体は、体積平均細孔径が好ましくは１００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、体積平均細孔径は好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、且つ好ましくは４００ｎｍ以下、より好ましくは３００ｎｍ以下であり、例えば、好ましくは１００～４００ｎｍ、さらに好ましくは２００～３００ｎｍである。例えば、担体が多糖の場合、体積平均細孔径は好ましくは５００ｎｍ以上、より好ましくは８００ｎｍ以上、且つ好ましくは１５００ｎｍ以下、より好ましくは１４００ｎｍ以下であり、例えば、好ましくは５００～１５００ｎｍ、さらに好ましくは８００～１４００ｎｍである。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１５００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
　当該固相担体が上記範囲の粒径、比表面積、及び細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間及び粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
　当該固相担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、親水化処理により外表面に（及び存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（－ＣＯＮＨ2、又はＮ置換型）、アミノ基（－ＮＨ2、又は置換型）、又はオリゴもしくはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、該ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３）：３７１－３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーは、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
　一実施形態において、当該固相担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０～５０質量％の架橋性ビニル単量体と３～８０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体、２０～８０質量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０～８０μｍであり、比表面積が５０～１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００～４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
　なお、当該固相担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは１．３ｍＬ／ｇ以上、７．０ｍＬ／ｇ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、細孔体積は、好ましくは１．３ｍＬ／ｇ以上、且つ好ましくは７．０ｍＬ／ｇ以下、より好ましくは５．０ｍＬ／ｇ以下、さらに好ましくは２．５ｍＬ／ｇ以下であり、例えば、好ましくは１．３～７．０ｍＬ／ｇ、より好ましくは１．３～５．０ｍＬ／ｇ、さらに好ましくは１．３～２．５ｍＬ／ｇである。また、例えば、担体が多糖の場合、細孔体積は、好ましくは３．０～６．０ｍＬ／ｇである。
　当該固相担体へのリガンド（すなわち本発明のイムノグロブリン結合タンパク質）の結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法；アミノ基又はカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基又はアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法；水酸基を有する担体を用い、臭化シアン等のハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法；担体の水酸基をトシル化又はトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法；ビスエポキシド、エピクロロヒドリン等によりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基、水酸基又はチオール基と反応させる方法；エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基又、水酸基又はチオール基と反応させる方法、などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを結合させる方法が望ましい。
　エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基である水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸又はアルカリにより、加熱又は室温で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミン等のアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。より好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノール等よりも毒性が低く、またチオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなる、といった利点を有する。
　必要に応じて固相担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としてはポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。
　本発明のアフィニティー担体は、アルカリ耐性の向上したリガンドを有しているため、例えば、アフィニティー精製における該担体の繰り返し利用のためのアルカリ性条件下での洗浄（例えば０．０１～１．０Ｍ水酸化ナトリウム等のアルカリ性溶液を用いた洗浄）に対しても性能の著しい低下がない。
４．抗体又はその断片の単離方法
　本発明の一実施形態に係る抗体又はその断片（以下、単に抗体と表記する。）の単離方法を説明する。本実施形態に係る抗体の単離方法は、好適には、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、抗体を含有する試料を通液し、該担体に該抗体を吸着させる工程（第一の工程）、及び、該担体から該抗体を溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。
　当該第一の工程では、本発明のアフィニティー担体を充填したカラム等に抗体を含有する試料を、リガンド（本発明のイムノグロブリン結合タンパク質）に抗体が吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中の抗体以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
　第二の工程では、ｐＨ２～５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着された抗体を溶出させる。この溶出液を回収することで、試料から抗体を単離することができる。
　抗体の純度を高めるために、上記第二の工程で得られた溶出液に含まれる抗体をさらに精製してもよい。抗体の精製は、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて使用して行うことができる。例えば、該第二の工程で得られた溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、抗体を精製することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＳＰ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＢｉｏＰｒｏ　ＩＥＸ　Ｓ（ＹＭＣ社製）、ＢｉｏＰｒｏ　ＩＥＸ　ＳｍａｒｔＳｅｐ　Ｓ（ＹＭＣ社製）等を用いて行うことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＢｉｏＰｒｏ　ＩＥＸ　Ｑ（ＹＭＣ社製）、ＢｉｏＰｒｏ　ＩＥＸ　ＳｍａｒｔＳｅｐ　Ｑ（ＹＭＣ社製）等を用いて行うことができる。
　本実施形態に係る抗体の単離方法においては、好ましくは、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われる。第三の工程では、アルカリ性溶液で該アフィニティー担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。また、第三の工程で使用される該アルカリ性溶液中のアルカリ塩のモル濃度は、下限値が、０．００１Ｍ以上、好ましくは０．０１Ｍ以上、より好ましくは０．１Ｍ以上であり、上限値が、６．０Ｍ以下、好ましくは４．０Ｍ以下、より好ましくは２．０Ｍ以下である。使用される該アルカリ性溶液のｐＨとしては、下限値が、ｐＨ１１．０以上、好ましくはｐＨ１２．０以上、より好ましくはｐＨ１２．５以上であり、上限値が、ｐＨ１６．０以下、好ましくはｐＨ１５．５以下、より好ましくはｐＨ１５．０以下である。
　本発明のアフィニティー担体は、タンパク質リガンドのアルカリ耐性向上により上記第三の工程での洗浄後も抗体結合活性を安定に保持しているため、抗体単離に繰り返し使用することができる。
　本発明の抗体の単離方法の一実施形態において、単離された抗体は、抗体医薬として使用される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述した抗体の単離方法の手順と同様である。
　以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
参考例１　多孔質粒子の合成
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
（２）グリシジルメタクリレート（三菱ケミカル株式会社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
（３）（１）で得た水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に（２）で得た単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加した。
（４）（３）で得た反応液を、８６℃に温度を維持しながら、３時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、ろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子（ＰＢ）分散液を得た。
実施例１　イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｔ－０～３２）の作製
　イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔ－０～３２を取得した。ＰｒＡｔ－０は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（アルカリ耐性向上変異体；非特許文献１）がペプチド結合によって直列に連結したホモテトラマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質である。ＰｒＡｔ－１～３２は、ＰｒＡｔ－０の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表１記載の変異を導入した変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＰｒＡｔ－０～３２の発現と精製はそれぞれ以下のように行った。ＰｒＡｔ－０～３２をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、培地に終濃度１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、目的タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心分離して上清を除き、得られた菌体に卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加して菌体を破砕した。得られた細胞破砕液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって組み換えイムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
実施例２　イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｐ－０～４１）の作製
　イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｐ－０～３９を取得した。ＰｒＡｐ－０は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモペンタマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質であり、ＰｒＡｐ－２１は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモペンタマーのＣ末端にシステイン（Ｃ）を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。ＰｒＡｐ－１～２０は、ＰｒＡｐ－０の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表２記載の変異を導入した変異体であり、ＰｒＡｐ－２２～４１は、ＰｒＡｐ－２１の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表３記載の変異を導入した変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰｒＡｐ－０～４１の発現と精製はＰｒＡｔ－０～３２と同様に行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
実施例３　イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｈ－０～４１）の作製
　イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈ－０～４１を取得した。ＰｒＡｈ－０は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーを含むイムノグロブリン結合タンパク質であり、ＰｒＡｈ－２１は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーのＣ末端にシステイン（Ｃ）を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。ＰｒＡｈ－１～２０は、ＰｒＡｈ－０の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表４記載の変異を導入した変異体であり、ＰｒＡｈ－２２～４１は、ＰｒＡｈ－２１の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表５記載の変異を導入した変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰｒＡｈ－０～４１の発現と精製はＰｒＡｔ－０～３２と同様に行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
実施例４　リガンド固定化粒子の調製
　参考例１で取得した多孔質粒子（ＰＢ）８ｍｇに対して、実施例１で調製したＰｒＡｔ－０を１．１６ｍｇ溶解した、１．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．８）４５０μＬを加え、混合液を２５℃で５時間振盪して、ＰｒＡｔ－０をＰＢに結合させた。粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールを用いてブロッキングした後、０．５Ｍ　ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）を用いて粒子を洗浄し、リガンド固定化粒子（ＰｒＡｔ－０／ＰＢ）を得た。同様の手順で、ＰｒＡｔ－１～３２のいずれかが結合したリガンド固定化粒子（ＰｒＡｔ－１／ＰＢ～ＰｒＡｔ－３２／ＰＢ）を得た。また、同様の手順でＰｒＡｐ－０～４１のいずれかが結合したリガンド固定化粒子（ＰｒＡｐ－０／ＰＢ～ＰｒＡｐ－４１／ＰＢ）を得た。さらに、同様の手順でＰｒＡｈ－０～４１のいずれかが結合したリガンド固定化粒子（ＰｒＡｈ－０／ＰＢ～ＰｒＡｈ－４１／ＰＢ）を得た。
実施例５　イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｓ－０～２２）の作製
　イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｓ－０～２２を取得した。ＰｒＡｓ－０は、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体のＮ末端に６回繰り返しヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ配列）を連結したイムノグロブリン結合タンパク質である。ＰｒＡｓ－１～２２は、ＰｒＡｓ－０の各イムノグロブリン結合ドメインに対して表６記載の変異を導入した変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＰｒＡｓ－０～２２の発現と精製は、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって組み換えイムノグロブリン結合タンパク質を精製したこと以外は、ＰｒＡｔ－０～３２と同様に行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
試験例１
　実施例４で作製した、変異ドメインを含むリガンド固定化粒子ＰｒＡｔ－１／ＰＢ～ＰｒＡｔ－２９／ＰＢについて、親ドメインを含むリガンド固定化粒子ＰｒＡｔ－０に対する相対アルカリ耐性を評価した。
（１）静的結合容量（ＳＢＣ）の測定
　２ｍｇのリガンド固定化粒子（ＰｒＡｔ－０／ＰＢ）に２．０ｍｇのＩｇＧを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）４００μＬを添加し、３０分間インキュベートした。次いで２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）４００μＬで洗浄した後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５）４００μＬを添加し、ＩｇＧを含む溶出液を回収した。溶出液中のＩｇＧ量を吸光度測定により算出し、溶出ＩｇＧ量と担体体積からＰｒＡｔ－０／ＰＢの静的結合容量（ＳＢＣ）を求めた。同様の手順で、ＰｒＡｔ－１／ＰＢ～ＰｒＡｔ－２９／ＰＢのＳＢＣを求めた。また、同様の手順で、ＰｒＡｈ－２１／ＰＢ～ＰｒＡｈ－４１／ＰＢのＳＢＣを求めた。
（２）アルカリ耐性の評価：ＰｒＡｔ－１～２９
　２ｍｇのリガンド固定化粒子（ＰｒＡｔ－０／ＰＢ）を１．０Ｍ　ＮａＯＨで平衡化させた後、２４時間インキュベートした。次いで２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で粒子を平衡化させた後、２．０ｍｇのＩｇＧを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）４００μＬを添加し、３０分間インキュベートした。次いで２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）４００μＬで洗浄した後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５）４００μＬを添加し、ＩｇＧを含む溶出液を回収した。溶出液中のＩｇＧ量を吸光度測定により算出し、溶出ＩｇＧ量と担体体積からアルカリに暴露したＰｒＡｔ－０／ＰＢのＳＢＣを求めた。同様の手順で、アルカリに暴露したＰｒＡｔ－１～２９／ＰＢのＳＢＣを求めた。各リガンド固定化粒子について、（１）で求めたＳＢＣに対するアルカリ暴露後のＳＢＣの相対値（ＳＢＣ維持率）を算出し、次いで以下の式に従って各リガンド固定化粒子（ＰｒＡｔ－１～２９）のＰｒＡｔ－０に対する相対アルカリ耐性（％）を算出した。
　相対アルカリ耐性（％）＝（ＰｒＡｔ－Ｎ（Ｎ＝１～２９）のＳＢＣ維持率）／（ＰｒＡｔ－０のＳＢＣ維持率）×１００
（３）アルカリ耐性の評価：ＰｒＡｈ－２２～３８
　（２）と同様の手順でアルカリに暴露したＰｒＡｈ－２１～３８／ＰＢのＳＢＣを求め、ＰｒＡｈ－２２～３８のＰｒＡｈ－２１に対する相対アルカリ耐性（％）を算出した。
（４）アルカリ耐性の評価：ＰｒＡｈ－３９～４１
　リガンド固定化粒子（ＰｒＡｈ－２１／ＰＢ及びＰｒＡｈ－３９～４１／ＰＢ）を、（２）と同様の手順で、ただし１．０Ｍ　ＮａＯＨの代わりに０．５Ｍ　ＮａＯＨで平衡化させた後、２４時間インキュベートした。その後は、（２）と同様の方法で、アルカリに暴露したＰｒＡｈ－２１、及び３９～４１／ＰＢのＳＢＣを求め、ＰｒＡｈ－３９～４１のＰｒＡｈ－２１に対する相対アルカリ耐性（％）を算出した。
　（１）で測定したＳＢＣ及び（２）～（４）で測定した相対アルカリ耐性の測定結果を表７～９に示す。ＰｒＡｔ－１～２９／ＰＢのＳＢＣは、ＰｒＡｔ－０／ＰＢと比較して大きな相違は見られなかった。一方、ＰｒＡｔ－１～２９／ＰＢの相対アルカリ耐性はＰｒＡｔ－０／ＰＢと比較して１４～６４％向上していた。また、ＰｒＡｈ－２２～３８／ＰＢは、ＳＢＣはＰｒＡｈ－２１／ＰＢと比較して大きな相違は見られなかった一方、相対アルカリ耐性はＰｒＡｈ－２１／ＰＢと比較して２８～６９％向上していた。さらに、ＰｒＡｈ－３９～４１／ＰＢは、ＳＢＣはＰｒＡｈ－２１／ＰＢと比較して大きな相違は見られなかった一方、相対アルカリ耐性はＰｒＡｈ－２１／ＰＢと比較して２２～２６％向上していた。これらの結果から、変異ドメインを含む実施例１～３のイムノグロブリン結合タンパク質は、変異導入前と比べてアルカリ耐性が高く、１．０Ｍ又は０．５Ｍ水酸化ナトリウムに２４時間曝露するという比較的過酷な条件に置いた後も抗体結合活性を維持することができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
試験例２
　実施例５で作製した、変異ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｓ－１～ＰｒＡｓ－１９について、親ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｓ－０に対する相対アルカリ耐性を評価した。
（１）試料溶液の調製
　０．１３ｍｇのイムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｓ－０及びＰｒＡｓ－１～１９）を１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中でインキュベートした。インキュベート開始直後又はインキュベート開始２４時間後に、液を１．０Ｍクエン酸により中和した。次いで中和溶液を、０．１％ウシ血清由来アルブミン（和光純薬工業社製）及び０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業社製）を含むＤ－ＰＢＳバッファーを用いてタンパク質濃度１０μｇ／ｍＬに希釈し、試料溶液を調製した。これら試料溶液について、ＰｒＡｓ－Ｎ（Ｎ＝０～１９）を水酸化ナトリウム中でインキュベート開始直後に中和した試料溶液をＰｒＡｓ－Ｎａとし、インキュベート開始２４時間後に中和した試料溶液をＰｒＡｓ－Ｎｂとする。
（２）ＩｇＧ結合バイオセンサーの調製
　１．０ｍｇのＩｇＧを３．９μｇのＥＺ－Ｌｉｎｋ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と反応させ、ＩｇＧをビオチン化した。これをＯｃｔｅｔ　ＲＥＤ　９６ｅシステム（Ｐａｌｌ　ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いてストレプトアビジンバイオセンサー（Ｐａｌｌ　ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）に接触させ、センサー上にＩｇＧを固定化した。
（３）アルカリ耐性の評価
　Ｏｃｔｅｔ　ＲＥＤ　９６ｅシステムを用いてＩｇＧ結合バイオセンサーを試料溶液に接触させて、センサー上のＩｇＧにイムノグロブリン結合タンパク質を結合させた。センサグラムから結合速度を決定し、ＰｒＡｓ－Ｎａの結合速度に対するＰｒＡｓ－Ｎｂの結合速度の相対値（結合速度維持率）を算出した。次いで、以下の式に従って各イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｓ－０～１９）のＰｒＡｓ－０に対する相対アルカリ耐性（％）を算出した。
　相対アルカリ耐性（％）＝｛（ＰｒＡｓ－Ｎ（Ｎ＝１～１９）の結合速度維持率）／（ＰｒＡｓ－０の結合速度維持率）｝×１００
　ＰｒＡｓ－Ｎ（Ｎ＝０～１９）の結合速度維持率＝（ＰｒＡｓ－Ｎ（Ｎ＝０～１９）ｂの結合速度）／（ＰｒＡｓ－Ｎ（Ｎ＝０～１９）ａの結合速度）
　相対アルカリ耐性の測定結果を表１０に示す。ＰｒＡｓ－１７～１９の相対アルカリ耐性がＰｒＡｓ－０と比較して低下していた一方、ＰｒＡｓ－１～１６の相対アルカリ耐性はＰｒＡｓ－０と比較して６０～３３８％向上していた。これらの結果から、変異ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｓ－１～１６は、変異導入前と比べてアルカリ耐性が高く、１．０Ｍ水酸化ナトリウムに２４時間曝露するという比較的過酷な条件に置いた後も抗体結合活性を維持することができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
試験例３
　実施例５で作製したイムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡｓ－０及びＰｒＡｓ－２０～２２）について、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中でインキュベートしたこと以外は試験例２と同様の手順で、アルカリ耐性を算出した。相対アルカリ耐性の測定結果を表１１に示す。ＰｒＡｓ－２０～２２は、相対アルカリ耐性がＰｒＡｓ－０と比較して２１～３１％向上していたことから、変異導入前と比べアルカリ耐性が高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011

Claims (18)

  1. 　配列番号１～６及び５７～６２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む、イムノグロブリン結合タンパク質：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
    （ｆ）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
  2. 　前記ポリペプチド鎖が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である、請求項１記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  3. 　前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、
    （ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｒｇへの置換；
    （ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＣｙｓへの置換；
    （ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｕへの置換；
    （ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＨｉｓへの置換；
    （ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＩｌｅへの置換；
    （ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｅｕへの置換；
    （ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｙｓへの置換；
    （ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＭｅｔへの置換；
    （ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＰｈｅへの置換；
    （ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｈｒへの置換；
    （ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｒｐへの置換；
    （ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｙｒへの置換；
    （ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＶａｌへの置換；
    （ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
    （ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
    （ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＬｙｓへの置換；
    （ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＡｒｇへの置換；
    （ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｓｐへの置換；
    （ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＧｌｕへの置換；
    （ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＬｙｓへの置換；
    （ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｒｇへの置換；
    （ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
    （ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
    （ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
    （ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換、
    （ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換；
    （ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＬｅｕへの置換；及び
    （ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけＴｈｒからＳｅｒへの置換、
    からなる群より選択される少なくとも１種の変異である、請求項１又は２記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  4. 　前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、
    （ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ4）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ5）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ6）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ7）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ8）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換；
    （ａ9）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｒｇへの置換；
    （ａ10）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換；
    （ａ11）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＣｙｓへの置換；
    （ａ12）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｕへの置換；
    （ａ13）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＨｉｓへの置換；
    （ａ14）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＩｌｅへの置換；
    （ａ15）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｅｕへの置換；
    （ａ16）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＬｙｓへの置換；
    （ａ17）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＭｅｔへの置換；
    （ａ18）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＰｈｅへの置換；
    （ａ19）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｈｒへの置換；
    （ａ20）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｒｐへの置換；
    （ａ21）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＴｙｒへの置換；
    （ａ22）配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＶａｌへの置換；
    （ａ23）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ24）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ25）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ26）配列番号３のアミノ酸配列の６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ27）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ａ28）配列番号３のアミノ酸配列の３位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｌａへの置換、６位に相当する位置におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換、及び１１位に相当する位置におけるＡｓｎからＧｌｎへの置換；
    （ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の２４位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
    （ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の２５位に相当する位置におけるＧｌｕからＡｓｐへの置換；
    （ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＬｙｓへの置換；
    （ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＳｅｒからＡｒｇへの置換；
    （ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｓｐへの置換；
    （ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＧｌｕへの置換；
    （ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＬｙｓへの置換；
    （ｄ4）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるＡｌａからＡｒｇへの置換；
    （ｅ1）配列番号３のアミノ酸配列の４位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
    （ｅ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
    （ｅ3）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓの欠失；
    （ｅ4）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換；
    （ｆ1）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＡｒｇへの置換；
    （ｆ2）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるＴｈｒからＬｅｕへの置換；
    （ｆ3）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけＴｈｒからＳｅｒへの置換；
    （ｇ1）　（ａ7）と（ｆ1）の組み合わせ；
    （ｇ2）　（ａ7）と（ｆ2）の組み合わせ；
    （ｇ3）　（ａ7）と（ｆ3）の組み合わせ；
    （ｇ4）　（ａ7）と（ｅ2）の組み合わせ；
    （ｇ5）　（ａ7）と（ｅ4）の組み合わせ；
    （ｇ6）　（ａ7）と（ｆ1）と（ｅ2）の組み合わせ；
    （ｇ7）　（ａ7）と（ｆ2）と（ｅ2）の組み合わせ；及び
    （ｇ8）　（ａ7）と（ｆ3）と（ｅ2）の組み合わせ、
    のいずれか１種である、請求項３記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  5. 　前記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位、２４位、２５位、３９位、４６位、４位、４９位、５８位及び２３位のうちの少なくとも２つの位置に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を含む、請求項１～４のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  6. 　前記少なくとも１種の変異が、前記（ａ23）～（ａ28）のいずれかであるか、又は前記（ａ1）～（ａ28）のいずれか１つと前記（ｂ1）～（ｆ3）のいずれか１つ以上との組み合わせである、請求項５記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  7. 　前記アミノ酸配列の同一性が少なくとも９０％である、請求項１～６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  8. 　前記ポリペプチド鎖が、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＶａｌへの置換、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｌａへの置換をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  9. 　前記ポリペプチド鎖を２個以上含む、請求項１～８のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. 　請求項１１記載のベクターを含む形質転換体。
  13. 　固相担体と、該固相担体に結合した請求項１～９のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
  14. 　請求項１３のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
  15. 　請求項１３記載のアフィニティー担体又は請求項１４記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
  16. 　請求項１～９のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、請求項１２記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
  17. 　変異ポリペプチド鎖の製造方法であって、
    　配列番号１～６及び５７～６２のいずれかのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖に対して、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することを含む、方法：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列の３位、６位、１１位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の２４位及び２５位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４６位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列の４位、４９位及び５８位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
    （ｆ）配列番号３のアミノ酸配列の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入。
  18. 　固相担体に、請求項１～９のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
     
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