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WO2019123886A1 - アレイ及びその使用 - Google Patents

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WO2019123886A1
WO2019123886A1 PCT/JP2018/041720 JP2018041720W WO2019123886A1 WO 2019123886 A1 WO2019123886 A1 WO 2019123886A1 JP 2018041720 W JP2018041720 W JP 2018041720W WO 2019123886 A1 WO2019123886 A1 WO 2019123886A1
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WO
WIPO (PCT)
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array
tubes
cells
target substance
cell
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/041720
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English (en)
French (fr)
Inventor
昌治 竹内
悠加 ▲吉▼江
亜衣 島
翔伍 長田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
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Priority to US16/957,037 priority patent/US20200392439A1/en
Publication of WO2019123886A1 publication Critical patent/WO2019123886A1/ja
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/06—Tubular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
    • C09J201/00—Adhesives based on unspecified macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/42—Integrated assemblies, e.g. cassettes or cartridges
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/10—Hollow fibers or tubes
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    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
    • C09J139/00—Adhesives based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen; Adhesives based on derivatives of such polymers
    • C09J139/02—Homopolymers or copolymers of vinylamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to arrays and their use. More particularly, the present invention relates to an array, a cell culture method, a method for transporting unfrozen cells in a living state, and a method for producing an array.
  • the present application claims priority based on US Pat. No. 62 / 610,160 filed Dec. 23, 2017, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • An array is one in which a target substance is disposed on a substrate.
  • cell arrays DNA arrays, protein arrays and the like are known.
  • Patent Document 1 describes the use of cell arrays for screening of test compounds, toxicology assays, single cell differentiation studies, cell function studies and the like.
  • US Pat. No. 5,075,015 describes a cell array in which a plurality of independent spots are spotted on the top surface of a chemically modified glass slide, each spot comprising a matrix bottom layer and a matrix surface layer, the matrix surface layer comprising cells. It is done.
  • the cell array described in Patent Document 1 needs to spot cells in the manufacturing process. For this reason, for example, when producing a cell array consisting of a plurality of types of cells, different cells may be mixed in one spot. In addition, when preparing an array of cell aggregates such as spheroids, it takes a long time to make spheroids.
  • the present invention aims to provide a new array.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the cells comprise cells that respond to a chemical substance.
  • a method of manufacturing an array which comprises arranging a plurality of fibers containing a target substance in the interior of a tube made of anionic hydrogel, with a plurality of fibers in parallel so that the axial directions are parallel to each other Bonding with an adhesive containing surface-coated nanoparticles with a hydrophobic polymer to obtain a bundle of fibers, embedding the bundle in a support and cutting the bundle together with the support Obtaining, and the section is an array.
  • the quotient storage elastic modulus / loss elastic modulus obtained by dividing the storage elastic modulus of the support material by the loss elastic modulus is larger than 10 and the storage elastic modulus is 100 kPa or less.
  • a new array can be provided.
  • (C) is a photograph which shows the result of having detected the nucleus in a cell array in example 2 of an experiment.
  • (D) is a photograph in which (a) to (c) are merged.
  • (A) is a fluorescence microscope picture which photographed fluorescence of a calcium probe in example 3 of an experiment.
  • (B) is a graph which shows the result of having measured the fluorescence intensity of the calcium probe after addition of muscarinic in experimental example 3 sequentially.
  • (A) is a microscope picture which observed the cell array before transportation in example 4 of an experiment.
  • (B) is a microscope picture which observed the cell array after transportation in example 4 of an experiment.
  • (C) is a photograph which shows the result of having detected the living cell after transportation in example 4 of an experiment.
  • (D) is a photograph which shows the result of having detected the dead cell after transportation in example 4 of an experiment.
  • the present invention includes a plurality of tubes disposed in contact so that axial directions are parallel to each other, and a target substance disposed in at least one of the plurality of tubes.
  • the tubes are composed of an anionic hydrogel, and the surface in contact with the plurality of tubes is adhered with an adhesive containing nanoparticles surface-coated with a cationic water-soluble polymer to provide an array .
  • the target substance is not particularly limited, and examples include animal cells, plant cells, cells such as microorganisms, biomolecules such as DNA, RNA, and proteins, tissue fragments derived from living bodies, compounds such as low molecular weight compounds, and the like.
  • the compounds include, for example, pharmaceuticals.
  • the compound may be a library.
  • natural compound libraries, synthetic compound libraries, existing drug libraries, metabolite libraries and the like can be mentioned.
  • the array of this embodiment can be used as a DNA array.
  • the array of the present embodiment can be used as a protein array.
  • an array in which the target substance is a cell may be particularly referred to as a "cell array”.
  • cell aggregates such as spheroids, which are three-dimensional cell structures, are closer to living bodies than two-dimensional cultured cells, and are expected to be further used in drug screening, toxicity tests, and the like.
  • the array of this embodiment can be used as a cell aggregate array, and can be said to be a highly biomimetic three-dimensional tissue array.
  • the array of this embodiment can be used as a chemical substance sensor, means for transporting cells, an efficient drug screening system, etc., and cell tests in places where cell culture is difficult such as in the field It can also be used for
  • FIG. 1 is a schematic view showing the structure of the array of this embodiment.
  • the array 100 includes a plurality of tubes 120 disposed in contact with each other such that axial directions are parallel to each other, and a target substance 110 disposed inside at least one of the plurality of tubes 120.
  • the plurality of tubes 120 are composed of an anionic hydrogel, and the surface 130 in contact with the plurality of tubes 120 is bonded with an adhesive including nanoparticles whose surface is coated with a cationic water-soluble polymer It is done.
  • the axial direction of the pipe means the direction along the central axis of the pipe.
  • the thickness of the array is preferably 800 ⁇ m or less, and more preferably about 200 ⁇ m, from the viewpoint of supplying oxygen and nutrients to the cell.
  • the hydrogel is a three-dimensional network structure containing a large amount of water.
  • an alginate hydrogel can be suitably used as the anionic hydrogel.
  • the alginic acid hydrogel means a hydrogel obtained by forming a salt of alginic acid and a divalent metal ion (such as calcium ion or barium ion).
  • Anionic hydrogels are hydrated in an aqueous solvent such as water, culture medium, buffer solution and the like, so it is difficult to maintain the adhesion between anionic hydrogels in an aqueous solvent.
  • an aqueous solvent such as water, culture medium, buffer solution and the like
  • the inventors previously adhered anionic hydrogels to each other with an adhesive containing nanoparticles (hereinafter sometimes referred to as "CNP") whose surface is coated with a cationic water-soluble polymer. I found that I could do it.
  • CNP adhesive containing nanoparticles
  • the anionic hydrogel adhered by CNP can stably maintain the adhesion state even in an aqueous solvent. Also, CNP has little toxicity to cells.
  • the adhesive containing CNP will be described later.
  • the type of the target substance contained in the array of this embodiment is arbitrary, and may be one type or two or more types.
  • the array of the present embodiment may include the target substance in all of the plurality of tubes. Alternatively, among the plurality of tubes, some tubes may contain the target substance inside, and the remaining tubes may not contain the target substance.
  • the arrangement of the target substance can be arbitrarily controlled. For example, in the example of the array in FIG. 1, the target substances are not arranged in a grid, but the target substances are arranged in a grid by controlling the arrangement of a tube containing the target substance and a pipe not containing the target substance. be able to.
  • the target substance may be a cell.
  • the cells may be cells that respond to the chemical substance.
  • Chemical substance sensors using cells are useful because of their high sensitivity and high selectivity. In recent years, with the development of gene transfer technology, it has become possible to express a receptor for any chemical substance on the cell membrane surface, and the focus on chemical substance sensors using cells has further increased.
  • muscarinic can be reacted with a cell array in which cells expressing a muscarinic acetylcholine receptor are arranged, and calcium influx into cells can be detected.
  • cells may be disposed inside two adjacent tubes among a plurality of tubes, and the tubes around the two tubes may be free of cells.
  • cells arranged inside the adjacent two tubes grow respectively and grow as cell clusters that have been pulled out of the tubes and contact each other to form a contact surface.
  • a set of two adjacent tubes in which cells are arranged may be present in the array as long as they are sufficiently separated from the other sets. That is, the array of the present embodiment may be an array of two adjacent tubes in which cells are respectively disposed.
  • the present invention provides cells in a medium in which cells are placed inside two adjacent tubes of a plurality of tubes, and the tubes surrounding the two tubes do not contain cells.
  • a method of cell culture is provided, which comprises the step of incubating, as a result of which the cells arranged inside the two adjacent tubes proliferate and contact each other to form a contact surface.
  • the cells are not particularly limited.
  • cell lines primary cells, genetically modified cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), tissues Stem cells, cells differentiated from stem cells, cell clusters formed from these cells (spheroids), tissue fragments separated from living bodies, and the like can be mentioned.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • tissues Stem cells cells differentiated from stem cells, cell clusters formed from these cells (spheroids), tissue fragments separated from living bodies, and the like can be mentioned.
  • Nanoparticles refer to particles having an average particle size of less than 1 ⁇ m.
  • the average particle size of CNP is preferably 1 to 100 nm, more preferably 5 to 70 nm, and still more preferably 20 to 50 nm.
  • the anionic hydrogel tends to be more firmly adhered.
  • visible light can be transmitted, and the location of the adhesive can be made transparent.
  • the charge on the surface of CNP is preferably, for example, about 10 to 50 mV.
  • the CNP consists of a cationic water-soluble polymer that covers the surface and a core.
  • the cationic water-soluble polymer may be a polymer having a cationic functional group. Examples of the cationic functional group include, but are not limited to, primary to quaternary amino groups and guanidine groups.
  • the cationic water-soluble polymer is a polymer obtained by polymerizing the above-described monomer having a cationic functional group (cationic monomer).
  • cationic monomers include vinylamine, allylamine, ethyleneimine, 3- (N, N-dimethylaminopropyl)-(meth) acrylamide, 3- (N, N-dimethylaminopropyl)-(meth) acrylate, amino Styrene, 2- (N, N-dimethylaminoethyl)-(meth) acrylamide, 2- (N, N-dimethylaminoethyl)-(meth) acrylate and salts thereof, and diallyldialkylammonium halides and the like It can be mentioned.
  • One of these cationic monomers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the cationic water-soluble polymer may be a polymer obtained by copolymerizing the above-mentioned cationic monomer with another monomer.
  • the other monomer may be a hydrophilic monomer, or may be a hydrophobic monomer depending on the blending ratio.
  • the hydrophilic monomer may be neutral one in an aqueous solvent, and examples thereof include dimethyl acrylamide, acrylic acid and methacrylic acid having polyethylene glycol side chains, and the like. One of these may be used alone, or two or more of these may be used in combination.
  • hydrophobic monomer examples include those shown in (i) to (v) below. One of these may be used alone, or two or more of these may be used in combination.
  • acrylic esters such as methyl acrylate, ethyl acrylate, isopropyl acrylate, n-butyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate;
  • Methacrylates such as methyl methacrylate, ethyl methacrylate, isopropyl methacrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl methacrylate, n-hexyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, lauryl methacrylate, glycidyl methacrylate and the like ;
  • aromatic olefins such as styrene and ⁇ -methylstyrene;
  • vinyl esters such as vinyl acetate;
  • the cationic water-soluble polymer is preferably polyethyleneimine obtained by polymerizing ethyleneimine or a salt thereof.
  • Polyethyleneimine is a polymer obtained by ring-opening polymerization of ethyleneimine by a known method.
  • the salt of polyethylenimine is one in which a part or all of the amino groups in polyethylenimine are neutralized with an acid.
  • the acid used for neutralization may be an inorganic acid or an organic acid.
  • an inorganic acid hydrochloric acid, a sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid etc. are mentioned, for example.
  • the organic acid include acetic acid, formic acid, propionic acid and the like.
  • the material constituting the core is preferably a hydrophobic polymer.
  • a hydrophobic polymer By being a hydrophobic polymer, an emulsion containing spherical CNP can be easily produced by the production method described later.
  • the hydrophobic polymer is a polymer obtained by polymerizing a hydrophobic monomer.
  • the hydrophobic monomer may be one having a solubility in water at 25 ° C. of 10 g / dL or less, and specifically, those described above as the hydrophobic monomer which can be contained in the cationic water-soluble polymer constituent material It can be mentioned.
  • the hydrophobic polymer may be a polymer obtained by copolymerizing the above-mentioned hydrophobic monomer and the crosslinkable monomer.
  • the crosslinkable monomer include ethylene glycol di (meth) acrylate, hexanediol di (meth) acrylate, divinyl benzene, methylene bis acrylamide, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, tetraallyl ethane and the like. One of these may be used alone, or two or more of these may be used in combination.
  • the hydrophobic polymer is preferably polystyrene obtained by polymerizing styrene.
  • CNP can be obtained by emulsion polymerization of the above-mentioned cationic monomer and hydrophobic monomer in an aqueous solvent in the presence of a radical polymerization initiator.
  • the blending amount of the cationic monomer with respect to the mass of the hydrophobic monomer is preferably 0.5 to 30% by mass or less, more preferably 0.5 to 15% by mass or less, and 0. More preferably, it is 5 to 5% by mass or less.
  • the compounding amount of the cationic monomer is the above lower limit value or more, CNP dispersed in the aqueous solvent can be obtained more stably.
  • the blending amount of the cationic monomer is less than or equal to the above upper limit value, it tends to be easy to obtain CNP which is appropriately positively charged.
  • radical polymerization initiator examples include those shown in the following (i) to (v). One of these may be used alone, or two or more of these may be used in combination.
  • oil-soluble azo compounds such as 2,2'-azobisisobutyronitrile, 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile);
  • organic peroxides such as benzoyloxy peroxide, ditertiary butyl peroxide and the like;
  • inorganic peroxides such as potassium persulfate
  • the radical polymerization initiator is preferably one represented by the above (ii), and 2,2′-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride, 2,2′-azobis [2- (2-imidazoline— It is preferable that it is 2-yl) propane] or a hydrochloride thereof, or 2,2′-azobis [2-methyl-N- (2-hydroxyethyl) propionamide].
  • the compounding amount of the radical polymerization initiator can be, for example, 0.001 to 2% by mass or less based on the mass of the hydrophobic monomer.
  • an aqueous solvent used in the emulsion polymerization any solvent containing water as a main component may be used, and examples thereof include distilled water, ion exchanged water, tap water, industrial water and the like.
  • soap free emulsion polymerization the method which does not use the emulsifier of low molecular weight called soap free emulsion polymerization as emulsion polymerization.
  • soap free emulsion polymerization the method which does not use the emulsifier of low molecular weight called soap free emulsion polymerization as emulsion polymerization.
  • the polymer can form fine particles in an aqueous solvent, and thus CNP can be easily obtained.
  • the total blending amount of the cationic water-soluble polymer and the hydrophobic polymer with respect to the total mass of the polymerization system is usually 1 to 70% by mass or less, preferably 10 to 60% by mass or less, It is more preferable that it is 60 mass% or less.
  • the polymerization temperature and time are selected depending on the polymerizability of the monomer, the decomposition temperature and the half life of the initiator, and the like.
  • the polymerization temperature can be usually 30 to 130 ° C., preferably 50 to 100 ° C.
  • the polymerization time can be usually 1 to 10 hours.
  • the adhesive containing CNP may be in powder form or in liquid form. Moreover, the adhesive containing CNP may contain other components to the extent that the cationic property of CNP is not impaired in addition to CNP. Examples of other components include stabilizers, thickeners, preservatives and the like.
  • the adhesive containing CNP When the adhesive containing CNP is in liquid form, it may contain, for example, an aqueous solvent.
  • the aqueous solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and physiological saline having a buffer effect.
  • Examples of the buffered saline include phosphate buffered saline (PBS), Tris buffered saline (TBS), HEPES buffered saline and the like.
  • a water-soluble organic solvent may be contained.
  • the water-soluble organic solvent include lower alcohols, acetone, dioxane, ethylene glycol and the like.
  • the lower alcohol may be a monohydric alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and specific examples thereof include methanol, ethanol and propanol.
  • the present invention provides a method for alive transport of unfrozen cells, comprising the step of transporting a container containing the above-described cell array and culture medium. As described later in the Examples, non-freezed cells can be transported alive by the method of the present embodiment.
  • the cell array is immobilized on the substrate during the transport period.
  • the substrate may be glass, resin, metal or the like, but transparent glass or resin is easy to handle from the viewpoint of easy observation with a microscope.
  • the above-described CNP can be used to immobilize the cell array on the substrate.
  • the container containing the cell array and the culture medium With a heat insulating material or the like during the transport period to keep the temperature of the cell array and the culture medium at 33 to 36.degree.
  • the present invention relates to a method for producing an array, wherein a plurality of fibers containing a target substance are brought into contact with each other in a tube made of anionic hydrogel so that axial directions thereof are parallel to each other. Placing and bonding with an adhesive comprising nanoparticles surface coated with a cationic water soluble polymer to obtain a bundle of fibers, embedding the bundle in a support, and supporting the bundle Cutting along with the material to obtain a section, wherein the section is an array.
  • the above-described array can be manufactured by the manufacturing method of this embodiment.
  • a fiber is a fibrous structure that contains a target substance inside a tube made of anionic hydrogel.
  • the anionic hydrogel is the same as described above.
  • the target substance is also not particularly limited, and is the same as described above.
  • the method of producing the fiber is not particularly limited, it can be conveniently produced, for example, by using a dual coaxial microfluidic device as shown in FIG.
  • Microfluidic devices that can split and inject two fluids coaxially into the core and the shell are, for example, Wonje Jeong, et al., Hydrodynamic microfabrication via "on the fly” photopolymerization of microscale fibers and tubes. , Lab Chip, 2004, 4, 576-580. 1 is also specifically described.
  • FIG. 2 is a schematic view illustrating an example of a method of manufacturing the fiber 300.
  • the target substance is cells, and a mixture of medium, cells and extracellular matrix (hereinafter referred to as "cell mixture") is used as the material of the core, and sodium alginate solution before crosslinking is used as the material of the shell.
  • cell mixture a mixture of medium, cells and extracellular matrix
  • sodium alginate solution before crosslinking is used as the material of the shell.
  • Matrigel, collagen gel or the like can be used as the extracellular matrix.
  • the cell mixture is introduced and ejected from the inlet 210 of the microfluidic device 200.
  • the sodium alginate solution before crosslinking is introduced and ejected from the introduction port 220 of the microfluidic device 200.
  • a calcium chloride solution is introduced and ejected from the inlet 230 of the microfluidic device 200.
  • the sodium alginate solution in the shell portion is gelated, and a fiber in which the core portion 310 is a hydrogel containing cells and the shell portion 320 is an alginate hydrogel can be manufactured.
  • the injection speed of the solution at the inlets 210 and 220 is not particularly limited, but may be about 10 to 500 ⁇ L / min when the diameter of the microfluidic device 200 is about 50 ⁇ m to 2 mm. By adjusting the injection speed of the solution at the inlets 210 and 220, the diameter of the core portion and the coating thickness of the shell portion can be appropriately adjusted.
  • the injection speed of the solution at the inlet 230 is not particularly limited, but may be, for example, about 1 to 10 mL / min.
  • a hydrogel containing no target substance may be used instead of the above-mentioned cell mixture.
  • the target substance is a substance other than cells
  • a mixture of the target substance and a hydrogel material suitable for the target substance may be used as the material of the core portion.
  • the method of producing the fiber is not limited to the one described above.
  • the target substance to be contained in the fiber may be valuable and only a small amount can be prepared.
  • it is effective to manufacture the fiber by placing the target substance through a funnel type device inside a tube made of anionic hydrogel. This can reduce the amount of target material needed to make the fiber.
  • FIG. 3 is a schematic view for explaining the manufacturing method of the present embodiment.
  • a fiber bundle is manufactured.
  • a plurality of the above-described fibers 300 are disposed in contact with each other such that the axial directions are parallel to each other.
  • it is bonded with an adhesive containing CNP described above to obtain a bundle 400 of fibers 300.
  • a hydrogel fiber containing no target substance is used instead of the part of the fibers 300.
  • the bundle 400 may be manufactured.
  • the fiber bundle 400 is embedded in the support 500. Cutting the bundle 400 directly can not cut out the array well. By embedding the bundle 400 in the support member 500 and cutting it together with the support member, the fibers constituting the bundle 400 can be cut perpendicularly to the axial direction. Also, it is possible to reliably cut the layer containing the target substance to obtain an array.
  • the quotient (storage elastic modulus / loss elastic modulus) obtained by dividing the storage elastic modulus of the support member 500 by the loss elastic modulus is preferably greater than 10, and the storage elastic modulus is 100 kPa or less.
  • the quotient (storage elastic modulus / loss elastic modulus) obtained by dividing the storage elastic modulus of the support material 500 by the loss elastic modulus is larger than 10 and the storage elastic modulus is 100 kPa or less. It tends to be able to cut out the array correctly.
  • the storage elastic modulus and loss elastic modulus of the support member 500 may be subjected to a dynamic viscoelasticity test using a commercially available rheometer, and a value measured at 1 Hz may be used.
  • the bundle 400 is cut together with the support 500 to obtain a section.
  • a cutter 600 obtained by stacking two microtome blades 610 is pressed along the cutting line 510 of the support 500, and the bundle 400 is cut together with the support 500 to obtain a section.
  • This section is an array.
  • the thickness of the array is 200 ⁇ m.
  • alginic acid hydrogel which is the material of alginic acid hydrogel
  • mannuronic acid the concentration of sodium alginate
  • calcium ion five types of alginic acid hydrogels of GEL1 to 5 are prepared and used as a support material, Embedded the bundle.
  • FIG. 4 is a graph showing the measurement results of the storage modulus (G ') and the loss modulus (G' ') of each support material.
  • the quotient of the storage modulus (G ') of the support material divided by the loss modulus (G' ') is greater than 10 (G' / G ''> 10), and the storage modulus (G ') It has become clear that the array can be cut out correctly if the)) is less than or equal to 100 kPa (G ' ⁇ 100 kPa).
  • Fluorescent bead array (Preparation of array) ⁇ Fluorescent bead array >> First, production of a fluorescent bead array was attempted using fluorescent beads as target substances. As fluorescent beads, FluoSpheres Carboxylate-modified microspheres red, yellow-green and blue (all are Thermo Fisher Scientific Inc.) were used.
  • a fiber containing each fluorescent bead was produced. Subsequently, the produced fibers were bonded with the above-described adhesive containing CNP to produce a bundle. Subsequently, the bundle was embedded in a support and cut with a double-layered microtome blade to obtain a fluorescent bead array.
  • FIG. 5 is a photograph of the produced fluorescent bead array observed with a fluorescence microscope. As a result, it was confirmed that a fluorescent bead array observable with a microscope could be produced.
  • FIG. 6 is the photograph which observed several fluorescence bead array produced by the same method by a fluorescence microscope.
  • the lower left in FIG. 6 shows an enlarged photograph of one of the fluorescent bead arrays.
  • a large number of uniform fluorescent bead arrays can be produced by the method of the present experimental example.
  • a cell array was prepared in the same manner as described above except that HEK293T cells, which are human embryonic kidney-derived cell lines, were used instead of fluorescent beads. Subsequently, it was examined whether the cells in the prepared cell array were alive or not.
  • the cell array is a live cell staining reagent, calcein AM (Takara Bio Inc.), a dead cell staining reagent ethidium bromide (Takara Bio Inc.), and a nucleus staining reagent Hoechst 33342. (Thermo Fisher Scientific) was stained and observed with a fluorescence microscope.
  • FIGS. 7 (a) to 7 (d) are photographs of the cell array observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 7 (a) is a photograph showing the result of detection of living cells.
  • FIG. 7 (b) is a photograph showing the result of detecting dead cells.
  • FIG. 7 (c) is a photograph showing the result of detecting a nucleus.
  • FIG. 7 (d) is a photograph obtained by merging FIGS. 7 (a) to 7 (c). As a result, it was confirmed that the cells in the cell array were alive.
  • muscarinic receptor human muscarinic acetylcholine receptor
  • FIG. 8 (a) is a fluorescence micrograph of the state in which the calcium probe emits fluorescence in response to muscarinic acid added to the medium.
  • FIG. 8 (b) is a graph showing the results of measuring the fluorescence intensity of the calcium probe over time after the addition of muscarinic.
  • the box for thermal insulation transport was transported by courier service, and reciprocated between Kanagawa Prefecture and Kyoto Prefecture. After 2 days of transport, the status of the cell array was assessed.
  • the cell array after transport is stained with a viable cell staining reagent, Calcein AM (Takara Bio Inc.) and a dead cell staining reagent with ethidium bromide (Takara Bio Inc.), and observed with a fluorescent microscope did.
  • FIGS. 9 (a) to 9 (d) are photographs of the cell array observed with a microscope.
  • FIG. 9 (a) is a photomicrograph of the cell array before transport.
  • FIG. 9 (b) is a photomicrograph of observing the cell array after transport.
  • FIG. 9 (c) is a photograph showing the result of detection of live cells after transport.
  • FIG. 9 (d) is a photograph showing the result of detection of dead cells after transport.
  • a new array can be provided.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 ... Array, 120 ... Tube, 110 ... Target substance, 130 ... Surface, 200 ... Microfluidic device, 210, 220, 230 ... Introduction port, 310 ... Core part, 320 ... Shell part, 300 ... Fiber, 400 ... Bundle, 500 ... support material, 510 ... cutting line, 610 ... blade, 600 ... cutter.

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Abstract

軸方向が互いに平行になるように接して配置された複数の管と、前記複数の管の少なくとも１つの内部に配置された対象物質と、を含み、前記複数の管はアニオン性ハイドロゲルで構成されており、前記複数の管同士が接する面は、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着されている、アレイ。

Description

アレイ及びその使用
　本発明は、アレイ及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、アレイ、細胞培養方法、非凍結状態の細胞を生きたまま輸送する方法、及び、アレイの製造方法に関する。本願は、２０１７年１２月２３日に、米国に仮出願された米国特許第６２／６１０，１６０号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アレイは、基板上に対象物質を配置したものである。例えば、細胞アレイ、ＤＮＡアレイ、タンパク質アレイ等が知られている。例えば、特許文献１には、試験化合物のスクリーニング、毒物学アッセイ、単一細胞分化研究、細胞機能研究等に細胞アレイを利用することが記載されている。特許文献１にはまた、化学修飾されたガラススライドの上面に複数の独立したスポットがスポットされ、各スポットがマトリックス底面層及びマトリックス表面層を含み、マトリックス表面層が細胞を含む、細胞アレイが記載されている。
特表２００９－５１３１６０号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の細胞アレイは、製造工程において細胞をスポットする必要がある。このため、例えば、複数種類の細胞からなる細胞アレイを作製する場合に、１つのスポットに異種細胞が混合する場合がある。また、スフェロイド等の細胞凝集塊のアレイを作製する場合、スフェロイドができるまでに長時間を必要とする。本発明は、新たなアレイを提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］軸方向が互いに平行になるように接して配置された複数の管と、前記複数の管の少なくとも１つの内部に配置された対象物質と、を含み、前記複数の管はアニオン性ハイドロゲルで構成されており、前記複数の管同士が接する面は、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着されている、アレイ。
［２］前記複数の管のうち、一部の管は内部に対象物質を含み、残部の管は対象物質を含まない、［１］に記載のアレイ。
［３］前記対象物質が細胞である、［１］又は［２］に記載のアレイ。
［４］前記細胞が化学物質に応答する細胞を含む、［３］に記載のアレイ。
［５］前記複数の管のうち、隣接する２個の管の内部に細胞が配置され、前記２個の管の周囲の管が細胞を含まない、［３］又は［４］に記載のアレイ。
［６］［５］に記載のアレイを培地中でインキュベートする工程を含み、その結果、前記隣接する２個の管の内部に配置された細胞がそれぞれ増殖して互いに接触し、接触面を形成する、細胞培養方法。
［７］非凍結状態の細胞を生きたまま輸送する方法であって、［３］～［５］のいずれかに記載のアレイ及び培地を収容した容器を輸送する工程を含む方法。
［８］アレイの製造方法であって、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に対象物質を含むファイバを、軸方向が互いに平行になるように複数個接触させて配置し、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着して、ファイバのバンドルを得る工程と、前記バンドルを支持材に包埋する工程と、前記バンドルを前記支持材とともに切断して切片を得る工程と、を含み、前記切片がアレイである、製造方法。
［９］前記支持材の貯蔵弾性率を損失弾性率で割った商（貯蔵弾性率／損失弾性率）が１０より大きく、且つ前記貯蔵弾性率が１００ｋＰａ以下である、［８］に記載の製造方法。
［１０］前記ファイバは、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に、漏斗型デバイスを通して対象物質を入れる工程により製造される、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］前記対象物質が細胞である、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、新たなアレイを提供することができる。
アレイの構造の一例を示す模式図である。 ファイバの製造方法の一例を説明する模式図である。 アレイの製造方法の一例を説明する模式図である。 実験例１の結果を示すグラフである。 実験例２において、蛍光ビーズアレイを蛍光顕微鏡で観察した写真である。 実験例２において、蛍光ビーズアレイを蛍光顕微鏡で観察した写真である。 （ａ）は、実験例２において細胞アレイ中の生細胞を検出した結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例２において細胞アレイ中の死細胞を検出した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例２において細胞アレイ中の核を検出した結果を示す写真である。（ｄ）は、（ａ）～（ｃ）をマージした写真である。 （ａ）は、実験例３においてカルシウムプローブの蛍光を撮影した蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例３においてムスカリンの添加後のカルシウムプローブの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例４において輸送前の細胞アレイを観察した顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例４において輸送後の細胞アレイを観察した顕微鏡写真である。（ｃ）は、、実験例４において輸送後の生細胞を検出した結果を示す写真である。（ｄ）は、実験例４において輸送後の死細胞を検出した結果を示す写真である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［アレイ］
　１実施形態において、本発明は、軸方向が互いに平行になるように接して配置された複数の管と、前記複数の管の少なくとも１つの内部に配置された対象物質と、を含み、前記複数の管はアニオン性ハイドロゲルで構成されており、前記複数の管同士が接する面は、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着されている、アレイを提供する。
　対象物質としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、微生物等の細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子、生体由来の組織片、低分子化合物等の化合物等が挙げられる。
　化合物としては例えば医薬が挙げられる。化合物はライブラリであってもよい。例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
　例えば、対象物質がＤＮＡである場合、本実施形態のアレイをＤＮＡアレイとして利用することができる。同様に、対象物質がタンパク質である場合、本実施形態のアレイをタンパク質アレイとして利用することができる。以下、対象物質が細胞であるアレイを特に「細胞アレイ」という場合がある。
　例えば、３次元細胞構造であるスフェロイド等の細胞凝集塊は２次元培養細胞に比べてより生体に近いことから、薬剤スクリーニングや毒性試験等において今後更に使用されることが期待されている。本実施形態のアレイは、細胞凝集塊アレイとして利用することができ、生体模倣性の高い３次元組織アレイであるといえる。後述するように、本実施形態のアレイは、化学物質センサ、細胞の輸送手段、効率的な薬剤スクリーニング系等として利用することができ、また、野外等細胞培養が困難な場所での細胞試験等に利用することもできる。
　図１は、本実施形態のアレイの構造を示す模式図である。図１に示すように、アレイ１００は、軸方向が互いに平行になるように接して配置された複数の管１２０と、前記複数の管１２０の少なくとも１つの内部に配置された対象物質１１０と、を含み、前記複数の管１２０はアニオン性ハイドロゲルで構成されており、前記複数の管１２０同士が接する面１３０は、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着されている。本明細書において、管の軸方向とは、管の中心軸に沿った方向を意味する。
　対象物質が細胞である場合、細胞に酸素や栄養分を供給する観点から、アレイの厚さは８００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ程度であることがより好ましい。
　ハイドロゲルとは、多量の水を含んだ３次元の網目構造体である。本実施形態のアレイにおいて、アニオン性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ハイドロゲルを好適に用いることができる。アルギン酸ハイドロゲルとは、アルギン酸と二価の金属イオン（カルシウムイオンやバリウムイオン等）とが塩を形成して得られるハイドロゲルを意味する。
　アニオン性ハイドロゲルは、水、培地、緩衝液等の水系溶媒中において水和するため、水系溶媒中でアニオン性ハイドロゲル同士の接着状態を保つことは困難である。これに対し、発明者らは、以前に、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子（以下、「ＣＮＰ」という場合がある。）を含む接着剤で、アニオン性ハイドロゲル同士を接着することができることを見出した。ＣＮＰで接着したアニオン性ハイドロゲルは、水系溶媒中でも安定に接着状態を維持することができる。また、ＣＮＰは細胞に対する毒性がほとんどない。ＣＮＰを含む接着剤については後述する。
　本実施形態のアレイが含む対象物質の種類は任意であり、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。また、本実施形態のアレイは、複数の管のすべてに対象物質を含んでいてもよい。あるいは、複数の管のうち、一部の管は内部に対象物質を含み、残部の管は対象物質を含まなくてもよい。対象物質を含む管と対象物質を含まない管の配置を制御することにより、対象物質の配置を任意に制御することができる。例えば、図１のアレイの例では、対象物質は格子状に配置されていないが、対象物質を含む管と対象物質を含まない管の配置を制御することにより、対象物質を格子状に配置することができる。
　本実施形態のアレイにおいて、対象物質が細胞であってもよい。また、細胞の少なくとも一部が化学物質に応答する細胞であってもよい。細胞を用いた化学物質センサはその感度の高さと選択性の高さから有用である。近年、遺伝子導入技術の発達により、細胞膜表面に任意の化学物質に対する受容体を発現させることが可能になり、細胞を用いた化学物質センサへの注目は更に高まっている。
　実施例において後述するように、例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現させた細胞を配置した細胞アレイにムスカリンを反応させ、細胞内部へのカルシウムの流入を検出することができる。
　本実施形態のアレイは、複数の管のうち、隣接する２個の管の内部に細胞が配置され、前記２個の管の周囲の管が細胞を含まないものであってもよい。このようなアレイを培地中でインキュベートすると、隣接する２個の管の内部に配置された細胞がそれぞれ増殖して管からはみ出した細胞塊として成長し、互いに接触して接触面を形成する。内部に細胞が配置された、隣接する２個の管の組は、他の組と十分離れている限り、アレイ内に複数存在していてもよい。すなわち、本実施形態のアレイは、内部にそれぞれ細胞が配置された、隣接する２個の管のアレイであってもよい。
　生体の発生において、異なる種類の幹細胞同士が接触面を形成し、相互作用により器官を形成する場合があることが知られている。このような発生をインビトロで再現することは困難であるが、このようなアレイを用いることにより、異なる細胞同士に接触面を形成させ、解析することが可能である。
　したがって、１実施形態において、本発明は、複数の管のうち、隣接する２個の管の内部に細胞が配置され、前記２個の管の周囲の管が細胞を含まないアレイを培地中でインキュベートする工程を含み、その結果、前記隣接する２個の管の内部に配置された細胞がそれぞれ増殖して互いに接触し、接触面を形成する、細胞培養方法を提供する。
（細胞）
　本実施形態のアレイが細胞を含む場合、細胞としては、特に限定されず、例えば、細胞株、初代細胞、遺伝子改変細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｉＰＳ細胞）、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＥＳ細胞）、組織幹細胞、幹細胞から分化誘導した細胞、これら細胞から形成された細胞塊（スフェロイド）、生体から分離された組織片等が挙げられる。
（ＣＮＰを含む接着剤）
　カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子（以下、「ＣＮＰ」という場合がある。）を含む接着剤について説明する。ナノ粒子とは、平均粒子径が１μｍ未満である粒子をいう。ＣＮＰの平均粒子径は、１～１００ｎｍであることが好ましく、５～７０ｎｍであることがより好ましく、２０～５０ｎｍであることがさらに好ましい。平均粒子径が上記範囲であることにより、アニオン性ハイドロゲルをより強固に接着できる傾向にある。また、可視光を通すことができ、接着剤の存在部位を透明にすることができる。
　また、ＣＮＰの表面の電荷は、例えば１０～５０ｍＶ程度であることが好ましい。
　ＣＮＰは、表面を被覆するカチオン性水溶性ポリマーと、コアとからなる。カチオン性水溶性ポリマーは、カチオン性官能基を有するポリマーであればよい。カチオン性官能基としては、例えば、第１級～第４級アミノ基、グアニジン基等が挙げられ、これらに限定されない。
　カチオン性水溶性ポリマーは、上記カチオン性官能基を有するモノマー（カチオン性モノマー）を重合させて得られる重合体である。カチオン性モノマーとしては、例えば、ビニルアミン、アリルアミン、エチレンイミン、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル）－（メタ）アクリルアミド、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル）－（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル）－（メタ）アクリルアミド、２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル）－（メタ）アクリレート、及びそれらの塩、並びに、ハロゲン化ジアリルジアルキルアンモニウム等が挙げられる。これらのカチオン性モノマーは、１種を単独用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　カチオン性水溶性ポリマーは、上記カチオン性モノマーと、他のモノマーとを共重合させたポリマーであってもよい。他のモノマーとしては、親水性モノマーであってもよく、配合割合によっては、疎水性モノマーであってもよい。
　親水性モノマーとしては、水系溶媒中で中性のものであればよく、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　疎水性モノマーとしては、例えば、以下の（ｉ）～（ｖ）に示すものが挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　（ｉ）アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸－ｎ－ブチル、アクリル酸－２－エチルヘキシル等のアクリル酸エステル類；
　（ｉｉ）メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸－ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸－ｎ－ヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸グリシジル等のメタクリル酸エステル類；
　（ｉｉｉ）スチレン、α－メチルスチレン等の芳香族オレフィン；
　（ｉｖ）酢酸ビニル等のビニルエステル；
　（ｖ）アクリロニトリル、メタアクリロニトリル等のビニルニトリル。
　カチオン性水溶性ポリマーは、中でも、エチレンイミンを重合させて得られるポリエチレンイミン又はその塩であることが好ましい。ポリエチレンイミンは、エチレンイミンを公知の方法で開環重合して得られる重合体である。また、ポリエチレンイミンの塩は、ポリエチレンイミン中のアミノ基の一部又は全部が酸で中和されたものである。中和に使用する酸は、無機酸であってもよく、有機酸であってもよい。無機酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸等が挙げられる。
　ＣＮＰにおいて、コアを構成する材料は、疎水性ポリマーであることが好ましい。疎水性ポリマーであることにより、後述に示す製造方法により球状のＣＮＰを含むエマルションを簡便に製造することができる。疎水性ポリマーは、疎水性モノマーを重合させて得られる重合体である。疎水性モノマーは、２５℃での水への溶解度が１０ｇ／ｄＬ以下のものであればよく、具体的には、カチオン性水溶性ポリマー構成材料に含むことができる疎水性モノマーとして上述したものが挙げられる。
　また、疎水性ポリマーは、上記疎水性モノマーと架橋性モノマーとを共重合させたポリマーであってもよい。架橋性モノマーとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラアリルエタン等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　疎水性ポリマーは、中でも、スチレンを重合させて得られるポリスチレンであることが好ましい。
　ＣＮＰは、上述したカチオン性モノマーと疎水性モノマーとを水系溶媒中でラジカル重合開始剤の存在下において乳化重合させることで得ることができる。乳化重合において、上記疎水性モノマーの質量に対するカチオン性モノマーの配合量は、０．５～３０質量％以下であることが好ましく、０．５～１５質量％以下であることがより好ましく、０．５～５質量％以下であることがさらに好ましい。カチオン性モノマーの配合量が上記下限値以上であることにより、より安定して水系溶媒に分散したＣＮＰを得ることができる。一方、カチオン性モノマーの配合量が上記上限値以下であることにより、適度に正の電荷を帯びたＣＮＰを得やすい傾向にある。
　ラジカル重合開始剤としては、例えば、以下の（ｉ）～（ｖ）に示すものが挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　（ｉ）２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル等の油溶性アゾ化合物；
　（ｉｉ）２，２’－アゾビス（２－アミ ジノプロパン）又はその塩酸塩、４，４’－アゾビス（４－シアノバレリン酸）又はそのアルカリ金属塩、２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］又はその塩酸塩、２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエトル）プロピオンアミド］等の水溶性アゾ化合物；
　（ｉｉｉ）ベンゾイルオキシパーオキサイド、ジターシャリイブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；
　（ｉｖ）過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の無機過酸化物；
　（ｖ）：上記（ｉｖ）と還元性物質（亜硫酸ナトリウム、ジメチルアミノエタノール、ジメチルアミノ安息香酸等）とを組み合わせたレドックス開始剤
　ラジカル重合開始剤は、中でも、上記（ｉｉ）に示すものであることが好ましく、２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）塩酸塩、２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］若しくはその塩酸塩、又は、２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエトル）プロピオンアミド］であることが好ましい。
　乳化重合において、上記疎水性モノマーの質量に対するラジカル重合開始剤の配合量は、例えば０．００１～２質量％以下とすることができる。また、乳化重合において用いられる水系溶媒としては、水を主成分とするものであればよく、例えば、蒸留水、イオン交換水、水道水、工業用水等が挙げられる。
　また、乳化重合としては、ソープフリー乳化重合と呼ばれる低分子の乳化剤を使用しない方法であることが好ましい。この方法では、カチオン性水溶性ポリマーと、疎水性ポリマーとの親水性及び疎水性のバランスをとることにより、ポリマーが水系溶媒中で微粒子を形成するため、簡便にＣＮＰを得ることができる。
　乳化重合において、重合系全体の質量に対するカチオン性水溶性ポリマー及び疎水性ポリマーの合計配合量は、通常、１～７０質量％以下であり、１０～６０質量％以下であることが好ましく、２０～６０質量％以下であることがより好ましい。
　また、ＣＮＰを製造する系としては、例えばバッチ式重合系、連続チューブ式重合系、半連続重合系等の方法が挙げられる。バッチ式重合系の場合、原料を仕込む手順としては以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）に示すもの等が挙げられ、これらに限定されない。
　（ｉ）カチオン性モノマー、疎水性モノマー及びラジカル重合開始剤を一括して反応槽に仕込んで重合を行う方法；
　（ｉｉ）カチオン性モノマー、疎水性モノマー及びラジカル重合開始剤をそれぞれ個別に滴下しつつ重合する方法；
　（ｉｉｉ）疎水性モノマー及びラジカル重合開始剤の混合物を（カチオン性モノマー）を含む水中に滴下しつつ重合する方法
　重合温度と時間は、モノマーの重合性、並びに、開始剤の分解温度及び半減期等により選択される。重合温度は、通常３０～１３０℃とすることができ、５０～１００℃であることが好ましい。重合時間は、通常１～１０時間とすることができる。
　ＣＮＰを含む接着剤は、粉末状であってもよく、液体状であってもよい。また、ＣＮＰを含む接着剤は、ＣＮＰ以外に、ＣＮＰのカチオン性を損なわない程度に、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、安定剤、増粘剤、防腐剤等が挙げられる。
　ＣＮＰを含む接着剤が液体状である場合、例えば、水系溶媒を含んでいてもよい。水系溶媒としては、特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝効果のある生理食塩水等が挙げられる。前記緩衝効果のある生理食塩水としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が挙げられる。
　また、水系溶媒以外に、水溶性の有機溶剤を含んでいていてもよい。水溶性の有機溶剤としては、例えば、低級アルコール、アセトン、ジオキサン、エチレングリコール等が挙げられる。前記低級アルコールとしては、炭素数１～３の１価のアルコールであればよく、具体的には、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
［非凍結状態の細胞を生きたまま輸送する方法］
　１実施形態において、本発明は、非凍結状態の細胞を生きたまま輸送する方法であって、上述した細胞アレイ及び培地を収容した容器を輸送する工程を含む方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の方法により、非凍結状態の細胞を生きたまま輸送することができる。
　輸送期間中、細胞アレイは基板上に固定されていることが好ましい。基板は、ガラスであってもよく、樹脂であってもよく、金属等であってもよいが、顕微鏡で観察しやすい観点から、透明なガラス又は樹脂が扱いやすい。細胞アレイの基板上への固定には、上述したＣＮＰを利用することができる。
　輸送期間中、細胞アレイ及び培地を収容した容器を断熱材等で包み、細胞アレイ及び培地の温度を、３３～３６℃に保つことが好ましい。また、細胞アレイ及び培地を収容した容器とともにＣＯ２ガス発生剤を同包し、ＣＯ２濃度を細胞培養環境に保つことが好ましい。少なくとも２日間の輸送については、細胞を生きたまま且つ細胞の機能を保ったまま輸送できることが確認されている。
［アレイの製造方法］
　１実施形態において、本発明は、アレイの製造方法であって、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に対象物質を含むファイバを、軸方向が互いに平行になるように複数個接触させて配置し、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着して、ファイバのバンドルを得る工程と、前記バンドルを支持材に包埋する工程と、前記バンドルを前記支持材とともに切断して切片を得る工程と、を含み、前記切片がアレイである、製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、上述したアレイを製造することができる。
（ファイバ）
　まず、対象物質を含むファイバの製造方法を説明する。ファイバは、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に対象物質を含む繊維状の構造体である。アニオン性ハイドロゲルについては上述したものと同様である。また、対象物質も特に限定されず、上述したものと同様である。
　ファイバの製造方法は特に限定されないが、例えば、図２に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ）を用いることにより簡便に製造することができる。２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置は、例えば、Wonje Jeong, et al., Hydrodynamic microfabrication via "on the fly" photopolymerization of microscale fibers and tubes, Lab Chip, 2004, 4, 576-580 のＦｉｇ．１にも具体的に説明されている。
　図２は、ファイバ３００の製造方法の一例を説明する模式図である。ここでは、対象物質が細胞であり、コア部の材料に培地、細胞及び細胞外マトリックスの混合液（以下、「細胞混合液」という。）を用い、シェル部の材料に架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を用いた場合について説明する。細胞外マトリックスとしては、マトリゲル、コラーゲンゲル等を利用することができる。
　まず、マイクロ流体装置２００の導入口２１０から、細胞混合液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置２００の導入口２２０から、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置２００の導入口２３０から、塩化カルシウム溶液を導入して射出する。すると、シェル部のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、コア部３１０が細胞を含むハイドロゲルであり、シェル部３２０がアルギン酸ハイドロゲルであるファイバを製造することができる。
　導入口２１０及び２２０における溶液の射出速度は特に限定されないが、マイクロ流体装置２００の口径が５０μｍ～２ｍｍ程度である場合には、１０～５００μＬ／分程度であってもよい。導入口２１０及び２２０における溶液の射出速度を調節することにより、コア部の直径及びシェル部の被覆厚みを適宜調節できる。導入口２３０における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば１～１０ｍＬ／分程度であってもよい。
　また、対象物質を含まないハイドロゲルファイバを製造する場合には、上述した細胞混合液の代わりに対象物質を含まないハイドロゲルを用いればよい。また、対象物質が細胞以外の物質である場合、コア部の材料として、当該対象物質及び当該対象物質に適したハイドロゲル材料の混合物を用いればよい。
　ファイバの製造方法は上述したものに限られない。例えば、ファイバに含ませる対象物質が貴重で少量しか用意できない場合がある。このような場合には、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に、漏斗型デバイスを通して対象物質を入れる工程により、ファイバを製造することが有効である。これにより、ファイバの作製に必要な対象物質の量を減らすことができる。
（ファイバのバンドル）
　図３は、本実施形態の製造方法を説明する模式図である。まず、ファイバのバンドルを製造する。図３に示すように、まず、上述したファイバ３００を、軸方向が互いに平行になるように複数個接触させて配置する。続いて、上述したＣＮＰを含む接着剤で接着してファイバ３００のバンドル４００を得る。
　ここで、一部の管が内部に対象物質を含み、残部の管は対象物質を含まないアレイを製造する場合には、一部のファイバ３００の代わりに対象物質を含まないハイドロゲルファイバを用いてバンドル４００を製造すればよい。
（支持材）
　続いて、ファイバのバンドル４００を支持材５００に包埋する。バンドル４００を直接切断しても、うまくアレイを切り出すことができない。バンドル４００を支持材５００に包埋し、支持材とともに切断することにより、バンドル４００を構成するファイバを、軸線方向に対して垂直に切断することが可能になる。また、対象物質を含む層を確実に切断し、アレイを得ることが可能になる。
　支持材５００の貯蔵弾性率を損失弾性率で割った商（貯蔵弾性率／損失弾性率）は、１０より大きく、且つ前記貯蔵弾性率が１００ｋＰａ以下であることが好ましい。
　実施例において後述するように、支持材５００の貯蔵弾性率を損失弾性率で割った商（貯蔵弾性率／損失弾性率）が１０より大きく、且つ前記貯蔵弾性率が１００ｋＰａ以下である場合に、アレイを正確に切り出すことができる傾向にある。
　支持材５００の貯蔵弾性率及び損失弾性率は、市販のレオメーターを用いて動的粘弾性試験を行い、１Ｈｚで測定された値を用いるとよい。
（アレイの切り出し）
　続いて、バンドル４００を支持材５００とともに切断して切片を得る。例えば、ミクロトーム用のブレード６１０を２枚重ねたカッター６００を、支持材５００の切断線５１０に沿って押し当て、バンドル４００を支持材５００とともに切断することにより、切片が得られる。この切片がアレイである。カッター６００において、２枚のブレード６１０の間の距離が２００μｍである場合、アレイの厚さは２００μｍとなる。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（支持材の検討）
　上述したように、ファイバのバンドルを切断する時には支持材に包埋する必要がある。本実験例では、支持材の検討を行った。支持材としては、アルギン酸ハイドロゲルを使用した。
　アルギン酸ハイドロゲルの材料であるグルコン酸の割合、マンヌロン酸の割合、アルギン酸ナトリウムの濃度、カルシウムイオンの濃度を変化させて、ＧＥＬ１～５の５種類のアルギン酸ハイドロゲルを作製して支持材とし、ファイバのバンドルを包埋した。
　続いて、レオメーター（型式「ＭＣＲ３０２」、アントンパール社）を用いて、各支持材の動的粘弾性試験を行い、貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）を１Ｈｚで測定した。図４は、各支持材の貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）の測定結果を示すグラフである。
　また、各支持材に包埋したファイバのバンドルを切断し、アレイを切り出した。その結果、ＧＥＬ１～３を支持材に用いた場合には、アレイを切り出すことができることが明らかとなった。一方、ＧＥＬ４、５を支持材に用いた場合には、アレイを切り出すことができなかった。
　以上の結果から、支持材の貯蔵弾性率（Ｇ’）を損失弾性率（Ｇ’’）で割った商が１０より大きく（Ｇ’／Ｇ’’＞１０）、且つ貯蔵弾性率（Ｇ’）が１００ｋＰａ以下（Ｇ’≦１００ｋＰａ）である場合に、アレイを正確に切り出すことができることが明らかとなった。
［実験例２］
（アレイの作製）
《蛍光ビーズアレイ》
　まず、対象物質として蛍光ビーズを使用して蛍光ビーズアレイの作製を試みた。蛍光ビーズとして、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｒｅｄ、ｙｅｌｌｏｗ－ｇｒｅｅｎ、ｂｌｕｅ（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。
　続いて、各蛍光ビーズを含むファイバを作製した。続いて、作製したファイバを、上述したＣＮＰを含む接着剤で接着してバンドルを作製した。続いて、バンドルを支持材に包埋し、２枚重ねたミクロトーム用のブレードで切断し、蛍光ビーズアレイを得た。
　図５は、作製した蛍光ビーズアレイを蛍光顕微鏡で観察した写真である。その結果、顕微鏡で観察可能な蛍光ビーズアレイを作製できたことが確認された。
　また、図６は、同様の方法で作製した複数の蛍光ビーズアレイを蛍光顕微鏡で観察した写真である。図６中、左下には、蛍光ビーズアレイの１つを拡大した写真を示す。その結果、本実験例の方法により、均一な蛍光ビーズアレイを多数作製できることが確認された。
《細胞アレイ》
　続いて、対象物質として細胞を使用して細胞アレイの作製を試みた。蛍光ビーズの代わりにヒト胎児腎由来の細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した以外は上記と同様にして、細胞アレイを作製した。続いて、作製した細胞アレイ中の細胞が生きているか否かを検討した。具体的には、細胞アレイを、生細胞染色試薬である、カルセインＡＭ（タカラバイオ株式会社）、死細胞染色試薬であるエチジウムブロマイド（タカラバイオ株式会社）、及び、核を染色する試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図７（ａ）～（ｄ）は、細胞アレイを蛍光顕微鏡で観察した写真である。図７（ａ）は生細胞を検出した結果を示す写真である。図７（ｂ）は死細胞を検出した結果を示す写真である。図７（ｃ）は核を検出した結果を示す写真である。図７（ｄ）は図７（ａ）～（ｃ）をマージした写真である。その結果、細胞アレイ中の細胞が生きていることが確認された。
［実験例３］
（細胞を用いた化学物質センサ）
　細胞アレイ中の細胞にムスカリン受容体を発現させ、ムスカリンに対する応答性を検討した。
　具体的には、まず、実験の２日前に、ヒト胎児腎由来の細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体（ムスカリン受容体）の発現ベクターを導入し、一過性に発現させた。続いて、この細胞を用いて細胞アレイを作製した。
　続いて、この細胞アレイの培地に１００ｍＭムスカリンを添加し、細胞へのカルシウムイオンの流入を測定した。細胞へのカルシウムイオンの流入は、カルシウムプローブであるＦｌｕｏ－８，ＡＭ（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）を培地に添加し、その蛍光を蛍光顕微鏡で観察することにより検出した。
　図８（ａ）は培地に添加したムスカリンに反応して、カルシウムプローブが蛍光を発している様子を撮影した蛍光顕微鏡写真である。図８（ｂ）は、ムスカリンの添加後のカルシウムプローブの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。
　その結果、ムスカリン受容体を発現させた細胞がムスカリンに応答する様子を観察できることが確認された。この結果は、細胞アレイを化学物質センサとして利用できることを示す。
［実験例４］
（細胞の輸送）
　細胞アレイの形態で、細胞を生きたまま輸送できるか否かを検討した。具体的には、まず、上述したＣＮＰを含む接着剤で細胞アレイをガラス基板に固定し、培地とともに６ウェルプレートに収容した。続いて、６ウェルプレートをＣＯ２ガス発生剤（商品名「カルチャーパル」、コスモバイオ株式会社）とともに市販の保温輸送用ボックス（サンプラテック社）に入れて梱包した。この保温輸送用ボックスは、外気温が２５℃の条件で、内部の温度を３３～３６℃に１５０時間以上維持することができる。
　続いて、保温輸送用ボックスを宅配便で輸送し、神奈川県と京都府の間を往復した。２日間の輸送の後、細胞アレイの状態を評価した。
　具体的には、輸送後の細胞アレイを、生細胞染色試薬である、カルセインＡＭ（タカラバイオ株式会社）及び死細胞染色試薬であるエチジウムブロマイド（タカラバイオ株式会社）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図９（ａ）～（ｄ）は、細胞アレイを顕微鏡で観察した写真である。図９（ａ）は輸送前の細胞アレイを観察した顕微鏡写真である。図９（ｂ）は輸送後の細胞アレイを観察した顕微鏡写真である。図９（ｃ）は輸送後の生細胞を検出した結果を示す写真である。図９（ｄ）は輸送後の死細胞を検出した結果を示す写真である。
　その結果、輸送後も細胞アレイの位置関係が維持されていることが確認された。また、輸送後もほとんどの細胞が生存していることが確認された。
　また、同様の実験を、ムスカリン受容体安定発現細胞で作製した細胞アレイで行った結果、輸送後にムスカリンに対する応答性を維持していることが確認された。
　以上の結果は、細胞アレイの形態で輸送することにより、非凍結状態の細胞を生きたまま且つ細胞の機能を保ったまま輸送することができることを示す。
　本発明によれば、新たなアレイを提供することができる。
　１００…アレイ、１２０…管、１１０…対象物質、１３０…面、２００…マイクロ流体装置、２１０，２２０，２３０…導入口、３１０…コア部、３２０…シェル部、３００…ファイバ、４００…バンドル、５００…支持材、５１０…切断線、６１０…ブレード、６００…カッター。

Claims (11)

  1. 　軸方向が互いに平行になるように接して配置された複数の管と、
    　前記複数の管の少なくとも１つの内部に配置された対象物質と、を含み、
    　前記複数の管はアニオン性ハイドロゲルで構成されており、前記複数の管同士が接する面は、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着されている、アレイ。
  2. 　前記複数の管のうち、一部の管は内部に対象物質を含み、残部の管は対象物質を含まない、請求項１に記載のアレイ。
  3. 　前記対象物質が細胞である、請求項１又は２に記載のアレイ。
  4. 　前記細胞が化学物質に応答する細胞を含む、請求項３に記載のアレイ。
  5. 　前記複数の管のうち、隣接する２個の管の内部に細胞が配置され、前記２個の管の周囲の管が細胞を含まない、請求項３又は４に記載のアレイ。
  6. 　請求項５に記載のアレイを培地中でインキュベートする工程を含み、その結果、前記隣接する２個の管の内部に配置された細胞がそれぞれ増殖して互いに接触し、接触面を形成する、細胞培養方法。
  7. 　非凍結状態の細胞を生きたまま輸送する方法であって、
    　請求項３～５のいずれか一項に記載のアレイ及び培地を収容した容器を輸送する工程を含む方法。
  8. 　アレイの製造方法であって、
    　アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に対象物質を含むファイバを、軸方向が互いに平行になるように複数個接触させて配置し、カチオン性水溶性ポリマーで表面が被覆されたナノ粒子を含む接着剤で接着して、ファイバのバンドルを得る工程と、
    　前記バンドルを支持材に包埋する工程と、
    　前記バンドルを前記支持材とともに切断して切片を得る工程と、を含み、
    　前記切片がアレイである、製造方法。
  9. 　前記支持材の貯蔵弾性率を損失弾性率で割った商（貯蔵弾性率／損失弾性率）が１０より大きく、且つ前記貯蔵弾性率が１００ｋＰａ以下である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記ファイバは、アニオン性ハイドロゲルで構成されたチューブの内部に、漏斗型デバイスを通して対象物質を入れる工程により製造される、請求項８又は９に記載の製造方法。
  11. 　前記対象物質が細胞である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
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