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WO2019167830A1 - ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法 - Google Patents

ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法 Download PDF

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WO2019167830A1
WO2019167830A1 PCT/JP2019/006778 JP2019006778W WO2019167830A1 WO 2019167830 A1 WO2019167830 A1 WO 2019167830A1 JP 2019006778 W JP2019006778 W JP 2019006778W WO 2019167830 A1 WO2019167830 A1 WO 2019167830A1
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WO
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antibody
app669
immunoassay
target polypeptide
antigen
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PCT/JP2019/006778
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English (en)
French (fr)
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金子　直樹
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Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
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Publication date
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Priority to EP19760318.6A priority patent/EP3760640A4/en
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    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to an immunological measurement method in the field of Alzheimer's disease. More particularly, the invention relates to an antibody that recognizes a peptide whose N-terminus begins with APP669 (collectively referred to as APP669-x), including the peptide APP669-711 related to amyloid ⁇ (A ⁇ ), and The present invention relates to a method for measuring APP669-x using the antibody.
  • APP669-x a peptide whose N-terminus begins with APP669
  • a ⁇ amyloid ⁇
  • the present invention also relates to a sandwich type immunoassay method using a specific immune reaction, belonging to the fields of clinical test drugs such as trace components and infectious microorganism antigens, biochemical research, and immunological research. More particularly, the present invention also relates to a sandwich immunoassay useful for detecting and quantifying trace polypeptides in a sample.
  • Alzheimer's disease is a major cause of dementia, accounting for 50-60% of all dementia.
  • a ⁇ is thought to be deeply involved in the development of Alzheimer's disease.
  • a ⁇ is a transmembrane protein produced by proteolysis of amyloid precursor protein (APP) consisting of 770 amino acids by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase.
  • APP amyloid precursor protein
  • a ⁇ mainly consists of 40mer (A ⁇ 1-40) and 42mer (A ⁇ 1-42), and it is also known that A ⁇ is transferred to cerebrospinal fluid (CSF). It has also been suggested that it may migrate into the blood. In recent years, it has been known that A ⁇ -like peptides having different lengths from A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 also exist in CSF.
  • Non-patent Document 1 Patent Document 1: International Publication WO2015 / 178398. These A ⁇ and A ⁇ -related peptides are quantified by mass spectrometry (MALDI-TOF MS) after immunoprecipitation (IP).
  • Patent Document 2 International Publication WO2017 / 047529 that three ratios for A ⁇ and A ⁇ -related peptides (A ⁇ -like peptides), A ⁇ 1-39 / A ⁇ 1-42, A ⁇ 1-40 / A ⁇ 1- 42, and a numerical value obtained by combining two or more ratios selected from the group consisting of APP669-711 / A ⁇ 1-42 by a mathematical method is promising as a blood biomarker.
  • a ⁇ and A ⁇ -related peptides are quantified by mass spectrometry (MALDI-TOF MS) after immunoprecipitation (IP).
  • the ratio of APP669-711, which is one of A ⁇ -related peptides, and A ⁇ 1-42 is promising as a blood biomarker candidate by mass spectrometry (MALDI-TOF MS) by the present inventors.
  • MALDI-TOF MS mass spectrometry
  • Mass spectrometry is useful as a technique for analyzing biomarkers such as A ⁇ -related peptides including APP669-711.
  • the sandwich ELISA is a measurement method that is widely used as a clinical test method and is inexpensive, and can be a useful analysis technique.
  • ELISA Kits that can analyze A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 in plasma are commercially available from various manufacturers (Wako Pure Chemicals, IBL, etc.).
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-170951 specifically recognizes monoclonal antibodies BAN-52a and BAN-50a that recognize the N-terminal part (A ⁇ 1-16) of amyloid ⁇ and the C-terminal part of amyloid ⁇ Monoclonal antibodies BA-27a, BS-85 and BC-05a are disclosed, and sandwich EIAs specific for A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 are disclosed.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-208678 discloses an antibody that specifically recognizes A ⁇ 11-x, and discloses a sandwich ELISA for A ⁇ 11-40 and a Western blot for A ⁇ 11-x.
  • An immunoassay is a method that uses a specific antigen-antibody reaction to measure the concentration of an analyte in a sample, and because it can measure trace components specifically and accurately, Widely used in chemical research.
  • the immunoassay includes enzyme immunoassay (EIA) using an enzyme as a labeling substance, radioimmunoassay (RIA) using a radioisotope, chemiluminescence immunoassay (CIA) using a chemiluminescent substance, Fluorescence immunoassay (FIA) using fluorescent materials, electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) using metal complexes, bioluminescence immunoassay (BLIA) using bioluminescent materials such as luciferase, antibody labeling PCR to amplify the detected nucleic acid by PCR, immunoturbidimetric method (TAI) to detect turbidity generated by immune complex formation, latex agglutination turbidimetric method to detect latex aggregated by immune complex formation (LA), an immunochromatography method for reacting on a cellulose membrane.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • sandwich ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent I Assay
  • EIA Enzyme-Linked ImmunoSorbent I Assay
  • This is a method in which the detection antibody labeled with is reacted, and the concentration of the substance to be analyzed is determined using the color of the substrate of the labeled enzyme (for example, Patent Document 5: JP-A-8-220098).
  • ECLIA also uses a sandwich method in which a biotinylated antibody and an antibody labeled with a ruthenium (Ru) complex that emits light by an electrochemical change are reacted with an analyte (for example, patent documents) 6: JP-T-2014-509735).
  • a sandwich method in which a biotinylated antibody and an antibody labeled with a ruthenium (Ru) complex that emits light by an electrochemical change are reacted with an analyte (for example, patent documents) 6: JP-T-2014-509735).
  • ruthenium (Ru) complex that emits light by an electrochemical change
  • the sandwich method is also used as a method for specifically quantifying a specific peptide fragment, and the peptide fragment is specifically measured by sandwiching the peptide fragment to be analyzed between an N-terminal recognition antibody and a C-terminal recognition antibody.
  • a ⁇ produced by cleaving from amyloid precursor protein (Amyloid precursor protein; APP) with a protease
  • APP amyloid precursor protein
  • a ⁇ 1-42 is quantified by an immunoassay such as ELISA as a cerebrospinal fluid (CSF) biomarker of Alzheimer's disease (Non-patent Document 3).
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-23985 discloses a method of improving the measurement sensitivity of an immunoassay method by using a high concentration of ions before immunoassay for a protein that is difficult to extract from a sample. A method for extracting a sample with an ionic surfactant has been reported.
  • APP669-711 is the same as the C-terminus of A ⁇ 1-40 (ie APP672-711), and there are antibodies that specifically recognize the C-terminus of APP669-711. However, no antibody specifically recognizes the N-terminus of APP669-711.
  • an object of the present invention is to provide an antibody that recognizes a peptide (generally called APP669-x) whose N-terminus begins with APP669, including peptide APP669-711 related to amyloid ⁇ (A ⁇ ). It is in. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for measuring APP669-x using the antibody.
  • a peptide generally called APP669-x
  • a ⁇ amyloid ⁇
  • two antibodies that recognize each of two different sites (epitopes) of the polypeptide to be analyzed are analyzed simultaneously. After binding to the peptide, or after binding one of the antibodies, the other antibody is bound. That is, it is necessary that two antibodies simultaneously bind to two different sites (epitope) of the polypeptide to be analyzed, and the polypeptide to be analyzed is sandwiched between the two antibodies.
  • a sandwich immunoassay for measuring A ⁇ which is a peptide fragment
  • the peptide fragment is sandwiched between an N-recognizing antibody and a C-terminal recognizing antibody, but the primary antibody recognition sites (epitopes) are separated from each other.
  • the two epitopes are close in spatial distance (Non-patent Document 4). Therefore, it may cause a decrease in sensitivity of the sandwich immunoassay.
  • An object of the present invention is to provide a sandwich immunoassay that can detect and quantify a polypeptide to be analyzed with high sensitivity.
  • an object of the present invention is to provide a sandwich immunoassay that can detect and quantify A ⁇ and A ⁇ -related peptides to be analyzed with high sensitivity.
  • an object of the present invention is to provide a sandwich immunoassay kit for polypeptides.
  • the present inventor immunized mice with a KLH (keyhole limpet hemocyanin) -binding synthetic peptide VKMC in order to produce an antibody that recognizes the N-terminus of APP669-x, and by cell fusion and screening, APP669- A hybridoma producing an antibody that recognizes the N-terminus of x was obtained.
  • an immunoassay method such as sandwich ELISA for specifically quantifying APP669-x was constructed.
  • an APP669-x ELISA kit can be constructed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the immunoassay consists of sandwich immunoassay, direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, Western blot, immunohistological staining, flow cytometry, immunoprecipitation, affinity chromatography, and immune cell staining.
  • the immunoassay method according to (2) selected from the group.
  • the sandwich immunoassay includes enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunoassay (CIA), fluorescence immunoassay (FIA), and electrochemiluminescence immunoassay.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay.
  • ECIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay.
  • ELIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • sample (10) The sample according to any one of (2) to (9), wherein the sample is a biological sample selected from the group consisting of blood, cerebrospinal fluid, urine, feces, and body secretions. Immunoassay.
  • APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody that specifically recognizes the N-terminus of APP669-x peptide (first antibody), and monoclonal antibody or polyclonal antibody that can recognize the C-terminus of APP669-711 (second Antibody) APP-669-711 sandwich immunoassay kit.
  • the inventor has changed the conformation of the polypeptide to be analyzed, and is a treatment for separating the two epitopes to be bound by the two antibodies used in the sandwich immunoassay from each other in terms of spatial distance. Specifically, by applying a substance having affinity for the analysis target polypeptide (antigen affinity substance) to the analysis target polypeptide and changing the conformation, the analysis target polypeptide is increased.
  • a substance having affinity for the analysis target polypeptide antigen affinity substance
  • the polypeptide includes a peptide and a protein.
  • the protein includes post-translationally modified proteins such as glycoproteins and phosphorylated proteins.
  • a ⁇ is used as an abbreviation for amyloid ⁇ peptide. That is, “A ⁇ ” includes A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42.
  • a peptide other than A ⁇ produced by cleaving amyloid precursor protein (Amyloid precursor protein; APP) may be referred to as an A ⁇ -related peptide (or A ⁇ -like peptide).
  • a ⁇ and A ⁇ -related peptides (or A ⁇ -like peptides) generated by cleaving amyloid precursor protein (Amyloid precursor protein; APP) may be referred to as “APP-derived peptides”.
  • the present invention includes the following inventions.
  • B-1) a first antibody having an antigen binding site capable of recognizing a target polypeptide in a sample, and an antigen binding site capable of recognizing the target polypeptide and possessed by the first antibody
  • B-2 adding the antigen-affinity substance to a sample containing the target polypeptide and then reacting the target polypeptide with the first antibody and the second antibody, or When the target polypeptide is reacted with the first antibody and the second antibody, the antigen affinity substance is added to the reaction system, or The target polypeptide is reacted with one of the first antibody and the second antibody, and then the antigen affinity substance is added to a reaction system, and then the target polypeptide is converted into the first antibody. And the immunoassay method according to (B-1) above, which is reacted with either one of the second antibody.
  • (B-3) The immunoassay method according to (B-1) or (B-2) above, wherein the antigen affinity substance is selected from the group consisting of an antibody, a peptide, a low molecular compound, and a nucleic acid aptamer.
  • the sandwich immunoassay includes enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunoassay (CIA), fluorescence immunoassay (FIA), electrochemiluminescence immunity (B-1) to (B-1) to (B) selected from the group consisting of measurement method (ECLIA), bioluminescence immunoassay method (BLIA), immuno-PCR, immunoturbidimetric method (TAI), and latex agglutination turbidimetric method (LA).
  • ECIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • ECIA electrochemiluminescence immunity
  • B-1) to (B-1) to (B) selected from the group consisting of measurement method (ECLIA), bioluminescence immunoassay method (BLIA), immuno-PCR, immunoturbidimetric method (TAI), and latex agg
  • the antigen-affinity substance acts on an intermediate site from the N-terminal 4 residue site to the C-terminal 4 residue site of the target polypeptide, (B-5) or The immunoassay method according to (B-6).
  • the sample is a biological sample selected from the group consisting of blood, cerebrospinal fluid, urine, feces, and body secretions
  • the immunoassay method according to any one of the above.
  • a sandwich type immunoassay kit for polypeptides comprising:
  • an antibody that specifically recognizes the N-terminus of APP669-x is provided.
  • sandwich immunoassay of APP669-x ELISA, Western blot, immunohistological staining, flow cytometry, immunoprecipitation, affinity chromatography, Immunological measurement methods such as immune cell staining are provided.
  • a sandwich ELISA method of APP669-711 is provided. Also provided is a reagent kit for performing a sandwich ELISA method for APP669-711. Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is useful as an analysis technique for biomarkers such as A ⁇ -related peptides including APP669-711, but sandwich ELISA is a measurement method that is widely used as a clinical test method. It is a more useful analytical technique because it is inexpensive and available.
  • MALDI-TOF MS Mass spectrometry
  • an antigen affinity substance capable of binding to the target polypeptide is added to the sample. This alters the conformation of the target polypeptide and separates the two epitopes to which each of the two antibodies used in the sandwich immunoassay should bind in spatial distance. Therefore, the antigen-antibody reaction at two sites is successfully performed, and the target polypeptide can be detected and quantified with high sensitivity.
  • a ⁇ A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42
  • a ⁇ -related peptides eg, A ⁇ 1-39, APP669-711
  • a sandwich immunoassay that can detect and quantify these A ⁇ and A ⁇ -related peptides, particularly A ⁇ -related peptides, with high sensitivity is desired.
  • a sandwich immunoassay that can detect and quantify these A ⁇ and A ⁇ -related peptides, particularly A ⁇ -related peptides, with high sensitivity is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 34-6E in Example 1-2.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 24-6G in Example 1-2.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 20-1A in Example 1-2.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 1 represents peptide concentration (pmol / mL)
  • the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of APP669-711 sandwich ELISA using three types of APP669-x N-terminal specific antibody clones in Example 2-1.
  • the horizontal axis represents the concentration of APP669-711 (pmol / mL), and the vertical axis represents the absorbance (absorbance) of the main wavelength 450 nm / subwavelength 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 5 is a graph showing the specificity of APP669-711 sandwich ELISA when APP669-x N-terminal specific antibody clone 34-6E is used in Example 2-2.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of human plasma measurement by APP669-711 sandwich ELISA in Example 2-4.
  • the horizontal axis represents each plasma sample, and the vertical axis represents APP669-711 concentration (fmol / mL).
  • FIG. 7 is a graph showing a calibration curve of APP669-711 ELISA by adding anti-A ⁇ antibody 4G8 in Example B1.
  • the horizontal axis represents the concentration of APP669-711 (fmol / mL), and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • a calibration curve is shown for each concentration of anti-A ⁇ antibody 4G8.
  • FIG. 8 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA by addition of anti-A ⁇ antibody 4G8 in Example B1.
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of anti-A ⁇ antibody 4G8, and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the dots are connected by a line for each concentration of APP669-711.
  • FIG. 9 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA against A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody 4G8 was added in Example B1.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of anti-A ⁇ antibody 4G8 addition in APP669-711 ELISA using 3 clones of N-terminal recognition antibody in Example B2.
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of anti-A ⁇ antibody 4G8, and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • FIG. 11 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA to A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody 4G8 was added in Example B2.
  • Three clones were used as N-terminal recognition antibodies.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of addition of 4 clones of anti-A ⁇ antibody in APP669-711 ELISA in Example B3.
  • the horizontal axis represents the concentration of added anti-A ⁇ antibody (ng / mL), and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the dots are connected by a line for each clone of the anti-A ⁇ antibody.
  • FIG. 13 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA against A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody was added in Example B3. Four clones were used as the anti-A ⁇ antibody.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of addition of anti-A ⁇ antibodies 4G8 and 6E10 in A ⁇ 1-40 ELISA in Example B4.
  • the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • standard included in ELISA Kit and A ⁇ 1-40 of AnaSpec were used.
  • APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody specifically recognizes the N-terminal of APP669-x peptide.
  • mice are immunized with the KLH-binding synthetic peptide VKMC (SEQ ID NO: 5), and antibodies that recognize the N-terminus of APP669-x are produced by cell fusion and screening. Hybridomas were obtained. More detailed antibody production is described in the examples.
  • this antibody recognizes the N-terminus of APP669-x, it can specifically recognize the N-terminus of various peptides belonging to APP669-x including APP669-711 (SEQ ID NO: 3). Therefore, using this APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody, APP669-x in the sample can be immunoreacted with the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody.
  • Amyloid precursor protein is a transmembrane protein consisting of 770 amino acids. Amyloid precursor protein (APP) is proteolyzed by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase, and amyloid beta peptide (A ⁇ ) is produced by proteolysis. APP672-711 and A ⁇ 1-40 represent the same peptide (SEQ ID NO: 1). APP672-713 and A ⁇ 1-42 represent the same peptide (SEQ ID NO: 2). APP669-711 (SEQ ID NO: 3) belongs to APP669-x, where x is greater than 669 for the lower limit, for example greater than 677, and is particularly limited for the upper limit.
  • the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody can specifically recognize the N-terminus of the APP669-x peptide and can cause an immunoreaction.
  • the upper limit value is not particularly limited.
  • APP669-x peptides include APP669-711 (SEQ ID NO: 3), APP669-709, APP669-710, APP669-713, and the like.
  • APP672-711 (A ⁇ 1-40) (SEQ ID NO: 1): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV APP672-713 (A ⁇ 1-42) (SEQ ID NO: 2): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA APP669-711 (SEQ ID NO: 3): VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
  • the immunoassay method of the present invention uses APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody that specifically recognizes the N-terminus of APP669-x peptide, and uses APP669-x in the sample and the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody. And measuring APP669-x.
  • immunoassay examples include various methods such as sandwich immunoassay, direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, Western blot, immunohistological staining, flow cytometry, immunoprecipitation, affinity chromatography, and immune cell staining.
  • sandwich immunoassay direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, Western blot, immunohistological staining, flow cytometry, immunoprecipitation, affinity chromatography, and immune cell staining.
  • An immunoassay is mentioned.
  • Immunoassay can be performed by a conventional method using the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody of the present invention.
  • the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody first antibody
  • An anti-A ⁇ antibody second antibody capable of recognizing the C-terminus of the -x fragment can be used.
  • an anti-A ⁇ antibody capable of recognizing the C-terminus of the APP669-x fragment may be used.
  • the peptide to be measured is APP669-711
  • a monoclonal antibody that can recognize the C-terminus of APP669-711 is used.
  • the C-terminus of A ⁇ 1-40 is the same as that of APP669-711, and antibodies capable of recognizing such C-terminus are commercially available.
  • sandwich immunoassay examples include enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunoassay (CIA), fluorescence immunoassay (FIA), and electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA). ), Bioluminescence immunoassay (BLIA), immuno-PCR, immunoturbidimetry (TAI), latex agglutination turbidimetry (LA), and the like.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • BLIA Bioluminescence immunoassay
  • TAI immunoturbidimetry
  • LA latex agglutination turbidimetry
  • the first antibody and the second antibody may be added to a sample containing the APP669-x peptide sequentially or simultaneously to cause an immune reaction according to a usual technique.
  • an antigen affinity substance capable of binding to APP669-x may be added to the sample containing the APP669-x peptide.
  • the antigen affinity substance is added to the sample, and then the APP669-x peptide is reacted with the first antibody and the second antibody, or
  • the antigen affinity substance is added to the reaction system, or
  • the APP669-x peptide is reacted with either the first antibody or the second antibody, and then the antigen affinity substance is added to the reaction system, and then the APP669-x peptide is added to the first antibody. It can be made to react with either one of said antibody and said 2nd antibody.
  • the conformation of the target polypeptide is changed, so that the two epitopes to which the two antibodies used in the sandwich immunoassay should each bind Spatial distances from each other. Therefore, the antigen-antibody reaction at the two sites is successfully performed, and the target polypeptide can be detected and quantified with higher sensitivity.
  • the antigen-affinity substance may be any substance that has an affinity and can bind to the target polypeptide, and examples thereof include antibodies, peptides, low-molecular compounds, and nucleic acid aptamers.
  • the bond here includes a bond by an intermolecular interaction such as electrostatic interaction, van der Waals force, hydrogen bond, hydrophobic interaction, dipole interaction, dispersion force and the like. Any one may be used as long as the conformation of the target polypeptide is changed and the two epitopes to which each of the two antibodies used in the sandwich immunoassay should bind are separated from each other by a spatial distance.
  • an antibody having an antigen binding site different from the antigen binding site of the first antibody and the second antibody may be used.
  • a peptide consisting of 2 to 12 amino acid residues may be used as the peptide as the antigen affinity substance.
  • iA ⁇ 5 5 amino acids
  • D3 (12 amino acids)
  • NH2- examples thereof include D-Trp-Aib-OH (2 amino acids).
  • the low molecular weight compound as the antigen affinity substance a low molecular weight compound capable of binding to a target polypeptide may be used, for example, a low molecular weight compound that binds to a protein as used in drug discovery. It is done.
  • Examples of the low molecular compound that binds to A ⁇ include Scyllo-inositol. Various inhibitors (for example, various types of Stemolecule TM low molecular weight compounds) are also included.
  • Examples of the nucleic acid aptamer as the antigen affinity substance include a DNA aptamer and an RNA aptamer.
  • the amount of the antigen affinity substance added is not particularly limited depending on the type and amount of the target polypeptide in the sample and the type of the antigen affinity substance. An amount that can change the conformation of the peptide may be used.
  • the amount of the antigen affinity substance added is about 0.1 ng / mL to about 100,000 ng / mL, preferably about 0.1 ng / mL to about 10,000 ng / mL, as the concentration in the sample containing the target polypeptide. Preferably, it is about 0.1 ng / mL to 3000 ng / mL.
  • the APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody (first antibody) and the antigen binding site of the first antibody of APP669-x are different from each other.
  • an anti-A ⁇ antibody (second antibody) capable of recognizing the C-terminus of the APP669-x fragment can be used.
  • the antigen affinity substance does not act near the N-terminus of the target polypeptide and does not act near the C-terminus of the target polypeptide. It is not preferable that competition or inhibition between the antigen affinity substance and the first antibody occurs with respect to the target polypeptide, and competition or inhibition between the antigen affinity substance and the second antibody may occur. It is not preferable.
  • the antigen-affinity substance preferably acts on an intermediate site from the 4-residue site from the N-terminal to the 4-residue site from the C-terminal of the target polypeptide. Furthermore, the antigen affinity substance preferably acts on an intermediate site from the 6-residue site from the N-terminal to the 6-residue site from the C-terminal of the target polypeptide.
  • the N-terminal recognition antibody of the target polypeptide as the first antibody is used as a solid-phased antibody (capture antibody).
  • the C-terminal recognition antibody of the target polypeptide as the antibody may be used as a detection antibody (labeled antibody).
  • the sandwich immunoassay of the present invention includes a radioisotope (RIA) using a radioisotope, a chemiluminescence immunoassay (CIA) using a chemiluminescent substance, in addition to a sandwich ELISA using an enzyme as a labeling substance.
  • RIA radioisotope
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA Immunofluorescence assay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • BLIA bioluminescence immunoassay
  • TAI immunoturbidimetric method
  • LA turbidity method
  • the basic operation of the sandwich immunoassay method of the present invention can be performed according to a known operation even when an antigen affinity substance is added to a sample.
  • the target APP669-x peptide is contained in a biological sample.
  • Biological samples include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid (CSF), urine, body secretions, saliva, and sputum; and feces.
  • Blood samples include whole blood, plasma and serum.
  • a blood sample can be prepared by appropriately treating whole blood collected from an individual. The treatment performed when preparing a blood sample from the collected whole blood is not particularly limited, and any clinically acceptable treatment may be performed. For example, centrifugation can be performed.
  • the blood sample may be stored at a low temperature such as freezing as appropriate in the middle of the preparation process or at a later stage of the preparation process. In the present invention, the biological sample is discarded without returning to the original individual.
  • Targeting a blood sample as a target sample is less invasive than when the sample is a solid or cerebrospinal fluid, and is also a target sample for screening for various diseases in general health checkups and medical checkups. This is also preferable.
  • the APP669-711 sandwich immunoassay kit of the present invention is for performing the sandwich immunoassay described above, APP669-x N-terminal recognition monoclonal antibody that specifically recognizes N-terminal of APP669-x peptide (first antibody), and monoclonal antibody or polyclonal antibody that can recognize C-terminal of APP669-711 (second antibody) Is included.
  • the kit may further contain an antigen affinity substance that can bind to APP669-x.
  • the kit can contain various components used for the operation of the sandwich immunoassay, for example, a diluent for preparing a sample solution, a washing solution, and the like.
  • the immunoassay method of the present invention comprises a first antibody having an antigen-binding site capable of recognizing a target polypeptide in a sample, and an antigen-binding site capable of recognizing the target polypeptide, the first antibody having In a sandwich immunoassay method for a polypeptide using a second antibody having an antigen binding site different from the antigen binding site, an antigen affinity substance capable of binding to the target polypeptide is added to the sample.
  • the antigen-affinity substance is added to a sample containing the target polypeptide, and then the target polypeptide is reacted with the first antibody and the second antibody, or
  • the antigen affinity substance is added to the reaction system, or
  • the target polypeptide is reacted with one of the first antibody and the second antibody, and then the antigen affinity substance is added to a reaction system, and then the target polypeptide is converted into the first antibody. And can be reacted with either one of the second antibodies.
  • the conformation of the target polypeptide is changed, so that the two epitopes to which the two antibodies used in the sandwich immunoassay should each bind Spatial distances from each other. Therefore, the antigen-antibody reaction at two sites is successfully performed, and the target polypeptide can be detected and quantified with high sensitivity.
  • the antigen-affinity substance may be any substance that has an affinity and can bind to the target polypeptide, and examples thereof include antibodies, peptides, low-molecular compounds, and nucleic acid aptamers.
  • the bond here includes a bond by an intermolecular interaction such as electrostatic interaction, van der Waals force, hydrogen bond, hydrophobic interaction, dipole interaction, dispersion force and the like. Any one may be used as long as the conformation of the target polypeptide is changed and the two epitopes to which each of the two antibodies used in the sandwich immunoassay should bind are separated from each other by a spatial distance.
  • an antibody having an antigen binding site different from the antigen binding site of the first antibody and the second antibody may be used.
  • a peptide consisting of 2 to 12 amino acid residues may be used as the peptide as the antigen affinity substance.
  • iA ⁇ 5 5 amino acids
  • D3 (12 amino acids)
  • NH2- examples thereof include D-Trp-Aib-OH (2 amino acids).
  • the low molecular weight compound as the antigen affinity substance a low molecular weight compound capable of binding to a target polypeptide may be used, for example, a low molecular weight compound that binds to a protein as used in drug discovery. It is done.
  • Examples of the low molecular compound that binds to A ⁇ include Scyllo-inositol. Various inhibitors (for example, various types of Stemolecule TM low molecular weight compounds) are also included.
  • Examples of the nucleic acid aptamer as the antigen affinity substance include a DNA aptamer and an RNA aptamer.
  • the amount of the antigen affinity substance added is not particularly limited depending on the type and amount of the target polypeptide in the sample and the type of the antigen affinity substance. An amount that can change the conformation of the peptide may be used.
  • the amount of the antigen affinity substance added is about 0.1 ng / mL to about 100,000 ng / mL, preferably about 0.1 ng / mL to about 10,000 ng / mL, as the concentration in the sample containing the target polypeptide. Preferably, it is about 0.1 ng / mL to 3000 ng / mL.
  • a first antibody having an antigen-binding site capable of recognizing a target polypeptide, and an antigen-binding site capable of recognizing the target polypeptide, which is different from the antigen-binding site of the first antibody As the second antibody having a binding site, various antibodies used in sandwich immunoassays can be used.
  • an N-terminal recognition antibody of a target polypeptide can be used as the first antibody, and a C-terminal recognition antibody of the target polypeptide can be used as the second antibody.
  • the antigen affinity substance does not act near the N-terminus of the target polypeptide and does not act near the C-terminus of the target polypeptide. It is not preferable that competition or inhibition between the antigen affinity substance and the first antibody occurs with respect to the target polypeptide, and competition or inhibition between the antigen affinity substance and the second antibody may occur. It is not preferable.
  • the antigen-affinity substance preferably acts on an intermediate site from the 4-residue site from the N-terminal to the 4-residue site from the C-terminal of the target polypeptide. Furthermore, the antigen affinity substance preferably acts on an intermediate site from the 6-residue site from the N-terminal to the 6-residue site from the C-terminal of the target polypeptide.
  • the N-terminal recognition antibody of the target polypeptide as the first antibody is used as a solid-phased antibody (capture antibody).
  • the C-terminal recognition antibody of the target polypeptide as the antibody may be used as a detection antibody (labeled antibody).
  • the sandwich immunoassay of the present invention includes a radioisotope (RIA) using a radioisotope, a chemiluminescence immunoassay (CIA) using a chemiluminescent substance, in addition to a sandwich ELISA using an enzyme as a labeling substance.
  • RIA radioisotope
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA Immunofluorescence assay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • BLIA bioluminescence immunoassay
  • TAI immunoturbidimetric method
  • LA turbidity method
  • the basic operation of the sandwich immunoassay method of the present invention can be performed according to a known operation except that an antigen affinity substance is added to a sample.
  • the present invention is particularly suitable when the target polypeptide is A ⁇ and an A ⁇ -related peptide.
  • a ⁇ (A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42) and A ⁇ -related peptides (for example, A ⁇ 1-39, APP669-711) are present in vivo and are attracting attention as biomarkers of Alzheimer's disease.
  • a sandwich immunoassay that can detect and quantify these A ⁇ and A ⁇ -related peptides, particularly A ⁇ -related peptides, with high sensitivity has been desired.
  • the present invention provides a sandwich immunoassay that can detect and quantify these A ⁇ and A ⁇ -related peptides, particularly A ⁇ -related peptides, with high sensitivity. Examples of A ⁇ and A ⁇ -related peptides are shown below.
  • APP672-709 (A ⁇ 1-38) (SEQ ID NO: 6): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG APP674-711 (A ⁇ 3-40) (SEQ ID NO: 7): EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV APP672-710 (A ⁇ 1-39) (SEQ ID NO: 8): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV APP672-711 (A ⁇ 1-40) (SEQ ID NO: 1): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV OxAPP672-711 (OxA ⁇ 1-40) (SEQ ID NO: 9): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (Met 706 is oxidized) APP672-713 (A ⁇ 1-42) (SEQ ID NO: 2): DAEFRHDSGYEVHHQK
  • Amyloid precursor protein is a single-membrane transmembrane protein consisting of 770 amino acids. Amyloid precursor protein (APP) is proteolyzed by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase, and amyloid beta peptide (A ⁇ ) is produced by proteolysis. APP672-713 and A ⁇ 1-42 represent the same peptide (SEQ ID NO: 2). APP672-711 and A ⁇ 1-40 represent the same peptide (SEQ ID NO: 1).
  • the target polypeptide includes, without limitation, various A ⁇ -related peptides other than those exemplified above. The present invention is also applicable to various polypeptides other than A ⁇ and A ⁇ -related peptides.
  • the target polypeptide is contained in a biological sample.
  • Biological samples include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid (CSF), urine, body secretions, saliva, and sputum; and feces.
  • Blood samples include whole blood, plasma and serum.
  • a blood sample can be prepared by appropriately treating whole blood collected from an individual. The treatment performed when preparing a blood sample from the collected whole blood is not particularly limited, and any clinically acceptable treatment may be performed. For example, centrifugation can be performed.
  • the blood sample may be stored at a low temperature such as freezing as appropriate in the middle of the preparation process or at a later stage of the preparation process. In the present invention, the biological sample is discarded without returning to the original individual.
  • Targeting a blood sample as a target sample is less invasive than when the sample is a solid or cerebrospinal fluid, and is also a target sample for screening for various diseases in general health checkups and medical checkups. This is also preferable.
  • the polypeptide sandwich sandwich immunoassay kit of the present invention is for performing the sandwich immunoassay described above, A first antibody having an antigen binding site capable of recognizing a target polypeptide; A second antibody having an antigen binding site capable of recognizing the target polypeptide and different from the antigen binding site of the first antibody; and an antigen affinity substance capable of binding to the target polypeptide including.
  • the kit can contain various components used for the operation of the sandwich immunoassay, for example, a diluent for preparing a sample solution, a washing solution, and the like.
  • Example 1 Preparation of APP669-x N-terminal recognition antibody
  • Example 1-1 Preparation of monoclonal antibody
  • the C-terminal Cys of the synthetic peptide VKMC (SEQ ID NO: 5) was bound to a carrier protein (KLH) using a bivalent reactive reagent.
  • This KLH-binding synthetic peptide was mixed and emulsified with FCA (Freund complete adjuvant) using a syringe, and 200 ⁇ g was injected (immunized) into the ridge muscle of one BALB / c mouse. Furthermore, the antigen was mixed with FICA (Freund in complete adjuvant) and emulsified, and 50 ⁇ g was subcutaneously injected (boost immunization) to one mouse twice at two-week intervals. Thereafter, 100 ⁇ g of each mouse was finally immunized intraperitoneally.
  • lymphocytes were separated and stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • whole blood was collected from mice, and serum was separated from the blood and stored frozen at ⁇ 40 ° C.
  • the resulting lymphocytes and mouse myeloma were subjected to cell fusion in the presence of 50% polyethylene glycol.
  • the fused cells were dispensed into eight 96-well microplates and cultured. Eight days after cell fusion, the culture supernatant was sampled from each well of a 96-well microwell plate, and primary and secondary screening were sequentially performed by ELISA, and cells in positive wells were cloned by limiting dilution. Thereafter, primary and secondary screening were sequentially performed by ELISA, and hybridomas of positive clones were stored frozen.
  • the obtained hybridomas (clone 20-1A, 24-6G, 34-6E) were subjected to high density serum-free culture.
  • the antibody was purified from the culture supernatant using Protein A.
  • Example 1-2 Confirmation of specificity of monoclonal antibody by direct ELISA
  • the specificity of APP669-x N-terminal recognition antibody clones 20-1A, 24-6G, 34-6E was directly assessed by ELISA.
  • Direct ELISA was performed as follows.
  • Synthetic peptide APP669-711 (Peptide Laboratories), A ⁇ 1-40 (Peptide Laboratories), or APP668-677 (Sequence No. 4) (Toray Research Center) with sodium carbonate buffer (pH 9.6) at 50 or 500 pmol / mL. Diluted to each concentration.
  • the sequence of the synthetic peptide is shown in Table 1. 50 ⁇ L of each synthetic peptide solution was added to each well of a 96-well microplate and immobilized by incubation at 4 ° C. for 2 hours. A blank well was also prepared. The solution in the plate was removed, 100 ⁇ L of 4 times diluted Block Ace (DS Pharma) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 2 hours for blocking.
  • DS Pharma Block Ace
  • PBST 0.05% Tween 20weenin PBS
  • APP669-x N-terminal recognition antibody diluted to a concentration of 0.5 ⁇ g / mL with 10-fold diluted Block Ace was added in an amount of 50 ⁇ L and incubated at 4 ° C. for 1 hour.
  • the sample solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST.
  • 50 ⁇ L each of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (ZYMED) solution diluted 4000 times with 10-fold diluted Block Ace was added and incubated at 4 ° C. for 1 hour.
  • the solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST. 100 ⁇ L of ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai) was added, and color was developed by incubation in the dark for 30 minutes. The color reaction was stopped by adding 100 ⁇ L of 2N sulfuric acid. Absorbance at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm was measured with a microplate reader.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 34-6E.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 24-6G.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of direct ELISA using APP669-x N-terminal specific antibody clone 20-1A.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) measured with a microplate reader at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm.
  • APP669-711 has the same N-terminal 3 amino acids as A ⁇ 1-40 and the other amino acid sequences are the same as A ⁇ 1-40, but did not react with A ⁇ 1-40, so clone 20-1A, 24-6G and 34-6E indicate that 3 amino acids on the N-terminal side of APP669-711 are recognized.
  • APP668-677 is only 1 amino acid longer than APP669-711 on the N-terminal side, but clones 20-1A, 24-6G, and 34-6E no longer react. This indicates that clones 20-1A, 24-6G, 34-6E specifically recognize the N-terminus of APP669-711.
  • Example 2 Sandwich ELISA of APP669-711
  • Example 2-1 Sandwich ELISA using three clones of APP669-x N-terminal recognition antibody
  • the reactivity of sandwich ELISA against APP669-711 was evaluated using APP669-x N-terminal recognition antibody clones 20-1A, 24-6G, and 34-6E as capture antibodies.
  • APP669-x N-terminal recognition antibody is diluted with sodium carbonate buffer (pH 9.6) to a concentration of 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L is added to each well of a 96-well microplate, and incubated at 4 ° C. for 6 hours. Phased. The solution in the plate was removed, 100 ⁇ L of 20% Blocking One (Nacalai Tesque) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 2 hours for blocking. The solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST.
  • HRP-labeled C-terminal recognition antibody (clone BA27) solution contained in Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit (Wako Pure Chemical Industries) was diluted 5-fold with 5% Blocking One in PBST, and 50 ⁇ L was added. Incubated at 2 ° C. for 2 hours. The solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of APP669-7117 sandwich ELISA using three kinds of APP669-x N-terminal specific antibody clones.
  • the horizontal axis represents the concentration of APP669-711 (pmol / mL), and the vertical axis represents the absorbance (absorbance) of the main wavelength 450 nm / subwavelength 650 nm measured with a microplate reader.
  • FIG. 4 shows that 34-6E has the highest reactivity with APP669-711 among the three types of APP669-x N-terminal recognition antibody clones.
  • sandwich ELISA was evaluated focusing on 34-6E.
  • Example 2-2 Confirmation of specificity of sandwich ELISA
  • the specificity of the sandwich ELISA for APP669-711 was assessed using APP669-x N-terminal recognition antibody clone 34-6E as a capture antibody.
  • Sandwich ELISA was performed as follows.
  • APP669-x N-terminal recognition antibody clone 34-6E was diluted with sodium carbonate buffer (pH 9.6) to a concentration of 20 ⁇ g / mL, added 50 ⁇ L to each well of a 96-well microplate, and incubated at 4 ° C. for 6 hours. To make it solid-phased. The solution in the plate was removed, 100 ⁇ L of 4 times diluted Block Ace was added, and blocking was performed by incubating at 4 ° C. for 2 hours. The solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST.
  • Synthetic peptide APP669-711 or A ⁇ 1-40 diluted with sample buffer B [10-fold diluted Block Ace, 60 ng / mL anti-A ⁇ antibody clone 4G8 (BioLegend, epitope A ⁇ 18-22)] was added as a sample solution in 50 ⁇ L aliquots. Incubated overnight at 4 ° C. Each sample was performed by double measurement. Sample buffer B contained anti-A ⁇ antibody clone 4G8 (60 ng / mL) for the purpose of increasing reactivity. The sample solution in the plate was removed and washed with 300 ⁇ L of PBST.
  • FIG. 5 is a graph showing the specificity of APP669-7117 sandwich ELISA when APP669-x N-terminal specific antibody clone 34-6E is used.
  • the horizontal axis represents peptide concentration (pmol / mL), and the vertical axis represents absorbance (Absorbance) at a main wavelength of 450 nm / subwavelength of 650 nm measured with a microplate reader.
  • Example 2-3 APP669-711 ELISA addition recovery test
  • Sandwich ELISA was performed in the same manner as in Example 2-2.
  • the sample used was commercial plasma (Tennessee Blood Services) diluted 4-fold with a sample buffer.
  • APP669-711 was added so that the concentration of added APP669-711 would be 0, 5, 10, or 20 fmol / mL.
  • Example 2-4 Plasma measurement by APP669-711 ELISA
  • Endogenous APP669-711 in plasma was quantified using an APP669-711 ELISA. Samples were measured in duplicate using 5 commercially available plasma samples diluted 4-fold with sample buffer.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of human plasma measurement by APP669-711 sandwich ELISA.
  • the horizontal axis represents each plasma sample, and the vertical axis represents APP669-711 concentration (fmol / mL).
  • FIG. 6 shows that the concentration exceeds the lower limit of quantification (2.42 fmol / mL) in all five samples. From the above results, it was shown that this sandwich ELISA is a sufficient measurement system for quantifying APP669-711 in plasma.
  • Example B1 APP669-711 Sandwich ELISA Operation Method
  • Experimental Example B1 the basic operation method of the sandwich ELISA of APP669-711 will be described below. Each operation in Examples B1 to B4 was performed based on this operation method.
  • N-terminal recognition antibody ITM was requested to produce an antibody that recognizes the N-terminus of APP669-711, and 3 clones (20-1A, 24-6G, 34-6E) were obtained.
  • N-terminal recognition antibody Solidification and blocking of N-terminal recognition antibody
  • the N-terminal recognition antibody is diluted with sodium carbonate buffer (pH 9.6) to a concentration of 20 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L of the resulting antibody diluted solution is added to each well of a 96-well plate and incubated at 4 ° C. for 2 hours.
  • the antibody dilution solution in the plate was removed, and 100 ⁇ L of 20% Blocking One (Nacalai Tesque) was added to each well, followed by incubation at 4 ° C. for 2 hours for blocking.
  • sample solution was prepared by setting the peptide to be measured APP669-711 to a predetermined concentration with 5% Blocking One in PBST.
  • an antibody used as an antigen affinity substance was adjusted to an arbitrary concentration with 5% Blocking One in PBST, and an equal amount was added to the sample solution.
  • HRP-labeled antibody that recognizes C-terminal
  • An HRP-labeled antibody (clone BA27) solution that recognizes the C-terminus contained in Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit (Wako Pure Chemical Industries) was diluted 5-fold with 5% Blocking One in PBST.
  • the sample solution in the plate was removed and washed 3 times with 300 ⁇ L of PBST.
  • 50 ⁇ L each of HRP-labeled antibody (BA27) solution diluted 5-fold was added and incubated at 4 ° C. for 1 hour.
  • the solution in the plate was removed and washed 5 times with 300 ⁇ L PBST.
  • Example B1 [APP669-711 sandwich ELISA reactivity evaluation by adding anti-A ⁇ antibody 4G8]
  • Amyloid ⁇ (A ⁇ ) 1-40 has a structure in which the C-terminal and N-terminal are close in spatial distance (Non-patent Document 4).
  • APP669-711 which is only 3 amino acids longer than the N-terminus of A ⁇ 1-40, is considered to be close to the C-terminus and N-terminus.
  • Anti-A ⁇ antibody 4G8 was used as an antibody (antigen affinity substance) that can bind to APP669-711.
  • the concentration of APP669-711 is 0 fmol / mL, 15.625 fmol / mL, 31.25 fmol / mL, 62.5 fmol / mL, 125 fmol / mL, 250 fmol / mL, 500 fmol / mL, 1000 fmol / mL, anti-A ⁇ antibody 4G8 concentration is 0, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 ng / mL It prepared so that it might become. These solutions were measured by APP669-711 sandwich ELISA.
  • the epitope of clone 4G8 is A ⁇ 18-22.
  • N-terminal recognition antibody clone 34-6E was used as the immobilized antibody.
  • the absorbance increased when anti-A ⁇ antibody 4G8 was added compared to the case where 4G8 was not added (0 ng / mL) (FIG. 7).
  • the concentration increased depending on the concentration up to an addition concentration of 100 ng / mL, and gradually decreased when the concentration was exceeded (FIG. 8).
  • the reason why the absorbance increased may be that anti-A ⁇ antibody 4G8 was immobilized on the plate, captured by APP669-711, and reacted with a C-terminal recognition HRP-labeled antibody.
  • anti-A ⁇ antibody 4G8 reacts, but N-terminal recognition antibody 34-6E does not react with a sample solution of A ⁇ 1-40 (0 to 1000 fmol / mL).
  • APP669-711 sandwich ELISA reactivity when / mL was added was evaluated. Since the epitope of anti-A ⁇ antibody 4G8 is A ⁇ 18-22, if anti-A ⁇ antibody 4G8 is immobilized, it exhibits reactivity. However, no response was shown in this measurement result (FIG. 9).
  • FIG. 7 is a graph showing a calibration curve of APP669-711 ELISA with anti-A ⁇ antibody 4G8 added.
  • the horizontal axis represents the concentration of APP669-711 (fmol / mL), and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • a calibration curve is shown for each concentration of anti-A ⁇ antibody 4G8.
  • FIG. 8 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA with the addition of anti-A ⁇ antibody 4G8.
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of anti-A ⁇ antibody 4G8, and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the dots are connected by a line for each concentration of APP669-711.
  • FIG. 9 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA against A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody 4G8 is added.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the amount of anti-A ⁇ antibody 4G8 added was 10,000 ng / mL.
  • Example B2 Verification of anti-A ⁇ antibody 4G8 addition effect when clone of N-terminal recognition antibody is changed
  • anti-A ⁇ antibody 4G8 as an antigen affinity substance to the sample solution of APP669-711
  • APP669-711 concentration is 500 fmol / mL
  • anti-A ⁇ antibody 4G8 concentration is 0, 10, 30, 100, 300 , 1000, 3000 ng / mL.
  • These solutions were measured by APP669-711 sandwich ELISA.
  • As the immobilized antibody 3 clones 20-1A, 24-6G and 34-6E of N-terminal recognition antibodies were used, respectively. As a result, an increase in absorbance was confirmed in all three clones, and the concentration of anti-A ⁇ antibody 4G8 that showed the highest absorbance in each clone was 100 ng / mL in common (FIG. 10). That is, the optimal anti-A ⁇ antibody 4G8 addition concentration was the same for all clones.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of addition of anti-A ⁇ antibody 4G8 in APP669-711 ELISA using 3 N-terminal recognition antibody clones.
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of anti-A ⁇ antibody 4G8, and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the dots are connected by a line for each clone of the N-terminal recognition antibody.
  • FIG. 11 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA against A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody 4G8 is added.
  • Three clones were used as N-terminal recognition antibodies.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the amount of anti-A ⁇ antibody 4G8 added was 3000 ng / mL.
  • Example B3 Verification of APP669-711 sandwich ELISA reactivity improvement effect when the added anti-A ⁇ antibody is changed
  • APP669-711 By adding 4 clones of anti-A ⁇ antibody (4G8, 6E10, BAM90.1, or NAB228) as an antigen affinity substance to the sample solution of APP669-711, the concentration of APP669-711 is 500 fmol / mL, anti-A ⁇ Antibody 4G8 concentrations were adjusted to 0, 10, 30, 100, 300, 1000, and 3000 ng / mL. These solutions were measured by APP669-711 sandwich ELISA.
  • the epitope of clone 6E10 is A ⁇ 3-8
  • BAM90.1 is A ⁇ 20-23
  • NAB228 is a part of A ⁇ 1-11.
  • As the immobilized antibody N-terminal recognition antibody clone 34-6E was used.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of addition of 4 clones of anti-A ⁇ antibody in APP669-711 ELISA.
  • the horizontal axis represents the concentration of added anti-A ⁇ antibody (ng / mL), and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the dots are connected by a line for each clone of the anti-A ⁇ antibody.
  • FIG. 13 is a graph showing the reactivity of APP669-711 ELISA against A ⁇ 1-40 when anti-A ⁇ antibody is added.
  • Four clones were used as the anti-A ⁇ antibody.
  • the horizontal axis indicates the concentration of A ⁇ 1-40 (fmol / mL), and the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • the amount of anti-A ⁇ antibody added was 3000 ng / mL.
  • Example B4 Verification of anti-A ⁇ antibody addition effect in A ⁇ 1-40 sandwich ELISA
  • Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit Waako Pure Chemical Industries
  • the samples were standard contained in Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit and A ⁇ 1-40 purchased from AnaSpec.
  • 4G8 concentration is 100 ng so that A ⁇ 1-40 concentration is 50 fmol / mL / mL or 6E10 concentration was adjusted to 300 ng / mL.
  • These solutions were operated according to the protocol in the instruction manual of Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit, and the absorbance was measured. Further, as a reference, the operation was performed without adding 4G8 or 6E10, and the absorbance was measured (indicated as “non-spiked” in FIG.
  • an anti-A ⁇ antibody to be added as an antigen-affinity substance, which has an epitope that is located at a certain spatial distance from the epitope recognized by the antibody used in the sandwich ELISA.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of addition of anti-A ⁇ antibodies 4G8 and 6E10 in A ⁇ 1-40 ELISA.
  • the vertical axis indicates the absorbance (Absorbance) at 450 nm / 650 nm.
  • standard included in ELISA Kit and A ⁇ 1-40 of AnaSpec were used.
  • the analysis target polypeptides are APP669-711 and A ⁇ 1-40.
  • the present invention is also useful for sandwich ELISAs that analyze polypeptides and proteins other than these. Further, the present invention is not limited to the ELISA method, and can be similarly applied to a sandwich method using other labels.

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Abstract

アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９－７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９－ｘと呼ぶ）を認識する抗体を提供する。さらに、その抗体を用いてＡＰＰ６６９－ｘを測定する方法を提供する。分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供する。ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９－ｘと前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９－ｘを測定することを含む、免疫測定法。

Description

ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
　本発明は、アルツハイマー病分野における免疫学的測定方法に関する。より詳細には、本発明は、アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９－７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９－ｘと呼ぶ）を認識する抗体、及び、その抗体を用いてＡＰＰ６６９－ｘを測定する方法に関する。
　また、本発明は、微量成分や感染微生物抗原等の臨床検査薬、生化学研究、及び免疫学研究等の分野に属し、特異的な免疫反応を利用したサンドイッチ型免疫測定法にも関する。より詳しくは、本発明は、試料中の微量ポリペプチドを検出及び定量するのに有用なサンドイッチ型免疫測定法にも関する。
　アルツハイマー病（Alzheimer's disease； ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０－６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０４０年には８１００万人に達すると推定される。アルツハイマー病の発症にはＡβが深く関わっていると考えられている。Ａβは、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される。Ａβの線維化を伴う凝集により老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、極度の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０mer（Ａβ１－４０）と４２mer（Ａβ１－４２）からなることが古くから知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ移行することもわかっている。また、血液中へも移行する可能性も示唆されている。さらに近年では、Ａβ１－４０とＡβ１－４２とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦ中にも存在することが知られている。
　Ａβについては、最近の研究で、本発明者らによって、Ａβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）の一つであるＡＰＰ６６９－７１１とＡβ１－４２との比が血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１，特許文献１：国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８）。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を行うことにより定量されている。
　さらに、本発明者らによって、特許文献２：国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９には、Ａβ及びＡβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）についての３つの比、Ａβ１－３９／Ａβ１－４２、Ａβ１－４０／Ａβ１－４２、及びＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２からなる群より選ばれる２以上の比を数学的手法で組み合わせた数値が血液バイオマーカーとして有望であることが開示されている。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を行うことにより定量されている。
　このように、本発明者らによって、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を用いて、Ａβ関連ペプチドの一つであるＡＰＰ６６９－７１１とＡβ１－４２との比が血液バイオマーカー候補として有望であることが発見された。そして、その比ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２と、Ａβ１－４０／Ａβ１－４２の比とを組み合わせたcomposite biomarkerは脳内アミロイド蓄積を高精度に推定できることを日本とオーストラリアの多検体で示し、信頼性と汎用性のあるバイオマーカーであることが、本発明者らによって報告されている（非特許文献２）。
　ＡＰＰ６６９－７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）は有用である。一方、その他の分析技術として、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、有用な分析技術となり得る。
　現在、血漿中のＡβ１－４０やＡβ１－４２を分析可能なＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔは、各メーカー（和光純薬、ＩＢＬ等）から市販されている。
　特許文献３：特開２００５－１７０９５１号公報では、アミロイドβのＮ端部（Ａβ１－１６）を認識するモノクローナル抗体BAN-52aおよびBAN-50aや、アミロイドβのＣ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体BA-27a、BS-85およびBC-05aが開示されており、Ａβ１－４０やＡβ１－４２に特異的なサンドイッチＥＩＡが開示されている。
　特許文献４：特開２０１４－２０８６７８号公報では、Ａβ１１－ｘを特異的に認識する抗体が開示され、Ａβ１１－４０に対するサンドイッチＥＬＩＳＡや、Ａβ１１－ｘに対するウェスタンブロットが開示されている。
　しかし、ＡＰＰ６６９－ｘを免疫学的測定方法で分析する手段は知られていない。
　免疫測定法とは、特異的な抗原抗体反応を利用して試料中の分析対象物質の濃度を測定する方法であり、微量成分を特異的に、かつ、精度よく測定できることから、臨床検査や生化学研究などで広く利用されている。
　免疫測定法には、標識物質として酵素を利用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などがある。
　それら免疫測定法の中で、分析対象物質の異なるエピトープを認識する２つの抗体を用いて分析対象物質を挟み込む方法をサンドイッチ法と呼ぶ。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）とはＥＩＡの一つで、９６ウェルプレート面に固相された捕捉抗体で分析対象物質を捕捉し、その分析対象物質にペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識された検出抗体を反応させ、標識酵素の基質の発色を利用して分析対象物質の濃度を決定する方法である（例えば、特許文献５：特開平８－２２００９８号公報）。ＥＣＬＩＡにおいても、分析対象物質に対して、ビオチン化された抗体と、電気化学的変化で発光するルテニウム（Ｒｕ）錯体を標識した抗体とを反応させるサンドイッチ法を利用している（例えば、特許文献６：特表２０１４－５０９７３５号公報）。このように、免疫測定法ではサンドイッチ法が広く利用されている。
　特定のペプチド断片を特異的に定量する方法としてもサンドイッチ法は利用され、分析対象ペプチド断片をＮ末端認識抗体とＣ末端認識抗体で挟み込む方法でペプチド断片を特異的に測定している。例えば、アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein； ＡＰＰ）からプロテアーゼによって切断されて生成されるＡβについては、異なる断片のペプチドが生体内に存在している。それらの中でＡβ１－４２は、アルツハイマー病の脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーとして、ＥＬＩＳＡなどの免疫測定法で定量されている（非特許文献３）。
　特許文献７：特開２００４－２３９８８５号公報には、免疫測定法の測定感度を改善する方法の一つとして、試料中から抽出しにくいタンパク質に対して、免疫測定法の前に高濃度のイオン性界面活性剤で試料を抽出する方法が報告されている。
国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８ 国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９ 特開２００５－１７０９５１号公報 特開２０１４－２０８６７８号公報 特開平８－２２００９８号公報 特表２０１４－５０９７３５号公報 特開２００４－２３９８８５号公報
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014; 90(9): 353-64. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018; 554 (7691): 249-254. Blennow K. :Cerebrospinal Fluid Protein Biomarkers for Alzheimer's Disease. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 2004 Apr;1(2):213-25. Murakami K, Masuda Y, Shirasawa T, Shimizu T, Irie K. : The turn formation at positions 22 and 23 in the 42-mer amyloid beta peptide: the emerging role in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2010 Jul;10 Suppl 1:S169-79.
　ペプチド特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを構築するためには、Ｎ末端とＣ末端を特異的に認識する抗体が必要となる。ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端はＡβ１－４０（すなわち、ＡＰＰ６７２－７１１）のＣ末端と同じであり、ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を特異的に認識する抗体は存在する。しかし、ＡＰＰ６６９－７１１のＮ末端を特異的に認識する抗体は存在しない。
　ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体が存在しないため、ＡＰＰ６６９－７１１を特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡやＡＰＰ６６９－ｘを免疫学的測定方法で分析する手段がない。
　そこで、本発明の目的は、アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９－７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９－ｘと呼ぶ）を認識する抗体を提供することにある。さらに、本発明の目的は、その抗体を用いてＡＰＰ６６９－ｘを測定する方法を提供することにある。
　試料中の分析対象ポリペプチドをサンドイッチ免疫測定法で特異的に定量するためには、分析対象ポリペプチドの２箇所の異なる部位（エピトープ）に対して、それぞれを認識する２つの抗体を同時に分析対象ペプチドへ結合させる、もしくは、どちらか一方の抗体を結合させた後に、もう一方の抗体を結合させる。つまり、分析対象ポリペプチドの２箇所の異なる部位（エピトープ）に２つの抗体が同時に結合し、分析対象ポリペプチドが２つの抗体によりサンドイッチされた状態とする必要がある。
　ポリペプチドの一次構造としては２つの抗体が各々結合すべき２つの異なる認識部位（エピトープ）が互いに離れていても、ポリペプチドのコンフォメーションにより空間距離的に前記２つのエピトープが近い場合がある。分析対象ポリペプチドの前記２つのエピトープが空間距離的に近い場合には、前記２つの抗体が同時に結合することが難しくなり、サンドイッチ免疫測定法の感度が低下する要因となる。例えば、ペプチド断片であるＡβを測定するサンドイッチ免疫測定法では、Ｎ認識抗体とＣ末認識抗体とでペプチド断片を挟み込むが、一次構造としては２つの抗体の認識部位（エピトープ）が互いに離れていても、空間距離的には２つのエピトープが近い（非特許文献４）。そのため、サンドイッチ免疫測定法の感度低下を引き起こす可能性がある。
　本発明の目的は、分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供することにある。とりわけ本発明の目的は、分析対象Ａβ及びＡβ関連ペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キットを提供することにある。
　本発明者は、鋭意検討の結果、ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）結合合成ペプチドVKMCをマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。この抗体を用いてＡＰＰ６６９－ｘを特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡ等の免疫測定法を構築した。これにより、ＡＰＰ６６９－ｘのＥＬＩＳＡキットを構成することもできる。
　本発明は、以下の発明を含む。
（１）　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。
（２）　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９－ｘと前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９－ｘを測定することを含む、免疫測定法。
（３）　前記免疫測定法が、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる、上記（２）に記載の免疫測定法。
（４）　前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９－ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９－ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いる、上記（３）に記載の免疫測定法。
（５）　前記第２の抗体が、ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、上記（３）又は（４）に記載の免疫測定法。
（６）　前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、上記（３）～（５）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（７）　前記試料に、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、上記（３）～（６）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（８）　前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、上記（７）に記載の免疫測定法。
（９）　前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、上記（７）又は（８）に記載の免疫測定法。
（１０）　前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（２）～（９）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（１１）　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
　ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
を含む、ＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
（１２）　さらに、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を含む、上記（１１）に記載のＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
　また、本発明者は、鋭意検討の結果、分析対象ポリペプチドのコンフォメーションを変化させ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープを空間距離的に互いに遠ざける処置を施すことにより、具体的には、分析対象ポリペプチドに親和性のある物質（抗原親和性物質）を該分析対象ポリペプチドに結合させてコンフォメーションを変化させることにより、分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が得られることを見出した。それにより、本発明を完成するに至った。
　本明細書において、ポリペプチドには、ペプチド、及びタンパク質が含まれる。前記タンパク質には、糖タンパク、リン酸化タンパク質などの翻訳後修飾されたタンパク質も含まれる。
　本明細書において、アミロイド・βペプチドの略称として「Ａβ」を用いる。すなわち、「Ａβ」とは、Ａβ１－４０、及びＡβ１－４２を含んでいる。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じる前記Ａβ以外のペプチドをＡβ関連ペプチド（又は、Ａβ様ペプチド）と称することがある。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβ関連ペプチド（又は、Ａβ様ペプチド）を、「ＡＰＰ派生型ペプチド」と称することがある。
　本発明は、以下の発明を含む。
（Ｂ－１）　試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、免疫測定法。
（Ｂ－２）　前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、上記（Ｂ－１）に記載の免疫測定法。
（Ｂ－３）　前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、上記（Ｂ－１）又は（Ｂ－２）に記載の免疫測定法。
（Ｂ－４）　前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－３）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（Ｂ－５）　前記第１の抗体が、前記標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体であり、前記第２の抗体が、前記標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体である、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－４）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（Ｂ－６）　前記抗原親和性物質が、前記標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものである、上記（Ｂ－５）に記載の免疫測定法。
（Ｂ－７）　前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものである、上記（Ｂ－５）又は（Ｂ－６）に記載の免疫測定法。
（Ｂ－８）　前記標的ポリペプチドが、Ａβ及びＡβ関連ペプチドからなる群から選ばれる、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－７）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（Ｂ－９）　前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－８）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。
（Ｂ－１０）　標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
　前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
　前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
を含む、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キット。
　本発明によれば、ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体が提供される。該ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体を用いて、ＡＰＰ６６９－ｘのサンドイッチ型免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、免疫細胞染色などの免疫学的測定方法が提供される。
　本発明によれば、好ましい態様として、ＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法が提供される。また、ＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための試薬キットが提供される。ＡＰＰ６６９－７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）は有用であるが、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、さらに有用な分析技術と言える。
　本発明のサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加する。このことにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドを高感度で検出及び定量できる。
　特定のポリペプチドＡβ（Ａβ１－４０、及びＡβ１－４２）や、Ａβ関連ペプチド（例えば、Ａβ１－３９、ＡＰＰ６６９－７１１）は、生体内に存在しており、アルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されていた。これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が望まれている。本発明によれば、これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が提供される。
図１は、実施例１－２において、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図２は、実施例１－２において、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図３は、実施例１－２において、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図４は、実施例２－１において、３種類のＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローンを用いたＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ＡＰＰ６６９－７１１濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図５は、実施例２－２において、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた場合の、ＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図６は、実施例２－４において、ＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト血漿測定の結果を示すグラフである。横軸は、各血漿サンプルを表し、縦軸は、ＡＰＰ６６９－７１１濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）を表す。 図７は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの検量線を示すグラフである。横軸はAPP669-711の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の濃度毎に検量線が示されている。 図８は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。APP669-711の濃度毎に点を線で繋いでいる。 図９は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。 図１０は、実施例Ｂ２において、Ｎ末端認識抗体３クローンを用いたAPP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。Ｎ末端認識抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。 図１１は、実施例Ｂ２において、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。Ｎ末端認識抗体として、３クローンを各々用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。 図１２は、実施例Ｂ３において、APP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体の４クローンの添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体の添加濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。 図１３は、実施例Ｂ３において、抗Aβ抗体添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。抗Aβ抗体は４クローンを用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。 図１４は、実施例Ｂ４において、Aβ1-40 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8及び6E10の添加効果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。サンプルとして、ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社のAβ1-40を用いた。
［１．ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体］
　本発明のＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体は、ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するものである。
　ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ結合合成ペプチドVKMC（配列番号５）をマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。より詳細な抗体作成は、実施例で述べられる。
　この抗体は、ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を認識する抗体であるので、ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号３）を含むＡＰＰ６６９－ｘに属する種々のペプチドのＮ末端を特異的に認識することができる。そのため、このＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９－ｘと前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを免疫反応させることができる。
［２．標的ＡＰＰ６６９－ｘペプチド］
　アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２－７１１とＡβ１－４０とは同じペプチドを表す（配列番号１）。ＡＰＰ６７２－７１３とＡβ１－４２とは同じペプチドを表す（配列番号２）。ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号３）は、ＡＰＰ６６９－ｘに属するものであり、ここで、ｘは、下限については６６９よりも大きく、例えば６７７よりも大きく、また、上限については、特に限定されることはなく、７７０またはそれよりも小さい。しかしながら、本発明の趣旨、すなわち、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体が、ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識することができ、免疫反応させることができるということからすれば、ｘの上限値は特に限定されることはない。例示すれば、ＡＰＰ６６９－ｘペプチドには、ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号３）、ＡＰＰ６６９－７０９、ＡＰＰ６６９－７１０、ＡＰＰ６６９－７１３などが挙げられる。
ＡＰＰ６７２－７１１（Ａβ１－４０）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２－７１３（Ａβ１－４２）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
［３．免疫測定法］
　本発明の免疫測定法は、ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９－ｘと前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９－ｘを測定することを含む。
　前記免疫測定法としては、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色などの種々の免疫測定法が挙げられる。通常の方法により、本発明のＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行うことができる。
　前記サンドイッチ型免疫測定法においては、前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９－ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９－ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いることができる。
　前記第２の抗体としては、ＡＰＰ６６９－ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体をを用いるとよい。測定対象ペプチドがＡＰＰ６６９－７１１の場合には、ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体を用いる。Ａβ１－４０のＣ末端は、ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端と同じであり、このようなＣ末端を認識可能な抗体は市販されている。
　前記サンドイッチ型免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）等が挙げられる。
　前記サンドイッチ型免疫測定法において、通常の手法に従い、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを含む試料に、前記第１の抗体及び前記第２の抗体を逐次又は同時に添加して、免疫反応させるとよい。
　さらに、本発明において、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを含む試料に、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを行ってもよい。
　この場合、前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させることができる。
　試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドをより高感度で検出及び定量できる。
　前記抗原親和性物質は、標的ポリペプチドに親和性を有し結合可能な物質であればよく、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマー等が挙げられる。ここでの結合とは、静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、双極子相互作用、分散力などの分子間相互作用による結合が含まれる。標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられるものであればよい。
　前記抗原親和性物質としての抗体としては、前記第１の抗体及び前記第２の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ抗体を用いるとよい。
前記抗原親和性物質としてのペプチドとしては、２～１２アミノ酸残基からなるペプチドを用いるとよく、例えば、Ａβに結合するペプチドであれば、iAβ5（５アミノ酸）、D3（１２アミノ酸）、NH2-D-Trp-Aib-OH（２アミノ酸）等が例示される。
前記抗原親和性物質としての低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物を用いるとよく、例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。Ａβに結合する低分子化合物であれば、Scyllo-inositol等が例示される。各種の阻害剤（例えば、Stemolecule TM 低分子化合物の各種）も挙げられる。
前記抗原親和性物質としての核酸アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等が挙げられる。
　前記抗原親和性物質の添加量は、試料中の標的ポリペプチドの種類や量、及び抗原親和性物質の種類にもより、特に限定されることはなく、標的ポリペプチドに結合して該標的ポリペプチドのコンフォメーションを変化させられる量とすればよい。例えば、前記抗原親和性物質の添加量は、標的ポリペプチドを含んでいる試料中の濃度として、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～１００００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～３０００ｎｇ／ｍＬ程度とするとよい。
　前述したように、前記サンドイッチ型免疫測定法においては、前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９－ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９－ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いることができる。
　この場合には、前記抗原親和性物質が、標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものが好ましい。標的ポリペプチドに対して、前記抗原親和性物質と前記第１の抗体との競合や阻害が起こることは好ましくないし、前記抗原親和性物質と前記第２の抗体との競合や阻害が起こることも好ましくない。
　より具体的には、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。さらに、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から６残基部位からＣ末端から６残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。
　標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、前記第１の抗体としての標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
　本発明のサンドイッチ型免疫測定法は、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などにも適用できる。
　本発明のサンドイッチ型免疫測定法の基本的操作は、試料に抗原親和性物質を添加する場合も、公知の操作に従って行なうことができる。
　本発明において、標的ＡＰＰ６６９－ｘペプチドは生体試料に含まれる。生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；　及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
　本発明のＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチ型免疫測定用キットは、上記のサンドイッチ型免疫測定を行うためのものであって、
　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
　ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
を含むものである。
　キットは、さらに、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を含んでもよい。また、キットには、サンドイッチ型免疫測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
　本発明の免疫測定法は、試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む。
　本発明の免疫測定法において、前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させることができる。
　試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドを高感度で検出及び定量できる。
　前記抗原親和性物質は、標的ポリペプチドに親和性を有し結合可能な物質であればよく、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマー等が挙げられる。ここでの結合とは、静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、双極子相互作用、分散力などの分子間相互作用による結合が含まれる。標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられるものであればよい。
　前記抗原親和性物質としての抗体としては、前記第１の抗体及び前記第２の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ抗体を用いるとよい。
前記抗原親和性物質としてのペプチドとしては、２～１２アミノ酸残基からなるペプチドを用いるとよく、例えば、Ａβに結合するペプチドであれば、iAβ5（５アミノ酸）、D3（１２アミノ酸）、NH2-D-Trp-Aib-OH（２アミノ酸）等が例示される。
前記抗原親和性物質としての低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物を用いるとよく、例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。Ａβに結合する低分子化合物であれば、Scyllo-inositol等が例示される。各種の阻害剤（例えば、Stemolecule TM 低分子化合物の各種）も挙げられる。
前記抗原親和性物質としての核酸アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマー等が挙げられる。
　前記抗原親和性物質の添加量は、試料中の標的ポリペプチドの種類や量、及び抗原親和性物質の種類にもより、特に限定されることはなく、標的ポリペプチドに結合して該標的ポリペプチドのコンフォメーションを変化させられる量とすればよい。例えば、前記抗原親和性物質の添加量は、標的ポリペプチドを含んでいる試料中の濃度として、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～１００００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～３０００ｎｇ／ｍＬ程度とするとよい。
　本発明において、標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体としては、サンドイッチ型免疫測定法で用いられている種々のものを用いることができる。
　例えば、前記第１の抗体として、標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を用いて、前記第２の抗体として、標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を用いることができる。
　この場合には、前記抗原親和性物質が、標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものが好ましい。標的ポリペプチドに対して、前記抗原親和性物質と前記第１の抗体との競合や阻害が起こることは好ましくないし、前記抗原親和性物質と前記第２の抗体との競合や阻害が起こることも好ましくない。
　より具体的には、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。さらに、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から６残基部位からＣ末端から６残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。
　標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、前記第１の抗体としての標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
　本発明のサンドイッチ型免疫測定法は、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などにも適用できる。
　本発明のサンドイッチ型免疫測定法の基本的操作は、試料に抗原親和性物質を添加すること以外は、公知の操作に従って行なうことができる。
　本発明は、標的ポリペプチドがＡβ及びＡβ関連ペプチドである場合に特に好適である。Ａβ（Ａβ１－４０、及びＡβ１－４２）や、Ａβ関連ペプチド（例えば、Ａβ１－３９、ＡＰＰ６６９－７１１）は、生体内に存在しており、アルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されている。これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が望まれていた。本発明により、これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が提供される。以下に、Ａβ及びＡβ関連ペプチドの例を示す。
ＡＰＰ６７２－７０９（Ａβ１－３８）（配列番号６）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６７４－７１１（Ａβ３－４０）（配列番号７）：
EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２－７１０（Ａβ１－３９）（配列番号８）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６７２－７１１（Ａβ１－４０）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＯｘＡＰＰ６７２－７１１（ＯｘＡβ１－４０）（配列番号９）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV （Met ７０６が酸化されている）
ＡＰＰ６７２－７１３（Ａβ１－４２）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
　アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２－７１３とＡβ１－４２とは同じペプチドを表す（配列番号２）。また、ＡＰＰ６７２－７１１とＡβ１－４０とは同じペプチドを表す（配列番号１）。本発明において、標的ポリペプチドには、上記例示のもの以外にも、種々のＡβ関連ペプチドが限定されることなく含まれる。また、本発明は、Ａβ及びＡβ関連ペプチド以外の各種ポリペプチドにも適用される。
　本発明において、標的ポリペプチドは生体試料に含まれる。生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；　及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
　本発明のポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キットは、上記のサンドイッチ型免疫測定を行うためのものであって、
　標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
　前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
　前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
を含む。
　キットには、サンドイッチ型免疫測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。
［実施例１：ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体の作成］
［実施例１－１：モノクローナル抗体の作成］
　合成ペプチドVKMC（配列番号５）のＣ末端のCysを、二価反応性試薬を用いてキャリアタンパク質（ＫＬＨ）に結合させた。
　このＫＬＨ結合合成ペプチドをFCA（フロインドコンプリートアジュバンド）と注射筒を用いて混和して乳化させ、BALB/cマウス１匹に対して２００μｇを尾根部筋肉内に注射（免疫）した。さらに抗原をFICA（フロインドインコンプリートアジュバンド）を混和して乳化させ、二週間間隔で２回、マウス１匹に対して５０μｇを皮下に注射（追加免疫）した。その後、マウス１匹に対して１００μｇを腹腔に最終免疫した。
　最終免疫より３日後に脾臓を採取し、リンパ球を分離した後、－８０℃で凍結保存した。また、マウスより全採血を実施し、血液から血清を分離後、－４０℃で凍結保存した。
　得られたリンパ球とマウスミエローマを５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を実施した。融合細胞を９６ウェルマイクロプレート８枚に分注して培養した。細胞融合から８日後、９６ウェルマイクロウェルプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングした。その後、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性クローンのハイブリドーマを凍結保存した。
　取得したハイブリドーマ（クローン20-1A, 24-6G, 34-6E）は高密度無血清培養を行った。その培養上清からProtein Aを用いて抗体を精製した。
［実施例１－２：直接ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体の特異性の確認］
　ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eの特異性を直接ＥＬＩＳＡで評価した。直接ＥＬＩＳＡは以下のように行った。
　合成ペプチドＡＰＰ６６９－７１１（ペプチド研）、Ａβ１－４０（ペプチド研）、又はＡＰＰ６６８－６７７（配列番号４）（東レリサーチセンター）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５０，又は５００ｐｍｏｌ／ｍＬの各濃度に希釈した。合成ペプチドの配列は表１に示す。各合成ペプチド溶液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、２時間インキュベーションすることで固相化した。また、ブランクウェルも用意した。プレート中の溶液を除去し、４倍希釈ブロックエース（ＤＳファーマ）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ（0.05% Tween20 in PBS）３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間インキュベートした。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで４０００倍希釈したＨＲＰ標識－抗マウスIgG抗体（ZYMED）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
　これらの結果を図１～３に示す。すなわち、図１は、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図２は、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図３は、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図１～３において、横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
　図１～３より、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体の全てのクローン20-1A, 24-6G, 34-6Eで、ＡＰＰ６６９－７１１に反応することを確認した。一方、Ａβ１－４０やＡＰＰ６６８－６７７には全く反応性が確認されなかった。ＡＰＰ６６９－７１１はＮ末端側３アミノ酸がＡβ１－４０よりも長いだけで他のアミノ酸配列はＡβ１－４０と同じであるが、Ａβ１－４０には反応を示さなかったことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９－７１１のＮ末端側３アミノ酸を認識することを示している。また、ＡＰＰ６６８－６７７はＡＰＰ６６９－７１１よりもＮ末端側に１アミノ酸だけ長いだけだが、クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eは反応しなくなった。このことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９－７１１のＮ末端を特異的に認識していることを示している。
　以上の結果により、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体の３種類のクローンは、ＡＰＰ６６９－７１１のＮ末端を特異的に認識していることを確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２：ＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ］
［実施例２－１：ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体の３種類のクローンを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ］
　ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体クローン20-1A、24-6G、及び、34-6Eを捕捉抗体として用いて、ＡＰＰ６６９－７１１に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの反応性を評価した。
　ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、６時間インキュベーションすることで固相化した。プレート中の溶液を除去し、２０％ Blocking One（ナカライテスク）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。サンプル用バッファーＡ（5% Blocking One in PBST）で希釈した合成ペプチドＡＰＰ６６９－７１１をサンプル溶液として５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナトでインキュベートした。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＨＲＰ標識されたＣ末端認識抗体（クローンBA27）溶液を5% Blocking One in PBST で５倍希釈した後、５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキットを１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
　これらの結果を図４に示す。すなわち、図４は、３種類のＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローンを用いたＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ＡＰＰ６６９－７１１濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
　図４より、３種類のＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体クローンのうち34-6EがＡＰＰ６６９－７１１と最も反応性が高いことが示された。これ以降の実施例では、34-6EにフォーカスしてサンドイッチＥＬＩＳＡを評価した。
［実施例２－２：サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性の確認］
　ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体クローン34-6Eを捕捉抗体として用いて、ＡＰＰ６６９－７１１に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を評価した。サンドイッチＥＬＩＳＡは以下のように行った。
　ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識抗体クローン34-6Eを炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、６時間インキュベーションすることで固相化した。プレート中の溶液を除去し、４倍希釈ブロックエースを１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。サンプル用バッファーＢ［10倍希釈ブロックエース、60 ng/mL 抗Aβ抗体クローン4G8（BioLegend, エピトープＡβ１８－２２）］で希釈した合成ペプチドＡＰＰ６６９－７１１、又はＡβ１－４０をサンプル溶液として５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。各サンプルは２重測定で行った。なお、サンプル用バッファーＢには反応性を高める目的で抗Aβ抗体クローン4G8（６０ｎｇ／ｍＬ）が含まれていた。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＨＲＰ標識されたＣ末端認識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキットを１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
　これらの結果を図５に示す。すなわち、図５は、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた場合の、ＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
　図５より、ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6EとＣ末端認識抗体（クローンBA27）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡはＡＰＰ６６９－７１１には反応を示したが、Ａβ１－４０には全く反応を示さなかった。このことにより、ＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を確認できた。
　また、異なる濃度の合成ペプチドＡＰＰ６６９－７１１をｎ＝４で測定して定量下限（Blank 吸光度 + 2SD）を求めたところ、２．４２ｆｍｏｌ／ｍＬであった。
［実施例２－３：ＡＰＰ６６９－７１１ ＥＬＩＳＡ添加回収試験］
　ヒト血漿中の測定干渉物質による測定値への影響を確認するために、ＡＰＰ６６９－７１１ ＥＬＩＳＡの添加回収試験を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡは前記実施例２－２と同様に行った。サンプルはサンプル用バッファーで４倍希釈した市販血漿（Tennessee Blood Services）を用いた。添加ＡＰＰ６６９－７１１濃度は、０，５，１０，又は２０ｆｍｏｌ／ｍＬとなるようにＡＰＰ６６９－７１１を添加した。
　添加回収率を評価した結果、８９～９１％と問題のない範囲を示した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例２－４：ＡＰＰ６６９－７１１ ＥＬＩＳＡによる血漿測定］
　ＡＰＰ６６９－７１１ ＥＬＩＳＡを用いて血漿中の内在性ＡＰＰ６６９－７１１を定量した。サンプルはサンプル用バッファーで４倍希釈した市販血漿５検体を用いて、２重測定で行った。
　これらの結果を図６に示す。すなわち、図６は、ＡＰＰ６６９－７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト血漿測定の結果を示すグラフである。横軸は、各血漿サンプルを表し、縦軸は、ＡＰＰ６６９－７１１濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）を表す。
　図６より、５検体全てで定量下限（２．４２ｆｍｏｌ／ｍＬ）を上回る濃度を示した。以上の結果から、本サンドイッチＥＬＩＳＡは血漿中ＡＰＰ６６９－７１１を定量するのに十分な測定系であることが示された。
［実験例Ｂ１：APP669-711のサンドイッチELISAの操作方法］
　まず、実験例Ｂ１では、APP669-711のサンドイッチELISAの基本操作方法について以下に示す。実施例Ｂ１～Ｂ４の各操作はこの操作方法に基づいて行った。
（Ｎ末端認識抗体）
　APP669-711のＮ末端を認識する抗体の作成をＩＴＭ社へ依頼し、３クローン（20-1A、24-6G、34-6E）を取得した。
（Ｎ末端認識抗体の固相化とブロッキング）
　Ｎ末端認識抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で20 μg/mLの濃度に希釈し、得られた抗体希釈溶液を96 well plateの各wellに50 μLずつ加え、４℃、２時間インキュベーションすることでＮ末端認識抗体を固相化した。Plate中の抗体希釈溶液を除去し、20% Blocking One（ナカライテスク）を各wellに100 μLずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。
（サンプル溶液の調製）
　測定対象ペプチドAPP669-711を5% Blocking One in PBSTで所定の濃度にしてサンプル溶液を調製した。また、抗原親和性物質として用いる抗体を5% Blocking One in PBSTで任意の濃度に調製し、サンプル溶液に等量添加した。
（サンプル溶液の添加）
　Plate中の20% Blocking Oneを除去し、PBST 300 μLで３回洗浄した。前記サンプル溶液をplateの各wellに50 μLずつ入れて、４℃、１時間インキュベートした。
（Ｃ末端認識するHRP標識抗体の添加）
　Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＣ末端を認識するHRP標識抗体（クローンBA27）溶液を5% Blocking One in PBSTで５倍希釈した。Plate中のサンプル溶液を除去し、PBST 300 μLで３回洗浄した。５倍希釈したHRP標識抗体（BA27）溶液を50 μLずつ入れて、４℃、１時間でインキュベートした。Plate中の溶液を除去し、PBST 300 μLで５回洗浄した。
（酵素標識抗体添加と吸光度測定）
　ELISA POD基質TMBキット（ナカライ）を100 μL ずつ加えて、暗所で１５分インキュベーションして発色させた。２Ｎ硫酸を100 μL ずつ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
［実施例Ｂ１］
［抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 サンドイッチELISA反応性評価］
　アミロイドβ（Aβ）1-40は空間距離的にＣ末端とＮ末端が近い構造を取っている（非特許文献４）。Aβ1-40のＮ末端から３アミノ酸長くなっただけのAPP669-711もＣ末端とＮ末端が近いと考えられる。そこで、APP669-711に結合可能な抗体をサンプルに添加することにより、コンフォメーションが変化し、サンドイッチELISAの反応性が向上するかどうかを検証した。APP669-711に結合可能な抗体（抗原親和性物質）として、抗Aβ抗体4G8を用いた。
　APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体4G8を添加することで、APP669-711濃度が0 fmol/mL、15.625 fmol/mL、31.25 fmol/mL、62.5 fmol/mL、125 fmol/mL、250 fmol/mL、500 fmol/mL、1000 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。クローン4G8のエピトープはAβ18-22である。固相化抗体としてはＮ末端認識抗体クローン34-6Eを用いた。その結果、4G8添加なし（0 ng/mL）と比べて、抗Aβ抗体4G8を添加することにより吸光度が増加した（図７）。添加濃度100 ng/mLまでは濃度依存的に増加し、それを超えると徐々に低下した（図８）。
　吸光度が増加した理由として、抗Aβ抗体4G8がプレートに固相化され、それがAPP669-711を捕捉し、Ｃ末端認識HRP標識抗体とサンドイッチしたことで反応した可能性も考えられる。それを検証するため、抗Aβ抗体4G8は反応するが、Ｎ末端認識抗体34-6E では反応しないAβ1-40（0～1000 fmol/mL）のサンプル溶液を用いて、抗Aβ抗体4G8を10000 ng/mL添加したときのAPP669-711 サンドイッチELISA反応性を評価した。抗Aβ抗体4G8のエピトープはAβ18-22であるため、仮に抗Aβ抗体4G8が固相化されたら反応性を示す。しかし、本測定結果では反応を示していなかった（図９）。つまり、抗Aβ抗体4G8が固相化され、それがAPP669-711を捕捉したことで反応性が増したわけではないことが確認された。以上の結果から、抗Aβ抗体4G8をサンプル溶液に添加することで、APP669-711への特異性を保持したまま、サンドイッチELISAの反応性を向上させることが判明した。
　図７は、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの検量線を示すグラフである。横軸はAPP669-711の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の濃度毎に検量線が示されている。
　図８は、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。APP669-711の濃度毎に点を線で繋いでいる。
　図９は、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の添加量は10000 ng/mLであった。
［実施例Ｂ２：Ｎ末端認識抗体のクローンを変えたときの抗Aβ抗体4G8添加効果の検証］
　固相化抗体として使用するＮ末端認識抗体のクローンを変えたときに、抗Aβ抗体4G8添加の効果があるかどうかを検証するための実験を行った。
　APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体4G8を添加することで、APP669-711濃度が500 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。固相化抗体はＮ末端認識抗体の３クローン20-1A、24-6G及び34-6Eをそれぞれ用いた。その結果、３クローン全てにおいて吸光度の増加が確認され、各クローンにおいて最も高い吸光度を示した抗Aβ抗体4G8添加濃度は共通して100 ng/mLだった（図１０）。つまり、どのクローンでも最適な抗Aβ抗体4G8添加濃度は同じであった。
　なお、各クローンを固相化したAPP669-711 サンドイッチELISAにおいて、抗Aβ抗体4G8を3000 ng/mL添加したときのAβ1-40（0～1000 fmol/mL）のサンプル溶液への反応性を評価したが、反応は認められなかった（図１１）。つまり、抗Aβ抗体4G8が固相化され、それがAPP669-711を捕捉することで反応性が増したわけではないことが確認された。
　図１０は、Ｎ末端認識抗体３クローンを用いたAPP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。Ｎ末端認識抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。
　図１１は、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。Ｎ末端認識抗体として、３クローンを各々用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の添加量は3000 ng/mLであった。
［実施例Ｂ３：添加する抗Aβ抗体を変えたときのAPP669-711 サンドイッチELISA反応性向上効果の検証］
　サンプルに添加する抗Aβ抗体のクローンを変えたときに、APP669-711 サンドイッチELISAの反応性が向上する効果があるかどうかを検証するための実験を行った。
　APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体４クローン（4G8、6E10、BAM90.1、又はNAB228）を添加することで、APP669-711濃度が500 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。クローン6E10のエピトープはAβ3-8、BAM90.1はAβ20-23であり、NAB228はAβ1-11の中の一部がエピトープとなる。固相化抗体はＮ末端認識抗体クローン34-6Eを用いた。測定の結果、添加した抗Aβ抗体４クローン全てにおいて吸光度の増加が認められた（図１２）。各クローンで最も高い吸光度を示した濃度は、4G8では100 ng/mL、6E10では300 ng/mL、BAM90.1では1000 ng/mL、NAB228では3000 ng/mLであった。つまり、クローンによって最適な濃度は異なっていた。
　なお、APP669-711 サンドイッチELISAにおいて、各クローンの抗Aβ抗体を3000 ng/mL添加したときのAβ1-40（0～1000 fmol/mL、具体的には、0 fmol/mL、500 fmol/mL、1000 fmol/mL）のサンプル溶液への反応性を評価したが、反応は認められなかった（図１３）。つまり、どのクローンを添加した場合においても、固相化され、APP669-711を捕捉することで反応性が増したわけではないことが確認された。
　図１２は、APP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体の４クローンの添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体の添加濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。
　図１３は、抗Aβ抗体添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。抗Aβ抗体は４クローンを用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体の添加量は3000 ng/mLであった。
［実施例Ｂ４：Aβ1-40 サンドイッチELISAにおける抗Aβ抗体添加効果の検証］
　Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）を用いて、Aβ1-40 サンドイッチELISA についても、抗Aβ抗体を添加して反応性が向上するかどうかを検証するための実験を行った。
　サンプルはHuman βAmyloid(1-40)ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社から購入したAβ1-40とした。それぞれのサンプルのAβ1-40 (Standard in kit、又はAnaSpec product)に、抗Aβ抗体クローン4G8又は6E10を添加することで、Aβ1-40濃度が50 fmol/mLとなるように、4G8濃度が100 ng/mL又は6E10濃度が300 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液をHuman βAmyloid(1-40)ELISA Kitの取り扱い説明書のプロトコールに従って操作を行い、吸光度を測定した。また、基準として、4G8も6E10も添加しないで操作を行い、吸光度を測定した(図１４において、"non-spiked"と表記されている)。その結果、クローン4G8添加では基準に対して吸光度の増加が認められたが、クローン6E10添加では基準に対して吸光度に変化を与えなかった。6E10はエピトープがAβ3-8であり、Aβ1-40のＮ末端に近いため、ELISAの固相化抗体として使用しているＮ末端認識抗体が立体構造的に6E10の結合を妨害していると考えられる。一方、クローン4G8はエピトープがAβ18-22であり、Ｎ末端認識抗体とは空間距離的に離れているため、Aβ1-40 サンドイッチELISAの反応性向上に寄与したと考えられる。
　このため、抗原親和性物質として添加する抗Aβ抗体については、サンドイッチELISAで用いる抗体が認識するエピトープからある程度空間距離的に離れている部位をエピトープとする抗体を選択する必要があると考えられる。
　図１４は、Aβ1-40 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8及び6E10の添加効果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。サンプルとして、ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社のAβ1-40を用いた。
　以上の実施例Ｂ１～Ｂ４の結果から、分析対象ポリペプチドであるAPP669-711やAβ1-40に対して結合する抗体を添加することにより、それぞれに対応するサンドイッチELISAの反応性が向上する効果があることが判明した。
　以上の各実施例では、分析対象ポリペプチドがAPP669-711及びAβ1-40である例を示した。本発明は、これら以外のポリペプチドやタンパク質を分析対象とするサンドイッチELISAについても有用である。また、本発明は、ELISA法に限らず、他の標識を用いるサンドイッチ法についても同様に適用できる。

Claims (22)

  1. 　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。
  2. 　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９－ｘと前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９－ｘを測定することを含む、免疫測定法。
  3. 　前記免疫測定法が、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる、請求項２に記載の免疫測定法。
  4. 　前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記ＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９－ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９－ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いる、請求項３に記載の免疫測定法。
  5. 　前記第２の抗体が、ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項３に記載の免疫測定法。
  6. 　前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、請求項３に記載の免疫測定法。
  7. 　前記試料に、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、請求項３に記載の免疫測定法。
  8. 　前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
    　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
    　前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９－ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、請求項７に記載の免疫測定法。
  9. 　前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、請求項７に記載の免疫測定法。
  10. 　前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項２に記載の免疫測定法。
  11. 　ＡＰＰ６６９－ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９－ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
    　ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
    を含む、ＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
  12. 　さらに、ＡＰＰ６６９－ｘに結合可能な抗原親和性物質を含む、請求項１１に記載のＡＰＰ６６９－７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
  13. 　試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、免疫測定法。
  14. 　前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
    　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
    　前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、請求項１３に記載の免疫測定法。
  15. 　前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
  16. 　前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
  17. 　前記第１の抗体が、前記標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体であり、前記第２の抗体が、前記標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体である、請求項１３に記載の免疫測定法。
  18. 　前記抗原親和性物質が、前記標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものである、請求項１７に記載の免疫測定法。
  19. 　前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものである、請求項１７に記載の免疫測定法。
  20. 　前記標的ポリペプチドが、Ａβ及びＡβ関連ペプチドからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
  21. 　前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項１３に記載の免疫測定法。
  22. 　標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
    　前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
    　前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
    を含む、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キット。
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