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CN111770935A - 特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法 - Google Patents

特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法 Download PDF

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CN111770935A
CN111770935A CN201980015355.9A CN201980015355A CN111770935A CN 111770935 A CN111770935 A CN 111770935A CN 201980015355 A CN201980015355 A CN 201980015355A CN 111770935 A CN111770935 A CN 111770935A
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antibody
app669
immunoassay
antigen
target polypeptide
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Shimadzu Corp
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Abstract

提供识别包括淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669‑711的、N末端从APP669开始的肽(将其总称为APP669‑x)的抗体。还提供使用该抗体测定APP669‑x的方法。提供可以以高灵敏度检测及定量分析对象多肽的夹心免疫测定法。一种APP669‑x N末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669‑x肽的N末端。一种免疫测定法，其包括：使用特异性识别APP669‑x肽的N末端的APP669‑x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669‑x和上述APP669‑x N末端识别单克隆抗体反应而测定APP669‑x。

Description

特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病领域中的免疫学测定方法。更详细而言，本发明涉及识别包括淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669-711的、N末端从APP669开始的肽(将其总称为APP669-x)的抗体、以及使用该抗体测定APP669-x的方法。
另外，本发明属于微量成分和感染微生物抗原等的临床检查药、生化研究及免疫学研究等领域，还涉及利用特异性免疫反应的夹心型免疫测定法。更详细而言，本发明还涉及在检测及定量试样中的微量多肽时有用的夹心型免疫测定法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease；AD)是痴呆症的主要原因，占痴呆症整体的50-60％。据推断，在2001年已达2400万人以上的全世界痴呆症患者数，将在2040年达到8100万人。一般认为，阿尔茨海默病的发病与Aβ密切相关。Aβ是如下产生的：作为单次跨膜蛋白的由770个氨基酸残基构成的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)由于β分泌酶和γ分泌酶而接受蛋白质分解，从而产生。当由于Aβ的伴有纤维化的凝集而出现老年斑时，以此为诱因，微管相关蛋白(tau蛋白)在神经细胞内凝集、蓄积而引起神经功能障碍、神经细胞死亡。作为其结果，一般认为会引发极度的认知能力下降。众所周知的是，Aβ主要由40mer(Aβ1-40)和42mer(Aβ1-42)构成，还已知其会向脑脊液(CSF)中转移。另外，还显示出也向血液中转移的可能性。另外，近年获知CSF中也存在Aβ1-40和Aβ1-42这样的长度不同的Aβ样肽。
关于Aβ，在最近的研究中本发明人们报道了作为Aβ关联肽(Aβ样肽)之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物(非专利文献1，专利文献1：国际公开WO2015/178398)。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOF MS)来定量。
进一步地，本发明人们在专利文献2：国际公开WO2017/047529中公开了：将选自由Aβ及Aβ关联肽(Aβ样肽)的3个比值、即Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42及APP669-711/Aβ1-42组成的组中的2种以上比值用数学方法组合而成的数值有望作为血液生物标志物。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOF MS)来定量。
综上，本发明人们发现，使用质谱(MALDI-TOF MS)定量的、作为Aβ关联肽之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物候补。然后，本发明人报道了：日本和澳大利亚的多个被检体显示，将该比值APP669-711/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的比值组合而得的复合生物标志物(composite biomarker)可以高精度地推断脑内淀粉样蛋白蓄积，为具有可靠性和通用性的生物标志物(非专利文献2)。
作为包含APP669-711的Aβ关联肽等生物标志物的分析技术，质谱(MALDI-TOF MS)是有用的。另一方面，作为此外的分析技术，夹心ELISA为广泛且常规地用作临床检查法的测定方法，并且廉价，因此可成为有用的分析技术。
目前，各厂商(和光纯药、IBL等)已经在销售能够分析血浆中的Aβ1-40、Aβ1-42的ELISA试剂盒。
专利文献3：日本特开2005-170951号公报公开了识别淀粉样蛋白β的N端部(Aβ1-16)的单克隆抗体BAN-52a及BAN-50a、以及特异性识别淀粉样蛋白β的C端部的单克隆抗体BA-27a、BS-85及BC-05a，公开了Aβ1-40、Aβ1-42特异性夹心EIA。
专利文献4：日本特开2014-208678号公报公开了特异性识别Aβ11-x的抗体，公开了针对Aβ11-40的夹心ELISA、以及针对Aβ11-x的蛋白质印迹。
但是，用免疫学测定方法分析APP669-x的手段尚属未知。
免疫测定法是指利用特异性抗原抗体反应测定试样中的分析对象物质的浓度的方法，由于可以特异性且精度良好地测定微量成分而广泛用于临床检查、生化研究等。
免疫测定法包括：使用酶作为标记物的酶免疫测定法(EIA)；使用放射性同位素的放射免疫测定法(RIA)；使用化学发光物质的化学发光免疫测定法(CIA)；使用荧光发光物质的荧光免疫测定法(FIA)；使用金属络合物的电化学发光免疫测定法(ECLIA)；使用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(BLIA)；用PCR扩增、检测标记在抗体上的核酸的免疫PCR；检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(TAI)；检测由于形成免疫复合体而凝集的胶乳的胶乳凝集比浊法(LA)；在纤维素膜上进行反应的免疫层析法等。
在上述免疫测定法中，将使用识别分析对象物质不同的表位的2种抗体来夹持分析对象物质的方法称为夹心法。例如，夹心ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)为EIA的一种，为如下方法：通过固定在96孔板表面的捕捉抗体捕捉分析对象物质，使标记有过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶的检测抗体与该分析对象物质反应，利用标记酶的底物的显色来确定分析对象物质的浓度(例如专利文献5：日本特开平8-220098号公报)。ECLIA中也利用了夹心法，所述夹心法是下述方法：使生物素化的抗体、标记有因电化学变化而发光的钌(Ru)络合物的抗体与分析对象物质反应(例如专利文献6：日本特表2014-509735号公报)。这样，免疫测定法中广泛使用夹心法。
作为特异性定量特定的肽片段的方法，也使用夹心法，通过用N末端识别抗体和C末端识别抗体夹持分析对象肽片段的方法来特异性测定肽片段。例如，对于蛋白酶切断淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)而生成的Aβ而言，在生物体内存在不同片段的肽。这些中，Aβ1-42作为阿尔茨海默病的脑脊液(CSF)生物标志物而通过ELISA等免疫测定法进行定量(非专利文献3)。
专利文献7：日本特开2004-239885号公报报道了下述方法：作为改善免疫测定法的测定灵敏度的方法之一，对于难以从试样中提取的蛋白质，在免疫测定法之前用高浓度的离子型表面活性剂对试样进行提取。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2015/178398
专利文献2:国际公开WO2017/047529
专利文献3:日本特开2005-170951号公报
专利文献4:日本特开2014-208678号公报
专利文献5:日本特开平8-220098号公报
专利文献6:日本特表2014-509735号公报
专利文献7:日本特开2004-239885号公报
非专利文献
非专利文献1:Kaneko N,Nakamura A,Washimi Y,Kato T,Sakurai T,Arahata Y,Bundo M,Takeda A,Niida S,Ito K,Toba K,Tanaka K,Yanagisawa K.:Novel plasmabiomarker surrogating cerebral amyloid deposition.Proc Jpn Acad Ser B PhysBiol Sci.2014；90(9):353-64.
非专利文献2:Nakamura A,Kaneko N,Villemagne VL,Kato T,Doecke J,Dore V,Fowler C,Li QX,Martins R,Rowe C,Tomita T,Matsuzaki K,Ishii K,Ishii K,ArahataY,Iwamoto S,Ito K,Tanaka K,Masters CL,Yanagisawa K.:High performance plasmaamyloid-βbiomarkers for Alzheimer’s disease.Nature.2018；554(7691):249-254.
非专利文献3:Blennow K.:Cerebrospinal Fluid Protein Biomarkers forAlzheimer’s Disease.The Journal of the American Society for ExperimentalNeuroTherapeutics 2004Apr；1(2):213-25.
非专利文献4:Murakami K,Masuda Y,Shirasawa T,Shimizu T,Irie K.:Theturn formation at positions 22and 23in the 42-mer amyloid beta peptide:theemerging role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease.Geriatr GerontolInt.2010Jul；10Suppl 1:S169-79.
发明内容
发明要解决的问题
为了构建肽特异性夹心ELISA，需要特异性识别N末端和C末端的抗体。APP669-711的C末端与Aβ1-40(即，APP672-711)的C末端相同，已存在特异性识别APP669-711的C末端的抗体。但是，不存在特异性识别APP669-711的N末端的抗体。
由于不存在识别APP669-x的N末端的抗体，因此不存在特异性定量APP669-711的夹心ELISA和用免疫学测定方法分析APP669-x的手段。
因此，本发明的目的在于，提供识别包括淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669-711的、N末端从APP669开始的肽(将其总称为APP669-x)的抗体。进一步地，本发明的目的在于提供使用该抗体测定APP669-x的方法。
为了用夹心免疫测定法特异性定量试样中的分析对象多肽，使分别识别分析对象多肽的2个不同部位(表位)的2种抗体同时与分析对象肽结合，或者使其中的一抗体结合后再使另一抗体结合。即，需要形成如下状态：在分析对象多肽的2个不同部位(表位)上同时结合有2种抗体、分析对象多肽被2种抗体夹心。
存在以下情况：虽然2种抗体分别要结合的2个不同识别部位(表位)在多肽的一级结构上彼此远离，但是上述2个表位由于多肽的构象而在空间距离上靠近。分析对象多肽的上述2个表位在空间距离上靠近的情况下，上述2种抗体则难以同时结合，成为夹心免疫测定法的灵敏度下降的主因。例如，在测定作为肽片段的Aβ的夹心免疫测定法中，用N识别抗体和C末识别抗体夹持肽片段，虽然2种抗体的识别部位(表位)在一级结构上彼此远离，但是2个表位在空间距离上靠近(非专利文献4)。因此，有可能引起夹心免疫测定法的灵敏度下降。
本发明的目的在于，提供可以以高灵敏度检测及定量分析对象多肽的夹心免疫测定法。本发明的目的尤其在于，提供可以以高灵敏度检测及定量分析对象Aβ及Aβ关联肽的夹心免疫测定法。进一步地，本发明的目的在于提供多肽的夹心型免疫测定用试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明人进行深入研究的结果是，为了制作识别APP669-x的N末端的抗体而对小鼠免疫了结合有KLH(keyhole limpet hemocyanin，匙孔血蓝蛋白)的合成肽VKMC，通过细胞融合和筛选取得了产生识别APP669-x的N末端的抗体的杂交瘤。使用该抗体构建了特异性定量APP669-x的夹心ELISA等的免疫测定法。由此，也可以构成APP669-x的ELISA试剂盒。
本发明包括以下的发明。
(1)一种APP669-x N末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669-x肽的N末端。
(2)一种免疫测定法，其包括：使用特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-x与上述APP669-x N末端识别单克隆抗体反应而测定APP669-x。
(3)根据上述(2)所述的免疫测定法，其中，上述免疫测定法选自由夹心型免疫测定法、直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、蛋白质印迹、免疫组织学染色、流式细胞术、免疫沉降、亲和层析及免疫细胞染色组成的组。
(4)根据上述(3)所述的免疫测定法，其中，在上述夹心型免疫测定法中，使用上述APP669-x N末端识别单克隆抗体(第1抗体)；及、能够识别APP669-x的不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的部分或APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体(第2抗体)。
(5)根据上述(3)或(4)所述的免疫测定法，其中，上述第2抗体为能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体。
(6)根据上述(3)～(5)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述夹心型免疫测定法选自由酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)组成的组。
(7)根据上述(3)～(6)中任一项所述的免疫测定法，其包括：向上述试样中添加能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。
(8)根据上述(7)所述的免疫测定法，其中，向上述试样中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应；或者
在使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应时向反应体系中添加上述抗原亲和性物质；或者
使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的另一者反应。
(9)根据上述(7)或(8)所述的免疫测定法，其中，上述抗原亲和性物质选自由抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体组成的组。
(10)根据上述(2)～(9)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述试样为选自血液、脑脊液、尿、粪便及体分泌液组成的组中的生物体源试样。
(11)一种APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒，其包含：
特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-x N末端识别单克隆抗体(第1抗体)；以及
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)。
(12)根据上述(11)所述的APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒，其还包含能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。
另外，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过改变分析对象多肽的构象而实施使夹心免疫测定法中使用的2种抗体分别要结合的2个表位在空间距离上彼此远离的处置，具体而言，通过使与分析对象多肽有亲和性的物质(抗原亲和性物质)结合于该分析对象多肽而改变构象，从而可以得到可以以高灵敏度检测及定量分析对象多肽的夹心免疫测定法。由此而完成了本发明。
本说明书中，多肽包括肽及蛋白质。上述蛋白质中，也包括糖蛋白、磷酸化蛋白等经翻译后修饰的蛋白质。
本说明书中，使用“Aβ”作为淀粉样蛋白·β肽的简称。即，“Aβ”包括Aβ1-40及Aβ1-42。有时将切断淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)而生成的、上述Aβ以外的肽称为Aβ关联肽(或Aβ样肽)。有时将切断淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursorprotein；APP)而生成的Aβ及Aβ关联肽(或Aβ样肽)称为“APP派生型肽”。
本发明包括以下的发明。
(B-1)一种免疫测定法，在使用第1抗体及第2抗体的多肽的夹心型免疫测定法中，向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质，所述第1抗体具有能够识别试样中的目标多肽的抗原结合部位；所述第2抗体具有能够识别上述目标多肽的、不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位。
(B-2)根据上述(B-1)所述的免疫测定法，其中，向包含上述目标多肽的试样中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应；或者
在使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应时向反应体系中添加上述抗原亲和性物质；或者
使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的另一者反应。
(B-3)根据上述(B-1)或(B-2)所述的免疫测定法，其中，上述抗原亲和性物质选自由抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体组成的组。
(B-4)根据上述(B-1)～(B-3)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述夹心型免疫测定法选自由酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)组成的组。
(B-5)根据上述(B-1)～(B-4)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述第1抗体为上述目标多肽的N末端识别抗体，上述第2抗体为上述目标多肽的C末端识别抗体。
(B-6)根据上述(B-5)所述的免疫测定法，其中，上述抗原亲和性物质不作用于上述目标多肽的N末端附近且不作用于上述目标多肽的C末端附近。
(B-7)根据上述(B-5)或(B-6)所述的免疫测定法，其中，上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽的N末端起4个残基的部位至C末端起4个残基的部位为止的中间部位。
(B-8)根据上述(B-1)～(B-7)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述目标多肽选自由Aβ及Aβ关联肽组成的组。
(B-9)根据上述(B-1)～(B-8)中任一项所述的免疫测定法，其中，上述试样为选自由血液、脑脊液、尿、粪便及体分泌液组成的组中的生物体源试样。
(B-10)一种多肽的夹心型免疫测定用试剂盒，其包含：
具有能够识别目标多肽的抗原结合部位的第1抗体；
具有能够识别上述目标多肽的、不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的第2抗体；及
能够结合于上述目标多肽的抗原亲和性物质。
发明的效果
根据本发明，可提供特异性识别APP669-x的N末端的抗体。使用该特异性识别APP669-x的N末端的抗体，可提供APP669-x的夹心型免疫测定法、ELISA、蛋白质印迹、免疫组织学染色、流式细胞术、免疫沉降、亲和层析、免疫细胞染色等免疫学测定方法。
根据本发明，作为优选方式，提供APP669-711的夹心ELISA法。另外，提供用于实施APP669-711的夹心ELISA法的试剂盒。作为包括APP669-711的Aβ关联肽等生物标志物的分析技术，质谱分析(MALDI-TOF MS)是有用的，但是夹心ELISA为广泛且常规地用作临床检查法的测定方法，并且廉价，因此可称之为更有用的分析技术。
本发明的夹心型免疫测定法中，向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质。由此而改变目标多肽的构象，使夹心免疫测定法中使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离。因此，2个部位的抗原抗体反应可顺利地进行，可以以高灵敏度检测及定量目标多肽。
特定的多肽Aβ(Aβ1-40及Aβ1-42)以及Aβ关联肽(例如Aβ1-39、APP669-711)存在于生物体内，作为阿尔茨海默病的生物标志物受到关注。对于这些Aβ和Aβ关联肽、特别是Aβ关联肽而言，需要可以以高灵敏度检测及定量的夹心免疫测定法。根据本发明，可以提供可以以高灵敏度检测及定量这些Aβ和Aβ关联肽、特别是Aβ关联肽的夹心免疫测定法。
附图说明
图1为示出实施例1-2中使用APP669-x N末端特异性抗体克隆34-6E的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图2为示出实施例1-2中使用APP669-x N末端特异性抗体克隆24-6G的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图3为示出实施例1-2中使用APP669-x N末端特异性抗体克隆20-1A的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图4为示出实施例2-1中使用3种APP669-x N末端特异性抗体克隆的APP669-711夹心ELISA结果的图。横轴表示APP669-711浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图5为示出实施例2-2中使用APP669-x N末端特异性抗体克隆34-6E时的、APP669-711夹心ELISA的特异性的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图6为示出实施例2-4中利用APP669-711夹心ELISA得到的人血浆测定结果的图。横轴表示各血浆样品，纵轴表示APP669-711浓度(fmol/mL)。
图7为示出实施例B1中通过添加抗Aβ抗体4G8而得的APP669-711ELISA的标准曲线的图。横轴表示APP669-711的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对抗Aβ抗体4G8的每一浓度示出标准曲线。
图8为示出实施例B1中通过添加抗Aβ抗体4G8而得的APP669-711ELISA的反应性的图。横轴表示抗Aβ抗体4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于APP669-711的每一浓度，将点用线连接。
图9为示出实施例B1中添加抗Aβ抗体4G8时的、对Aβ1-40的APP669-711 ELISA的反应性图。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
图10为示出实施例B2中使用3个N末端识别抗体克隆的APP669-711ELISA中的抗Aβ抗体4G8添加效果的图。横轴表示抗Aβ抗体4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于N末端识别抗体的每个克隆，将点用线连接。
图11为示出实施例B2中添加抗Aβ抗体4G8添加时的、对Aβ1-40的APP669-711ELISA的反应性的图。作为N末端识别抗体，分别使用了3个克隆。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
图12为示出实施例B3中4个抗Aβ抗体克隆在APP669-711 ELISA中的添加效果的图。横轴表示抗Aβ抗体的添加浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于抗Aβ抗体的每个克隆，将点用线连接。
图13为示出实施例B3中添加抗Aβ抗体时的、对Aβ1-40的APP669-711ELISA的反应性的图。抗Aβ抗体使用了4个克隆。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
图14为示出实施例B4中Aβ1-40ELISA中的抗Aβ抗体4G8及6E10的添加效果的图。纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。作为样品，使用ELISA试剂盒内包含的标准品和AnaSpec公司的Aβ1-40。
具体实施方式
[1.APP669-x N末端识别单克隆抗体]
本发明的APP669-x N末端识别单克隆抗体特异性识别APP669-x肽的N末端。
为了制作识别APP669-x的N末端的抗体而对小鼠免疫结合有KLH的合成肽VKMC(序列号5)，通过细胞融合和筛选而取得产生识别APP669-x的N末端的抗体的杂交瘤。更详细的抗体制作将在实施例中说明。
该抗体为识别APP669-x的N末端的抗体，因此可以特异性识别包括APP669-711(序列号3)的属于APP669-x的各种肽的N末端。因此，可以使用该APP669-x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-x与上述APP669-x N末端识别单克隆抗体进行免疫反应。
[2.目标APP669-x肽]
淀粉样蛋白前体蛋白(APP)为单次跨膜蛋白，由770个氨基酸残基构成。淀粉样蛋白前体蛋白(APP)由于β分泌酶和γ分泌酶而接受蛋白质分解，通过蛋白质分解而产生淀粉样蛋白·β肽(Aβ)。APP672-711和Aβ1-40表示同一肽(序列号1)。APP672-713与Aβ1-42表示同一肽(序列号2)。APP669-711(序列号3)属于APP669-x，在此，x的下限大于669，例如大于677，另外，上限没有特别限定，为770或更小。但是，从本发明的主旨、即APP669-x N末端识别单克隆抗体可以特异性识别APP669-x肽的N末端、可以进行免疫反应来看，x的上限值没有特别限定。若进行例示，作为APP669-x肽，可列举APP669-711(序列号3)、APP669-709、APP669-710、APP669-713等。
APP672-711(Aβ1-40)(序列号1)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
APP672-713(Aβ1-42)(序列号2)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
APP669-711(序列号3)：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
[3.免疫测定法]
本发明的免疫测定法包括：使用APP669-x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-x与上述APP669-x N末端识别单克隆抗体反应，测定APP669-x，所述APP669-x N末端识别单克隆抗体特异性识别APP669-x肽的N末端。
作为上述免疫测定法，可列举夹心型免疫测定法、直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、蛋白质印迹、免疫组织学染色、流式细胞术、免疫沉降、亲和层析及免疫细胞染色等各种免疫测定法。可以通过常规方法使用本发明的APP669-x N末端识别单克隆抗体进行免疫测定。
在上述夹心型免疫测定法中，可以使用上述APP669-x N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、及能够识别APP669-x的不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的部分或APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体(第2抗体)。
作为上述第2抗体，可以使用能够识别APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体。在测定对象肽为APP669-711时，使用能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体。Aβ1-40的C末端与APP669-711的C末端相同，能够识别这样的C末端的抗体市场中有销售。
作为上述夹心型免疫测定法，可列举酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)等。
在上述夹心型免疫测定法中，可以按照常规方法向包含上述APP669-x肽的试样中逐次或同时添加上述第1抗体及上述第2抗体而进行免疫反应。
进一步地，在本发明中，可以向包含上述APP669-x肽的试样中添加能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质来进行。
这种情况下，可以向上述试样中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应；或者
在使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应时向反应体系中添加上述抗原亲和性物质；或者
使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述APP669-x肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的另一者反应。
通过向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质，从而改变目标多肽的构象，使夹心免疫测定法中所使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离。因此，2个部位的抗原抗体反应顺利地进行，可以以更高的灵敏度检测及定量目标多肽。
上述抗原亲和性物质只要是与目标多肽具有亲和性、能够与其结合的物质即可，可列举抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体等。这里的结合包括静电相互作用、范德华力、氢键、疏水性相互作用、偶极相互作用、分散力等利用分子间相互作用而实现的结合。为改变目标多肽的构象、使夹心免疫测定法中使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离的物质即可。
就作为上述抗原亲和性物质的抗体而言，可以使用具有不同于上述第1抗体及上述第2抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的抗体。
就作为上述抗原亲和性物质的肽而言，可以使用由2～12个氨基酸残基构成的肽，例如作为结合于Aβ的肽，可例示iAβ5(5个氨基酸)、D3(12个氨基酸)、NH2-D-Trp-Aib-OH(2个氨基酸)等。
就作为上述抗原亲和性物质的低分子化合物而言，可以使用能够结合于目标多肽的低分子化合物，可列举例如药物开发中使用的与某种蛋白质结合的低分子化合物。作为与Aβ结合的低分子化合物，可例示Scyllo-inositol等。还可列举各种抑制剂(例如各种StemoleculeTM低分子化合物)。
就作为上述抗原亲和性物质的核酸适配体而言，可列举DNA适配体、RNA适配体等。
上述抗原亲和性物质的添加量也取决于试样中的目标多肽的种类、量及抗原亲和性物质的种类，没有特别限定，只要为结合于目标多肽且改变该目标多肽的构象的量即可。例如，上述抗原亲和性物质的添加量可以以在包含目标多肽的试样中的浓度计设为0.1ng/mL～100000ng/mL左右，优选设为0.1ng/mL～10000ng/mL左右，更优选设为0.1ng/mL～3000ng/mL左右。
如上所述，上述夹心型免疫测定法中可以使用上述APP669-x N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、及能够识别APP669-x的不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的部分或APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体(第2抗体)。
这种情况下，优选上述抗原亲和性物质不作用于目标多肽的N末端附近且不作用于上述目标多肽的C末端附近。不优选上述抗原亲和性物质与上述第1抗体发生对目标多肽的竞争、抑制，也不优选上述抗原亲和性物质与上述第2抗体发生对目标多肽的竞争、抑制。
更具体而言，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽的N末端起4个残基的部位至C末端起4个残基为止的中间部位。进一步地，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽的N末端起6个残基的部位至C末端起6个残基为止的中间部位。
在使用酶作为标记物的夹心ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫分析)的情况下，可以使用作为上述第1抗体的目标多肽的N末端识别抗体来作为进行固定抗体(捕捉抗体)、使用作为上述第2抗体的目标多肽的C末端识别抗体来作为检测抗体(标记抗体)。
本发明的夹心型免疫测定法除了可以用于使用酶作为标记物的夹心ELISA以外，还可以用于使用放射性同位素的放射免疫测定法(RIA)、使用化学发光物质的化学发光免疫测定法(CIA)、使用荧光发光物质的荧光免疫测定法(FIA)、使用金属络合物的电化学发光免疫测定法(ECLIA)、使用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(BLIA)、用PCR扩增、检测标记在抗体上的核酸的免疫PCR、检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(TAI)、检测由于形成免疫复合体而凝集的胶乳的胶乳凝集比浊法(LA)、在纤维素膜上进行反应的免疫层析法等。
就本发明的夹心型免疫测定法的基本操作而言，在向试样中添加抗原亲和性物质时也可以按照公知的操作来进行。
本发明中，目标APP669-x肽包含在生物体试样中。生物体试样包括：血液、脑脊液(CSF)、尿、体分泌液、唾液及痰等体液；以及粪便。血液试样包括全血、血浆及血清等。血液试样可通过对由个体采集的全血进行适当处理而制备。作为由采集的全血制备血液试样时所进行的处理，没有特别限定，可进行临床学上允许的任何处理。例如，可进行离心分离等。另外，在血液试样制备工序的中间阶段或制备工序的后阶段，可以适当地在冷冻等低温下保存血液试样。需要说明的是，本发明中，生物体试样不返送回来源个体而是废弃。就以血液试样为对象试样而言，试样采集的侵入性比固体和脑脊液低、另外为一般医学检查和体检等中用于筛查各种疾病的对象试样，因此是优选的。
本发明的APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒为用于进行上述的夹心型免疫测定的试剂盒，包含：
特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-x N末端识别单克隆抗体(第1抗体)；及
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)。
试剂盒可以还包含能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。另外，试剂盒中可以包含夹心型免疫测定法的操作中使用的各种成分，例如制备试样溶液用的稀释液、洗涤溶液等。
对于本发明的免疫测定法而言，在使用第1抗体及第2抗体的多肽的夹心型免疫测定法中包括：向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质，所述第1抗体具有能够识别试样中的目标多肽的抗原结合部位；所述第2抗体具有作为能够识别上述目标多肽的、不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位。
本发明的免疫测定法中，可以向包含上述目标多肽的试样中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应；或者
在使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体反应时向反应体系中添加上述抗原亲和性物质；或者
使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加上述抗原亲和性物质，然后使上述目标多肽与上述第1抗体及上述第2抗体中的另一者反应。
通过向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质，从而改变目标多肽的构象，使夹心免疫测定法中使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离。因此，2个部位的抗原抗体反应顺利进行，可以以高灵敏度检测及定量目标多肽。
上述抗原亲和性物质只要为与目标多肽具有亲和性、能够与其结合的物质即可，可列举抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体等。这里的结合包括静电相互作用、范德华力、氢键、疏水性相互作用、偶极相互作用、分散力等利用分子间相互作用而实现的结合。为改变目标多肽的构象、使夹心免疫测定法中使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离的物质即可。
就作为上述抗原亲和性物质的抗体而言，可以使用具有不同于上述第1抗体及上述第2抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的抗体。
就作为上述抗原亲和性物质的肽而言，可以使用由2～12个氨基酸残基构成的肽，例如作为结合于Aβ的肽，可例示iAβ5(5个氨基酸)、D3(12个氨基酸)、NH2-D-Trp-Aib-OH(2个氨基酸)等。
就作为上述抗原亲和性物质的低分子化合物而言，可以使用能够结合于目标多肽的低分子化合物，可列举例如药物开发中使用的与某种蛋白质结合的低分子化合物。作为与Aβ结合的低分子化合物，可例示Scyllo-inositol等。还可列举各种抑制剂(例如各种StemoleculeTM低分子化合物)。
就作为上述抗原亲和性物质的核酸适配体而言，可列举DNA适配体、RNA适配体等。
上述抗原亲和性物质的添加量也取决于试样中的目标多肽的种类、量及抗原亲和性物质的种类，没有特别限定，只要为结合于目标多肽且改变该目标多肽的构象的量即可。例如，上述抗原亲和性物质的添加量可以以在包含目标多肽的试样中的浓度计设为0.1ng/mL～100000ng/mL左右，优选设为0.1ng/mL～10000ng/mL左右，更优选设为0.1ng/mL～3000ng/mL左右。
本发明中，作为具有能够识别目标多肽的抗原结合部位的第1抗体、及具有能够识别上述目标多肽的、不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的第2抗体，可以使用夹心型免疫测定法中所用的各种物质。
例如，作为上述第1抗体可以使用目标多肽的N末端识别抗体，作为上述第2抗体可以使用目标多肽的C末端识别抗体。
这种情况下，优选上述抗原亲和性物质不作用于目标多肽的N末端附近且不作用于上述目标多肽的C末端附近。不优选上述抗原亲和性物质与上述第1抗体发生对目标多肽的竞争、抑制，也不优选上述抗原亲和性物质与上述第2抗体发生对目标多肽的竞争、抑制。
更具体而言，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽的N末端起4个残基的部位至C末端起4个残基为止的中间部位。进一步地，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽的N末端起6个残基的部位至C末端起6个残基为止的中间部位。
在使用酶作为标记物的夹心ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫分析)的情况下，可以使用作为上述第1抗体的目标多肽的N末端识别抗体来作为固定化抗体(捕捉抗体)、使用作为上述第2抗体的目标多肽的C末端识别抗体来作为检测抗体(标记抗体)。
本发明的夹心型免疫测定法除了可以用于使用酶作为标记物的夹心ELISA以外，还可以用于使用放射性同位素的放射免疫测定法(RIA)、使用化学发光物质的化学发光免疫测定法(CIA)、使用荧光发光物质的荧光免疫测定法(FIA)、使用金属络合物的电化学发光免疫测定法(ECLIA)、使用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(BLIA)、用PCR扩增、检测标记在抗体上的核酸的免疫PCR、检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(TAI)、检测由于形成免疫复合体而凝集的胶乳的胶乳凝集比浊法(LA)、在纤维素膜上进行反应的免疫层析法等。
就本发明的夹心型免疫测定法的基本操作而言，除了向试样中添加抗原亲和性物质以外均可以按照公知的操作来进行。
本发明特别适合于目标多肽为Aβ及Aβ关联肽的情况。Aβ(Aβ1-40及Aβ1-42)和Aβ关联肽(例如Aβ1-39、APP669-711)存在于生物体内，作为阿尔茨海默病的生物标志物而受到关注。对于这些Aβ和Aβ关联肽、特别是Aβ关联肽而言，需要可以以高灵敏度检测及定量的夹心免疫测定法。根据本发明，可以提供可以以高灵敏度检测及定量这些Aβ和Aβ关联肽、特别是Aβ关联肽的夹心免疫测定法。以下示出Aβ及Aβ关联肽的例子。
APP672-709(Aβ1-38)(序列号6)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
APP674-711(Aβ3-40)(序列号7)：
EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
APP672-710(Aβ1-39)(序列号8)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
APP672-711(Aβ1-40)(序列号1)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
OxAPP672-711(OxAβ1-40)(序列号9)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(Met706被氧化)
APP672-713(Aβ1-42)(序列号2)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
APP669-711(序列号3)：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
淀粉样蛋白前体蛋白(APP)为单次跨膜蛋白，由770个氨基酸残基构成。淀粉样蛋白前体蛋白(APP)由于β分泌酶和γ分泌酶而接受蛋白质分解，通过蛋白质分解而产生淀粉样蛋白·β肽(Aβ)。APP672-713和Aβ1-42表示同一肽(序列号2)。另外，APP672-711和Aβ1-40表示同一肽(序列号1)。本发明中，作为目标多肽，除了上述例示的多肽以外还不受限定地包含各种Aβ关联肽。另外，本发明也可以应用于Aβ及Aβ关联肽以外的各种多肽。
本发明中，目标多肽包含在生物体试样中。生物体试样包括：血液、脑脊液(CSF)、尿、体分泌液、唾液及痰等体液；以及粪便。血液试样包括全血、血浆及血清等。血液试样可通过对由个体采集的全血进行适当处理而制备。作为由采集的全血制备血液试样时所进行的处理，没有特别限定，可进行临床学上允许的任何处理。例如，可进行离心分离等。另外，在血液试样制备工序的中间阶段或制备工序的后阶段，可以适当地在冷冻等低温下保存血液试样来进行。需要说明的是，本发明中，生物体试样不返送回来源个体而是废弃。就以血液试样为对象试样而言，试样采集的侵入性比固体和脑脊液低、另外为一般医学检查和体检等中用于筛查各种疾病的对象试样，因此是优选的。
本发明的多肽的夹心型免疫测定用试剂盒为用于进行上述的夹心型免疫测定的试剂盒，包含：
具有能够识别目标多肽的抗原结合部位的第1抗体；
具有能够识别上述目标多肽的、不同于上述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的第2抗体；及
能够结合于上述目标多肽的抗原亲和性物质。
试剂盒中可以包含夹心型免疫测定法的操作中使用的各种成分，例如制备试样溶液用的稀释液、洗涤溶液等。
实施例
以下示出实施例来具体说明本发明，本发明不受这些实施例限制。关于以下用％表示的物质的量，在没有特别声明时，在该物质为固体时以重量基准表示，为液体时以体积基准表示。
[实施例1：APP669-x N末端识别抗体的制作]
[实施例1-1：单克隆抗体的制作]
使用二价反应性试剂将合成肽VKMC(序列号5)的C末端的Cys结合至载体蛋白(KLH)。
使用注射器筒将该结合有KLH的合成肽与FCA(弗氏完全佐剂)混和、乳化，对于1只BALB/c小鼠，将200μg注射(免疫)至尾根部肌肉内。进一步将抗原与FICA(弗氏不完全佐剂)混和、乳化，以两周的间隔2次对1只小鼠皮下注射(追加免疫)50μg。然后对1只小鼠，将100μg末次免疫至腹腔。
末次免疫起3天后采集脾脏，分离淋巴细胞后，在-80℃冷冻保存。另外，从小鼠中采集全血，从血液分离血清后，在-40℃下冷冻保存。
将得到的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤在50％聚乙二醇存在下实施细胞融合。将融合细胞分注到8块96孔微孔板进行培养。在细胞融合起8天后，从96孔微孔板的各孔对培养上清进行取样，通过ELISA依次进行一次、二次筛选，用有限稀释法克隆阳性孔的细胞。然后通过ELISA依次进行一次、二次筛选，将阳性克隆的杂交瘤冷冻保存。
所取得的杂交瘤(克隆20-1A、24-6G、34-6E)进行高密度无血清培养。使用蛋白A从其培养上清中纯化抗体。
[实施例1-2：利用直接ELISA的单克隆抗体的特异性的确认]
通过直接ELISA评价APP669-x N末端识别抗体克隆20-1A、24-6G、34-6E的特异性。直接ELISA如下进行。
将合成肽APP669-711(PEPTIDE INSTITUTE,INC)、Aβ1-40(PEPTIDE INSTITUTE,INC)或APP668-677(序列号4)(Toray Research Center,Inc.)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成50或500pmol/mL的各浓度。合成肽的序列如表1所示。将各合成肽溶液向96孔微孔板的各孔中各加入50μL，在4℃下孵育2小时而进行固定化。另外，也准备了空白孔。除去平板中的溶液，将4倍稀释Block Ace(DS Pharma)各加入100μL，在4℃孵育2小时而进行封闭。除去平板中的溶液，用PBST(0.05％Tween20 in PBS)300μL洗涤。将用10倍稀释Block Ace稀释成0.5μg/mL的浓度的APP669-x N末端识别抗体各加入50μL，在4℃下孵育1小时。除去平板中的样品溶液，用PBST 300μL洗涤。将用10倍稀释Block Ace稀释4000倍的HRP标记-抗小鼠IgG抗体(ZYMED)溶液各加入50μL，在4℃下孵育1小时。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。加入ELISA POD底物TMB试剂盒(NACALAI TESQUE,INC.)100μL，在暗处孵育30分钟而显色。加入2N硫酸100μL使显色反应停止。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图1～3。即，图1为示出使用APP669-x N末端特异性抗体克隆34-6E的直接ELISA的结果的图。图2为示出使用APP669-x N末端特异性抗体克隆24-6G的直接ELISA的结果的图。图3为示出使用APP669-x N末端特异性抗体克隆20-1A的直接ELISA的结果的图。图1～3中，横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
由图1～3确认：APP669-x N末端识别抗体的所有克隆即20-1A、24-6G、34-6E均与APP669-711反应。另一方面，对Aβ1-40、APP668-677则完全未确认到反应性。APP669-711与Aβ1-40相比仅N末端侧多3个氨基酸，此外的氨基酸序列与Aβ1-40相同，对Aβ1-40不显示反应这一点表明克隆20-1A、24-6G、34-6E识别APP669-711的N末端侧3个氨基酸。另外，APP668-677与APP669-711相比仅N末端侧多1个氨基酸，但是其不与克隆20-1A、24-6G、34-6E反应。该结果表明：克隆20-1A、24-6G、34-6E特异性识别APP669-711的N末端。
由以上的结果可确认：APP669-x N末端识别抗体的3种克隆特异性识别APP669-711的N末端。
[表1]
Figure BDA0002649172600000231
[实施例2：APP669-711的夹心ELISA]
[实施例2-1：使用3种APP669-x N末端识别抗体克隆的夹心ELISA]
使用APP669-x N末端识别抗体克隆20-1A、24-6G及34-6E作为捕捉抗体，评价对APP669-711的夹心ELISA的反应性。
将APP669-x N末端识别抗体用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，在96孔微孔板的各孔中各加入50μL，在4℃下孵育6小时而进行固定化。除去平板中的溶液，各加入20％Blocking One(NACALAI TESQUE,INC.)100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。将用样品用缓冲液A(5％Blocking One in PBST)稀释的合成肽APP669-711作为样品溶液各加入50μL，在4℃下孵育一夜。除去平板中的样品溶液，用PBST 300μL洗涤。将HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒(和光纯药)中包含的HRP标记的C末端识别抗体(克隆BA27)溶液用5％Blocking One in PBST稀释5倍后，各加入50μL，在4℃下孵育2小时。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。加入ELISA POD底物TMB试剂盒100μL，在暗处孵育30分钟而显色。加入2N硫酸100μL使显色反应停止。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图4。即，图4为示出使用3种APP669-x N末端特异性抗体克隆的APP669-711夹心ELISA的结果的图。横轴表示APP669-711浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图4表明：3种APP669-x N末端识别抗体克隆中，34-6E与APP669-711的反应性最高。在此后的实施例中，聚焦34-6E来评价夹心ELISA。
[实施例2-2：夹心ELISA的特异性的确认]
使用APP669-x N末端识别抗体克隆34-6E作为捕捉抗体，评价对APP669-711的夹心ELISA的特异性。夹心ELISA如下进行。
将APP669-x N末端识别抗体克隆34-6E用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔微孔板的各孔中各加入50μL，在4℃下孵育6小时而进行固定化。除去平板中的溶液，加入4倍稀释Block Ace各100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。将用样品用缓冲液B[10倍稀释Block Ace、60ng/mL抗Aβ抗体克隆4G8(BioLegend,表位Aβ18-22)]稀释的合成肽APP669-711或Aβ1-40作为样品溶液各加入50μL，在4℃下孵育一夜。各样品的测定进行2次重复。需要说明的是，样品用缓冲液B中包含抗Aβ抗体克隆4G8(60ng/mL)，以提高反应性。除去平板中的样品溶液，用PBST 300μL洗涤。各加入HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒(和光纯药)中包含的HRP标记的C末端识别抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。加入ELISAPOD底物TMB试剂盒100μL，在暗处孵育30分钟而显色。加入2N硫酸100μL使显色反应停止。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图5。即，图5为示出使用APP669-x N末端特异性抗体克隆34-6E时的、APP669-711夹心ELISA的特异性的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图5表明：使用APP669-x N末端特异性抗体克隆34-6E和C末端识别抗体(克隆BA27)的夹心ELISA对APP669-711显示反应，对Aβ1-40则完全不显示反应。由此可以确认APP669-711夹心ELISA的特异性。
另外，以n＝4对不同浓度的合成肽APP669-711进行测定而求出定量下限(Blank吸光度+2SD)，结果为2.42fmol/mL。
[实施例2-3：APP669-711 ELISA添加回收试验]
为了确认人血浆中的测定干扰物质对测定值的影响，进行APP669-711ELISA的添加回收试验。夹心ELISA与上述实施例2-2同样进行。样品使用用样品用缓冲液4倍稀释的市售血浆(Tennessee Blood Services)。添加APP669-711，使得添加APP669-711浓度达到0、5、10或20fmol/mL。
评价添加回收率的结果为89～91％，为没有问题的范围(表2)。
[表2]
Figure BDA0002649172600000251
[实施例2-4：利用APP669-711 ELISA的血浆测定]
使用APP669-711 ELISA定量血浆中的内源性APP669-711。样品使用了用样品用缓冲液4倍稀释的市售血浆的5个被检体，通过2次重复来进行测定。
将这些结果示于图6。即，图6为示出利用APP669-711夹心ELISA的人血浆测定的结果的图。横轴表示各血浆样品，纵轴表示APP669-711浓度(fmol/mL)。
根据图6，5个被检体均显示出超过定量下限(2.42fmol/mL)的浓度。以上的结果表明：本夹心ELISA为足以定量血浆中APP669-711的测定体系。
[实验例B1：APP669-711的夹心ELISA的操作方法]
首先，在实验例B1中如下所述地示出APP669-711的夹心ELISA的基本操作方法。实施例B1～B4的各操作基于该操作方法来进行。
(N末端识别抗体)
委托ITM公司进行识别APP669-711的N末端的抗体的制作，取得3个克隆(20-1A、24-6G、34-6E)。
(N末端识别抗体的固定化和封闭)
将N末端识别抗体用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，将得到的抗体稀释溶液向96孔板的各孔中各添加50μL，在4℃下孵育2小时而对N末端识别抗体进行固定化。除去平板中的抗体稀释溶液，向各孔中添加20％Blocking One(NACALAI TESQUE,INC.)各100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。
(样品溶液的制备)
用5％Blocking One in PBST使测定对象肽APP669-711达到规定的浓度，从而制备样品溶液。另外，将用作抗原亲和性物质的抗体用5％Blocking One in PBST制备成任意的浓度，等量添加到样品溶液中。
(样品溶液的添加)
除去平板中的20％Blocking One，用PBST 300μL洗涤3次。向平板的各孔中添加上述样品溶液各50μL，在4℃下孵育1小时。
(添加识别C末端的HRP标记抗体)
将HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒(和光纯药)中包含的识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液用5％Blocking One in PBST进行5倍稀释。除去平板中的样品溶液，用PBST 300μL洗涤3次。各加入5倍稀释的HRP标记抗体(BA27)溶液50μL，在4℃下孵育1小时。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。
(添加酶标记抗体和测定吸光度)
加入ELISA POD底物TMB试剂盒(NACALAI TESQUE,INC.)各100μL，在暗处孵育15分钟而显色。加入2N硫酸各100μL使显色反应停止。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
[实施例B1]
[通过添加抗Aβ抗体4G8进行的APP669-711夹心ELISA反应性评价]
淀粉样蛋白β(Aβ)1-40采取C末端与N末端在空间距离上靠近的结构(非专利文献4)。可认为，仅从Aβ1-40的N末端起多3个氨基酸的APP669-711也是C末端与N末端靠近的。因此，验证了向样品中添加能够与APP669-711结合的抗体是否会改变构象、提高夹心ELISA的反应性。作为能够与APP669-711结合的抗体(抗原亲和性物质)，使用抗Aβ抗体4G8。
对APP669-711的样品溶液添加作为抗原亲和性物质的抗Aβ抗体4G8，从而制备成APP669-711浓度为0fmol/mL、15.625fmol/mL、31.25fmol/mL、62.5fmol/mL、125fmol/mL、250fmol/mL、500fmol/mL、1000fmol/mL且抗Aβ抗体4G8浓度为0、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL。用APP669-711夹心ELISA对这些溶液进行测定。克隆4G8的表位为Aβ18-22。作为固定化抗体，使用N末端识别抗体克隆34-6E。其结果是，与不添加4G8(0ng/mL)相比，添加抗Aβ抗体4G8使吸光度增加(图7)。至添加浓度100ng/mL为止呈浓度依赖性增加，超过该值则缓慢下降(图8)。
作为吸光度增加的理由，想到了下述可能性：抗Aβ抗体4G8被固定在平板上，其捕捉APP669-711并与C末端识别HRP标记抗体进行夹心而进行反应。为了验证这一点，使用抗Aβ抗体4G8反应、而N末端识别抗体34-6E不反应的Aβ1-40(0～1000fmol/mL)的样品溶液，评价添加10000ng/mL的抗Aβ抗体4G8时的APP669-711夹心ELISA反应性。抗Aβ抗体4G8的表位为Aβ18-22，因此如果固定抗Aβ抗体4G8则显示反应性。但是，本测定结果未显示反应(图9)。即，确认并不是由于固定抗Aβ抗体4G8、其捕捉APP669-711而增加了反应性。以上的结果表明：通过向样品溶液中添加抗Aβ抗体4G8，在保持对APP669-711的特异性的状态下提高夹心ELISA的反应性。
图7为示出通过添加抗Aβ抗体4G8而得的APP669-711 ELISA的标准曲线的图。横轴表示APP669-711的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于抗Aβ抗体4G8的每一浓度示出标准曲线。
图8为示出通过添加抗Aβ抗体4G8而得的APP669-711 ELISA的反应性的图。横轴表示抗Aβ抗体4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对APP669-711的每一浓度，将点用线连接。
图9为示出添加抗Aβ抗体4G8时的、对Aβ1-40的APP669-711 ELISA的反应性的图。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。抗Aβ抗体4G8的添加量为10000ng/mL。
[实施例B2：改变N末端识别抗体的克隆时的抗Aβ抗体4G8添加效果的检验]
进行实验，以检验改变用作固定化抗体的N末端识别抗体的克隆时添加抗Aβ抗体4G8是否有效。
对APP669-711的样品溶液添加作为抗原亲和性物质的抗Aβ抗体4G8，从而制备成APP669-711浓度为500fmol/mL且抗Aβ抗体4G8浓度为0、10、30、100、300、1000、3000ng/mL。用APP669-711夹心ELISA对这些溶液进行测定。固定抗体分别使用N末端识别抗体的3个克隆20-1A、24-6G及34-6E。其结果是3个克隆均确认到吸光度增加，各克隆中显示最高吸光度的抗Aβ抗体4G8添加浓度均为100ng/mL(图10)。即，任一克隆的最佳抗Aβ抗体4G8添加浓度均相同。
需要说明的是，在将各克隆固定化的APP669-711夹心ELISA中，评价了添加3000ng/mL的抗Aβ抗体4G8时对Aβ1-40(0～1000fmol/mL)的样品溶液的反应性，但未确认到反应(图11)。即，确认并不是由于固定化抗Aβ抗体4G8、其捕捉APP669-711而增加了反应性。
图10为示出使用3个N末端识别抗体克隆的APP669-711 ELISA中的抗Aβ抗体4G8添加效果的图。横轴表示抗Aβ抗体4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于N末端识别抗体的每个克隆，将点用线连接。
图11为示出添加抗Aβ抗体4G8时的、对Aβ1-40的APP669-711 ELISA的反应性的图。作为N末端识别抗体，分别使用3个克隆。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。抗Aβ抗体4G8的添加量为3000ng/mL。
[实施例B3：改变所添加的抗Aβ抗体时的APP669-711夹心ELISA反应性提高效果的检验]
进行实验，以检验改变添加于样品的抗Aβ抗体的克隆时是否具有提高APP669-711夹心ELISA的反应性的效果。
对APP669-711的样品溶液，添加作为抗原亲和性物质的抗Aβ抗体的4个克隆(4G8、6E10、BAM90.1或NAB228)，制备成APP669-711浓度为500fmol/mL且抗Aβ抗体4G8浓度为0、10、30、100、300、1000、3000ng/mL。用APP669-711夹心ELISA对这些溶液进行测定。克隆6E10的表位为Aβ3-8，BAM90.1的表位为Aβ20-23，NAB228的表位为Aβ1-11中的一部分。固定化抗体使用N末端识别抗体克隆34-6E。测定的结果是，在所添加的4个抗Aβ抗体克隆中均观察到吸光度的增加(图12)。关于各克隆中显示最高吸光度的浓度，4G8时为100ng/mL，6E10时为300ng/mL，BAM90.1时为1000ng/mL，NAB228时为3000ng/mL。即，最佳浓度根据克隆而不同。
需要说明的是，在APP669-711夹心ELISA中，评价了添加3000ng/mL的各克隆的抗Aβ抗体时对Aβ1-40(0～1000fmol/mL，具体为0fmol/mL、500fmol/mL、1000fmol/mL)的样品溶液的反应性，但是未确认到反应(图13)。即，确认了添加任一克隆的情况下都不是由于固定并捕捉APP669-711而增加反应性的。
图12为示出APP669-711 ELISA中4个抗Aβ抗体克隆的添加效果的图。横轴表示抗Aβ抗体的添加浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。对于抗Aβ抗体的每个克隆，将点用线连接。
图13为示出添加抗Aβ抗体时的、对Aβ1-40的APP669-711 ELISA的反应性的图。抗Aβ抗体使用了4个克隆。横轴表示Aβ1-40的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。抗Aβ抗体的添加量为3000ng/mL。
[实施例B4：Aβ1-40夹心ELISA中的抗Aβ抗体添加效果的检验]
使用HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒(和光纯药)进行实验，以检验对Aβ1-40夹心ELISA添加抗Aβ抗体时反应性是否提高。
样品设为HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒中包含的标准品和购自AnaSpec公司的Aβ1-40。向各样品的Aβ1-40(Standard in kit、或AnaSpec product)中添加抗Aβ抗体克隆4G8或6E10，制备成Aβ1-40浓度为50fmol/mL、4G8浓度为100ng/mL或6E10浓度为300ng/mL。对于这些溶液，按照HumanβAmyloid(1-40)ELISA试剂盒的处理说明书的规程进行操作，测定吸光度。另外，作为基准，在不添加4G8和6E10的情况下进行操作，测定吸光度(图14中记作"无掺加"(non-spiked))。其结果是，添加克隆4G8时，确认吸光度相对于基准增加，添加克隆6E10时，并未造成吸光度相对于基准发生变化。认为；由于6E10的表位为Aβ3-8、靠近Aβ1-40的N末端，因此用作ELISA的固定化抗体的N末端识别抗体在立体结构上会妨碍6E10的结合。另一方面认为，克隆4G8的表位为Aβ18-22，在空间距离上远离N末端识别抗体，因此有助于Aβ1-40夹心ELISA的反应性提高。
因此认为，对于作为抗原亲和性物质而添加的抗Aβ抗体而言，需要选择以在空间距离上远离夹心ELISA中使用的抗体所识别的表位的部位为表位的抗体。
图14为示出Aβ1-40ELISA中的抗Aβ抗体4G8及6E10的添加效果的图。纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。作为样品，使用ELISA试剂盒中包含的标准品和AnaSpec公司的Aβ1-40。
以上的实施例B1～B4的结果表明：通过添加与作为分析对象多肽的APP669-711、Aβ1-40结合的抗体，具有提高各自对应的夹心ELISA的反应性的效果。
以上的各实施例中示出了分析对象多肽为APP669-711及Aβ1-40的例子。本发明对于以这些以外的多肽、蛋白质为分析对象的夹心ELISA也是有用的。另外，本发明不限于ELISA法，也可以同样用于使用其它标记的夹心法。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所(SHIMADZU CORPORATION)
<120> 特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法
<130> SP20180164
<150> WO PCT/JP2018/007295
<151> 2018-02-27
<150> JP 2018-171278
<151> 2018-09-13
<160> 9
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 3
Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His
1 5 10 15
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly
20 25 30
Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 4
Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His
1 5 10
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 5
Val Lys Met Cys
1
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 6
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly
35
<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 7
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val
35
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 8
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val
35
<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 9
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40

Claims (22)

1.一种APP669-x N末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669-x肽的N末端。
2.一种免疫测定法，其包括：使用特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-x与所述APP669-x N末端识别单克隆抗体反应而测定APP669-x。
3.根据权利要求2所述的免疫测定法，其中，所述免疫测定法选自由夹心型免疫测定法、直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、蛋白质印迹、免疫组织学染色、流式细胞术、免疫沉降、亲和层析及免疫细胞染色组成的组。
4.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，在所述夹心型免疫测定法中，使用第1抗体及第2抗体，
所述第1抗体是所述APP669-x N末端识别单克隆抗体；
所述第2抗体是能够识别APP669-x的不同于所述第1抗体所具有的抗原结合部位的部分或APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体。
5.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，所述第2抗体为能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，所述夹心型免疫测定法选自由酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)组成的组。
7.根据权利要求3所述的免疫测定法，其包括：向所述试样中添加能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。
8.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中，向所述试样中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应；或者
在使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应时向反应体系中添加所述抗原亲和性物质；或者
使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的另一者反应。
9.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中，所述抗原亲和性物质选自由抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体组成的组。
10.根据权利要求2所述的免疫测定法，其中，所述试样为选自血液、脑脊液、尿、粪便及体分泌液组成的组中的生物体源试样。
11.一种APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒，其包含：
第1抗体，其为特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-x N末端识别单克隆抗体；以及
第2抗体，其为能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体。
12.根据权利要求11所述的APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒，其还包含能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。
13.一种免疫测定法，在使用了第1抗体及第2抗体的多肽的夹心型免疫测定法中，向试样中添加能够结合于目标多肽的抗原亲和性物质，
所述第1抗体具有能够识别试样中的目标多肽的抗原结合部位，
所述第2抗体具有能够识别所述目标多肽的、不同于所述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位。
14.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，向包含所述目标多肽的试样中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述目标多肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应；或者
在使所述目标多肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应时向反应体系中添加所述抗原亲和性物质；或者
使所述目标多肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述目标多肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的另一者反应。
15.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，所述抗原亲和性物质选自由抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体组成的组。
16.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，所述夹心型免疫测定法选自由酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)组成的组。
17.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，所述第1抗体为所述目标多肽的N末端识别抗体，所述第2抗体为所述目标多肽的C末端识别抗体。
18.根据权利要求17所述的免疫测定法，其中，所述抗原亲和性物质不作用于所述目标多肽的N末端附近且不作用于所述目标多肽的C末端附近。
19.根据权利要求17所述的免疫测定法，其中，所述抗原亲和性物质作用于所述目标多肽的N末端起4个残基的部位至C末端起4个残基的部位为止的中间部位。
20.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，所述目标多肽选自由Aβ及Aβ关联肽组成的组。
21.根据权利要求13所述的免疫测定法，其中，所述试样为选自由血液、脑脊液、尿、粪便及体分泌液组成的组中的生物体源试样。
22.一种多肽的夹心型免疫测定用试剂盒，其包含：
具有能够识别目标多肽的抗原结合部位的第1抗体；
具有能够识别所述目标多肽的、不同于所述第1抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的第2抗体；及
能够结合于所述目标多肽的抗原亲和性物质。
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