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WO2018124425A1 - 신규한 펩타이드 - Google Patents

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WO2018124425A1
WO2018124425A1 PCT/KR2017/010085 KR2017010085W WO2018124425A1 WO 2018124425 A1 WO2018124425 A1 WO 2018124425A1 KR 2017010085 W KR2017010085 W KR 2017010085W WO 2018124425 A1 WO2018124425 A1 WO 2018124425A1
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WO
WIPO (PCT)
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dentin
peptide
pulp
disease
tissue
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2017/010085
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박주황
이지현
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hysensbio Co Ltd
Original Assignee
Hysensbio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP17868497.3A priority patent/EP3369741A4/en
Priority to BR112019013106A priority patent/BR112019013106A2/pt
Priority to SG11201804006QA priority patent/SG11201804006QA/en
Priority to MX2019007152A priority patent/MX2019007152A/es
Priority to JP2018525544A priority patent/JP6715446B2/ja
Priority to RU2019119842A priority patent/RU2719434C1/ru
Priority to MYPI2018701767A priority patent/MY197825A/en
Priority to AU2017359581A priority patent/AU2017359581B2/en
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Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide, and more particularly, the present invention provides a novel peptide for promoting regeneration of dentin or pulp tissue and treating dentin hypersensitivity, a polynucleotide encoding the peptide, and an expression vector comprising the polynucleotide. And it relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating dentin disease or pulp disease comprising the peptide, a quasi-drug composition for preventing or improving dentin disease or pulp disease and health functional food composition for prevention or improvement.
  • the pulp is a soft connective tissue filling the pulp cavity inside the tooth, which is rich in nerves and blood vessels, and reaches the dentin surface. Lesions that occur in these dimensions are called pulp diseases.
  • pulp disease causes pulp disease vary widely, but in most cases are caused by bacterial infection by caries and infection into the pulp through perforations, fractures, cracks, and periodontal sacs. It can also cause trauma, wear, cracking of teeth, heat and friction from dental instruments during treatment. Bacterial infection can be extended to root root disease and periodontal disease. When pulp disease occurs, pulp hyperemia, pulpitis, and pulp necrosis progress. In case of pulp necrosis, the entire periodontal tissue disappears because the pulp dies and there is no blood supply to the pulp, which may later lead to root root disease or abnormalities of the entire tooth.
  • pulp and root canal disease uses pulp replicators and root canal fillers.
  • Calcium hydroxide, mineral trioxide aggregate (MTA), and gutta-percha have generally been used.
  • MTA mineral trioxide aggregate
  • gutta-percha it has a sealing force and bio-friendly properties, so it is effective in treatment, but relatively high cost problems occur as a dental treatment, and discoloration causes aesthetic problems.
  • gutta-percha it is a cost-effective and fluid, but it is a physiological treatment that results in loss of pulp.
  • conservative treatments for treating dentin pulp disease have resulted in weakened, brittle and risk of reinfection of the treated teeth.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2012-0089547 discloses a composition for hard tissue formation and dentin or pulp tissue regeneration comprising enamel hair cells, epithelial bud cells or their cultures as an active ingredient
  • Korean Patent Application Publication No. 2012-0089547 2009-0033643 discloses new stem cells derived from dental vesicles and a method of culturing the same.
  • the present inventors in order to develop a drug that can more effectively treat dentin disease or pulp disease, as a result of intensive research efforts, develop a peptide that shows the effect of promoting cell regeneration and dentin hypersensitivity treatment of dentin or pulp tissue, and the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide novel peptides for promoting regeneration of dentin or pulp tissue and treating dentin or pulp disease.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide an expression vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating dentin disease or pulp disease comprising the peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for preventing or improving dentin disease or pulp disease containing the peptide.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food composition for preventing or improving dentin disease or pulp disease comprising the peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating dentin disease or pulp disease, comprising administering to a subject a composition comprising the peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for promoting regeneration of dentin or pulp tissue, comprising administering to a subject a composition comprising the peptide.
  • Still another object of the present invention is to promote the regeneration of dentin or pulp tissue of a peptide comprising the amino acid sequence of Formula 1 or a composition comprising the peptide, to prevent or treat dentin hypersensitivity and to prevent dentin disease or pulp disease Or to provide a therapeutic use.
  • R 1 is arginine (R), lysine (K) or glutamine (Q);
  • R2 is arginine (R) or glutamine (Q);
  • R3, R4 and R5 are arginine (R) or lysine (K), respectively;
  • R6 is asparagine (N) or serine (S);
  • R7 and R8 are lysine (K) or tyrosine (Y).
  • Still another object of the present invention is to provide a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a composition comprising the peptide, to promote regeneration of dentin or pulp tissue, or to prevent or treat dentin hypersensitivity. And it provides a prophylactic or therapeutic use of dentin disease or pulp disease.
  • Peptides for promoting regeneration of dentin or pulp tissue of the present invention and dentin hypersensitivity hypersensitivity exhibit excellent regeneration promoting effect of dentin or pulp tissue, and thus can be widely used in the development of preparations for the prevention or treatment of various dentin and pulp-related diseases.
  • a dentin and pulp-related diseases could be.
  • Figure 1a is a graph showing the results of comparing the effect of each peptide provided by the present invention on DSPP expression, an odontoblast differentiation marker gene for each group.
  • Figure 1b is a graph showing the result of comparing the expression level of Dspp gene, an oblast differentiation marker in MDPC-23 cells treated with the peptide of the present invention.
  • Figure 1c is a graph showing the results of comparing the expression level of Dspp, Dmp1 and Nestin genes, the odontoblast differentiation marker genes in the MDPC-23 cells treated with the peptides of Groups 11 and 12 of the present invention.
  • 1D is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of the peptides of the present invention on pulp tissue cells.
  • FIG. 2 is a micrograph showing dentin / dimension-like tissue produced in vivo by implantation of a pulp tissue cell and an implant comprising various components, wherein A to C are pulp tissue cells and Micrograph (size bars: A 200 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m) showing the results of implantation of the control group containing only HA / TCP for 6 weeks; D to F are micrographs (size bars: D 200 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides for 6 weeks; G to I are micrographs (size bars: G 200 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 6 weeks; J to L are micrographs showing the results of transplantation of implants of control groups containing pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 6
  • Figure 3 is a micrograph showing the formation level of collagen contained in the dentin / dimension tissue-like tissue produced in vivo by implanting the implant containing the pulp tissue cells and various components for 6 weeks, A to C The result of transplantation of a control group containing only tissue cells and HA / TCP for 6 weeks is shown (size bar: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m), and D to F represent pulp tissue cells and HA / TCP.
  • implants containing peptides of group 11 for 6 weeks (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m), G to I for pulp tissue cells, HA / TCP and group 12
  • the result of transplantation containing the peptide of 6 weeks after transplantation (size bar: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m), J to L include pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2
  • the result of transplantation of the implants of the control group for 6 weeks is shown (size bar: J 500 ⁇ m, K 200 ⁇ m, L 50 ⁇ m).
  • Figure 4 shows a dendritic cell-specific differentiation marker gene DSP and osteoblast-specific differentiation markers in dentin / dimension-like tissues generated in vivo after 6 weeks of implantation of pulp tissue cells and various components.
  • Immunostaining photograph showing the results of evaluating the expression level of phosphorus BSP, A and E show the result of implantation of control tissue containing only pulp cells and HA / TCP for 6 weeks, B and F are pulp tissue The results of transplantation containing the cells, HA / TCP and group 11 peptides were transplanted for 6 weeks, with C and G being the implants containing the pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 6 weeks.
  • D and H represent the results of transplantation of the control group including the pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 6 weeks, and the arrows of A, B, C and D are newly DSP in dentin-like tissues formed It denotes a portion embodied, the arrowhead of the E, F, G and H represents a BSP is expressed in bone tissue similar to the newly formed part.
  • the size bar is 50 mu m.
  • FIG. 5 is a micrograph showing dentin / dimension-like tissue produced in vivo by implantation of a pulp tissue cell and an implant comprising various components, wherein A to C are pulp tissue cells and Micrograph (size bars: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m) showing the results of implantation of the control group containing only HA / TCP for 12 weeks; D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides for 12 weeks; G to I are micrographs (size bars: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the results of implantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 12 weeks; J to L are photomicrographs showing the results of transplantation of implants of control groups containing pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for
  • FIG. 6 is a micrograph showing the level of collagen formation in dentin / dimension-like tissue generated in vivo after implantation of a pulp tissue cell and an implant containing various components for 12 weeks.
  • the result of implantation of a control group containing only tissue cells and HA / TCP was transplanted for 12 weeks (size bar: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m), and D to F were pulp tissue cells, HA / TCP.
  • implants comprising peptides of group 11 for 12 weeks (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m), G to I represent pulp tissue cells, HA / TCP and group 12
  • the implant containing the peptides of the implants were transplanted for 12 weeks (size bar: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m), and J to L include pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2.
  • the result of transplantation of the implants of the control group for 12 weeks is shown (size bar: J 500 ⁇ m, K 200 ⁇ m, L 50 ⁇ m).
  • FIG. 7 shows a dendritic cell-specific differentiation marker gene DSP and osteoblast-specific differentiation marker in dentin / dimension-like tissues generated in vivo by implanting a pulp tissue cell and an implant containing various components for 12 weeks.
  • FIG. Immunostaining photograph showing the results of evaluating the expression level of phosphorus BSP, where A and E show the result of transplantation of a control group containing only pulp tissue cells and HA / TCP for 12 weeks; B and F show the results of implantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides; C and G show the results of transplantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides; D and H represent the results of transplantation of implants of control groups containing pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 12 weeks; Arrows in A, B, C and D indicate the areas where DSP is expressed in newly formed dentin-like tissue; Arrowheads of E, F
  • FIG. 8 is a scanning electron micrograph showing the internal structure of dentin / dimension-like tissue generated in vivo after implantation of a transplant containing pulp tissue cells and various components for 12 weeks.
  • FIG. The implants of control group containing only cells and HA / TCP were transplanted for 12 weeks (size bars: A 50 ⁇ m, B 20 ⁇ m); C and D show the results of transplantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 12 peptide (SEQ ID NO: 96) (size bar: C 50 ⁇ m, D 20 ⁇ m); E and F show the results of implantation of the control group including the pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 12 weeks (size bar: E 50 ⁇ m, F 20 ⁇ m).
  • Figure 9 is a micrograph and a scanning electron micrograph showing the results of the implantation of the implant containing the peptide of the present invention in the root canal space of human teeth, after analysis of the odontoblast / dimension-like tissue formed therefrom
  • a and B show the result of staining the tissue transplanted with the pulp tissue cells and the implant of the control group containing only HA / TCP (size bar: A 500 ⁇ m, B 50 ⁇ m);
  • C, D and D ' show the results of staining tissues implanted with pulp tissue cells, HA / TCP and implants containing group 12 peptide (SEQ ID NO: 96), where D is an enlarged view of box 1 of C D 'is an enlarged view of box 2 of C (size bar: C 500 ⁇ m, D 50 ⁇ m, D' 50 ⁇ m);
  • E and F show the results of scanning electron microscopy of tissues implanted with a control tissue containing only pulp tissue cells and HA / TCP (size bar: E
  • FIG. 10 is a micrograph showing histological analysis of the effect of new peptides on physiological dentin formation in the shallow vortex model of the indirect pulp demodulation model, where A to C are the dentin tubules of the exposed dentin site.
  • a micrograph showing the results of the control group without any material applied to the inlet (size bars: A 500 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m);
  • D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the result of applying a group 11 peptide (1.5 ug) to the inlet port of the exposed dentin site;
  • G-I are micrographs (size bar: G 500 micrometers, H 100 micrometers, I 50 micrometers) which show the result of apply
  • P stands for pulp
  • D stands for dentin
  • TD stands for newly formed tertiary dentin.
  • FIG. 11 is a micrograph showing the histological analysis of the effect of new peptides on physiological dentin formation in the deep vortex model of the indirect dimensional demodulation model, where A to C do not apply any substance.
  • micrograph size bar: A 500 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m showing results of a control filled with cement
  • D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the result of applying the group 11 peptide (1.5 ug) and filling the GI cement
  • G to I are micrographs (size bar: G 500 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the result of applying the group 12 peptide (1.5 ug) and filling the GI cement.
  • P stands for pulp
  • D stands for dentin
  • TD stands for newly formed tertiary dentin.
  • FIG. 12 is a micrograph showing the histological analysis of the effect of the novel peptide on the physiological dentin formation in the direct pulp demodulation model, A to C treated GI cement without applying any material
  • Micrograph showing size of control group size bar: A 200 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m
  • D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing results of positive control covered with GI cement after sealing with MTA without applying any material
  • G to I are group A photomicrograph (size bar: G 200 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the result of applying 11 peptides (1.5 ug), sealing with MTA, and covering with GI cement
  • J to L are micrographs (size bars: J 500 ⁇ m, K 100 ⁇ m, L 50 ⁇ m) showing the result of applying the peptide of group 12 (1.5 ug), sealing with MTA, and then covering with GI cement.
  • the present inventors have conducted various studies to develop a novel peptide consisting of 10 amino acids in order to develop an agent that can more effectively treat dentin disease or pulp disease.
  • the novel peptide was produced by partially replacing the amino acid sequence of the peptide that may exhibit a therapeutic effect on dentin disease or pulp disease, and can increase the expression level of Dspp, Dmp1 and Nestin genes, which are markers of the odontoblast differentiation marker. In addition, while showing the effect of promoting dentin regeneration, it was confirmed that no cytotoxicity to the cells of the pulp tissue.
  • an implant comprising the peptide together with the pulp tissue cells was prepared, and the prepared implant was implanted into the subcutaneous tissue of a mouse with an injured immune system, and after 6 to 12 weeks, the transplanted tissue was analyzed.
  • dentin-dimension-like tissue in the form most similar to dentin-dimension tissue in vivo is formed, collagen formation level is increased, and the expression level of DSP, an oblast specific cell differentiation marker gene, is increased, It was confirmed that the expression level of BSP, a specific differentiation marker, was not particularly increased.
  • the odontoblast-like cells were present as a hedge array in the existing dentin wall, their cell projections, along with the increased nuclei, the existing dentin tubules To expand.
  • the peptide of the present invention may have an effect of promoting regeneration of dentin or pulp tissue and treating dentin hypersensitivity. Peptides of the present invention that exhibit this effect have not been reported so far and were first developed by the present inventors.
  • the present invention provides a peptide for promoting the regeneration of dentin or pulp tissue and the treatment of dentin disease or pulp disease comprising the amino acid sequence of the general formula (1).
  • R 1 is arginine (R), lysine (K) or glutamine (Q);
  • R2 is arginine (R) or glutamine (Q);
  • R3, R4 and R5 are arginine (R) or lysine (K), respectively;
  • R6 is asparagine (N) or serine (S);
  • R7 and R8 are lysine (K) or tyrosine (Y).
  • dentine in the present invention, also referred to as “hemorrhoids”, means a yellowish white solid tissue forming most of the teeth.
  • the dentin is enameled in the crown and covered with cement in the root, so it is not visible on the surface of the tooth, but as the enamel wears off with age, the tip or occlusal surface of the crown Dentin may be exposed to the surface.
  • the dentin is a kind of bone tissue, but the main body of the cells making the dentin is in the pulp ( ⁇ ⁇ ), it is distinguished from the normal bone tissue in that only the projections extend into the dentin.
  • the term "dental pulp”, also referred to as “dimension”, means a soft connective tissue filling the pulp cavity inside the tooth. Anatomically, it may mean a region rich in nerves and blood vessels and extending up to the dentin surface.
  • the peptide provided in the present invention can increase the expression level of Dspp, Dmp1, and Nestin genes, which are the oocyte differentiation marker genes, without showing cytotoxicity, and when implanted in vivo with pulp tissue cells, the pulp tissue cells May be characterized by the formation of dentin / dimension-like tissue.
  • Peptides provided in the present invention as long as it can promote the regeneration of dentin or pulp tissue and the treatment of dentin disease or pulp disease, the variant peptide having a sequence different from the amino acid sequence and one or more amino acid residues constituting it It is included in the category of peptides provided by.
  • amino acid exchanges in proteins and polypeptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art.
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • the peptide may include a peptide having an increased structural stability against heat, pH, or the like, or an increased regeneration-promoting ability of dentin or pulp tissue due to variation or modification of the amino acid sequence.
  • glutamine an acidic amino acid located at No. 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 provided in the present invention
  • glutamine an acidic amino acid located at No. 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 provided in the present invention
  • glutamine an acidic amino acid located at No. 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 provided in the present invention
  • Arginine a basic amino acid located at positions 4 or 5 of the peptide of SEQ ID NO: 1 may exhibit the effect of the peptide provided in the present invention even when substituted with an acidic amino acid glutamine or a basic amino acid lysine
  • Lysine a basic amino acid located at Nos.
  • the acidic amino acid, basic amino acid or aromatic amino acid constituting the peptide of the present invention is substituted with amino acids having the same properties, respectively, of course, even if each is substituted with another acidic amino acid, basic amino acid, neutral amino acid or aromatic amino acid, Since the effects of the peptides provided by the present invention can be exhibited as it is, it is obvious that the variant peptide having a sequence in which the amino acid sequence constituting the peptide of the present invention differs from one or more amino acid residues is also included in the scope of the peptide provided in the present invention.
  • the peptide of the present invention can exhibit the effects of the peptide provided in the present invention as it is, and therefore, Included.
  • the peptide may have a form in which 1 to 300 amino acids are added to the N-terminus or C-terminus of the peptide, and as another example, 1 to 100 amino acids may be added to the N-terminus or C-terminus of the peptide. It may be in an added form, and as another example, may be a form in which 1 to 24 amino acids are added to the N-terminus or C-terminus of the peptide.
  • the peptide of the present invention may be protected from protein cleavage enzymes in vivo, and its N-terminus and / or C-terminus may be chemically modified or protected with an organic terminus, or amino acids may be added to the peptide terminus. It may be in a modified form.
  • acetylation of the N-terminus, methylation or N-terminus of the N-terminus is performed to remove such charges.
  • Methods for preparing peptide mimetic compounds are known in the art, for example in Quantitative Drug Design, C.A. See Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992).
  • backbone modification refers to a backbone (backbone) of a chain or cyclic backbone, which is a major amino acid of a peptide, and directly changes amino acids constituting these peptide backbones to amino acid analogs. This is called backbone variation.
  • An amino acid analogue refers to an amino acid in which hydrogen atoms are modified by substitution of nitrogen or ⁇ -carbon of the amino acid backbone.
  • side chain modification refers to the side chains of amino acids, which are branched from branches or chains of the main chain of amino acids constituting the peptides, such as side-chains. Modifications by means of side chain modifications include, but are not limited to, peptide side chain modifications, such as reduction alkylation reactions, amidation with methylacetimidates, alkylation with acetic anhydrides, carbamolation of amino groups with cyanates; Trinitrobenzylation of amino acids with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS); Alkylation of amino groups with succinic unhydrides; and pyridoselation reduced with NaBH 4 after pyriosal-5-phosphate treatment And modification of amino groups such as these.
  • peptide side chain modifications such as reduction alkylation reactions, amidation with methylacetimidates, alkylation with acetic anhydrides, carbamolation of amino groups with cyanates
  • the peptides of the present invention can be used alone, but can be used in combination with various carriers (cattier) approved as a drug, such as an organic solvent, carbo, such as glucose, sucrose or dextran for increased stability and efficacy It is also possible to include hydrates, ascorbic acid, or antioxidants such as glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers. .
  • a drug such as an organic solvent, carbo, such as glucose, sucrose or dextran
  • hydrates, ascorbic acid, or antioxidants such as glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers.
  • 96 peptides corresponding to the general formula 1 provided by the present invention were synthesized, and the effect of the synthesized peptides on the expression level of the Dspp gene, which is an oblast differentiation marker gene, was verified. .
  • the Dspp gene in MDPC-23 cells treated with the 96 peptides was compared to the mRNA level of the Dspp gene, an oocyte differentiation marker measured in the MDPC-23 cells (control) not treated with the peptide of the present invention.
  • MRNA levels of all showed a value of 1.3 times or more (Tables 13 to 24).
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the peptide.
  • the polynucleotide may be mutated by one or more bases substituted, deleted, inserted, or a combination thereof.
  • synthetic methods well known in the art may be used, for example, those described in Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Eng., 37: 73-127, 1988. , Tryster, phosphite, phosphoramidite and H-phosphate methods, PCR and other autoprimer methods, oligonucleotide synthesis on a solid support, and the like.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide, a transformant comprising the expression vector, and a method of preparing the peptide using the transformant.
  • expression vector refers to a gene construct that is a recombinant vector capable of expressing a peptide of interest in a host cell of interest, and includes a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • the expression vector includes expression control elements such as initiation codon, termination codon, promoter, operator, etc.
  • the initiation codon and termination codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene construct is administered, Must be functional and be in frame with the coding sequence.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • operably linked means a state in which a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest are functionally linked to perform a general function.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the coding sequence.
  • Operative linkage with expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can employ enzymes commonly known in the art.
  • the expression vector may include a signal sequence for the release of the peptide in order to facilitate the separation of the peptide from the cell culture.
  • Specific initiation signals may also be required for efficient translation of inserted nucleic acid sequences. These signals include ATG start codons and contiguous sequences.
  • an exogenous translational control signal must be provided which can include an ATG start codon. These exogenous translational control signals and initiation codons can be various natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of appropriate transcriptional or translation enhancing factors.
  • the expression vector may further include a protein tag that can be removed using an endopeptidase, in order to facilitate the detection of the peptide.
  • the term "tag” refers to a molecule that exhibits quantifiable activity or properties, and refers to a polypeptide fluorescent material such as a chemical fluorescent substance such as fluorescein, fluorescent protein (GFP) or related proteins. It may be a fluorescent molecule including; It may be an epitope tag such as a Myc tag, a flag tag, a histidine tag, a leucine tag, an IgG tag, a straptavidin tag, or the like. In particular, when an epitope tag is used, a peptide tag preferably consisting of 6 or more amino acid residues, more preferably 8 to 50 amino acid residues, may be used.
  • the expression vector may include a nucleotide sequence encoding a peptide for promoting the regeneration of the dentin or pulp tissue of the present invention and the treatment of dentin or pulp disease described above, wherein the vector is used to produce the peptide.
  • plasmid DNA preferably plasmid DNA, phage DNA and the like, more preferably commercially developed plasmid (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), E.
  • coli-derived plasmid (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 etc.), Bacillus subtilis derived plasmids (pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP Etc.), animal virus vectors (retrovirus, adenovirus, vaccinia virus, etc.), insect virus vectors ( It can be kyulro virus (baculovirus), etc.). Since the expression vector is expressed differently depending on the host cell expression amount and formula, it is preferable to select the host cell most suitable for the purpose.
  • the transformant provided by the present invention may be prepared by introducing and transforming the expression vector provided by the present invention into a host, and may be used to produce the peptide by expressing a polynucleotide included in the expression vector. .
  • the transformation may be performed by a variety of methods, as long as it can produce the peptide, but is not particularly limited thereto, the efficiency by using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) in CaCl 2 precipitation method, CaCl 2 precipitation method Enhanced Hanahan Method, Electroporation, Calcium Phosphate Precipitation, Protoplast Fusion, Stirring with Silicon Carbide Fibers, Agrobacterial Mediated Transformation, Transformation with PEG, Dextran Sulfate, Lipofectamine Dry / inhibition mediated transformation methods and the like can be used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium
  • Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae and ski-irradiated caromyces pombe
  • Fungal cells such as Pchia pastoris
  • Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells
  • Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanoma cells; Or plant cells.
  • the transformant may also be used in the method of producing a peptide for promoting regeneration of dentin or pulp tissue of the present invention and treating dentin hypersensitivity.
  • the method of producing a peptide for the promotion of regeneration of dentin or pulp tissue and the treatment of dentin disease or pulp disease of the present invention comprises the steps of: (a) culturing the transformant to obtain a culture; And (b) may include recovering the peptide of the present invention from the culture.
  • the term "culture” means a method of growing microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the method of culturing the transformant may be performed using a method well known in the art.
  • the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing a peptide for promoting regeneration of dentin or pulp tissue of the present invention and treating dentin disease or pulp disease, but it is a batch process or an injection batch or a repeated injection batch process (fed batch). or repeated fed batch process).
  • the medium used for culturing should meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner while controlling the temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins and the like.
  • Carbon sources that can be used include mixed sugars of glucose and xylose as the main carbon source, and sugars and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut Oils such as oils and fats, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation product, skim soy cake or its degradation product Can be. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include, as personnel, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate and corresponding sodium-containing salts.
  • Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used.
  • the raw materials described above may be added batchwise, fed-batch or continuous in a suitable manner to the culture in the culture process, but is not particularly limited thereto.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • the temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 35 ° C. Incubation is continued until the maximum amount of production of the peptide is obtained. For this purpose it is usually achieved in 10 to 100 hours.
  • the step of recovering the peptide from the culture may be performed by a method known in the art.
  • the recovery method is not particularly limited as long as it can be used for recovery of the peptide produced, but preferably centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, augmentation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution. (Eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (eg ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion) can be used.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dentin disease or pulp disease comprising the peptide.
  • the peptide for promoting regeneration of dentin or pulp tissue of the present invention and dentin hypersensitivity treatment is characterized in that when the pulp tissue cells are implanted in vivo with pulp tissue cells, the pulp cells form dentin / dimension-like tissue.
  • Dentin disease or pulp resulting from damage to the dentin or pulp tissue as it can promote and form the same physiological dentin as seen in human natural tooth dentin by incorporating the peptide in the damaged dentin site or pulp site It can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating diseases.
  • Peptides contained in the pharmaceutical composition may be used in the form of a peptide alone, the peptide may be used in the form of a polypeptide linked to repeat two or more times, dentin diseases or dimensions at the N-terminal or C-terminal of the peptide It may also be used in the form of a complex with a drug that exhibits a therapeutic effect on the disease.
  • the term “dental disease” or “dimension disease” refers to any disease caused by damage to the pulp tissue and the dentin bonded thereto due to the damage of the dentin and pulp tissue.
  • the dentin disease or pulp disease is not particularly limited as long as it shows a therapeutic effect by the peptide of the present invention, for example, dentin hypersensitivity, pulp hyperemia, pulpitis, pulp degeneration, necrosis of the pulp and necrosis It may be a symptom.
  • prevention of the present invention means any action that inhibits or delays the occurrence of dentin disease or pulp disease by administration of a pharmaceutical composition for preventing or treating dentin disease or pulp disease comprising the peptide of the present invention.
  • treatment of the present invention is to administer a pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention as an active ingredient to a subject in need of treatment of dentin disease or pulp disease, thereby promoting the regeneration of dentin or pulp tissue, dentin disease or pulp By any action the treatment of the disease is carried out.
  • the pharmaceutical composition of the present invention in the form of a pharmaceutical composition for treating dentin disease or pulp disease further comprising a suitable carrier (natural or non-natural carrier), excipients or diluents commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition to the peptide.
  • a suitable carrier naturally or non-natural carrier
  • the pharmaceutical composition may be used in the form of a sterile injectable solution that can be administered to the site where dentin disease or pulp disease is caused, respectively, according to a conventional method.
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, collagen and the like.
  • aqueous solutions such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • sterile aqueous solutions such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • sterile aqueous solutions such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the content of the peptide included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in an amount of 0.0001 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 20% by weight based on the total weight of the final composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion treatment Period of time, factors including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the invention used, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with known pharmaceutical compositions for treating dentin disease or pulp disease. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 100 mg / kg, preferably 1 ng to about 10 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically Although not limited, it can be administered once a day or several times in divided doses.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method for treating dentin disease or pulp disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject other than a human having denticular disease or pulp disease in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "individual” of the present invention may include, without limitation, mammals including rats, livestock, and the like, which are required to treat dentin disease or pulp disease, but excludes humans among individuals in which the disease is developed.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition for treating dentin disease or pulp disease of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered through a route such as oral administration or intraoral injection, as desired.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or improving dentin disease or pulp disease comprising the peptide.
  • improvement means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the extent of symptoms.
  • the improvement is by administering a pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention as an active ingredient to an individual in need of treatment of dentin disease or pulp disease, thereby promoting the regeneration of dentin or pulp tissue, dentin disease or pulp disease It can be interpreted as meaning any action that causes the symptoms to improve or benefit.
  • Quasi drug of the present invention refers to articles that have a lesser action than medicines among articles used for the purpose of diagnosing, treating, ameliorating, reducing, treating, or preventing a disease of a human or animal.
  • Quasi-drugs except those used for the purpose of medicines, include textiles and rubber products used for the treatment or prevention of diseases of humans and animals; minor or direct action on the human body; This includes sterilizing and insecticides for preventing infectious diseases.
  • the kind or formulation of the quasi-drug composition containing the peptide is not particularly limited, but may be, for example, a disinfectant cleaner for oral cavity, oral cleaning products, toothpaste, dental floss, oral ointment.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving dentin disease or pulp disease comprising the peptide.
  • the term "food” of the present invention meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, alcoholic beverages , Vitamin complexes, nutraceuticals and health foods, and includes all foods in the usual sense.
  • the functional food is the same term as a food for special health use (Food for special health use, FoSHU), in addition to the nutritional supply, the processed food, so that the bioregulatory function appears efficiently, high medical effect Means food.
  • the term "functionality” means obtaining useful effects for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding the raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the food may also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in various forms of formulation, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and excellent portability, the present invention Foods can be taken as an adjuvant to enhance the effect of preventing or improving dentin disease or pulp disease.
  • the health food refers to foods having active health maintenance or promotion effect as compared to general foods
  • the health supplement food refers to foods for health supplementation purposes.
  • nutraceutical, health food, dietary supplement may be used interchangeably.
  • the health functional food is a food prepared by adding the peptide of the present invention to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, and the like.
  • food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, and the like.
  • the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, since a high effect can be expected for the prevention or improvement of dentin disease or pulp disease, it can be used very usefully.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier, and the type of carrier is not particularly limited and may be any carrier that is commonly used in the art.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • additional ingredients may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) and chromium (Cr) may be included. It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • the food composition is a preservative (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetic acid, etc.), fungicides (bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisol (BHA), butylhydride) Oxytoluene (BHT), etc.), colorant (such as tar pigment), colorant (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasoning (MSG glutamate, etc.), sweetener (ducin, cyclate, saccharin Foods such as sodium, etc.), fragrances (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (foils), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, modifiers, etc. It may include food additives.
  • the additive may be
  • the peptide of the present invention may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less based on the food or beverage in the manufacture of food or beverage.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • An example of the food composition of the present invention may be used as a health beverage composition, in which case it may contain various flavors or natural carbohydrates and the like as additional ingredients, such as a general beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumartin, stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame;
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the health beverage composition of the present invention.
  • the health beverage composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, Alcohol or carbonation agent and the like.
  • Others may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks, or vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • the ratio of such additives is not critical, but is generally selected from 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present invention.
  • Food composition of the present invention may include a variety of weight% if it can exhibit a prophylactic or improvement effect of ivory disease or pulp disease, but specifically, the peptide of the present invention 0.00001 to 100% by weight or 0.01 to the total weight of the food composition 80 wt%, but is not limited thereto.
  • a method for preventing or treating dentin disease or pulp disease comprising administering to a subject a composition comprising the peptide.
  • the present invention provides a method for promoting regeneration of dentin or pulp tissue, comprising administering to a subject a composition comprising said peptide.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of the following general formula (1) or a composition comprising the peptide for use in promoting the regeneration of dentin or pulp tissue, dentin hypersensitivity prevention or treatment and dentin disease or pulp disease It provides a prophylactic or therapeutic use.
  • R 1 is arginine (R), lysine (K) or glutamine (Q);
  • R2 is arginine (R) or glutamine (Q);
  • R3, R4 and R5 are arginine (R) or lysine (K), respectively;
  • R6 is asparagine (N) or serine (S);
  • R7 and R8 are lysine (K) or tyrosine (Y).
  • the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 96 or a composition comprising the peptide for the purpose of promoting the regeneration of dentin or pulp tissue, preventing or treating dentin hypersensitivity and Provided for the prevention or treatment of dentin disease or pulp disease.
  • Example 1 Promotes regeneration and dentin of dentin or pulp tissue Hypersensitivity Synthesis of Therapeutic Peptides
  • the present inventors synthesize a peptide (SEQ ID NO: 1) showing a reproducing promoting effect of dentin or pulp tissue by the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method, and substituted the amino acid of the synthesized peptide to each Groups of peptides were synthesized (Tables 1-12).
  • the peptide of group 1 was synthesized by substituting lysine or arginine for amino acids 5 to 7 of the peptide of SEQ ID NO: 1 or the peptide of SEQ ID NO: 1 (Table 1).
  • the peptide of group 2 was synthesized by substituting lysine or arginine for amino acids 5 to 7 of the peptide of SEQ ID NO: 1 and replacing amino acid 8 with serine (Table 2).
  • the peptide of Group 3 was synthesized by substituting amino acids 5 to 7 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with lysine or arginine and substituting amino acid 9 with tyrosine (Table 3).
  • the peptides of Group 4 replace amino acids 5 to 7 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with lysine or arginine, amino acid 8 with serine, amino acid 9 with tyrosine, and amino acid 10 with Synthesis by substitution with lysine (Table 4).
  • Peptides of group 4 SEQ ID NO: Amino acid sequence (N-C) 25 KYQRRKKSYK 26 KYQRRKRSYK 27 KYQRRRKSYK 28 KYQRRRRSYK 29 KYQRKKKSYK 30 KYQRKRKSYK 31 KYQRKKRSYK 32 KYQRKRRSYK
  • the peptide of group 5 was synthesized by replacing amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with arginine, amino acid 4 with glutamine, and amino acids 5 through 7 with lysine or arginine (Table 5 ).
  • the peptide of group 6 replaces amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with arginine, amino acid 4 with glutamine, amino acids 5 through 7 with lysine or arginine, and amino acid 8 with Synthesis by substitution with serine (Table 6).
  • the peptides of group 7 replace amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with arginine, amino acid 4 with glutamine, amino acids 5-7 with lysine or arginine, amino acid 9 Substituted with tyrosine and synthesized by replacing amino acid 10 with lysine (Table 7).
  • the peptide of group 8 replaces amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with arginine, amino acid 4 with glutamine, amino acids 5 through 7 with lysine or arginine, and amino acid 8 with Substituted with serine, amino acid 9 was substituted with tyrosine and amino acid 10 was replaced with lysine (Table 8).
  • the peptide of group 9 was synthesized by replacing amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with lysine, amino acid 4 with glutamine, and amino acids 5-7 with lysine or arginine (Table 9 ).
  • the peptide of group 10 substitutes lysine for amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1, replaces amino acid 4 with glutamine, replaces amino acids 5-7 with lysine or arginine, and amino acid 8 Synthesis by substitution with serine (Table 10).
  • the peptide of group 11 substitutes lysine for amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1, replaces amino acid 4 with glutamine, replaces amino acids 5-7 with lysine or arginine, and amino acid 9 Substituted with tyrosine and synthesized by replacing amino acid 10 with lysine (Table 11).
  • the peptides of group 12 replace amino acid 3 of the peptide of SEQ ID NO: 1 with lysine, amino acid 4 with glutamine, amino acids 5-7 with lysine or arginine, amino acid 8 Substituted with serine, amino acid 9 was replaced with tyrosine and amino acid 10 was replaced with lysine (Table 12).
  • Peptides of group 12 SEQ ID NO: Amino acid sequence (N-C) 89 KYKQRKKSYK 90 KYKQRKRSYK 91 KYKQRRKSYK 92 KYKQRRRSYK 93 KYKQKKKSYK 94 KYKQKRKSYK 95 KYKQKKRSYK 96 KYKQKRRSYK
  • Example 2 Dentin cells For promoting regeneration of dentin or pulp tissue and treating dentin hypersensitivity Peptide Effect Verification
  • Example 2-1 DSPP (dentin sialophosphoprotein ) Promotes regeneration and dentin of dentin or pulp tissue on promoter activity Hypersensitivity For treatment Peptide effect
  • MDPC-23 cells derived from mouse odontoblasts were cultured in DMEM medium containing 10% FBS at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the cultured MDPC-23 cells were dispensed in a 24-well plate at 5 X 10 4 cells per well, incubated for 24 hours, and then cultured into the cultured cells using Lipofectamine Plus TM reagent, pGL3.
  • the vector was transformed by introducing a recombinant vector into which the DSPP promoter and luciferase gene were introduced.
  • the transformed MDPC-23 cells were treated with the peptides of Groups 1 to 12 synthesized in Example 1 and incubated for 48 hours, and then luciferase activity was measured in each of the transformed MDPC-23 cells. , And compared the average level calculated for each group (Fig. 1a). At this time, the transformed MDPC-23 cells not treated with the peptide of the present invention was used as a control.
  • Figure 1a is a graph showing the results of comparing the effect of each peptide provided by the present invention on DSPP expression, an odontoblast differentiation marker gene for each group.
  • each peptide provided in the present invention showed a value of about 1.3 times or more of the luciferase activity level measured in the control group as a whole, but shows a difference for each group, the peptide of the group 12 the highest level of lucifer It was confirmed that the peptide showing lase activity and the next highest level of luciferase activity was a peptide of group 11.
  • the peptide provided in the present invention was found to exhibit the effect of activating the Dspp promoter.
  • Example 2-2 Dentin Eruption marker Gene Dspp Promotes regeneration of dentin or pulp tissue and treatment of dentin or pulp disease on gene expression level Peptide effect
  • the MDPC-23 cells cultured in Example 2-1 were treated with the peptides of each group synthesized in Example 1, incubated for 48 hours, and then were the oblast differentiation marker genes expressed in the MDPC-23 cells.
  • the mRNA level of the Dspp gene was measured and the mRNA level of each of the measured Dspp genes was converted as a relative ratio to the mRNA level of the Dspp gene measured in the control group (Tables 13 to 24).
  • the average value of the mRNA level of the Dspp gene measured according to the peptide of each group was compared for each group (Fig. In this case, MDPC-23 cells not treated with the peptide of the present invention were used as a control.
  • the expression level of the Dspp gene was measured by RT-PCR and real-time PCR analysis: Specifically, total RNA was isolated from the MDPC-23 cells using TRIzol reagent. CDNA was synthesized using 2 ⁇ g total RNA, 1 ul reverse transcriptase, and 0.5 ⁇ g oligo (dT). The synthesized cDNA was used for real time polymerase chain reaction. Real-time polymerase chain reaction was performed in ABI PRISM 7500 sequence detection system (Applied Biosystems) using each primer below and SYBR GREEN PCR Master Mix (Takara, Japan). Real time polymerase chain reaction at 94 DEG C, 1 minute; 95 ° C., 15 sec.-60 ° C., 34 sec was run under 40 cycles. The analysis of the results was evaluated using comparative cycle threshold (CT) method. In this case, the Gapdh gene was used as the internal control group, and the measured value was performed three times, and then the average value and the standard deviation value were used.
  • CT comparative
  • Dmp1_F 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3 '(SEQ ID NO: 98)
  • Gapdh_F 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 '(SEQ ID NO: 99)
  • Gapdh_R 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3 '(SEQ ID NO: 100)
  • Figure 1b is a graph showing the results of comparing the expression level of the Dspp gene, an oblast differentiation marker in the MDPC-23 cells treated with the peptide of the present invention.
  • the mRNA level of the Dspp gene, an oblast differentiation marker is increased, and similar to that of Figure 1a, a value of about 1.3 times or more of the mRNA level of the Dspp gene measured in the control group. It confirmed that it was shown.
  • Example 2-3 Dentin Eruption marker Gene Dspp , Dmp1 And Nestin Promotes regeneration of dentin or pulp tissue and treatment of dentin or pulp disease on gene expression level Peptide effect
  • the peptide of the present invention can increase the mRNA level of the Dspp gene, in particular, the peptides of groups 11 and 12 can increase the mRNA level of the Dspp gene by at least three times or more. Confirmed.
  • Example 2-2 Approximately, the same method as in Example 2-2 was carried out except that the following primers were used, and peptides of groups 11 and 12 were used as peptides, and thus the present invention had an effect on the expression level of Dmp1 and Nestin genes.
  • the effect of peptides was measured and the average level calculated for each group was compared (FIG. 1C).
  • MDPC-23 cells not treated with the peptide of the present invention was used as a control group, and mRNA level of the Dspp gene was used as a comparison group.
  • Dmp1_F 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3 '(SEQ ID NO: 101)
  • Dmp1_R 5'-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 102)
  • Figure 1c is a graph showing the results of comparing the expression level of Dspp, Dmp1 and Nestin genes, the odontoblast differentiation marker genes in the MDPC-23 cells treated with the peptides of Groups 11 and 12 of the present invention.
  • the treatment of the peptide of the present invention, the expression level of the Dspp, Dmp1 and Nestin genes of the oblast differentiation marker genes were all increased, but showed a difference in the increase level for each gene, group than the peptide of group 11 It was confirmed that the peptide of 12 increased to a higher level.
  • the differentiation marker genes are known as genes involved in the process of odontoblast differentiation and dentin calcification, the peptide provided in the present invention was analyzed to have an effect of promoting dentin regeneration.
  • Example 2-4 Promotes the regeneration of dentin or pulp tissue to pulp tissue cells and treatment of dentin or pulp disease Peptide Cytotoxicity Assessment
  • pulp tissue cells were divided into 96 well plates so as to have a number of 3 ⁇ 10 3 cells per well, incubated for 24 hours, and then treated with a group 11 or 12 peptide at a concentration of 10 or 50 ⁇ g / ml. Incubated again for 1, 3 or 5 days. After the incubation was terminated, the cultured cells were washed with PBS, 20 ⁇ l of MTT solution was added, and then reacted at 37 ° C. for 4 hours. After the reaction was completed, the MTT solution was removed, 100 ⁇ l of DMSO was added, and the absorbance was measured at a wavelength of 540 nm (FIG. 1D). In this case, pulp tissue cells cultured without the peptide were used as a control.
  • 1D is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of the peptides of the present invention on pulp tissue cells. As shown in Figure 1d, the addition of the peptide of the present invention was confirmed that the survival rate of the pulp tissue cells showed the same level as the control.
  • Example 3 In vivo Promotes the regeneration of dentin or pulp tissue and the treatment of dentin or pulp disease on the formation of dentin / dimension-like tissue Peptide effect
  • Example 3- 1 for 6 weeks From the bred animals Derived Morphological Analysis of Transplantation
  • a 100 mg dentin substitute was added to pulp tissue cells of 2 ⁇ 10 6 cell numbers and mixed with 0.5% fibrin gel to make an implant.
  • the dentin substitute hydroxy apatite / tricalcium phosphate (HA / TCP) ceramic powder (Zimmer, USA) was used, and the fibrin gel was composed of 10 ⁇ g of group 11 peptide (SEQ ID NO: 87). ), Peptide of group 12 (SEQ ID NO: 96) or 2 ⁇ g of BMP-2.
  • the implant was implanted into subcutaneous tissue of an immune system-damaged mouse (NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, Ind.), And the mice were bred for 6 weeks, then dentin formed from the implant / The pulp-like tissue was extracted.
  • the extracted tissue was fixed in 4% paraformaldehyde, demineralized in 10% EDTA (pH 7.4), embedded in paraffin, stained with hematoxylin-eosin (HE) (Vector Labs), and the dentin / dimension
  • the level of tissue-like tissue was assessed (FIG. 2).
  • the control was used to transplant the implant containing no peptide of the present invention.
  • FIG. 2 is a micrograph showing dentin / dimension-like tissue produced in vivo by implantation of a pulp tissue cell and an implant comprising various components, wherein A to C are pulp tissue cells and Micrograph (size bars: A 200 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m) showing the results of implantation of the control group containing only HA / TCP for 6 weeks; D to F are micrographs (size bars: D 200 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides for 6 weeks; G to I are micrographs (size bars: G 200 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 6 weeks; J to L are micrographs showing the results of transplantation of implants of control groups containing pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 6
  • Example 3- 2 6 weeks From animals raised during Derived Collagen staining analysis of transplanted tissue
  • Collagen is the most abundant organic matrix in dentin and bone and is known to play an important role in dentin regeneration by accepting the deposited minerals.
  • Figure 3 is a micrograph showing the formation level of collagen contained in the dentin / dimension tissue-like tissue produced in vivo by implanting the implant containing the pulp tissue cells and various components for 6 weeks, A to C The result of transplantation of a control group containing only tissue cells and HA / TCP for 6 weeks is shown (size bar: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m), and D to F represent pulp tissue cells and HA / TCP.
  • implants containing peptides of group 11 for 6 weeks (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m), G to I for pulp tissue cells, HA / TCP and group 12
  • the result of transplantation containing the peptide of 6 weeks after transplantation (size bar: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m), J to L include pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2
  • the result of transplantation of the implants of the control group for 6 weeks is shown (size bar: J 500 ⁇ m, K 200 ⁇ m, L 50 ⁇ m).
  • Example 3- 3 for 6 weeks From the bred animals Derived Immunostaining Analysis of Transplantation
  • the extracted tissue was fixed in 4% paraformaldehyde, demineralized in 10% EDTA (pH 7.4), embedded in paraffin, then diluted 1: 150 with primary antigen and anti-DSP After immunostaining with -BSP antibody, immunoreaction was performed with goat anti-rabbit IgG (Vector Labs) labeled with biotin as the secondary antigen, and the levels of DSP and BSP were measured (FIG. 4). At this time, the control was used to transplant the implant containing no peptide of the present invention.
  • Figure 4 shows a dendritic cell-specific differentiation marker gene DSP and osteoblast-specific differentiation markers in dentin / dimension-like tissues generated in vivo after 6 weeks of implantation of pulp tissue cells and various components.
  • Immunostaining photograph showing the results of evaluating the expression level of phosphorus BSP, A and E show the result of implantation of control tissue containing only pulp cells and HA / TCP for 6 weeks, B and F are pulp tissue The results of transplantation containing the cells, HA / TCP and group 11 peptides were transplanted for 6 weeks, with C and G being the implants containing the pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 6 weeks.
  • D and H represent the results of transplantation of the control group including the pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 6 weeks, and the arrows of A, B, C and D are newly DSP in dentin-like tissues formed It denotes a portion embodied, the arrowhead of the E, F, G and H represents a BSP is expressed in bone tissue similar to the newly formed part.
  • the size bar is 50 mu m.
  • DSP dentin-dimension-like tissue
  • A dentin-dimension-like tissue
  • B and C newly formed calcified tissues
  • Example 3- 4 for 12 weeks From the bred animals Derived Morphological Analysis of Transplantation
  • Example 3-1 was performed to assess the level of dentin / dimension-like tissue (FIG. 5).
  • FIG. 5 is a micrograph showing dentin / dimension-like tissue produced in vivo by implantation of a pulp tissue cell and an implant comprising various components, wherein A to C are pulp tissue cells and Micrograph (size bars: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m) showing the results of implantation of the control group containing only HA / TCP for 12 weeks; D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the results of transplantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides for 12 weeks; G to I are micrographs (size bars: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the results of implantation of implants containing pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides for 12 weeks; J to L are photomicrographs showing the results of transplantation of implants of control groups containing pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for
  • grafted implants containing the peptides of the present invention (D to I) have a high similarity to those in vivo It was confirmed that the parental cells and dentin / dimension complexes were formed.
  • Example 3- 5 12 weeks From the bred animals Derived Collagen staining analysis of transplanted tissue
  • FIG. 6 is a micrograph showing the level of collagen formation in dentin / dimension-like tissue generated in vivo after implantation of a pulp tissue cell and an implant containing various components for 12 weeks.
  • the result of implantation of a control group containing only tissue cells and HA / TCP was transplanted for 12 weeks (size bar: A 500 ⁇ m, B 200 ⁇ m, C 50 ⁇ m), and D to F were pulp tissue cells, HA / TCP.
  • implants comprising peptides of group 11 for 12 weeks (size bars: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m), G to I represent pulp tissue cells, HA / TCP and group 12
  • the implant containing the peptides of the implants were transplanted for 12 weeks (size bar: G 500 ⁇ m, H 200 ⁇ m, I 50 ⁇ m), and J to L include pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2.
  • the result of transplantation of the implants of the control group for 12 weeks is shown (size bar: J 500 ⁇ m, K 200 ⁇ m, L 50 ⁇ m).
  • Example 3- 6 12 weeks From the bred animals Derived Immunostaining Analysis of Transplantation
  • Example 3-3 An immunostaining assay was performed according to the method of Example 3-3, except for using each tissue extracted in Example 3-4 instead of each tissue extracted in Example 3-1 ( 7). At this time, the control was used to transplant the implant containing no peptide of the present invention.
  • FIG. 7 shows a dendritic cell-specific differentiation marker gene DSP and osteoblast-specific differentiation marker in dentin / dimension-like tissues generated in vivo by implanting a pulp tissue cell and an implant containing various components for 12 weeks.
  • FIG. Immunostaining photograph showing the results of evaluating the expression level of phosphorus BSP, where A and E show the result of transplantation of a control group containing only pulp tissue cells and HA / TCP for 12 weeks; B and F show the results of implantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 11 peptides; C and G show the results of transplantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 12 peptides; D and H represent the results of transplantation of implants of control groups containing pulp cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 12 weeks; Arrows in A, B, C and D indicate the areas where DSP is expressed in newly formed dentin-like tissue; Arrowheads of E, F
  • the dentin-dimension newly formed when the control group (A) or the implant (D) containing rhBMP2 was transplanted even when transplanted for 12 weeks, similarly to the transplantation for 6 weeks.
  • DSP was expressed at low levels in similar tissues, when implants (B and C) containing peptides of groups 11 or 12 were implanted, it was confirmed that DSP was expressed at relatively high levels in newly formed calcified tissues. .
  • the peptide of the present invention was found to exhibit an effect that can promote the regeneration of the dentin / dimension tissue complex.
  • Example 3-7 graft Into odontoblasts Differentiation Analysis
  • Example 3-4 In each of the tissues extracted in Example 3-4, it was confirmed by scanning electron microscopy whether the pulp tissue cells contained in the implants were differentiated into odontoblasts (FIG. 8). At this time, the control was used to transplant the implant containing no peptide of the present invention.
  • each tissue is immersed in 2.5% glutaraldehyde / 0.1 M Cacodylate buffer for 30 minutes, and the immobilized tissue is placed in a cacodylate buffer containing 1% osmium tetraoxide. The reaction was immersed for a time. Subsequently, the tissue was immersed in ethanol, dehydrated and dried, and then the dried tissue was coated with gold and photographed with a scanning electron microscope (S-4700, HITACHI, Tokyo, Japan).
  • FIG. 8 is a scanning electron micrograph showing the internal structure of dentin / dimension-like tissue generated in vivo after implantation of a transplant containing pulp tissue cells and various components for 12 weeks.
  • FIG. The implants of control group containing only cells and HA / TCP were transplanted for 12 weeks (size bars: A 50 ⁇ m, B 20 ⁇ m); C and D show the results of transplantation for 12 weeks with implants comprising pulp cells, HA / TCP and group 12 peptide (SEQ ID NO: 96) (size bar: C 50 ⁇ m, D 20 ⁇ m); E and F show the results of implantation of the control group including the pulp tissue cells, HA / TCP and rhBMP-2 for 12 weeks (size bar: E 50 ⁇ m, F 20 ⁇ m).
  • the peptide of the present invention was found to be able to more effectively form the oocytes.
  • Example 4 promoting regeneration and dentin of dentin or pulp tissue in human teeth G For treating hypersensitivity Peptide effect
  • each of the implants prepared in Example 3-1 each of the implants containing the peptide of group 12 (SEQ ID NO: 96) at a concentration of 10 ⁇ g / ml for the control implants Hematoxylin-Eosin, according to the method of Example 3-1, was implanted into the root canal space, which is an empty root canal space of the tooth part, and was used for dentin / dimension-like tissue formed in each implant. It was stained with (HE) and photographed with a scanning electron microscope according to the method of Example 3-7 (FIG. 9).
  • Figure 9 is a micrograph and a scanning electron micrograph showing the results of the implantation of the implant containing the peptide of the present invention in the root canal space of human teeth, after analysis of the odontoblast / dimension-like tissue formed therefrom
  • a and B show the result of staining the tissue transplanted with the pulp tissue cells and the implant of the control group containing only HA / TCP (size bar: A 500 ⁇ m, B 50 ⁇ m);
  • C, D and D ' show the results of staining tissues implanted with pulp tissue cells, HA / TCP and implants containing group 12 peptide (SEQ ID NO: 96), where D is an enlarged view of box 1 of C D 'is an enlarged view of box 2 of C (size bar: C 500 ⁇ m, D 50 ⁇ m, D' 50 ⁇ m);
  • E and F show the results of scanning electron microscopy of tissues implanted with a control tissue containing only pulp tissue cells and HA / TCP (size bar: E
  • the odontoblast-like cells were present as hedge arrays in the existing dentin walls, and their cell processes, along with the elongated nuclei, were present in the existing dentin. Expanded toward the tubules, it was confirmed that there is a new dentin formed tissue in the existing dentin wall (C, D and D ').
  • Example 5 indirect dimensions Demodulation In the dog model New Peptide Effect on Physiological Dentin Formation
  • part of the enamel of the cervical region was removed using a dental burr from the premolar of the 12-month-old dog to establish an dentin injured dog model using indirect pulp demodulation.
  • Shallow cavity model to form vortices by shallow deletion of dentin according to the degree of dentin exposure, and deep cavity model to delete dentin so that dimensions are visible from outside but not exposed outside was established.
  • the dogs were euthanized and teeth were extracted.
  • the extracted tooth was fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then washed several times with PBS (pH7.4) and then demineralized with 10% formic acid. Demineralized teeth are embedded with paraffin to produce tissue sections. Tissue sections were stained with hematoxylin / eosin (H & E) to evaluate dentin regeneration through histological analysis.
  • FIG. 10 is a micrograph showing histological analysis of the effect of new peptides on physiological dentin formation in the shallow vortex model of the indirect pulp demodulation model, where A to C are the dentin tubules of the exposed dentin site.
  • a micrograph showing the results of the control group without any material applied to the inlet (size bars: A 500 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m);
  • D to F are micrographs (size bars: D 500 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) showing the result of applying a group 11 peptide (1.5 ug) to the inlet port of the exposed dentin site;
  • G-I are micrographs (size bar: G 500 micrometers, H 100 micrometers, I 50 micrometers) which show the result of apply
  • P stands for pulp
  • D stands for dentin
  • TD stands for newly formed tertiary dentin.
  • the control group showed no change in the damaged dentin site (Figs. 10 A-C). However, in the group 11 (FIG. 10 DF) and the group 12 (FIG. 10 GI), the new physiological dentin (TD) exhibited continuity with the dentin dendritic dendrite of the existing dentin at the lower dentin of the existing dentin. It was observed to form.
  • Figure 11 is a micrograph showing the histological analysis of the effect of the new peptide on the physiological dentin (tertiary dentin) formation in the deep vortex model of the indirect dimensional demodulation model
  • a to C is the exposure of the dentin site
  • Micrograph showing the results of a control filled with dental filler GI cement (Glass Ionomer Cement, Fuji II LC, GC America Inc., Alsip, IL, USA) without applying any material at the entrance to the ivory tubule size bar: A 500 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m
  • D to F are micrographs showing the results of applying a peptide of group 11 (1.5 ug) to the inlet port of the dentin exposed site and filling the GI cement (size bar: D 500 ⁇ m, E 100 ⁇ m, F 50 ⁇ m) Is
  • G to I are micrographs (size bar: G 500 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m) showing the result
  • Example 6 direct dimension Demodulation In the dog model New Peptide Effect on Physiological Dentin Formation
  • the enamel and dentin of the cervical region were removed so that the pulp was exposed out of the premolar of the 12-month-old adult premolars using direct dental demodulation.
  • the dogs were euthanized and teeth were extracted.
  • the extracted tooth was fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then washed several times with PBS (pH7.4) and then demineralized with 10% formic acid. Demineralized teeth are embedded with paraffin to produce tissue sections. Tissue sections were stained with hematoxylin / eosin (H & E) to evaluate dentin regeneration through histological analysis.
  • FIG. 12 is a micrograph showing a histological analysis of the effect of the novel peptides on physiological dentin formation in the direct pulp demodulation model, A to C without applying any substance to the exposed pulp site.
  • Micrograph size bar: A 200 ⁇ m, B 100 ⁇ m, C 50 ⁇ m
  • D to F are positive control groups covered with GI cement after sealing with the dental restoration material MTA (Mineral trioxide aggregate, ProRoot MTA, Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, USA)
  • Micrograph showing the results size bar: D 500 ⁇ m, E 200 ⁇ m, F 50 ⁇ m); G to I were coated with a group 11 peptide (1.5 ug) on the exposed dimension site, sealed with MTA, and then coated with GI cement.
  • a micrograph showing the result of covering (size bar: G 200 ⁇ m, H 100 ⁇ m, I 50 ⁇ m); J to L is a micrograph showing the results of applying a group 12 peptide (1.5 ug) to the exposed pulp site, sealing it with MTA and covering it with GI cement (size bar: J 500 ⁇ m, K 100 ⁇ m, L 50 ⁇ m) to be.
  • D stands for dentin
  • OD stands for osteodentin
  • TD stands for newly formed physiological dentin.
  • the control group treated with GI cement did not show any change in the pulp region of the damaged dentin (FIGS. 12A-C).
  • MTA is a dental restorative material that is now widely used for dentin formation and regeneration.
  • hard tissue produced by MTA is known to be a bone-like bone dentin, in which cells are buried in calcified tissue and bones of dentin, an important component of dentin, are not observed.
  • the morphology of bone dentin (OD) buried in the calcified tissue was observed in the MTA-treated group along the existing dentin remaining in the upper and lower portions of the exposed pulp (Fig. 12 D-F).
  • group treated with group 11 (FIG. 12 GI) and group 12 (FIG. 12 JL) together with the MTA the dentin and continuity of the dentin along the existing dentin remain above and below the exposed pulp. The formation of new physiological dentin (TD) was observed.
  • the peptides provided by the present invention increase the expression level of Dspp, Dmp1 and Nestin genes, which are the oocyte-specific differentiation marker genes, and when transplanted to a living body with pulp tissue cells, It was found that it promotes the formation, and especially when implanted into the root canal space, has an effect of promoting the formation of the pulp tissue into dentin / dimension-like tissue. In addition, it can be seen that the same physiological dentin as seen in human natural tooth dentin is formed by the novel peptide.
  • the peptide provided in the present invention can be used to treat dentin disease or pulp disease.

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Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 펩타이드
본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
치수는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳을 말한다. 이런 치수에 생기는 병변을 치수질환이라 한다.
치수 질환의 원인은 매우 다양하나, 대부분의 경우는 충치에 의한 세균감염과 치아의 천공, 파절, 균열, 치주낭을 통해서 치수내부로의 감염에 의해 발생한다. 또한 외상, 마모, 치아 균열, 치료 시 치과용 기구에서 나오는 열과 마찰 등도 유발할 수 있다. 세균감염에 의한 치수염은 치근단 질환과 치주질환으로 확대 될 수 있다. 치수질환이 발생 하였을 때, 치수 충혈, 치수염, 치수 괴사의 순으로 진행된다. 치수 괴사의 경우, 치수가 죽어서 치수에 혈액공급이 전혀 안되기 때문에 전체 치주 조직이 사라져서 나중에는 치근단 질환 또는 치아전체의 이상이 초래 될 수 있다.
치수, 치근단 질환의 치료는 치수 복제제와 치근관 충전재를 사용하는데, 일반적으로 칼슘 히드록사이드, MTA(Mineral Trioxide Aggregate), 거타퍼차(Gutta-percha) 등이 이용되어 왔다. MTA의 경우, 밀봉력과 생체친화적인 성질을 가지고 있어서 치료에 효과를 보이나, 상대적으로 치과 치료제로써 높은 비용문제가 발생하고, 변색이 되어 심미적 문제가 발생한다. 거타퍼차의 경우, 비용이 경제적이고 유동성이 좋으나, 치수생활력을 상실하게 되는, 생리적이지 못한 치료방법이다. 현재까지 상아질 치수질환을 치료하는 보존적인 치료 방법은 치료한 치아가 약해지거나, 부서지기 쉬우며, 재감염의 위험을 가지게 된다.
이에 따라, 상기 상아질질환 또는 치수질환을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2012-0089547호에는 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0033643호에는 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 상아질질환 또는 치수질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 예의 연구 노력한 결과, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진용 세포치료 및 상아질 지각과민증 치료 효과를 나타내는 펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질 또는 치수조직의 재생 촉진 용도, 상아질 지각과민증 예방 또는 치료 용도 및 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명은 서열번호 1 내지 96 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질 또는 치수조직의 재생 촉진 용도, 상아질 지각과민증 예방 또는 치료 용도 및 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드는 우수한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 효과를 나타내므로, 다양한 상아질과 치수 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 그룹 11 및 12의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 치수조직 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 3은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 4는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 5는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 6은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 7은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 8은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직의 내부 구조를 나타내는 주사형 전자 현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 50㎛, B 20㎛); C 및 D는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: C 50㎛, D 20㎛); E 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: E 50㎛, F 20㎛).
도 9는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 인간 치아의 치근관 공간에 이식한 후, 이로부터 형성되는 상아모세포/치수조직-유사 조직을 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 주사형 전자현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 50㎛); C, D 및 D'은 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내며, D는 C의 1번 박스의 확대도이고, D'은 C의 2번 박스의 확대도이며(크기바: C 500㎛, D 50㎛, D' 50㎛); E 및 F는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내고(크기바: E 50㎛, F 10㎛); G 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내며(크기바: G 50㎛, H 10㎛); P는 재생된 치수조직을 나타내고, De는 기존의 상아질 벽을 나타내며, DT는 기존의 상아질 세관을 나타내고, Od는 상아모세포를 나타내며, OP는 상아모세포 돌기를 나타내고, D에 있는 화살표는 상아모세포 돌기와 함께 상아모세포-유사 세포가 재생된 것을 나타낸다.
도 10은 간접 치수 복조술 모델 중 얕은 와동 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 아무런 물질도 도포하지 않은 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 100㎛, I 50㎛)이다. P는 치수(pulp)를 나타내고, D는 상아질(dentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
도 11은 간접 치수 복조술 모델 중 깊은 와동 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 아무런 물질도 도포하지 않고 GI cement를 충전한 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 GI cement를 충전한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 GI cement를 충전한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 100㎛, I 50㎛)이다. P는 치수(pulp)를 나타내고, D는 상아질(dentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
도 12는 직접 치수 복조술 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 아무런 물질도 도포하지 않고 GI cement를 처리한 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 아무런 물질도 도포하지 않고 MTA로 밀봉후 GI cement로 덮어준 양성 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이고;G 내지 I는 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 MTA로 밀봉 후 GI cement로 덮어준 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이며; J 내지 L는 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 MTA로 밀봉 후 GI cement로 덮어준 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다. D는 상아질(dentin)을 나타내고, OD는 골양상아질(osteodentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 상아질질환 또는 치수질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행한 결과, 10개의 아미노산으로 구성된 신규한 펩타이드를 개발하였다.
상기 개발된 신규한 펩타이드는 상아질질환 또는 치수질환 치료효과를 나타낼 수 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 일부 치환하여 제작된 것으로서, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있어, 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타내면서도, 치수조직의 세포에 대하여는 어떠한 세포독성도 나타내지 않음을 확인하였다.
또한, 상기 펩타이드를 치수조직세포와 함께 포함하는 이식물을 제작하고, 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스의 피하조직에 이식하고, 6주 내지 12주가 경과된 후, 이식된 조직을 분석한 결과, 생체내 상아질-치수조직과 가장 유사한 형태의 상아질-치수 유사 조직이 형성되고, 콜라겐의 형성수준이 증가하며, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP의 발현수준이 증가하는 반면, 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준은 특별히 증가되지 않음을 확인하였다.
아울러, 상기 이식된 조직의 형상을 주사 전자현미경을 통해 분석한 결과, 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장됨을 확인하였다.
또한, 간접 치수 복조술 성견 모델 및 직접 치수 복조술 성견 모델에서의 상기 펩타이드의 효과를 확인한 결과, 사람 자연 치아 상아질에서 볼 수 있는 것과 동일한 생리적인 상아질이 신규한 펩타이드에 의하여 형성됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과를 나타내는 본 발명의 펩타이드는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
본 발명의 용어, "상아질(dentine)"이란, "치질(齒質)"이라고도 호칭되고, 치아의 대부분을 이루고있는, 노란 빛을 띤 흰색의 단단한 조직을 의미한다. 상기 상아질은 치관부(齒冠部)에서는 에나멜질, 치근부(齒根部)에서는 시멘트질로 덮여 있으므로 치아의 표면으로는 드러나지 않으나, 나이가 많아짐에 따라 에나멜질이 마멸되면 치관의 선단부나 교합면(咬合面)에 상아질이 노출될 수 있다. 상기 상아질은 일종의 골조직이지만 상아질을 만들고 있는 세포의 본체는 치수(齒髓) 속에 있고, 그 돌기만 상아질 속으로 뻗어 나온다는 점에서 일반적인 골조직과 구별된다.
본 발명의 용어, "치수조직(dental pulp)"이란, "치수"라고도 하며, 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직을 의미한다. 해부학적으로는, 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳까지의 영역을 의미할 수도 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있으며, 치수조직 세포와 함께 생체내에 이식할 경우, 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사 조직을 형성하는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환의 치료효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.
일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 상아질 또는 치수조직의 재생촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 4번 또는 5번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 산성 아미노산인 글루타민 또는 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 6번, 7번 또는 9번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 방향족 아미노산인 타이로신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 8번에 위치한 산성 아미노산인 아스파라긴은 중성 아미노산인 세린으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 10번에 위치한 방향족 아미노산인 타이로신은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.
이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산은 각각 같은 성질을 갖는 아미노산으로 치환되는 경우에는 물론, 각각 이와 다른 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는, 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation), N-말단을 메틸화(Metylation) 또는/및 C-말단을 아미드화(amidation)할 수 있고, 또는 D-아미노산 도입, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.
본 발명의 용어 "백본 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬의 모양 또는 고리 모양의 골격을 백본(주사슬: backbone)이라 하며, 이들 펩타이드 백본을 구성하는 아미노산을 아미노산 유사체로 직접 변형하는 것을 백본 변형이라 한다. 아미노산 유사체란, 아미노산 백본의 질소 또는 α-탄소에서 수소원자를 치환작용에 의해 변형시킨 아미노산을 말한다.
본 발명의 용어 "측쇄 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬 모양 또는 고리 모양의 골격으로부터 가지처럼 갈라져 나간 원자단을 아미노산의 측쇄(곁사슬: side-chains라 하며, 이들 측쇄를 화학물질을 이용하여 변형하는 것을 측쇄 변형이라 한다. 펩타이드 측쇄 변형의 예로, 환원 알킬화 반응; 메틸아세티미데이트에 의한 아미디화; 아세틱 언하이드라이드에 의한 알킬화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카르바모릴레이션; 2,4,6-트리니트로벤젠 술포닉산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질레이션; 숙신 언하이드라이드에 의한 아미노 그룹의 알킬화; 및 피리오살-5-포스페이트 처리 후 NaBH4로 환원된 피리도실레이션과 같은 아미노그룹의 변형 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 단독으로 사용될 수 있으나, 유기용매와 같이 약제로 허가된 여러 캐리어(cattier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성 및 효능의 증대를 위해 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅 산(ascorbic acid), 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등을 포함하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 일반식 1에 해당하는 96종의 펩타이드를 합성하고, 상기 합성된 펩타이드가 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 영향을 검증하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포(대조군)에서 측정된 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 상기 96종의 펩타이드를 처리한 MDPC-23 세포에서 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 1.3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다(표 13 내지 24).
지금까지 보고된 바에 의하면, DSPP의 mRNA발현 수준이 증가되면, 상아모세포 분화 및 상아질 재생이 촉진된다고 알려져 있으므로, 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 효과를 나타내는 상기 96종의 펩타이드는 상아모세포 분화 및 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24874-24880, 2003; William T. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171-178, 2003).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동 가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량 가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환 시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
상기 형질전환체는 또한 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.
아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드는 치수조직 세포와 함께 생체내에 이식할 경우, 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사 조직을 형성하는 것을 촉진시킬 수 있고, 손상된 상아질 부위 또는 치수 부위에 상기 펩타이드를 도포함으로서 사람의 자연 치아 상아질에서 볼 수 있는 것과 동일한 생리적인 상아질을 형성시킬 수 있으므로, 상아질 또는 치수조직이 손상되어 발생하는 상아질질환 또는 치수질환 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 펩타이드는 펩타이드 단독의 형태로 사용될 수도 있고, 상기 펩타이드가 2회 이상 반복되어 연결된 폴리펩타이드의 형태로 사용될 수도 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 상아질질환 또는 치수질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체 형태로 사용될 수도 있다.
본 발명의 용어 "상아질질환" 또는 "치수질환"이란, 상기 상아질 및 치수조직의 손상으로 인하여, 치수조직과 이에 결합된 상아질이 손상되어 발병되는 모든 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 상아질질환 또는 치수질환은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성, 치수의 괴사 및 괴저증 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 상아질질환 또는 치수질환의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 상아질질환 또는 치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써, 상아질질환 또는 치수질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 상기 펩타이드에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 상아질질환 또는 치수질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 상아질질환 또는 치수질환 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 상아질질환 또는 치수질환이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 상아질질환 또는 치수질환의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발병된 개체 중에서 인간을 제외한다.
본 발명의 상아질질환 또는 치수질환 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 구강내 투여 또는 구강내 주사 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 상아질질환 또는 치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써, 상아질질환 또는 치수질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실, 구강용 연고제 등일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 상아질질환 또는 치수질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 상아질질환 또는 치수질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 상아질질환 또는 치수질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질 또는 치수조직의 재생 촉진 용도, 상아질 지각과민증 예방 또는 치료 용도 및 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 96 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질 또는 치수조직의 재생 촉진 용도, 상아질 지각과민증 예방 또는 치료 용도 및 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 합성
본 발명자들은 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 효과를 나타내는 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐 (9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 각 그룹의 펩타이드를 합성하였다(표 1 내지 12).
N-KYQRRKKNKY-C(서열번호 1)
먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 1).
그룹 1의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
1 KYQRRKKNKY
2 KYQRRKRNKY
3 KYQRRRKNKY
4 KYQRRRRNKY
5 KYQRKKKNKY
6 KYQRKRKNKY
7 KYQRKKRNKY
8 KYQRKRRNKY
다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 2).
그룹 2의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
9 KYQRRKKSKY
10 KYQRRKRSKY
11 KYQRRRKSKY
12 KYQRRRRSKY
13 KYQRKKKSKY
14 KYQRKRKSKY
15 KYQRKKRSKY
16 KYQRKRRSKY
다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하여 합성하였다(표 3).
그룹 3의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
17 KYQRRKKNYK
18 KYQRRKRNYK
19 KYQRRRKNYK
20 KYQRRRRNYK
21 KYQRKKKNYK
22 KYQRKRKNYK
23 KYQRKKRNYK
24 KYQRKRRNYK
다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 4).
그룹 4의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
25 KYQRRKKSYK
26 KYQRRKRSYK
27 KYQRRRKSYK
28 KYQRRRRSYK
29 KYQRKKKSYK
30 KYQRKRKSYK
31 KYQRKKRSYK
32 KYQRKRRSYK
다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 5).
그룹 5의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
33 KYRQRKKNKY
34 KYRQRKRNKY
35 KYRQRRKNKY
36 KYRQRRRNKY
37 KYRQKKKNKY
38 KYRQKRKNKY
39 KYRQKKRNKY
40 KYRQKRRNKY
다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 6).
그룹 6의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
41 KYRQRKKSKY
42 KYRQRKRSKY
43 KYRQRRKSKY
44 KYRQRRRSKY
45 KYRQKKKSKY
46 KYRQKRKSKY
47 KYRQKKRSKY
48 KYRQKRRSKY
다음으로, 그룹 7의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 7).
그룹 7의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
49 KYRQRKKNYK
50 KYRQRKRNYK
51 KYRQRRKNYK
52 KYRQRRRNYK
53 KYRQKKKNYK
54 KYRQKRKNYK
55 KYRQKKRNYK
56 KYRQKRRNYK
다음으로, 그룹 8의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 8).
그룹 8의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
57 KYRQRKKSYK
58 KYRQRKRSYK
59 KYRQRRKSYK
60 KYRQRRRSYK
61 KYRQKKKSYK
62 KYRQKRKSYK
63 KYRQKKRSYK
64 KYRQKRRSYK
다음으로, 그룹 9의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 9).
그룹 9의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
65 KYKQRKKNKY
66 KYKQRKRNKY
67 KYKQRRKNKY
68 KYKQRRRNKY
69 KYKQKKKNKY
70 KYKQKRKNKY
71 KYKQKKRNKY
72 KYKQKRRNKY
다음으로, 그룹 10의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 10).
그룹 10의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
73 KYKQRKKSKY
74 KYKQRKRSKY
75 KYKQRRKSKY
76 KYKQRRRSKY
77 KYKQKKKSKY
78 KYKQKRKSKY
79 KYKQKKRSKY
80 KYKQKRRSKY
다음으로, 그룹 11의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 11).
그룹 11의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
81 KYKQRKKNYK
82 KYKQRKRNYK
83 KYKQRRKNYK
84 KYKQRRRNYK
85 KYKQKKKNYK
86 KYKQKRKNYK
87 KYKQKKRNYK
88 KYKQKRRNYK
끝으로, 그룹 12의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 12).
그룹 12의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
89 KYKQRKKSYK
90 KYKQRKRSYK
91 KYKQRRKSYK
92 KYKQRRRSYK
93 KYKQKKKSYK
94 KYKQKRKSYK
95 KYKQKKRSYK
96 KYKQKRRSYK
실시예 2: 상아모세포를 이용한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 효과검증
실시예 2-1: DSPP (dentin sialophosphoprotein ) 프로모터 활성에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 영향
먼저, 마우스 유래 상아모세포인 MDPC-23 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서, 5%의 CO2 및 37℃ 조건으로 배양하였다.
다음으로, 상기 배양된 MDPC-23 세포를 24웰 플레이트에 각 웰당 5 X 104 세포수로 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 리포펙타민 Plus™ 시약을 이용하여 상기 배양된 세포에, pGL3 벡터에 DSPP 프로모터와 루시퍼라제 유전자가 도입된 재조합 벡터를 도입하여 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 MDPC-23 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 그룹 1 내지 12의 펩타이드를 각각 처리하고 48시간 동안 배양한 다음, 상기 각각의 형질전환된 MDPC-23 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1a). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 형질전환된 MDPC-23 세포를 사용하였다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드는 전체적으로 대조군에서 측정된 루시퍼라제 활성수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타내었으나, 각 그룹별로 차이를 나타내며, 그룹 12의 펩타이드가 가장 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내고, 다음으로 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드는 그룹 11의 펩타이드임을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 Dspp 프로모터를 활성화시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-1에서 배양한 MDPC-23 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 각 그룹의 펩타이드를 처리하고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 MDPC-23 세포에서 발현되는 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 측정하고, 상기 측정된 각각의 Dspp 유전자의 mRNA 수준을, 대조군에서 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 대한 상대적 비율로 환산하였다(표 13 내지 24). 또한, 각 그룹의 펩타이드에 따라 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준의 평균값을 각 그룹별로 비교하였다(도 1b). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포를 사용하였다.
상기 Dspp 유전자의 발현수준은 RT-PCR 및 실시간 PCR 분석을 통해 측정하였다: 구체적으로, TRIzol 시약을 이용하여 상기 MDPC-23 세포로부터 전체(total) RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 전체 RNA와 역전사효소 1 ul와 0.5 ㎍의 올리고(oligo; dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 하기 각 프라이머와 SYBR GREEN PCR Master Mix(Takara, 일본)를 이용하여 ABI PRISM 7500 시퀀스 검출 시스템(sequence detection system)(Applied Biosystems)에서 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 94℃, 1분; 95℃, 15초 - 60℃, 34초를 40 사이클(cycles) 반복하는 조건으로 진행하였다. 결과의 분석은 comparative cycle threshold(CT) 방법을 이용하여 평가하였다. 이때, 내부대조군으로는 Gapdh 유전자를 사용하였고, 측정값은 3회 반복실험을 수행한 후, 이의 평균값 및 표준편차 값을 사용하였다.
Dspp_R: 5'-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3'(서열번호 97)
Dmp1_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 98)
Gapdh_F: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(서열번호 99)
Gapdh_R: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(서열번호 100)
그룹 1의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
1 1.754 0.132
2 1.646 0.092
3 1.464 0.221
4 1.855 0.102
5 1.639 0.057
6 1.746 0.091
7 1.864 0.132
8 1.639 0.032
그룹 2의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
9 1.854 0.032
10 1.746 0.052
11 1.639 0.201
12 1.548 0.027
13 1.685 0.077
14 1.846 0.141
15 1.964 0.279
16 1.739 0.092
그룹 3의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
17 2.117 0.209
18 2.319 0.092
19 1.931 0.102
20 2.553 0.099
21 1.893 0.132
22 2.412 0.072
23 2.171 0.281
24 2.212 0.111
그룹 4의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
25 2.371 0.089
26 2.193 0.052
27 1.993 0.202
28 2.453 0.192
29 1.883 0.101
30 2.512 0.209
31 2.371 0.139
32 2.219 0.302
그룹 5의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
33 1.712 0.091
34 1.931 0.172
35 1.983 0.102
36 2.319 0.292
37 1.597 0.301
38 2.116 0.211
39 1.712 0.191
40 2.219 0.212
그룹 6의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
41 1.546 0.091
42 1.586 0.103
43 1.669 0.095
44 1.793 0.203
45 1.532 0.310
46 1.887 0.077
47 1.697 0.009
48 1.558 0.201
그룹 7의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
49 1.923 0.192
50 1.887 0.007
51 1.601 0.082
52 2.019 0.135
53 1.592 0.222
54 1.437 0.341
55 1.663 0.094
56 1.701 0.109
그룹 8의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
57 2.039 0.082
58 1.998 0.172
59 1.792 0.007
60 2.107 0.201
61 2.301 0.019
62 1.672 0.308
63 1.769 0.085
64 1.967 0.039
그룹 9의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
65 1.723 0.072
66 1.627 0.291
67 1.777 0.027
68 1.432 0.410
69 2.011 0.081
70 1.927 0.105
71 1.879 0.060
72 2.011 0.009
그룹 10의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
73 2.035 0.021
74 2.011 0.063
75 1.997 0.059
76 2.351 0.109
77 1.729 0.111
78 2.635 0.091
79 2.231 0.077
80 1.837 0.201
그룹 11의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
81 3.092 0.152
82 3.361 0.098
83 3.572 0.209
84 3.702 0.301
85 3.670 0.088
86 3.705 0.137
87 3.888 0.072
88 4.021 0.301
그룹 12의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
89 4.211 0.413
90 4.811 0.302
91 4.362 0.182
92 4.211 0.287
93 4.525 0.250
94 3.836 0.099
95 4.620 0.401
96 5.211 0.371
상기 표 13 내지 24에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포(대조군)에서 측정된 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 1.3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
특히, 그룹 11의 모든 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3배 이상의 값을 나타내었고, 그룹 12의 모든 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3.8배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 증가되고, 도 1a의 것과 비슷하게, 대조군에서 측정된 Dspp 유전자 mRNA 수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp , Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-2의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시킬 수 있고, 특히, 그룹 11 및 12의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 적어도 3배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이에 따라, 상기 그룹 11 및 12의 펩타이드가 다른 상아모세포 분화마커 유전자인 Dmp1 및 Nestin 유전자의 mRNA 수준도 증가시킬 수 있는지 확인하였다.
대략적으로, 하기 각 프라이머를 사용하고, 펩타이드로서 그룹 11 및 12의 펩타이드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하여, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1c). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포를 사용하였고, 비교군으로서 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 사용하였다.
Dmp1_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 101)
Dmp1_R: 5'-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3'(서열번호 102)
Nestin_F: 5'-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3'(서열번호 103)
Nestin_R: 5'-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3'(서열번호 104)
도 1c는 본 발명의 그룹 11 및 12의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하면, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준이 모두 증가되었으나, 각 유전자별로 증가수준에 차이를 나타내고, 그룹 11의 펩타이드 보다는 그룹 12의 펩타이드가 더욱 높은 수준으로 증가시킴을 확인하였다.
상기 각 분화마커 유전자는 상아모세포 분화와 상아질의 석회화 과정에 관여하는 유전자로 알려져 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 2-4: 치수조직 세포에 대한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드의 세포독성 평가
먼저, 사람 치수 줄기세포는 서울대학교 치과병원에서 성인 10명(18-22세)의 사랑니에서 치수조직 세포를 분리하였다. 구체적으로, 모든 실험은 임상연구심의위원회(hospital's Institutional Review Board)에서 승인을 받은 후 환 자의 동의를 받아 실험을 수행하였으며, Jung HS et al(J Mol Histol.(2011))의 방법에 따라 사랑니는 절단하여, 치수를 노출시켜 포셉으로 치수조직을 분리하였다. 상기 분리된 치수조직을 양면도로 잘게 세절하고, 60 mm 접시에 넣고, 커버 슬립으로 덮은 후, DMEM 배지에서 배양하여, 배양된 치수조직 세포를 수득하였다.
다음으로, 상기 수득한 치수조직 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 3 × 103 세포수가 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 10 또는 50㎍/㎖ 농도로 처리하고, 다시 1, 3 또는 5일 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 20㎕의 MTT 용액을 가하였으며, 이후 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MTT 용액을 제거하고, 100㎕의 DMSO를 가한 후, 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 1d). 이때, 대조군으로는 상기 펩타이드를 처리하지 않고 배양한 치수조직 세포를 사용하였다.
도 1d는 치수조직 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1d에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 가하여도 치수조직 세포의 생존율은 대조군과 동일한 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3: 생체내에서 상아질/치수조직 유사조직 형성에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드의 영향
실시예 3- 1: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
2 x 106 세포수의 치수조직 세포에 100mg의 상아질 대용품을 가하고, 0.5% 피브린 겔과 혼합하여 이식물을 제작하였다. 이때, 상기 상아질 대용품으로는 히드록시 에퍼타이트(hydroxy apatite)/트리칼슘 포스페이트 (HA/TCP) 세라믹 파우더(Zimmer, USA)를 사용하였고, 상기 피브린 겔은 10㎍의 그룹 11의 펩타이드(서열번호 87), 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96) 또는 2㎍의 BMP-2를 포함하도록 제조하였다. 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스(NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)의 피하조직에 이식 하고, 상기 마우스를 6주 동안 사육한 후, 이식물로부터 형성된 상아질/치수조직-유사 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켰으며, 파라핀에 포매하고, 헤마톡실린-에오신(H-E) (Vector Labs)으로 염색하여, 상기 상아질/치수조직-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 2는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 2에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 이식물을 이식한 경우(A 내지 I)에는 HA/TCP 입자의 주변에 상아질-치수 유사 조직이 발생됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 이식한 경우(J 내지 L)에는 HA/TCP 입자의 주변에 뼈-유사 석회화된 조직과 골수 유사 조직이 발생됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 상대적으로 높은 수준으로 생체내 상아질-치수조직과 가장 유사한 형태의 상아질-치수 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
실시예 3- 2: 6주 동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
콜라겐은 상아질과 뼈에서 가장 풍부하게 존재하는 유기바탕질(organic matrix) 이며, 침착되는 무기질을 수용하여 상아질의 재생에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
이에 따라, 상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 3은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 3에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우에는, 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3- 3: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가하기 위하여, 면역염색 분석을 수행하였다.
대략적으로, 상기 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켰으며, 파라핀에 포매한 다음, 1차 항원으로 1:150로 희석한 항-DSP와 항-BSP 항체를 사용하여 면역염색한 후, 2차 항원으로 비오틴 라벨을 한 염소 항-래빗 IgG (Vector Labs)로 면역반응을 수행하여, DSP와 BSP의 수준을 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 4는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 4에서 보듯이, 대조군의 이식물이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 낮은 수준으로 발현되었지만(A), 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현되었으나(B 및 C), rhBMP2를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 DSP가 거의 발현되지 않음을 확인하였다(D).
또한, 대조군의 이식물(E), 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물(F) 또는 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G)이 이식된 경우에는, 형성된 석회화된 조직에서 BSP가 낮은 수준으로 발현되었으나, rhBMP2를 포함하는 이식물(H)이 이식된 경우에는 형성된 석회화된 조직과 석회화된 조직에 함입된 골세포 유사세포에서 BSP가 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 3- 4: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
이식물이 이식된 마우스를 12주 동안 사육하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, 상아질/치수조직-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 5).
도 5는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 5에서 보듯이, 이식후 12주 동안 사육한 경우, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 이식물을 이식한 경우(A 내지 I)에는 이식후 6주 동안 사육한 경우와 유사하게 HA/TCP 입자의 주변에 상아질-치수 유사 조직과 상아모세포 돌기가 발생됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 이식한 경우(J 내지 L)에는 HA/TCP 입자의 주변에 기질에 세포가 함임된 뼈-유사 조직과 골수 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 생체내의 것과 유사성이 높은 상아모세포와 상아질/치수조직 복합체가 형성됨을 확인하였다.
실시예 3- 5: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 6은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 6에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주 동안 이식한 경우에는, 6주동안 이식한 경우와 유사하게 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3- 6: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직 대신에, 상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3의 방법에 따라 면역염색 분석을 수행하였다(도 7). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 7은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 7에서 보듯이, 6주 동안 이식한 경우와 유사하게 12주 동안 이식한 경우에도, 대조군의 이식물(A) 또는 rhBMP2를 포함하는 이식물(D)이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 낮은 수준으로 발현되었지만, 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(B 및 C)이 이식된 경우에는 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
또한, 대조군의 이식물(E), 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물(F) 또는 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G)이 이식된 경우에는, 형성된 석회화된 조직에서 BSP가 낮은 수준으로 발현되었으나, rhBMP2를 포함하는 이식물(H)이 이식된 경우에는 형성된 석회화된 조직과 석회화된 조직에 함입된 골세포 유사세포에서 BSP가 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아질/치수조직 복합체의 재생을 촉진할 수 있는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3-7: 이식조직의 상아모세포로의 분화분석
상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직에서, 이식물에 포함된 치수조직 세포가 상아모세포로 분화되었는지의 여부를 주사형 전자 현미경을 이용하여 확인하였다(도 8). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
대략적으로, 상기 각 조직을 2.5% 글루타르알데히드/0.1 M 카코딜레이트 완충액(Cacodylate buffer)에 침지하여 30분동안 고정시키고, 고정된 조직을 1% 오스뮴테트라옥사이드를 포함하는 카코딜레이트 완충액에 1시간 동안 침지하여 반응시켰다. 이어, 상기 조직을 에탄올에 침지하여 탈수 및 건조시킨 다음, 건조된 조직을 금으로 코팅하고, 주사형 전자 현미경(S-4700, HITACHI, Tokyo, Japan)으로 촬영하였다.
도 8은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직의 내부 구조를 나타내는 주사형 전자 현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 50㎛, B 20㎛); C 및 D는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: C 50㎛, D 20㎛); E 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: E 50㎛, F 20㎛).
도 8에서 보듯이, 대조군의 이식물(A 및 B)이 이식된 경우에는 형성된 경조직 주위에서 상아모세포 돌기가 형성된 상아모세포-유사 세포가 일부 관찰되었고, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물(C 및 D)이 이식된 경우에는 형성된 경조직을 따라 많은 수의 상아모세포-유사 세포가 관찰되었고, 상아모세포 돌기 또한 형성된 경조직 방향으로 확장됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물(E 및 F)이 이식된 경우에는 형성된 경조직의 표면에 입방형의 세포가 부착되어 있는 전형적인 골모세포의 특징을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아모세포를 보다 효과적으로 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 인간의 치아에서 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지 각과민증 치료용 펩타이드의 효과
알려진 바에 의하면, 자연적 치아의 상아질 벽 및 빈 치수 공간은, 치수세포에 의한 상아질/치수 유사 조직의 재생에 특이적인 국소 환경을 만들어준다고 알려져 있다(Huang GT, et al. (2010) Tissue engineering. Part A 16(2):605-615). 이에 따라, 치근관 공간에서의 상아질-치수조직 유사 조직 형성을 평가하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조한 각각의 이식물 중에서, 대조군의 이식물 또는 10㎍/㎖의 농도로 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 각각 6주 동안 인간 치아 부분의 빈 근관공간인 치근관 공간(root canal space)에 이식하고, 각 이식물에서 형성되는 상아질/치수조직-유사 조직을 대상으로, 실시예 3-1의 방법에 따라 헤마톡실린-에오신(H-E)으로 염색하고, 실시예 3-7의 방법에 따라 주사형 전자 현미경으로 촬영하였다(도 9).
도 9는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 인간 치아의 치근관 공간에 이식한 후, 이로부터 형성되는 상아모세포/치수조직-유사 조직을 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 주사형 전자현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 50㎛); C, D 및 D'은 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내며, D는 C의 1번 박스의 확대도이고, D'은 C의 2번 박스의 확대도이며(크기바: C 500㎛, D 50㎛, D' 50㎛); E 및 F는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내고(크기바: E 50㎛, F 10㎛); G 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내며(크기바: G 50㎛, H 10㎛); P는 재생된 치수조직을 나타내고, De는 기존의 상아질 벽을 나타내며, DT는 기존의 상아질 세관을 나타내고, Od는 상아모세포를 나타내며, OP는 상아모세포 돌기를 나타내고, D에 있는 화살표는 상아모세포 돌기와 함께 상아모세포-유사 세포가 재생된 것을 나타낸다.
도 9에서 보듯이, 대조군의 이식물과 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 치근관 내부에서는 모두 혈관이 발달된 치수조직-유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
그러나, 본 발명의 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는, 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장되었으며, 기존의 상아질 벽에 새로운 상아질이 형성된 조직이 존재함을 확인하였다(C, D 및 D').
특히, 주사형 전자현미경 사진(E 내지 H)에서 보듯이, 대조군의 이식물(E 및 F)이 이식된 경우에 비하여, 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G 및 H)이 이식된 경우에는 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장됨을 확인하였다.
실시예 5: 간접 치수 복조술 성견 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질) 형성에 미치는 영향
간접 치수 복조술 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질) 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상아질 재생능을 평가하고자 하였다.
구체적으로, 간접 치수 복조술을 이용하여 상아질 손상 성견모델을 확립하기 위하여 생후 12개월 성견의 소구치에서 치과용 버를 사용하여 치경부의 법랑질 일부를 제거하였다. 상아질을 노출시키는 정도에 따라 상아질을 얕게 삭제하여 와동을 형성 시키는 얕은 와동 모델(Shallow cavity model) 및 치수가 밖에서 비쳐 보이지만 밖으로 노출은 되지 않는 상태가 되도록 상아질을 삭제하는 깊은 와동 모델(Deep cavity model)을 확립하였다. 상기 모델에 대조군, 그룹 11의 펩타이드 또는 그룹 12의 펩타이드를 각각 처리하는 실험을 진행 후 3주 후에 성견을 안락사하여 치아를 발치하였다.
상기 발치된 치아는 4% 파라포름알데히드에서 24시간 동안 고정한 다음 PBS(pH7.4)로 여러번 수세 후 10% 포름산(formic acid)을 이용하여 탈회시켰다. 탈회된 치아는 파라핀으로 포매하여 조직절편을 제작한다. 조직절편은 헤마톡실린/에오신(H&E)으로 염색하여 조직학적 분석을 통하여 상아질 재생 능을 평가하였다.
도 10은 간접 치수 복조술 모델 중 얕은 와동 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 아무런 물질도 도포하지 않은 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 100㎛, I 50㎛)이다. P는 치수(pulp)를 나타내고, D는 상아질(dentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
대조군에서는 손상된 상아질부위에 아무런 변화를 나타내지 않았다(도10 A-C). 그러나 그룹11(도10 D-F) 및 그룹12(도10 G-I)의 펩타이드를 처리한 군에서는 손상된 상아질에 존재하는 기존의 상아질 아래쪽 부위에서 기존상아질의 상아모세포돌기와 연속성을 나타내는 새로운 생리적 상아질(TD)이 형성되는 것이 관찰되었다.
또한, 도 11은 간접 치수 복조술 모델 중 깊은 와동 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 아무런 물질도 도포하지 않고 치과용 충전제인 GI cement(Glass Ionomer Cement, Fuji II LC, GC America Inc., Alsip, IL, USA)를 충전한 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 GI cement를 충전한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 노출된 상아질 부위의 상아세관 입구에 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 GI cement를 충전한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 100㎛, I 50㎛)이다. P는 치수(pulp)를 나타내고, D는 상아질(dentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
깊은 와동 모델에서도 얕은 와동 모델과 유사한 결과가 관찰 되었다. 손상된 상아질 부위에 치과용 충전 재료인 GI cement를 처리한 대조군에서는 아무런 변화를 나타내지 않았다(도11 A-C). 그러나 그룹11(도11 D-F) 및 그룹12(도11 G-I)의 펩타이드와 GI cement를 함께 처리한 군에서는 손상된 상아질에 존재하는 기존의 상아질 아래쪽 부위에서 기존상아질의 상아모세포돌기와 연속성을 나타내는 새로운 생리적 상아질(TD)이 형성되는 것이 관찰되었다.
실시예 6: 직접 치수 복조술 성견 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질) 형성에 미치는 영향
직접 치수 복조술 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질) 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상아질 재생능을 평가하고자 하였다.
구체적으로, 직접 치수 복조술을 이용하여 상아질 손상 성견모델을 확립하기 위하여 생후 12개월 성견의 소구치에서 치과용 버를 사용하여 치수가 밖으로 노출되도록 치경부의 법랑질과 상아질을 제거하였다. 상기 모델에 대조군, 그룹 11의 펩타이드 또는 그룹 12의 펩타이드를 각각 처리하는 실험을 진행 후 3주 후에 성견을 안락사하여 치아를 발치하였다.
상기 발치된 치아는 4% 파라포름알데히드에서 24시간 동안 고정한 다음 PBS(pH7.4)로 여러번 수세 후 10% 포름산(formic acid)을 이용하여 탈회시켰다. 탈회된 치아는 파라핀으로 포매하여 조직절편을 제작한다. 조직절편은 헤마톡실린/에오신(H&E)으로 염색하여 조직학적 분석을 통하여 상아질 재생 능을 평가하였다.
도 12는 직접 치수 복조술 모델에서 신규한 펩타이드가 생리적 상아질(삼차 상아질)형성에 미치는 영향을 조직학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 노출된 치수 부위에 아무런 물질도 도포하지 않고 GI cement를 처리한 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 노출된 치수 부위에 아무런 물질도 도포하지 않고 치과용 수복 재료인 MTA(Mineral trioxide aggregate, ProRoot MTA, Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, USA)로 밀봉후 GI cement로 덮어준 양성 대조군의 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이고;G 내지 I는 노출된 치수 부위에 그룹 11의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 MTA로 밀봉후 GI cement로 덮어준 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이며; J 내지 L는 노출된 치수 부위에 그룹 12의 펩타이드(1.5ug)를 도포하고 MTA로 밀봉후 GI cement로 덮어준 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다. D는 상아질(dentin)을 나타내고, OD는 골양상아질(osteodentin)을 나타내고, TD는 새롭게 형성된 생리적 상아질(newly formed tertiary dentin)을 나타낸다.
GI cement를 처리한 대조군에서는 손상된 상아질의 치수부위에 아무런 변화를 나타내지 않았다(도 12 A-C). MTA는 현재 상아질 형성 및 재생에 널리 쓰이고 있는 치과용 수복재료이다. 그러나 MTA에 의해 만들어지는 경조직은 세포가 석회화된 조직에 묻혀 있으며, 상아질의 중요한 구성요소인 상아세관이 관찰되지 않는 뼈와 유사한 골양상아질의 형태를 보인다고 알려져 있다. 본 결과에서도 MTA를 처리한 군에서는 노출된 치수의 위쪽과 아래쪽 부위에 남아있는 기존 상아질을 따라 세포가 석회화된 조직에 묻혀있는 골양상아질(OD)의 형태가 관찰 되었다(도12 D-F). 그러나, MTA와 함께 그룹 11 (도 12 G-I)과 그룹 12(도 12 J-L)의 펩타이드를 처리한 군에서는 노출된 치수의 위쪽과 아래쪽 부위에 남아있는 기존 상아질을 따라 기존상아질의 상아모세포돌기와 연속성을 나타내는 새로운 생리적 상아질(TD)이 형성되는 것이 관찰되었다.
상기 실시예의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시키고, 치수조직 세포와 함께 생체에 이식할 경우에는 상아모세포의 형성을 촉진하며, 특히 치근관 공간에 이식할 경우에는 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사조직으로 형성되는 것을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 사람의 자연 치아 상아질에서 볼 수 있는 것과 동일한 생리적인 상아질이 신규한 펩타이드에 의하여 형성됨을 나타냄을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아질질환 또는 치수질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이 연구는 2017년도 산업통상자원부 및 산업기술평가관리원(KEIT) 연구비 지원에 의한 연구임('10078369').

Claims (16)

  1. 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질질환 또는 치수질환 치료용 펩타이드:
    K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
    상기 일반식 1에서,
    R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
    R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
    R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
    R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
    R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 96 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단의 아세틸화, 아미드화, 메틸화; D-아미노산 도입; CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형; 백본 변형; 또는 측쇄 변형된 것인, 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 상기 펩타이드가 반복되어 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 상기 펩타이드에 상아질질환 또는 치수질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체를 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 상아질질환 또는 치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 및 괴저증인 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 의약외품 조성물은 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실 또는 구강용 연고제인 것인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품 조성물은 음료, 차류, 향신료, 껌류 또는 과자류의 제조에 사용되는 것인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질질환 또는 치수질환 예방 또는 치료 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법.
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