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WO2018185324A1 - Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées - Google Patents

Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées Download PDF

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Publication number
WO2018185324A1
WO2018185324A1 PCT/EP2018/058929 EP2018058929W WO2018185324A1 WO 2018185324 A1 WO2018185324 A1 WO 2018185324A1 EP 2018058929 W EP2018058929 W EP 2018058929W WO 2018185324 A1 WO2018185324 A1 WO 2018185324A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
treatment
secretome
bacterial
bacterium
cutaneous lesions
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2018/058929
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English (en)
Inventor
Nathalie Castex-Rizzi
Marie Florence GALLIANO
Hélène HERNANDEZ-PIGEON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Original Assignee
Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CN201880029816.3A priority patent/CN111630152B/zh
Priority to CA3059380A priority patent/CA3059380C/fr
Priority to AU2018248899A priority patent/AU2018248899B2/en
Priority to SG11201909144V priority patent/SG11201909144VA/en
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Priority to RU2019134658A priority patent/RU2794128C2/ru
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/36—Neisseria

Definitions

  • Bacterial secretonoma for use in the treatment of skin lesions is Bacterial secretonoma for use in the treatment of skin lesions
  • the present invention relates to a new use of a bacterial secretome in the field of the treatment of cutaneous lesions and more particularly of cicatrization.
  • the invention also relates to cosmetic or dermatological compositions comprising such a bacterial secretome as active agent.
  • Wound healing is a complex and dynamic biological process that involves the interaction of many local and systemic factors in normal tissue repair. There are three interdependent phases to healing progression: hemostasis and inflammation, proliferation and remodeling (Witte MB, Barbul A. Clin Clin North Am., 1997 Jun; 77 (3): 509). -28.). Proliferation involves three observable processes: granulation, contraction and re-epithelialization.
  • Macrophages are constantly releasing chemotactic factors and growth factors.
  • the fibroblasts construct the new cell matrix necessary for the growth of cells at the bottom of the wound. This scaffold promotes cell migration.
  • the endothelial cells trigger the formation of vascular buds that will form new capillaries, which will restore the perfusion and ensure the supply of oxygen and nutrients essential to the metabolic activity of cells in the wound.
  • the contraction of the wound is a mechanism for reducing the size of the wound and the fibroblasts play a leading role in this contraction.
  • Reepithelialization is the regeneration of an epidemic that covers a wound to reform an effective barrier against the external environment, capable of pigmentation and regain its sensory and immune functions. It therefore involves the cellular processes of migration and proliferation of keratinocytes, but also the differentiation of this neoepithelium and the restoration of a basement membrane that reconnects the dermis and the epidermis.
  • a wave of cellular mitosis occurs to fill the spaces left by the migration and provide cells for epithelial tissue in three-dimensional regeneration. .
  • the proliferation steps of keratinocyte cells, fibroblasts or endothelial cells can be considered as one of the functional phenomena testifying to the healing activity of an active ingredient.
  • An increase in the proliferation of fibroblasts would participate in the healing of a deep wound (damage to the dermis), whereas the increase in proliferation and / or migration of keratinocytes would participate in reepithelialization.
  • the Applicant has demonstrated the beneficial properties in the tissue regeneration and healing of cutaneous lesions of a bacterial secretome derived from a bacterial strain (or bacteria) LMB64 isolated from a water table.
  • This bacterium has been described by the Applicant in the patent application WO2012 / 085182. More particularly, the bacterium was described as such for its anti-inflammatory activities. Even more particularly, the extracts designated S0, E0 and ESO, respectively consisting of the culture supernatant separated from the biomass, the biomass of lysed cells, and the supernatant after incubation of the basic pH culture for several hours were described and exemplified. . Only the pharmacological activities of the EO and ESO extracts were tested and it was shown that these EO and ESO extracts had the ability to induce cytokines and Langerhans cell maturation (for EO) as well as TLR2 / TLR4 receptor activation.
  • a secretome consisting not of the same elements as the extracts ESO and EO mentioned above, but mainly constituted bio molecules secreted and extemalised in the culture supernatant by said bacterium LMB64, presents surprising healing properties.
  • the subject of the present invention is a bacterial secretome of a non-pathogenic Gram-negative bacterium belonging to the class Betaproteobacteria, subfamily Neisseriaceae, comprising a 16S rRNA comprising the sequence SEQ ID No. 1, or any sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID No. 1, for its use in the treatment of cutaneous lesions,
  • said secretome being obtainable or obtained by a process comprising the steps of: a) culturing said bacterium in a culture medium and conditions adapted to its growth,
  • the bacterial secretome for its use in the treatment of cutaneous lesions according to the invention is characterized in that a basic buffer is added to the liquid phase obtained in step b) and the buffered liquid phase obtained is optionally left in contact for 1 to 7 hours, preferably at a temperature of between 1 and 6 ° C.
  • the bacterium LMB64 has been characterized and defined as belonging to the class Beta-proteobacteria, subfamily of Neisseriaceae, and probably of a new genus not yet defined. Analysis of the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequence allowed us to locate this bacterium close to the genera Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia and Glubenkiana, with which it shares 95% sequence similarity.
  • rRNA 16S ribosomal RNA
  • This non-pathogenic bacterium is a Gram-negative bacterium that has been isolated from the water table.
  • the bacterium LMB64 is in the form of a rod with a length around 2.3 ⁇ (+/- 0.3) and a width around ⁇ , ⁇ (+/- 0, 1).
  • a peculiarity of this bacterium is the presence of a polar flagellum.
  • the gene coding for the 16S rRNA was almost completely sequenced (1487 bp, corresponding to the sequence SEQ ID No. 1).
  • the bacterium LMB64 has a circular plasmid of 10948 bp. This plasmid was completely sequenced and the sequence is represented in the sequence SEQ ID No. 2.
  • a bacterium from which the secretome according to the invention is derived comprises at least one plasmid comprising the sequence SEQ ID No. 2, or any sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID No. 2, advantageously at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97% and even more preferably at least 98% identity with the sequence SEQ ID No. 2.
  • a bacterium from which the secretome is derived is a non-pathogenic gram-negative bacterium belonging to the class Betaproteobacteria, subfamily of Neisseriaceae, said bacterium comprising a 16S rRNA comprising the sequence SEQ ID No.
  • such a bacterium is represented by the LMB64 strain which has been deposited in the name of the applicant at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM), Institut Pasteur, Paris, on April 8, 2010 under the reference I-4290. .
  • percent identity between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention, is meant a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment (optimal alignment), this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length.
  • sequence comparisons between two nucleic acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being possible by segment or by "comparison window”.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol.
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid sequence to be compared may comprise additions or deletions with respect to the reference sequence for alignment. optimal between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide is identical between the two sequences, dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result obtained by 100 to get the percentage of identity between these two sequences.
  • BLAST 2 sequences (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250) available on the site. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, The parameters used are those given by default (in particular for the parameters "open gap penalty”: 5, and “extension gap penalty”: 2 the matrix chosen is for example the matrix "BLOSUM 62" proposed by the program). The percentage of identity between the two sequences to be compared is calculated directly by the program. It is also possible to use other programs such as software "ALIGN” or “Megalign” (DNASTAR).
  • a bacterium according to the invention comprises the bacterium LMB64 which comprises at least one plasmid comprising the sequence SEQ ID No. 2, or any sequence exhibiting at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% identity. with said sequence SEQ ID No. 2.
  • Other features of said LMB64 bacterium will be detailed later in the examples.
  • the bacterium LMB64 was deposited in the name of the plaintiff at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, Paris, April 8, 2010 under the reference 1-4290.
  • the present invention also relates to another embodiment of a bacterial secretome for its use in the treatment of cutaneous lesions according to the second embodiment, characterized in that the basic buffer is selected from Tris buffer, Arginine buffer and mixtures thereof.
  • the invention relates to a bacterial secretome for its use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that step b) of liquid / solid separation is followed by a step b ') of clarifying the liquid phase or the liquid phase buffered by filtration before step c).
  • the invention relates to a bacterial secretome for its use in the treatment of cutaneous lesions according to the preceding embodiment, characterized in that the filtration is carried out with a threshold of 0.2 ⁇ .
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that said bio molecules consist of peptides, proteins and proteins. secondary metabolites secreted by said bacterium. It is also another embodiment of the present invention to provide a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that the bacterium comprises at least one plasmid comprising the sequence SEQ ID No. 2, or any sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the methods of previous embodiment, characterized in that the bacterium is the bacterium deposited at the CNCM April 8, 2010 under the reference 1-4920.
  • secretome is used to describe all the secreted bio-molecules excreted in the culture medium and solubilized in this medium, by a cell, a tissue or an organism.
  • secretome all the secreted and outsourced bio-molecules by the bacterium LMB64, without modification, alteration or lysis of the bacterial cell.
  • these biomolecules consist mainly of proteins, peptides and secondary metabolites secreted and externalized by the bacterium in the culture medium.
  • the bacteria multiply by binary fission, that is to say that each bacterium grows and then divides into two daughter cells separated by a septum of division formed by the cell wall. During division, the DNA is duplicated as are the other constituents.
  • Various enzymatic systems of synthesis and degradation participate in cell division.
  • Bacterial growth is the orderly growth of all components of the bacteria. It results in an increase in the number of bacteria. During the growth, there is, on the one hand, a depletion of the nutrient culture medium and, on the other hand, an enrichment in biomolecules secreted and excreted in the culture medium by the bacterium and solubilized in this medium. as well as by-products of metabolism.
  • culture medium or “medium” is meant any medium comprising at least the nutrients necessary for the growth and multiplication of bacteria.
  • the bacteria can be cultured in a liquid, solid or semi-liquid medium.
  • the culture medium is a liquid medium for recovering the culture supernatant containing the secretome.
  • An adequate culture medium contains nutrients that promote the growth and multiplication of bacteria.
  • a suitable culture medium may include water, a carbon source, a nitrogen source and salts.
  • a particular example of a culture medium is described below in the examples.
  • secondary metabolites it is necessary to understand the small molecules that a bacterium according to the invention, in particular the bacterium LMB64, produced, secreted and excreted in the culture medium.
  • such secondary metabolites may be soluble molecules such as bacteriocins, non-ribosomal peptides, siderophores, lipopeptides or polyketides or molecules such as terpenes, pyrazines, indoles or sulphide derivatives.
  • the proteins present in the secretome have sizes of between 10 Kd and 100 Kd, preferably between 18 Kd and 98 Kd, and preferably a majority protein whose size is approximately 38 kDa.
  • the secretome of a bacterium according to the invention for example and in particular the bacterium LMB64, can be obtained from a culture in a culture medium allowing the growth, development and multiplication of the bacterium ( as for example that described below) by simple recovery of the culture supernatant which contains the secreted biomolecules constituting the secretome according to the invention.
  • these biomolecules are secreted and externalized by the bacterium and solubilized in the medium, it is not necessary to perform a step of treating said bacteria (mechanical or chemical inducing lysis total or partial cells or protein release or components of the wall or membrane or the periplasmic space).
  • the recovery of the components of the culture supernatant (hereinafter the secretome) of the insoluble solid cell components can be by any liquid / solid separation means. More particularly, it is therefore possible, by the techniques known to those skilled in the art, to isolate the liquid fraction containing the solubilized bio molecules from the solid fraction containing predominantly whole cells, cell debris comprising surface proteins. and / or proteins located in the periplasmic space of the bacterium.
  • the liquid / solid separation can be carried out by a technique chosen from: centrifugation, sedimentation, filtration, ultrafiltration, decantation, dewatering for example.
  • the liquid / solid separation is carried out by centrifugation of the bacterial culture in order to separate, on one side, the solid phase, ie the pellet, containing cells and cellular debris and, on the other hand, the liquid phase, ie the supernatant, comprising the soluble molecules, i.e. the secretome.
  • the supernatant i.e. the liquid phase
  • the supernatant can be used as it is, or after simple filtration to rid it of any cell debris present and sterilize it. It can also be envisaged to concentrate it for example by diafiltration.
  • the proteins constituting the secretome may also be recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • the process for preparing a bacterial secretome according to the invention is characterized in that a basic buffer is added to the liquid phase obtained in step b) and that the buffered liquid phase obtained is optionally left in contact with such a buffer for 1 to 7 hours, in particular at a low temperature, preferably at a temperature of between 1 and 6 ° C.
  • This basic buffer is preferably a Tris buffer or an arginine buffer or a Tris-arginine mixture. Preferably it is a Tris-arginine buffer.
  • the amount of basic buffer, preferably Tris-arginine added to the liquid phase is such that the buffered liquid phase obtained has an arginine concentration of between 100 mM and 500 mM and / or a tris concentration of between 10 mM and 90 mM.
  • the pH of the buffered liquid phase may be between 8 and 12, and preferably between 9 and 11.
  • Tris, Arginine or Tris-arginine makes it possible to stabilize the proteins in solution and to avoid their aggregation over a long period of storage.
  • a preferred culture mode of the bacterium according to the invention may comprise three steps.
  • a first inoculum can be prepared in Erlenmeyer flask in a suitable medium containing mineral substances, protein and carbohydrates suitable for this preculture.
  • a second pre-fermentation culture in batch mode in a second medium near or identical to the first medium (or any equivalent medium) is then performed.
  • This buffered supernatant, or buffered liquid phase can then be clarified by filtration.
  • the liquid / solid separation step b) is followed by a step b ') of clarifying the liquid phase or the buffered liquid phase, for example by filtration, before step c).
  • the filtration may be carried out by any suitable means for clarification of the liquid phase, or buffered liquid phase where appropriate. Such clarification by filtration allows the removal of suspended particles that would not have been removed in the liquid / solid separation step and aims to obtain a clear secretome.
  • the filtration can be carried out by any means of filtration, ultrafiltration or diafiltration.
  • the filtration is carried out by filtration on a filter or filter cartridge having a threshold of 0.4 ⁇ , preferably 0.2 ⁇ .
  • the bacterial secretome is characterized in that the peptides, proteins and secreted secondary metabolites have a size less than or equal to 0.2 ⁇ .
  • electrostatically charged filters or prefilters can be used to avoid any absorption of the biomolecules responsible for all or part of the activity.
  • the invention also relates, in another embodiment, to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that the cutaneous lesions are chosen from the group including abrasions, burns, sunburns, scratches, cuts, scrapes, sutures.
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments for its use for the attenuation of healing defects.
  • the invention also relates, in another embodiment, to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that the cutaneous lesions are post-traumatic lesions, post -surgical, posterior to an act of dermatology, posterior to an act of aesthetic medicine.
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the preceding embodiments, characterized in that it is associated with a copper salt or a zinc salt.
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cutaneous lesions according to one of the methods of previous embodiment, characterized in that the treatment of skin lesions is the improvement of healing and skin repair.
  • the invention also provides a method of cosmetic treatment for attenuating skin healing defects, comprising the application of an effective amount of a composition comprising an effective amount of a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments in combination with a cosmetically suitable excipient and formulated in a form suitable for topical application.
  • the invention also relates to a bacterial secretome for use in the treatment of cicatricial defects according to one of the preceding embodiments, characterized in that it is associated with a copper salt and / or a salt. of Zinc.
  • the invention also aims in another embodiment, the use of a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments for the cosmetic treatment of attenuation of skin healing defects.
  • the secretome according to the invention is used in combination with a copper salt and / or a zinc salt.
  • the invention is directed to a dermatological composition
  • a dermatological composition comprising a bacterial secretome as defined in one of embodiments 1 to 9 and a dermatological excipient suitable for topical application.
  • the dermatological composition further comprises a zinc salt and / or a copper salt.
  • the invention also provides a dermatological composition according to one of the preceding embodiments for its use in the treatment of cutaneous lesions.
  • the dermatological composition further comprises a zinc salt and / or a copper salt.
  • the invention provides a cosmetic composition comprising a bacterial secretome as defined in one of the embodiments of the invention. and a cosmetic excipient suitable for topical application.
  • the cosmetic composition may further comprise a zinc salt and / or a copper salt.
  • the present invention provides a use of a cosmetic composition according to a previous embodiment for the cosmetic treatment of attenuation of cutaneous healing defects.
  • the subject of the invention is a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments, for a topical use intended to promote the proliferation of fibroblasts.
  • the subject of the invention is a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments, for a topical use intended to promote proliferation and / or migration of keratinocytes.
  • the subject of the invention is a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments, for a topical use intended to treat cutaneous lesions.
  • the subject of the invention is a bacterial secretome as defined in one of the preceding embodiments, for a topical use intended to improve cutaneous cicatrization and recovery.
  • compositions for accelerating cutaneous repair in order to restore the integrity and the quality of the skin comprising as active principle the secretome defined in one of the preceding embodiments.
  • the composition may further comprise a copper salt and / or a zinc salt.
  • the concentration of the secretome in a composition according to the invention is between 0.05% and 10%. More preferably, it is between 0.1% and 5%.
  • composition according to the invention further comprises one or more dermatologically and / or cosmetologically compatible excipients known to those skilled in the art in order to obtain a composition for topical application, such as emulsifiers, thickeners, gelling agents, water fixatives, leveling agents, stabilizers, colorants, perfumes and preservatives.
  • dermatologically and / or cosmetologically compatible excipients known to those skilled in the art in order to obtain a composition for topical application, such as emulsifiers, thickeners, gelling agents, water fixatives, leveling agents, stabilizers, colorants, perfumes and preservatives.
  • the term "dermatologically or cosmetically acceptable” is intended to mean that which is useful in the preparation of a dermatological or cosmetic composition, which is generally safe, non-toxic and neither bio-logical nor otherwise undesirable and which is acceptable for dermatological or cosmetic use, and in particular dermatological or dermo-cosmetic use, especially by topical application.
  • compositions according to the invention are advantageously intended for topical application, in particular on the skin.
  • composition according to the invention may be prepared in the form of an emulsion, a dispersion or an aqueous or oily lotion.
  • the dermatological or cosmetic composition according to the invention comprises at least one other active ingredient, more particularly at least one hydrating active ingredient.
  • This other active ingredient can thus be selected especially in the group comprising:
  • Anti-infectious agents trace elements like copper-zinc, honey
  • Moisturizing and nourishing agents glycerine, shea butter, natural waxes, hyaluronic acid, fatty acids
  • the second active ingredient will be a trace element copper-zinc type.
  • the composition of the invention will therefore comprise the secretome and copper-zinc type microelement.
  • a dermatological or cosmetic composition according to the invention comprising the secretome may comprise a copper salt or a salt of zinc.
  • the copper salt will be copper sulfate.
  • the zinc salt will be chosen from zinc oxide and zinc sulphate.
  • the amount of copper sulfate in a composition according to the invention may vary between 0.05 and 0.5% by weight of the composition, preferably between 0.1 and 0.25% by weight of the composition, more preferably still about 0.2% by weight. of the composition.
  • the amount of zinc sulphate in a composition according to the invention may vary between 0.05 and 0.5% by weight of the composition, preferably between 0.1 and 0.4% by weight of the composition, more particularly between 0.1 and 0.2% by weight. weight of the composition.
  • the amount of zinc oxide in a composition according to the invention may vary between 0.5 and 10%, by weight of the composition, preferably between 1 and 5%, by weight of the composition, more particularly about 2 to 4% by weight. of the composition.
  • compositions according to one of the preceding embodiments characterized in that it further comprises at least one other active ingredient chosen from the cicatrisants, the anti-infectives, moisturizing agents, soothing agents and mixtures thereof.
  • at least one other active ingredient will be chosen from hydrating agents, healing agents, soothing agents and mixtures thereof, preferably moisturizing agents.
  • Such an active ingredient will preferably be used in dermatological compositions.
  • the present invention also relates to a method for treating and healing skin lesions comprising administering, preferably topically, an effective amount of a composition comprising as active ingredient a secretome according to the invention.
  • compositions according to the invention are intended in particular for the care of skin having undergone lesions.
  • Skin lesions can occur as a result of trauma or as a result of medical or surgical procedures, invasive or non-invasive, curative or aesthetic.
  • invasive medical or surgical procedures may be mentioned: surgical procedures (exeresis, shavings) with or without suture, cryotherapy, ablative laser, medium or strong peels, suture, mesotherapy or curettage for example.
  • a non-invasive medical procedure requiring a superficial healing product that accelerates skin recovery include light peels, laser hair removal, superficial vascular treatments (rosacea), for example.
  • the treatment of lesions of the skin and mucous membranes according to the invention may in particular include the treatment of cuts, sutures, abrasions, scratches, scratches, scars post-surgery or post-act of cosmetic dermatology, superficial burns , sunburns.
  • the present invention further relates to the use of a cosmetic composition according to the invention for the improvement of scarring and skin repair and in particular for the attenuation of healing defects.
  • FIGURE 1 SDS-PAGE gel of secreto proteins.
  • Lane 1 (M, standard molecular weight markers, Sea Blue).
  • Lanes 2 to 5 (secret secret before addition of Arginine buffer) - deposits of 10 ⁇ , 15 ⁇ , 20 ⁇ and 30 ⁇ , respectively.
  • Lanes 6 to 9 (Sec + Arg, secretome after addition of Arginine buffer) - deposits of 10 ⁇ , 15 ⁇ , 20 ⁇ and 30 ⁇ , respectively.
  • preferred culture media contain ammonium chloride, magnesium sulfate and yeast extract.
  • other similar media can be used and should therefore be considered as an integral part of the present description. Any adaptation of the person skilled in the art must also be considered as part of the invention.
  • the LMB64 strain is cultured in three stages, namely a first inoculum, a preculture (or pre-fermentation) in batch mode and finally a culture but in fed-batch mode (addition of glucose).
  • Inoculum A tube of the WCB LMB64 is used to seed a
  • Preculture The prefermenter is then filled with approximately 16 L of medium then sterilized to full.
  • Two satellite bottles are connected to the pre-fermenter after sterilization of the tank then add blocks:
  • the preculture is started and then regulated automatically.
  • the following parameters may be mentioned: temperature, stirring speed, pressure, air flow, or even P0 2 .
  • the growth of the cells is followed by a measurement of the optical density at 620 nm.
  • the preculture is stopped by cooling when it reaches a sufficient density.
  • the culture is launched and then regulated automatically.
  • the following parameters can also be mentioned: Temperature, pH, agitation, pressure, air flow P0 2 .
  • the secretome is generally obtained after centrifugation of the result of the culturing step to remove cells, surface proteins and proteins located in the periplasmic space of the bacterium. This centrifugation step is followed by addition of a basic Tris-Arginine buffer to the supernatant. A last step of filtration of the supernatant is also possible. Any adaptation of the person skilled in the art must also be considered as part of the invention.
  • Centrifugation The transfer line from fermenter to centrifuge is sterilized. The fermentation must is then separated by continuous centrifugation on a centrifuge. The centrifugation is conducted at 150 L / h (+/- 30 L / h) with a bowl rotation speed of 10900 ⁇ 1000 rpm. The supernatant is recovered in a container equipped with a disposable pocket. The weight of the supernatant is measured on the balance plate.
  • Tris Arginine addition The Tris Arginine extraction buffer is sterilized and transferred to the disposable bag containing the culture supernatant. The required contact time is between 1 and 7 hours. The target concentration of Tris and arginine after addition to the single-use bag is around 0.3 M L-arginine and 20 mM Tris.
  • the total volume after addition of the extraction buffer is about 240 L.
  • the technique used is that of the incorporation of a thymidine-like nucleotide, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), into the DNA of S-phase cells at 37 ° C.
  • This technique makes it possible to quantify the cells whose advance in the cell cycle is characteristic of a proliferative cell (S phase or DNA synthesis).
  • the fibroblasts are inoculated into a 96-well plate and then incubated for 72 hours in the presence of the test compounds, the EGF as a positive control and the secretome at 0.4, 0.6 and 1%.
  • the incorporation of BrdU is carried out during the last 24 hours. BrdU incorporation is quantified using the BrdU ELISA kit (11647229001, Roche Diagnostic).
  • The% of the control is calculated according to the formula:
  • the stimulation in% is calculated according to the formula:
  • Average Stimulation in% (Mean (Value / Average Control) x 100) - 100
  • the positive control EGF stimulated strongly and significantly the proliferation of fibroblasts and reproducibly on the 3 donor pools (95% stimulation). This validates the experiments.
  • the results show that the secretome tested at 0.4%, 0.6% and 1% significantly stimulated the proliferation of normal human fibroblasts.
  • the studies were performed using the Oris Cell Migration Assay Cell Migration Kit (Platypus Technologies) according to the standard protocol recommended by the manufacturer. Mainly, the cells of the HaCaT line (human cell line of keratinocytes) are seeded in a 96-well plate Oris TM stoppers are removed and the compounds to be evaluated are added to the culture medium. Incubation is continued for 24 hours to allow cell migration. A cell-permeable fluorescent tracer, calcein is then added to allow visualization of the cells in the area delimited by the stoppers.
  • the HaCaT line human cell line of keratinocytes
  • Cell migration is assessed by imaging wells and measuring the migration area in mm 2 .
  • The% of the control is calculated according to the formula:
  • Average Stimulation in% (Mean (Value / Average Control) x 100) - 100
  • Cutaneous explants of pork ears are kept alive. 6mm biopsies are performed at the center of which a wound is formed of 3 mm circular. The wound affects the entire epidermis as well as the upper dermis. The products to be evaluated are applied topically. Forty-eight hours later, the biopsies are frozen and haemalun-eosin staining is performed on section. The kinetics of reepithelialization is evaluated according to the following method: 1) Assigning a defined score from 0 to 3 according to the protocol developed by J. Brandner (Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med).
  • the secretome was incorporated in 0.4%, 0.6% and 1% by weight in the same formulation base as that of a repair cream, reference (cream Cicalfate®) tested in parallel .
  • the evaluation of the reepithelialization is made by comparison with this reference cream.
  • the results show a dose effect with the secretome on the progression of the reepithelialization of the wound.
  • the morphological analysis of the tissues show an excellent tolerance of the formulations containing the secretome. The results are shown in Figure 4.
  • Cetearyl glucoside 0.1 - 1%
  • Cetearyl alcohol 0.9 - 4%
  • Vegetable oil 0.1-10%

Landscapes

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'un sécrétome bactérien dans le domaine du traitement des lésions cutanées et plus particulièrement de la cicatrisation. L'invention a également pour objet des compositions cosmétiques ou dermatologiques comprenant un tel sécrétome bactérien comme agent actif.

Description

Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'un sécrétome bactérien dans le domaine du traitement des lésions cutanées et plus particulièrement de la cicatrisation. L'invention a également pour objet des compositions cosmétiques ou dermatologiques comprenant un tel sécrétome bactérien comme agent actif.
ART ANTERIEUR
La cicatrisation des plaies est un processus biologique complexe et dynamique qui met en jeu l'interaction de nombreux facteurs locaux et systémiques dans la réparation normale des tissus. La progression de la cicatrisation comporte trois phases interdépendantes : l'hémostasie et l'inflammation, la prolifération et le remodelage (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 Jun; 77(3):509-28.). La prolifération implique trois processus bien observables : la granulation, la contraction et la réépithélialisation.
Au cours de la granulation, on observe la prolifération et la migration vers le lit de la plaie des cellules qui interviendront dans le reste du processus de réparation. Ainsi, on y retrouve des macrophages, des fïbroblastes et des cellules endothéliales. Les macrophages libèrent constamment des facteurs chimiotactiques et des facteurs de croissance. Les fïbroblastes construisent la nouvelle matrice cellulaire nécessaire à la croissance des cellules au fond de la plaie. Cet échafaudage favorise la migration cellulaire. Enfin, les cellules endothéliales déclenchent la formation de bourgeons vasculaires qui constitueront de nouveaux capillaires, ce qui permettra de rétablir la perfusion et d'assurer l'apport en oxygène et en nutriments essentiels à l'activité métabolique des cellules dans la plaie.
La contraction de la plaie est un mécanisme de réduction de la taille de la plaie et les fïbroblastes jouent un rôle de premier plan dans cette contraction. La réépithélialisation consiste en la régénération d'un épidémie qui recouvre une plaie pour reformer une barrière efficace contre l'environnement extérieur, capable de se pigmenter et de retrouver ses fonctions sensorielles et immunitaires. Elle implique donc les processus cellulaires de migration et de prolifération des kératinocytes, mais aussi la différenciation de ce néo-épithélium et la restauration d'une membrane basale qui reconnecte le derme et l'épiderme. Lorsque la migration des cellules basales en direction du centre de la plaie permet aux deux bords de la plaie de se rejoindre, une vague de mitose cellulaire se produit pour combler les espaces laissés par la migration et fournir des cellules pour le tissu épithélial en régénération tridimensionnelle.
Les étapes de prolifération des cellules kératinocytaires, de fïbroblastes ou de cellules endothéliales peuvent être considérées comme un des phénomènes fonctionnels témoignant de l'activité cicatrisante d'un actif. Une augmentation de la prolifération des fïbroblastes participerait à la cicatrisation d'une plaie profonde (atteinte du derme), alors que l'augmentation de la prolifération et/ou de la migration des kératinocytes participerait à la réépithélialisation.
La cicatrisation pose aussi des problèmes cosmétiques à partir du moment où des défauts de cicatrisation, ou une mauvaise cicatrisation pourront être responsables de marques visibles disgracieuses et quasi permanentes telles que de cicatrices épaisses ou chéloïdes.
Toutes les interventions chirurgicales, de médecine esthétique, de dermatologie ainsi que les lésions traumatiques non médicales (éraflures, coupures, égratignures, brûlures) ou pathologiques entraînent des cicatrices. L'une des principales compétences des chirurgiens plastiques est de contrôler la formation de cicatrices.
La pression est, par exemple, utilisée depuis de nombreuses années pour les cicatrices causées par des brûlures et elle a été plus récemment combinée à des feuilles de silicone posées directement sur la cicatrice.
Il existe toujours un besoin de proposer de nouvelles compositions pour favoriser la cicatrisation des peaux lésées ainsi que pour améliorer l'aspect esthétique des cicatrices.
Pour la première fois, et de manière surprenante, la demanderesse a mis en évidence les propriétés bénéfiques dans la régénération tissulaire et la cicatrisation des lésions cutanées d'un sécrétome bactérien issu d'une souche bactérienne (ou bactérie) LMB64 isolée à partir d'une nappe phréatique.
Cette bactérie a été décrite par la Demanderesse dans la demande de brevet WO2012/085182. Plus particulièrement, il était décrit la bactérie en tant que telle pour ses activités anti- inflammatoires. Encore plus particulièrement, il était décrit et exemplifïé les extraits dénommés S0, E0 et ESO, respectivement constitués du surnageant de culture séparé de la biomasse, de la biomasse de cellules lysées, et du surnageant après incubation de la culture à pH basique pendant plusieurs heures. Seules les activités pharmacologiques des extraits EO et ESO étaient testées et il était montré que ces extraits EO et ESO avaient la capacité d'induction des cytokines et de maturation des cellules de Langerhans (pour EO) ainsi que d'activation des récepteurs TLR2/TLR4/TLR5, antagonistes des récepteurs PARs et d'induction des peptides antimicrobiens (pour ESO). Ces résultats permettaient d'envisager l'utilisation de tels extraits dans le traitement de maladies inflammatoires comme le prurit, le psoriasis, l'eczéma ou encore la dermatite atopique.
Contre toute attente, la Demanderesse met ici en évidence qu'un sécrétome constitué non pas des mêmes éléments que les extraits ESO et EO mentionnés ci-dessus, mais constitué majoritairement des bio molécules sécrétées et extemalisées dans le surnageant de culture par ladite bactérie LMB64, présente des propriétés cicatrisantes surprenantes.
DESCRIPTION DETAILLEE Selon un premier mode de réalisation (1), la présente invention a pour objet un sécrétome bactérien d'une bactérie non-pathogène à Gram négatif appartenant à la classe des Betaproteobacteria, sous-famille des Neisseriaceae, comprenant un ARNr 16S comprenant la séquence SEQ ID No. 1 , ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 1, pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées,
ledit sécrétome étant susceptible d'être obtenu, ou obtenu, par un procédé comprenant les étapes de : - a) mise en culture de ladite bactérie dans un milieu de culture et des conditions adaptés à sa croissance,
- b) séparation liquide/solide et récupération de la phase liquide,
- c) obtention dudit sécrétome comprenant les bio molécules sécrétées par ladite bactérie dans la phase liquide.
Selon un second mode de réalisation de la présente invention, le sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'invention est caractérisé en ce qu'un tampon basique est ajouté à la phase liquide obtenue à l'étape b) et que la phase liquide tamponnée obtenue est optionnellement laissée en contact pendant 1 à 7 h, de préférence à une température comprise entre 1 et 6°C.
La bactérie LMB64 a été caractérisée et définie comme appartenant à la classe des Beta-proteobacteria, sous-famille des Neisseriaceae, et probablement d'un nouveau genre non encore défini. L'analyse de la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomique (ARNr) 16S a permis de situer cette bactérie proche des genres Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia et Glubenkiana, avec lesquels elle partage 95% de similarité de séquence.
Cette bactérie, non pathogène, est une bactérie à Gram négatif qui a été isolée à partir de la nappe phréatique.
Plus particulièrement, la bactérie LMB64 se présente sous la forme d'un bâtonnet d'une longueur aux alentours de 2,3μιη (+/- 0,3) et d'une largeur aux alentours de Ι,Ομιη (+/-0,1). Une particularité de cette bactérie est la présence d'un flagelle polaire.
Le gène codant pour l'ARNr 16S a été presque totalement séquencé (1487 pb, correspondant à la séquence SEQ ID No. 1). La bactérie LMB64 possède un plasmide circulaire de 10948 pb. Ce plasmide a été entièrement séquencé et la séquence est représentée en la séquence SEQ ID No. 2.
Selon une autre forme de réalisation, une bactérie dont est issu le sécrétome selon l'invention comprend au moins un plasmide comprenant la séquence SEQ ID No. 2, ou toute séquence présentant au moins 80%> d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2, de manière avantageuse au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, encore au moins 97% et plus préférentiellement encore au moins 98% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2. Aussi, une bactérie dont est issu le sécrétome est une bactérie non-pathogène à Gram négatif appartenant à la classe des Betaproteobacteria, sous-famille des Neisseriaceae, ladite bactérie comprenant un ARNr 16S comprenant la séquence SEQ ID No. 1, ou toute séquence présentant au moins 80%, encore au moins 90%>, au moins 95%o, au moins 97% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 1 et ladite bactérie comprenant au moins un plasmide comprenant la séquence SEQ ID No. 2, ou toute séquence présentant au moins 80%> d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2, de manière avantageuse au moins 85%, au moins 90%>, au moins 95%, encore au moins 97%o et plus préférentiellement encore au moins 98%> d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2.
A titre d'exemple une telle bactérie est représentée par la souche LMB64 qui a été déposée au nom de la demanderesse à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, le 8 avril 2010 sous la référence I- 4290.
Ayant ces informations génotypiques, associées aux caractéristiques de croissance en milieu non sulfuré, de la nature non filamenteuse de cette bactérie, un homme du métier n'aurait pas difficulté à trouver/identifier une autre bactérie permettant d'obtenir un sécrétome selon l'invention. Une telle identification d'une autre bactérie certes légèrement différente génotypiquement mais rassemblant les critères phénotypiques de l'invention quant au sécrétome peut être réalisée après un travail de sélection qui n'est en aucun cas insurmontable et ce sur la base des informations contenues dans la présente demande ainsi que celles contenues dans la demande WO2012/085182 associées aux connaissances générales de l'homme du métier. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison ». L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, « BLAST 2 séquences » (Tatusova et al, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucléotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, Les paramètres utilisés sont ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres « open gap penaltie » : 5, et « extension gap penaltie » : 2 ; la matrice choisie est par exemple la matrice « BLOSUM 62 » proposée par le programme). Le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer est calculé directement par le programme. Il est également possible d'utiliser d'autres programmes comme les logiciels « ALIGN » ou « Megalign » (DNASTAR).
Une bactérie selon l'invention comprend la bactérie LMB64 qui comprend au moins un plasmide comprenant la séquence SEQ ID No. 2, ou toute séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec ladite séquence SEQ ID No. 2. D'autres caractéristiques de ladite bactérie LMB64 seront détaillées plus loin dans les exemples. En outre, la bactérie LMB64 a été déposée au nom de la demanderesse à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, le 8 avril 2010 sous la référence 1-4290. La présente invention concerne aussi selon un autre mode de réalisation un sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon le second mode de réalisation, caractérisé en ce que le tampon basique est choisi parmi tampon Tris, tampon Arginine et leurs mélanges. Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise un sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que l'étape b) de séparation liquide/solide est suivie d'une étape b') de clarification de la phase liquide ou de la phase liquide tamponnée par filtration avant l'étape c).
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise un sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon le mode de réalisation précédent, caractérisé en ce que la filtration est réalisée avec un seuil de 0,2 μιη. Selon un autre mode de réalisation, l'invention vise aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que lesdites bio molécules consistent en les peptides, les protéines et les métabolites secondaires sécrétés par ladite bactérie. C'est aussi un autre mode de réalisation de la présente invention que de fournir un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que la bactérie comprend au moins un plasmide comprenant la séquence SEQ ID No. 2, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention vise aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que la bactérie est la bactérie déposée à la CNCM le 8 avril 2010 sous la référence 1-4920.
De manière générale, le terme « sécrétome » est utilisé pour décrire l'ensemble des bio molécules sécrétées et excrétées dans le milieu de culture et solubilisées dans ce milieu, par une cellule, un tissu ou un organisme. Dans le cas présent, il faut comprendre par sécrétome l'ensemble des bio molécules sécrétées et externalisées par la bactérie LMB64, et ce sans modification ni altération ni lyse de la cellule bactérienne. Plus particulièrement, ces biomolécules consistent principalement en les protéines, les peptides et les métabolites secondaires sécrétés et externalisés par la bactérie dans le milieu de culture.
Les bactéries se multiplient par fission binaire, c'est-à-dire que chaque bactérie grandit puis se divise en deux cellules filles séparées par un septum de division formé par la paroi cellulaire. Durant la division, l'ADN se duplique ainsi que les autres constituants. Divers systèmes enzymatiques de synthèse et de dégradation participent à la division cellulaire.
La croissance bactérienne est l'accroissement ordonné de tous les composants de la bactérie. Elle aboutit à l'augmentation du nombre de bactéries. Au cours de la croissance, il se produit, d'une part, un appauvrissement du milieu de culture en nutriments et, d'autre part, un enrichissement en biomolécules sécrétées et excrétées dans le milieu de culture par la bactérie et solubilisées dans ce milieu ainsi qu'en sous- produits du métabolisme.
Par l'expression « milieu de culture » ou « milieu », il faut comprendre tout milieu comprenant au moins les nutriments nécessaires pour la croissance et la multiplication des bactéries. Les bactéries peuvent être cultivées en milieu liquide, solide ou semi-liquide. De préférence, le milieu de culture est un milieu liquide permettant la récupération du surnageant de culture contenant le sécrétome.
Un milieu de culture adéquat contient des nutriments favorisants la croissance et la multiplication des bactéries. De manière générale, un milieu de culture convenable pourra comprendre de l'eau, une source de carbone, une source d'azote et des sels. A titre illustratif, un exemple particulier de milieu de culture est décrit plus bas dans les exemples. Par « métabolites secondaires », il faut comprendre les petites molécules qu'une bactérie selon l'invention, en particulier la bactérie LMB64, produit, secrète et excrète dans le milieu de culture. A titre illustratif, de tels métabolites secondaires peuvent être des molécules so lubies comme les bactériocines, les peptides non-ribosomaux, les sidérophores, les lipopeptides ou encore les polyketides ou des molécules comme les terpènes, les pyrazines, les indoles ou encore les dérivés sulfures. Les protéines présentes dans le sécrétome présentent des tailles comprises entre 10 Kd et 100 Kd, préférentiellement entre 18 Kd et 98 Kd, et de préférence une protéine majoritaire dont la taille est de 38 kDa environ.
En pratique, le sécrétome d'une bactérie selon l'invention, par exemple et en particulier la bactérie LMB64, peut être obtenu à partir d'une culture dans un milieu de culture permettant la croissance, le développement et la multiplication de la bactérie (comme par exemple celui décrit plus bas) par simple récupération du surnageant de culture qui contient les biomolécules sécrétées constitutives du sécrétome selon l'invention. Concrètement, du fait que ces biomolécules sont sécrétées et externalisées par la bactérie et solubilisées dans le milieu, il n'est pas nécessaire de réaliser une étape de traitement desdites bactéries (mécanique ou chimique induisant lyse totale ou partielle des cellules ou encore libération de protéines ou composants de la paroi ou de la membrane ou encore de l'espace périplasmique). La récupération des composants du surnageant de culture (ci-après le sécrétome) des composants cellulaires solides non solubles peut se faire par tout moyen de séparation liquide/solide. Plus particulièrement, il est donc possible, par les techniques connues par l'homme de l'art, d'isoler la fraction liquide contenant les bio molécules solubilisées de la fraction solide contenant majoritairement des cellules entières, des débris cellulaires comprenant des protéines de surface et/ou des protéines localisées dans l'espace périplasmique de la bactérie.
A titre illustratif, la séparation liquide/solide peut être réalisée par une technique choisie parmi : la centrifugation, la sédimentation, la fîltration, l'ultrafiltration, la décantation, l'égouttage par exemple. De manière préférée, la séparation liquide/solide est réalisée par centrifugation de la culture bactérienne afin de séparer, d'un côté la phase solide, i.e. le culot, contenant cellules et débris cellulaires et d'un autre côté la phase liquide, i.e. le surnageant, comprenant les molécules solubles, c'est-à-dire le sécrétome.
Le surnageant, i.e. la phase liquide, peut être utilisé tel quel, ou après simple fïltration pour le débarrasser des débris cellulaires éventuellement présents et le stériliser. Il peut aussi être envisagé de le concentrer par exemple par diafîltration. Les protéines constituant le sécrétome peuvent également être récupérées par précipitation au sulfate d'ammonium.
Comme indiqué plus avant, le procédé de préparation d'un sécrétome bactérien selon l'invention est caractérisé en ce qu'un tampon basique est ajouté à la phase liquide obtenue à l'étape b) et que la phase liquide tamponnée obtenue est optionnellement laissée en contact d'un tel tampon pendant 1 à 7 h, en particulier à basse température, de préférence à une température comprise entre 1 et 6°C.
L'ajout d'un tampon basique au surnageant permet d'améliorer la solubilité et/ou la stabilité des protéines et peptides en solution.
De manière préférée ce tampon basique est un tampon Tris ou un tampon arginine ou un mélange Tris-arginine. De préférence il s'agit d'un tampon Tris-arginine.
La quantité de tampon basique, préférentiellement Tris-arginine ajouté à la phase liquide est telle que la phase liquide tamponnée obtenue présente une concentration en arginine comprise entre 100 mM et 500 mM et/ou une concentration en Tris comprise entre 10 mM et 90 mM.
Le pH de la phase liquide tamponnée pourra être compris entre 8 et 12, et de préférence entre 9 et 11.
L'emploi d'un tampon basique (Tris, Arginine ou Tris-arginine) permet de stabiliser les protéines en solution et d'éviter leur agrégation sur une longue période de stockage.
Un mode préféré de culture de la bactérie selon l'invention, en particulier la souche LMB64, peut comprendre trois étapes. • Un premier inoculum peut être préparé en erlenmeyer dans un milieu adapté contenant substances minérales, protéiques et glucidiques convenables à cette préculture.
• Une seconde culture de pré- fermentation en mode batch dans un second milieu proche ou identique au premier milieu (ou tout milieu équivalent) est ensuite réalisée.
• Enfin, une fermentation en mode fed-batch dans un milieu identique ou proche du second milieu en vue d'obtenir une densité cellulaire élevée. Une étape de centrifugation permet ensuite l'élimination des cellules et débris cellulaires et la récupération du surnageant de culture.
Ce surnageant tamponné, ou phase liquide tamponnée, peut ensuite être clarifié par filtration.
Comme indiqué plus avant, l'étape b) de séparation liquide/solide est suivie d'une étape b') de clarification de la phase liquide ou de la phase liquide tamponnée, par exemple par filtration, avant l'étape c). La filtration pourra être réalisée par tout moyen adéquat permettant une clarification de la phase liquide, ou de la phase liquide tamponnée le cas échéant. Une telle clarification par filtration permet l'élimination des particules en suspension qui n'auraient pas été éliminées lors de l'étape de séparation liquide/solide et vise à obtenir un sécrétome limpide.
La filtration peut être réalisée par tout moyen de filtration, ultrafîltration ou diafîltration.
De manière avantageuse la filtration est effectuée par filtration sur filtre ou cartouche à filtre présentant un seuil de 0,4 μιη, préférentiellement 0,2 μιη. Dans ce cas, le sécrétome bactérien est caractérisé en ce que les peptides, protéines et métabolites secondaires sécrétés ont une taille inférieure ou égale à 0,2μιη. A titre préféré, il peut être utilisé des filtres ou préfîltres non chargés électrostatiquement afin d'éviter toute absorption des biomolécules responsables de tout ou partie de l'activité.
La nature exacte des milieux ainsi que des différentes étapes sera décrite plus en détails dans les exemples. Il faut comprendre que toute modification du procédé, des milieux, des enchaînements d'étapes qui parait évidente pour un homme du métier au regard de la présente description devra être considérée comme entrant dans le champ de la présente demande de brevet. Comme évoqué supra, l'invention concerne aussi dans un autre mode de réalisation, un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que les lésions cutanées sont choisies dans le groupe comprenant écorchures, brûlures, coups de soleil, égratignures, coupures, éraflures, sutures.
L'invention vise aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédent pour son utilisation pour l'atténuation de défauts de cicatrisation. L'invention concerne aussi, dans un autre mode de réalisation, un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce que les lésions cutanées sont des lésions post-traumatiques, post-chirurgicales, postérieures à un acte de dermatologie, postérieures à un acte de médecine esthétique.
De manière avantageuse, l'invention concerne aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce qu'il est associé à un sel de Cuivre ou un sel de Zinc. Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'un des modes de réalisation précédent, caractérisé en ce que le traitement des lésions cutanées consiste en l'amélioration de la cicatrisation et de la réparation cutanée.
L'invention vise encore dans un autre mode de réalisation, une méthode de traitement cosmétique d'atténuation des défauts de cicatrisation cutanée comprenant l'application d'une quantité efficace d'une composition comprenant une quantité efficace d'un sécrétome bactérien tel que défini dans l'un des modes de réalisation précédent en association avec un excipient cosmétiquement approprié et formulée sous une forme adaptée pour une application topique.
De manière avantageuse, l'invention concerne aussi un sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des défauts de cicratisation selon l'un des modes de réalisation précédents, caractérisé en ce qu'il est associé à un sel de Cuivre et/ou un sel de Zinc. Ainsi, l'invention vise encore dans un autre mode de réalisation, l'utilisation d'un sécrétome bactérien tel que défini dans l'un des modes de réalisation précédent pour le traitement cosmétique d'atténuation des défauts de cicatrisation cutanés. Selon un mode de réalisation particulier le sécrétome selon l'invention est utilisé en combinaison avec un sel de Cuivre et/ou un sel de Zinc.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise une composition dermatologique comprenant un sécrétome bactérien tel que défini dans l'un des modes de réalisation 1 à 9 et un excipient dermatologique approprié pour une application topique. Dans un mode de réalisation avantageux, la composition dermatologique comprend en outre un sel de Zinc et/ou un sel de Cuivre.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise encore une composition dermatologique selon l'un des modes de réalisation précédents pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées. Dans un mode de réalisation avantageux, la composition dermatologique comprend en outre un sel de Zinc et/ou un sel de Cuivre.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise une composition cosmétique comprenant un sécrétome bactérien tel que défini dans l'un des modes de réalisation précédents et un excipient cosmétique approprié pour une application topique. La composition cosmétique peut en outre comprendre un sel de Zinc et/ou un sel de Cuivre.
Enfin, dans un autre mode de réalisation, la présente invention vise une utilisation d'une composition cosmétique selon un mode de réalisation précédent pour le traitement cosmétique d'atténuation des défauts de cicatrisation cutanés.
Selon une forme d'exécution, l'invention a pour objet un sécrétome bactérien tel que défini dans un des modes de réalisation précédent, pour une utilisation topique destinée à favoriser la prolifération des fîbroblastes.
Selon une forme d'exécution, l'invention a pour objet un sécrétome bactérien tel que défini dans un des modes de réalisation précédents, pour une utilisation topique destinée à favoriser la prolifération et/ou la migration des kératinocytes.
Selon une forme d'exécution, l'invention a pour objet un sécrétome bactérien tel que défini dans un des modes de réalisation précédents, pour une utilisation topique destinée à traiter les lésions cutanées
Selon une forme d'exécution, l'invention a pour objet un sécrétome bactérien tel que défini dans un des modes de réalisation précédents, pour une utilisation topique destinée à améliorer la cicatrisation et la récupération cutanées.
Un autre objet de l'invention concerne une composition destinée à accélérer la réparation cutanée afin de rétablir l'intégrité et la qualité de la peau comprenant en tant que principe actif le sécrétome défini dans un des modes de réalisation précédents. De façon encore avantageuse, la composition peut comprendre en outre un sel de Cuivre et/ou un sel de Zinc.
De façon préférée, la concentration du sécrétome dans une composition selon l'invention est comprise entre 0,05% et 10 %. De façon plus préférée, elle est comprise entre 0,1% et 5%.
La composition selon l'invention comprend, en outre, un ou plusieurs excipients usuels dermatologiquement et/ou cosmétologiquement compatibles connus de l'homme de l'art en vue d'obtenir une composition pour l'application topique, tels que des émulsionnants, des épaississants, des gélifiants, des fixateurs d'eau, des agents d'étalement, des stabilisants, des colorants, des parfums et des conservateurs.
Dans la présente invention, on entend désigner par « dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition dermatologique ou cosmétique, qui est généralement sûr, non toxique et ni bio logiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation dermatologique ou cosmétique, et en particulier dermatologique ou dermo-cosmétique, notamment par application topique.
Les compositions selon l'invention sont avantageusement destinées à une application topique, en particulier sur la peau.
La composition selon l'invention peut être préparée sous la forme d'une émulsion, d'une dispersion, d'une lotion aqueuse ou huileuse.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition dermatologique ou cosmétique selon l'invention comprend au moins un autre principe actif, plus particulièrement au moins un actif hydratant.
Cet autre principe actif pourra ainsi notamment être sélectionné dans le groupe comprenant :
• Agents cicatrisants ou réparateurs bien connus : panthénol, madecassoside, allantoine, aloe vera, miel ;
• Agents anti infectieux : oligo éléments type cuivre-zinc, miel
• Agents hydratants et nourrissants : glycérine, beurre de karité, cires naturelles, acide hyaluronique, acides gras
• Agents apaisants : allantoine, bisabolol, panthénol, enoxolone
• Filtres UV.
De façon préférée, le deuxième principe actif sera un oligo-élément type cuivre- zinc. Dans ce mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprendra donc le sécrétome et Poligoélément type cuivre-zinc.
Comme évoqué, une composition dermatologique ou cosmétique selon l'invention comprenant le sécrétome pourra comprendre un sel de cuivre ou un sel de zinc. De manière préférée le sel de cuivre sera le sulfate de cuivre. De manière avantageuse le sel de Zinc sera choisi parmi l'oxyde de zinc et le sulfate de zinc.
La quantité de sulfate de cuivre dans une composition selon l'invention pourra varier entre entre 0.05 et 0.5% en poids de la composition, préférentiellement entre 0.1 et 0.25%), en poids de la composition, plus préférentiellement encore environ 0.2%> en poids de la composition.
La quantité de sulfate de zinc dans une composition selon l'invention pourra varier entre 0.05 et 0.5%, en poids de la composition, préférentiellement entre 0.1 et 0.4%), en poids de la composition, plus particulièrement entre 0.1 et 0.2%> en poids de la composition.
La quantité d'oxyde de zinc dans une composition selon l'invention pourra varier entre 0.5 et 10%, en poids de la composition, préférentiellement entre 1 et 5%, en poids de la composition, plus particulièrement environ 2 à 4% en poids de la composition.
Selon une forme d'exécution de l'invention, il est envisagé une composition selon l'un des modes de réalisation précédents caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un autre principe actif choisi parmi les cicatrisants, les anti-infectieux, les agents hydratants, les apaisants et leurs mélanges. Selon un autre mode de réalisation particulier, au moins un autre principe actif sera choisi parmi les agents hydratants, les agents cicatrisants, les agents apaisants et leurs mélanges, de préférence les agents hydratants. Un tel principe actif sera utilisé de préférence dans des compositions dermatologiques.
La présente invention concerne également une méthode pour traiter et cicatriser des lésions cutanées comprenant l'administration, de préférence topique, d'une quantité efficace d'une composition comprenant en tant que principe actif un sécrétome selon l'invention.
Les compositions selon l'invention sont destinées notamment aux soins des peaux ayant subi des lésions.
Des lésions cutanées peuvent apparaître à la suite de traumatismes ou à la suite d'actes médical ou chirurgical, invasif ou non invasif, curatif ou à visée esthétique. Comme actes médical ou chirurgical invasifs on peut citer : actes chirurgicaux (exérèses, shavings) avec ou sans suture, la cryothérapie, le laser ablatif, les peelings moyens ou forts, la suture, la mésothérapie ou encore le curetage par exemple.
Comme lésions cutanées post traumatiques, par exemple faisant suite à une altération extérieure légère de la peau, on peut citer les coupures, griffures, égratignures et les brûlures superficielles ou les coups de soleil par exemple.
Comme acte médical non invasif superficiel nécessitant un produit cicatrisant qui accélère la récupération cutanée, utilisable au long cours (jusqu'à réparation complète de la peau) on peut citer les peelings légers, les épilations au laser, les traitements vasculaires superficiels (couperose), par exemple.
Le traitement des lésions de la peau et des muqueuses selon l'invention pourra notamment comprendre le traitement des coupures, des sutures, des écorchures, des éraflures, des égratignures, des cicatrices post-chirurgie ou post-acte de dermatologie esthétique, des brûlures superficielles, des coups de soleil.
La présente invention porte, en outre, sur l'utilisation d'une composition cosmétique selon l'invention destinée à l'amélioration de la cicatrisation et de la réparation cutanée et en particulier pour l'atténuation des défauts de cicatrisation.
L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples ci-dessous l'illustrent sans en limiter la portée.
Les exemples font références aux figures suivantes
FIGURE 1 : Gel SDS-PAGE des protéines du Secrétome.
Piste 1 (M, marqueurs poids moléculaires standards, Sea Blue).
Pistes 2 à 5 : (Sec secrétome avant addition de tampon Arginine) - dépôts de 10 μΐ, 15 μΐ, 20 μΐ et 30 μΐ respectivement.
Pistes 6 à 9 : (Sec + Arg, secrétome après addition de tampon Arginine) - dépôts de 10 μΐ, 15 μΐ, 20 μΐ et 30 μΐ respectivement. FIGURE 2 : % stimulation de prolifération (moyenne ± sem) des fîbroblastes humains normaux traités avec les différents par comparaison aux cellules contrôle (n=3 pools de donneurs). FIGURE 3 : % stimulation (moyenne ± sem) de la migration de la lignée de kératinocytes HaCaT traités avec les différents composés par comparaison aux cellules contrôle (n=2).
FIGURE 4 : Réépithelialisation (moyenne ± sem) de la blessure après application pendant 48h sur des explants d'oreilles de porc des différents produits par comparaison à une crème réparatrice référente (n=10 donneurs indépendants).
Exemple 1 : Culture de la bactérie LMB64
A titre d'exemple non limitatif, des milieux de culture préférés contiennent du chlorure d'ammonium, du sulfate de magnésium et de l'extrait de levure. A noter également, comme cela ressort entre autres de la demande WO2012/085182, d'autres milieux similaires pourront être utilisés et doivent donc être considérés comme faisant partie intégrante de la présente description. Toute adaptation de l'Homme de l'Art doit également être considérée comme partie de l'invention.
Un exemple de procédé de culture est décrit ci-dessous. Il convient de rappeler ici que cet exemple n'a de valeur qu'illustrative et ne doit aucunement être considéré comme limitatif.
La souche LMB64 est cultivée en trois étapes, à savoir un premier inoculum, une préculture (ou préfermentation) en mode batch et enfin une culture mais en mode fed-batch (ajout de glucose). Inoculum : Un tube de la WCB LMB64 est utilisé pour ensemencer un
Erlenmeyer contenant 1000 mL de milieu stérile. L'erlenmeyer est ensuite placé dans le shaker incubateur sous agitation Lorsque la densité cellulaire du bouillon est suffisante, la culture est arrêtée. Les cellules sont alors mises en refroidissement jusqu'à transfert dans le préfermenteur.
Préculture : Le préfermenteur est ensuite rempli avec environ 16 L de milieu puis stérilisée à plein. Deux flacons satellites sont connectés sur le préfermenteur après stérilisation de la cuve puis des blocs d'ajout :
• un flacon contenant une solution stérile de glucose à 50%. Cette solution (Glucose batch préculture) est transférée immédiatement dans le milieu de culture pour atteindre la concentration initiale de glucose de 20 g/L
• L'erlenmeyer contenant l'inoculum décrit plus haut à l'étape Inoculum est ensemencé dans le préfermenteur.
La préculture est lancée puis régulée automatiquement. A titre d'exemple, il peut être mentionné les paramètres suivants : Température, Vitesse d'agitation, Pression, Débit d'air, ou encore P02 .
La croissance des cellules est suivie par une mesure de la densité optique à 620 nm. La préculture est arrêtée par refroidissement lorsqu'elle atteint une densité suffisante.
Culture : Le fermenteur est ensuite rempli avec 127 L de milieu ajusté à pH 7,0 puis stérilisé à plein. Trois flacons satellites sont utilisés :
• un flacon contenant une solution stérile de glucose. Cette solution est transférée immédiatement dans le milieu de culture pour atteindre la concentration initiale de glucose de 20 g/L.
• un flacon d'antimousse. Cet antimousse sera ajouté automatiquement pendant la culture pour contrôler le niveau de mousse dans la cuve.
• un flacon de glucose fedbatch. Cette solution sera ajoutée en cours de culture pour supporter la croissance des cellules.
La culture est lancée puis régulée automatiquement. A titre d'exemple, il peut également être mentionné les paramètres suivants : Température, pH, Agitation, Pression, débit d'air P02.
Après épuisement du glucose initialement présent dans le milieu (remontée de P02), l'ajout de la solution glucose fedbatch est déclenché et permet une croissance des cellules à haute densité La fermentation est arrêtée après consommation totale du glucose. A ce stade, le mout de fermentation est refroidi automatiquement. Tout au long de la culture, la croissance des cellules est suivie par une mesure de la densité optique à 620 nm. La quantité de biomasse sèche (g/L) obtenue en fin de culture est déterminée en utilisant une méthode pondérale. Exemple 2 : Extraction du sécrétome
L'exemple ci-dessous est donné à titre illustratif d'un mode de réalisation préféré, mais ne doit pas être considéré comme limitatif.
Le sécrétome est obtenu de manière générale après centrifugation du résultat de l'étape de culture afin d'éliminer les cellules, les protéines de surface et les protéines localisées dans l'espace périplasmique de la bactérie. Cette étape de centrifugation est suivie d'un ajout d'un tampon basique Tris-Arginine au surnageant. Une dernière étape de fïltration du surnageant est également possible. Toute adaptation de l'Homme de l'Art doit également être considérée comme partie de l'invention.
Centrifugation : La ligne de transfert du fermenteur à la centrifugeuse est stérilisée. Le moût de fermentation est ensuite séparé par centrifugation continue sur une centrifugeuse. La centrifugation est conduite à 150 L/h (+/-30 L/h) avec une vitesse de rotation du bol de 10900±1000 rpm. Le surnageant est récupéré dans un container équipé d'une poche à usage unique. Le poids du surnageant est mesuré sur le plateau balance.
Ajout Arginine : Le tampon d'extraction Tris Arginine est stérilisé puis transféré dans la poche à usage unique contenant le surnageant de culture. Le temps de contact nécessaire est compris entre 1 et 7 heures. La concentration cible en Tris et arginine après ajout dans la poche à usage unique est aux alentours de 0,3 M en L- arginine et 20 mM en Tris.
Le volume total après ajout du tampon d'extraction est d'environ 240 L.
Fïltration : Deux étapes de fïltration sont réalisées en ligne, afin de clarifier le surnageant et aboutir à un sécrétome clair exempt de germes. Le pilotage de la fïltration est réalisé grâce au système de fïltration/répartition. La cartouche de filtration en profondeur à usage unique est placée dans son carter de filtration. La totalité du produit filtré est récupéré stérilement dans un container équipé d'une poche à usage unique. La poche de produit filtré est pesée sur le plateau balance puis stockée à +5°C jusqu'à répartition.
Gel électrophorèse des protéines du secrétome : voir Figure 1
Gel SDS-PAGE (4 - 12%) Bis-Tris, dans des conditions dénaturantes et réduites, révélation au Bleu de Comassie des dépôts de différents volumes de surnageants de culture (10, 15, 20, 30 μΐ respectivement) avant et après ajout du tampon Arginine. On observe dans les 2 cas des différentes bandes de protéines de taille entre 14 et 100 Kda, dont une bande majeure environ à 38 Kda.
Exemple 3 : Effet du sécrétome sur la prolifération des fibroblastes humains normaux
La technique utilisée est celle de l'incorporation d'un nucléotide, la 5-bromo-2'- deoxyuridine (BrdU), analogue de la thymidine, dans l'ADN des cellules en phase S, à 37°C. Cette technique permet de quantifier les cellules dont l'avancée dans le cycle cellulaire est caractéristique d'une cellule proliférative (phase S ou de synthèse de l'ADN).
Les fibroblastes sont ensemencés en plaque de 96-puits puis incubés pendant 72h en présence des composés à tester, l'EGF comme contrôle positif et le sécrétome à 0,4, 0,6 et 1%. L'incorporation de BrdU est réalisée durant les dernières 24h. L'incorporation de BrdU est quantifiée à l'aide du kit ELISA BrdU (réf. 11647229001, Roche Diagnostic).
Le % du contrôle est calculé selon la formule :
(Valeur / moyenne du contrôle) x 100
La stimulation en % est calculée selon la formule :
Moyenne de Stimulation en % = (Moyenne (Valeur / moyenne du contrôle) x 100) - 100
SEM = standard dev / ^n Les analyses statistiques sont faites en utilisant le test de Student. Les études ont été réalisées sur 3 pools de donneur.
Le contrôle positif EGF, a stimulé fortement et signifïcativement la prolifération des fïbroblastes et de façon reproductible sur les 3 pools donneurs (95% de stimulation). Ceci valide les expérimentations. Les résultats montrent que le sécrétome testé à 0,4%, 0,6% et 1% a stimulé de façon significative la prolifération des fïbroblastes humains normaux. Le tableau 1 ci-dessous regroupe les résultats de l'incorporation de BrdU (moyenne ± sem) par les fïbroblastes humains normaux (par dosage ELISA) après 72h d'incubation en présence des composés testés (n=3 pools de donneurs). Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Tableau 1
Figure imgf000023_0001
Exemple 4 : Effet du sécrétome sur la migration de la lignée kératinocytaire HaCaT
Les études ont été réalisées à l'aide du Kit de migration cellulaire Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies) selon le protocole standard recommandé par le fabriquant. Principalement, les cellules de la lignée HaCaT (Lignée cellulaire Humaine de kératinocytes) sont ensemencées en plaque de 96-puits les stoppeurs Oris™ sont ôtés et les composés à évaluer sont ajoutés au milieu de culture. L'incubation se poursuit pendant 24 h pour permettre la migration des cellules. Un traceur fluorescent perméable aux cellules, la calcéine est alors ajoutée pour permettre la visualisation des cellules dans la zone délimitée par les stoppeurs.
La migration cellulaire est évaluée par la prise d'images des puits et mesure de la surface de migration en en mm2.
Le % du contrôle est calculé selon la formule :
(Valeur / moyenne du contrôle) x 100 La stimulation en % est calculée selon la formule :
Moyenne de Stimulation en % = (Moyenne (Valeur / moyenne du contrôle) x 100) - 100
SEM = standard dev / n
Les analyses statistiques sont faites en utilisant le test de Student.
Les études sont réalisées sur 6 répliquas techniques et en n=2 expériences indépendantes.
Les contrôles positifs, le TGF-b et le sérum de veau fœtal (FCS), ont stimulé fortement et significativement la migration des cellules et de façon reproductible (51 % et 176% de stimulation respectivement). Ceci valide les expérimentations. Les résultats montrent que le sécrétome testé à 0,4%>, 0,6%> et 1% a stimulé de façon significative la migration des kératinocytes HaCaT. Le tableau 2 ci-dessous regroupe les résultats de la migration des cellules HaCaT après 24 h d'incubation avec les différents composés (n=2). Les résultats sont illustrés par la Figure 3.
Tableau 2
Figure imgf000024_0001
Exemple 5 : Effet du sécrétome sur la fermeture de la plaie sur un modèle ex vivo de cicatrisation
Des explants cutanés d'oreilles de porc sont maintenus en survie. Des biopsies de 6mm sont réalisées au centre desquelles une plaie est formée de 3 mm circulaire. La plaie altère l'épiderme entier ainsi que le derme supérieur. Les produits à évaluer sont appliqués en topique. Quarante-huit heures après, les biopsies sont congelées et une coloration hémalun-éosine est réalisée sur coupe. La cinétique de réépithélialisation est évaluée selon le procédé suivant : 1) Attribution d'un score défini de 0 à 3 selon le protocole développé par J. Brandner (Pollok et al, 2010, J Cell Mol Med).
Mesure précise en μηι de l'étendue de la zone réépithélialisée à partir de la bordure de la plaie. Un test de Student est réalisé pour la signifïcativité.
2) L'aspect morphologique en bordure de la plaie est aussi évalué et permet de rendre compte de la qualité de la préservation du tissu.
Préparations des produits à appliquer : le sécrétome a été incorporé à 0,4%, 0,6%> et 1% en poids dans la même base de formulation que celle d'une crème réparatrice, référente (crème Cicalfate®) testée en parallèle. L'évaluation de la réépithélialisation est faite par comparaison à cette crème référente.
Les résultats montrent un effet dose avec le sécrétome sur la progression de la réépithélialisation de la blessure. La formulation contenant le sécrétome à 1% accélère signifîcativement la progression de fermeture de la blessure par rapport à la crème réparatrice référente (p=0,043). Par ailleurs, l'analyse morphologique des tissus montrent une excellente tolérance des formulations contenant le sécrétome. Les résultats sont représentés à la Figure 4.
Exemple de composition : émulsion huile dans eau
Sécrétome selon l'exemple 2 : 0,1-5%
Glycérine : 1-30%
Hexylène glycol : 0,1 - 7%
Cétéaryl glucoside : 0,1 - 1%
Cétéaryl alcool : 0,9 - 4%
Acide stéarique : 0,5-4%
Glycéryl stéarate : 0,1-4%
Huile végétale : 0,1-10%
Eau qsp 100%

Claims

REVENDICATIONS
Sécrétome bactérien d'une bactérie non-pathogène à Gram négatif appartenant à la classe des Betaproteobacteria, sous-famille des Neisseriaceae, comprenant un ARNr 16S comprenant la séquence SEQ ID No. 1 , ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 1, pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées,
ledit sécrétome étant obtenu par un procédé comprenant les étapes de :
- a) mise en culture de ladite bactérie dans un milieu de culture et des conditions adaptées à sa croissance,
- b) séparation liquide/solide et récupération de la phase liquide,
- c) obtention dudit sécrétome comprenant les bio molécules sécrétées par ladite bactérie dans la phase liquide.
Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un tampon basique est ajouté à la phase liquide obtenue à l'étape b) et que la phase liquide tamponnée obtenue est optionnellement laissée en contact pendant 1 à 7 h, de préférence à une température comprise entre 1 et 6°C.
Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tampon basique est choisi parmi tampon Tris, tampon Arginine est leurs mélanges.
Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape b) de séparation liquide/solide est suivie d'une étape b') de clarification de la phase liquide ou de la phase liquide tamponnée par fïltration avant l'étape c).
Sécrétome bactérien pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon la revendication 4, caractérisé en ce que la fïltration est réalisée avec un seuil de 0,2 μιη.
6. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites biomolécules consistent en les peptides, les protéines et les métabolites secondaires sécrétés par ladite bactérie.
7. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la bactérie comprend au moins un plasmide comprenant la séquence SEQ ID No. 2, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID No. 2.
8. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la bactérie est la bactérie déposée à la CNCM le 8 avril 2010 sous la référence 1-4920.
9. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les lésions cutanées sont choisies dans le groupe comprenant écorchures, brûlures, coups de soleil, égratignures, coupures, éraflures, sutures.
10. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les lésions cutanées sont des lésions post-traumatiques, post-chirurgicales, postérieures à un acte de dermatologie, postérieures à un acte de médecine esthétique.
11. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le traitement des lésions cutanées consiste en l'amélioration de la cicatrisation et de la réparation cutanée.
12. Sécrétome bactérien pour une utilisation dans le traitement des lésions cutanées selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il est associé à un sel de Cuivre et/ou un sel de Zinc.
13. Composition dermatologique comprenant un sécrétome bactérien tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 et un excipient dermatologique approprié pour une application topique, pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées.
14. Composition dermatologique comprenant un sécrétome bactérien tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8, un sel de Cuivre et/ou un sel de Zinc et un excipient dermatologique approprié.
15. Composition dermatologique selon la revendication 14, pour son utilisation dans le traitement des lésions cutanées.
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