WO2018170752A1 - 一种敲减 miRNA-29a 、 miRNA-148a 和 miRNA-424 的 Tud RNA 及其应用 - Google Patents
一种敲减 miRNA-29a 、 miRNA-148a 和 miRNA-424 的 Tud RNA 及其应用 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a Tud RN ⁇ application for knockdown of miRNA-29a, miRNA-148a and miRNA-424, and belongs to the field of genetic engineering technology.
- MicroRNAs are a class of endogenous non-coding RNAs found in eukaryotes, typically between 22 and 25 nt. miRNAs are widely distributed in plants, animals, and multicellular organisms, and are important. In the study of human miRNAs, it was found that the expression of miRNAs in normal tissues was significantly different. Some miRNAs were lowly expressed in tumor tissues and highly expressed in tumor tissues, indicating that miRNAs are involved in tumorigenesis. Has played a crucial role in the '
- the target gene which is involved in the regulation of target gene regulation 4 , affects the biological effects and development of tumor cells, plays a role similar to oncogenes, suppresses cancer, or promotes and inhibits tumor invasion and metastasis.
- miR-424 is a multifunctional miRr associated with cervical cancer, pancreatic cancer and other cell invasion and metastasis; with inflammatory factors such as IL-6, TNF-oc; since the miR-424 promoter region has a CpG island, it Methylation-induced gene silencing also controls the expression of miR-29a, miR-148a, and miR-424, and synergizes with other drugs.
- miR miRNA
- Tough Decoy RNA is a novel miRNA-inhibiting method for the adsorption of target miRNAs into double-stranded RNA to inhibit miRNAs. Since the bow I is double-stranded and has a secondary structure of a stem loop, it is resistant to intracellular nuclease degradation and stably and efficiently inhibits miRNA.
- the present invention provides a Tud RN nucleotide sequence which knocks down miRNA-29a, miRNA-148a and miRNA-424 as shown in SEQ ID NO: 1, mainly in inhibiting human miR-29a, miR-148a and n Application in the expression product.
- the present invention also provides a method for preparing a shRNA interference carrier, and the steps are as follows:
- the interference fragment obtained in the step (1) was ligated to the BamHI and Hindlll linearized vector to obtain a Tud RNA vector.
- the interference fragment obtained in the step (1) was ligated to the linearized nesil 1.0 plasmid vector via BamHI and Hindlll to obtain the Tud RNA vector p-Genesil-Tud-29a-148a-424.
- the preparation method of the RNA vector is used to inhibit the expression of human miR-29a, 11 11 -148 & and 1 ⁇ 1 -424 expression preparations.
- the effective interference fragment constructed and screened is Tud-29a-148a-424.
- the homology designed by the present invention interferes with the miR-29a, miR-148a and miR-424 TuD RNA sequence structures, which are not easily degraded, and the double-stranded Tud RNA is more efficient than the currently used single-stranded miRNA spons. And the same target for three targets, can better achieve the efficiency of the dry high-miRNA function of the three miRNAs.
- FIG. 1 miRNA expression levels of cells in each group, wherein a. miR-29a expression, b. miR-148a expression, c. miR-424 expression.
- the pGenesill.O vector was purchased from the Biovector Plasmid Vector Culture Cell Collection; Reverse Transcription -
- SYBR fluorescence real-time quantitative PCR kits were purchased from Takara Reagent Co., Ltd.; endotoxin plasmid ⁇ was purchased from Tiangen Biochemical.
- TuD RNA oligonuclear ⁇ ijTud targeting miR-29a, miR-148a and miR-424 was designed based on the tuD RNA design sequence and miR-29a, miR-148a and miR-4 column information provided in miRBase.
- -29a-148a-424, whose sequence ⁇ ij is shown in SEQ ID NO 1, was commissioned by Shanghai Biotech to be synthesized by gene.
- the Tud-29a-148a-424 sequence and p-Genesill.0 were separately treated with BamHI and Hindlll enzymes, and the fractions were recovered, ligated with T4 DNA ligase at 4 ° C overnight, and then transformed into competent E. coli ToplO colonies and cultured. Sended to Shanghai Shenggong for sequencing. The correctly sequenced p-Genesil- ⁇ 8a-424 vector was constructed. Extraction of p-Genesil-Tud-29a-148a-424 using the endotoxin plasmid extraction kit :
- HeLa cells were seeded in 6-well plates at 1000000 cells per well. After 18 h, the cell density was approximately transduced into Hela cells by jetPrime transfection reagent, p-Genesil-Tud-29a-148a-424 vector, ⁇ After that, the medium was changed to fresh DMEM complete medium, and then cultured for 24 h.
- the homology designed by the present invention interferes with the miR-29a, miR-148a and miR-424 TuD RNA sequences, and is not easily degraded.
- the double-stranded Tud RNA is more efficient than the commonly used single-stranded miRNA spons, and the same ⁇
- the efficiency of dry miRNA high miRNA function studies of three miRNAs can be well achieved.
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
提供了一种敲减miRNA-29a、miR-148a和miR-424的Tud RNA。所述Tud RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。还提供了一种抑制小RNA-29a、148a和424表达的Tud RNA干扰载体及其制备方法，包括根据经对比分析后的人源miR-29a、miR-148a和miR-424序列，合成带有BamHI和HindIII酶切位点的片段，并将该片段连接到经BamHI和HindIII线性化的质粒载体上，经筛选后获得所述干扰载体。
Description
发明名称：一种敲减 miRNA-29a、 miRNA-148a和 miRNA-424
RNA及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种敲减 miRNA-29a、 miRNA-148a和 miRNA-424的 Tud RN^ 应用， 属于基因工程技术领域。
背景技术
[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA 一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、 动物和多细胞生物中， 并 挥重要的调节作用， 而在人类 miRNA的研究中， 发现 miRNA在正常组织 组织中的表达有着显著差异， 有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达， 有 肿瘤组织中有高表达， 这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的'
[0003] miR-29a是一个与细胞增殖紧密相关的小分子 RNA， 参与多种疾病， 可 肿瘤中起到抑癌基因作用， 它与人胃癌和膀胱癌等细胞的生长和侵袭能 ， 其表达水平是评价胶质瘤良恶性的重要参考指标， 还与动脉粥样硬化 ff 化等疾病相关， 对多种肿瘤的治疗具有重要的潜在应用价值； miR-148a 年研究得较多的一种 micr0RNA。 据报道， miR-148a与外源性物质代谢、 ； 亡、 多种癌症的发生、 发展和表观遗传等都密切有关； miR-424是近年来 一个 miRNA, 其在多种肿瘤中通过作用于靶基因， 参与靶基因调控的信4 ， 从而影响肿瘤细胞生物学效应和发生发展， 发挥类似于癌基因、 抑癌 ¾ 作用， 或促进、 抑制肿瘤的侵袭转移。 有研究表明 miR-424是多功能 miRr 与宫颈癌， 胰腺癌等细胞侵袭转移相关； 与炎性因子如 IL-6、 TNF-oc的表 ； 由于 miR-424启动子区域具有 CpG岛， 它与甲基化诱导的基因沉默也相: 过控制 miR-29a、 miR- 148a和 miR-424的表达， 同吋与其他药物协同作用，
miR, miRNA
sponge等， 这些技术均属于瞬吋转染技术， 无法保持对目的 miRNA的长其 沉默， 沉默效果远未达到最优。
[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入 I 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能 稳定和高效地抑制 miRNA。
问题的解决方案
技术解决方案
[0006] 本发明提供一种敲减 miRNA-29a、 miRNA-148a和 miRNA-424的 Tud RN^ 核苷酸序列如 SEQ ID NO 1所示， 主要在抑制人源 miR-29a、 miR-148a和 n 表达制品中应用。
[0007] 本发明还提供了一种 shRNA干扰载体的制备方法， 步骤如下：
[0008] (1) 在 SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有 BamHI和 Hir 切位点， 获得 Tud RNA片段；
[0009] (2) 将步骤 （1) 中获得的干扰片段连接到经过 BamHI和 Hindlll线性化 载体上， 获得 Tud RNA载体。
[0010] 具体步骤如下：
[0011] (1) 在 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列两端加入合成带有 BamHI和 Hir 切位点， 获得 Tud RNA片段；
[0012] (2) 将步骤 （1) 中获得的干扰片段连接到经过 BamHI和 Hindlll线性化 nesil 1.0质粒载体上， 获得 Tud RNA载体 p-Genesil-Tud-29a-148a-424。
[0013] 本发明提供的 Tud
RNA载体的制备方法在抑制人源 miR-29a、 11 11 -148&和1^1 -424表达制品 c 用。
切位点的单链 Tud RNA片段， 复性成双链后， 连接到经过 BamHI和 Hindll 的 p-Genesill.O载体。 构建并筛选的有效干扰片段为 Tud-29a-148a-424。 发明的有益效果
有益效果
[0016] 本发明设计的同吋干扰 miR-29a、 miR-148a和 miR-424 TuD RNA序列带 ^ 结构， 不容易降解， 双链的 Tud RNA相对目前常用的单链的 miRNA spons 结合效率更高， 并且同吋针对三个靶点， 能较好地实现三个 miRNA的干主 高 miRNA功能研究的效率。
对附图的简要说明
附图说明
[0017] 图 1各组细胞的 miRNA表达水平情况， 其中， a. miR-29a的表达情况， b. miR- 148a的表达情况， c. miR-424的表达情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0018] 以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施 限于此。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下 ¾ 例中所用的试验材料， 如无特别说明， 均为购自市场。
[0019] pGenesill.O载体购自 Biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心； 反转录-
、 SYBR荧光实吋定量 PCR试剂盒均购自 Takara试剂公司； 去内毒素质粒 ί 剂盒购自天根生化。
[0020] SEQ ID NO 1： 5'-
[0022] 靶向 miR-29a、 miR-148a和 miR-424的 Tud RNA的设计与合成
[0023] 根据 TuD RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-29a、 miR-148a和 miR-4 列信息， 设计出同吋针对 miR-29a、 miR- 148a和 miR-424的 TuD RNA寡核 歹 ijTud-29a-148a-424， 其序歹 ij如 SEQ ID NO 1所示， 委托上海生工以基因 方式合成。
[0024] 实施例 2:
[0025] p-Genesil-Tud-29a-148a-424载体的构建
[0026] 用 BamHI和 Hindlll酶分别处理 Tud-29a-148a-424序列和 p-Genesill.0， 分 回收后， 用 T4 DNA连接酶 4°C连接过夜， 然后转化感受态大肠杆菌 ToplO 菌落培养并送至上海生工测序。 测序正确的即为成功构建的 p-Genesil-Τικ 8a-424载体。 用去内毒素质粒提取试剂盒提取 p-Genesil-Tud-29a- 148a-424:
[0027] 实施例 3:
[0028] p-Genesil-Tud-29a-148a-424载体转导 Hela细胞
[0029] 接种 Hela细胞于 6孔板中， 每孔 1000000个细胞， 18 h后细胞密度约为 用 jetPrime转染试剂将 p-Genesil-Tud-29a- 148a-424载体转导 Hela细胞中， β 后， 将培养基换成新鲜的 DMEM完全培养基， 然后继续培养 24 h。
[0030] 实施例 4:
[0031] miR-29a、 miR- 148a和 miR-424表达水平的检测
[0032] 取 Hela细胞和转导 p-Genesil-Tud-29a-148a-424载体的 Hela细胞， 用 miRci miRNA提取分离试剂盒提取这些细胞的 miRNA, 然后用 S-Poly(T) hsa-mil qPCR-assay primer set、 S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer set和 S-I hsa-miR-424 qPCR-assay primer set试剂盒 （均购自深圳盎然生物） 对 miRI 逆转录和加尾， 得到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA各 2
为模板， 荧光定量 PCR检测 miR-29a、 miR- 148a和 miR-424表达水平的 3 实验重复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord 44作为内参。 结果如图 1所示
工业实用性
本发明设计的同吋干扰 miR-29a、 miR- 148a和 miR-424 TuD RNA序列带 ^ 结构， 不容易降解， 双链的 Tud RNA相对目前常用的单链的 miRNA spons 结合效率更高， 并且同吋针对三个靶点， 能较好地实现三个 miRNA的干主 高 miRNA功能研究的效率。
Claims
(1)在 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列两端加入 BamHI和 Hindll: 点， 得到 Tud RNA片段；
(2)将步骤 (1)中获得的干扰片段连接到经过 BamHI和 Hindlll线† 质粒载体上， 获得干扰载体。
[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 具体步骤如下：
(1)在 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列两端加入 BamHI和 Hindlll 点， 得到 Tud RNA片段；
(2)将步骤 ( 1)中获得的 Tud RNA片段连接到经过 BamHI和 Hindi] 化的 p-Genesill.O质粒载体上， 获得干扰载体 p-Genesil-Tud-29a 24。
Priority Applications (1)
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| PCT/CN2017/077593 WO2018170752A1 (zh) | 2017-03-21 | 2017-03-21 | 一种敲减 miRNA-29a 、 miRNA-148a 和 miRNA-424 的 Tud RNA 及其应用 |
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Publications (1)
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| PCT/CN2017/077593 Ceased WO2018170752A1 (zh) | 2017-03-21 | 2017-03-21 | 一种敲减 miRNA-29a 、 miRNA-148a 和 miRNA-424 的 Tud RNA 及其应用 |
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-
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- 2017-03-21 WO PCT/CN2017/077593 patent/WO2018170752A1/zh not_active Ceased
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