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WO2017195505A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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WO2017195505A1
WO2017195505A1 PCT/JP2017/014139 JP2017014139W WO2017195505A1 WO 2017195505 A1 WO2017195505 A1 WO 2017195505A1 JP 2017014139 W JP2017014139 W JP 2017014139W WO 2017195505 A1 WO2017195505 A1 WO 2017195505A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
amino acid
acid sequence
seq
ketoacyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/014139
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English (en)
French (fr)
Inventor
三佳 寺井
彰人 川原
達郎 尾崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Priority to MYPI2018001845A priority Critical patent/MY186776A/en
Priority to US16/094,080 priority patent/US10995348B2/en
Publication of WO2017195505A1 publication Critical patent/WO2017195505A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01041—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I (2.3.1.41)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids.
  • the present invention also relates to a transformant used in the method.
  • Fatty acids are one of the main components of lipids, and constitute lipids (oils and fats) such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • surfactants are used as cleaning agents, disinfectants, and the like.
  • Cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary ammonium salts, which are derivatives of the same higher alcohol, are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used for bactericides and preservatives.
  • vegetable oils and fats are also used as raw materials for biodiesel fuel.
  • long chain fatty acids having 20 or more carbon atoms have different chemical properties depending on the degree of unsaturation, and are used in various applications.
  • long-chain polyunsaturated fatty acids such as EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid) are used as functional foods.
  • long-chain saturated fatty acids or long-chain monounsaturated fatty acids such as arachidic acid, behenic acid and erucic acid are useful as industrial raw materials such as dispersants and lubricating oils.
  • acyl-CoA and malonyl-ACP acyl-carrier-protein
  • acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms ( A complex composed of an acyl group, which is a fatty acid residue, and ACP, where the number of carbon atoms indicates the number of carbon atoms in the acyl group, and may be indicated in the same manner below).
  • KAS ⁇ -ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase
  • KAS III works at the initiation stage of the chain length extension reaction and extends acetyl-CoA having 2 carbon atoms to ⁇ -ketoacyl-ACP having 4 carbon atoms.
  • Subsequent elongation reactions involve KAS I, KAS II, and KAS IV.
  • KAS I is mainly involved in the elongation reaction up to 16 carbon atoms palmitoyl-ACP
  • KAS II is mainly involved in the elongation reaction up to 18 carbon atoms stearoyl-ACP.
  • KAS IV is said to be involved in the elongation reaction up to medium chain acyl-ACP having 6 to 14 carbon atoms.
  • Patent Document 1 discloses KAS II of an algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of algae.
  • Cyanobacteria (a cyanobacteria) is a group of eubacteria and has the ability to produce oxygen by photosynthesis and immobilize carbon dioxide.
  • Cyanobacteria are thought to be the origin of chloroplasts because they were symbiotic (primary symbiosis) in eukaryotes a billion billion years ago. Therefore, it is widely used in photosynthesis research as an ancestor of chloroplasts. Cyanobacteria grow faster than other plants and have high photosynthetic ability. In addition, cyanobacteria also have transformation ability. For this reason, cyanobacteria are attracting attention as a production host for substances such as biofuels because they can be used for microbiological substance production by introducing foreign DNA into cells.
  • Patent Document 2 Fatty acid production has been reported as an example of substance production using cyanobacteria (Patent Document 2 and Non-Patent Document 1). However, there are few reports on attempts to produce long-chain fatty acids having 20 or more carbon atoms using cyanobacteria.
  • a transformant in which expression of a gene encoding at least one of the following proteins (A) to (D) is promoted in a cyanobacterial cell is cultured, and the fatty acid or this is used as a constituent component.
  • the present invention relates to a lipid production method for producing lipid.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and having ⁇ -ketoacyl-ACP synthase activity (hereinafter also referred to as “KAS activity”).
  • KAS activity ⁇ -ketoacyl-ACP synthase activity
  • C The protein represented by SEQ ID NO: 44.
  • D A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (C) and having KAS activity.
  • the present invention also relates to a long-chain fatty acid produced in a cyanobacterial cell by promoting the expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) in the cell of the cyanobacteria or the same.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for improving lipid productivity, which improves the productivity of lipids comprising a component.
  • the expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) is promoted in a cyanobacterial cell, and a long-chain fatty acid produced in the cyanobacterial cell or
  • the present invention relates to a method for modifying the composition of lipids, which improves the productivity of lipids comprising this as a constituent and modifies the composition of fatty acids or lipids in the total fatty acids or total lipids produced.
  • the present invention also provides a long-chain fatty acid or a lipid-producing ability comprising this as a constituent, which promotes the expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) in cyanobacterial cells.
  • the present invention relates to a method for imparting cyanobacterium to cyanobacteria.
  • the present invention relates to a transformant in which expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) is promoted in cells of cyanobacteria.
  • the present invention relates to the provision of a method for producing a lipid using cyanobacteria, which improves the productivity of long-chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • the present invention also relates to the provision of a cyanobacterial transformant with improved productivity of long-chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • the present inventors paid attention to the aforementioned KAS of the algae belonging to the genus Nannochloropsis as an enzyme involved in the synthesis of long-chain fatty acids, and expressed the expression of the gene encoding KAS of the algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • cyanobacteria originally not capable of producing long-chain fatty acids acquire the ability to produce long-chain fatty acids.
  • productivity of a long-chain fatty acid improved compared with the case where the expression of the gene which codes KAS of the algae of the genus Nannochloropsis is not promoted.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the method for producing a lipid of the present invention it is possible to improve the productivity of a long-chain fatty acid or a lipid comprising the same. Moreover, the transformant of the present invention is excellent in productivity of long-chain fatty acids or lipids containing the same as a constituent component.
  • lipid refers to simple lipids such as neutral fats (such as triacylglycerol), waxes, and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids, and sulfolipids; and fatty acids derived from these lipids (Free fatty acids), derived lipids such as alcohols and hydrocarbons are included.
  • Fatty acids generally classified as derived lipids refer to the fatty acids themselves, meaning “free fatty acids”.
  • fatty acid residue a fatty acid moiety or an acyl group moiety in simple lipid and complex lipid molecules is referred to as “fatty acid residue”.
  • fatty acid is used as a general term for “free fatty acid” and “fatty acid residue”.
  • fatty acid or lipid containing this as a constituent is used generically as “free fatty acid” and “lipid having the fatty acid residue”.
  • the “fatty acid composition” means the weight ratio of each fatty acid to the total fatty acid (total fatty acid) obtained by adding the free fatty acid and the fatty acid residue. The weight (production amount) and fatty acid composition of the fatty acid can be measured by the methods used in the examples.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • stringent conditions include the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • composition of 1 ⁇ SSC 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0
  • SDS 0.5% SDS
  • 5 ⁇ Denhart 100 mg / mL herring sperm DNA
  • hybridization with the probe at 65 ° C. for 8 to 16 hours.
  • upstream of a gene refers to a region continuing on the 5 ′ side of a gene or region regarded as a target, not a position from the translation start point.
  • downstream indicates a region continuing 3 ′ side of the gene or region captured as a target.
  • the proteins (A) to (D) are a kind of KAS and are proteins involved in the synthesis of long-chain fatty acids.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is one of KAS derived from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis .
  • KAS is an enzyme involved in the control of acyl chain length in the fatty acid synthesis pathway.
  • Plant fatty acid synthesis pathways are generally located in the chloroplast.
  • acetyl-CoA is used as a starting material, and the carbon chain elongation reaction is repeated to finally synthesize acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms.
  • acyl-ACP thioesterase acts to hydrolyze the thioester bond of acyl-ACP to produce a free fatty acid.
  • TE acyl-ACP thioesterase
  • acetoacetyl ACP is produced by the condensation reaction of acetyl-CoA and malonyl ACP.
  • KAS activity means an activity of catalyzing the condensation reaction of acetyl-CoA or acyl-ACP with malonyl ACP.
  • the fact that a protein has KAS activity means that, for example, a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell lacking the fatty acid degradation system, and the introduced gene is expressed.
  • the cells can be cultured under such conditions, and changes in fatty acid composition in the host cells or in the culture medium can be confirmed by a conventional method.
  • KAS is classified as KAS I, KAS II, KAS III, or KAS IV depending on its substrate specificity.
  • KAS III uses acetyl-CoA having 2 carbon atoms as a substrate and catalyzes an extension reaction having 2 to 4 carbon atoms.
  • KAS I mainly catalyzes the elongation reaction of 4 to 16 carbon atoms to synthesize palmitoyl-ACP having 16 carbon atoms.
  • KAS II mainly synthesizes a long-chain acyl-ACP by catalyzing an extension reaction to a long-chain acyl group having 18 or more carbon atoms.
  • KAS IV mainly catalyzes the elongation reaction of 6 to 14 carbon atoms to synthesize medium chain acyl-ACP.
  • the productivity of long chain fatty acids having 20, 22, or 24 carbon atoms is improved.
  • the proteins (A) to (D) are KAS type KAS having a long-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity having 20 or more carbon atoms.
  • long-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity refers to an elongation reaction of synthesizing a long-chain acyl-ACP having 20 or more carbon atoms mainly using an acyl-ACP having 16 or more carbon atoms as a substrate. The activity to catalyze.
  • the “long chain” means that the acyl group has 20 or more carbon atoms, preferably 20, 22 or 24 carbon atoms.
  • Protein (A) is a chloroplast localized type KAS, and the amino acid 40 residue on the N-terminal side is considered to be a chloroplast translocation signal sequence.
  • a DNA linking a gene encoding a protein downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell deficient in the fatty acid degradation system.
  • the cells can be cultured under conditions that allow the expressed gene to be analyzed, and changes in fatty acid composition in the host cells or culture medium can be confirmed by conventional methods.
  • introducing a DNA linking a gene encoding a protein downstream of a promoter that functions in the host cell into the host cell and culturing the cell under conditions in which the introduced gene is expressed This can be confirmed by performing a chain extension reaction.
  • the protein (B) is composed of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and has KAS activity.
  • the protein (D) is composed of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (C) and has KAS activity.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced. Also in the present invention, a protein that retains KAS activity and is partially mutated in amino acid sequence can be used.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more. More preferably, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • the protein (B) one or more (for example, 1 to 190, preferably 1 to 166, more preferably 1 to 142, in the amino acid sequence of the protein (A) , More preferably 1 to 118, more preferably 1 to 95, more preferably 1 to 71, more preferably 1 to 47, and more preferably 1 to 38 More preferably 1 to 23, more preferably 1 to 9 and even more preferably 1 to 4 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • the protein (B) preferably comprises an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A), has KAS activity, and has a deleted chloroplast translocation signal sequence.
  • Such a protein (B) includes, as an amino acid sequence on the N-terminal side, an amino acid sequence in which an amino acid on the N-terminal side is deleted at any position from position 1 to position 40 of SEQ ID NO: 1, and an amino acid on the C-terminal side
  • the sequence may be a protein consisting of the amino acid sequence of positions 41 to 475 of SEQ ID NO: 1.
  • the protein (B) may be a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • the protein (C) consists of the amino acid sequence of positions 41 to 475 of SEQ ID NO: 1 and a methionine residue added to the N-terminal side thereof.
  • the protein (B) includes protein (C).
  • the N-terminal chloroplast translocation signal sequence (amino acid residues at positions 1 to 40 in SEQ ID NO: 1) has been deleted from the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (C) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more. More preferably, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • the protein (D) one or more (for example, 1 or more and 174 or less, preferably 1 or more and 152 or less, more preferably 1 or more and 130 or less) in the amino acid sequence of the protein (C) 1 or more, 108 or less, more preferably 1 or more and 87 or less, more preferably 1 or more and 65 or less, more preferably 1 or more and 43 or less, more preferably 1 or more and 34 or less. More preferably 1 to 21 or less, more preferably 1 to 8 or less, and still more preferably 1 or more and 4 or less) amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • the protein (D) may be a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (C) or (D).
  • Examples of a method for introducing a mutation into an amino acid sequence include a method for introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence.
  • Examples of the method for introducing mutation include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using SOE-PCR reaction, ODA method, Kunkel method and the like. You can also use commercially available kits such as Site-Directed Mutagesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) it can.
  • the target gene after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the proteins (A) to (D) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification or the like from Nannochloropsis oculata.
  • the proteins (A) to (D) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1.
  • the proteins (A) to (D) may be prepared as recombinant proteins by gene recombination techniques. When producing a recombinant protein, the ⁇ -ketoacyl-ACP synthase gene described later can be used.
  • Nannochloropsis oculata can be obtained from a preservation organization such as a private or public laboratory.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a gene encoding the protein (A) to (D) (hereinafter also referred to as “KAS gene”), a gene consisting of any one of the following DNA (a) to (d) (hereinafter referred to as “NoKASII gene”) ").
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • B A DNA encoding a protein having a KAS activity and having a nucleotide sequence having an identity of 60% or more with the nucleotide sequence of the DNA (a).
  • C DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KAS derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145).
  • the identity with the base sequence of the DNA (a) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more. More preferably, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • DNA (b) one or more (for example, 1 or more and 571 or less, preferably 1 or more and 499 or less, more preferably 1 or more and 428 or less) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, Preferably from 1 to 357, more preferably from 1 to 285, more preferably from 1 to 214, more preferably from 1 to 142, more preferably from 1 to 114, more Preferably 1 or more and 71 or less, more preferably 1 or more and 28 or less, and even more preferably 1 or more and 14 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and have KAS activity
  • a DNA encoding the protein (A) or (B) is also preferable.
  • the DNA (b) encodes the protein (A) or (B) which hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions and has KAS activity. DNA is also preferred.
  • the DNA (b) encodes the protein (A) or (B) having a KAS activity consisting of a base sequence having 60% or more identity with the base sequence of the DNA (a), and a chloroplast. It is preferable that the nucleotide sequence of the region encoding the transition signal sequence is deleted. As shown in Examples described later, the long-chain fatty acid productivity is further improved by deleting the N-terminal chloroplast transition signal sequence in the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA encoding such a protein includes a base sequence in which the base at the 5 ′ end is deleted at any position from position 1 to position 120 of SEQ ID NO: 2, as the base sequence at the 5 ′ end,
  • the terminal base sequence may be DNA consisting of the base sequence of positions 121 to 1428 of SEQ ID NO: 2.
  • the DNA (b) may be a DNA comprising a base sequence in which a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the base sequence of the DNA (a) or (b). Good.
  • the DNA (c) comprises the base sequence of positions 121 to 1428 of SEQ ID NO: 2 and the start codon (ATG) added to the 5 ′ end of the protein (C) (amino acid represented by SEQ ID NO: 44) A protein consisting of a sequence).
  • the DNA (b) includes DNA (c).
  • the base sequence encoding the chloroplast translocation signal sequence (base sequence from position 1 to position 120 of SEQ ID NO: 2) is deleted from the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Yes.
  • the identity with the base sequence of the DNA (c) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more. More preferably, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • a DNA encoding the protein (C) or (D) is also preferable.
  • the DNA (d) encodes the protein (C) or (D) that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (c) and has KAS activity. DNA is also preferred.
  • the DNA (d) may be a DNA comprising a base sequence in which a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the base sequence of the DNA (c) or (d). Good.
  • the method for promoting the expression of the KAS gene can be appropriately selected from conventional methods. Examples thereof include a method for introducing the KAS gene into cyanobacteria, and a method for modifying the expression regulatory region (promoter, terminator, etc.) of the gene in cyanobacteria having the KAS gene on the genome. Among them, a method of introducing the KAS gene into cyanobacteria and promoting the expression of the KAS gene is preferable.
  • a method of introducing the KAS gene into cyanobacteria and promoting the expression of the KAS gene is preferable.
  • one that promotes the expression of a gene encoding the target protein is also referred to as a “transformant”, and one that does not promote the expression of the gene encoding the target protein is referred to as “host” or “ Also referred to as “wild strain”.
  • the transformant used in the present invention compared to the host itself, is a product of long chain fatty acids and lipids comprising them (production amount of long chain fatty acids and lipids comprising them, total fatty acids produced or The ratio of long-chain fatty acids and lipids comprising these as constituents in lipids) tends to increase.
  • the fatty acid composition in the lipid is modified. Therefore, the present invention using the transformant is a lipid having a specific number of carbon atoms, particularly a long-chain fatty acid and a lipid comprising this as a constituent, preferably a fatty acid having 20 or more carbon atoms and a constituent thereof.
  • Lipids more preferably fatty acids having 20 to 24 carbon atoms and lipids comprising them, more preferably fatty acids having 20, 22 or 24 carbon atoms and lipids comprising these, more preferably carbon atoms 20, 22 or 24 saturated fatty acid, monovalent unsaturated fatty acid, or divalent unsaturated fatty acid, and lipids comprising this, more preferably 20, 22 or 24 saturated fatty acid or monovalent unsaturated It can be suitably used for the production of fatty acids and lipids comprising them.
  • the productivity of fatty acids and lipids in the host and transformant can be measured by the method used in the examples.
  • the KAS gene can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • the KAS gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • services such as Invitrogen can be used.
  • It can also be obtained by cloning from Nannochloropsis oculata.
  • it can be carried out by the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)].
  • Nannochloropsis oculata NIES-2145 used in the examples can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing the KAS gene into cyanobacteria by a conventional method. Specifically, a recombinant vector or gene expression cassette capable of expressing the KAS gene in cyanobacterial cells is prepared, and introduced into the cyanobacterial cells to transform host cells. Can be made.
  • the cyanobacteria used as the host of the transformant of the present invention is a group of prokaryotes that perform photosynthesis using chlorophyll. Cyanobacteria are rich in diversity, even looking at only the shape of the cell, Synechocystis sp (Synechocystis sp.) PCC6803 those unicellular such as, Anabaena sp performing forming a Heteroshisuto nitrogen fixation (Anabaena sp .) There are filamentous ones in which many cells are connected like a string like PCC7120, or those that are spiral or branched.
  • the growth environment is also thermophilic, such as Thermosynechococcus elongatus BP-1, isolated from Beppu hot spring, Synechococcus sp. ( Synechococcus sp.) CC9311 Species adapted to various conditions such as Synechococcus sp. WH8102 inhabiting the open ocean can be seen.
  • thermophilic such as Thermosynechococcus elongatus BP-1, isolated from Beppu hot spring, Synechococcus sp. ( Synechococcus sp.) CC9311 Species adapted to various conditions such as Synechococcus sp. WH8102 inhabiting the open ocean can be seen.
  • gas vesicles such as Microcystis aeruginosa, and phycobilisomes that do not have thylakoids and are collecting antennas.
  • cyanobacteria carbon dioxide fixed by photosynthesis is converted to acetyl-CoA through a number of enzymatic reaction processes.
  • the first step in fatty acid synthesis is the synthesis of malonyl-CoA from acetyl-CoA and CO 2 by the action of acetyl-CoA carboxylase.
  • malonyl-CoA is converted to malonyl-ACP by the action of malonyl CoA: ACP transacylase.
  • acyl-ACP having two carbon increments is synthesized, and used as a synthetic intermediate for membrane lipids, etc.
  • cyanobacteria Any kind of cyanobacteria can be used as the host of the transformant of the present invention.
  • Synechocystis Synechocystis
  • Synechococcus Synechococcus
  • Thermo Synechococcus Thermosynechococcus
  • Torikodesumiumu Trichodesmium
  • Akari Ok Loris Acaryochloris
  • Kurokosufaera Crocosphaera
  • Anabaena Anabaena ) genus cyanobacteria.
  • cyanobacteria belonging to the genus Synecocystis, Synechococcus, Thermocinecococcus or Anavena are preferable, and cyanobacteria belonging to the genus Synecocystis or Synecococcus are more preferable.
  • the host used in the present invention includes Synecocystis sp. PCC6803, Synecocystis sp. PCC7509, Synecocystis sp. PCC6714, Synechococcus elongatus sp.
  • Trichodesmium erythraeum IMS101 Trichodesmium erythraeum IMS101, Acaryochloris mariana MBIC11017, Crocosphaera watsonii WH8501, and Anabaena sp. Synecococcus elongata sp. PCC7942 is more preferred.
  • a gene capable of introducing a gene encoding a target protein into a host and expressing the gene in a host cell I just need it.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • pUC vectors (Takara Bio), pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pSTV vectors (Takara Bio), pET Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), pGEX system vector (manufactured by GE Healthcare Inc.), pCold series vector (produced by Takara Bio Inc.), pHY300PLK (manufactured by Takara Bio Inc.), pUB110 (Plasmid, 1986, vol.
  • pUC vectors are more preferred.
  • promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated in the expression vector
  • Promoters that can be preferably used in the present invention can be induced by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Promoters related to various derivatives the Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), c-phycocyanin ⁇ subunit (cpcB), and the promoter of the rrnA operon gene encoding ribosomal RNA .
  • rbc the Rubisco operon
  • psaAB PSI reaction center protein
  • psbA PSII D1 protein
  • cpcB c-phycocyanin ⁇ subunit
  • promoter of the rrnA operon gene encoding ribosomal RNA .
  • trc promoter and cpc promoter are more preferable.
  • the type of selectable marker for confirming that the target DNA fragment has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include drug resistance genes such as chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, and gentamicin resistance gene. . Furthermore, a gene deficiency associated with auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
  • Introduction of a gene encoding the target protein into the vector can be performed by a conventional method such as restriction enzyme treatment or ligation.
  • the heterologous gene introduced into cyanobacteria is optimized for codons in accordance with the codon usage frequency in cyanobacteria. Information on codons used by various organisms is available from the Codon Usage Database (www.kazusa.or.jp/codon/).
  • the transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. Examples of transformation methods include natural transformation methods, electroporation methods, and conjugation methods.
  • the KAS gene introduced into cyanobacteria is preferably integrated into the genome of cyanobacteria by homologous recombination or the like.
  • the position at which the KAS gene is integrated into the genome can be appropriately set.
  • the KAS gene is preferably integrated in a slr0168 region or a neutral site such as NS1 region on the genome of cyanobacteria.
  • the transformant of the present invention has the ability to produce long-chain fatty acids that are not originally possessed by cyanobacteria or lipids comprising this as a constituent.
  • the productivity is improved as compared with a host in which expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) is not promoted. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the long-chain fatty acid or a lipid containing this as a constituent component is recovered from the obtained culture or growth product, the long-chain fatty acid or the constituent component thereof is recovered.
  • culture refers to the culture solution and transformant after culturing
  • “growth” refers to the transformant after growth.
  • the transformant of the present invention was cultured in BG-11 medium (J. Gen. Microbiol., 1979, vol. 111, p. 1-61), A medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, p. 6052-6056), AA medium (Plant Physiol., 1955, vol. 30, p. 366-372), etc. It can be implemented by law.
  • the culture period for lipid production may be such that fatty acid accumulates at a high concentration under conditions where the cells have sufficiently grown, for example, 7 to 45 days, preferably 7 to 30 days, more preferably 10 It is preferable to perform aeration stirring culture or shaking culture for -14 days.
  • the method for collecting lipid from the culture or growth can be appropriately selected from conventional methods.
  • lipid components can be isolated from the aforementioned culture or growth by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. Can be separated and recovered.
  • oil is recovered from the culture or growth by pressing or extraction, and then general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. is performed to obtain lipids. be able to.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the lipid produced in the production method of the present invention comprises a polar lipid which is a kind of glycerin ester of fatty acid.
  • polar lipids include monogalactosyl diacylglycerol (MGDG), digalactosyl diacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG), phosphatidylglycerol (PG), and the like.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a long-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 20 or more carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, from the viewpoint of use as an industrial raw material such as a dispersant.
  • a fatty acid having 20 to 24 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, a fatty acid having 20 to 22 or 24 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, a saturated fatty acid having 20, 22, or 24 carbon atoms, A monovalent unsaturated fatty acid, a divalent unsaturated fatty acid, or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, and a saturated fatty acid having 20, 20, or 24 carbon atoms, a monovalent unsaturated fatty acid, or a fatty acid ester compound thereof is more preferable. .
  • the lipid obtained according to the present invention can be used as an edible material, as a plasticizer, an emulsifier such as cosmetics, a detergent such as soap or detergent, a fiber treatment agent, a hair rinse agent, or a bactericide or preservative.
  • the present invention further discloses the following lipid production method, lipid productivity improvement method, method for modifying the composition of fatty acid produced, transformant, and transformant production method.
  • ⁇ 1> Fatty acid or lipid comprising the same as a component obtained by culturing a transformant in which the expression of a gene encoding at least one of the following proteins (A) to (D) is promoted in cells of cyanobacteria To produce lipids.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • (B) 60% or more of identity with the amino acid sequence of the protein (A), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and a protein having KAS activity .
  • (C) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (C) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and a protein having KAS activity .
  • ⁇ 2> A long-chain fatty acid produced in a cyanobacterial cell by promoting the expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) in the cell of the cyanobacteria or a composition thereof
  • a method for improving lipid productivity, which improves the productivity of lipid as a component Fatty acids produced in cyanobacterial cells or their constituents by promoting the expression of the gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) in the cells of cyanobacteria
  • a method for modifying a fatty acid composition wherein the composition of a fatty acid of a lipid as a component is modified.
  • ⁇ 4> The method according to ⁇ 3>, wherein the proportion of long-chain fatty acids in the total fatty acids produced is increased.
  • Long-chain fatty acids that promote the expression of a gene that encodes at least one of the proteins (A) to (D) in the cells of cyanobacteria or lipids that contain them as a constituent component are cyanogenic. A method of giving to bacteria.
  • a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) is introduced into a neutral site on a cyanobacteria, preferably a cyanobacteria genome, to promote expression of the gene, The method according to any one of 1> to ⁇ 5>.
  • the protein (B) has one or more, preferably 1 to 190, more preferably 1 to 166, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (A).
  • the protein (D) has one or more, preferably 1 or more and 174 or less, more preferably 1 or more and 152 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (C).
  • (B) 60% or more of identity with the base sequence of DNA (a), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and a protein having KAS activity DNA encoding (C) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45.
  • the identity with the base sequence of the DNA (c) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and a protein having KAS activity DNA encoding ⁇ 11>
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 or more and 571 or less, preferably 1 or more and 499 or less, more preferably 1 or more and 428, in the base sequence of the DNA (a).
  • the DNA (d) has one or more, preferably 1 or more and 523 or less, preferably 1 or more and 457 or less, more preferably 1 or more and 392 in the base sequence of the DNA (c).
  • Soybean and a DNA encoding the protein (C) or (D) with KAS activity, the method of the ⁇ 10> above, wherein.
  • the cyanobacteria are selected from the group consisting of Synechocystis, Synecococcus, Thermocinecococcus, Trichodesmium, Acariochloris, Crocosphaela, and Anavena, preferably Synecocystis
  • the lipid is a long chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 20 or more carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 20 to 24 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably.
  • ⁇ 15> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein the cyanobacteria are cultured using a BG-11 medium.
  • ⁇ 16> A transformant in which expression of a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) is promoted in cyanobacterial cells.
  • ⁇ 17> A transformant obtained by introducing a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) or a recombinant vector containing the gene into cyanobacteria.
  • ⁇ 18> A method for producing a transformant, wherein a gene encoding at least one of the proteins (A) to (D) or a recombinant vector containing the gene is introduced into cyanobacteria.
  • the cyanobacteria are selected from the group consisting of Synechocystis, Synecococcus, Thermocinecococcus, Trichodesmium, Acariochloris, Crocosphaela, and Anavena, preferably Synecocystis
  • the lipid is a long-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 20 or more carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 20 to 24 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably.
  • a fatty acid compound having 20, 20, or 24 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof more preferably a saturated fatty acid having 20, 20, or 24 carbon atoms, a monovalent unsaturated fatty acid, a divalent unsaturated fatty acid, or a fatty acid thereof.
  • Preparation Example 1 Preparation of transformant by introducing NoKASII gene into cyanobacteria (1) Construction of kanamycin resistance gene expression plasmid Primer pUC118 described in Table 1 using the genomic DNA of the wild strain of Synechocystis sp. PCC6803 as a template The upstream fragment of the neutral site slr0168 region (slr0168up fragment: SEQ ID NO: 5) was amplified using / slr0168up-F (SEQ ID NO: 3) and the primer Kmr / slr0168up-R (SEQ ID NO: 4).
  • the slr0168up fragment, slr0168down fragment, and Kmr fragment described above were inserted into the Hin cII site of pUC118 plasmid (Takara Bio Inc.) using the In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and pUC118-slr0168 :: The Km plasmid was obtained.
  • PCC6803 using the primer slr0168up / Pcpc560-F (SEQ ID NO: 13) and primer Pcpc560-R (SEQ ID NO: 14) described in Table 1, a highly expressed cpc560 promoter fragment ( Scientific Reports, 2014, vol. 4, p. 4500, Pcpc560 fragment: SEQ ID NO: 15) was amplified. Also, PCR was performed from the wild-type genomic DNA of Synechocystis sp.
  • PCC6803 strain using the primers Trbc-F (SEQ ID NO: 16) and Km / Trbc-R (SEQ ID NO: 17) described in Table 1, and the terminator region of the rbc gene (Trbc fragment: SEQ ID NO: 18) was amplified. Furthermore, using a cDNA library prepared from Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 as a template, primer Pcpc560 / NoKASII-F (SEQ ID NO: 19) and primer Trbc / NoKASII-R (SEQ ID NO: 20) shown in Table 1 were used. PCR was performed to amplify the NoKASII fragment (SEQ ID NO: 2).
  • Synechocystis sp. PCC6803 strain by mixing the linearized pUC118-slr0168 :: Km plasmid, Pcpc560 fragment, Trbc fragment and NoKASII fragment and using the In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech).
  • the pUC118-slr0168 :: Pcpc560-NoKASII-Trbc-Km plasmid was obtained, in which the cpc560 promoter, NoKASII gene, rbc terminator, and kanamycin resistance gene cassette were inserted in this order into the neutral site slr0168 region derived from.
  • Preparation Example 2 Preparation of transformant obtained by introducing NoKASII gene from which chloroplast transfer signal is deleted into cyanobacteria Primers listed in Table 1 using a cDNA library prepared from Nannochloropsis oculata NIES-2145 as a template PCR was performed using Pcpc560 / NoKASII (-40) -F (SEQ ID NO: 21) and primer Trbc / NoKASII-R (SEQ ID NO: 20) to remove the chloroplast translocation signal (NoKASII (-40) A fragment, a base sequence (base sequence represented by SEQ ID NO: 45) in which an initiation codon (ATG) was added to the 5 ′ end side of the base sequence of positions 121 to 1428 of SEQ ID NO: 2, was amplified.
  • Preparation Example 3 Preparation of Transformant by Introducing Arabidopsis thaliana- derived KASII Gene into Cyanobacteria Primer Pcpc560 / AtKASII-F (SEQ ID NO: 22) described in Table 1 using a cDNA library prepared from Arabidopsis thaliana as a template ) And primer Trbc / AtKASII-R (SEQ ID NO: 23) to amplify the KASII gene fragment (AtKASII fragment, NCBI Gene ID 843835, SEQ ID NO: 24) encoding KASII (SEQ ID NO: 42) derived from Arabidopsis thaliana did.
  • the cpc560 promoter, AtKASII gene, rbc terminator, and kanamycin resistance gene cassette are in this order in the neutral site slr0168 region derived from Synecocystis sp. PCC6803, except that the AtKASII fragment was used instead of the NoKASII fragment.
  • Synechocystis sp.PCC6803 strain was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that the pUC118-slr0168 :: Pcpc560-AtKASII-Trbc-Km plasmid was used instead of the pUC118-slr0168 :: Pcpc560-NoKASII-Trbc-Km plasmid. After transformation, ⁇ slr0168 :: AtKASII strain was obtained.
  • Test Example 1 Manufacture of lipids
  • kanamycin was added to the BG-11 medium for culturing the transformant to a concentration of 25 ⁇ g / mL.
  • the organic layer (lower layer) was collected with a Pasteur pipette into a test tube with a lid, and dried with nitrogen gas.
  • a Pasteur pipette into a test tube with a lid, and dried with nitrogen gas.
  • 0.7 mL of 0.5N KOH methanol solution was added and stirred, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes.
  • 1 mL of boron trifluoride methanol solution was added, and methyl esterification reaction was performed at 80 ° C. for 10 minutes.
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions. From the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis, the ratio (%) of the amount of various fatty acids in the total fatty acid amount of each transformant was calculated. The results are shown in Table 4. The results in Table 4 show the average values and standard deviations of triplicate culture experiments performed under the same conditions.
  • Synecocystis sp. PCC6803 strain has the ability to produce fatty acids having 18 or less carbon atoms, but does not have the ability to produce long-chain fatty acids having 20 or more carbon atoms.
  • Table 4 by introducing the NoKASII gene derived from Nannochloropsis oculata, Synechocystis sp. PCC6803 strain acquires the ability to produce long chain fatty acids having 20 or more carbon atoms.
  • the transformant obtained by introducing the NoKASII gene from which the chloroplast transfer signal was deleted into cyanobacteria the production amount of long-chain fatty acids having 20 or more carbon atoms was further increased.
  • AtKASII gene derived from Arabidopsis thaliana was introduced into Synechocystis sp. PCC6803, production of long chain fatty acids having 20 or more carbon atoms could not be detected.
  • Preparation Example 4 Preparation of a transformant obtained by introducing NoKASII gene into cyanobacteria (1) Construction of kanamycin resistance gene expression plasmid Using the genomic DNA of the wild strain of Synechococcus elongata sp. Using the primer set of primer pUC118 / NS1up-F (SEQ ID NO: 25) and primer Kmr / NS1up-R (SEQ ID NO: 26), an upstream fragment (NS1up fragment: SEQ ID NO: 27) of the neutral site NS1 region was amplified.
  • TM In-Fusion
  • Trbc-F SEQ ID NO: 16
  • NS1down / Trbc-R SEQ ID NO: 35
  • Trbc fragments SEQ ID NO: 18
  • Trbc fragments SEQ ID NO: 18
  • the primer Ptrc / NoKASII-F SEQ ID NO: 36
  • the primer Trbc / NoKASII-R SEQ ID NO: 20
  • PCR was performed to amplify the NoKASII fragment (SEQ ID NO: 2).
  • the aforementioned linearized pUC118-NS1 Km plasmid, Ptrc fragment, Trbc fragment, and NoKASII fragment are mixed, and the Synechococcus elongata sp. Is used by using the In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech).
  • a pUC118-NS1 Km-Ptrc-NoKASII-Trbc plasmid was obtained in which the kanamycin resistance gene cassette, trc promoter region, NoKASII gene, and rbc terminator were inserted in this order into the neutral site NS1 region derived from PCC7942.
  • Preparation Example 5 Preparation of transformant by introducing NoKASII gene from which chloroplast transfer signal is deleted into cyanobacteria Primers listed in Table 2 using a cDNA library prepared from Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 as a template PCR was performed using Ptrc / NoKASII (-40) -F (SEQ ID NO: 37) and primer Trbc / NoKASII-R (SEQ ID NO: 20) to delete the chloroplast translocation signal (NoKASII (-40) A fragment, a base sequence (base sequence represented by SEQ ID NO: 45) in which an initiation codon (ATG) was added to the 5 ′ end side of the base sequence of positions 121 to 1428 of SEQ ID NO: 2, was amplified.
  • a kanamycin resistance gene cassette, trc promoter region, NoKASII in the neutral site NS1 region derived from Synechococcus elongata sp. PCC7942, except that the NoKASII (-40) fragment was used instead of the NoKASII fragment.
  • -40) fragment and the pUC118-NS1 :: Km-Ptrc-NoKASII (-40) -Trbc plasmid in which the rbc terminator was inserted in this order was obtained.
  • Preparation Example 7 Preparation of transformant by introducing E. coli-derived KASII gene into cyanobacteria Primer Ptrc / EcKASII-F (SEQ ID NO: 39) and primer described in Table 2 using genomic DNA extracted from E. coli K12 as a template PCR was performed using Trbc / EcKASII-R (SEQ ID NO: 40) to amplify a KASII gene fragment (EcKASII fragment, EcoGene Accession Number EG12606: SEQ ID NO: 41) encoding KASII (SEQ ID NO: 43) derived from E. coli.
  • Trbc / EcKASII-R SEQ ID NO: 40
  • the kanamycin resistance gene cassette, trc promoter region, EcKASII gene, and rbc terminator are contained in the neutral site NS1 region derived from Synechococcus elongatatus sp. PCC7942, except that the EcKASII fragment is used instead of the NoKASII fragment.
  • the pUC118-NS1 Km-Ptrc-EcKASII-Trbc plasmid.
  • Test Example 2 Production of Lipid
  • the transformant produced in Production Examples 4 to 7 and Synechococcus elongata sp. PCC7942 strain (wild strain) were cultured under the same conditions as in Test Example 1 to produce lipid. It was. After completion of the culture, the ratio (%) of various fatty acid amounts in the total fatty acid amount was calculated in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 5.
  • Synechococcus elongata sp. PCC7942 strain has the ability to produce fatty acids having 18 or less carbon atoms, but does not have the ability to produce long chain fatty acids having 20 or more carbon atoms.
  • Table 5 by introducing the NoKASII gene derived from Nannochloropsis oculata, Synechococcus elongata sp. PCC7942 acquires the ability to produce long-chain fatty acids having 20 carbon atoms.
  • the cyanobacteria can have a long chain having 20 or more carbon atoms. Acquire the ability to produce fatty acids. And compared with the host in which the expression of the said gene is not accelerated
  • the identity of the base sequences of AtKASII gene and EcKASII gene relative to the base sequence of NoKASII gene was calculated.
  • the identity of the base sequence of the AtKASII gene (SEQ ID NO: 24) to the base sequence of the NoKASII gene (SEQ ID NO: 2) was 49%.
  • the identity of the base sequence of the EcKASII gene (SEQ ID NO: 41) to the base sequence of the NoKASII gene (SEQ ID NO: 2) was 52%.

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Abstract

下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。 （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。 （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いる形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
　また、炭素原子数が２０以上の長鎖脂肪酸は不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、EPA（エイコサペンタエン酸）やDHA（ドコサヘキサエン酸）といった長鎖多価不飽和脂肪酸は機能性食品として用いられている。また、アラキジン酸、ベヘン酸、エルカ酸といった長鎖飽和脂肪酸又は長鎖一価不飽和脂肪酸は、分散剤や潤滑油などの工業原料として有用である。
　一般に、植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル－ＣｏＡとマロニル－ＡＣＰ（アシルキャリアプロテイン、acyl-carrier-protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体。ここで炭素原子数はアシル基の炭素数を示し、以下同様に示す場合がある。）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein　synthase、以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS　I、KAS　II、KAS　III、KAS　IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS　IIIは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素原子数２のアセチル－ＣｏＡを炭素原子数４のβ－ケトアシル－ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、KAS　I、KAS　II、及びKAS　IVが関与する。KAS　Iは主に炭素原子数１６のパルミトイル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、KAS　IIは主に炭素原子数１８のステアロイル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、KAS　IVは炭素原子数６～１４の中鎖アシル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与するといわれている。
　このうちKAS　IIとして、藻類の１種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類のKAS　IIが、特許文献１に記載されている。
　前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物や細菌等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
　シアノバクテリア（藍色細菌）は真正細菌の一群であり、光合成によって酸素を産生し、二酸化炭素を固定化する能力を有する。シアノバクテリアは、それらが１０数億年前に真核生物に細胞内共生（１次共生）したことが葉緑体の起源であると考えられている。そのため、葉緑体の祖先生物として光合成研究に広く利用されている。また、シアノバクテリアは他の植物と比べて生育が速く、かつ高い光合成能力を有する。さらにシアノバクテリアは形質転換能も有する。
　そのためシアノバクテリアは外来ＤＮＡを細胞内に導入することで微生物学的な物質生産に利用可能であることから、バイオ燃料などの物質の生産用宿主として注目されている。
　シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、脂肪酸の生産が報告されている（特許文献２及び非特許文献１）。しかし、シアノバクテリアを用いて、炭素原子数が２０以上の長鎖脂肪酸を生産する試みについてはほとんど報告がない。
米国特許出願公開第２０１３／０１０２０４０号明細書 国際公開第２００９／０７６５５９号
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, vol. 108, p. 6899-6904
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４４で表されるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させ、シアノバクテリアの細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させて、シアノバクテリアの細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させる、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能をシアノバクテリアに付与する方法に関する。
　さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、シアノバクテリアを用いた脂質の製造方法の提供に関する。
　また本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させたシアノバクテリアの形質転換体の提供に関する。
　本発明者らは、長鎖脂肪酸の合成に関与する酵素として、前述のナンノクロロプシス属の藻類のKASに着目し、このナンノクロロプシス属の藻類のKASをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた結果、元来長鎖脂肪酸の生産能を有さないシアノバクテリアが長鎖脂肪酸の生産能を獲得することを見い出した。そして、ナンノクロロプシス属の藻類のKASをコードする遺伝子の発現を促進させない場合と比較して、長鎖脂肪酸の生産性が向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の脂質の製造方法によれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本明細書における「脂質」は、中性脂肪（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
　また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
　本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）（以下、「NoKASII」ともいう）はKASの１種であり、長鎖脂肪酸の合成に関与するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のKASの１つである。
　KASは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は一般的に葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル－ＣｏＡを出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰが合成される。次いで、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）の作用によってアシル－ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
　脂肪酸合成の第一段階では、アセチル－ＣｏＡとマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β－ケトアシル－ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル－ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル－ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル－ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰが合成される。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）はいずれも、KAS活性を有する。本明細書において「KAS活性」とは、アセチル－ＣｏＡやアシル－ＡＣＰと、マロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
　タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル－ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　KASはその基質特異性によってKAS　I、KAS　II、KAS　III、又はKAS　IVに分類される。KAS　IIIは、炭素原子数２のアセチル－ＣｏＡを基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS　Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル－ＡＣＰを合成する。KAS　IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル－ＡＣＰを合成する。KAS　IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル－ＡＣＰを合成する。
　後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｃ）をコードする遺伝子の発現を促進した形質転換体では、炭素原子数２０、２２、又は２４の長鎖脂肪酸の生産性が向上する。よって前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）は、炭素原子数２０以上の長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有する、KAS　II型のKASであると考えられる。なお本明細書において「長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性」とは、主に炭素原子数１６以上のアシル－ＡＣＰを基質とし、炭素原子数２０以上の長鎖アシル－ＡＣＰ合成の伸長反応を触媒する活性のことをいう。また本明細書において「長鎖」とは、アシル基の炭素原子数が２０以上、好ましくは炭素原子数が２０、２２又は２４であることをいう。
　また、ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）やtargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)を用いた局在予測より、前記タンパク質（Ａ）は葉緑体局在型のKASであり、Ｎ末端側のアミノ酸４０残基は葉緑体移行シグナル配列であると考えられる。
　KASの長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有する。タンパク質（Ｄ）は、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有する。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにKAS活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　前記タンパク質（Ｂ）において、KAS活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　またタンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、KAS活性を有し、かつ葉緑体移行シグナル配列が削除されていることが好ましい。後述の実施例で示すように、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質においてＮ末端側の葉緑体移行シグナル配列を削除することで、長鎖脂肪酸の生産性がさらに向上する。このようなタンパク質（Ｂ）としては、Ｎ末端側のアミノ酸配列として、配列番号１の１位～４０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列と、Ｃ末端側のアミノ酸配列として、配列番号１の４１位～４７５位のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　またタンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　前記タンパク質（Ｃ）は、配列番号１の４１位～４７５位のアミノ酸配列と、そのＮ末端側に付加したメチオニン残基からなる。なお前記タンパク質（Ｂ）は、タンパク質（Ｃ）も包含する。タンパク質（Ｃ）では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質から、Ｎ末端側の葉緑体移行シグナル配列（配列番号１の１位～４０位のアミノ酸残基）が削除されている。
　前記タンパク質（Ｄ）において、KAS活性の点から、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７４個以下、好ましくは１個以上１５２個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　またタンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ遺伝子を用いることができる。
　なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）をコードする遺伝子（以下、「KAS遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子（以下、「NoKASII遺伝子」ともいう）が挙げられる。
 
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のKAS）をコードする遺伝子の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、KAS活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７１個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、さらに好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　またＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性が６０％以上の塩基配列からなり、KAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードし、かつ葉緑体移行シグナル配列をコードする領域の塩基配列が削除されていることが好ましい。後述の実施例で示すように、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質においてＮ末端側の葉緑体移行シグナル配列を削除することで、長鎖脂肪酸の生産性がさらに向上する。このようなタンパク質をコードするＤＮＡとしては、5’末端側の塩基配列として、配列番号２の１位～１２０位の任意の位置で5’末端側の塩基が欠失した塩基配列と、3’末端側の塩基配列として、配列番号２の１２１位～１４２８位の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　また前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が付加された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　前記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号２の１２１位～１４２８位の塩基配列と、その5’末端側に付加した開始コドン（ATG）からなり前記タンパク質（Ｃ）（配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードする。なお前記ＤＮＡ（ｂ）は、ＤＮＡ（ｃ）も包含する。ＤＮＡ（ｃ）では、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡから、前記葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列（配列番号２の１位～１２０位の塩基配列）が削除されている。
　前記ＤＮＡ（ｄ）において、KAS活性の点から、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５２３個以下、好ましくは１個以上４５７個以下、より好ましくは１個以上３９２個以下、より好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２６１個以下、より好ましくは１個以上１９６個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡも好ましい。さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が付加された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　前記KAS遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記KAS遺伝子をシアノバクテリアに導入する方法、前記KAS遺伝子をゲノム上に有するシアノバクテリアにおいて、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。なかでも、前記KAS遺伝子をシアノバクテリアに導入し、KAS遺伝子の発現を促進させる方法が好ましい。
　以下本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性（長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸又は脂質に占める長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の割合）が増加傾向にある。そしてその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂質、特に長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数２０以上の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０～２４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸、１価の不飽和脂肪酸、若しくは２価の不飽和脂肪酸、及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくは２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸若しくは１価の不飽和脂肪酸、及びこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　前記KAS遺伝子をシアノバクテリアに導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　前記KAS遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、KAS遺伝子を人工的に合成できる。KAS遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記KAS遺伝子を常法によりシアノバクテリアに導入することで得られる。具体的には、前記KAS遺伝子をシアノバクテリアの細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これをシアノバクテリアの細胞内に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　本発明の形質転換体の宿主として用いるシアノバクテリアは、クロロフィルを用いた光合成を行う原核生物の一群である。
　シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803のような単細胞性のもの、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー（Anabaena sp.）PCC7120のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。
　生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー（Synechococcus sp.）CC9311、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーWH8102など、様々な条件に適応した種が見られる。
　また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス（Gloeobacter violaceus）PCC7421、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルａでなくクロロフィルｄを主要な（＞９５％）光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）なども挙げられる。
　シアノバクテリアでは、光合成により固定された二酸化炭素は多数の酵素反応プロセスを経てアセチル－ＣｏＡへと変換される。脂肪酸合成の最初の段階は、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼの作用による、アセチル－ＣｏＡとＣＯ2からのマロニル－ＣｏＡの合成である。次に、マロニル－ＣｏＡがマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼの作用によってマロニル－ＡＣＰへと変換される。その後、β-ケトアシル-ACPシンターゼの進行的作用時に、炭素単位２個の連続的付加が起こり、炭素が２個ずつ増加した、アシル－ＡＣＰが合成され、膜脂質等の合成中間体として利用される。
　本発明の形質転換体の宿主としては、あらゆる種類のシアノバクテリアを用いることができる。例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属のシアノバクテリアが挙げられる。このうち、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属又はアナベナ属のシアノバクテリアが好ましく、シネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリアがより好ましい。また本発明で用いる宿主としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803、シネコシスティス・エスピーPCC7509、シネコシスティス・エスピーPCC6714、シネココッカス・エロンガタスエスピー（Synechococcus　elongatus　sp．）PCC7942、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1、トリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium　erythraeum）IMS101、アカリオクロリス・マリアナ（Acaryochloris　mariana）MBIC11017、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera　watsonii）WH8501、及びアナベナ・エスピー（Anabaena　sp．）PCC7120がより好ましく、シネコシスティス・エスピーPCC6803及びシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現ベクターとしては、pUC系ベクター（タカラバイオ社製）、pBluescript（pBS) II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Plasmid, 1986, vol. 15(2), p. 93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。このうち、pUC系ベクターがより好ましい。
　また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin βサブユニット (cpcB)、リボゾームRNAをコードするrrnAオペロン遺伝子のプロモーターが挙げられる。このうち、trcプロモーター及びcpcプロモーターがより好ましい。
　また、目的ＤＮＡ断片が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、及びゲンタマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　またシアノバクテリアに導入する異種遺伝子は、シアノバクテリアにおけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database (www.kazusa.or.jp/codon/) から入手可能である。
　形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。形質転換方法としては、自然形質転換法、エレクトロポレーション法、及び接合法が挙げられる。
　シアノバクテリアに導入した前記KAS遺伝子は、相同組換え等によりシアノバクテリアのゲノム上に組み込まれていることが好ましい。前記KAS遺伝子がゲノム上に組み込まれる位置は適宜設定することができる。例えば前記KAS遺伝子は、シアノバクテリアのゲノム上のslr0168領域中又はNS1領域などのニュートラルサイト中に組み込まれていることが好ましい。
　本発明の形質転換体は、シアノバクテリアが元来有していない長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能を有する。そしてその生産性は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率のよく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養は、BG-11培地(J. Gen. Microbiol., 1979, vol. 111, p. 1-61）、Ａ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, vol. 77, p. 6052-6056）、ＡＡ培地（Plant Physiol., 1955, vol. 30, p. 366-372）など、シアノバクテリアの培養に通常用いられる培地を用いて、液体培養又はその変法により実施することができる。
　脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、７～４５日間、好ましくは７～３０日間、より好ましくは１０～１４日間、通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。
　培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、脂肪酸のグリセリンエステルの一種である極性脂質を含んでなる。極性脂質としては、例えばモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）、スルホキノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などが挙げられる。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、分散剤等の工業原料への利用の観点から、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数２０以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０～２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０、２２若しくは２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸、１価の不飽和脂肪酸、若しくは２価の不飽和脂肪酸、又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸若しくは１価の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　本発明により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、生産される脂肪酸の組成を改変する方法、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させ、シアノバクテリアの細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させることで、シアノバクテリアの細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の脂肪酸の組成を改変する、脂肪酸組成の改変方法。
＜４＞生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、前記＜３＞項記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させる、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能をシアノバクテリアに付与する方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子をシアノバクテリア、好ましくはシアノバクテリアのゲノム上のニュートラルサイトに導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７４個以下、より好ましくは１個以上１５２個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）が、長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有するKASである、前記＜１＞～＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上５７１個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１２＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上５２３個以下、好ましくは１個以上４５７個以下、より好ましくは１個以上３９２個以下、より好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２６１個以下、より好ましくは１個以上１９６個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１３＞前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数２０以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０～２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸、１価の不飽和脂肪酸、若しくは２価の不飽和脂肪酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸若しくは１価の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞BG-11培地を用いて前記シアノバクテリアを培養する、前記＜１＞～＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体。
＜１７＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターをシアノバクテリアに導入してなる、形質転換体。
＜１８＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターをシアノバクテリアに導入する、形質転換体の作製方法。
＜１９＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）がそれぞれ、前記＜６＞又は＜７＞項で規定するタンパク質である、前記＜１６＞～＜１７＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２０＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１６＞～＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２１＞前記ＤＮＡ（ｂ）及び（ｄ）がそれぞれ、前記＜１１＞又は＜１２＞項で規定するＤＮＡである、前記＜２０＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２２＞前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記＜１６＞～＜２１＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２３＞脂質を製造するための、前記＜１６＞～＜２２＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜２４＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数２０以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０～２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸、１価の不飽和脂肪酸、若しくは２価の不飽和脂肪酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸若しくは１価の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜２３＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
作製例１　NoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
（１）カナマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　シネコシスティス・エスピーPCC6803株の野生株のゲノムDNAを鋳型として、表１記載のプライマーpUC118/slr0168up-F（配列番号３）及びプライマーKmr/slr0168up-R（配列番号４）を用い、ニュートラルサイトslr0168領域の上流断片（slr0168up断片：配列番号５）を増幅した。また、前記ゲノムDNAを鋳型として、表１記載のプライマーKmr/slr0168down-F（配列番号６）とプライマーpUC118/slr0168down-R（配列番号７）のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトslr0168領域の下流断片（slr0168down断片：配列番号８）を増幅した。
　さらに、pJH1プラスミド（Gene, 1983, vol. 23, p. 331-341）を鋳型として、表１記載のプライマーKmr-F（配列番号９）及びKmr-R（配列番号１０）を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性マーカー遺伝子断片（Kmr断片：配列番号１１）を増幅した。
　前述の、slr0168up断片、slr0168down断片、及びKmr断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ社製）のHincIIサイトにIn-Fusion（登録商標）PCRクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、pUC118-slr0168::Kmプラスミドを取得した。
（２）NoKASII遺伝子発現用プラスミドの構築
　前記pUC118-slr0168::Kmプラスミドを鋳型とし、表１記載のプライマーKmr-F（配列番号９）及びプライマーslr0168up-R（配列番号１２）を用いてPCRを行い、pUC118-slr0168::Kmプラスミドを線状化した。
　次に、シネコシスティス・エスピーPCC6803株の野生株のゲノムDNAより、表１記載のプライマーslr0168up/Pcpc560-F（配列番号１３）及びプライマーPcpc560-R（配列番号１４）を用い、高発現cpc560プロモーター断片（Scientific Reports, 2014, vol. 4, p. 4500、Pcpc560断片：配列番号１５）を増幅した。
　また、シネコシスティス・エスピーPCC6803株の野生型ゲノムDNAより、表１記載のプライマーTrbc-F（配列番号１６）及びKm/Trbc-R（配列番号１７）を用いてPCRを行い、rbc遺伝子のターミネーター領域（Trbc断片：配列番号１８）を増幅した。
　さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表１記載のプライマーPcpc560/NoKASII-F（配列番号１９）及びプライマーTrbc/NoKASII-R（配列番号２０）を用いてPCRを行い、NoKASII断片（配列番号２）を増幅した。
　前述の線状化したpUC118-slr0168::Kmプラスミド、Pcpc560断片、Trbc断片、及びNoKASII断片を混合し、In-Fusion（登録商標）PCRクローニング法（Clontech）を用いることで、シネコシスティス・エスピーPCC6803株由来のニュートラルサイトslr0168領域中にcpc560プロモーター、NoKASII遺伝子、rbcターミネーター、及びカナマイシン耐性遺伝子カセットがこの順で挿入された、pUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII-Trbc-Kmプラスミドを得た。
（３）NoKASII遺伝子発現用プラスミドを用いたシアノバクテリアの形質転換
　得られたpUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII-Trbc-Kmプラスミドを用いて、自然形質転換法によりシネコシスティス・エスピーPCC6803株を形質転換し、カナマイシン耐性により選抜した。このようにして、シネコシスティス・エスピーPCC6803株のゲノム上のslr0168領域中に、NoKASII遺伝子発現コンストラクトを導入したΔslr0168::NoKASII株を取得した。
作製例２　葉緑体移行シグナルを削除したNoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表１記載のプライマーPcpc560/NoKASII(-40)-F（配列番号２１）及びプライマーTrbc/NoKASII-R（配列番号２０）を用いてPCRを行い、葉緑体移行シグナルを削除したNoKASII遺伝子断片（NoKASII(-40)断片、配列番号２の１２１位～１４２８位の塩基配列の5'末端側に開始コドン（ATG）を付加した塩基配列（配列番号４５で表される塩基配列））を増幅した。
　NoKASII断片に代えてNoKASII(-40)断片を用いた以外は作製例１と同様にして、シネコシスティス・エスピーPCC6803株由来のニュートラルサイトslr0168領域中にcpc560プロモーター、NoKASII(-40)断片、rbcターミネーター、及びカナマイシン耐性遺伝子カセットがこの順で挿入された、pUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII(-40)-Trbc-Kmプラスミドを得た。
　そして、pUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII-Trbc-Kmプラスミドに代えてpUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII(-40)-Trbc-Kmプラスミドを用いた以外は作製例１と同様にして、シネコシスティス・エスピーPCC6803株を形質転換し、Δslr0168::NoKASII(-40)株を取得した。
作製例３　シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
　シロイヌナズナより作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表１記載のプライマーPcpc560/AtKASII-F（配列番号２２）及びプライマーTrbc/AtKASII-R（配列番号２３）を用いてPCRを行い、シロイヌナズナ由来のKASII（配列番号４２）をコードするKASII遺伝子断片（AtKASII断片、NCBI Gene ID 843835、配列番号２４）を増幅した。
　NoKASII断片に代えてAtKASII断片を用いた以外は作製例１と同様にして、シネコシスティス・エスピーPCC6803株由来のニュートラルサイトslr0168領域中にcpc560プロモーター、AtKASII遺伝子、rbcターミネーター、及びカナマイシン耐性遺伝子カセットがこの順で挿入された、pUC118-slr0168::Pcpc560-AtKASII-Trbc-Kmプラスミドを得た。
　そして、pUC118-slr0168::Pcpc560-NoKASII-Trbc-Kmプラスミドに代えてpUC118-slr0168::Pcpc560-AtKASII-Trbc-Kmプラスミドを用いた以外は作製例１と同様にして、シネコシスティス・エスピーPCC6803株を形質転換し、Δslr0168::AtKASII株を取得した。
試験例１　脂質の製造
　下記表３に示す組成のBG-11培地10mLを加えた20mL三角フラスコ中で、作製例１～３で作製した形質転換体、並びにシネコシスティス・エスピーPCC6803株（野生株）を10日間培養した。培養は一定の照明下（60μE・m-2・sec-1）、30℃にてロータリーシェーカー（120rpm）を用いて行い、初発菌体濃度をOD730＝0.4に設定した。なお形質転換体を培養するBG-11培地には、カナマイシンを25μg/mLの濃度となるよう添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　培養終了後、培養液5mLをガラス試験管に分取し、3000rpmで遠心することにより集菌した。上清を除去した沈殿を蒸留水0.5mLに懸濁し、内部標準として内部標準としてメタノールに溶解した7-ペンタデカノン（1mg/mL）50μLを添加した。これに、クロロホルム0.5mL、メタノール1mLを加えて攪拌し、さらに30分静置した。その後、クロロホルム0.5mL、1.5%KCl溶液0.5mLを加えて攪拌した。3000rpm、室温で15分遠心した後、有機層（下層）をパスツールピペットでふた付き試験管に回収し、窒素ガスで乾固した。
　乾固した脂質画分に0.5N　KOHメタノール溶液0.7mLを加えて攪拌し、80℃で30分間恒温した。さらに、3フッ化ホウ素メタノール溶液1mLを加え、80℃で10分間メチルエステル化反応を行った。この反応液に、ヘキサン0.5mL及び飽和食塩水1mLを加えて攪拌し、室温にて10分間静置した後、上層のヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
（解析条件）
分析装置：7890A GC system（Agilent）
キャピラリーカラム：DB-WAX 20m×100μm×0.10μm（J&W Scientific)
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：0.3mL/分
昇温プログラム：100℃（1分）→12.5℃/分(200℃まで)→5℃/分(250℃まで)→250℃（9分）
平衡化時間：0.5分
注入口：スプリット注入（スプリット比：50:1）
圧力：57.308psi
注入量：5μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：350℃
　脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各形質転換体の総脂肪酸量に占める、各種脂肪酸量の割合(%)を算出した。その結果を表４に示す。表４の結果は、同条件で行った３連の培養実験の平均値と標準偏差を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　表４に示すように、シネコシスティス・エスピーPCC6803株は炭素原子数１８以下の脂肪酸の生産能は有するが、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の生産能は有さない。
　これに対し、表４に示すように、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のNoKASII遺伝子を導入することで、シネコシスティス・エスピーPCC6803株は炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の生産能を獲得する。特に、葉緑体移行シグナルを削除したNoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体では、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の生産量がより増加した。
　一方、シネコシスティス・エスピーPCC6803株にシロイヌナズナ由来のAtKASII遺伝子を導入しても、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の産生を検知することができなかった。
作製例４　NoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
（１）カナマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942の野生株のゲノムDNAを鋳型として、表２記載のプライマーpUC118/NS1up-F（配列番号２５）とプライマーKmr/NS1up-R（配列番号２６）のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトNS1領域の上流断片（NS1up断片：配列番号２７）を増幅した。また、前記ゲノムDNAを鋳型として、表２記載のプライマーKmr/NS1down-F（配列番号２８）とプライマーpUC118/NS1down-R（配列番号２９）のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトNS1領域の下流断片（NS1down断片：配列番号３０）を増幅した。
　前述のNS1up断片及びNS1down断片、並びに作製例１と同様に作製したKmr断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ社製）のHincIIサイト間にIn-Fusion（登録商標）PCRクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、pUC118-NS1::Kmプラスミドを取得した。
（２）NoKASII遺伝子発現用プラスミドの構築
　前記pUC118-NS1::Kmプラスミドを鋳型とし、表１記載のプライマーKmr-R（配列番号１０）及び表２記載のプライマーNS1down-F（配列番号３１）を用いてPCRを行い、pUC118-NS1::Kmプラスミドを線状化した。
　次に、pTrc99Aクローニングベクター（NCBI Accession number M22744）の配列より人工合成したtrcプロモーター配列を鋳型に、表２記載のプライマーKmr/Ptrc-F（配列番号３２）及びプライマーPtrc-R（配列番号３３）を用いてPCRを行い、Ptrc断片（配列番号３４）を増幅した。
　また、シネコシスティス・エスピーPCC6803株の野生型ゲノムDNAより、表１記載のプライマーTrbc-F（配列番号１６）及びNS1down/Trbc-R（配列番号３５）を用いてPCRを行い、Trbc断片（配列番号１８）を増幅した。
　さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表２記載のプライマーPtrc/NoKASII-F（配列番号３６）及びプライマーTrbc/NoKASII-R（配列番号２０）を用いてPCRを行い、NoKASII断片（配列番号２）を増幅した。
　前述の線状化したpUC118-NS1::Kmプラスミド、Ptrc断片、Trbc断片、及びNoKASII断片を混合し、In-Fusion（登録商標）PCRクローニング法（Clontech）を用いることでシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来のニュートラルサイトNS1領域中にカナマイシン耐性遺伝子カセット、trcプロモーター領域、NoKASII遺伝子、及びrbcターミネーターがこの順で挿入された、pUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII-Trbcプラスミドを得た。
（３）NoKASII遺伝子発現用プラスミドを用いたシアノバクテリアの形質転換
　得られたpUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII-Trbcプラスミドを用いて、自然形質転換法によりシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、カナマイシン耐性により選抜した。このようにして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株のゲノム上のNS1領域中に、NoKASII遺伝子発現コンストラクトを導入したΔNS1::NoKASII株を取得した。
作製例５　葉緑体移行シグナルを削除したNoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表２記載のプライマーPtrc/NoKASII(-40)-F（配列番号３７）及びプライマーTrbc/NoKASII-R（配列番号２０）を用いてPCRを行い、葉緑体移行シグナルを削除したNoKASII遺伝子断片（NoKASII(-40)断片、配列番号２の１２１位～１４２８位の塩基配列の5'末端側に開始コドン（ATG）を付加した塩基配列（配列番号４５で表される塩基配列））を増幅した。
　NoKASII断片に代えてNoKASII(-40)断片を用いた以外は作製例４と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来のニュートラルサイトNS1領域中にカナマイシン耐性遺伝子カセット、trcプロモーター領域、NoKASII(-40)断片、及びrbcターミネーターがこの順で挿入された、pUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII(-40)-Trbcプラスミドを得た。
　そして、pUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII-Trbcプラスミドに代えてpUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII(-40)-Trbcプラスミドを用いた以外は作製例４と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、ΔNS1::NoKASII(-40)株を取得した。
作製例６　シロイヌナズナ由来のKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
　シロイヌナズナより作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表２記載のプライマーPtrc/AtKASII-F（配列番号３８）及び表１に記載のプライマーTrbc/AtKASII-R（配列番号２３）を用いてPCRを行い、シロイヌナズナ由来のKASII（配列番号４２）をコードするKASII遺伝子断片（AtKASII断片、NCBI Gene ID 843835、配列番号２４）を増幅した。
　NoKASII断片に代えてAtKASII断片を用いた以外は作製例５と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来のニュートラルサイトNS1領域中にカナマイシン耐性遺伝子カセット、trcプロモーター領域、AtKASII遺伝子、及びrbcターミネーターがこの順で挿入された、pUC118-NS1::Km-Ptrc-AtKASII-Trbcプラスミドを得た。
　そして、pUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII-Trbcプラスミドに代えてpUC118-NS1::Km-Ptrc-AtKASII-Trbcプラスミドを用いた以外は作製例４と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、ΔNS1::AtKASII株を取得した。
作製例７　大腸菌由来のKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体の作製
　大腸菌K12株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２記載のプライマーPtrc/EcKASII-F（配列番号３９）及びプライマーTrbc/EcKASII-R（配列番号４０）を用いてPCRを行い、大腸菌由来のKASII（配列番号４３）をコードするKASII遺伝子断片（EcKASII断片、EcoGene Accession Number EG12606：配列番号４１）を増幅した。
　NoKASII断片に代えてEcKASII断片を用いた以外は作製例５と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来のニュートラルサイトNS1領域中にカナマイシン耐性遺伝子カセット、trcプロモーター領域、EcKASII遺伝子、及びrbcターミネーターがこの順で挿入された、pUC118-NS1::Km-Ptrc-EcKASII-Trbcプラスミドを得た。
　そして、pUC118-NS1::Km-Ptrc-NoKASII-Trbcプラスミドに代えてpUC118-NS1::Km-Ptrc-EcKASII-Trbcプラスミドを用いた以外は作製例４と同様にして、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、ΔNS1::EcKASII株を取得した。
試験例２　脂質の製造
　作製例４～７で作製した形質転換体、並びにシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株（野生株）について、試験例１と同様の条件下で培養し、脂質の製造を行った。
　培養終了後、試験例１と同様に、総脂肪酸量に占める各種脂肪酸量の割合(%)の算出を行った。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　表５に示すように、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株は炭素原子数１８以下の脂肪酸の生産能は有するが、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の生産能は有さない。
　これに対し、表５に示すように、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のNoKASII遺伝子を導入することで、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株は炭素原子数２０の長鎖脂肪酸の生産能を獲得する。特に、葉緑体移行シグナルを欠失して削除したNoKASII遺伝子をシアノバクテリアに導入してなる形質転換体では、炭素原子数２０の長鎖脂肪酸の生産量がより増加し、炭素原子数２２以上の長鎖脂肪酸の生産能も獲得した。
　一方、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株にシロイヌナズナ由来のAtKASII遺伝子や大腸菌由来のEcKASII遺伝子を導入しても、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の産生を検知することができなかった。
　上記のように、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させることで、シアノバクテリアは、炭素原子数２０以上の長鎖脂肪酸の生産能を獲得する。そして、前記遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して、長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産量が増加傾向にある。
　よって、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させることで、長鎖脂肪酸の生産性を獲得又は向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
試験例
　遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、NoKASIIのアミノ酸配列に対する、シロイヌナズナ由来のKASII（AtKASII）及び大腸菌由来のKASII（EcKASII）のアミノ酸配列の同一性を算出した。その結果、NoKASIIのアミノ酸配列（配列番号１）に対する、AtKASIIのアミノ酸配列（配列番号４２）の同一性は３９％であった。また、NoKASIIのアミノ酸配列（配列番号１）に対する、EcKASIIのアミノ酸配列（配列番号４３）の同一性は４４％であった。
　さらに、NoKASII遺伝子の塩基配列に対する、AtKASII遺伝子及びEcKASII遺伝子の塩基配列の同一性を算出した。その結果、NoKASII遺伝子の塩基配列（配列番号２）に対する、AtKASII遺伝子の塩基配列（配列番号２４）の同一性は４９％であった。また、NoKASII遺伝子の塩基配列（配列番号２）に対する、EcKASII遺伝子の塩基配列（配列番号４１）の同一性は５２％であった。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2016年5月10日に日本国で特許出願された特願2016-094479に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (22)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させ、シアノバクテリアの細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させることで、シアノバクテリアの細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の脂肪酸の組成を改変する、脂肪酸組成の改変方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、請求項３記載の方法。
  5. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させる、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能をシアノバクテリアに付与する方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  6. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）が、長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有するβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼである、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｃ）配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  9. 　前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属からなる群より選ばれるシアノバクテリアである、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属又はシネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアである、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　前記脂質が長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物を含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 　前記脂質が、炭素原子数２０、２２若しくは２４の飽和脂肪酸若しくは１価の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  15. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子の発現をシアノバクテリアの細胞内で促進させた形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  16. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターをシアノバクテリアに導入してなる形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  17. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）が、長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有するβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼである、請求項１５又は１６に記載の形質転換体。
  18. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）の少なくともいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の形質転換体。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｃ）配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  19. 　前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属からなる群より選ばれるシアノバクテリアである、請求項１５～１８のいずれか１項記載の形質転換体。
  20. 　前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属又はシネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアである、請求項１５～１９のいずれか１項記載の形質転換体。
  21. 　前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１５～２０のいずれか１項記載の形質転換体。
  22. 　前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１５～２０のいずれか１項記載の形質転換体。
     
     
     
     
     
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