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WO2017022740A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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WO2017022740A1
WO2017022740A1 PCT/JP2016/072606 JP2016072606W WO2017022740A1 WO 2017022740 A1 WO2017022740 A1 WO 2017022740A1 JP 2016072606 W JP2016072606 W JP 2016072606W WO 2017022740 A1 WO2017022740 A1 WO 2017022740A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
gene
amino acid
acid sequence
transformant
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/072606
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English (en)
French (fr)
Inventor
達郎 尾崎
慎二 杉原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
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Priority to US15/747,936 priority patent/US10337037B2/en
Priority to JP2017533077A priority patent/JP6785769B2/ja
Publication of WO2017022740A1 publication Critical patent/WO2017022740A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01041—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I (2.3.1.41)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids.
  • the present invention also relates to ⁇ -ketoacyl-ACP synthase used in the method, a gene encoding the same, and a transformant that promotes the expression of the gene.
  • Fatty acids are one of the main constituents of lipids and constitute lipids (oils and fats) such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • surfactants are used as cleaning agents, disinfectants, and the like.
  • Cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts, which are derivatives of the same higher alcohol, are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used for bactericides and preservatives.
  • vegetable oils and fats are also used as raw materials for biodiesel fuel.
  • long-chain fatty acids having 18 or more carbon atoms particularly long-chain polyunsaturated fatty acids into which a plurality of unsaturated bonds are introduced (hereinafter also referred to as “PUFA”) are indispensable that cannot be synthesized in the living body of animals. It is known to be a fatty acid. Therefore, such PUFA is particularly useful for nutritional applications and is used for functional foods and the like.
  • Plant fatty acid synthesis pathway is localized in chloroplasts.
  • acetyl-ACP acyl carrier protein
  • acyl-ACP acyl which is a fatty acid residue
  • a complex comprising a group and an ACP
  • KAS ⁇ -ketoacyl-ACP synthase
  • KAS III works at the initiation stage of the chain length extension reaction and extends acetyl-ACP (or acetyl-CoA) having 2 carbon atoms to ⁇ -ketoacyl-ACP having 4 carbon atoms.
  • KAS II is mainly involved in the elongation reaction up to 16 carbon atoms palmitoyl-ACP
  • KAS II is mainly involved in the elongation reaction up to 18 carbon atoms stearoyl-ACP.
  • KAS IV is said to be involved in the elongation reaction up to medium chain acyl-ACP having 6 to 14 carbon atoms. Furthermore, it is said that long-chain fatty acids having 18 or more carbon atoms, particularly PUFA, are synthesized outside the chloroplasts by a large number of desaturases and elongases.
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, in which a transformant in which expression of a gene encoding the following protein (A) or (B) is promoted is cultured to produce a fatty acid or a lipid comprising the same.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and having ⁇ -ketoacyl-ACP synthase activity (hereinafter also referred to as “KAS activity”).
  • the present invention also relates to the protein (A) or (B).
  • the present invention also relates to a gene encoding the protein (A) or (B). Furthermore, this invention relates to the transformant which promoted the expression of the gene which codes the said protein (A) or (B).
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, which improves the productivity of a long-chain fatty acid or a lipid comprising the same.
  • the present invention also relates to a transformant with improved productivity of long-chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • the present inventors newly identified KAS of algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of algae, as an enzyme involved in the synthesis of long-chain fatty acids. As a result of accelerating the expression of KAS in microorganisms, the present inventors have found that the productivity of produced long-chain fatty acids or lipids comprising them as a constituent component is significantly improved. The present invention has been completed based on these findings.
  • the method for producing a lipid of the present invention it is possible to improve the productivity of a long-chain fatty acid or a lipid comprising the same. Moreover, the transformant of the present invention is excellent in productivity of long-chain fatty acids or lipids containing the same as a constituent component.
  • lipid refers to simple lipids such as neutral fats (such as triacylglycerol), waxes, and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids, and sulfolipids; and fatty acids derived from these lipids And derived lipids such as alcohols and hydrocarbons.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • “Cx” represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • the identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • “stringent conditions” include, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W., et al. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • upstream of a gene indicates not a position from the translation start point but a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target.
  • downstream of a gene indicates a region continuing 3 ′ side of the gene or region captured as a target.
  • the proteins (A) and (B) are one type of KAS, and are proteins involved in the synthesis of long-chain fatty acids.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is one of KAS derived from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis .
  • KAS is an enzyme involved in the control of acyl chain length in the fatty acid synthesis pathway.
  • Plant fatty acid synthesis pathways are generally located in the chloroplast.
  • acetyl-ACP or acetyl-CoA
  • the carbon chain elongation reaction is repeated to finally synthesize acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms.
  • acyl-ACP thioesterase acts to hydrolyze the thioester bond of acyl-ACP to produce a free fatty acid.
  • acetoacetyl ACP is produced by a condensation reaction of acetyl-ACP (or acetyl-CoA) and malonyl ACP. This reaction is catalyzed by KAS. Subsequently, the keto group of acetoacetyl ACP is reduced by ⁇ -ketoacyl-ACP reductase to produce hydroxybutyryl ACP. Subsequently, hydroxybutyryl ACP is dehydrated by ⁇ -hydroxyacyl-ACP dehydrase to produce crotonyl ACP. Finally, crotonyl ACP is reduced by enoyl-ACP reductase to produce butyryl ACP.
  • butyryl ACP in which two carbon chains of the acyl group are extended from acetyl-ACP is generated. Thereafter, by repeating the same reaction, the carbon chain of acyl-ACP is extended, and finally acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms is synthesized.
  • KAS activity means an activity that catalyzes the condensation reaction of acetyl-ACP (or acetyl-CoA) or acyl-ACP with malonyl ACP.
  • the fact that a protein has KAS activity means that, for example, a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell lacking the fatty acid degradation system, and the introduced gene is expressed.
  • the cells can be cultured under such conditions, and changes in fatty acid composition in the host cells or in the culture medium can be confirmed by a conventional method.
  • a DNA ligated with the gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into the host cell and culturing the cell under conditions in which the introduced gene is expressed, It can be confirmed by performing a chain length extension reaction using various acyl-ACPs as substrates.
  • KAS is classified as KAS I, KAS II, KAS III, or KAS IV depending on its substrate specificity.
  • KAS III uses acetyl-ACP (or acetyl-CoA) having 2 carbon atoms as a substrate and catalyzes an elongation reaction having 2 to 4 carbon atoms.
  • KAS I mainly catalyzes the elongation reaction of 4 to 16 carbon atoms to synthesize palmitoyl-ACP having 16 carbon atoms.
  • KAS II mainly synthesizes a long-chain acyl-ACP by catalyzing an extension reaction to a long-chain acyl group having 18 or more carbon atoms.
  • KAS IV mainly catalyzes the elongation reaction of 6 to 14 carbon atoms to synthesize medium chain acyl-ACP.
  • the proteins (A) and (B) are considered to be KAS type II KAS having long-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity having 18 or more carbon atoms.
  • the protein (A) is a chloroplast-localized KAS, and is located on the N-terminal side. Amino acid 33 residue is considered to be a chloroplast translocation signal sequence.
  • “long-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity” refers to an elongation reaction of synthesizing a long-chain acyl-ACP having 18 or more carbon atoms, mainly using acyl-ACP having 16 or more carbon atoms as a substrate. The activity to catalyze.
  • the term “long chain” means that the acyl group has 18 or more carbon atoms, preferably 18 or 20 carbon atoms.
  • a DNA linking a gene encoding a protein downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell deficient in the fatty acid degradation system.
  • the cells can be cultured under conditions that allow the expressed gene to be analyzed, and changes in fatty acid composition in the host cells or culture medium can be confirmed by conventional methods. Moreover, it can confirm by co-expressing TE mentioned later to said system, and comparing with the fatty acid composition at the time of expressing only TE.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more. More preferably, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • one or more (for example, 1 to 142, preferably 1 to 118, more preferably 1 to 95) amino acid sequences of the protein (A) More preferably 1 to 71, more preferably 1 to 47, more preferably 1 to 38, more preferably 1 to 23, more preferably 1 to 9
  • a protein in which 1 to 4 amino acids are deleted, substituted, inserted or added examples include a method for introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence. Examples of the method for introducing mutation include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using SOE-PCR reaction, ODA method, Kunkel method and the like. Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification or the like from Nannochloropsis oculata.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1.
  • the proteins (A) and (B) may be prepared as recombinant proteins by genetic recombination techniques.
  • the ⁇ -ketoacyl-ACP synthase gene described later can be used.
  • Nannochloropsis oculata can be obtained from a preservation organization such as a private or public laboratory.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a gene encoding the protein (A) or (B) (hereinafter also referred to as “KAS gene”), a gene comprising the following DNA (a) or (b) (hereinafter also referred to as “NoKASII gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KAS derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145).
  • the identity with the base sequence of the DNA (a) is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more. More preferably, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is further preferable.
  • DNA (b) one or more (for example, 1 or more and 428 or less, preferably 1 or more and 357 or less, more preferably 1 or more and 285 or less) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, More preferably 1 or more and 214 or less, more preferably 1 or more and 142 or less, more preferably 1 or more and 114 or less, more preferably 1 or more and 71 or less, more preferably 1 or more and 28 or less, Furthermore, DNA encoding a protein having 1 to 14 bases deleted, substituted, inserted or added and having KAS activity is also preferable. Furthermore, the DNA (b) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (a) under a stringent condition and encodes a protein having KAS activity.
  • the method for promoting the expression of the KAS gene can be appropriately selected from conventional methods. For example, a method of introducing the KAS gene into a host, a method of modifying an expression regulatory region (promoter, terminator, etc.) of the gene in a host having the KAS gene on the genome, and the like can be mentioned.
  • a method of introducing the KAS gene into a host a method of modifying an expression regulatory region (promoter, terminator, etc.) of the gene in a host having the KAS gene on the genome, and the like can be mentioned.
  • one that promotes the expression of a gene encoding the target protein is also referred to as a “transformant”, and one that does not promote the expression of the gene encoding the target protein is referred to as “host” or “ Also referred to as “wild strain”.
  • the transformant used in the present invention compared to the host itself, is a product of long chain fatty acids or lipids comprising them (production amount of long chain fatty acids or lipids comprising them, total fatty acids produced) Or the ratio (ratio) of the long chain fatty acid which occupies in all the lipids or the lipid which uses this as a structural component improves significantly.
  • the fatty acid composition in the lipid is modified. Therefore, the present invention using the transformant is a lipid having a specific number of carbon atoms, particularly a long-chain fatty acid or a lipid comprising this as a constituent, preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms or a constituent thereof.
  • Lipids more preferably fatty acids having 18 to 22 carbon atoms or lipids comprising this, more preferably fatty acids having 18 to 20 carbon atoms or lipids comprising these, more preferably 18 or 20 fatty acids or lipids composed thereof, more preferably unsaturated fatty acids having 18 or 20 carbon atoms or lipids composed thereof, more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20 : 4 or C20: 5, or a lipid comprising this component, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or this component More preferably, PUFA having 20 carbon atoms or a lipid constituting the same, more preferably C20: 4 or C20: 5, or a lipid constituting the same, and even more preferably eicosapentaenoic acid (hereinafter referred to as “EPA”).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the ratio of the amount of long-chain fatty acid and the amount of the ester compound to the total amount of fatty acid and the fatty acid ester constituting the ester compound is improved as compared with the host.
  • the long chain fatty acid is preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, and more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms.
  • unsaturated fatty acids having 18 or 20 carbon atoms more preferred are C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, and more preferred are PUFAs having 18 or 20 carbon atoms.
  • PUFA having 20 carbon atoms is more preferable
  • C20: 4 or C20: 5 is more preferable
  • EPA is more preferable.
  • the productivity of fatty acids and lipids in the host and transformant can be measured by the method used in the examples.
  • the KAS gene can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • the KAS gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • services such as Invitrogen can be used.
  • It can also be obtained by cloning from Nannochloropsis oculata.
  • Nannochloropsis oculata NIES-2145 used in the examples can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing the KAS gene into the host by a conventional method. Specifically, it can be prepared by preparing a recombinant vector or gene expression cassette capable of expressing the KAS gene in a host cell, introducing it into the host cell, and transforming the host cell.
  • the host for the transformant can be appropriately selected from those usually used.
  • hosts that can be used in the present invention include microorganisms (including algae and microalgae), plants, and animals. From the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid, the host is preferably a microorganism or a plant, more preferably a microorganism, and even more preferably a microalgae.
  • the microorganism may be either prokaryotic, eukaryotic, Escherichia (Escherichia) genus microorganisms or Bacillus (Bacillus) genus microorganisms, Synechocystis (Synechocystis) microorganism of the genus, Synechococcus (Synechococcus) genus microorganism of Prokaryotes or eukaryotic microorganisms such as yeast and filamentous fungi can be used.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • red yeast Rhodosporidium toruloides
  • Mortierella sp Mortierella sp.
  • Chlamydomonas Chlamydomonas
  • Chlorella Chlorella
  • Faye Oda Kuti ram Phaeodactylum
  • Nan'nokuroro Algae of the genus Psis are preferred, and algae of the genus Nannochloropsis are more preferred.
  • Nannochloropsis gaditana examples include Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica Examples thereof include Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • Arabidopsis thaliana As the plant body, Arabidopsis thaliana , Brassica napus , Brassica rapa , Cocos nucifera , Palm ( Elaeis guineensis ), caffe, soybean, from the viewpoint of high lipid content in seeds ( Glycine max ), corn ( Zea mays ), rice ( Oryza sativa ), sunflower ( Helianthus annuus ), camphor ( Cinnamomum camphora ), or jatropha ( Jatropha curcas ) are preferable, and Arabidopsis is more preferable.
  • a gene capable of introducing a gene encoding a target protein into a host and expressing the gene in a host cell I just need it.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • an expression vector that can be preferably used in the present invention, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pSTV vector (Takara Bio), pUC vector (Takara Shuzo), pET vector (Takara Bio), pGEX vector (GE Healthcare), pCold vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 ( Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15 (2), p.
  • pBR322 (Takara Bio), pRS403 (Stratagene), and pMW218 / 219 (Nippon Gene) It is done.
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • P66 Cholamydomonas Center
  • P-322 Cholamydomonas Center
  • pPha-T1 Yangmin Gong, et al., Journal of Basic Microbiology, 2011, vol.
  • pJET1 manufactured by Cosmo Bio
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis
  • pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • pJET1 is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • a host can also be transformed with a DNA fragment (gene expression cassette) comprising a target gene, a promoter and a terminator.
  • Examples of the DNA fragment include a DNA fragment amplified by PCR and a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme.
  • pRI vectors manufactured by Takara Bio Inc.
  • pBI vectors manufactured by Clontech
  • IN3 vectors manufactured by Implanta Innovations
  • the host is Arabidopsis thaliana
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated in the expression vector
  • Promoters that can be preferably used in the present invention can be induced by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Promoters related to various derivatives Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosil virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg, tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin promoter) etc.), rape or oilseed rape derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoters, Nannochloropsis from the genus violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene promoter VCP1 promoter, VCP2 promoter) (Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • Nannochloropsis lipid droplet surface protein gene promoter
  • the promoter of a violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene or the promoter of an oleosin-like protein LDSP gene derived from the genus Nannochloropsis can be preferably used.
  • the type of selectable marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, and hygromycin resistance genes. Furthermore, a gene defect associated with auxotrophy can be used as a selection marker gene.
  • transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc. .
  • transformation methods using calcium ions For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc.
  • transformation can also be carried out using the electroporation method described in Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012 and the like.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • a drug resistance gene acquired by a transformant as a result of introduction of a drug resistance gene into a host cell together with a target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can be confirmed by a PCR method using a genome as a template.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • the expression regulatory region of the gene is modified to promote the expression of the KAS gene, thereby improving the productivity of long-chain fatty acids or lipids comprising this. be able to.
  • Examples of the method for modifying the expression regulatory region include promoter replacement.
  • the expression of the KAS gene can be promoted by replacing the promoter of the gene (hereinafter also referred to as “KAS promoter”) with a promoter having higher transcriptional activity.
  • KAS promoter the promoter of the gene
  • the NoKASII gene is present immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23
  • a promoter region is present in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the promoter used for replacement of the KAS promoter is not particularly limited, and can be appropriately selected from those having higher transcription activity than the KAS promoter and suitable for the production of long-chain fatty acids or lipids comprising them.
  • a tubulin promoter a heat shock protein promoter
  • the promoter of the above-mentioned violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene VCP1 promoter, VCP2 promoter
  • an oleosin-like protein derived from the genus Nannochloropsis The promoter of the LDSP gene (SEQ ID NO: 6) can be preferably used.
  • the promoter of the violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene or the promoter of the LDSP gene is more preferred, and the promoter of the LDSP gene is even more preferred.
  • the above-described promoter modification can be performed according to a conventional method such as homologous recombination. Specifically, a linear DNA fragment containing upstream and downstream regions of the target promoter and containing another promoter instead of the target promoter is constructed, and this is incorporated into the host cell, and the target promoter of the host genome Two homologous recombination occurs at the upstream and downstream side of. As a result, the target promoter on the genome is replaced with another promoter fragment, and the promoter can be modified.
  • a method for modifying a target promoter by homologous recombination is described in, for example, Besher et al., Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p.
  • the transformant of the present invention preferably promotes expression of a gene encoding TE (hereinafter also referred to as “TE gene”) in addition to the gene encoding the protein (A) or (B).
  • TE is an enzyme that hydrolyzes the thioester bond of acyl-ACP synthesized by a fatty acid synthase such as KAS to produce free fatty acid.
  • the fatty acid synthesis on the ACP is completed by the action of TE, and the cut fatty acid is subjected to synthesis of PUFA, triacylglycerol (hereinafter also referred to as “TAG”) and the like.
  • the TE that can be used in the present invention may be a protein having acyl-ACP thioesterase activity (hereinafter also referred to as “TE activity”).
  • TE activity refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • TE has a plurality of TEs having different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds of the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP.
  • TE is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • introduction of a gene encoding TE, preferably a gene encoding TE having substrate specificity for long-chain acyl-ACP is effective. . By introducing such a gene, the productivity of long-chain fatty acids can be further improved.
  • TE that can be used in the present invention can be appropriately selected from normal TE and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • Arabidopsis-derived FatA (SEQ ID NO: 24), Arabidopsis-derived FatB (SEQ ID NO: 25), Mangosteen ( Garcinia mangostana ) -derived FatA (SEQ ID NO: 26), Nannochloropsis gadytana-derived TE (SEQ ID NO: 27), Nannochloropsis Oculata-derived TE (SEQ ID NO: 28 or 30), Nannochloropsis granulata-derived TE (SEQ ID NO: 29), Escherichia coli-derived tesA (SEQ ID NO: 31) and the like can be used.
  • the transformant which promoted the expression of TE gene can be produced by a conventional method.
  • a transformant is obtained by a method of introducing a TE gene into a host, a method of modifying an expression regulatory region of the gene in a host having the TE gene on the genome, etc. Can be produced.
  • the transformant of the present invention includes a gene encoding desaturase (hereinafter also referred to as “desaturase gene”) and a gene encoding elongase (hereinafter referred to as “desaturase gene”). It is also preferred that the expression of at least one gene selected from the group consisting of “elongase gene” is also promoted.
  • desaturase gene a gene encoding desaturase
  • elongase gene elongase gene
  • the desaturase and elongase that can be used in the present invention can be appropriately selected from ordinary desaturases and elongases, and proteins functionally equivalent to them according to the type of the host.
  • Nannochloropsis-derived desaturase and elongase described in Patent Documents 1 to 3 can be preferably used.
  • Examples of desaturases that can be used in the present invention include ⁇ 12-desaturase (hereinafter also referred to as “ ⁇ 12-DES”), ⁇ 6-desaturase (hereinafter also referred to as “ ⁇ 6-DES”), ⁇ 3-desaturase (hereinafter referred to as “ ⁇ 3- DES), ⁇ 5-desaturase (hereinafter also referred to as “ ⁇ 5-DES”), and ⁇ 9-desaturase (hereinafter also referred to as “ ⁇ 9-DES”).
  • these desaturases may be used alone or in combination of two or more.
  • ⁇ 12-DES means a protein (enzyme) that catalyzes a reaction in which an unsaturated bond is introduced at the ⁇ 12 position of oleic acid to produce linoleic acid.
  • ⁇ 12-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 12-DES activity ” means an activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 12 position of oleic acid. Whether a protein has ⁇ 12-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 12-DES synthetic gene-deficient strain.
  • ⁇ 12-DES DNA linking a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into a ⁇ 12-DES synthetic gene-deficient strain and examining the production of linoleic acid.
  • ⁇ 12-DES or a cell disruption solution containing the same is prepared, reacted with a reaction solution containing oleic acid, oleoyl CoA, etc., and a decrease in the amount of oleic acid or an increase in the amount of linoleic acid is measured according to a conventional method. It can be confirmed with.
  • ⁇ 12-DES that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from ordinary ⁇ 12-DES and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • ⁇ 12-DES derived from Nannochloropsis oculata (hereinafter also referred to as “No ⁇ 12-DES”) (SEQ ID NO: 32) and ⁇ 12-DES derived from Nannochloropsis gaditana (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 12-DES”). (SEQ ID NO: 34) and the like.
  • the identity with the amino acid sequence of No ⁇ 12-DES or Ng ⁇ 12-DES is 60% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more. )
  • a protein having ⁇ 12-DES activity can also be used.
  • the gene encoding No ⁇ 12-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 33. And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 12-DES activity.
  • the gene encoding Ng ⁇ 12-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 12-DES activity.
  • ⁇ 6-DES means a protein (enzyme) that catalyzes a reaction in which an unsaturated bond is introduced at the ⁇ 6 position of linoleic acid to produce ⁇ -linolenic acid.
  • ⁇ 6-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 6-DES activity ” means an activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 6 position of linoleic acid. Whether a protein has ⁇ 6-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 6-DES synthetic gene-deficient strain.
  • ⁇ 6-DES DNA linked with a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into a ⁇ 6-DES synthetic gene-deficient strain and examining the production of ⁇ -linolenic acid.
  • ⁇ 6-DES or a cell disruption solution containing the same is prepared and reacted with a reaction solution containing linoleic acid, linoleoyl CoA, etc., and a decrease in the amount of linoleic acid or an increase in the amount of ⁇ -linolenic acid is measured according to a conventional method. This can be confirmed.
  • ⁇ 6-DES that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from ordinary ⁇ 6-DES and proteins functionally equivalent to them according to the type of host.
  • ⁇ 6-DES derived from Nannochloropsis oculata hereinafter also referred to as “No ⁇ 6-DES”
  • Ng ⁇ 6-DES ⁇ 6-DES derived from Nannochloropsis gaditana
  • the identity with the amino acid sequence of No ⁇ 6-DES or Ng ⁇ 6-DES is 60% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • the gene encoding No ⁇ 6-DES has a gene comprising a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 37 or an identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 37 of 60% or more (preferably 70% or more) And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 6-DES activity.
  • the gene encoding Ng ⁇ 6-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 6-DES activity.
  • ⁇ 3-DES refers to a protein (enzyme) that catalyzes a reaction that introduces an unsaturated bond at the ⁇ 3 position of arachidonic acid to produce EPA.
  • ⁇ 3-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 3-DES activity ””
  • ⁇ 3-DES activity means the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 3 position of arachidonic acid.
  • the presence of -DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 3-DES synthetic gene-deficient strain, or DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in a host cell.
  • ⁇ 3-DES can be confirmed by introducing ⁇ 3-DES into a synthetic gene-deficient strain and examining the production of EPA, or by preparing a cell lysate containing ⁇ 3-DES or a arachidonic acid derivative (thioester compound with CoA, This can be confirmed by measuring the decrease in the amount of arachidonic acid or the increase in the amount of EPA according to a conventional method.
  • the ⁇ 3-DES that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from normal ⁇ 3-DES and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • ⁇ 3-DES derived from Nannochloropsis oculata (hereinafter also referred to as “No ⁇ 3-DES”) (SEQ ID NO: 40) or ⁇ 3-DES derived from Nannochloropsis gaditana (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 3-DES”). (SEQ ID NO: 42) and the like.
  • the identity with the amino acid sequence of No ⁇ 3-DES or Ng ⁇ 3-DES is 60% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.
  • a protein having an ⁇ 3-DES activity can also be used.
  • the identity with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 is 60% or more (preferably 70% or more More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 3-DES activity.
  • the gene encoding Ng ⁇ 3-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 3-DES activity.
  • ⁇ 5-DES means a protein (enzyme) that catalyzes a reaction that introduces an unsaturated bond at the ⁇ 5 position of dihomo- ⁇ -linolenic acid to produce arachidonic acid.
  • ⁇ 5-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 5-DES activity ”” ”means the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 5 position of dihomo- ⁇ -linolenic acid.
  • Whether a protein has ⁇ 5-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a strain lacking a ⁇ 5-DES synthetic gene, or a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell. DNA can be confirmed by introducing DNA into the ⁇ 5-DES synthetic gene-deficient strain and examining the production of arachidonic acid, or by preparing a cell disruption solution containing ⁇ 5-DES or this and dihomo- ⁇ -linolene.
  • ⁇ 5-DES that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from ordinary ⁇ 5-DES and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • ⁇ 5-DES derived from Nannochloropsis oculata (hereinafter also referred to as “No ⁇ 5-DES”) (SEQ ID NO: 44) or ⁇ 5-DES derived from Nannochloropsis gaditana (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 5-DES”) (SEQ ID NO: 46) and the like.
  • Ng ⁇ 5-DES ⁇ 5-DES derived from Nannochloropsis gaditana
  • the identity with the amino acid sequence of No ⁇ 5-DES or Ng ⁇ 5-DES is 60% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • a protein having ⁇ 5-DES activity can also be used.
  • the gene encoding No ⁇ 5-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 5-DES activity.
  • the gene encoding Ng ⁇ 5-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 47 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 47 More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 5-DES activity.
  • ⁇ 9-DES refers to a protein (enzyme) that catalyzes a reaction in which an unsaturated bond is introduced at the ⁇ 9 position of stearic acid (hereinafter also referred to as “C18: 0”) to produce oleic acid.
  • C18: 0 stearic acid
  • ⁇ 9-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 9-DES activity ””means the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 9 position of stearic acid.
  • the presence of -DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 9-DES synthetic gene-deficient strain, or DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell.
  • ⁇ 9-DES that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from ordinary ⁇ 9-DES and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • ⁇ 9-DES derived from Nannochloropsis oculata (hereinafter also referred to as “No ⁇ 9-DES”) (SEQ ID NO: 48)
  • Ng ⁇ 9-DES ⁇ 9-DES derived from Nannochloropsis gaditana
  • SEQ ID NO: 50 the identity with the amino acid sequence of No ⁇ 9-DES or Ng ⁇ 9-DES is 60% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • a protein having ⁇ 9-DES activity can also be used.
  • the identity with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 is 60% or more (preferably 70% or more And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 9-DES activity.
  • the gene encoding Ng ⁇ 9-DES has a identity of 60% or more (preferably 70% or more) with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 51 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 51 And more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ⁇ 9-DES activity.
  • transformants in which the expression of these desaturase genes and elongase genes are promoted can be prepared by conventional methods. For example, in the same manner as the method for promoting the expression of the KAS gene described above, a method for introducing a gene encoding desaturase or elongase into a host, an expression control region of the gene in a host having a gene encoding desaturase or elongase on the genome. A transformant can be produced by a modification method or the like.
  • productivity of long-chain fatty acids or lipids comprising the same is improved as compared with a host in which expression of the gene encoding the protein (A) or (B) is not promoted. is doing. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the long-chain fatty acid or a lipid containing this as a constituent component is recovered from the obtained culture or growth product, the long-chain fatty acid or the constituent component thereof is recovered. Can be produced efficiently.
  • “culture” refers to the culture solution and transformant after culturing
  • growth refers to the transformant after growth.
  • the culture conditions of the transformant of the present invention can be appropriately selected depending on the host, and culture conditions usually used for the host can be used. From the viewpoint of fatty acid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, glucose or the like may be added to the medium as a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • the Escherichia coli When Escherichia coli is used as a host, the Escherichia coli can be cultured, for example, in LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day.
  • the culture of Arabidopsis thaliana can be performed, for example, at a temperature of 20 to 25 ° C. in soil, continuously irradiated with white light, or under light conditions such as 16 hours of light and 8 hours of dark. Can be cultivated monthly.
  • the culture medium may be based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium may be used.
  • the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium.
  • the amount of transformant to be inoculated into the medium can be appropriately selected, and is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol) per medium from the viewpoint of growth.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the algae is preferably cultured under light irradiation so that photosynthesis is possible. The light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance during light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. It is. Further, the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle, and the light period in 24 hours is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, More preferably, it is 12 hours.
  • the culture of algae is preferably performed in the presence of a gas containing carbon dioxide or a medium containing a carbonate such as sodium bicarbonate so that photosynthesis is possible.
  • concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03 (similar to atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. More preferably, it is 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited.
  • sodium bicarbonate it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids.
  • the content is 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days.
  • the culture may be any of aeration and agitation culture, shaking culture or stationary culture. From the viewpoint of improving aeration, aeration and agitation culture or shaking culture is preferable, and aeration and agitation culture is more preferable.
  • the method for collecting lipid from the culture or growth can be appropriately selected from conventional methods.
  • lipid components can be isolated from the aforementioned culture or growth by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. Can be separated and recovered.
  • oil is recovered from the culture or growth by pressing or extraction, and then general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. is performed to obtain lipids. be able to.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound, from the viewpoint of its availability.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a long-chain fatty acid or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms or an ester compound thereof, from the viewpoint of availability to a surfactant or the like and nutritional viewpoint.
  • a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms or an ester compound thereof is more preferable, a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms or an ester compound thereof is more preferable, and a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof is more preferable.
  • More preferred are unsaturated fatty acids having 18 or 20 carbon atoms or ester compounds thereof, more preferred are C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, or ester compounds thereof, and 18 carbon atoms.
  • 20 PUFAs or ester compounds thereof are more preferred.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably triacylglycerol.
  • Lipids obtained by the production method of the present invention are used as edible, plasticizers, emulsifiers such as cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can do.
  • the present invention further relates to the embodiments described above, and the following methods for producing lipids, methods for improving lipid productivity, methods for modifying the composition of fatty acids produced, proteins, genes, recombinant vectors, organisms, transformants, and A method for producing a transformant is disclosed.
  • a transformant in which expression of a gene encoding the following protein (A) or (B) is promoted is cultured, and a fatty acid, preferably a long-chain fatty acid, more preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms, more preferably Is a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably an unsaturated fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably Is C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms, more preferably C20: 4 or C20: 5, more preferably EPA, or a method for producing a lipid, wherein a lipid comprising this component is produced.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B The identity with the amino acid sequence of the protein (A) is 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92 % Or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and a protein having KAS activity.
  • a long-chain fatty acid that promotes the expression of the gene encoding the protein (A) or (B) and is produced in the cells of the transformant preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms, more preferably carbon Fatty acids with 18 to 22 atoms, more preferably fatty acids with 18 to 20 carbon atoms, more preferably fatty acids with 18 or 20 carbon atoms, more preferably unsaturated fatty acids with 18 or 20 carbon atoms, more preferably C18 : 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms, more preferably C20: 4 or C20: 5, More preferably, EPA, or a method for improving lipid productivity, which improves the productivity of lipids comprising this component.
  • a long-chain fatty acid preferably a long-chain fatty acid, more preferably 18 carbon atoms, produced in cells of the transformant by promoting the expression of the gene encoding the protein (A) or (B).
  • the above fatty acids more preferably fatty acids having 18 to 22 carbon atoms, more preferably fatty acids having 18 to 20 carbon atoms, more preferably fatty acids having 18 or 20 carbon atoms, more preferably 18 or 20 carbon atoms.
  • Unsaturated fatty acids more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, more preferably 18 or 20 carbon atoms, more preferably 20 carbon atoms.
  • C20: 4 or C20: 5, more preferably EPA, or a lipid containing this as a constituent is produced with improved productivity.
  • method of modifying the lipid composition is to alter the composition of the fatty acids or lipids in the fatty acid or in the total lipids.
  • a long-chain fatty acid (preferably occupying the total amount of fatty acid and fatty acid ester constituting the ester compound) by culturing a transformant that promotes expression of the gene encoding the protein (A) or (B) Is a fatty acid having 18 or more carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably a carbon atom.
  • a transformant introduced with a gene encoding the protein (A) or (B) is cultured, and fatty acids, preferably long chain fatty acids, more preferably fatty acids having 18 or more carbon atoms, more preferably carbon atoms.
  • a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably an unsaturated fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms, more preferably C20: 4 or C20: 5 More preferably, EPA, or a method for producing a lipid, wherein a lipid comprising this component is produced.
  • a long chain fatty acid preferably 18 or more carbon atoms, produced in a transformant by introducing a gene encoding the protein (A) or (B) into a host.
  • Fatty acid more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms.
  • Saturated fatty acids more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, more preferably 18 or 20 carbon atoms, more preferably 20 carbon atoms.
  • a long-chain fatty acid preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms, produced by introducing a gene encoding the protein (A) or (B) into a transformant and produced in the cells of the transformant More preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably an unsaturated fatty acid having 18 or 20 carbon atoms.
  • a long-chain fatty acid (preferably a carbon atom) that cultivates a transformant introduced with a gene encoding the protein (A) or (B) and occupies the total amount of fatty acid and fatty acid ester constituting the ester compound
  • a fatty acid having a number of 18 or more, more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms, more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms, more preferably 18 or 20 carbon atoms.
  • the protein (B) has one or more, preferably 1 to 142, more preferably 1 to 118, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (A). 95 or less, more preferably 1 or more and 71 or less, more preferably 1 or more and 47 or less, more preferably 1 or more and 38 or less, more preferably 1 or more and 23 or less, more preferably 1 or more.
  • the identity of the base sequence of the DNA (a) is 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92 % Or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and the DNA encoding the protein (A) or (B) having KAS activity.
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 or more and 428 or less, more preferably 1 or more and 357 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (a).
  • ⁇ 14> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the proteins (A) and (B) are KAS having long-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity.
  • ⁇ 15> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein expression of a gene encoding TE is promoted in the transformant.
  • ⁇ 16> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein expression of a gene encoding a desaturase is promoted in the transformant.
  • ⁇ 17> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16>, wherein a gene encoding a desaturase is introduced into the transformant.
  • ⁇ 18> The item ⁇ 16> or ⁇ 17>, wherein the desaturase is at least one desaturase selected from the group consisting of ⁇ 12-DES, ⁇ 6-DES, ⁇ 3-DES, ⁇ 5-DES, and ⁇ 9-DES.
  • the method of. ⁇ 19> The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 or 34, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 or 34 is 60% or more, preferably 70% or more, The method according to ⁇ 18> above, which is a protein having an amino acid sequence of 80% or more, more preferably 90% or more, and having ⁇ 12-DES activity.
  • the gene encoding ⁇ 12-DES has 60% identity with the gene consisting of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or 35, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or 35.
  • the above ⁇ 18> which is a gene consisting of DNA encoding a protein having a base sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more and more preferably ⁇ 12-DES activity Alternatively, the method according to ⁇ 19>.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 or 38, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 or 38 is 60% or more, preferably 70% or more,
  • the gene encoding ⁇ 6-DES has 60% identity with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 or 39, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 or 39
  • the above ⁇ 18> which is a gene consisting of DNA encoding a protein having a nucleotide sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 90% or more, and having ⁇ 6-DES activity.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 or 42, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 or 42 is 60% or more, preferably 70% or more,
  • the gene encoding the ⁇ 3-DES is 60% identical to the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 or 43, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 or 43
  • the above ⁇ 18> which is a gene comprising a DNA comprising a base sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and encoding a protein having ⁇ 3-DES activity.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or 46, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or 46 is 60% or more, preferably 70% or more,
  • the gene encoding ⁇ 5-DES has 60% identity with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 or 47, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 or 47.
  • the above ⁇ 18> which is a gene consisting of a DNA comprising a base sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and encoding a protein having ⁇ 5-DES activity.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or 50, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or 50, the ⁇ 9-DES is 60% or more, preferably 70% or more,
  • the gene encoding ⁇ 9-DES has 60% identity with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 or 51, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 or 51.
  • the above ⁇ 18> which is a gene consisting of DNA encoding a protein having a base sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more and more preferably ⁇ 9-DES activity.
  • ⁇ 29> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 28>, wherein in the transformant, expression of a gene encoding an elongase is promoted.
  • ⁇ 30> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 29>, wherein the transformant is a microorganism or a plant.
  • the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis, more preferably Nannochloropsis oculata.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the lipid is a long chain fatty acid or an ester compound thereof, preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a carbon atom.
  • a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms or an ester compound thereof more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably an unsaturated fatty acid having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, or an ester compound thereof, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms or a compound thereof Ester compounds, more preferably C20: 4 young C20: 5, or its ester compound, even more preferably from, EPA or its ester compound, wherein ⁇ 1> to any one method according to ⁇ 33>. ⁇ 35> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 34>, wherein the long-chain fatty acid is a long-chain polyunsaturated fatty acid.
  • ⁇ 36> The protein (A) or (B) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 35>.
  • ⁇ 37> A gene encoding the protein according to ⁇ 36>.
  • ⁇ 38> A gene comprising the DNA (a) or (b) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 35>.
  • ⁇ 39> A recombinant vector containing the gene according to ⁇ 37> or ⁇ 38>.
  • ⁇ 40> A transformant that promotes the expression of the gene according to ⁇ 37> or ⁇ 38>.
  • ⁇ 41> The transformant according to ⁇ 40> above, wherein the productivity of the long-chain fatty acid or a lipid comprising the long-chain fatty acid is improved as compared with the host.
  • ⁇ 42> A transformant obtained by introducing the gene according to ⁇ 37> or ⁇ 38> or the recombinant vector according to ⁇ 39> into a host.
  • ⁇ 43> A method for producing a transformant, wherein the gene according to ⁇ 37> or ⁇ 38> or the recombinant vector according to ⁇ 39> is introduced into a host.
  • ⁇ 44> The transformant according to any one of ⁇ 40> to ⁇ 43> or a method for producing the same, wherein expression of a gene encoding TE is promoted.
  • ⁇ 45> The transformant according to any one of ⁇ 40> to ⁇ 44> or a method for producing the same, wherein expression of a gene encoding a desaturase is promoted.
  • ⁇ 46> The transformant according to any one of ⁇ 40> to ⁇ 45> or a method for producing the transformant, wherein a gene encoding desaturase is introduced into the transformant.
  • ⁇ 47> The ⁇ 45> or ⁇ 46> item, wherein the desaturase is at least one desaturase selected from the group consisting of ⁇ 12-DES, ⁇ 6-DES, ⁇ 3-DES, ⁇ 5-DES, and ⁇ 9-DES. Or a method for producing the same.
  • ⁇ 48> The ⁇ 45> to ⁇ 47, wherein the desaturase or a gene encoding a desaturase is the desaturase defined in any one of the items ⁇ 19> to ⁇ 28> or a gene encoding a desaturase. > The transformant of any one of>, or its preparation method.
  • ⁇ 49> The transformant according to any one of ⁇ 40> to ⁇ 48> or a method for producing the same, wherein expression of a gene encoding an elongase is promoted.
  • ⁇ 50> The transformant according to any one of the above ⁇ 40> to ⁇ 49>, wherein the transformant or host is a microorganism or a plant, or a method for producing the transformant.
  • ⁇ 51> The transformant according to ⁇ 50> or the method for producing the same, wherein the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis, more preferably Nannochloropsis oculata.
  • ⁇ 52> The transformant according to ⁇ 50> or the method for producing the same, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 53> The transformant according to ⁇ 50> or the method for producing the same, wherein the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the lipid is a long chain fatty acid or an ester compound thereof, preferably a fatty acid having 18 or more carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 18 to 22 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a carbon atom.
  • a fatty acid having 18 to 20 carbon atoms or an ester compound thereof more preferably a fatty acid having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably an unsaturated fatty acid having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably C18: 1, C18: 2, C18: 3, C20: 4 or C20: 5, or an ester compound thereof, more preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms or a compound thereof Ester compounds, more preferably C20: 4 young C20: 5, or its ester compound, even more preferably from, EPA or its ester compound, use of the ⁇ 54> above, wherein. ⁇ 56> The use according to ⁇ 55>, wherein the long-chain fatty acid is a long-chain polyunsaturated fatty acid.
  • Example 1 Production of transformant in which NoKASII gene was introduced into Nannochloropsis oculata, and production of fatty acid by transformant
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 8 and primer number 9 and the primer pair of primer number 10 and primer number 11 shown in Table 1, respectively, and the zeocin resistance gene and tubulin promoter sequence Each was amplified.
  • PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 12 and primer number 13 shown in Table 1 to amplify the heat shock protein terminator sequence (SEQ ID NO: 5).
  • PCR was carried out using the plasmid vector pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template and the primer pair of primer number 14 and primer number 15 shown in Table 1 to amplify the plasmid vector pUC19.
  • This expression plasmid consists of an insert sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 18 and primer number 19 and the primer pair of primer number 20 and primer number 21 shown in Table 1, respectively.
  • Promoter sequence SEQ ID NO: 6
  • zeocin resistance gene expression plasmid As a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 22 and primer number 15 shown in Table 1, and a zeocin resistance gene expression cassette (tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, A fragment consisting of a heat shock protein terminator sequence) and a pUC19 vector sequence was amplified.
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, a NoKASII gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and an pUC19 vector sequence.
  • NoKASII gene expression cassette into Nannochloropsis Using the NoKASII gene expression plasmid as a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 13 and primer number 18 shown in Table 1, and the NoKASII gene expression cassette ( DNA fragment consisting of LDSP promoter sequence, NoKASII gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence). The amplified DNA fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES2145 obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES)
  • NIES2145 obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES)
  • 384 mM sorbitol solution to completely remove salts, and transformed host cells Used as.
  • About 500 ng of the NoKASII gene expression cassette amplified above was mixed with host cells, and electroporation was performed under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm.
  • the mixture was applied to a 2 ⁇ g / mL zeocin-containing f / 2 agar medium and cultured at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions for 3 weeks. From the obtained colonies, the Nannochloropsis oculata strain containing the NoKASII gene expression cassette was selected by the PCR method (two independent lines were obtained).
  • the selected strain was cultured in a medium in which the nitrogen concentration of f / 2 medium was increased 15 times and the phosphorus concentration was increased 5 times (hereinafter referred to as “N15P5 medium”), and cultured with shaking at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under a 12 h / 12 h light / dark condition for 4 weeks to obtain a preculture solution.
  • 20 mL of the preculture was transferred to 18 mL of N15P5 medium, and cultured with shaking for 3 weeks under 25 h, 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions.
  • As a negative control the same experiment was performed on the wild strain Nannochloropsis oculata NIES2145.
  • Nitrogen gas was blown to the chloroform layer thus obtained to dryness, 1 mL of 14% boron trifluoride-methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept at 80 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated saline were added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • 14% boron trifluoride-methanol solution manufactured by SIGMA
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis. Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated. Furthermore, the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the ratio of each fatty acid amount which occupies for the total fatty acid amount was computed.
  • the results (the ratio of each fatty acid amount and the C20: 5 production amount) are shown in Table 2. In the table below, “fatty acid composition (% TFA)” indicates the ratio (weight percent) of each fatty acid to the total fatty acid.
  • the plate After development, the plate is dried, sprayed with 0.1% primulin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in methanol, and then dried with a handy UV lamp UVL-21 (manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.). Minute detected.
  • a handy UV lamp UVL-21 manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.
  • the TAG fraction was scraped off using a toothpick, 1 mL of 14% boron trifluoride-methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated brine were added and stirred vigorously. After standing at room temperature for 10 minutes, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester. The obtained fatty acid methyl ester was subjected to gas chromatography analysis in the same manner as described above. The results are shown in Table 3 as the fatty acid composition.
  • Example 2 Production of Transformant Introducing NoKASII Gene and Desaturase Gene into Nannochloropsis Oculata, and Production of Fatty Acid by Transformant
  • the primer pair of primer number 52 and primer number 53 and the primer pair of primer number 54 and primer number 55 shown in Table 1 were used respectively.
  • PCR was performed to obtain a gene fragment consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a gene fragment consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41, respectively.
  • the obtained amplified fragment was fused with the LDSP promoter sequence, VCP1 terminator sequence, and zeocin resistance gene expression cassette in the same manner as in Example 1, and a No ⁇ 12-DES gene expression plasmid and a No ⁇ 3-DES gene expression plasmid were prepared.
  • This expression plasmid is composed of an LDSP promoter sequence, each desaturase gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence in this order, and a pUC19 vector sequence.
  • the obtained amplified fragments were each fused with a paromomycin-resistant gene fragment to construct a No ⁇ 12-DES gene expression plasmid (paromomycin resistance) and a No ⁇ 3-DES gene expression plasmid (paromomycin resistance).
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, each desaturase gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a paromomycin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence in this order, and a pUC19 vector sequence.
  • the amplified DNA fragments were purified in the same manner as in Example 1, and the purified fragments were electroporated into the transformant NoKASII_line2 (hereinafter also referred to as “NoKASII gene-introduced strain”) prepared in Example 1. Each was introduced. After recovery culture in the same manner as in Example 1, it was applied to an f / 2 agar medium containing 2 ⁇ g / mL zeocin and 100 ⁇ g / mL paromomycin, and light and dark conditions at 25 ° C. under 0.3% CO 2 atmosphere for 12 h / 12 h. For 2 to 3 weeks. From the obtained colonies, Nannochloropsis oculata strains containing various desaturase gene expression cassettes were selected.
  • N15P5 medium a medium in which the nitrogen concentration of the f / 2 medium was increased 5 times and the phosphorus concentration was increased 5 times, and was maintained at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere for 12 hours.
  • N5P5 medium a medium in which the nitrogen concentration of the f / 2 medium was increased 5 times and the phosphorus concentration was increased 5 times, and was maintained at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere for 12 hours.
  • N5P5 medium a medium in which the nitrogen concentration of the f / 2 medium was increased 5 times and the phosphorus concentration was increased 5 times, and was maintained at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere for 12 hours.
  • Shaking culture was performed for 10 days under light and dark conditions.
  • the strain introduced with the NoKASII gene and the No ⁇ 12-DES gene has a reduced ratio of C18: 1 compared to the wild strain (NIES2145), and C18: 2, C18 : 3, C20: 3, C20: 4, and C20: 5 ratios were improved. Furthermore, the ratio of C20: 4 and C20: 5 was further improved by introducing the No ⁇ 12-DES gene into the NoKASII gene-introduced strain (NoKASII).
  • the ratio of C20: 4 decreased and the ratio of C20: 5 improved compared to the wild strain (NIES2145). Furthermore, the ratio of C20: 5 was further improved by introducing the No ⁇ 3-DES gene into the NoKASII gene-introduced strain (NoKASII).
  • a transformant with improved long-chain fatty acid productivity can be produced by promoting the expression of the KAS gene defined in the present invention. And by culturing this transformant, the productivity of long chain fatty acids can be improved.

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Abstract

下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。 （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
　また、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸、特に不飽和結合が複数導入された長鎖多価不飽和脂肪酸（以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。したがって、このようなＰＵＦＡは、栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
　植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル－ＡＣＰ（アシルキャリアプロテイン、acyl carrier protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-ＡＣＰ　synthase、以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS　I、KAS　II、KAS　III、KAS　IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS　IIIは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素原子数２のアセチル－ＡＣＰ（又はアセチル－ＣｏＡ）を炭素原子数４のβ－ケトアシル－ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、KAS　I、KAS　II、及びKAS　IVが関与する。KAS　Iは主に炭素原子数１６のパルミトイル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、KAS　IIは主に炭素原子数１８のステアロイル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、KAS　IVは炭素原子数６～１４の中鎖アシル－ＡＣＰまでの伸長反応に関与するといわれている。
　さらに、炭素原子数１８以上の長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡは、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）によって合成されると言われている。
　前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
　一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、デサチュラーゼやエロンガーゼの強化が有効であると考えられており、様々な生物からこれらの酵素群が同定されている（特許文献１参照）。例えば、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のデサチュラーゼやエロンガーゼが、長鎖脂肪酸の合成に使用できることが知られている（特許文献２及び３参照）。
　このように、油糧生物において所望の長鎖脂肪酸（特にＰＵＦＡ）に富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
国際公開第２０１２／０５２４６８号 国際公開第２０１２／１４９４５７号 米国特許出願公開第２０１２／０２７７４１８号明細書
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）に関する
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に関する。
　さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
　本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体に関する。
　本発明者らは、長鎖脂肪酸の合成に関与する酵素として、藻類の１種であるナンノクロロプシス属の藻類のKASを新たに同定した。そして、このKASの微生物内での発現を促進させた結果、生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の脂質の製造方法によれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本明細書における「脂質」は、中性脂肪（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell.，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）（以下、「NoKASII」ともいう）はKASの１種であり、長鎖脂肪酸の合成に関与するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis　oculata）NIES2145株由来のKASの１つである。
　KASは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は一般的に葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル－ＡＣＰ（又はアセチル－ＣｏＡ）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰが合成される。次いで、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）の作用によってアシル－ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
　脂肪酸合成の第一段階では、アセチル－ＡＣＰ（又はアセチル－ＣｏＡ）とマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β－ケトアシル－ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル－ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル－ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル－ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル－ＡＣＰが合成される。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）はいずれも、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有する。本明細書において「KAS活性」とは、アセチル－ＡＣＰ（又はアセチル－ＣｏＡ）やアシル－ＡＣＰと、マロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
　タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル－ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　KASはその基質特異性によってKAS　I、KAS　II、KAS　III、又はKAS　IVに分類される。KAS　IIIは、炭素原子数２のアセチル－ＡＣＰ（又はアセチル－ＣｏＡ）を基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS　Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル－ＡＣＰを合成する。KAS　IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル－ＡＣＰを合成する。KAS　IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル－ＡＣＰを合成する。
　後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子の発現を促進した形質転換体では、炭素原子数１８や２０の長鎖脂肪酸の生産性が向上する。よって前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、炭素原子数１８以上の長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有する、KAS　II型のKASであると考えられる。また、ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）を用いた局在予測より、前記タンパク質（Ａ）は葉緑体局在型のKASであり、Ｎ末端側のアミノ酸３３残基は葉緑体移行シグナル配列であると考えられる。なお本明細書において「長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性」とは、主に炭素原子数１６以上のアシル－ＡＣＰを基質とし、炭素原子数１８以上の長鎖アシル－ＡＣＰ合成の伸長反応を触媒する活性のことをいう。また本明細書において「長鎖」とは、アシル基の炭素原子数が１８以上、好ましくは炭素原子数が１８又は２０であることをいう。
　KASの長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述するTEを共発現させ、TEのみを発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　前記タンパク質（Ｂ）において、KAS活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４２個以下、好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed　Mutagenesis　System　Mutan-SuperExpress　Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer　TM　Site-Directed　Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis　Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ遺伝子を用いることができる。
　なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（以下、「KAS遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子（以下、「NoKASII遺伝子」ともいう）が挙げられる。
 
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のKAS）をコードする遺伝子の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、KAS活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４２８個以下、好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、さらに好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記KAS遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記KAS遺伝子を宿主に導入する方法、前記KAS遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。
　以下本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性（長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合（比率））が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂質、特に長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はこれを構成する脂質、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、又はこれを構成する脂質、よりさらに好ましくはエイコサペンタエン酸（以下、「EPA」ともいう）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　さらに本発明の形質転換体は、宿主と比較して、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸量及びそのエステル化合物量の比率が向上する。前記長鎖脂肪酸は、炭素原子数１８以上の脂肪酸が好ましく、炭素原子数１８～２２の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８～２０の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８又は２０の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８又は２０の不飽和脂肪酸がより好ましく、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４又はＣ２０：５がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡがより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡがより好ましく、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５がより好ましく、EPAがより好ましい。
　なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　前記KAS遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　前記KAS遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、KAS遺伝子を人工的に合成できる。KAS遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記KAS遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記KAS遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia　coli）、枯草菌（Bacillus　subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis　gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis　salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis　oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis　atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis　maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis　granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis　thaliana）、西洋アブラナ（Brassica　napus）、アブラナ（Brassica　rapa）、ココヤシ（Cocos　nucifera）、パーム（Elaeis　guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine　max）、トウモロコシ（Zea　mays）、イネ（Oryza　sativa）、ヒマワリ（Helianthus　annuus）、クスノキ（Cinnamomum　camphora）、又はヤトロファ（Jatropha　curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）　II　SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et　al.，1986，Plasmid　15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript　II　SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas　Center）、P-322（Chlamydomonas　Center）、pPha-T1（Yangmin　Gong，et　al.，Journal　of　Basic　Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、PCRにより増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid　droplet　surface　protein)遺伝子のプロモーター（Astrid　Vieler,　et　al.,　PLOS　Genetics,　2012;8(11):e1003064.　doi:　10.1371）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor　Radakovits,　et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
　前記KAS遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記KAS遺伝子の発現を促進させることで、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「KASプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記KAS遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoKASII遺伝子が存在しており、配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記KAS遺伝子の発現を促進させることができる。
　KASプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、KASプロモーターよりも転写活性が高く、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
　宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター（配列番号６）を好ましく用いることができる。長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター又はＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがさらにより好ましい。
　前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
　このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher　et　al.，Methods　in　molecular　biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、TEをコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はＰＵＦＡの合成やトリアシルグリセロール（以下、「ＴＡＧ」ともいう）等の合成に供される。そのため、KAS遺伝子に加えてTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　TEは、基質であるアシル－ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEはKASと同様、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子、好ましくは長鎖アシル－ＡＣＰに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の導入が効果的である。このような遺伝子を導入することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、シロイヌナズナ由来FatA（配列番号２４）、シロイヌナズナ由来FatB（配列番号２５）、マンゴスチン（Garcinia　mangostana）由来FatA（配列番号２６）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来TE（配列番号２７）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来TE（配列番号２８又は３０）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来TE（配列番号２９）、大腸菌由来tesA（配列番号３１）などを用いることができる。長鎖アシル－ＡＣＰに対する基質特異性の観点から、シロイヌナズナ由来FatA、マンゴスチン由来FatAがより好ましい。
　また、TE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のKAS遺伝子の発現を促進させる方法と同様、TE遺伝子を宿主に導入する方法、TE遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、デサチュラーゼをコードする遺伝子（以下、「デサチュラーゼ遺伝子」ともいう）、及びエロンガーゼをコードする遺伝子（以下、「エロンガーゼ遺伝子」ともいう）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
　前述したように、炭素原子数１８以上の長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡは、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼやエロンガーゼによって合成されると言われている。そのため、KAS遺伝子に加えデサチュラーゼやエロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるデサチュラーゼやエロンガーゼは、通常のデサチュラーゼやエロンガーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、特許文献１～３記載のナンノクロロプシス由来デサチュラーゼ、エロンガーゼを好ましく用いることができる。
　本発明で用いることができるデサチュラーゼとしては、Δ12-デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう）、Δ6-デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう）、ω3-デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう）、Δ5-デサチュラーゼ（以下、「Δ5-DES」ともいう）、Δ9-デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう）が挙げられる。
　なお本発明において、これらのデサチュラーゼを単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
　本明細書において「Δ12-DES」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入し、リノール酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明で好ましく用いることができるΔ12-DESは、通常のΔ12-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）（配列番号３２）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ12-DES（以下、「NgΔ12-DES」ともいう）（配列番号３４）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ12-DESやNgΔ12-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３３で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３５で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「Δ6-DES」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入し、γ-リノレン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明で好ましく用いることができるΔ6-DESは、通常のΔ6-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）（配列番号３６）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ6-DES（以下、「NgΔ6-DES」ともいう）（配列番号３８）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ6-DESやNgΔ6-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３７で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３９で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「ω3-DES」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入し、EPAを生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう」」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
　本発明で好ましく用いることができるω3-DESは、通常のω3-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）（配列番号４０）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のω3-DES（以下、「Ngω3-DES」ともいう）（配列番号４２）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、Noω3-DESやNgω3-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。Noω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４１で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。Ngω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４３で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「Δ5-DES」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入し、アラキドン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ5-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ5-DES活性」ともいう」」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ5-DES活性を有することは、例えば、Δ5-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ5-DES合成遺伝子欠損株に導入し、アラキドン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ5-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ジホモ-γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いジホモ-γ-リノレン酸量の減少又はアラキドン酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明で好ましく用いることができるΔ5-DESは、通常のΔ5-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ5-DES（以下、「NoΔ5-DES」ともいう）（配列番号４４）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ5-DES（以下、「NgΔ5-DES」ともいう）（配列番号４６）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ5-DESやNgΔ5-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４５で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４７で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「Δ9-DES」とは、ステアリン酸（以下、「C18:0」とも表記する）のΔ9位に不飽和結合を導入し、オレイン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう」」とは、ステアリン酸のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸、ステアロイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン量の増加を測定することで確認できる。
　本発明で好ましく用いることができるΔ9-DESは、通常のΔ9-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）（配列番号４８）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ9-DES（以下、「NgΔ9-DES」ともいう）（配列番号５０）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ9-DESやNgΔ9-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４９で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５１で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　また、これらデサチュラーゼ遺伝子やエロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のKAS遺伝子の発現を促進させる方法と同様、デサチュラーゼ又はエロンガーゼをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、デサチュラーゼ又はエロンガーゼをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率のよく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
　宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養することができる。
　また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培することができる。
　宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
　培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
　培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物が好ましく、炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８～２２の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８～２０の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物がさらに好ましく、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物がより好ましく、EPA又はそのエステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、生産される脂肪酸の組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター、生物、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜４＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸（好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA）量及びそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜８＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸（好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA）量及びそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９２％以上のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
＜１３＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、よりさらに好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有するKASである、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記形質転換体において、TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞前記形質転換体において、デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記形質転換体に導入した、前記＜１＞～＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、前記＜１６＞又は＜１７＞項記載の方法。
＜１９＞前記Δ12-DESが、配列番号３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２０＞前記Δ12-DESをコードする遺伝子が、配列番号３３若しくは３５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３３若しくは３５で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞又は＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞前記Δ6-DESが、配列番号３６若しくは３８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３６若しくは３８で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞～＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
＜２２＞前記Δ6-DESをコードする遺伝子が、配列番号３７若しくは３９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３７若しくは３９で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞～＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
＜２３＞前記ω3-DESが、配列番号４０若しくは４２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４０若しくは４２で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞～＜２２＞のいずれか１項記載の方法。
＜２４＞前記ω3-DESをコードする遺伝子が、配列番号４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４１若しくは４３で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞～＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞前記Δ5-DESが、配列番号４４若しくは４６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４４若しくは４６で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞～＜２４＞のいずれか１項記載の方法。
＜２６＞前記Δ5-DESをコードする遺伝子が、配列番号４５若しくは４７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４５若しくは４７で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞～＜２５＞のいずれか１項記載の方法。
＜２７＞前記Δ9-DESが、配列番号４８若しくは５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４８若しくは５０で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞～＜２６＞のいずれか１項記載の方法。
＜２８＞前記Δ9-DESをコードする遺伝子が、配列番号４９若しくは５１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４９若しくは５１で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞～＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞前記形質転換体において、エロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３０＞前記形質転換体が微生物又は植物である、前記＜１＞～＜２９＞のいずれか１項記載の方法。
＜３１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３４＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５又はそのエステル化合物、よりさらに好ましくはEPA又はそのエステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜３３＞のいずれか１項記載の方法。
＜３５＞前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、前記＜１＞～＜３４＞のいずれか１項記載の方法。
＜３６＞前記＜１＞～＜３５＞のいずれか１項で規定した、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
＜３７＞前記＜３６＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜３８＞前記＜１＞～＜３５＞のいずれか１項で規定した、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子。
＜３９＞前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
＜４０＞前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
＜４１＞長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している、前記＜４０＞項記載の形質転換体。
＜４２＞前記＜３７＞若しくは＜３８＞項記載の遺伝子、又は前記＜３９＞項記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜４３＞前記＜３７＞若しくは＜３８＞項記載の遺伝子、又は前記＜３９＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜４４＞TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞～＜４３＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４５＞デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞～＜４４＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４６＞デサチュラーゼをコードする遺伝子を形質転換体に導入した、前記＜４０＞～＜４５＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４７＞前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、前記＜４５＞又は＜４６＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４８＞前記デサチュラーゼ、又はデサチュラーゼをコードする遺伝子が、前記＜１９＞～＜２８＞項のいずれか１項で規定したデサチュラーゼ、又はデサチュラーゼをコードする遺伝子、である、前記＜４５＞～＜４７＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４９＞エロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞～＜４８＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５０＞前記形質転換体又は宿主が微生物又は植物である、前記＜４０＞～＜４９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５４＞脂質を製造するための、前記＜３６＞～＜５３＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜５５＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８～２２の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８～２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５又はそのエステル化合物、よりさらに好ましくはEPA又はそのエステル化合物、を含む、前記＜５４＞項記載の使用。
＜５６＞前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、前記＜５５＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
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実施例１　NoKASII遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　ゼオシン耐性遺伝子（配列番号３）、及び文献（Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）に記載されている、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のチューブリンプロモーター配列（配列番号４）を人工合成した。
　合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号８及びプライマー番号９のプライマー対、並びにプライマー番号１０及びプライマー番号１１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号５）を増幅した。
　さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）NoKASII遺伝子の取得、及びNoKASII遺伝子発現用プラスミドの構築
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III　First-Strand　Synthesis　SuperMix　for　qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対、並びにプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対をそれぞれ用いたPCRを行い、ＬＤＳＰのプロモーター配列（配列番号６）及びＶＣＰ１（violaxanthin/chlorophyll　a-binding　protein　1）のターミネーター配列（配列番号７）を取得した。
　さらに、前述のゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１５のプライマー対を用いたPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19ベクター配列からなる断片を増幅した。
　これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoKASII遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現プラスミドは、ＬＤＳＰプロモーター配列、NoKASII遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）NoKASII遺伝子発現カセットのナンノクロロプシスへの導入
　前記NoKASII遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１８のプライマー対を用いたPCRを行い、NoKASII遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、NoKASII遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
　増幅したＤＮＡ断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoKASII遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）にて１日間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3週間培養した。得られたコロニーの中から、NoKASII遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCR法により選抜した（独立した２ラインを取得）。
（４）形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン50μLを添加後、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、14%三フッ化ホウ素－メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加して激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent　technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W　Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃　保持0.5分→100～250℃（20℃/min昇温）→250℃保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：50：1）
注入量：5μＬ
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃
　脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
　その結果（各脂肪酸量の割合、及びＣ２０：５生産量）を表２に示す。なお、以下の表において、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸量の割合（重量パーセント）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　表２から明らかなように、NoKASII遺伝子発現カセットを導入し、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体２株（NoKASII_line1、NoKASII_line2）はいずれも、野生株（NIES2145）と比べ、生産された全脂肪酸の総量に対する、長鎖脂肪酸（Ｃ１８脂肪酸、及びＣ２０脂肪酸）の含有率が有意に増加した。特に、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５（EPA）の含有率がより一層増加していた。
　また、Ｃ２０：５生産量の結果から、NoKASII_line1、NoKASII_line2のいずれの株においても、野生株と比較してEPAの生産性が向上していた。
（５）ＴＡＧの分画、及びＴＡＧ中の構成脂肪酸の分析
　前述の培養液1mLに、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、クロロホルム20μLに溶解した。
　このようにして得られた脂質抽出液全量、及び３種類の標準溶液｛トリミリスチン（和光純薬工業社製）、ジオレイン酸グリセロール（和光純薬工業社製）、オレイン酸（和光純薬工業社製）、10mg/mLクロロホルム溶液｝3μLをそれぞれTLCプレートシリカゲル60F254（メルク社製）上にスポットし、TLC展開槽DT-150（三菱化学メディエンス社製）を用い、展開溶媒（ヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸＝42：28：0.3（体積比））で約15分展開した。展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン（和光純薬工業社製）を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21（相互理化学硝子製作所社製）でＴＡＧ画分を検出した。
　爪楊枝を用いてＴＡＧ画分を掻き取り、14%三フッ化ホウ素－メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　前述の方法と同様の方法にて、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を脂肪酸組成として表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　表３から明らかなように、NoKASII遺伝子発現カセットを導入し、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体２株（NoKASII_line1, NoKASII_line2）はいずれも、野生株（NIES2145）と比べ、ＴＡＧ中の長鎖脂肪酸（Ｃ１８脂肪酸、及びＣ２０脂肪酸）の含有率が有意に増加した。特に、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５（EPA）の含有率がより一層増加していた。なかでも、Ｃ２０：４及びＣ２０：５などのＰＵＦＡの含有率の増加が特に顕著であった。
　さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータは生育期にEPAを生産するものの、油脂蓄積期ではEPAは生産されない。よって、蓄積脂質であるＴＡＧ中には、EPAは約4%程度しか存在しないことが知られている。これに対して、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体ではTAG中にもEPAが多く取り込まれ、EPAの含有率が最大で19.5%にまで達した。
実施例２　NoKASII遺伝子及びデサチュラーゼ遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）デサチュラーゼ遺伝子の取得、及びデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）の構築
　実施例１で取得したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号５２及びプライマー番号５３のプライマー対、並びにプライマー番号５４及びプライマー番号５５のプライマー対、をそれぞれ用いたPCRを行い、配列番号３３に示す塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号４１に示す塩基配列からなる遺伝子断片、をそれぞれ取得した。
　得られた増幅断片を、実施例１と同様の方法で、ＬＤＳＰプロモーター配列、VCP1ターミネーター配列、及びゼオシン耐性遺伝子発現カセットと融合し、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ構築した。なお、本発現プラスミドは、ＬＤＳＰプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
　人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号５６）を鋳型として、表１に示すプライマー番号５７及びプライマー番号５８のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。
　また、前記NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表４に示すプライマー番号５９及びプライマー番号６０のプライマー対を用いたPCRを行った。得られた増幅断片をそれぞれパロモマイシン耐性遺伝子断片と融合し、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）をそれぞれ構築した。なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）のNoKASII遺伝子導入株への導入
　前記NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１８のプライマー対を用いたPCRを行い、デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
　増幅したＤＮＡ断片を、実施例１と同様の方法でそれぞれ精製し、実施例１で作製した形質転換体NoKASII_line2（以降、「NoKASII遺伝子導入株」ともいう）に、精製した断片をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入した。
　実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLゼオシン及び100μg/mLパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株を選抜した。
（４）形質転換体の培養、脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３～４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１０日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株及びNoKASII遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
　得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　表４から明らかなように、NoKASII遺伝子及びNoΔ12-DES遺伝子を導入した株（NoKASII + NoΔ12-DES）では、野生株（NIES2145）と比べ、C18:1の割合が減少し、C18:2、C18:3、C20:3、C20:4、及びC20:5の割合が向上していた。さらに、NoKASII遺伝子導入株（NoKASII）にNoΔ12-DES遺伝子を導入することで、C20:4及びC20:5の割合がより一層向上していた。
　また、NoKASII遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（NoKASII + Noω3-DES）では、野生株（NIES2145）と比べ、C20:4の割合が減少し、C20:5の割合が向上していた。さらに、NoKASII遺伝子導入株（NoKASII）にNoω3-DES遺伝子を導入することで、C20:5の割合がより一層向上していた。
　これらの結果より、NoKASII遺伝子に加えデサチュラーゼ遺伝子の発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産性がより一層向上することが明らかになった。
　以上のように、本発明で規定するKAS遺伝子の発現を促進させることで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2015年8月5日に日本国で特許出願された特願2015-154771に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (29)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸及びそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  7. 　前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９２％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
  9. 　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、長鎖β－ケトアシル－ＡＣＰ合成活性を有するβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼである、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　前記形質転換体において、デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記形質転換体に導入した、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 　前記形質転換体が微生物又は植物である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記微生物が微細藻類である、請求項１２記載の方法。
  14. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１３記載の方法。
  15. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１２記載の方法。
  16. 　前記脂質が、炭素原子数１８～２２の長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物を含む、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. 　前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、請求項１～１６のいずれか１記載の方法。
  18. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、又は下記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）からなる遺伝子を含有する組換えベクター。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
  19. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、又は下記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）からなる遺伝子の発現を促進させ、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している、形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
  20. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、下記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）からなる遺伝子、又は請求項１８記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記 タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
  21. 　デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１９又は２０記載の形質転換体。
  22. 　デサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した、請求項１９～２１のいずれか１項記載の形質転換体。
  23. 　前記形質転換体又は宿主が微生物又は植物である、請求項１９～２２のいずれか１項記載の形質転換体。
  24. 　前記微生物が微細藻類である、請求項２３記載の形質転換体。
  25. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項２４記載の形質転換体。
  26. 　前記微生物が大腸菌である、請求項２３記載の形質転換体。
  27. 　脂質を製造するための、請求項１８～２６のいずれか１項記載の組換えベクター、又は形質転換体の使用。
  28. 　前記脂質が、炭素原子数１８～２２の脂肪酸又はそのエステル化合物を含む、請求項２７記載の使用。
  29. 　前記脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、請求項２８記載の使用。
     
     
     
     
     
     
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