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WO2017164349A1 - ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント含有医薬組成物 - Google Patents

ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント含有医薬組成物 Download PDF

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WO2017164349A1
WO2017164349A1 PCT/JP2017/011910 JP2017011910W WO2017164349A1 WO 2017164349 A1 WO2017164349 A1 WO 2017164349A1 JP 2017011910 W JP2017011910 W JP 2017011910W WO 2017164349 A1 WO2017164349 A1 WO 2017164349A1
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WO
WIPO (PCT)
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fragment
human ngf
ngf antibody
antibody fab
pharmaceutical composition
Prior art date
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PCT/JP2017/011910
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English (en)
French (fr)
Inventor
彩乃 山本
亮儀 筑紫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Astellas Pharma Inc
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Priority to CN201780019929.0A priority patent/CN108883177A/zh
Priority to EP17770389.9A priority patent/EP3434283A4/en
Priority to RU2018137495A priority patent/RU2018137495A/ru
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    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a stable pharmaceutical composition
  • a stable pharmaceutical composition comprising an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment conjugated with polyethylene glycol.
  • Nerve growth factor is one of the humoral factors collectively called neurotrophic factor, and plays an important role in the generation, differentiation and maintenance of neurons in vivo. Yes.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment conjugated with polyethylene glycol (hereinafter referred to as “PEGylation” hereinafter) by the present applicant is used for various diseases in which human NGF is involved in pathogenesis.
  • Prevention or treatment eg, joint pain associated with osteoarthritis (OA pain), joint pain associated with rheumatism, cancer pain, neuropathic pain, chronic low back pain, postoperative pain, postherpetic neuralgia, painful diabetes
  • Pain eg, joint pain associated with osteoarthritis (OA pain), joint pain associated with rheumatism, cancer pain, neuropathic pain, chronic low back pain, postoperative pain, postherpetic neuralgia, painful diabetes
  • Pain eg, joint pain associated with osteoarthritis (OA pain), joint pain associated with rheumatism, cancer pain, neuropathic pain, chronic low back pain, postoperative pain, postherpetic neuralgia, painful diabetes
  • Pain e.g, joint pain associated with osteoarthritis (OA pain),
  • parenteral pharmaceutical compositions such as liquid preparations or freeze-dried preparations in the medical field.
  • parenteral pharmaceutical compositions are presumed to be administered directly into the body, and are therefore preferably stable pharmaceutical preparations. That is, in a solution containing a protein such as an antibody, it is desirable to suppress the formation of insoluble foreign matter, and from the viewpoint of effectiveness, it is desirable to suppress the formation of degradation products, multimers, analogs, and the like. Therefore, there is still room for improvement in developing a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • Patent Documents 2, 3, and 4 Although inventions relating to anti-human NGF antibodies or stable pharmaceutical compositions containing human NGF are known (Patent Documents 2, 3, and 4), they are not related to PEGylated anti-human NGF antibody Fab 'fragments.
  • An object of the present invention is to provide a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • an object of the present invention is to include degradation products, multimers, acidic side analogs, basic side analogs that contain a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment and increase, for example, under heat or temperature conditions. It is providing the stable pharmaceutical composition which suppresses the production
  • Another object of the present invention is to provide a stable pharmaceutical composition containing a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment, which suppresses the formation of insoluble foreign matter that increases due to freeze-thawing, physical vibration, etc. To provide things.
  • the present inventors can prepare a stable pharmaceutical composition by adjusting the pH of a solution to a specific range and formulating a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment (Example 1 described later).
  • a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment Example 1 described later.
  • it is possible to provide a more stable pharmaceutical composition by adding a specific isotonic agent (Example 2 below), adding a surfactant (Example 3 below) and the like. As a result, the present invention has been completed.
  • a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment and having a pH of 4 to 5.5,
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is (1) an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and (2) the anti-antibody of (1) Selected from anti-human NGF antibody Fab ′ fragments, which are Fab ′ fragments generated by post-translational modification of human NGF antibody Fab ′ fragments;
  • a pharmaceutical composition wherein the PEGylation is a thiol reactive group of a PEG derivative having a thiol reactive group bonded to a thiol group of a hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment;
  • the pharmaceutical composition of [1], further comprising a pharmaceutically acceptable buffer, a pharmaceutically acceptable is
  • the pharmaceutical composition of [1] or [2], wherein the pH is 4.5 to 5.5 [4]
  • the pharmaceutically acceptable buffer is one or more selected from the group consisting of citric acid, acetic acid, and histidine, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • compositions 1] to [3]
  • pharmaceutical compositions selected from the group consisting of: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, [6] The pharmaceutical composition of any one of [1] to [5], wherein the concentration of the pharmaceutically acceptable buffer is 1 to 200 mmol / L, [7] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6], wherein the pharmaceutical composition is a liquid preparation or a freeze-dried preparation, [8] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [7], wherein the pharmaceutical composition is a liquid formulation, [9]
  • Pharmaceutically acceptable tonicity agents include arginine, D-sorbitol, D-mannitol, trehalose, sucrose, xylitol, erythritol, threitol, inositol, dulcitol, arabitol, isomalt, lactitol, and maltitol Any one or more of the pharmaceutical compositions selected from the group
  • a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment, in particular, a degradation product, a multimer, an acidic side analog, a basic side analog, an insoluble foreign substance
  • a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment that suppresses production can be provided.
  • D-1 to D-7) containing an isotonic agent (D-mannitol) and a surfactant (polysorbate 80), 25 ° C. or 40 ° C. 2
  • ⁇ indicates the result of a sample using 20 mmol / L citrate
  • ⁇ indicates a sample using 20 mmol / L histidine as a buffer.
  • stable means, for example, stable to heat, light, temperature, humidity, shaking, and / or freezing and thawing.
  • the amount of multimer, degradation product, acidic side analog, or basic side analog contained in the pharmaceutical composition, or a specific amount thereof is a certain amount. It means the following.
  • the “multimer” is a complex formed by collecting PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragments.
  • the method for measuring multimers is not particularly limited, but includes, for example, size exclusion chromatography (SE-HPLC method), gel electrophoresis, capillary electrophoresis, microflow imaging, etc. Is the SE-HPLC method.
  • SE-HPLC method size exclusion chromatography
  • the area of the detected peak is measured by an automatic analysis method and is calculated as a percentage (%) by dividing by the sum of all peak areas including the main peak.
  • the main peak means the peak of the active body.
  • the peaks having a retention time shorter than the main peak of SE-HPLC are combined into a multimer.
  • the amount of the multimer measured by the SE-HPLC method is 10% or less in one embodiment, and 5% or less in another embodiment.
  • the “degradation product” is a fragment produced by elimination of a part of a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • the method for measuring the degradation product is not particularly limited, and includes, for example, SE-HPLC method, gel electrophoresis method, capillary electrophoresis method and the like, and one embodiment is SE-HPLC method.
  • the method for measuring degradation products by the SE-HPLC method is the same as the method for measuring multimers by the SE-HPLC method.
  • a peak with a longer retention time than the main peak of SE-HPLC is taken as a decomposition product.
  • the amount of the degradation product measured by the SE-HPLC method is 10% or less in one embodiment, and 5% or less in another embodiment.
  • the increase in the amount of decomposed product is, for example, 2.5% or less, 2 as an aspect. 0.02% or less, and in one embodiment, the increase in the amount of degradation product after storage at 25 ° C. for 2 weeks, 1 month (4 weeks) or 40 ° C. for 2 weeks is, for example, 2.5% or less, 0.04% or less, and in another embodiment, the increase in the amount of degradation product after storage at 40 ° C. for 2 weeks is 2.5% or less, and in another embodiment, degradation after storage at 40 ° C. for 2 weeks.
  • the increase in the amount of the product is 2.0% or less.
  • the “acidic side analog” is an analog recognized as a peak that elutes earlier than the main component in analysis by cation exchange chromatography or imaging capillary isoelectric focusing.
  • the method for measuring the acidic side analog is not particularly limited, and for example, cation exchange chromatography (IE-HPLC method), gel electrophoresis, capillary electrophoresis, isoelectric focusing electrophoresis such as imaging capillary ( icIEF method) and the like, and an embodiment is IE-HPLC method or icIEF method.
  • IE-HPLC method cation exchange chromatography
  • gel electrophoresis gel electrophoresis
  • capillary electrophoresis capillary electrophoresis
  • isoelectric focusing electrophoresis such as imaging capillary ( icIEF method) and the like
  • an embodiment is IE-HPLC method or icIEF method.
  • the percentage (%) of the peak is calculated in the same manner as the SE-HPLC
  • the amount of the acidic side analog measured by the IE-HPLC method and / or the icIEF method is 50% or less in one embodiment, 35% or less in another embodiment, and 25% or less in another embodiment.
  • about the amount of increase of the amount of acidic side analogs (the difference between the amount of acidic side analogs after storage for a specific period under specific conditions and the amount of acidic side analogs at the start of the test (storage)), for example, 15% or less In some embodiments, it is 10% or less. More specifically, the amount of increase in the amount of acidic side analogs after storage at 25 ° C. for 2 weeks, 1 month (4 weeks) or 40 ° C. for 2 weeks is, for example, 15% or less, and in one embodiment, 10% or less.
  • the “basic side analog” is an analog recognized as a peak eluting later than the main component in the analysis by the IE-HPLC method or the icIEF method.
  • the method for measuring the basic side analog is not particularly limited, and includes, for example, IE-HPLC method, gel electrophoresis method, capillary electrophoresis method, icIEF method and the like. Or it is icIEF method.
  • the percentage (%) of the peak is calculated in the same manner as the SE-HPLC method described above.
  • the amount of the basic side analog measured by the icIEF method is 50% or less as an embodiment, 25% or less as another embodiment, and 20% or less as another embodiment.
  • the “insoluble foreign matter” is an insoluble complex formed by collecting PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragments, pharmaceutical additives and the like.
  • the insoluble foreign matter can be visually confirmed, for example, in accordance with the insoluble foreign matter inspection method for injections described in the 16th revised Japanese Pharmacopoeia or in conformity thereto.
  • “Stable pharmaceutical composition” means at least 1 month (4 weeks), preferably 3 months, more preferably 6 months, even more preferably 1 year, more preferably 2 years at a refrigeration temperature (2-8 ° C.); Or at room temperature (22-28 ° C) for at least 2 weeks, preferably 1 month, more preferably 3 months, more preferably 6 months, suitably 1 year; or at least 2 weeks at accelerated conditions (37-43 ° C), Preferably, it means a pharmaceutical composition in which the amount of multimers, degradation products, acidic side analogs or basic side analogs, or the total amount thereof is equal to or less than the specific amount described above, for one month (4 weeks).
  • IgG There are five classes of antibodies: IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the basic structure of an antibody molecule is common to each class, and is composed of a heavy chain having a molecular weight of 50,000 to 70,000 and a light chain having a molecular weight of 20,000 to 30,000.
  • the heavy chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 440 amino acids, has a characteristic structure for each class, and corresponds to IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, Ig ⁇ , Ig ⁇ , Ig ⁇ , Ig ⁇ . It is called.
  • IgG has IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subclasses, and the corresponding heavy chains are called Ig ⁇ 1, Ig ⁇ 2, Ig ⁇ 3, and Ig ⁇ 4.
  • the light chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 220 amino acids, and two types of L-type and K-type are known, and are called Ig ⁇ and Ig ⁇ , respectively.
  • the polypeptide structure of the basic structure of an antibody molecule is that two homologous heavy chains and two light chains are linked by a disulfide bond (SS bond) and a non-covalent bond, and have a molecular weight of 150,000 to 190,000. is there.
  • the two light chains can be paired with any heavy chain.
  • Each antibody molecule always consists of two identical light chains and two identical heavy chains.
  • a domain located at the amino terminus (N terminus) of both heavy and light chains is called a variable region because its amino acid sequence is not constant even if it is a specimen from the same class (subclass) of the same species.
  • Each domain is called a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L ).
  • the amino acid sequence on the carboxy terminus (C terminus) side of the variable region is almost constant for each class or subclass and is called a constant region, and each domain has C H 1, C H 2, C H 3, or Expressed as CL.
  • the antigen-binding site of an antibody is composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region, and the specificity of binding depends on the amino acid sequence of this site.
  • biological activities such as binding to complement and various cells reflect differences in the structure of the constant region of each class Ig. It has been found that the variability of the light chain and heavy chain variable regions is almost limited to the three small hypervariable regions present in both chains, these regions being complementarity determining regions (CDRs; each N-terminal). These are called CDR1, CDR2, CDR3) from the side.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the remaining part of the variable region is called the framework region (FR) and is relatively constant.
  • the region between the C H 1 domain and C H 2 domain of the heavy chain constant region of an antibody is called the hinge region, and this region contains a number of proline residues and is composed of a plurality of chains connecting two heavy chains. Includes inter-SS bond.
  • each of the human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 hinge regions has two, four, eleven, and two cysteine residues that constitute SS bonds between heavy chains, respectively.
  • the hinge region is a region that is highly sensitive to proteolytic enzymes such as papain and pepsin.
  • the heavy chain When the antibody is digested with papain, the heavy chain is cleaved at a position N-terminal to the S—S bond between the heavy chains in the hinge region and decomposed into two Fab fragments and one Fc fragment.
  • the Fab fragment is composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (V H ), a C H 1 domain and a portion of the hinge region.
  • V H heavy chain variable region
  • the heavy chain When the antibody is digested with pepsin, the heavy chain is cleaved at a position on the C-terminal side of the S—S bond between heavy chains in the hinge region, and an F (ab ′) 2 fragment is generated.
  • the F (ab ′) 2 fragment is a fragment of a dimeric structure in which two Fab ′ fragments are linked by an inter-heavy chain SS bond in the hinge region.
  • the Fab ′ fragment is composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (V H ), a C H 1 domain, and a part of the hinge region. The cysteine residues that made up the S bond are included.
  • the Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, and Fab ′ fragment all contain a variable region and have antigen binding activity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of (1) below and / or PEGylated anti-human NGF of (2) below as a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • Anti-human NGF antibody Fab ′ comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 121 of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 113 of SEQ ID NO: 3
  • Anti-human NGF antibody Fab ′ fragment in which the thiol reactive group of the PEG derivative to which the thiol reactive group is bonded is covalently bonded to the thiol group of the hinge region cysteine of the fragment and PEGylated
  • the post-translational modification of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment described in (2) above is pyroglutamylation of the heavy chain variable region N-terminus.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of (2) is a heavy chain variable consisting of an amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 121 in which the glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 1 is modified with pyroglutamic acid.
  • Thiol of a PEG derivative in which a thiol reactive group is bonded to a thiol group of a hinge region cysteine of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a region and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 113 of SEQ ID NO: 3 It is an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment in which a reactive group is covalently bonded and PEGylated.
  • the constant region of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention includes any subclass constant region (eg, Ig ⁇ 1, Ig ⁇ 2, Ig ⁇ 3, or Ig ⁇ 4 constant region, light chain constant as the heavy chain constant region). As a region, a constant region of Ig ⁇ or Ig ⁇ may also be selectable.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention comprises a heavy chain constant region which is a human Ig ⁇ 1 constant region as the heavy chain constant region.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention comprises a light chain constant region which is a human Ig ⁇ constant region as the light chain constant region.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention comprises a heavy chain constant region that is a human Ig ⁇ 1 constant region and a light chain constant region that is a human Ig ⁇ constant region.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the following (3) and / or (4) PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment as a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment: (3) a thiol reactive group on the thiol group of the hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment which is PEGylated by covalently binding a thiol reactive group of a PEG derivative to which (4) A Fab ′ fragment produced by post-translational modification of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment obtained by covalently linking a thiol reactive group of a PEG derivative having a thiol reactive group bonded to a thiol group of a hinge region cysteine of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • the post-translational modification of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment described in (4) above is pyroglutamylation of the heavy chain variable region N-terminus.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of (4) is a heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which the glutamine of amino acid No. 1 in SEQ ID NO: 1 is modified with pyroglutamic acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the following (1) and a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the following (2):
  • Anti-human NGF antibody Fab ′ fragment in which the thiol reactive group of the PEG derivative to which the thiol reactive group is bonded is covalently bonded to the thiol group of the hinge region cysteine of the fragment and PEGylated (2) PEG in which a thiol reactive group is bonded to the thiol group of the hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment, which is
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the following (3) and (4) PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragments as PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragments: (3) a thiol reactive group on the thiol group of the hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment which is PEGylated by covalently binding a thiol reactive group of a PEG derivative to which (4) A Fab ′ fragment produced by post-translational modification of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment obtained by covalently linking a thiol reactive group of a PEG derivative having a thiol reactive group bonded to a thiol group of a hinge region cysteine of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • compositions containing an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment covalently PEGylated and PEGylated A heavy chain variable region comprising CDR1 consisting of the amino acid sequence 31 to 35 of SEQ ID NO: 1, CDR2 consisting of the amino acid sequence 50 to 65 of SEQ ID NO: 1, and CDR3 consisting of the amino acid sequence 98 to 110 of SEQ ID NO: 1, and A light chain variable region comprising CDR1 consisting of amino acid sequence 24 to 39 of SEQ ID NO: 3, CDR2 consisting of amino acid sequence 55 to 61 of SEQ ID NO: 3, and CDR3 consisting of amino acid sequence 94 to 102 of SEQ
  • the present invention provides a hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment that can be produced by culturing a host cell selected from the following (a) and (b) as a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment: Also included are pharmaceutical compositions containing an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment PEGylated by covalently binding a thiol reactive group of a PEG derivative having a thiol reactive group attached to the thiol group of (A) a polynucleotide comprising a base sequence encoding a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 121 of SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 113 of SEQ ID NO: 3 A host cell transformed with an expression vector comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding a light chain comprising a light chain variable region comprising: (B) an expression vector
  • the present invention provides a hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment that can be produced by culturing a host cell selected from the following (a) and (b) as a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment: Also included are pharmaceutical compositions containing an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment PEGylated by covalently binding a thiol reactive group of a PEG derivative having a thiol reactive group attached to the thiol group of (A) Expression comprising a polynucleotide containing a base sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide containing a base sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 A host cell transformed with the vector, (B) an expression vector comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding a heavy chain fragment consisting of
  • the Fab ′ fragment is a monovalent antibody fragment composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (V H ), a C H 1 domain and a part of the hinge region.
  • the hinge region includes at least one cysteine residue other than the cysteine residue constituting the SS bond between the heavy chain and the light chain (also referred to as “hinge region cysteine” in the present specification). Is included).
  • the hinge region cysteine can be used as a modification site with PEG.
  • the number of hinge region cysteines in the Fab ′ fragment can vary between one and several depending on the class of antibody used, but can be readily adjusted by one skilled in the art.
  • Fab ′ fragment of the human IgG1 class (usually having two hinge region cysteines in the hinge region)
  • the coding region of the first hinge region cysteine and the second in the heavy chain hinge region By inserting a stop codon between the coding region of the hinge region cysteine, a Fab ′ fragment having one hinge region cysteine in the hinge region can be produced. By subsequently inserting a stop codon, a Fab ′ fragment having two hinge region cysteines in the hinge region can be generated.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention is obtained by covalently binding the thiol reactive group of the PEG derivative in which the thiol reactive group is bonded to the thiol group of the hinge region cysteine of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment. It can be produced by PEGylation. Conjugation of PEG to the Fab 'fragment can be performed using methods known in the art (eg, EP 0 948 544). In the present invention, linear or branched PEG having an arbitrary average molecular weight or a derivative thereof can be used, and can be easily selected by those skilled in the art depending on the purpose of use.
  • Derivatives of PEG may be used to facilitate attachment of PEG to the hinge region cysteine.
  • a PEG derivative in which a thiol reactive group such as maleimide is bonded via a linker can be used to covalently bond the thiol group of the hinge region cysteine and the maleimide group.
  • the average molecular weight of PEG is from about 500 to about 50000 Da, preferably from about 5000 to about 40000 Da, and more preferably from about 10,000 to about 40000 Da.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention can be obtained by a person skilled in the art using methods known in the art based on the sequence information of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment disclosed herein. Can be easily produced. Examples of the method for producing the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the present invention include the method disclosed in International Publication No. 2013/022083.
  • the amount of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment in one unit pharmaceutical composition is, for example, 0.1 to 200 mg in terms of Fab′-PEG, 0.1 to 40 mg as an embodiment, Examples of the present invention include 20 to 40 mg, other embodiments include 60 to 150 mg, and other embodiments include 40 to 120 mg. In addition, each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the amount of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is, for example, 0.1 to 200 mg in terms of Fab′-PEG, In one embodiment, 0.1 to 40 mg, another embodiment is 20 to 40 mg, another embodiment is 60 to 150 mg, and another embodiment is 40 to 120 mg. In addition, each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the concentration of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is, for example, 0.1 to 200 mg / mL in terms of Fab′-PEG after dissolution at the time of use.
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the concentration of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is, for example, 0.1 to 200 mg / mL in terms of Fab′-PEG. -40 mg / mL, another embodiment 20-40 mg / mL, another embodiment 60-150 mg / mL, and another embodiment 40-120 mg / mL.
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the dose is, for example, 0.1 to 200 mg in terms of Fab′-PEG, 0.1 to 40 mg as one embodiment, 20 to 40 mg as another embodiment, 60 to 150 mg as another embodiment, In another embodiment, it contains 40 to 120 mg.
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • Indications include prevention and / or treatment of various diseases in which human NGF is involved in pathogenesis, such as joint pain associated with osteoarthritis (OA pain), joint pain associated with rheumatism, cancer pain, neuropathic Pain, chronic low back pain, postoperative pain, postherpetic neuralgia, painful diabetic neuropathy, fracture pain, bladder pain syndrome, interstitial cystitis, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, endometriosis, etc. including.
  • OA pain osteoarthritis
  • rheumatism cancer pain
  • neuropathic Pain chronic low back pain
  • postoperative pain postherpetic neuralgia
  • painful diabetic neuropathy painful diabetic neuropathy
  • fracture pain bladder pain syndrome
  • interstitial cystitis acute pancreatitis
  • chronic pancreatitis chronic pancreatitis
  • endometriosis etc.
  • the “pharmaceutically acceptable buffer” used in the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable and has a buffering ability within a desired pH range in a solution state.
  • the pharmaceutical composition has a buffer capacity within the following pH range.
  • the pH is the pH of the liquid formulation
  • the pharmaceutical composition is a freeze-dried formulation or a spray-dried formulation
  • the pH when the formulation is redissolved in water. It is set as pH of this solution.
  • buffer component examples include citric acid, acetic acid, histidine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another embodiment includes citric acid, acetic acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Other embodiments include anhydrous citric acid and / or trisodium citrate dihydrate.
  • hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc. suitably.
  • the concentration of the buffer is not particularly limited as long as it is an amount capable of adjusting the pH within a desired pH range.
  • the concentration of the buffer is, for example, 1 to 200 mmol / L in another solution (liquid formulation) dissolved in water for injection, 1 to 100 mmol / L in another embodiment, 5 to 100 mmol / L in another embodiment, In another embodiment, it is 1 to 50 mmol / L.
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the amount of the buffering agent is such an amount that the above-mentioned concentration of the buffering agent in the solution when the preparation is redissolved in water.
  • the “pharmaceutically acceptable isotonic agent” used in the present invention is pharmaceutically acceptable, has an isotonic action, and affects the stability of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment. There is no particular limitation as long as it does not exert or has a stabilizing action.
  • salts examples include salts, amino acids, sugars or sugar alcohols.
  • the salts include sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate and the like.
  • sodium chloride examples include sodium chloride.
  • amino acids include arginine (L-arginine) or a pharmaceutically acceptable salt thereof (for example, hydrochloride), glycine, lysine, ornithine and the like. In one embodiment, arginine and glycine are used, and in another embodiment, arginine is used.
  • sugar or sugar alcohol examples include D-sorbitol, D-mannitol, trehalose, sucrose, xylitol, erythritol, threitol, inositol, dulcitol, arabitol, isomalt, lactitol, maltitol, and the like.
  • D-sorbitol and D-mannitol are used, and in another embodiment, D-sorbitol.
  • arginine or a pharmaceutically acceptable salt thereof D-sorbitol, D-mannitol, trehalose, sucrose, xylitol, erythritol, inositol, arabitol, isomalt, lactitol, maltitol
  • L-arginine hydrochloride D-sorbitol
  • salts, amino acids, sugars or sugar alcohols are included in the pharmaceutical composition as long as they do not affect or stabilize the stability of the PEGylated anti-human antibody Fab ′ fragment.
  • the concentration of the tonicity agent is not particularly limited as long as it has an isotonic effect and does not affect the stability of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • the concentration in the case of a solution state (solution) dissolved in water for injection is, for example, 1 to 500 mmol / L, as one embodiment, 1 to 400 mmol / L, as another embodiment, 1 to 300 mmol / L, as another embodiment, 50 to 500 mmol / L, and in another embodiment, 100 to 300 mmol / L, in another embodiment, 200 to 300 mmol / L, and in still another embodiment, 100 to 200 mmol / L.
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the amount of the tonicity agent is an amount such that the tonicity agent in the solution when the preparation is redissolved in water has the above-mentioned concentration. It is.
  • the “pharmaceutically acceptable surfactant” used in the present invention is pharmaceutically acceptable and has a surfactant action and a stabilizing action of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment. There is no particular restriction.
  • nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerol monocaprylate, glycerol monomyristate, glycerol monostearate, etc.
  • Glycerin fatty acid ester of polyglycerol fatty acid ester such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate , Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester such as polystearate polyoxyethylene sorbitol, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester such as polyoxyethylene sorbitol tetraoleate; polyoxyethylene glycerin fatty acid ester such as polyoxyethylene glyceryl monostearate; distearin Polyethylene glycol fatty acid esters such as polyethylene glycol acid; polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene lauryl ether; poly
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether Polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as oxyethylene nonylphenyl ether; polyoxyethylene hydrogenated castor oils such as polyoxyethylene castor oil and polyoxyethylene hydrogenated castor oil; polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene sorbitol beeswax; poly Polyoxyethylene lanolin derivatives such as oxyethylene lanolin; surfactants having 6-18 HLB such as polyoxyethylene fatty acid amides such as polyoxyethylene octadecanamide; anionic surfactants such as sodium cetyl sulfate, Alkyl sulfates having C 10 -C 18 alkyl groups such as sodium lauryl sulfate and sodium oleyl sulfate; of the added ethylene oxide units such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate; Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average number of moles of 2 to 4 and an alkyl
  • These surfactants can be used by appropriately selecting one or more kinds.
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether
  • polysorbate or pluronic surfactant in another embodiment, polysorbate 20, 21, 40, 60. , 65, 80, 81, 85 or pluronic surfactant, and in another embodiment, polysorbate 20, 80 or poloxamer (poloxamer 188), and in another embodiment, polysorbate 80.
  • the surfactant has an action of suppressing the formation of insoluble foreign substances and the like, and is included in the pharmaceutical composition as long as the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is stabilized.
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited as long as it has a surfactant activity and a stabilizing effect of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.
  • 0.001 to 1% (w / v) in some embodiments 0.01 to 0.5% (w / v), in another embodiment 0.01 ⁇ 0.03% (w / v).
  • each said lower limit and each upper limit can be arbitrarily combined as desired.
  • the pharmaceutical composition is a freeze-dried preparation or a spray-dried preparation
  • the amount of the surfactant is such an amount that the concentration of the surfactant in the solution when the preparation is redissolved in water is as described above. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention is provided as a liquid formulation by filling a solution in a container, and as a parenteral pharmaceutical composition such as a lyophilized formulation or a spray-dried formulation by lyophilization or spray drying. can do.
  • a liquid preparation is preferred.
  • a liquid preparation containing citric acid, arginine and polysorbate or a liquid preparation containing citric acid, D-sorbitol and polysorbate is preferred.
  • pharmaceutical additives such as a suspending agent, a solubilizing agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a sulfur-containing reducing agent, and an antioxidant can be appropriately added as desired.
  • suspending agent examples include methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and the like.
  • solubilizer examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, nicotinamide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, tuna gol, castor oil fatty acid ethyl ester, and the like.
  • preservative examples include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol and the like.
  • adsorption inhibitor examples include human serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and polyethylene glycol.
  • sulfur-containing reducing agent examples include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione, And those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • antioxidants examples include methionine, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid stearate, sulfurous acid Chelating agents such as sodium hydrogen, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate and the like can be mentioned.
  • EDTA disodium ethylenediaminetetraacetate
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention includes a method of containing a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment and adjusting the pH to 4 to 5.5 by a production method known per se. It may further contain a pharmaceutically acceptable buffer, a pharmaceutically acceptable isotonic agent, and a pharmaceutically acceptable surfactant.
  • the container filled with the pharmaceutical composition of the present invention can be selected according to the purpose of use. For example, it includes those having a predetermined volume shape such as vials, ampoules and syringes, and those having a large volume shape such as bottles. Some embodiments include syringes (including disposable syringes). By pre-filling the syringe with the solution and providing it as a prefilled syringe solution preparation, an operation such as a dissolution operation becomes unnecessary in the medical field, and a quick response is possible.
  • Examples of the material of the container include glass and plastic.
  • a silica coat process, a silicone coat process, a sulfur process, various low alkali processes, etc. may be performed.
  • the present invention includes a method for stabilizing a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment, which is characterized by adjusting the pH to 4 to 5.5.
  • a pharmaceutically acceptable buffer, a pharmaceutically acceptable isotonic agent, and a pharmaceutically acceptable surfactant may be further used as desired.
  • the “permissible surfactant” the description in the pharmaceutical composition of the present invention can be applied as it is.
  • the said description in the pharmaceutical composition of this invention can be applied as it is.
  • the pH is adjusted to 4 to 5.5, and if desired, a pharmaceutically acceptable buffer.
  • a pharmaceutically acceptable isotonic agent and a pharmaceutically acceptable surfactant By further using a pharmaceutically acceptable surfactant, degradation products, multimers, acidic side analogs, basic side analogs, insoluble foreign substances Generation can be suppressed.
  • the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment used in the Examples was obtained by the production method described in Example 19 of International Publication No. 2013/022083 or a method analogous thereto.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 in the heavy chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment consist of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 from 31 to 35, 50 to 65, and 98 to 110, respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 in the light chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment are composed of amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 from 24 to 39, 55 to 61, and 94 to 102.
  • GS vector in which both heavy chain and light chain genes of the anti-human NGF antibody Fab 'fragment were inserted was constructed.
  • a stable expression strain of Fab ′ fragment was obtained by transfection into CHOK1SV cells (Lonza), and the Fab ′ fragment was expressed.
  • the culture supernatant was purified using affinity chromatography and anion exchange chromatography to obtain Fab 'fragments.
  • the process includes a virus inactivation process and a virus removal film process.
  • the obtained anti-human NGF antibody Fab ′ fragment was reduced with a reducing agent and conjugated with PEG maleimide (product name: SUNBRIGHT GL2-400MA, manufactured by NOF Corporation). Further purification was performed using cation exchange chromatography to prepare a PEGylated anti-human NGF antibody Fab 'fragment. As a result of analyzing the amino acid modification of the purified Fab 'fragment, pyroglutamylation of the heavy chain variable region N-terminal occurred in most of them.
  • Example 1 Stabilization effect by optimum pH selection >> PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment concentration is 10 mg / mL in terms of Fab ′ (approximately 20 mg / mL in terms of Fab′-PEG), and the buffer solutions shown in Table 1 (all concentrations are 20 mmol / L) Sterilize the prescription solution (Sample Nos. A-1 to A-8) prepared in Step 2 with a 0.22 ⁇ m filter, fill 1.3 mL each into a glass vial (3 mL capacity), plug with a rubber stopper, roll Tightening was performed, and storage was performed at 25 ° C. for one month in an inverted state.
  • Fab ′ equivalent concentration and the Fab′-PEG equivalent concentration were measured using an ultraviolet / visible spectrophotometer Nanodrop 2000c (Thermo Scientific, MA, USA). A 2 ⁇ L sample was applied to the stage, and the absorbance at 280 nm was measured. The protein concentration is obtained by using the obtained 280 nm absorbance and the extinction coefficient of 1.48 mL / mg / cm (in the case of Fab ′ equivalent) or 0.79 mL / mg / cm (in the case of Fab′-PEG equivalent). Calculated.
  • the evaluation results by SE-HPLC method and IE-HPLC method are shown in Table 1.
  • a TSKgel (registered trademark) G3000SWXL column manufactured by Tosoh Corporation
  • the solution has a composition of 10 mmol / L phosphoric acid / 500 mmol / L sodium chloride pH 7.0, and becomes 10%.
  • a mobile phase having a composition to which acetonitrile was added was allowed to flow at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the sample was used in an injection amount of 50 ⁇ g in terms of Fab ′ (about 100 ⁇ g in terms of Fab′-PEG).
  • the column temperature was set to 30 ° C.
  • the sample temperature was set to 5 ° C.
  • detection was performed at UV 280 nm.
  • the area of the peak detected by SE-HPLC measurement was measured by an automatic analysis method, and was calculated as a percentage (%) by dividing by the sum of all peak areas including the main peak.
  • the main peak means the peak of the active body.
  • a peak with a retention time shorter than that of the main peak of SE-HPLC was combined into a multimer, and a peak with a longer retention time was combined into a degradation product.
  • IE-HPLC measurement was performed by connecting a Propac WCX-10 column (Dionex) to the HPLC system.
  • a 20 mmol / L 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) / pH 6.0 was connected to the mobile phase A line, and a 20 mmol / L MES / 500 mmol / L sodium chloride / pH 6.0 mobile phase was connected to the mobile phase B line.
  • the flow rate was 1 mL / min.
  • the sample was diluted with mobile phase A to a Fab 'equivalent concentration of 1 mg / mL, and 10 ⁇ L was injected.
  • the gradient program kept mobile phase B at 0% for 2 minutes and then linearly increased the proportion of mobile phase B to 5% in 50 minutes.
  • the mobile phase B ratio was linearly increased to 100%, and after washing, the mobile phase B ratio was linearly decreased to 0% and held for about 10 minutes until the next sample injection. Equilibration was performed. The analysis time was about 70 minutes and detection was performed at UV 280 nm. The column temperature was set to 40 ° C and the sample temperature was set to 5 ° C.
  • Example 2 Stabilizing effect by selection of isotonic agent >> The PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment concentration was 20 mg / mL in terms of Fab ′ (approximately 40 mg / mL in terms of Fab′-PEG), and 6 types of buffer formulations of 20 mmol / L citric acid (pH 5.5). In the formulation (sample Nos.
  • the amount of multimers and the amount of degradation products were analyzed in the same manner as in Example 1 by the SE-HPLC method.
  • the polydispersity was measured by a dynamic light scattering (DLS) method using DynaPro Platformer (manufactured by Wyatt).
  • the amount of multimers and decomposed products after storage at 40 ° C. for 4 weeks there was a tendency for the amount of multimers and decomposed products after storage at 40 ° C. for 4 weeks to increase compared to the additive-free formulation.
  • the L-arginine hydrochloride-added formulation and the glycine-added formulation an increase in the amount of degradation products after storage at 40 ° C. for 4 weeks was observed compared to the additive-free formulation.
  • the amount of multimer, amount of degradation products, and polydispersity after storage at 40 ° C. for 4 weeks were the same as those with no additive.
  • the formulation with an increase in the amount of degradation products is comprehensively stable, taking into account fluctuations in the amount of multimers, acidic side analogs, basic side analogs, etc. Judging sex.
  • Example 3 Stabilization effect by addition of surfactant >> PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment concentration is 20 mg / mL in terms of Fab ′ (about 40 mg / mL in terms of Fab′-PEG), 20 mmol / L citric acid (pH 5.5), polysorbate as a surfactant Samples (Sample Nos. C-1 to C-4) to which 80 was added at three concentration levels (0.01, 0.02, 0.05% (w / v)) were physically stable against freeze-thaw stress Sex was evaluated.
  • Samples were prepared for each formulation, sterilized through a 0.22 ⁇ m filter, filled in 0.3 mL glass vials (3 mL capacity), stoppered with a rubber stopper, and then tightened.
  • a sample was stored in a freezer at ⁇ 80 ° C. in a fixed state and frozen, and then the sample was taken out from the freezer and stored in a fixed state in a refrigerator at 5 ° C. to be thawed. This freeze-thaw cycle was repeated 3 times.
  • hydrochloric acid and / or sodium hydroxide was added as a pH adjuster when necessary to prepare a buffer so that a predetermined pH was obtained.
  • Table 3 shows the results of visual appearance evaluation. In the appearance evaluation, the generation of a large number of insoluble foreign matters due to freezing and thawing stress was observed in the formulation with no polysorbate 80 added, but no insoluble foreign matters were observed at any concentration in the formulation added with polysorbate 80.
  • Example 4 Stabilization effect 1 by selection of optimum pH of formulation containing isotonic agent and surfactant >> Containing PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment at a concentration of 20 mg / mL in terms of Fab ′ (approximately 40 mg / mL in terms of Fab′-PEG), using 20 mmol / L citric acid or histidine as a buffer, 240 mmol / L
  • Sample Nos. D-1 to D-7 to which D-mannitol and 0.02% (w / v) polysorbate 80 were added, samples were prepared in the range of pH 4.0 to 6.0, and placed The stability during storage at 25 ° C.
  • the results are shown in FIGS.
  • the decomposed product had a pH of 5.0, and the amount of increase was minimal compared to the initial product.
  • the acid side analogs were found to increase in amount from the initial product as the pH increased under any storage conditions. From the DLS measurement results in Table 4, in the products stored at 40 ° C. for 2 weeks, the lower the pH, the larger the average particle size and polydispersity value, and the tendency to easily form aggregates was recognized.
  • Example 5 Stabilizing effect 2 by selection of optimum pH of formulation containing isotonic agent and surfactant >> To a formulation prepared using citric acid (concentration 20 mmol / L) at pH 4.6, pH 4.9, and pH 5.2, 240 mmol / L D-mannitol and 0.02% (w / v) For formulations with polysorbate 80 added and 240 mmol / L D-sorbitol added instead of 240 mmol / L D-mannitol (pH 4.9) at 5 ° C., 25 ° C., 40 ° C. Storage stability was evaluated.
  • the concentration of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment is 20 mg / mL in terms of Fab ′ (about 40 mg / mL in terms of Fab′-PEG).
  • Samples were prepared for each formulation, sterilized by filtration with a 0.22 ⁇ m filter, filled in 0.3 mL glass vials (3 mL capacity), stoppered with a rubber stopper, and then tightened.
  • hydrochloric acid and / or sodium hydroxide was added as a pH adjuster when necessary to prepare a buffer so that a predetermined pH was obtained.
  • Multimers and degradation products were measured by the SE-HPLC method, and acidic side analogs were measured by the IE-HPLC method.
  • the SE-HPLC method and IE-HPLC method were carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 6 Stabilizing effect by selection of buffering agent for formulation containing isotonic agent and surfactant >> Two formulations shown in Table 5 (Sample Nos. E-1 and E-2) were evaluated for stability after storage for 4 weeks under each condition (5 ° C, 25 ° C, 40 ° C) in an in-place state. Samples were prepared for each formulation, sterilized by filtration with a 0.22 ⁇ m filter, filled in 1.3 mL glass vials (3 mL capacity), stoppered with a rubber stopper, and then tightened. In addition, hydrochloric acid and / or sodium hydroxide was added as a pH adjuster when necessary to prepare a buffer so that a predetermined pH was obtained. Multimers and degradation products were measured by the SE-HPLC method, and acidic side analogs were measured by the IE-HPLC method. The SE-HPLC method and IE-HPLC method were carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 7 Stability evaluation of a formulation containing a buffer, an isotonic agent, and a surfactant >>
  • concentration of the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment was 40 mg / mL in terms of Fab′-PEG (about 20 mg / mL in terms of Fab ′),
  • D-sorbitol concentration was 240 mmol / L and the polysorbate 80 concentration was 0.02% (w / v)
  • the stability after storage for 3 months under each condition ⁇ 20 ° C., 5 ° C., 25 ° C.
  • citric acid and trisodium citrate dihydrate were added at such a ratio that the total amount was 20 mmol / L as citric acid and the pH was 4.9.
  • Hydrochloric acid or sodium hydroxide was added as necessary to adjust the pH to 4.6 to 5.2 when preparing the buffer.
  • the prepared sample was sterilized by filtration with a 0.22 ⁇ m filter, filled in 1.2 mL in a 3 mL vial, stoppered with a rubber stopper, wound, and stored under each condition.
  • the freeze / thaw test was performed in the same manner as in Example 3.
  • the shaking stability test was performed by placing the sample in a horizontal state on a shaker (RECIPRO SHAKER SR-1; manufactured by TAITEC) and shaking at room temperature for 48 hours.
  • the sample was stored in a horizontal state and irradiated with 1000 lux light for 48 hours using a D65 lamp. Appearance was measured by visual observation, pH was measured by pH meter, multimers and degradation products were measured by SE-HPLC method, acidic side analogs were measured by IE-HPLC method, and average particle size and polydispersity were measured by DLS method. Visual observation was performed under room light, pH was measured using a pH meter calibrated with a calibration standard solution, SE-HPLC method and IE-HPLC method were the same as in Example 1, and The DLS method was carried out in the same manner as in Example 2.
  • Example 8 Stabilization effect by selection of optimum pH of high concentration preparation >> Buffer solution using a spin column so that the PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment concentration is 100 mg / mL in terms of Fab′-PEG (approximately 50 mg / mL in terms of Fab ′) to the composition shown in Table 10.
  • Exchange / concentration was carried out, and polysorbate 80 was added to 0.02 w / v%, followed by filtration with a 0.22 ⁇ m filter. Fill the filtrate with 0.25 mL or 1.15 mL each into a 3 mL glass vial, stopper with a rubber stopper, and then tighten the wound.
  • a TSKgel (registered trademark) G3000SWXL column manufactured by Tosoh was connected to an HPLC system, and a solution having a composition of 20 mmol / L phosphoric acid / 400 mmol / L sodium chloride pH 7.0 was 17.5%.
  • a mobile phase having a composition to which acetonitrile was added was flowed at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the sample was injected at an amount of 50 ⁇ g in terms of Fab′-PEG.
  • the column temperature was set to 30 ° C.
  • the sample temperature was set to 5 ° C.
  • detection was performed at UV 280 nm.
  • IcIEF measurement was performed by connecting cIEF Cartridge FC-Coated (manufactured by Protein Simple) to the iCE3 system. About 0.2% methylcellulose, about 2.7% Pharmalyte 3-10, about 1.6% Pharmalyte 8-10.5, about 1.1% CHAPS, about 0.5% pI marker 5.85, about 0.5% 120 ⁇ L of a sample matrix consisting of the pI marker 9.46 and 5 ⁇ L of a sample diluted with ultrapure water to a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment concentration of 10 mg / mL were mixed to obtain a measurement sample. Prefocusing was performed at 1500 V for 1 minute, Focusing was performed at 3000 V for 16 minutes, and detection was performed at UV 280 nm.
  • Table 11 shows the results of measuring the amount of multimers
  • Table 12 shows the results of measurement of degradation products
  • Table 13 shows the results of measurement of acidic side analogs. Even in the high-concentration preparation, as the pH increased, the amount of multimers, degradation products, and acidic side analogs tended to increase.
  • Example 9 Stability evaluation study of formulation containing buffer, isotonic agent, surfactant in high concentration preparation >> In the same manner as in Example 8, using 20 mmol / L citric acid, a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment was added to a formulation solution adjusted to the pH shown in Table 14 at a concentration of 100 mg / mL in terms of Fab′-PEG ( Table in which the D-sorbitol concentration was 240 mmol / L, the L-arginine hydrochloride concentration was 140 mmol / L, and the polysorbate 80 concentration was 0.02% (w / v).
  • the stability after storage for 1 month or 3 months under each condition (5 ° C., 25 ° C.) in an in-place state was evaluated.
  • the prepared sample was sterilized by filtration with a 0.22 ⁇ m filter, filled into a 3 mL vial with 0.8 mL, struck with a rubber stopper, wound, and stored under each condition.
  • Multimers and degradation products were measured by the SE-HPLC method, and acidic side analogs and basic side analogs were measured by the icIEF method.
  • the SE-HPLC method and icIEF method were carried out in the same manner as in Example 8.
  • a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment, in particular, a degradation product, a multimer, an acidic side analog, a basic side analog, an insoluble foreign substance It is possible to provide a stable pharmaceutical composition comprising a PEGylated anti-human NGF antibody Fab ′ fragment which suppresses the production of As mentioned above, although this invention was demonstrated along the specific aspect, the modification and improvement obvious to those skilled in the art are contained in the scope of the present invention.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment
  • sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the heavy chain fragment gene of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment
  • sequence of No. 3 is the amino acid sequence of the light chain of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment
  • sequence of SEQ ID NO: 4 is the base sequence of the light chain gene of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment.

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Abstract

分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、安定なＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメントを含有してなる、医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、ｐＨが４～５．５であり、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、等張化剤、及び界面活性剤を更に含有することができる。

Description

ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント含有医薬組成物
　本発明は、ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物に関するものである。
　神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。
　本出願人により、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）を結合させた（以下、「ＰＥＧ化」と略記することもある）抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療（例えば、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等）に有用であることが公表されている（特許文献１）。
　他方、近年様々な抗体等のタンパク質を含む医薬品が開発され、実際に医療の現場に提供されている。これらの医薬品の多くは、静脈内投与や皮下投与等により投薬されるため、医療の現場には、液体製剤、あるいは凍結乾燥製剤等の非経口医薬組成物の形態として提供される。とりわけ、非経口医薬組成物は、直接体内に投与されることを前提とされるため、安定な医薬品製剤であることが望ましい。
　すなわち、抗体等のタンパク質を含有する溶液では、不溶性異物の形成等を抑制することが望ましく、また、有効性の観点から、分解物、多量体、類縁体等の形成を抑制することが望ましい。
　したがって、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を開発するには、いまなお改善の余地がある。
　なお、抗ヒトＮＧＦ抗体又はヒトＮＧＦを含有する安定な医薬組成物に関する発明（特許文献２、３、及び４）が知られているが、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントに関するものではない。
国際公開第２０１３／０２２０８３号 国際公開第２０１０／０３２２２０号 国際公開第９５／０５８４５号 国際公開第２０１１／１１６０９０号
　本発明の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
　詳細には、本発明の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、例えば、熱や温度条件等により増大する、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、例えば、凍結融解、物理的振動等により増大する、不溶性異物の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
　本発明者らは、溶液のｐＨを特定の範囲に調整し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを製剤化することにより、安定な医薬組成物を調製することができること（後記実施例１）、また、特定の等張化剤を添加すること（後記実施例２）、界面活性剤を添加すること（後記実施例３）等により、さらに安定な医薬組成物を提供することができること等を知見して、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨが４～５．５である、安定な医薬組成物であって、
　該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、医薬組成物、
［２］製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有する、［１］の医薬組成物、
［３］ｐＨが４．５～５．５である、［１］又は［２］の医薬組成物、
［４］製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸、酢酸、及びヒスチジン、並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、［１］～［３］のいずれかの医薬組成物、
［５］製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸又はその製薬学的に許容される塩である、［１］～［４］のいずれかの医薬組成物、
［６］製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１～２００ｍｍｏｌ／Ｌである、［１］～［５］のいずれかの医薬組成物、
［７］医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、［１］～［６］のいずれかの医薬組成物、
［８］医薬組成物が液体製剤である、［１］～［７］のいずれかの医薬組成物、
［９］製薬学的に許容される等張化剤が、アルギニン、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、［１］～［８］のいずれかの医薬組成物、
［１０］製薬学的に許容される等張化剤の濃度が、１～５００ｍｍｏｌ／Ｌである、［１］～［９］のいずれかの医薬組成物、
［１１］製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーの少なくとも一方である、［１］～［１０］のいずれかの医薬組成物、
［１２］製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート８０である、［１］～［１１］のいずれかの医薬組成物、
［１３］製薬学的に許容される界面活性剤の濃度が、０．００１～１％（ｗ／ｖ）である、［１］～［１２］のいずれかの医薬組成物、
［１４］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度が、０．１～２００ｍｇ／ｍＬである、［１］～［１３］のいずれかの医薬組成物、
［１５］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、［１］の医薬組成物、
［１６］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、［１］の医薬組成物、
［１７］抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、［１］又は［１６］の医薬組成物、
［１８］ｐＨを４～５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法であって、
　該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、前記方法、
［１９］製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を使用する、［１８］の方法
に関する。
　本発明によれば、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる安定な医薬組成物、詳細には、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
等張化剤（Ｄ－マンニトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含むｐＨ４．０～６．０の範囲の処方（試料Ｎｏ．Ｄ－１～Ｄ－７）について、２５℃又は４０℃２週の保管条件における分解物の増加量（％）を示すグラフである。●は２０ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸、■は２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ヒスチジンを緩衝剤として用いたサンプルの結果を示す。 等張化剤（Ｄ－マンニトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含むｐＨ４．０～６．０の範囲の処方（試料Ｎｏ．Ｄ－１～Ｄ－７）について、２５℃又は４０℃２週の保管条件における酸性側類縁体の増加量（％）を示すグラフである。●は２０ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸、■は２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ヒスチジンを緩衝剤として用いたサンプルの結果を示す。 等張化剤（Ｄ－マンニトール又はＤ－ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の多量体量（％）を示すグラフである。 等張化剤（Ｄ－マンニトール又はＤ－ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の分解物量（％）を示すグラフである。 等張化剤（Ｄ－マンニトール又はＤ－ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の酸性側類縁体量（％）を示すグラフである。
　本明細書において「安定」とは、例えば、熱、光、温度、湿度、振とう、及び／又は凍結融解に対して安定であることを意味する。例えば、医薬組成物を所定条件下に保存後、前記医薬組成物中に含まれる、多量体、分解物、酸性側類縁体、又は塩基性側類縁体の量、あるいはそれらの総量がある特定量以下であることを意味する。また、ある態様として、医薬組成物を所定条件下に保存後、不溶性異物が、目視により観察されないことを意味する。
　前記「多量体」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが集まって生成する複合体である。多量体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ－ＨＰＬＣ法）、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、マイクロフローイメージング法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ－ＨＰＬＣ法である。ＳＥ－ＨＰＬＣ法においては、検出されたピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算する。なお、メインピークとは、活性本体のピークを意味する。ＳＥ－ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体とする。ＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定される多量体の量としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下である。
　前記「分解物」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの一部が脱離して生成する断片体である。分解物を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、ＳＥ－ＨＰＬＣ法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ－ＨＰＬＣ法である。ＳＥ－ＨＰＬＣ法による分解物の測定方法は前記したＳＥ－ＨＰＬＣ法による多量体の測定と同様にして行う。なお、ＳＥ－ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が長いピークを合わせて分解物とする。ＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定される分解物の量としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下である。
　また、分解物の量の増加量（特定の条件で特定の期間保管後の分解物量と試験（保存）開始時の分解物量の差分）については、例えば、２．５％以下、ある態様として２．０％以下であり、ある態様としては、２５℃２週、１箇月（４週）又は４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が例えば２．５％以下、ある態様として２．０％以下であり、別の態様としては、４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が２．５％以下であり、他の態様としては、４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が２．０％以下である。
　前記「酸性側類縁体」は、陽イオン交換クロマトグラフ法、又はイメージングキャピラリー等電点電気泳動法による分析で主成分より早く溶出するピークとして認められる類縁体である。酸性側類縁体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、陽イオン交換クロマトグラフ法（ＩＥ－ＨＰＬＣ法）、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ法）等が含まれ、ある態様としては、ＩＥ－ＨＰＬＣ法、又はｉｃＩＥＦ法である。ＩＥ－ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は、前記したＳＥ－ＨＰＬＣ法と同様にしてピークの百分率（％）を計算する。ＩＥ－ＨＰＬＣ法及び／又はｉｃＩＥＦ法により測定される酸性側類縁体の量としては、ある態様として５０％以下、別の態様として３５％以下、他の態様として２５％以下である。
　また、酸性側類縁体の量の増加量（特定の条件で特定の期間保管後の酸性側類縁体量と試験（保存）開始時の酸性側類縁量の差分）については、例えば、１５％以下、ある態様として１０％以下である。より具体的には、２５℃２週、１箇月（４週）又は４０℃２週保存後の酸性側類縁体の量の増加量が例えば１５％以下、ある態様として１０％以下である。
　前記「塩基性側類縁体」は、ＩＥ－ＨＰＬＣ法又はｉｃＩＥＦ法による分析で主成分より遅く溶出するピークとして認められる類縁体である。塩基性側類縁体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、ＩＥ－ＨＰＬＣ法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ｉｃＩＥＦ法等が含まれ、ある態様としては、ＩＥ－ＨＰＬＣ法又はｉｃＩＥＦ法である。ＩＥ－ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は、前記したＳＥ－ＨＰＬＣ法と同様にしてピークの百分率（％）を計算する。ｉｃＩＥＦ法により測定される塩基性側類縁体の量としては、ある態様として５０％以下、別の態様として２５％以下、他の態様として２０％以下である。
　前記「不溶性異物」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントや医薬品添加物等が集まって生成する不溶性の複合体である。不溶性異物は例えば、第十六改正日本薬局方に記載の注射剤の不溶性異物検査法又はそれに準じて目視により確認することができる。
　「安定な医薬組成物」とは、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも１箇月（４週）、好ましくは３箇月、より好ましくは６箇月、さらに好ましくは１年、より好ましくは２年；又は室温（２２～２８℃）で少なくとも２週、好ましくは１箇月、さらに好ましくは３箇月、より好ましくは６箇月、好適には１年；又は加速条件（３７～４３℃）で少なくとも２週、好ましくは１箇月（４週）、多量体、分解物、酸性側類縁体又は塩基性側類縁体の量、あるいはそれらの総量が上述のある特定量以下である医薬組成物を意味する。
　抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万～７万の重鎖と２万～３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のポリペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万～１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
　鎖内Ｓ－Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００～１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＬと表される。
　抗体の抗原結合部位は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよばれている。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
　抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ－Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ－Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ－Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ－Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
　抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾等が挙げられ、種々の抗体において、重鎖Ｃ末端のリジンが欠失することや重鎖Ｎ末端のグルタミンの大部分がピログルタミン酸への修飾を受けることが知られている（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426）。また、このような翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことも当該分野で知られている（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
　本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、ＰＥＧ化した以下の（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント及び／又はＰＥＧ化した以下の（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（国際公開第２０１３／０２２０８３号）
　１つの実施形態において、前記（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾は、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である。１つの実施形態において、前記（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾されたアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントである。
　本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖定常領域としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、又はＩｇγ４の定常領域、軽鎖定常領域としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得る。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖定常領域として、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖定常領域として、ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。
　１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（３）及び／又は（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
　１つの実施形態において、前記（４）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾は、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である。１つの実施形態において、前記（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントである。
　１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、ＰＥＧ化した以下の（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント及びＰＥＧ化した以下の（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
　１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（３）及び（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
　本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の特徴を有する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
配列番号１の３１から３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１の５０から６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１の９８から１１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３の２４から３９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３の５５から６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３の９４から１０２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
　本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される宿主細胞を培養することで生産できる該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される宿主細胞を培養することで生産できる該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　本発明において、Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖のフラグメントから構成される、１価の抗体のフラグメントであり、このヒンジ領域の部分には、重鎖－軽鎖間のＳ－Ｓ結合を構成しているシステイン残基以外の少なくとも１つのシステイン残基（本明細書中、「ヒンジ領域システイン」とも称する）が含まれる。ヒンジ領域システインは、ＰＥＧでの修飾部位として使用することができる。Ｆａｂ’フラグメント中のヒンジ領域システインの数は、使用する抗体のクラスによって１～数個の間で異なり得るが、当業者によって容易に調整可能である。例えば、ヒトのＩｇＧ１クラス（通常、ヒンジ領域において、２個のヒンジ領域システインを有する）のＦａｂ’フラグメントを作製する場合、重鎖のヒンジ領域において、最初のヒンジ領域システインのコード部位と２番目のヒンジ領域システインのコード部位との間に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に１個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができ、２番目のヒンジ領域システインのコード部位の後に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に２個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができる。
　本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化することにより作製することができる。Ｆａｂ’フラグメントへのＰＥＧの結合は、当該分野で公知の方法を使用して実施可能である（例えば、欧州特許第０９４８５４４号明細書）。本発明においては、直鎖又は分枝鎖の、任意の平均分子量のＰＥＧ又はその誘導体が使用可能であり、使用目的に応じて当業者により容易に選択され得る。ヒンジ領域システインへのＰＥＧの結合を容易にするために、ＰＥＧの誘導体を使用してもよい。例えば、マレイミドのようなチオール反応基をリンカーを介して結合させたＰＥＧ誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させることができる。一般的にＰＥＧの平均分子量は、約５００～約５００００Ｄａであり、好ましくは、約５０００～約４００００Ｄａであり、より好ましくは、約１００００～約４００００Ｄａの範囲である。
　本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、本明細書に開示される抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者に容易に作製され得る。本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製方法としては、国際公開第２０１３／０２２０８３号に開示された方法が挙げられる。
　一単位医薬組成物（製剤）中のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの量としては、Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で、例えば、０．１～２００ｍｇ、ある態様として、０．１～４０ｍｇ、別の態様として、２０～４０ｍｇ、他の態様として、６０～１５０ｍｇ、また他の態様として、４０～１２０ｍｇが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　医薬組成物が固体状態（例えば、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤など）の場合、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの量としては、Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で、例えば、０．１～２００ｍｇ、ある態様として、０．１～４０ｍｇ、別の態様として、２０～４０ｍｇ、他の態様として、６０～１５０ｍｇ、また他の態様として、４０～１２０ｍｇが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　用時溶解するとき、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度としては、用時溶解後のＦａｂ’－ＰＥＧ換算で、例えば、０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、ある態様として、０．１～４０ｍｇ／ｍＬ、別の態様として、２０～４０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として、６０～１５０ｍｇ／ｍＬ、また他の態様として、４０～１２０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　医薬組成物が液体状態（溶液）の場合、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度としては、Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で、例えば、０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、ある態様として、０．１～４０ｍｇ／ｍＬ、別の態様として、２０～４０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として、６０～１５０ｍｇ／ｍＬ、また他の態様として、４０～１２０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　用量としては、例えば、Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で、例えば、０．１～２００ｍｇ、ある態様として、０．１～４０ｍｇ、別の態様として、２０～４０ｍｇ、他の態様として、６０～１５０ｍｇ、また他の態様として、４０～１２０ｍｇを含む。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　適応症としては、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防及び／又は治療、例えば、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等を含む。
　本発明に用いられる「製薬学的に許容される緩衝剤」としては、製薬学的に許容され、溶液状態において、所望のｐＨ範囲内で緩衝能を有するものであれば、特に制限されない。
　具体的には、次のｐＨ範囲内で緩衝能を有するものである。例えば、４～５．５、ある態様として４．０～５．５、別の態様として４．５～５．５、他の態様として４．６～５．２である。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。また、ｐＨは、医薬組成物が液体製剤である場合には、該液体製剤のｐＨとし、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液のｐＨとする。
　緩衝剤成分としては、例えば、クエン酸、酢酸、若しくはヒスチジン、又はそれらの製薬学的に許容される塩等を含む。別の態様としては、クエン酸、酢酸、又はそれらの製薬学的に許容される塩等を含む。他の態様としては、無水クエン酸及び／又はクエン酸三ナトリウム二水和物を含む。
　これらの緩衝剤成分は、１種又は２種以上適宜適量使用することができる。なお、ｐＨを所望のｐＨ範囲内に調整するために、塩酸や水酸化ナトリウム等を適宜加えてもよい。
　緩衝剤の濃度は、ｐＨを所望のｐＨ範囲内に調整できる量であれば、特に制限されない。緩衝剤の濃度は、注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、例えば、１～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、他の態様として、５～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、また他の態様として、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　緩衝剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の緩衝剤が上述の濃度となる量である。
　本発明に用いられる「製薬学的に許容される等張化剤」としては、製薬学的に許容され、等張作用を有し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響を及ぼさないもの又は安定化作用を有するものであれば、特に制限されない。
　具体的には、例えば、塩類、アミノ酸類、糖又は糖アルコール類を挙げることができる。
　塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム等を挙げることができる。ある態様としては、塩化ナトリウムである。
　アミノ酸類としては、例えば、アルギニン（Ｌ－アルギニン）又はその製薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）、グリシン、リシン、オルニチン等を挙げることができる。ある態様としては、アルギニン、グリシンであり、別の態様としてはアルギニンである。
　糖又は糖アルコール類としては、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール等を挙げることができる。ある態様として、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトールであり、別の態様として、Ｄ－ソルビトールである。
　等張化剤としては、ある態様として、アルギニン又はその製薬学的に許容される塩、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、イノシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトールであり、別の態様としては、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｄ－ソルビトールである。
　これらの等張化剤は、１種又は２種以上適宜選択され使用することができる。
　なお、塩類、アミノ酸類、糖又は糖アルコールは、ＰＥＧ化抗ヒト抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響をおよぼさない又は安定化する範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
　等張化剤の濃度は、等張作用を有し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響を及ぼさない濃度であれば、特に制限されない。
　注射用水により溶解され溶液状態（液剤）の場合の濃度として、例えば、１～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、ある態様として、１～４００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１～３００ｍｍｏｌ／Ｌ、他の態様として、５０～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、また他の態様として、１００～３００ｍｍｏｌ／Ｌ、また別の態様として、２００～３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに別の態様として、１００～２００ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　等張化剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の等張化剤が上述の濃度となる量である。
　本発明に用いられる「製薬学的に許容される界面活性剤」としては、製薬学的に許容され、界面活性作用及びＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定化作用を有するものであれば、特に制限されない。
　具体的には、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール等のグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル等のポリグリセロール脂肪酸エステル；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等のポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ジステアリン酸ポリエチレングリコール等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等ポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンオクタデカンアミド等の６～１８のＨＬＢを有する界面活性剤；陰イオン性界面活性剤、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等のＣ１０～Ｃ１８アルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、添加されたエチレンオキシド単位の平均モル数が２～４であり、アルキル基の炭素原子の数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；スルホコハク酸ラウリルナトリウム等のＣ８～Ｃ１８アルキル基を有するスルホコハク酸アルキル塩；レシチン、グリセロリン脂質等の天然の界面活性剤；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；又はＣ１２～Ｃ１８脂肪酸のショ糖エステルを含む。
　これらの界面活性剤は、１種又は２種以上適宜選択され使用することができる。
　ある態様として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルであり、別の態様として、ポリソルベート又はプルロニック型界面活性剤であり、他の態様として、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５又はプルロニック型界面活性剤であり、また他の態様として、ポリソルベート２０、８０又はポロキサマー（ポロキサマー１８８）、別の態様として、ポリソルベート８０である。
　なお、界面活性剤は、不溶性異物等の形成を抑制する作用を有しており、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化させる範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
　界面活性剤の濃度は、界面活性作用及びＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定化作用を有する濃度であれば、特に制限されない。
　注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、０．００１～１％（ｗ／ｖ）、ある態様として０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）、別の態様として０．０１～０．０３％（ｗ／ｖ）である。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
　界面活性剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の界面活性剤が上述の濃度となる量である。
　本発明の医薬組成物は、溶液を容器に充填して、液体製剤として、また、溶液を凍結乾燥法や噴霧乾燥法により、凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤等の非経口医薬組成物として、提供することができる。好適には、液体製剤である。
　本発明の医薬組成物の中でも特に、クエン酸、アルギニン及びポリソルベートを含む液体製剤、又は、クエン酸、Ｄ－ソルビトール及びポリソルベートを含む液体製剤が好適である。
　本発明の医薬組成物には、所望により、懸濁剤、溶解補助剤、保存剤、吸着防止剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の医薬品添加物を適宜添加することができる。
　懸濁剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
　溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
　保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
　吸着防止剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
　含硫還元剤としては、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
　酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
　各種医薬品添加物は、本発明の所望の効果を達成できる量の範囲で、適宜適量使用することができる。
　本発明の医薬組成物の製造方法は、自体公知の製造方法により、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨを４～５．５に調整する方法を含み、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有することができる。
　本発明の医薬組成物を充填する容器は、使用目的に応じて選択することができる。例えば、バイアル、アンプル、注射器のような規定容量の形状のもの、瓶のような大容量の形状のものを含む。ある態様として注射器（ディスポーザブル注射器を含む）を含む。該注射器に予め溶液を充填して、プレフィルドシリンジ溶液製剤として提供することにより、医療現場において、溶解操作等の操作が不要となり、迅速な対応が可能となる。
　容器の材質については、ガラス、プラスチック等が挙げられる。また、容器内の表面処理としては、シリカコート処理、シリコーンコート処理、サルファー処理、各種低アルカリ処理等が施されてもよい。
　本発明には、ｐＨを４～５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法が含まれる。本発明の安定化方法では、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に使用することができる。
　本発明の安定化方法で用いる「ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント」、「製薬学的に許容される緩衝剤」、「製薬学的に許容される等張化剤」、及び「製薬学的に許容される界面活性剤」については、本発明の医薬組成物における当該説明をそのまま適用することができる。また、これらの各成分の配合量、配合方法等については、本発明の医薬組成物における当該説明をそのまま適用することができる。
　本発明の安定化方法では、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを製造する際に、ｐＨを４～５．５に調整することにより、また、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に使用することにより、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制することができる。
　以下、参考例、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定解釈されるものではない。
　実施例において用いられた、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、国際公開第２０１３／０２２０８３号の実施例１９に記載の製法又はそれに準じた方法により入手した。
《参考例：ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製》
　本実施例で用いた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１に、該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号４に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１の３１から３５、５０から６５、９８から１１０までのアミノ酸配列からなる。該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、配列番号３の２４から３９、５５から６１、９４から１０２までのアミノ酸配列からなる。
　国際公開第２０１３／０２２０８３号に従い、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ社）を構築した。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションすることによりＦａｂ’フラグメントの安定発現化株を取得し、Ｆａｂ’フラグメントを発現させた。培養上清をアフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、Ｆａｂ’フラグメントを得た。なお、工程には、ウイルスの不活化工程とウイルス除去膜工程を含む。次いで、得られた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを還元剤で還元し、ＰＥＧマレイミド（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＧＬ２－４００ＭＡ、日油株式会社製）と結合させた。さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製した。なお、精製したＦａｂ’フラグメントのアミノ酸修飾を分析した結果、その大部分において重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化が生じていた。
《実施例１：至適ｐＨ選定による安定化効果》
　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で１０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約２０ｍｇ／ｍＬ）となるように、表１に示す緩衝液（濃度はいずれも２０ｍｍｏｌ／Ｌ）で希釈調製した処方液（試料Ｎｏ．Ａ－１～Ａ－８）を０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、倒置状態で２５℃１箇月の保管を実施した。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　また、Ｆａｂ’換算濃度及びＦａｂ’－ＰＥＧ換算濃度は、紫外・可視分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ　２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＭＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて測定した。２μＬのサンプルをステージにアプライし、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。タンパク濃度は、得られた２８０ｎｍ吸光度、及び吸光係数１．４８ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ（Ｆａｂ’換算濃度の場合）、又は０．７９ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算濃度の場合）を用いて算出した。
　ＳＥ－ＨＰＬＣ法、ＩＥ－ＨＰＬＣ法による評価結果を表１に示す。
　ＳＥ－ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続し、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ溶液に、１０％となるようアセトニトリルを添加した組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。サンプルはＦａｂ’換算で５０μｇ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約１００μｇ）となる注入量とした。カラム温度は３０℃、サンプル温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
　ＳＥ－ＨＰＬＣ測定で検出されたピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算した。なお、メインピークとは、活性本体のピークを意味する。
　ＳＥ－ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体、保持時間が長いピークを合わせて分解物とした。
　ＩＥ－ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｐｒｏｐａｃ　ＷＣＸ－１０　カラム（Ｄｉｏｎｅｘ製）を接続し、測定を行った。移動相Ａラインに２０ｍｍｏｌ／Ｌの２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ｐＨ６．０、移動相Ｂラインに２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ／５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム／ｐＨ６．０の移動相を接続し、１ｍＬ／分の流速で流した。サンプルは移動相ＡでＦａｂ’換算濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬを注入した。グラジエントプログラムは、移動相Ｂを０％で２分間保持後、５０分間で５％まで移動相Ｂの割合を直線的に増加させた。続いて、１００％まで移動相Ｂの割合を直線的に増加させ、洗浄を行った後、移動相Ｂの割合を０％まで直線的に減少させ、約１０分間保持し、次のサンプル注入まで平衡化を行った。分析時間は約７０分で、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。カラム温度は４０℃、サンプル温度は５℃に設定した。
　ピークの百分率はＳＥ－ＨＰＬＣと同様の方法により計算した。
　上記試験におけるＩＥ－ＨＰＬＣの１２分付近のピークを酸性側類縁体とした。
　結果、ｐＨ７付近のＡ－５では多量体、分解物、酸性側類縁体の増加が認められた。
　本結果より、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントはｐＨ４～６付近で製剤化することで、多量体、分解物、及び酸性側類縁体の生成が抑制されることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
《実施例２：等張化剤の選択による安定化効果》
　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ５．５）の緩衝液の処方に６種の医薬品添加剤物（Ｌ－アルギニン塩酸塩、塩化ナトリウム、グリシン、Ｄ－ソルビトール、スクロース及びＤ－マンニトール）を等張となる濃度で加えた処方（試料Ｎｏ．Ｂ－１～Ｂ－７）における、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性（多量体量、分解物量、多分散度）を評価した。各処方組成に調製したサンプルを、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、正置状態で４０℃４週の保管を実施した。結果を表２に示す。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　多量体量、分解物量はＳＥ－ＨＰＬＣ法により、実施例１と同様にして分析した。
　多分散度の測定はＤｙｎａＰｒｏ　Ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ製）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した。
　塩化ナトリウム添加処方では、４０℃４週保管後の多量体量及び分解物量が、無添加処方と比較して、増加する傾向が認められた。
　Ｌ－アルギニン塩酸塩添加処方、及びグリシン添加処方では、無添加処方と比較して、４０℃４週保管後の分解物量の増加が認められた。Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール添加処方では、４０℃４週保管後の、多量体量と分解物量、多分散度は無添加処方と同等であった。
　なお、無添加の処方と比較して、分解物量の増加のあった処方について、多量体量、酸性側類縁体量、塩基性側類縁体量等の変動等を考慮のうえ、総合的に安定性を判断する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
《実施例３：界面活性剤の添加による安定化効果》
　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ５．５）処方に、界面活性剤であるポリソルベート８０を３つの濃度水準（０．０１、０．０２、０．０５％（ｗ／ｖ））で添加したサンプル（試料Ｎｏ．Ｃ－１～Ｃ－４）について、凍結融解ストレスに対する物理的安定性を評価した。サンプルは、各処方組成に調製し、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
　凍結融解ストレス試験は、サンプルを正置状態で－８０℃の冷凍庫内に保管し凍結させた後、サンプルを冷凍庫から取り出し、５℃の冷蔵庫内に正置状態で保管し、融解させた。この凍結融解サイクルを３回繰り返すことにより行った。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　目視による、外観評価の結果を表３に示す。
　外観評価では、ポリソルベート８０無添加処方で、凍結融解ストレスによる多数の不溶性異物の発生が認められたが、ポリソルベート８０を添加した処方では、いずれの濃度においても不溶性異物は認められなかった。
《実施例４：等張化剤、界面活性剤を含む処方の至適ｐＨ選定による安定化効果１》
　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、又はヒスチジンを緩衝剤とし、２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－マンニトール、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を添加した処方（試料Ｎｏ．Ｄ－１～Ｄ－７）について、ｐＨ４．０～６．０の範囲でサンプルを調製し、正置状態での２５℃及び４０℃保管時における安定性をＳＥ－ＨＰＬＣ法、ＩＥ－ＨＰＬＣ法、ＤＬＳ法で評価した。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　ＳＥ－ＨＰＬＣ法及びＩＥ－ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして、ＤＬＳ法は実施例２と同様にして測定した。
　結果を図１、図２、及び表４に示す。
　分解物は、ｐＨ５．０で、初期品に比較して、増加量が最小となった。また、酸性側類縁体は、いずれの保管条件においても、ｐＨが高くなるほど初期品からの増加量は大きくなる傾向が認められた。
　表４のＤＬＳ測定結果からは、４０℃２週保管品において、ｐＨが低いほど平均粒子径及び多分散度の値が大きくなっており、凝集体を形成しやすい傾向が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
《実施例５：等張化剤、界面活性剤を含む処方の至適ｐＨ選定による安定化効果２》
　ｐＨ４．６、ｐＨ４．９、及びｐＨ５．２にクエン酸（濃度はいずれも２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて調製した処方液に、２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－マンニトール及び０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加えた処方、及び２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－マンニトールの代わりに２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－ソルビトールを添加した処方（ｐＨ４．９）について、正置状態での５℃、２５℃、４０℃における保管安定性を評価した。なお、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’－ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）である。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　多量体及び分解物はＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はＩＥ－ＨＰＬＣ法により測定した。ＳＥ－ＨＰＬＣ法及びＩＥ－ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして実施した。
　結果を図３～図５に示す。
　ｐＨ４．６～５．２の範囲で、Ｄ－マンニトール処方及びＤ－ソルビトール処方ともに安定であることが確かめられた。
《実施例６：等張化剤、界面活性剤を含む処方の緩衝剤選定による安定化効果》
　表５に示す２つの処方（試料Ｎｏ．Ｅ－１及びＥ－２）について、正置状態で各条件（５℃、２５℃、４０℃）下４週保管後の安定性を評価した。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
　多量体及び分解物はＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はＩＥ－ＨＰＬＣ法により測定した。ＳＥ－ＨＰＬＣ法及びＩＥ－ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして実施した。
　結果を表６に示す。
　Ｅ－１及びＥ－２ともに安定であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
《実施例７：緩衝剤、等張化剤、界面活性剤を含む処方の安定性評価》
　２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を用いてｐＨ４．９に調製した処方溶液に、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’－ＰＥＧ換算で４０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約２０ｍｇ／ｍＬ）、Ｄ－ソルビトール濃度が２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した表７に示す処方について、凍結融解あるいは振とうあるいは光ストレスを与えた後、及び、正置状態で各条件（－２０℃、５℃、２５℃）下３箇月保管後の安定性を評価した。なお、クエン酸とクエン酸三ナトリウム二水和物は合計がクエン酸として２０ｍｍｏｌ／Ｌとなり、ｐＨが４．９となる比率で添加した。塩酸又は水酸化ナトリウムは、必要に応じて緩衝液調製時にｐＨ４．６～５．２となるように添加した。調製したサンプルは０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、３ｍＬバイアルに１．２ｍＬ充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、各条件で保管した。
　凍結融解試験については、実施例３と同様にして行った。
　振とう安定性試験については、サンプルを横置状態で振とう機（ＲＥＣＩＰＲＯ　ＳＨＡＫＥＲ　ＳＲ－１；ＴＡＩＴＥＣ製）に設置し、室温下、１５０ｒｐｍの速度で４８時間振とうすることにより行った。
　光安定性試験については、サンプルを横置状態で保管し、Ｄ６５ランプを用いて１０００ｌｕｘの光を４８時間照射することにより行った。
　外観は目視観察、ｐＨはｐＨメーター、多量体及び分解物はＳＥ－ＨＰＬＣ法、酸性側類縁体はＩＥ－ＨＰＬＣ法、平均粒子径及び多分散度はＤＬＳ法により測定した。目視観察は室内光下で実施し、ｐＨは、校正用標準液を用いて校正を実施したｐＨメーターを用いて実施、ＳＥ－ＨＰＬＣ法及びＩＥ－ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして、また、ＤＬＳ法は実施例２と同様にして実施した。
　結果を表８及び表９に示すが、保管後においても安定であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
《実施例８：高濃度製剤の至適ｐＨ選定による安定化効果》
　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’－ＰＥＧ換算で１００ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約５０ｍｇ／ｍＬ）となるように、表１０に示す組成になるようスピンカラムを用いて緩衝液交換・濃縮を実施し、０．０２ｗ／ｖ％となるようにポリソルベート８０を添加の上、０．２２μｍフィルターでろ過した。ろ過液を０．２５ｍＬ又は１．１５ｍＬずつ３ｍＬガラスバイアルに充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、２５℃、４０℃における、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの保管安定性（多量体量、分解物量、酸性側類縁体量）を評価した。
　なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に水酸化ナトリウムを添加した。
　多量体及び分解物はＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はｉｃＩＥＦ法により測定した。
　ＳＥ－ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／４００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ溶液に、１７．５％となるようアセトニトリルを添加した組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。サンプルはＦａｂ’－ＰＥＧ換算で５０μｇとなる注入量とした。カラム温度は３０℃、サンプル温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
　ｉｃＩＥＦ測定は、ｉＣＥ３システムに、ｃＩＥＦ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　ＦＣ－Ｃｏａｔｅｄ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｉｍｐｌｅ製）を接続し、測定を行った。約０．２％メチルセルロース、約２．７％　Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０、約１．６％　Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ８－１０．５、約１．１％ＣＨＡＰＳ、約０．５％ｐＩマーカー５．８５、約０．５％ｐＩマーカー９．４６から成るサンプルマトリックス１２０μＬと、超純水でＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度１０ｍｇ／ｍＬに希釈したサンプル５μＬを混和し、測定試料とした。Ｐｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇは１５００Ｖで１分、Ｆｏｃｕｓｉｎｇは３０００Ｖで１６分実施し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
　表１１に多量体量測定結果、表１２に分解物測定結果、及び表１３に酸性側類縁体測定結果を示す。高濃度製剤においてもｐＨが高くなるほど、多量体、分解物、酸性側類縁体量が増加する傾向が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
《実施例９：高濃度製剤の緩衝剤、等張化剤、界面活性剤を含む処方の安定性評価検討》
　実施例８と同様にして、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を用いて、表１４のｐＨに調製した処方溶液に、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’－ＰＥＧ換算で１００ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約５０ｍｇ／ｍＬ）、Ｄ－ソルビトール濃度が２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ－アルギニン塩酸塩濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した表１４に示す処方について、正置状態で各条件（５℃、２５℃）下１箇月又は３箇月保管後の安定性を評価した。調製したサンプルは０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、３ｍＬバイアルに０．８ｍＬ充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、各条件で保管した。
　多量体及び分解物はＳＥ－ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体及び塩基性側類縁体はｉｃＩＥＦ法により測定した。ＳＥ－ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は実施例８と同様にして実施した。
　結果を表１５に示すが、クエン酸、アルギニン及びポリソルベートを含む高濃度製剤、又は、クエン酸、Ｄ－ソルビトール及びポリソルベートを含む高濃度製剤は保管後においても安定であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明によれば、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物、詳細には、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
　配列番号１の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントのアミノ酸配列であり、配列番号２の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメント遺伝子の塩基配列であり、配列番号３の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号４の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖遺伝子の塩基配列である。

Claims (19)

  1. 　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨが４～５．５である、安定な医薬組成物であって、
    　該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
    （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
    （２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
    から選択され、
    前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、医薬組成物。
  2. 　製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　ｐＨが４．５～５．５である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸、酢酸、及びヒスチジン、並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 　製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸又はその製薬学的に許容される塩である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 　製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１～２００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　医薬組成物が液体製剤である、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 　製薬学的に許容される等張化剤が、アルギニン、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 　製薬学的に許容される等張化剤の濃度が、１～５００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 　製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーの少なくとも一方である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 　製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 　製薬学的に許容される界面活性剤の濃度が、０．００１～１％（ｗ／ｖ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度が、０．１～２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  16. 　ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  17. 　抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、請求項１又は１６に記載の医薬組成物。
  18. 　ｐＨを４～５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法であって、
    　該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
    （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
    （２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
    から選択され、
    前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、前記方法。
  19. 　製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を使用する、請求項１８に記載の方法。
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