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WO2017061600A1 - マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法 - Google Patents

マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法 Download PDF

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WO2017061600A1
WO2017061600A1 PCT/JP2016/079956 JP2016079956W WO2017061600A1 WO 2017061600 A1 WO2017061600 A1 WO 2017061600A1 JP 2016079956 W JP2016079956 W JP 2016079956W WO 2017061600 A1 WO2017061600 A1 WO 2017061600A1
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WO
WIPO (PCT)
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microwell
substrate
microfluidic device
sample
wall layer
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/079956
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English (en)
French (fr)
Inventor
圭佑 後藤
牧野　洋一
星野　昭裕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Inc
Original Assignee
Toppan Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Printing Co Ltd filed Critical Toppan Printing Co Ltd
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Publication of WO2017061600A1 publication Critical patent/WO2017061600A1/ja
Priority to US15/945,272 priority patent/US11097269B2/en
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    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device having a microwell array and a sample analysis method using the microfluidic device.
  • microwell arrays having various types of fine channel structures formed using etching techniques, photolithography techniques, or fine plastic molding methods used in semiconductor circuit manufacturing techniques have been studied. ing.
  • the wells of these microwell arrays are used as chemical reaction vessels for causing various biochemical or chemical reactions in a small volume of fluid.
  • Materials for manufacturing microfluidic devices having microwell arrays include hard materials such as silicone and glass, various polymer resins such as PDMS (polydimethylsiloxane), and soft materials such as silicone rubber. It has been.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose using such a microfluidic device as various microchips and biochips.
  • digital PCR technology involves PCR amplification by dividing a mixture of a reagent and nucleic acid into countless microdroplets so that a signal such as fluorescence can be detected from the droplet containing nucleic acid. This is a technique for performing quantification by counting the number of detected droplets.
  • a method for producing a microdroplet As a method for producing a microdroplet, a method for producing a microdroplet by dividing with a sealing liquid, or a reagent is put into a hole formed on a substrate, and then a microdroplet is made by adding a sealing liquid. A manufacturing method and the like are being studied.
  • Patent Document 1 In a fluid system for acquiring a fluorescence value emitted from a biomolecule, a method for reducing autofluorescence by adding a pigment to a material constituting a fluid device used in the fluid system has been studied (for example, Patent Document 1). To 3). This is because if the auto-fluorescence derived from the material is detected as noise, it interferes with the detection of the fluorescence signal.
  • the size of the microwell Since microwells are very small, if a pigment is added when forming a microwell array, the size of the microwells may be close to the size of the microwells depending on the particle size of the pigment, and the microwells may not be formed with high accuracy.
  • the source of such autofluorescence is not limited to the material forming the microwell array. Therefore, it is difficult to completely solve the problem only by reducing the autofluorescence of the material.
  • the microfluidic device includes a substrate capable of transmitting electromagnetic waves and having no autofluorescence, and a wall portion formed on the substrate and having a plurality of through holes formed in the thickness direction.
  • a microwell array having a layer, and a lid member disposed to face the substrate in a state of being separated from the wall layer, and the microwell is formed by the substrate and the through hole formed in the wall layer.
  • the wall layer is formed of a material containing a colored component that absorbs an electromagnetic wave having a predetermined wavelength.
  • the colored component may be a pigment, and the particle diameter of the pigment may be 1/5 or less of the minimum dimension of the microwell.
  • a sample analysis method is a sample analysis method using the microfluidic device according to the first aspect, wherein a sample is supplied into the microwell (sample supply step), and a sealing liquid The sample is encapsulated in the microwell using (encapsulation step), and after encapsulating the sample in the microwell, the microfluidic device is irradiated with electromagnetic waves (electromagnetic wave irradiation step), and the electromagnetic waves are irradiated The microwell is observed from the substrate side (sample observation step).
  • microwell array According to the microwell array according to the first aspect of the present invention, it is possible to provide a microwell array in which microwells are formed with high accuracy while suppressing autofluorescence of the material. Moreover, according to the sample analysis method according to the second aspect of the present invention, it is possible to analyze the sample accommodated in the microwell while suitably eliminating minute fluorescence noise.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line bb of FIG. It is a figure which shows the state at the time of use of the microfluidic device which concerns on one Embodiment of this invention. It is a figure which shows the state at the time of use of the microfluidic device which concerns on one Embodiment of this invention. It is a figure for demonstrating the effect of the sample analysis method using the microfluidic device which concerns on one Embodiment of this invention. It is a table
  • FIG. 2 is a microscopic image of Example 1.
  • Example 2 is a microscopic image of Comparative Example 1.
  • 4 is a table showing the difference in fluorescence intensity depending on the presence or absence of a pigment in the material used in Example 1. It is a perspective view which shows the modification of the microfluidic device which concerns on one Embodiment of this invention. 4 is a result of bright field observation of Example 2. It is a result of the bright field observation of the comparative example 2.
  • 2 is a microscopic image of Example 2. It is a microscope image of the comparative example 2.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a microfluidic device 1 according to this embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line bb in FIG.
  • the microfluidic device 1 includes a substrate 10, a lid member 20, and a microwell array 30.
  • the lid member 20 is disposed opposite to the substrate 10.
  • the microwell array 30 is provided between the substrate 10 and the lid member 20.
  • the substrate 10 can transmit electromagnetic waves.
  • the electromagnetic wave include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays. Since the substrate 10 can transmit electromagnetic waves, fluorescence, phosphorescence, and the like generated in the sample sealed in the microfluidic device 1 can be observed from the substrate 10 side.
  • the substrate 10 may be able to transmit only electromagnetic waves in a predetermined wavelength range. For example, when detecting fluorescence having a peak in the wavelength range of 350 to 700 nm, which is the visible light region, of the sample in the microwell, a substrate that can transmit at least visible light in the wavelength range may be used.
  • Examples of the material for forming the substrate 10 include glass and resin.
  • Examples of the resin substrate include ABS resin, polycarbonate resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl acetate, and PET (polyethylene). Terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate) and the like. These resins may contain various additives, and a plurality of resins may be mixed.
  • substantially has no autofluorescence means that the substrate has no autofluorescence of the wavelength used for detection of the experimental results, or has influence on detection of the experimental results even if it has autofluorescence. It means that it is weak enough not to give. For example, if the autofluorescence is about 1/2 or less and 1/10 or less compared to the fluorescence of the detection target, it can be said that it is so weak that it does not affect the detection of the experimental result.
  • the thickness of the substrate 10 can be determined as appropriate, but is preferably 5 millimeters (mm) or less, more preferably 2 mm or less, and even more preferably 1.6 mm or less.
  • the lid member 20 is a member formed in a plate shape or a sheet shape, and has a first hole 21 and a second hole 22 penetrating in the thickness direction.
  • the first hole 21 and the second hole 22 communicate with the internal space S including the microwell array 30 in the completed microfluidic device 1.
  • the first hole 21 and the second hole 22 function as an inlet for supplying fluid to the internal space and an outlet for discharging the fluid, respectively.
  • the material for forming the lid member 20 and the thickness of the lid member 20 can be the same as those of the substrate 10.
  • the electromagnetic wave permeability of the lid member 20 can be set as appropriate. That is, when the electromagnetic wave irradiation process to be described later is not performed from the lid member 20 side, the lid member 20 may not be able to transmit electromagnetic waves.
  • the microwell array 30 has a bottom layer 31, a wall layer 32, and a plurality of microwells 33.
  • the bottom layer 31 is provided on the substrate 10.
  • the wall layer 32 is formed on the bottom layer 31.
  • the plurality of microwells 33 includes a bottom layer 31 and a plurality of through holes 32 a formed in the thickness direction of the wall layer 32.
  • the plurality of microwells 33 are formed in an array in the wall layer 32.
  • the bottom layer 31 constitutes the bottom surface of the microwell 33. Therefore, when it is desired to impart hydrophilicity to the bottom surface, the bottom layer 31 may be formed from a hydrophilic material. If it is desired to impart hydrophobicity to the bottom surface, the bottom layer 31 may be formed of a hydrophobic material.
  • the bottom layer 31 is preferably formed so that the bottom layer 31 can transmit electromagnetic waves, so that it does not hinder the observation of the sample in the microwell 33 from the substrate 10 side.
  • the bottom layer 31 is preferably made of a material that does not substantially have autofluorescence.
  • the integrated substrate 10 and the bottom layer 31 may be simply referred to as a substrate.
  • the wall layer 32 may be formed directly on the substrate 10 without providing the bottom layer 31. Therefore, in this case, the microwell 33 is constituted by the surface of the substrate 10 and the through hole 32 a of the wall portion layer 32.
  • the wall layer 32 is made of a colored material and has a plurality of through holes 32a provided in an array when viewed in the thickness direction.
  • the inner surface of each through hole 32 a constitutes the inner wall surface of each microwell 33.
  • Examples of the material forming the wall layer 32 include a material in which a colored component that absorbs an electromagnetic wave having a predetermined wavelength is mixed with a resin.
  • a resin material in consideration of the characteristics required for the microwell 33, etc., a hydrophilic resin in which the molecule of the resin component has a hydrophilic group, and a hydrophobic resin in which the molecule of the resin component has a hydrophobic group Any of these can be used.
  • hydrophilic group examples include a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfone group, a sulfonyl group, an amino group, an amide group, an ether group, and an ester group.
  • hydrophilic resins include siloxane polymers; epoxy resins; polyethylene resins; polyester resins; polyurethane resins; polyacrylamide resins; polyvinyl pyrrolidone resins; acrylic resins such as polyacrylic acid copolymers; Polyvinyl alcohol resins such as sulfonated polyvinyl alcohol and sulfonated polyvinyl alcohol; polyvinyl acetal resins; polyvinyl butyral resins; polyethylene polyamide resins; polyamide polyamine resins; cellulose derivatives such as hydroxymethyl cellulose and methyl cellulose; polyethylene oxide, polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymers Polyalkylene oxide derivatives; maleic anhydride copolymer; ethylene-viny
  • hydrophobic resins include, for example, novolak resins; acrylic resins; methacrylic resins; styrene resins; vinyl chloride resins; vinylidene chloride resins; polyolefin resins; polyamide resins; polyacetal resins; Fluorine resin; Silicone resin; Urea resin; Melamine resin; Guanamin resin; Phenol resin; Cellulose resin; Measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999 A material having a contact angle of 70 degrees or more can be appropriately selected and used. That is, the hydrophobicity in the present specification means that the contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999 is 70 degrees or more.
  • Both the hydrophilic resin and the hydrophobic resin may be a thermoplastic resin or a thermosetting resin. Further, it may be a resin curable by an active energy ray such as an electron beam or UV light, or may be an elastomer.
  • a photoresist is used as the resin material, a large number of fine through holes can be accurately formed in the wall layer 32 by photolithography.
  • photolithography known methods can be appropriately selected as a method for selecting the type of photoresist to be used, coating, exposing (photosensitive), and removing unnecessary photoresist.
  • the wall layer 32 can be formed by, for example, injection molding.
  • Examples of colored components include organic or inorganic pigments.
  • the black pigment include carbon black, acetylene black, and iron black.
  • yellow pigments include chrome yellow, zinc yellow, ocher, Hansa yellow, permanent yellow, and benzine yellow.
  • Examples of the orange pigment include orange lake, molybdenum orange, and benzine orange.
  • Examples of red pigments include red bean, cadmium red, antimony vermillion, permanent red, resol red, lake red, brilliant scarlet, and thioindigo red.
  • Blue pigments include cluster, cobalt blue, phthalocyanine blue, ferrocyan blue, and indigo.
  • Examples of the green pigment include chrome green, viridian naphthol green, and phthalocyanine green.
  • the wall layer 32 is formed by injection molding or the like, not only the pigment dispersed in the resin but also various dyes dissolved in the resin can be used as the colored component.
  • the dye can be exemplified by various dye methods. Specific examples include direct dyes, basic dyes, cationic dyes, acid dyes, mordant dyes, acid mordant dyes, sulfur dyes, vat dyes, naphthol dyes, disperse dyes, and reactive dyes. In particular, when dyeing a resin, a disperse dye is often selected.
  • the microwell means a well having a volume of 10 nanoliters (nL) or less.
  • an enzyme reaction such as digital PCR or invader reaction can be suitably performed.
  • gene mutation detection can be performed by digital PCR.
  • the volume of the microwell 33 is preferably 1 femtoliter (fL) or more and 6 nL or less, more preferably 1 fL or more and 5 picoliters (pL) or less, and most preferably 1 fL or more and 300 fL or less.
  • fL femtoliter
  • pL picoliters
  • the shape of the microwell 33 is not particularly limited as long as the volume is in the above-described range. Therefore, for example, a cylindrical shape, a polyhedron composed of a plurality of faces (for example, rectangular parallelepiped, hexagonal prism, octagonal prism, etc.), inverted cone, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted pentagonal pyramid) , An inverted hexagonal pyramid, an inverted polygonal pyramid with a heptagon or more). Furthermore, the shape which combined two or more of the above-mentioned shapes may be sufficient. For example, a part may be cylindrical and the rest may be an inverted cone.
  • the bottom surface of the cone or the pyramid is an opening that communicates the flow path and the microwell 33.
  • the bottom of the microwell 33 may be flattened by using a shape obtained by cutting a part from the top of an inverted cone or inverted pyramid.
  • the bottom may be formed in a curved shape that is convex or concave toward the opening.
  • the thickness of the wall layer 32 defines the depth of the microwell 33.
  • the thickness of the wall layer 32 is, for example, 10 nm to 100 ⁇ m, preferably 100 nm to 10 ⁇ m, more preferably Can be in the range of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • Each part of the microwell 33 has one or several biomolecules in one microwell in consideration of the amount of the aqueous liquid to be accommodated and the size of the carrier such as beads to which the biomolecules are attached. What is necessary is just to determine suitably so that it may be accommodated.
  • the number and density of the microwells 33 provided in the microwell array 30 can be set as appropriate.
  • the number of microwells 33 per 1 cm 2 is, for example, from 10,000 to 10,000,000, preferably from 100,000 to 5,000,000, and more preferably from 100,000 to 1,000,000.
  • the density of the microwells is within this range, the operation of enclosing an aqueous liquid as a sample in a predetermined number of wells is easy. It is also easy to observe wells for analyzing experimental results. For example, in the case of measuring cell-free DNA mutation, when the presence ratio of the mutation to be detected to the wild type is about 0.01%, for example, about 1 to 2 million microwells may be used. Is preferred.
  • FIG. 1 shows an example of a one-dimensional array in which a plurality of microwells 33 are arranged in a line.
  • a two-dimensional array in which a plurality of microwells are two-dimensionally arranged may be used.
  • the particle diameter of the pigment is set in a predetermined range according to the size of the microwell. If the particle diameter of the pigment is less than one fifth of the smaller dimension (hereinafter referred to as “minimum dimension”) of the microwell radial dimension and depth dimension, the formation accuracy of the microwell Will not be affected. More preferably, the particle diameter is set to 1/10 or less of the minimum dimension. For example, when the minimum dimension is about 10 nm to 100 ⁇ m, the particle diameter of the pigment is preferably about 1 nm to 10 ⁇ m. When the minimum dimension is 100 nm to 10 ⁇ m, the particle diameter of the pigment is preferably about 10 nm to 1 ⁇ m in the manufacturer catalog value and the like.
  • the particle diameter of the pigment By setting the particle diameter of the pigment within the above range, the pigment becomes sufficiently small relative to the microwell. As a result, even when a large number of microwells are formed, pigment particles are not hindered and can be formed with high accuracy. Further, by making the non-colored region between the pigment particles sufficiently small with respect to the microwell, the autofluorescence suppressing effect described later can be suitably exhibited.
  • a peripheral member 34 having a frame shape in plan view is disposed around the microwell array.
  • the dimension of the peripheral member 34 in the thickness direction of the microfluidic device 1 is larger than that of the wall layer 32.
  • the peripheral member 34 supports the lid member 20 to secure a gap between the lid member 20 and the microwell array and maintain the flow path.
  • stacked on both surfaces of the silicone material or the core material film formed from an acrylic foam are mentioned.
  • the microfluidic device 1 configured as described above can be manufactured, for example, by the following procedure.
  • the bottom layer 31 is provided, the bottom layer 31 is formed before the wall resin layer is formed. Even when the bottom layer 31 is not provided, an anchor layer or the like that enhances the adhesion between the substrate 10 and the wall portion resin layer may be provided on the surface of the substrate 10 as necessary.
  • the wall resin layer is formed from a material obtained by mixing a colored component with a resin material.
  • the content of the colored component can be, for example, not less than 0.5% by mass (wt%) and not more than 60 wt%.
  • the content is preferably 5 wt% or more and 55 wt% or less, and more preferably 20 wt% or more and 50 wt% or less.
  • the content ratio of the colored components can be appropriately set so that a desired pattern can be constructed in consideration of the ratio of photosensitive components and the like contained in the resist.
  • the colored component is a pigment
  • the particle diameter of the pigment is set so as to satisfy the predetermined condition described above for the microwell to be formed.
  • a dispersant may be appropriately added together with the pigment.
  • the formed wall resin layer has a color based on the colored component contained.
  • the through-hole 32a is formed in the formed wall resin layer.
  • the through hole 32a can be easily and accurately formed.
  • the wall resin layer is formed by injection molding or the like, the formation of the wall resin layer and the formation of the through hole can be performed by the same process.
  • the through holes 32a can be formed by etching using a pattern mask.
  • peripheral member 34 is disposed around the microwell array 30 and then the lid member 20 is disposed on the peripheral member 34.
  • the microfluidic device 1 is completed.
  • an aqueous liquid such as a sample in each microwell 33.
  • “sealing” means that an aqueous liquid is introduced into each microwell 33 of the microwell array 30 and further, the liquids introduced into each well are separated from each other so as not to be mixed with each other.
  • a method of isolating for example, an aqueous liquid is introduced into the well, and then a sealing liquid described later is filled in the flow path.
  • an aqueous liquid can be easily sealed in at least 90% or more, for example, 95% or more, for example, 99% or more, for example, 100% of the microwell.
  • the microwell array of this embodiment can suitably hold an aqueous liquid in the well even when the temperature of the enclosed aqueous liquid is changed, for example, in gene mutation detection.
  • the temperature range to be changed is, for example, 0 ° C. to 100 ° C., preferably 0 ° C. to 80 ° C., and more preferably 20 ° C. to 70 ° C.
  • an enzymatic reaction such as digital PCR or invader reaction can be suitably performed.
  • Examples of the sample to be analyzed using the microfluidic device 1 according to the present embodiment include a sample collected from a living body such as blood.
  • the detection target to be detected by sample analysis may be a PCR product or the like, or an artificially synthesized compound or the like.
  • the well may have a shape and size that allow one molecule of DNA to enter.
  • a sample to be sealed in a microwell is prepared.
  • the sample is an aqueous liquid containing a detection target, and examples thereof include a PCR reaction solution using a biological sample as a template and SYBR Green as a detection reagent.
  • a surfactant may be added to make it easier for the sample to enter the microwell.
  • beads that specifically recognize the detection target may be added to capture the detection target.
  • sample supply step the adjusted sample is supplied from the first hole 21 to the internal space S using a syringe or the like (sample supply step).
  • the supplied sample 100 is filled in each microwell 33 and the flow path 35.
  • the gas in the internal space S is extracted in advance before the sample supply process. This deaeration operation may be performed by filling the internal space S with a buffer.
  • an enclosing process for enclosing the sample in the microwell 33 is performed.
  • a fluorescent label is attached to the detection target in the sample.
  • the fluorescent labeling process may be performed before the sample supply process, for example, when the sample is adjusted, or may be performed after introducing the fluorescent label into the internal space S after the sample supply process.
  • the sealing liquid is supplied from the first hole 21 to the internal space S using a syringe or the like (sample supply step).
  • the supplied sealing liquid 110 flows in the flow path and is replaced with the sample 100 existing in the flow path 35 as shown in FIG.
  • the samples 100 are arranged only in the respective microwells 33 in an independent state, and the encapsulation of the samples is completed.
  • the sealing liquid means a liquid used for isolating the aqueous liquids introduced into the microwells 33 of the microwell array 30 so as not to mix with each other, and examples thereof include oils. .
  • oils for example, trade name “FC40” manufactured by Sigma, trade name “HFE-7500” manufactured by 3M, mineral oil used for PCR reaction, or the like can be used.
  • the sealing liquid preferably has a contact angle with respect to the material of the wall layer 32 of 5 degrees or more and 80 degrees or less. When the contact angle of the sealing liquid is within this range, the sample can be suitably sealed in each microwell 33.
  • the contact angle of the sealing liquid may be measured using the sealing liquid instead of water, for example, according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999.
  • an enzyme reaction such as a PCR reaction or an invader reaction may be performed as necessary by applying the microfluidic device to a thermal cycler.
  • the microfluidic device 1 after the encapsulation step is set on an inverted fluorescence microscope with the substrate 10 facing down, and excitation light (electromagnetic wave) is irradiated from the substrate 10 side (electromagnetic wave irradiation step).
  • excitation light electrospray
  • the wavelength of the excitation light is appropriately set according to the fluorescent label used.
  • a detection target that is fluorescently labeled is enclosed in the microwell 33, the microwell emits fluorescence by excitation light.
  • the user observes the well that emits fluorescence with a microscope from the substrate 10 side (sample observation step).
  • the detection target is, for example, a single nucleotide polymorphism (SNP), the frequency of SNP expression and the like can be analyzed by counting the number of microwells that emit fluorescence.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the wall layer 32 constituting the wall surface of the microwell array is formed of a material containing a colored component. Therefore, even if the resin material of the wall layer 32 has autofluorescence with respect to excitation light, the generated autofluorescence is absorbed and canceled by the colored component, and autofluorescence is reduced. As a result, autofluorescence around the microwell 33 is preferably reduced, and it is preferably prevented from obstructing the observation of the microwell 33.
  • the particle diameter of the colored component is set within a predetermined range with respect to the minimum dimension of the microwell 33. Therefore, it is possible to reduce the influence of autofluorescence in the sample analysis while suppressing the influence on the formation accuracy of the microwell 33. Further, the colored component particles moderately roughen the inner wall surface of the microwell 33. As a result, the contact area between the sample and the microwell increases, and the encapsulation efficiency can be improved.
  • the excitation light reaches the material. Hard to do. Even if the excitation light reaches a small amount to the substance, the generated autofluorescence is absorbed by the colored component and canceled out, and hardly affects the sample analysis.
  • a material having autofluorescence other than resin for example, dust
  • the wall portion layer 32 is formed in a colored manner, the visibility of the wall portion layer 32 is improved, and the formation state and the like can be suitably confirmed. Therefore, quality checks such as quality control and process control in manufacturing the microfluidic device 1 are facilitated.
  • the wall layer 32 is transparent, it is impossible to determine whether or not the wall layer is made of a predetermined resin only by the appearance.
  • the wall layer is produced from a material containing a colored component such as ferrocyan blue as in the present embodiment, even if it is a similar color at first glance, the absorption spectrum measured by a spectrophotometer A product manufactured by the manufacturer and a counterfeit product by a third party can be easily distinguished.
  • the microfluidic device 1 is irradiated with electromagnetic waves in the electromagnetic wave irradiation step, and the sample in the microwell 33 irradiated with the electromagnetic waves is observed from the substrate 10 side.
  • the dust d having autofluorescence falls on the lid member 20 of the microfluidic device 1, the dust d emits fluorescence by the irradiated excitation light.
  • the microwell 33 is observed from the substrate 10 side.
  • the dust d that has fallen to a position overlapping the wall layer 32 in a plan view of the microfluidic device 1 emits fluorescence it is preferably canceled by the colored component of the wall layer 32.
  • the excitation light reaching the dust d is reduced by the colored component of the wall portion layer 32, so that the fluorescence itself is hardly generated. Therefore, sample analysis can be performed while suitably suppressing the influence of autofluorescence caused by materials other than the material forming the wall layer 32.
  • the fluorescence wavelength to be used can be selected at an arbitrary wavelength.
  • the fluorescence wavelength to be used can be selected at an arbitrary wavelength. For example, when detecting fluorescence having a peak in the wavelength range of 350 to 700 nm, which is the visible light region, select blue, green, yellow, red, etc. as the color of the generated fluorescence, and bind to each biomolecule to be detected Keep different colors. This makes it possible to detect a plurality of types of biomolecules with a single detection.
  • a black or blue component is used as the colored component, electromagnetic waves in a wide wavelength range can be absorbed.
  • the electromagnetic wave absorption characteristics of the colored component may be appropriately changed according to the fluorescence wavelength to be used, the wavelength of the excitation light to be used, the autofluorescence wavelength of dust or the like that may fall.
  • the wall layer does not necessarily need to completely absorb the electromagnetic wave having a predetermined wavelength, and it is sufficient that the influence of the above-described autofluorescence can be reduced to a level that does not hinder the sample analysis. “A degree that does not hinder the sample analysis” is at least 1 ⁇ 2 or less of the fluorescence intensity of the detection target, and more preferably 1/10 or less.
  • Example 1 A glass substrate having a thickness of 500 ⁇ m was prepared as the substrate 10 having no autofluorescence.
  • a bottom layer 31 was formed by applying a solution containing hexamethyldisilazane (HMDS) to one surface of the substrate 10.
  • HMDS hexamethyldisilazane
  • a material for forming the wall layer 32 a negative photoresist which is cured by light exposure and 30% by weight of ferrocyan blue was used. The forming material was applied on the bottom layer 31 to a thickness of 3 ⁇ m by spin coating, prebaked and then exposed. Next, development processing was performed to remove unnecessary photoresist, and the wall portion layer 32 was formed.
  • Example 2 A glass substrate having a thickness of 500 ⁇ m was prepared as the substrate 10 having no autofluorescence.
  • a bottom layer 31 was formed by applying a solution containing hexamethyldisilazane (HMDS) to one surface of the substrate 10.
  • HMDS hexamethyldisilazane
  • As a material for forming the wall layer 32 a negative photoresist which is cured by light exposure and 30% by weight of ferrocyan blue was used. The forming material was applied on the bottom layer 31 by spin coating to a thickness of 3 ⁇ m and prebaked.
  • Example 2 which has a layer structure equivalent to the microfluidic device which concerns on this embodiment by the above was obtained.
  • thermosetting resin CYTOP manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.
  • CYTOP manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.
  • the laminated body of the comparative example 1 in which a wall part layer does not contain a colored component by the above was obtained.
  • Comparative Example 2 The same glass substrate as Example 1 was prepared as a substrate.
  • thermosetting resin (CYTOP manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), which is colorless and transparent and has no autofluorescence, was applied by spin coating to a thickness of 3 ⁇ m, and baked and cured. A resist for dry etching was applied thereon, and the resist was exposed so that minute holes (through holes) were formed in a dot shape. Next, development processing was performed to remove unnecessary resist. Thus, a photoresist for dry etching was formed on CYTOP. Dry etching was performed on the photoresist to form a wall layer formed of CYTOP. Finally, the photoresist for dry etching on CYTOP was removed to form micro holes (through holes) in the wall layer.
  • the laminated body of the comparative example 2 in which a wall part layer does not contain a colored component by the above was obtained.
  • Example 1 and Comparative Example 1 As excitation light, light having three types of wavelengths of 350 nm, 480 nm, and 590 nm was used. A sheet having autofluorescence with respect to all excitation light was placed in contact with the wall layer 32 of Example 1 and Comparative Example 1. Then, each excitation light was irradiated from the board
  • Example 1 The measurement results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in FIG.
  • the fluorescence wavelengths are shown alongside the wavelengths of the respective excitation lights.
  • the fluorescence intensity was measured under the same conditions for the excitation light of each wavelength used. As a result, it was confirmed that the fluorescence intensity in Example 1 can be reduced to about 1/7 to 1/80 that does not hinder the sample analysis as compared with Comparative Example 1.
  • Example 1 the microscope image of Example 1 is shown.
  • the wall layer 32 is removed for comparison in a partial region at the lower left of the image. Only this partial region appears bright due to the fluorescence of the autofluorescent sheet, but the other portions are dark, and the wall layer 32 suitably reduces the influence of the fluorescence of the autofluorescent sheet.
  • FIG. 8 the microscope image of the comparative example 1 is shown. In the lower left belt-like portion, the wall layer is removed as in FIG. In Comparative Example 1, the entire image appeared bright regardless of the presence or absence of the wall layer, indicating that autofluorescence had a strong effect.
  • FIG. 9 shows the difference in the fluorescence intensity of the photoresist depending on the presence or absence of a pigment.
  • the measurement conditions for the photoresist thickness and fluorescence intensity were the same as in Example 1.
  • the photoresist exhibited strong autofluorescence. Thereby, even if it was a material which has an autofluorescence with respect to the excitation wavelength to be used, it was shown that it can be used as a material of a wall part layer by containing a colored component.
  • Example 2 (Observation Procedure Using Example 2 and Comparative Example 2) As excitation light, light having a wavelength of 488 nm was used. A sheet having autofluorescence for all excitation light was placed in contact with the wall layer 32 of Example 2 and Comparative Example 2. Then, each excitation light was irradiated from the board
  • Example 2 The fluorescence intensity of the excitation light used in Example 2 and Comparative Example 2 was measured under the same conditions. As a result, in Example 2, fluorescence was observed only in the micropore portion (bottom surface was transmitted by glass) compared to Comparative Example 2. In Comparative Example 2, fluorescence was observed not only in the micropore portion but also in the portion having the wall layer.
  • Example 2 The results of bright field observation of Example 2 and Comparative Example 2 are shown in FIGS. 11A and 11B.
  • Example 2 the portions other than the micropores were colored and looked dark (the micropore portions were transparent because the bottom was glass).
  • Example 2 the microscope image of Example 2 is shown.
  • the wall layer 32 was not observed in the region observed in the form of dots in the image. Only the portion of the micropore appears bright, but the other portion is dark, and it was confirmed that the wall layer 32 suitably reduced the influence of the fluorescence of the autofluorescent sheet.
  • FIG. 13 the microscope image of the comparative example 2 is shown. As can be seen from the bright-field image of FIG. 11B, although it has dot-like micropores, in Comparative Example 2, the whole appears bright regardless of the presence or absence of the wall layer, and autofluorescence has a strong influence. It was shown that.
  • microfluidic device and the sample analysis method according to one embodiment of the present invention have been described using the embodiments and examples.
  • the technical scope of the present invention is not limited to the above embodiments and examples. It is possible to change the combination of the constituent elements without departing from the spirit of the present invention, to add various changes to the constituent elements, or to delete them.
  • the microfluidic device it is preferable to arrange the microfluidic device with the substrate on the lower side as described above because the possibility of dust or the like falling on the substrate is low.
  • the sample observation process may be performed with the substrate disposed on the upper side. Even if it does in this way, when the foreign material which has autofluorescence, such as dust, has adhered to the cover member 20, autofluorescence can be reduced.
  • the substrate is arranged on the upper side, if dust or the like falls on the substrate, auto-fluorescence such as dust may affect the sample observation. Therefore, air is injected onto the substrate immediately before the sample observation process. It is preferable to perform the process.
  • FIG. 10 shows a microfluidic device 1A in which microwells are arranged in a two-dimensional array as a modification of the microfluidic device according to this embodiment.
  • Constituent elements common to the microfluidic device 1 are assigned the same reference numerals and redundant description is omitted.
  • microfluidic device 1A unit well arrays 131 in which microwells (not shown) are arranged in a two-dimensional array are further arranged in a two-dimensional array to constitute a microwell array 130. In this way, a large number of microwells can be arranged with high accuracy and high density.
  • the lid member 20A of the microfluidic device 1A does not have the second hole. Instead, a part of the peripheral edge of the internal space S is opened by not arranging the peripheral member 34 on one side of the rectangular shape in plan view of the microfluidic device 1A. Therefore, excess portions of the sample and the sealing liquid introduced from the first hole 21 are discharged from the opened peripheral edge. Even if the microfluidic device is configured in this manner, the same effect can be obtained.
  • the sample analysis method according to the present embodiment is not limited to a method using fluorescence or phosphorescence.
  • it can be applied to sample analysis using turbidity or the like.
  • the turbidity it can be measured using light having a wavelength of about 400 to 1000 nm, for example, and the colored component and the electromagnetic wave absorption characteristics of the wall layer may be set based on this.

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Abstract

マイクロ流体デバイスは、電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、を備え、前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている。

Description

マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法
　本発明は、マイクロウェルアレイを有するマイクロ流体デバイス、およびマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法に関する。
　本願は、２０１５年１０月８日に日本に出願された特願２０１５－２００３６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術、または微細なプラスチックの成型方法を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。
　マイクロウェルアレイを有するマイクロ流体デバイスの製作のための材料としては、シリコーン、ガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。例えば、特許文献１から３には、このようなマイクロ流体デバイスを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが開示されている。
　ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことにより生体物質の検査を行う技術が注目されている。例えば、核酸の検出及び定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ技術が挙げられる。デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅を行い、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量を行う技術である。
　微小液滴の作製方法として、封止液で分断化することにより微小液滴を作製する方法や、基板上に形成した孔に試薬を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を作製する方法等が検討されている。
　生体分子から発せられる蛍光値を取得するための流体システム中で、流体システムに用いられる流体デバイスを構成する材料に顔料を添加して自家蛍光を低減させる方法が検討されている（例えば特許文献１から３を参照。）。これは、材料由来の自家蛍光がノイズとして検出されてしまうと、蛍光シグナルの検出に支障を来たすためである。
日本国特許第３５１０８８２号公報 日本国特許第３３２６７０８号公報 日本国特開平１１－２１１６５３号公報
　特許文献1に開示される技術をマイクロ流体デバイスに適用することには、いくつかの困難な点がある。
　まず、マイクロウェルの大きさである。マイクロウェルは非常に微小であるため、マイクロウェルアレイを形成する際に顔料を添加すると、顔料の粒径によってはマイクロウェルのサイズと近くなり、マイクロウェルを精度良く形成できない可能性がある。
　次に、ノイズとなる自家蛍光の発生源である。マイクロウェルに収容される液滴の体積は非常に小さいため、発せられる蛍光の値も非常に小さい。したがって、従来であればほとんど問題とならなかった微小な自家蛍光であっても、液滴の蛍光と同程度の蛍光値を有するノイズとなり、測定に影響を与える可能性がある。詳細は後述するが、このような自家蛍光の発生源は、マイクロウェルアレイを形成する材料に限られない。そのため、材料の自家蛍光を低減させるだけでは、完全に解決することは難しい。
　上記事情を踏まえ、本発明は、材料の自家蛍光を抑えつつ、マイクロウェルが精度良く形成されたマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。
　本発明の他の目的は、微小な蛍光ノイズを好適に排除してマイクロウェルに収容された試料を分析することができる試料分析方法を提供することである。
　本発明の第一態様に係るマイクロ流体デバイスは、電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、を備え、前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている。
　上記第一態様において、前記有色成分は顔料であり、前記顔料の粒子径が前記マイクロウェルの最小寸法の５分の１以下であってもよい。
　本発明の第二態様に係る試料分析方法は、上記第一態様に係るマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、前記マイクロウェル内に試料を供給し（試料供給工程）、封止液を用いて前記試料を前記マイクロウェル内に封入し（封入工程）、前記マイクロウェル内に前記試料を封入した後に、前記マイクロ流体デバイスに電磁波を照射し（電磁波照射工程）、前記電磁波が照射された前記マイクロウェルを前記基板側から観察する（試料観察工程）。
　本発明の上記第一態様に係るマイクロウェルアレイによれば、材料の自家蛍光を抑えつつ、マイクロウェルが精度良く形成されたマイクロウェルアレイを提供することができる。
　また、本発明の上記第二態様に係る試料分析方法によれば、微小な蛍光ノイズを好適に排除してマイクロウェルに収容された試料を分析することができる。
本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図１のｂ－ｂ線における断面図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法の効果を説明するための図である。 実施例１及び比較例１を用いたマイクロ流体デバイスの効果に関する実験結果を示す表である。 実施例１の顕微鏡画像である。 比較例１の顕微鏡画像である。 実施例１に用いた材料において、顔料の有無による蛍光強度の違いを示す表である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの変形例を示す斜視図である。 実施例２の明視野観察の結果である。 比較例２の明視野観察の結果である。 実施例２の顕微鏡画像である。 比較例２の顕微鏡画像である。
　本発明の一実施形態について、図１から図６を参照して説明する。本明細書において、各図面における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
　図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を示す斜視図である。図２は、図１のｂ－ｂ線における断面図である。マイクロ流体デバイス１は、図１および図２に示すように、基板１０と、蓋部材２０と、マイクロウェルアレイ３０とを備えている。蓋部材２０は、基板１０と対向配置されている。マイクロウェルアレイ３０は、基板１０と蓋部材２０との間に設けられている。
　基板１０は、電磁波を透過可能である。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。基板１０が電磁波を透過可能であることにより、マイクロ流体デバイス１に封入した試料に生じる蛍光、燐光等を基板１０側から観察することができる。
　基板１０は、所定の波長範囲の電磁波のみを透過可能であってもよい。例えば、マイクロウェル内の試料について、可視光領域である３５０～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記波長範囲の可視光を透過可能な基板を用いればよい。
　基板１０を形成する材料としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
　後述する試料分析方法では蛍光や燐光を利用するため、基板１０としては、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いる。ここで、「自家蛍光を実質的に有しない」とは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、自家蛍光を有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光であれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
　基板１０の厚みは、適宜決定することが出来るが、例えば５ミリメートル（ｍｍ）以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましく、１．６ｍｍ以下がさらに好ましい。
　蓋部材２０は、板状またはシート状に形成された部材であり、厚さ方向に貫通する第一孔２１および第二孔２２を有する。第一孔２１および第二孔２２は、完成したマイクロ流体デバイス１において、マイクロウェルアレイ３０を含む内部空間Ｓと連通する。第一孔２１および第二孔２２は、それぞれ内部空間に流体を供給する入口および流体が排出される出口として機能する。
　蓋部材２０を形成する材料や蓋部材２０の厚みについては、基板１０と同様とすることができる。
　蓋部材２０の電磁波透過性については適宜設定できる。すなわち、後述する電磁波照射工程を蓋部材２０側から行わない場合は、蓋部材２０は電磁波を透過可能でなくてもよい。
　マイクロウェルアレイ３０は、底部層３１と、壁部層３２と、複数のマイクロウェル３３とを有する。底部層３１は、基板１０上に設けられている。壁部層３２は、底部層３１上に形成されている。複数のマイクロウェル３３は、底部層３１と壁部層３２の厚さ方向に形成された複数の貫通孔３２ａとで構成されている。複数のマイクロウェル３３は、壁部層３２においてアレイ状に形成されている。基板１０と蓋部材２０との間の内部空間Ｓにおいて、マイクロウェルアレイ３０（壁部層３２）と蓋部材２０との間には隙間が存在する。この隙間は、複数のマイクロウェル３３、並びに第一孔２１および第二孔２２と連通する流路として機能する。
　底部層３１は、マイクロウェル３３の底面を構成する。したがって、底面に親水性を付与したい場合は親水性材料で底部層３１を形成すればよい。また、底面に疎水性を付与したい場合は疎水性材料で底部層３１を形成すればよい。底部層３１は、底部層３１が電磁波を透過可能なように形成され、基板１０側からのマイクロウェル３３内の試料観察の妨げにならないようにすることが好ましい。また、底部層３１には、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いることが好ましい。ここで、基板１０と底部層３１とが一体化されたものを単に基板と称することもできる。
　なお、マイクロウェル３３の底面の特性が基板１０の特性で問題ない場合は、底部層３１を設けずに、基板１０上に直接壁部層３２が形成されてもよい。従って、その場合、基板１０の表面と壁部層３２の貫通孔３２ａとでマイクロウェル３３が構成される。
　壁部層３２は、有色の材料で形成されており、厚さ方向に見た状態においてアレイ状に設けられた複数の貫通孔３２ａを有する。各貫通孔３２ａの内面は、各マイクロウェル３３の内壁面を構成する。
　壁部層３２を形成する材料としては、樹脂に所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を混合した材料が挙げられる。
　樹脂材料としては、マイクロウェル３３に求める特性等を考慮して、樹脂の構成成分の分子が親水性基を有する親水性樹脂と、樹脂の構成成分の分子が疎水性基を有する疎水性樹脂とのいずれも用いることができる。
　親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。親水性樹脂の例としては、例えば、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド－ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン－酢酸ビニル共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
　疎水性樹脂の例としては、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上である材料を適宜選択して使用することができる。すなわち、本明細書における疎水性とは、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であることを意味する。
　親水性樹脂および疎水性樹脂のいずれも、熱可塑性樹脂であっても熱硬化性樹脂であってもよい。さらに、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
　樹脂材料としてフォトレジストを用いると、フォトリソグラフィにより壁部層３２に多数の微細な貫通孔を精度良く形成することができる。
　フォトリソグラフィを用いる場合、使用するフォトレジストの種類の選択、塗布、露光（感光）、不要なフォトレジストの除去の方法には公知の手段を適宜選択することができる。
　レジストを用いない場合は、例えば射出成型等により壁部層３２を形成することができる。
　有色成分としては、有機質又は無機質の顔料が例示できる。具体的には、黒色顔料としては、カーボンブラック、アセチレンブラック、鉄黒等が挙げられる。黄色顔料としては、クロム黄、亜鉛黄、黄土、ハンザイエロー、パーマネントイエロー、ベンジンイエローが挙げられる。橙色顔料としては、オレンジレーキ、モリブデンオレンジ、ベンジンオレンジが挙げられる。赤色顔料としては、べんがら、カドミウムレッド、アンチモン朱、パーマネントレッド、リソールレッド、レーキレッド、ブリリアントスカーレット、チオインジゴレッドが挙げられる。青色顔料としては、群生、コバルトブルー、フタロシアニンブルー、フェロシアンブルー、インジゴが挙げられる。緑色顔料としては、クロムグリーン、ビリジアンナフトールグリーン、フタロシアニングリーン等が挙げられる。
　また、壁部層３２を射出成型等で形成する場合、樹脂中に分散する顔料だけでなく、樹脂中に溶解する各種染料も有色成分として用いることが可能である。染料は各種染料法より例示できる。具体的には、直接染料、塩基性染料、カチオン染料、酸性染料、媒染染料、酸性媒染染料、硫化染料、建染染料、ナフトール染料、分散染料、反応染料などが挙げられる。特に、樹脂を染色する場合には、分散染料が選択されることが多い。
　本明細書において、マイクロウェルとは、容積が１０ナノリットル（ｎＬ）以下のウェルを意味する。マイクロウェル３３の容積をこの程度に微小にすることにより、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。
　マイクロウェル３３の容積は、１フェムトリットル（ｆＬ）以上６ｎＬ以下が好ましく、１ｆＬ以上５ピコリットル（ｐＬ）以下がより好ましく、１ｆＬ以上３００ｆＬ以下が最も好ましい。このような範囲に容積を設定すると、後述する試料分析の際に、一つのマイクロウェル３３に、１から数個だけ生体分子又は担体を収容することが可能となる。
　マイクロウェル３３の形状は、容積が上述した範囲内である限り特に制限はない。したがって、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。
　さらに上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面が流路とマイクロウェル３３とを連通する開口部となる。この場合、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状を用いて、マイクロウェル３３の底部を平坦にしてもよい。他の例として、底部を開口部に向かって凸または凹となる曲面状に形成してもよい。
　壁部層３２の厚さは、マイクロウェル３３の深さを規定する。マイクロウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体（試料）を封入する目的のためには、壁部層３２の厚さは、例えば１０ｎｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下、更に好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内とすることができる。
　マイクロウェル３３の各部寸法は、収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさ等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように適宜決定すればよい。
　マイクロウェルアレイ３０に設けるマイクロウェル３３の数や密度は適宜設定できる。
　１ｃｍ２あたりのマイクロウェル３３の数は、例えば１万以上１０００万以下であり、好ましくは１０万以上５００万以下であり、更に好ましくは１０万以上１００万以下である。マイクロウェルの密度がこの範囲内であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個程度のマイクロウェルを使用することが好適である。
　図１では、複数のマイクロウェル３３が一列に並んだ一次元アレイの例を示している。しかしながら、上述のように多数のマイクロウェルを設ける場合、複数のマイクロウェルを二次元に配列した二次元アレイを用いてもよい。
　有色成分として顔料を用いる場合、顔料の粒子径は、マイクロウェルの大きさに応じて所定の範囲に設定される。顔料の粒子径が、マイクロウェルの径方向寸法および深さ方向寸法のうち小さい方の寸法（以下、「最小寸法」と称する。）に対して５分の１以下であればマイクロウェルの形成精度に影響を及ぼさない。粒子径を最小寸法に対して１０分の１以下に設定するとさらに好ましい。例えば、最小寸法が１０ｎｍ～１００μｍ程度であった場合、顔料の粒子径は１ｎｍ～１０μｍ程度が好ましい。最小寸法が１００ｎｍ～１０μｍであった場合、顔料の粒子径は、メーカーカタログ値等において１０ｎｍ～１μｍ程度が好ましい。
　顔料の粒子径を上述の範囲に設定することで、顔料がマイクロウェルに対して十分小さくなる。その結果、マイクロウェルを多数形成する際においても、顔料の粒子が妨げにならず、精度良く形成することができる。また、顔料の粒子間の着色されない領域をマイクロウェルに対して十分小さくすることにより、後述する自家蛍光抑制効果を好適に発揮させることができる。
　マイクロウェルアレイの周囲には、平面視枠状の周縁部材３４が配置されている。マイクロ流体デバイス１の厚さ方向における周縁部材３４の寸法は、壁部層３２よりも大きい。周縁部材３４は、蓋部材２０を支持することにより蓋部材２０とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、流路を維持している。
　周縁部材３４の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムや、アクリル発泡体から形成される芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
　上記のように構成されたマイクロ流体デバイス１は、例えば以下の手順で製造することができる。
　まず、基板１０を準備し、基板１０の面上に壁部層３２となる壁部用樹脂層を形成する。底部層３１を設ける場合は、壁部用樹脂層の形成前に底部層３１を形成する。底部層３１を設けない場合でも、必要に応じて基板１０の面上に基板１０と壁部用樹脂層との密着性を高めるアンカー層等を設けてもよい。
　壁部樹脂層は、樹脂材料に有色成分を混合した材料から形成される。樹脂材料がレジストである場合、有色成分の含有率は、例えば０．５質量％（ｗｔ％）以上６０ｗｔ％以下とすることができる。含有率に関して、好ましくは５ｗｔ％以上５５ｗｔ％以下であり、更に２０ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下がさらに好ましい。有色成分の含有率は、レジストに含まれる感光成分等の割合を考慮して所望するパターンが構築可能となるように、適宜設定することができる。また、有色成分が顔料である場合、形成するマイクロウェルに対して上述した所定の条件を満たすように顔料の粒子径を設定し、準備する。顔料と共に、分散剤が適宜添加されてもよい。
　形成された壁部樹脂層は、含有する有色成分に基づいた色彩を有する。
　次に、形成された壁部樹脂層に貫通孔３２ａを形成する。上述したように、フォトリソグラフィを用いると、貫通孔３２ａを簡便かつ精度よく形成することができる。壁部樹脂層を射出成型等により形成する場合は、壁部樹脂層の形成と貫通孔の形成とを同一のプロセスで行うことができる。この他、パターンマスクを用いたエッチング等によっても貫通孔３２ａの形成が可能である。
　貫通孔３２ａが形成されると、壁部樹脂層が壁部層３２となり、マイクロウェルアレイ３０が完成する。
　その後、マイクロウェルアレイ３０の周囲に周縁部材３４を配置してから蓋部材２０を周縁部材３４上に配置する。基板１０、周縁部材３４、および蓋部材２０を一体に接合すると、マイクロ流体デバイス１が完成する。
　次に、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を用いた、本実施形態の試料分析方法について説明する。
　本実施形態のマイクロウェルアレイ３０は、各マイクロウェル３３内に試料等の水性液体を封入することが非常に容易である。ここで、封入するとは、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に水性液体を導入し、更に、各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離することを意味する。隔離する方法としては、例えば、ウェルに水性液体を導入した後、流路内に後述する封止液を充填すること等が挙げられる。本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１によれば、マイクロウェルの少なくとも９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
　本実施形態のマイクロウェルアレイは、例えば遺伝子の変異検出等において、封入した水性液体の温度を変化させた場合も、ウェル内に水性液体を好適に保持することができる。変化させる温度の範囲は、例えば０℃～１００℃であり、好ましくは０℃～８０℃であり、更に好ましくは２０℃～７０℃である。ウェルに封入した水性溶液がこの範囲内であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。
　本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を使用して分析する試料としては、例えば血液等の生体から採取した試料が挙げられる。また、試料分析により検出する検出対象は、ＰＣＲ産物等であってもよいし、人工的に合成された化合物等であってもよい。例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状及び大きさを有していてもよい。
　以下、蛍光顕微鏡を用いた蛍光観察をする場合を例にとり、試料分析方法の詳細について説明する。準備工程として、マイクロウェルに封入する試料を調製する。試料は、検出対象を含有する水性の液体であり、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液等が挙げられる。調整においては、界面活性剤を添加して、試料をよりマイクロウェル内に入りやすくしてもよい。また、検出対象を特異的に認識するビーズを添加して、検出対象を捕捉させておいてもよい。
　次に、シリンジ等を用いて、調整した試料を第一孔２１から内部空間Ｓに供給する（試料供給工程）。供給された試料１００は、図３に示すように、各マイクロウェル３３内および流路３５に充填される。内部空間Ｓ内の気体は、試料供給工程の前に予め抜いておく。この脱気操作は、内部空間Ｓにバッファを満たすことにより行ってもよい。
　次に、試料をマイクロウェル３３に封入する封入工程を行う。封入工程の前に、試料内の検出対象に蛍光標識を付けておく。蛍光標識処理は、試料供給工程の前の、例えば試料の調整時に行ってもよいし、試料供給工程後に、蛍光標識を内部空間Ｓに導入して行ってもよい。
　封入工程では、シリンジ等を用いて、封止液を第一孔２１から内部空間Ｓに供給する（試料供給工程）。供給された封止液１１０は流路内を流れ、図４に示すように、流路３５内に存在する試料１００と置換される。その結果、試料１００は、各マイクロウェル３３内のみに、互いに独立した状態で配置され、試料の封入が完了する。
　本明細書において封止液とは、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に導入された水性液体同士が互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類等が挙げられる。オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ－７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。
　封止液は、壁部層３２の材質に対する接触角が５度以上８０度以下であることが好ましい。封止液の接触角がこの範囲であると、各マイクロウェル３３に好適に試料を封入することができる。封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
　続いて、試料の蛍光観察が行われるが、その前に、マイクロ流体デバイスをサーマルサイクラーにかけて、ＰＣＲ反応やインベーダー反応等の酵素反応等を必要に応じて行ってもよい。
　次に、封入工程後のマイクロ流体デバイス１を、基板１０を下側にして倒立型の蛍光顕微鏡にセットし、基板１０側から励起光（電磁波）を照射する（電磁波照射工程）。励起光の波長は使用している蛍光標識に応じて適宜設定される。
　マイクロウェル３３内に蛍光標識された検出対象が封入されていると、そのマイクロウェルは励起光によって蛍光を発する。使用者は、基板１０側から顕微鏡で蛍光を発するウェルを観察する（試料観察工程）。検出対象が例えば一塩基多型（ＳＮＰ）の場合、蛍光を発するマイクロウェルの数を数えることで、ＳＮＰの発現頻度等を分析することができる。
　本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１では、マイクロウェルアレイの壁面を構成する壁部層３２が有色成分を含有する材料で形成されている。したがって、壁部層３２の樹脂材料が励起光に対して自家蛍光を有していても、発生した自家蛍光は有色成分により吸収されて打ち消され、自家蛍光が低減される。その結果、マイクロウェル３３の周囲における自家蛍光が好適に低減され、マイクロウェル３３の観察に妨げになることが好適に防止される。
　また、有色成分の粒子径がマイクロウェル３３の最小寸法に対して所定の範囲とされている。そのため、マイクロウェル３３の形成精度に影響を与えることを抑えつつ、試料分析における自家蛍光の影響を低減することができる。
　さらに、有色成分の粒子がマイクロウェル３３の内壁面を適度に粗面化する。その結果、試料とマイクロウェルとの接触面積が増加し、封入効率を向上させることができる。
　さらに、壁部層３２の形成材料の中に、樹脂以外の自家蛍光を有する物質（例えば埃等）が入っていた場合でも、物質の周囲に有色成分が存在するため、励起光が物質まで到達しにくい。仮に励起光が物質まで少量到達した場合でも、発生した自家蛍光は有色成分により吸収されて打ち消され、試料分析に影響を与えにくい。
　加えて、基板１０と壁部層３２との境界の位置を認識しやすいため、試料観察工程において、マイクロウェル３３の底面付近に顕微鏡のピントを合わせやすい。したがって、試料観察を簡便かつ好適に行うことができる。
　さらに、壁部層３２が有色に形成されるため、壁部層３２の視認性が向上し、形成状況等を好適に確認することができる。したがって、マイクロ流体デバイス１の製造における品質管理や工程管理等の品質チェックが容易となる。
　さらに、壁部層３２の色彩特性を利用した偽造防止も可能である。壁部層が透明である場合、外観だけでは所定の樹脂で作製されているか否かを判別することが出来ない。本実施形態のように、フェロシアンブルー等の有色成分を含有した材料から壁部層を作製した場合、一見して同様の色彩であっても、分光光度計により測定した吸収スペクトルにより、正当な製造者が製造した物と第三者による偽造品とを容易に判別することができる。
　また、本実施形態に係る試料分析方法によれば、電磁波照射工程において電磁波をマイクロ流体デバイス１に照射し、電磁波が照射されたマイクロウェル３３内の試料を基板１０側から観察する。これにより以下の効果を奏する。
　図５に示すように、マイクロ流体デバイス１の蓋部材２０上に自家蛍光を有する埃ｄが落下した場合、埃ｄは照射された励起光により蛍光を発する。マイクロウェル３３の分析においては、埃ｄのような小さなものが発する蛍光であっても、試料分析に支障を及ぼすノイズとなる可能性が十分にある。本実施形態に係る試料分析方法では、基板１０側からマイクロウェル３３を観察する。そのため、マイクロ流体デバイス１の平面視において壁部層３２と重なる位置に落下した埃ｄが蛍光を発しても、壁部層３２の有色成分により好適に打ち消される。また、基板１０側から励起光を照射した場合は、壁部層３２の有色成分により埃ｄに到達する励起光が減少するため、蛍光自体が発生しにくくなる。したがって、壁部層３２を形成する材料以外に起因する自家蛍光の影響をも好適に抑えて試料分析を行うことができる。
　さらに、埃ｄ等の自家蛍光性異物が壁部層３２内に存在する場合でも、ほとんどの場合、自家蛍光性異物と基板１０との間には有色成分を含む壁部層３２の形成材料が存在する。このため、有色成分が自家蛍光の発生を抑制するとともに、発生した蛍光についても有色成分により吸収されて好適に打ち消される。自家蛍光性異物が繊維状である場合、有色成分が異物内に入り込み、より好適に自家蛍光を吸収する。
　本実施形態において、使用する蛍光波長は、任意の波長で選択することが出来る。例えば可視光領域である３５０～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合、発生する蛍光の色として青、緑、黄、赤色などを選択し、検出したい生体分子ごとに結合する蛍光分子の色を異ならせておく。これにより、一度の検出で複数種の生体分子を検出することが可能となる。
　ここで、有色成分として、黒色または青色の成分を用いると、広い波長範囲の電磁波を吸収できるため、汎用性が高く、好ましい。
　また、有色成分の電磁波吸収特性は、使用する蛍光波長や、使用する励起光の波長、また、落下の可能性がある埃等の自家蛍光波長等に応じて適宜変更されてよい。また、壁部層は、所定の波長の電磁波を完全に吸収する必要は必ずしもなく、上述した自家蛍光の影響を試料分析に支障のない程度まで低減できればよい。「試料分析に支障のない程度」とは、少なくとも検出対象の蛍光強度の１／２以下であり、１／１０以下であるとさらに好ましい。
　以上説明した本実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法について、効果を確認するための実施例および比較例を用いてさらに説明する。
（実施例１）
　自家蛍光を有さない基板１０として、厚さ５００μｍのガラス基板を準備した。基板１０の一方の面にヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を含む溶液を塗布して底部層３１を形成した。
　壁部層３２の形成材料として、感光により硬化するネガ型のフォトレジストにフェロシアンブルーを３０ｗｔ％添加したものを用いた。形成材料を底部層３１上にスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、プリベークを行った後感光させた。次に現像処理を行い、不要なフォトレジストを除去して壁部層３２を形成した。
　プリベークの条件および露光条件等は使用したフォトレジストに基づき適宜設定した。
　以上により本実施形態に係るマイクロ流体デバイスと同等の層構造を有する実施例１の積層体を得た。
（実施例２）
　自家蛍光を有さない基板１０として、厚さ５００μｍのガラス基板を準備した。基板１０の一方の面にヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を含む溶液を塗布して底部層３１を形成した。
　壁部層３２の形成材料として、感光により硬化するネガ型のフォトレジストにフェロシアンブルーを３０ｗｔ％添加したものを用いた。形成材料を底部層３１上にスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、プリベークを行った。その後、ドット状に微小孔（貫通孔）が形成されるように感光させた。次に現像処理を行い、不要なフォトレジストを除去した。このようにして微小孔を有する壁部層３２を形成した。
　プリベークの条件および露光条件等は使用したフォトレジストに基づき適宜設定した。
　以上により本実施形態に係るマイクロ流体デバイスと同等の層構造を有する実施例２の積層体を得た。
（比較例１）
　実施例１と同一のガラス基板を基板として準備した。基板の一方の面に、無色透明で自家蛍光を有さない熱硬化樹脂（旭硝子社製　ＣＹＴＯＰ）をスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、ベークして硬化させることで壁部層を形成した。
　以上により壁部層が有色成分を含まない比較例１の積層体を得た。
（比較例２）
　実施例１と同一のガラス基板を基板として準備した。基板の一方の面に、無色透明で自家蛍光を有さない熱硬化樹脂（旭硝子社製　ＣＹＴＯＰ）をスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、ベークして硬化させた。その上にドライエッチング用のレジストを塗布し、ドット状に微小孔（貫通孔）が形成されるように感光させた。次に現像処理を行い不要なレジストを除去した。これによりＣＹＴＯＰ上にドライエッチング用のフォトレジストを形成した。このフォトレジストの上からドライエッチングを実施し、ＣＹＴＯＰから形成される壁部層を形成した。最後にＣＹＴＯＰ上のドライエッチング用のフォトレジストを除去し、壁部層に微小孔（貫通孔）を形成した。
　以上により壁部層が有色成分を含まない比較例２の積層体を得た。
（実施例１および比較例１を用いた観察手順）
　励起光として、３５０ｎｍ、４８０ｎｍ、および５９０ｎｍの３種類の波長の光を用いた。すべての励起光に対して自家蛍光を有するシートを実施例１および比較例１の壁部層３２に接触させて配置した。その後、基板１０側から各励起光を照射し、基板１０側に戻る蛍光の蛍光強度を計測した。
　（結果）
　実施例１および比較例１の測定結果を図６に示す。各励起光の波長に並べて蛍光波長を示している。
　使用した各波長の励起光について同一条件で蛍光強度を測定した。その結果、実施例１では比較例１に対して、試料分析に支障のない１／７～１／８０程度まで蛍光強度を低減できることが確認できた。
　図７に、実施例１の顕微鏡画像を示す。画像における左下の一部領域において、比較のため壁部層３２が除去されている。この一部領域のみ自家蛍光シートの蛍光で明るく見えるが、他の部分は暗くなっており、壁部層３２が自家蛍光シートの蛍光の影響を好適に低減している。
　図８に、比較例１の顕微鏡画像を示す。左下の帯状の部分において、図７同様、壁部層が除去されている。比較例１では、壁部層の有無に関係なく全体が明るく見えており、自家蛍光が強く影響していることが示された。
　壁部層３２の材料として用いたフォトレジスト自体は、上述の波長の励起光に対して自家蛍光を有する。図９に、顔料の有無によるフォトレジストの蛍光強度の違いを示す。「顔料なし」のデータについては、フォトレジストの厚さおよび蛍光強度の測定条件を、実施例１と同一にして取得した。
　図９に示すように、顔料を添加していない状態において、フォトレジストは強い自家蛍光を示した。これにより、使用する励起波長に対して自家蛍光を有する材料であっても、有色成分を含有させることで壁部層の材料として使用可能なことが示された。
（実施例２および比較例２を用いた観察手順）
　励起光として、４８８ｎｍ波長の光を用いた。すべての励起光に対して自家蛍光を有するシートを実施例２および比較例２の壁部層３２に接触させて配置した。その後、基板１０側から各励起光を照射し、基板１０側に戻る蛍光の蛍光強度を計測した。
　（結果）
　実施例２および比較例２で使用した励起光について同一条件で蛍光強度を測定した。その結果、実施例２では比較例２に対して、微小孔部分（底面がガラスで透過）のみで蛍光が観察された。比較例２では、微小孔部分だけでなく壁部層がある部分でも蛍光が観察された。
　実施例２および比較例２の明視野観察の結果を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。実施例２では微小孔以外の部分に色がついており暗く見えた（微小孔部分は底がガラスのため透明である）。
　図１２に、実施例２の顕微鏡画像を示す。画像におけるドット状に観察される領域において、壁部層３２が観察されなかった。微小孔の部分のみ明るく見えるが、他の部分は暗くなっており、壁部層３２が自家蛍光シートの蛍光の影響を好適に低減していることが確認できた。
　図１３に、比較例２の顕微鏡画像を示す。図１１Ｂの明視野画像から分かるようにドット状の微小孔を有しているが、比較例２では、壁部層の有無に関係なく全体が明るく見えており、自家蛍光が強く影響していることが示された。
　以上、実施形態および実施例を用いて本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法について説明したが、本発明の技術範囲は上記実施形態および実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において構成要素の組み合わせを変えたり、各構成要素に種々の変更を加えたり、削除したりすることが可能である。
　例えば、本実施形態に係る試料分析方法においては、上述したようにマイクロ流体デバイスの基板を下側にして配置した場合、基板上に埃等が落下する可能性が低いため好ましい。しかしながら、基板を上側に配置した状態で試料観察工程を行ってもよい。このようにしても、蓋部材２０に埃などの自家蛍光を有する異物が付着していた場合に自家蛍光の低減を行うことができる。
　ただし、基板を上側に配置する場合、基板上に埃等が落下すると埃等の自家蛍光が試料観察に影響を及ぼす可能性があるため、試料観察工程の直前に基板上にエアを噴射する等の処理を行うのが好ましい。
　また、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスの変形例として、マイクロウェルを二次元アレイ状に配置したマイクロ流体デバイス１Ａを図１０に示す。マイクロ流体デバイス１と共通する構成については同一の符号を付して重複する説明を省略する。
　マイクロ流体デバイス１Ａでは、マイクロウェル（不図示）が二次元アレイ状に配列された単位ウェルアレイ１３１がさらに二次元アレイ状に配列されてマイクロウェルアレイ１３０が構成されている。このようにすると、多数のマイクロウェルを高精度かつ高密度に配置することができる。
　マイクロ流体デバイス１Ａの蓋部材２０Ａは、第二孔を有していない。そのかわりに、マイクロ流体デバイス１Ａの平面視における矩形形状の一辺に周縁部材３４を配置しないことにより、内部空間Ｓの周縁の一部を開放している。したがって、第一孔２１から導入した試料や封止液のうち過剰な部分は開放された周縁から排出される。マイクロ流体デバイスをこのように構成しても、同様の効果を奏する。
　また、本実施形態に係る試料分析方法は、蛍光または燐光を用いた方法に限定されない。例えば、濁度等を用いた試料分析にも適用可能である。濁度を用いる場合、例えば４００～１０００ｎｍ程度の波長の光を用いて測定することができ、これにもとづいて有色成分および壁部層の電磁波吸収特性を設定すればよい。
１、１Ａ　マイクロ流体デバイス
１０　基板
２０、２０Ａ　蓋部材
３０　マイクロウェルアレイ
３２　壁部層
３３　マイクロウェル
１００　試料
１１０　封止液

Claims (3)

  1. 　電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、
    　前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、
    　前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、
    　を備え、
    　前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、
    　前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている、マイクロ流体デバイス。
  2. 　前記有色成分は顔料であり、前記顔料の粒子径が前記マイクロウェルの最小寸法の５分の１以下である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 　請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、
    　前記マイクロウェル内に試料を供給し、
    　封止液を用いて前記試料を前記マイクロウェル内に封入し、
    　前記マイクロウェル内に前記試料を封入した後に、前記マイクロ流体デバイスに電磁波を照射し、
    　前記電磁波が照射された前記マイクロウェルを前記基板側から観察する試料分析方法。
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