WO2016193037A1 - Verfahren zum ermitteln einer ortsaufgelösten höheninformation einer probe mit einem weitfeldmikroskop und weitfeldmikroskop - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for determining a spatially resolved height information of a sample with a
- optical section The determination of a spatially resolved height information of a sample is also referred to as an optical section. Such optical sections are used in particular in microsopy to determine topographies of a sample or
- the sample is sampled in all three spatial directions, i. it is a matter of
- Point-scanning systems in which an optical beam is guided in the x / y direction over the sample.
- the height information and thus the topography can be derived for each x-y location.
- a disadvantage of this method is, among other things, the long time spent by the raster scan for a 3D topography
- Sample light is detected correspondingly with two photomultiplier tubes (PMT x s), wherein one filter is connected upstream of the one PMT. From the intensity ratio of the two PMTs, the transmission of the filter and thus the detected wavelength and, finally, a height information is determined.
- PMT x s photomultiplier tubes
- the transmission of the filter and thus the detected wavelength and, finally, a height information is determined.
- confocal wide-field systems which are based on structured illumination.
- Illumination light is obtained height information from the sample.
- DE 10 2007 018 048 A1 describes such a system in which two illumination patterns are projected onto the sample.
- optical sections can be generated.
- the focus variation should be mentioned, in which the image sharpness is evaluated as a function of z in order to calculate a maximum similar to the confocal case. It also spatial information of the system are used. With regard to susceptibility to vibration, the same problems exist as in the aforementioned methods.
- the object is achieved by a method according to claim 1 and by a wide field microscope according to claim 7.
- the chromatic confocal principle is applied to a wide-field optical cross-sectional imaging method and
- Wavelength-dependent filters in the detection beam path are Wavelength-dependent filters in the detection beam path
- the illumination beam path becomes chromatic
- At least one far field image is detected by detecting sample light reflected or emitted by the sample in a detection beam path.
- Sample light (eg when using a Nipkow disc), but also be composed of confocal and non-focal portions of the sample light.
- observation beam path and / or in the illumination or excitation beam path is at least one
- Wavelength-dependent filter function or spectral distribution are used and for each pixel in the x-y direction, at least two measuring operations are carried out with the different filters or spectral distributions. These measurements can take place in parallel (when using several image sensors) or sequentially. For example, if the ratio of the intensities of the at least two measurements in each pixel of the
- the intensity signal is in the invention
- Device may also depend on x, y
- Measuring process or chromatic modulation also includes beam splitters, etc.
- the ratio can be formed to:
- a wavelength-dependent filter for example, with the aid of two similar detectors and a beam splitter, wherein only in one beam path, a wavelength-dependent filter is used.
- Another possibility is to use only one channel and two sequential measurements with and without or with two different wavelength-dependent filters
- Another special case is the use of two spectrally offset bandpass filters in excitation and / or detection. In the detection is also here next to one
- An example of the parallel arrangement is the use of a Bayer pattern color camera with two color channels each.
- a first preferred embodiment of a wide field microscope according to the invention an embodiment variant with parallel detectors; an embodiment variant with parallel detectors and filters in the detection beam path; an embodiment variant with a switching element in the detection beam path; an embodiment variant with a chip splitter detector; a second preferred embodiment of a microscope according to the invention; a third preferred embodiment of a microscope according to the invention; an advantageous embodiment variant of the illumination beam path with a switching element; an advantageous embodiment variant of the illumination beam path with two equal moistening light sources; an advantageous embodiment variant of the illumination beam path with two spectrally different illumination light sources.
- FIG. 1 shows a first preferred embodiment of a wide field microscope according to the invention.
- a polychromatic light source 1 z. Ex. Broadband laser, halogen lamp, superluminescent diode, ...), wherein in this embodiment, different spectral distributions can be selected by a selection element 2 ⁇ .
- This selection element 2 can be, for example, an AOTF (acousto-optical tunable filter), a prism, a grating or also a filter selection unit.
- the illumination light can then be deflected by a deflection unit 3 in different directions.
- Deflection unit 3 for example, provides a fast
- switchable mirrors e.g., galvo mirrors
- AOD Acoustic-optic deflector
- polarization rotation e.g., polarization rotation
- a structured element 4 is arranged in a plane A conjugate to a sample plane P.
- the structured element 4 represents a transmissive 1D or 2D lattice structure.
- the structure is imaged into the sample space via refractive and / or diffractive longitudinal chromatic aberration-inducing elements 6, 7 (objective), so that here a chromatic splitting 8 is generated in z-direction, ie the focus shifts in dependence on the wavelength in the z-direction.
- Optical fiber 9 is arranged. But it can be in others
- Embodiments for this purpose a simple free beam guidance based on mirrors are used.
- Optical fibers 9 can optionally be made a polarization filtering.
- the deflection unit 3 it is possible to sequentially illuminate the structured element 4 by means of a respective collimating lens 11 from two sides (dashed representation).
- the structured element 4 is executed mirror-coated, it can accordingly be imaged two grid phases in the sample space or the sample plane P. Is this
- structured element 4 is not mirrored, so eliminates the deflection unit 3 and the dashed lines shown optics.
- a beam splitter 12 is used to combine the transmission and reflection beam path.
- Illumination light is then passed through a beam splitter 13 on to a sample 14 positioned in the sample space P, the beam splitter 13 advantageously being referred to as
- Polarization beam splitter is executed. Namely, it can continue to be a lambda / 4 plate 16 is arranged in the beam path, so that the sample 14 going to the illumination light and the sample 14 reflected or emitted to be detected sample light having a 90 ° to each other rotated polarization and so well at the beam splitter 13 from each other can be separated.
- a polarization filter 18 can furthermore be arranged in front of the detector unit 17.
- Detection unit 17 may be a simple camera with
- FIG. 2 describes an arrangement in which the sample light is first guided through a color splitter 19, so that two detection channels are operated, each comprising an imaging optic 21 and a camera 22.
- a filter 26 may also be arranged in channel II (T2 would then not be constant, if there is no filter 26, T2 would be constant).
- a switching element 27 serves for the sequential switching of filter functions.
- Switching element 27 can in this case e.g. a fast filter wheel or an AOTF or a suitable beam splitter arrangement with
- Switching mirror arrangement be.
- the evaluation of the image data takes place in such a way that the wavelength at which the optical sectional image signal becomes maximum is determined for each pixel. From this, the function z (x, y) or the surface topography can be directly deduced. This is done for example by
- At least two measuring processes are evaluated and from this directly on the wavelength is closed.
- HDR imaging for example, by multiple measurements with different exposure times is also useful, so that the noise for each pixel is essentially shot-noise limited. Sometimes a calibration is sufficient regardless of the function g as well as the function P is not enough, so these two functions as device properties still have to be included.
- Wavelength may then be determined not directly, but using an iterative method.
- Measuring range exceeds, so if necessary, a z-stitching is required, in which similar measurements at
- the filter functions are usefully like that
- Beam paths can be realized, including, for example, an electro-optical modulator (EOM) or an acousto-optic modulator (AOD) can be used.
- EOM electro-optical modulator
- AOD acousto-optic modulator
- Modulation in the pupil plane of the lens 7 causes.
- One Grid is here according to the Fourier transform in
- the structured element 4 which may also be formed by a 2D pinhole arrangement, is moved to different positions, and corresponding images are taken with the detector unit 17, but in this case only one light channel of the illumination is used ,
- the detector unit 17 can also be used as a digital PH, so that a truly confocal image
- the evaluation with regard to the wavelength takes place as described above.
- the structure 4 is completely eliminated and a sharpening function over the wavelength is determined in each case only for each local image area.
- the structured element 4 can also represent an element for targeted introduction of a speckle pattern, which can be completely removed from the beam path.
- FIG. 6 shows a further exemplary embodiment of a
- Chromatic wide field microscope which corresponds to the combination of the aperture correlation principle with the chromatic confocal technology.
- a rotatable disk 31 with a mirrored structure 32 is arranged here.
- the sample light (detection beam path) reflected or emitted back from the sample 14 is detected in two illustrated camera channels in the example shown, a first detector 33 passing through the disc 31
- polarization filters 18 can also be arranged in the detection beam path here.
- both a wide-field image and a confocal image can be calculated.
- the intensity information as a function of the wavelength yields the sought height information for each detection pixel.
- the resulting color image can also be used directly to represent a color image with extended depth of field information.
- structures are possible in which the two channels are arranged on only one camera chip.
- FIG. 7 shows a further exemplary embodiment in which, for example, a pinhole array 41 or a Nipkow disk is used.
- a detection of the entire sample surface is achieved by a movement (rotation,
- the pinhole array 41 is a Nipkow disk and designed as such with structured and unstructured sectors, this embodiment also provides a special case of the aperture correlation in which the confocality evaluation is carried out by offsetting sequentially or parallel recorded structured and non-structured illuminated images.
- An interferometer element 43 is optionally provided to increase the measurement accuracy. This may also be present in all other embodiments.
- FIGS. 8 to 10 show possible design variants for the use of filter functions or different spectral distributions in the illumination beam path.
- FIG. 8 shows the polychromatic light source 1, whose light can be conducted with a fast switching element 44 into different channels, which in turn is the same as the two measuring processes in analogy to the one discussed above.
- filters 46 and 47 are now different filters 46 and 47.
- the filters 46, 47 may possibly be dispensed with, which corresponds in its overall effect to the case described in FIG. 2 in a sequential design.
- Fig. 9 shows an embodiment variant of the invention, in which two similar light sources 1 with, respectively
- downstream filters 46, 47 are used, which are connected in quick succession.
- FIG. 10 A further advantageous embodiment variant is shown in FIG. 10 again.
- the beam combining element 53 is now designed as a pure beam combiner.
- the spectral characteristics already yield the desired filter functions. For example, the spectra of the
- Illumination sources 51, 52 are slightly shifted from each other and gaussförmig. From the intensity ratio of the two with each one of the illumination sources 51, 52 coupled
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Weitfeldmikroskop und ein Verfahren zum Ermitteln einer ortsaufgelösten Höheninformation einer Probe (14) mit einem Weitfeldmikroskop. Das Weitfeldmikroskop umfasst eine Beleuchtungsquelle (1, 52, 53), die in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist; eine erste Detektoreinheit (17, 33) zur Erfassung eines Weitfeldbildes in einem Beobachtungsstrahlengang einer in einer Probenebene (P) beleuchteten Probe (14); einen Modulator zur chromatischen Modulation des Beleuchtungsstrahlenganges oder des Beobachtungsstrahlenganges in einer Richtung senkrecht zur Probenebene (P); eine Auswerteeinheit zur Ermittlung einer chromatisch konfokalen Höheninformation in jedem Bildpunkt des Weitfeldbildes. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Beleuchten der Probe (14) mit einer breitbandigen Beleuchtungsquelle (1) in einem Beleuchtungsstrahlengang; chromatische Modulation des Beleuchtungsstrahlenganges oder eines Detektionsstrahlenganges; Erfassen mindestens eines Weitfeldbildes aus von der Probe in dem Detektionsstrahlengang reflektierten oder emittierten Probenlichtes mit chromatisch konfokalen Anteilen; Pixelweises Ermitteln von Höheninformationen der Probe aus dem Weitfeldbild durch Auswerten chromatisch konfokaler Anteile des Detektionsstrahlenganges in Abhängigkeit von der chromatischen Modulation.
Description
Verfahren zum Ermitteln einer ortsaufgelösten Höheninformation einer Probe mit einem Weitfeldmikroskop und Weitfeldmikroskop
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln einer ortsaufgelösten Höheninformation einer Probe mit einem
Weitfeldmikroskop und ein Weitfeldmikroskop.
Das Ermitteln einer ortsaufgelösten Höheninformation einer Probe wird auch als optischer Schnitt bezeichnet. Solche optischen Schnitte werden insbesondere in der Mikrosopie verwendet, um Topografien einer Probe zu bestimmen oder
Oberflächeneigenschaften einer Probe wie z.B. Rauheit zu messen .
Für die Charakterisierung von technischen Oberflächen wird heute als Standardverfahren die konfokale Mikroskopie
eingesetzt. Dabei findet meist ein Abtasten der Probe in allen drei Raumrichtungen statt, d.h. es handelt sich um
punktscannende Systeme, bei denen ein optischer Strahl in x/y- Richtung über die Probe geführt wird. Zur Ableitung der
Höheninformation wird eine Bewegung der Probe relativ zur Detektoreinheit (in z-Richtung) benötigt. Aus dem
Intensitätsmaximum in Abhängigkeit von der z-Position kann für jeden x-y-Ort die Höheninformation und damit die Topographie abgeleitet werden.
Nachteilig bei diesem Verfahren ist unter anderem die lange Zeit, die durch den Rasterscan für eine 3D-Topographie
benötigt wird. Weiterhin kann es während des xy-Scans, bei welchem eine fixierte geometrische Anordnung zwischen
Probenkörper und optischem Sensor vorliegt, durch äußere Stöße bzw. Schwingungen zu unkontrollierten Bewegungen des
Sensorkopfes relativ zum Probenkörper kommen, wodurch das Messergebnis verfälscht werden kann.
Um das z-Rastern zu vermeiden, wird das chromatisch konfokale Prinzip verwendet. Hier wird in der Regel eine
polychromatische Lichtquelle eingesetzt, die die
interessierende Probe über ein chromatisch wirkendes
refraktives und/oder diffraktives Element beleuchtet, wodurch die z-Information spektral kodiert wird. Wird nun hinter einer konfokalen Lochblende in der Detektion das Spektrum vermessen, so kann hieraus die Höheninformation abgeleitet werden. Auch möglich, aber zeitaufwendig ist die Verwendung einer
durchstimmbaren Lichtquelle mit sequentieller konfokaler
Detektion wodurch ebenfalls ein Spektrum erhalten wird.
Kim et al beschreiben in „Chromatic confocal microscopy with a novel wavelength detection method using transmittance", OPTICS EXPRESS 6286, Vol. 21, No . 5 eine punktscannende chromatisch konfokale Anordnung mit 50/50-Strahlteilung im
Detektionsstrahlengang hinter der Pinhole-Detektion . Das
Probenlicht wird entsprechend mit zwei Photomultipliertubes (PMTxs) erfasst, wobei dem einen PMT ein Filter vorgeschaltet ist. Aus dem Intensitätsverhältnis der beiden PMTs wird die Transmission des Filters und damit die detektierte Wellenlänge und daraus schließlich eine Höheninformation ermittelt. Um den Nachteil des x-y-Rasterscans zu umgehen, existieren schon seit langen konfokale Weitfeldsysteme, bei denen in der Regel Flächenkameras zum Einsatz kommen. Ein Beispiel hierfür ist das Spinning-Disc-Verfahren mit Nipkow-Scheibe . Hier werden mehrere Punkte quasi gleichzeitig nach dem konfokalen Prinzip detektiert. Das Anfahren verschiedener z-Positionen zur Ermittlung eines Schnittbildes ist auch hier erforderlich.
Weiterhin sind konfokale Weitfeldsysteme bekannt, die auf strukturierter Beleuchtung basieren. Hier wird für jeden z-
Wert ein konfokales Schnittbild errechnet aus Bildern die mit einer z.B. durch ein Gitter gegebenen strukturierten
Beleuchtung aufgenommen wurden. In der Regel kann dabei auch das Weitfeldbild erhalten werden. Unter Ausnutzung der
Polarisation oder der Farbeigenschaften des
Beleuchtungslichtes werden Höheninformationen aus der Probe gewonnen. In der DE 10 2007 018 048 AI ist beispielsweise ein solches System beschrieben, bei dem zwei Beleuchtungsmuster auf die Probe projiziert werden.
Ebenfalls verwandt ist das Verfahren der Apertur-Korrelation. Hier wird eine sich kontinuierlich ändernde strukturierte Beleuchtung verwendet und das optische Schnittbild aus zwei parallel oder sequentiell aufgenommenen Bildern errechnet, von denen eines als schlecht konfokales Bild mit außerfokalen
Anteilen und eines als reines Weitfeldbild bzw. als Bild mit überwiegend außerfokalen Anteilen angesehen werden kann. Ein Vorteil dieser auf strukturierter Beleuchtung basierenden Verfahren ist, dass parallel zum konfokalen Bild auch ein Weitfeldbild quasi in einem Schuss erhalten werden kann.
Letztlich ist allen auf strukturierter Beleuchtung basierenden Systemen gemein, dass während der Änderung des Phasenmusters und/oder beim Verfahren der Probe bzw. des Sensors in z- Richtung Vibrationen einen störenden Einfluss auf das
Messergebnis nehmen können.
Es existieren noch andere Weitfeld-Methoden, mit denen
optische Schnitte erzeugt werden können. Hier ist zum Beispiel die Fokus-Variation zu nennen, bei welcher die Bildschärfe in Abhängigkeit von z ausgewertet wird, um hieraus ähnlich dem konfokalen Fall ein Maximum zu errechnen. Es werden dabei auch räumliche Informationen des Systems herangezogen.
Hinsichtlich der Schwingungsanfälligkeit bestehen die gleichen Probleme wie bei den zuvor genannten Verfahren.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskop und ein
Verfahren zur Erzeugung einer ortsaufgelösten Höheninformation einer Probe anzugeben, bei welchen störende Bewegungen am Mikroskop vermieden werden können.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und durch ein Weitfeldmikroskop gemäß Anspruch 7 gelöst.
Erfindungsgemäß wird das chromatisch konfokale Prinzip auf ein optisches Weitfeld-Schnittbildverfahren angewendet und
angepasst. Dies wird insbesondere durch eine Kodierung der Wellenlänge im Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlengang erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden
wellenlängeabhängige Filter im Detektionsstrahlengang
verwendet . In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe mit einer breitbandigen Beleuchtungsquelle in einem
Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet .
Der Beleuchtungsstrahlengang wird nach dem chromatisch
konfokalen Prinzip chromatisch moduliert.
Weiterhin wird mindestens ein Weitfeldbild erfasst, indem von der Probe in einem Detektionsstrahlengang reflektiertes oder emittiertes Probenlicht erfasst wird.
Das Weitfeldbild kann sowohl rein konfokale Anteile des
Probenlichts (z.B. bei der Verwendung einer Nipkow-Scheibe) aufweisen, aber auch aus konfokalen und außerfokalen Anteilen des Probenlichtes zusammengesetzt sein.
Im Beobachtungsstrahlengang und/oder im Beleuchtungs- oder Anregungsstrahlengang kommt mindestens eine
wellenlängeabhängige Filterfunktion bzw. Spektralverteilung zum Einsatz und für jeden Bildpunkt in x-y-Richtung werden mindestens zwei Messvorgänge mit den unterschiedlichen Filtern bzw. Spektralverteilungen durchgeführt. Diese Messvorgänge können parallel (bei der Verwendung mehrerer Bildsensoren) oder sequentiell stattfinden. Wird beispielsweise das Verhältnis aus den Intensitäten der mindesten zwei Messvorgänge in jedem Bildpunkt des
Weitfeldbildes gebildet, so ist hieraus die Wellenlänge mit maximaler Intensität des Probenlichtes und damit der Höhenwert der Probe am jeweiligen Bildpunkt bestimmbar.
Insbesondere gelingt dies prinzipiell unabhängig von der spektralen Reflektivität der Probe sowie unabhängig von den spektralen Eigenschaften der Lichtquelle und oder des Gerätes. Allgemein ist das Intensitätssignal im erfindungsgemäßen
Verfahren und Mikroskop im i-ten Messvorgang gegeben durch: h{x,y,z) =jάλ' Ρ{χ,γ,λ') R{x,y, ') Τ^χ,γ,λ') λ[ζχ,γ)](λ[ζ(χ,γ)] - λ')
Mit :
P(x,y, r): spektrale Charakteristik der Lichtquelle und des
Geräts eventuell auch abhängig von x,y
R{x,y, '): spektrale Reflektivität der Probe
Τι{χ,γ,λ'): Filterfunktion oder Spektralverteilung im i-ten
Messvorgang bzw. chromatische Modulation (beinhaltet auch Strahlteiler etc.)
gXmax(hmax-X) : spektrale Geräte-Response-Funktion mit Xmax als
Parameter
max = [z(x,y)]: maximal reflektierte Wellenlänge an der Stelle x,y entsprechend der Höhenfunktion
z(x,y) : Höhenfunktion der Probe
Gesucht ist nun die Höhenfunktion z(x,y) für die zu untersuchende Probe. Die konfokale oder quasi konfokale Detektion äußert sich insbesondere in der Funktion gxmax( max-X) . Die
Parametrisierung hinsichtlich der Wellenlänge deutet an, dass diese Funktion je nach Beschaffenheit der chromatischen Ablage spektral variiert. Für die weitere Betrachtung wird
vereinfachend angenommen, dass die Parametrisierung
vernachlässigbar ist und die Funktion g eine bei 0 lokalisierte Deltafunktion darstellt. Die obige Formel vereinfacht sich dann zu: li(x,y,z) = P(x,y, [z(x,y)]) Ä(x,y,A[z(x,y)]) 7Kx,y,A[z(x,y)]) Sind P, R und T hinreichend bekannt, so kann hieraus
prinzipiell bereits z(x,y) abgeleitet werden, was allerdings einen enormen Kalibrieraufwand mit sich bringt, auch da es sich um eine Absolutmessung handelt. Werden jedoch mindestens zwei Detektionsvorgänge i=l,2
herangezogen, so kann das Verhältnis gebildet werden zu:
/jfa , z) _ 7\(x,y,l[z(x,y)])
P und R spielen keine Rolle mehr. In Näherung gilt dies auch dann, wenn P und R über den durch die Form von g vorgegebenen Integrationsbereich konstant sind. Aus der rechten Seite lässt sich anhand der bekannten Filterfunktionen bzw.
Spektralverteilungen relativ einfach der zu einem gegebenen Intensitätsverhältnis zugehörige Wert λ und damit auch der Wert z(x,y) bestimmen.
In einem Spezialfall weist T2 keine Wellenlängenabhängigkeit auf (TS(X) = constant) . Realisiert werden kann dieser Fall
beispielsweise mit Hilfe zweier gleichartiger Detektoren und einem Strahlteiler, wobei nur in einem Strahlengang ein wellenlängen-abhängiger Filter zum Einsatz kommt.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, nur einen Kanal zu verwenden und zwei sequentielle Messungen mit und ohne bzw. mit zwei verschiedenen wellenlängen-abhängigen Filter
durchzuführen, die allerdings in so schneller Folge
durchgeführt werden, dass quasi von einer Einschuss-Messung gesprochen werden kann (Gesamtmessung < 100ms) .
Auch möglich ist die Verwendung eines Filters in der Anregung, so dass bei gleicher Lichtquelle alternierend mit und ohne Filter gemessen wird.
Ein weiterer Spezialfall ist die Verwendung zweier spektral zueinander versetzter Bandpassfilter in Anregung und/oder Detektion. In der Detektion ist auch hier neben einer
sequentiellen Anordnung eine parallele Anordnung möglich. Ein Beispiel für die parallele Anordnung ist die Verwendung einer Farbkamera mit Bayer-Pattern mit Auswahl von jeweils zwei Farbkanälen .
Ein weiterer Spezialfall ist beispielsweise die Verwendung von zwei Detektionskanälen und einem dichroitischen Strahlteiler, so dass T2=l-T] wird. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
ein erstes bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Weitfeldmikroskops ; eine Ausgestaltungsvariante mit parallelen Detektoren; eine Ausgestaltungsvariante mit parallelen Detektoren und Filtern im Detektionsstrahlengang; eine Ausgestaltungsvariante mit einem Schaltelement im Detektionsstrahlengang; eine Ausgestaltungsvariante mit einem Chip-Splitter- Detektor; ein zweites bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops; ein drittes bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops; eine vorteilhafte Ausgestaltungsvariante des Beleuchtungsstrahlenganges mit einem Schaltelement; eine vorteilhafte Ausgestaltungsvariante des Beleuchtungsstrahlenganges mit zwei gleichen Be1euchtungsIichtquellen; eine vorteilhafte Ausgestaltungsvariante des Beleuchtungsstrahlenganges mit zwei spektral verschiedenen Beleuchtungslichtquellen .
In der nachfolgenden Figurenbeschreibung gelten gleiche
Bezugsziffern für gleiche Elemente. Deren Funktionsbeschrei-
bungen gelten auch in den Figuren bzw. Ausführungsformen, in denen sie nicht ausdrücklich erwähnt sind.
Figur 1 zeigt eine erste bevorzugtes Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Weitfeldmikroskops. Eine polychromatische Beleuchtungsquelle 1 (z. Bsp. Breitband-Laser, Halogenlampe, Superlumineszenz-Diode, ...) , bei der in dieser Ausführungsform verschiedene spektrale Verteilungen durch ein Selektions¬ element 2 selektierbar sind. Dieses Selektionselement 2 kann beispielsweise ein AOTF (Acousto-optical Tunable Filter) , ein Prisma, ein Gitter oder auch eine Filterselektionseinheit sein. Das Beleuchtungslicht kann dann durch eine Ablenkeinheit 3 in unterschiedliche Richtungen abgelenkt werden. Die
Ablenkeinheit 3 stellt beispielsweise einen schnell
schaltbaren Spiegel (z.B. Galvo-Spiegel) , einen AOD (Acousto- optical deflector) oder eine auf Polarisationsdrehung
basierende Schalteinheit dar.
Ein strukturiertes Element 4 ist in einer Ebene A konjugiert zu einer Probenebene P angeordnet. Im einfachsten Fall stellt das strukturierte Element 4 eine transmittive 1D- oder 2D- Gitterstruktur dar. Die Struktur wird über refraktiv und/oder diffraktiv wirkende Farblängsfehler-induzierende Elemente 6, 7 (Objektiv) in den Probenraum abgebildet, so dass hier eine chromatische Aufspaltung 8 in z-Richtung generiert wird, d.h. der Fokus verschiebt sich in Abhängigkeit von der Wellenlänge in z-Richtung.
Im Beobachtungsstrahlengang sind vorteilhafterweise
Lichtleiterfasern 9 angeordnet. Es kann aber in anderen
Ausführungsformen hierfür auch eine einfache Freistrahlführung basierend auf Spiegeln verwendet werden. Mit den
Lichtleitfasern 9 kann optional eine Polarisationsfilterung vorgenommen werden.
Durch die Ablenkeinheit 3 ist es möglich, das strukturierte Element 4 mit Hilfe je einer Kollimationslinse 11 von zwei Seiten sequentiell zu beleuchten (gestrichelte Darstellung) . Dazu ist das strukturierte Element 4 verspiegelt ausgeführt, es können dementsprechend zwei Gitterphasen in den Probenraum bzw. die Probenebene P abgebildet werden. Ist das
strukturierte Element 4 nicht verspiegelt, so entfällt die Ablenkeinheit 3 und die gestrichelt dargestellte Optik.
Zur Vereinigung des Transmissions- und Reflexions- Strahlengangs wird ein Strahlteiler 12 verwendet. Das
Beleuchtungslicht wird dann durch einen Strahlteiler 13 weiter zu einer im Probenraum P positionierten Probe 14 geführt, wobei der Strahlteiler 13 vorteilhafterweise als
Polarisationsstrahlteiler ausgeführt ist. Es kann nämlich weiterhin eine Lambda/4-Platte 16 im Strahlengang angeordnet sein, so dass das zur Probe 14 gehende Beleuchtungslicht und von der Probe 14 reflektierte oder emittierte zu detektierende Probenlicht eine um 90° zueinander verdrehte Polarisation aufweisen und so am Strahlteiler 13 gut voneinander abgetrennt werden können.
Weiterhin ist es mit einer solchen Konfiguration möglich, störende Reflexionen, die von den optischen Elementen einer
Detektionseinheit 17 und nicht von der Probe 14 herrühren, zu unterdrücken. Hierzu kann weiterhin vor der Detektoreinheit 17 ein Polarisationsfilter 18 angeordnet sein. Die
Detektionseinheit 17 kann eine einfache Kamera mit
entsprechender Abbildungsoptik sein, wenn die spektralen
Verteilungen über das Selektionselement 2 allein in der
Beleuchtung bzw. Anregung gewählt werden. Zusätzlich oder stattdessen ist auch eine der Ausführungsvarianten gemäß der Figuren 2 bis 5 möglich.
Figur 2 beschreibt beispielsweise eine Anordnung, in welcher das Probenlicht zunächst durch einen Farbteiler 19 geführt wird, so dass zwei Detektionskanäle bedient werden, die jeweils eine Abbildungsoptik 21 und eine Kamera 22 umfassen.
Im Wesentlichen entspricht diese Anordnung dem oben
beschriebenen Spezialfall mit T2 = 1- Tl. In Figur 3 ist im Vergleich zu Fig. 2 der Farbteiler durch einen Strahlteiler 23 ersetzt, der zunächst keine
wellenlängen-abhängige Filterung bewirkt. Diese kommt
allerdings in Kanal I durch einen Filter 24 zustande. Optional kann auch in Kanal II ein Filter 26 angeordnet sein (T2 wäre dann nicht konstant; gibt es keinen Filter 26, so wäre T2 konstant) .
Mit Figur 4 wird die weiter oben bereits beschriebene
sequentielle Detektion abgebildet. Ein Schaltelement 27 dient dem sequentiellen Schalten von Filterunktionen . Das
Schaltelement 27 kann dabei z.B. ein schnelles Filterrad oder ein AOTF oder eine geeignete Strahlteileranordnung mit
Schaltspiegelanordnung sein. Eine spezielle Anordnung, die ähnlich wie die in Figur 2 oder 3 beschriebenen Anordnungen funktioniert, ist in Figur 5 gezeigt. Hier kommt ein sogenannter Chip-Splitter 28 zum
Einsatz, wie er beispielsweise von der Firma Optosplit
angeboten wird, d.h. es wird ein und derselbe Kamerachip der Kamera 22 für die zwei Messvorgänge genutzt, die somit auch parallel ablaufen können.
Es ist somit mit einer Vorrichtung gemäß der zuvor
beschriebenen Figuren zunächst möglich, unterschiedliche
Gitterphasen bzw. Strukturen auf die Probe abzubilden und zu detektieren, und es kann auf diese Weise wie bei den gängigen Verfahren der strukturierten Beleuchtung ein „optisches
Schnittbild" erstellt werden, welches für ein gegebenes Pixel in xy nur dann ein signifikantes Signal aufweist, wenn die Probenoberfläche an dieser Stelle im Fokus ist. In der Regel lässt sich hier stets eine Wellenlänge finden, für die dieser Fall gegeben ist, sofern die Oberflächentopographie in ihrer Höhendynamik nicht wesentlich über den mit der chromatisch Ablage verknüpften Messbereich hinaus geht.
Die Auswertung der Bilddaten erfolgt dahingehend, dass für jedes Pixel diejenige Wellenlänge ermittelt wird, bei der das optische Schnittbildsignal maximal wird. Hieraus kann dann direkt auf die Funktion z(x,y) bzw. die Oberflächentopographie geschlossen werden. Dies erfolgt beispielsweise durch
Auswertung der Filterfunktion wie oben beschrieben, wobei im einfachsten Fall die Intensitätsverhältnisse aus den
mindestens zwei Messvorgängen ausgewertet werden und hieraus direkt auf die Wellenlänge geschlossen wird.
Selbstverständlich sind hierbei Mehrfachmessungen sinnvoll, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Sinnvoll kann es darüber hinaus auch sein, die Mehrfachmessungen bei unterschiedlichen Absolut-Höhen durch ein Verschieben der Probe relativ zum Sensor durchzuführen. Dies ist dann
vorteilhaft, wenn die Probe stark gefärbt ist und in
unterschiedlichen Spektralbereichen ein unterschiedlichen Reflexionsverhalten zeigt. In Abhängigkeit von der Probe ist ebenfalls ein HDR-Imaging beispielsweise durch Mehrfachmessungen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten sinnvoll, damit das Rauschen für jedes Pixel im wesentlichen Shot-Noise limitiert ist. Mitunter reicht eine Kalibrierung unabhängig von der Funktion g sowie der Funktion
P nicht aus, so dass diese beiden Funktionen als Geräte- Eigenschaften noch mit hinzugezogen werden müssen. Die
Wellenlänge wird dann unter Umständen nicht direkt, sondern unter Anwendung eines iterativen Verfahrens bestimmt.
Ist die Oberflächentopographie so beschaffen, dass ihre
Höhendynamik den mit der chromatisch Ablage verknüpften
Messbereich übersteigt, so ist gegebenenfalls ein z-Stitching erforderlich, bei welchem gleichartige Messungen bei
verschiedenen Abständen zwischen Sensor und Probe durchgeführt werden und anschließend miteinander verknüpft werden.
Die Filterfunktionen sind sinnvollerweise so an die
chromatische Farbablage angepasst, dass über den gesamten Wellenlängenbereich eine ähnlich sensitive Höhenbestimmung möglich ist.
Mitunter kann es zweckmäßig sein, eine Filterfunktion sowohl in der Beleuchtung als auch in der Detektion anzuwenden sowie mehrere Messungen mit unterschiedlichen Filterfunktionen durchzuführen, um eine bessere Sensitivität hinsichtlich der Höhenbestimmung zu erreichen.
Mit Hinblick auf Figur 1 kann das Schalten unterschiedlicher Gitterphasen auch durch ein einfaches Umschalten von
Strahlengängen realisiert werden, wozu beispielsweise ein elektrooptischer Modulator (EOM) oder ein akustooptischer Modulator (AOD) zum Einsatz kommen kann. Im gezeigten Fall ergibt sich dabei beispielsweise eine phasenverschobene
Abbildung des strukturierten Elementes 4 in Transmission und
Reflexion. Es sind darüber hinaus auch Anordnungen denkbar, wo beispielsweise ein EOM oder ein AOD oder auch ein Galvo- Spiegel ein schnelles Gitterschalten durch eine direkte
Modulation in der Pupillenebene des Objektivs 7 bewirkt. Ein
Gitter ist hier gemäß der Fouriertransformation im
Wesentlichen als Punktmuster dargestellt, welches den
einzelnen Beugungsordnungen des Gitters entspricht. Durch eine Winkelmodulation wäre es beispielsweise möglich, schnell zwischen unterschiedlichen Gitterlagen zu schalten.
In einer anderen Variante wird das strukturierte Element 4, das auch durch eine 2D-Lochblenden-Anordnung gebildet sein kann, auf verschiedene Positionen bewegt, und es werden mit der Detektoreinheit 17 entsprechende Bilder aufgenommen, wobei hier aber nur jeweils ein Lichtkanal der Beleuchtung verwendet wird. Die Detektoreinheit 17 kann gleichsam als digitales PH- verwendet werden, so dass ein echt konfokales Bild durch
Verrechnen und Zusammensetzen der bei den einzelnen Positionen aufgenommenen Bilder erhalten wird.
Die Auswertung hinsichtlich der Wellenlänge erfolgt wie oben beschrieben . In einer weiteren Variante entfällt die Struktur 4 komplett und es wird jeweils nur für jeden lokalen Bildbereich eine Schärfefunktion über die Wellenlänge ermittelt. Dies
entspricht dem Prinzip der Fokusvariation, wie sie
beispielsweise in M. Rahlves, J. Seewig, „Optisches Messen technischer Oberflächen", Beuth Verlag GmbH, Berlin, 2009, beschrieben ist. Bei hinreichend strukturierten Proben reicht auch dies aus, um Höheninformationen zu erhalten.
Ähnlich gestaltet sich ein Aufbau, der nach dem Prinzip des HiLo-Verfahrens funktioniert. Das strukturierte Element 4 kann hier auch ein Element zu gezielten Einführung eines Speckle- Patterns darstellen, welches komplett aus dem Strahlengang entfernt werden kann.
Figur 6 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel für ein
chromatisches Weitfeldmikroskop, welches der Kombination des Apertur-Korrelationsprinzips mit der chromatisch konfokalen Technologie entspricht. In einer Zwischenbildebene Z ist hier eine rotierbare Scheibe 31 mit einer verspiegelten Struktur 32 angeordnet. Das von der Probe 14 zurückreflektierte oder emittierte Probenlicht (Detektionsstrahlengang) wird im dargestellten Beispiel in zwei Kamera-Kanälen detektiert, wobei ein erster Detektor 33 das durch die Scheibe 31
transmittierte Probenlicht (konfokale Anteile) und ein zweiter Detektor 34 das ab der verspiegelten Struktur 32 reflektierte Probenlicht (Weitfeld-Bild mit außerfokalen Anteilen)
erfassen. Optional können auch hier Polarisationsfilter 18 im Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
Aus den beiden Bildern der Detektoren 33, 34 kann in
Abhängigkeit von der Wellenlänge sowohl ein Weitfeld-Bild als auch ein konfokales Bild errechnet werden. Wiederum ergibt sich aus der Intensität als Funktion der Wellenlänge die gesuchte Höheninformation für jedes Detektionspixel . Natürlich lässt sich die erhaltene Farbaufnahme auch direkt dazu nutzen, ein Farbbild mit erweiterter Schärfentiefen-Information darzustellen. Ebenso sind auch Aufbauten möglich, bei denen die beiden Kanäle auf nur einem Kamera-Chip angeordnet sind.
In Figur 7 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel dargestellt, in welchen beispielsweise ein Lochblenden-Array 41 bzw. eine Nipkow-Scheibe zum Einsatz kommt. Eine Erfassung der gesamten Probenoberfläche wird durch eine Bewegung (Rotation,
Verschiebung) des Lochblenden-Arrays 41 und/oder eine
optionale Scannereinheit 42 erreicht. Ist das Lochblenden- Array 41 eine Nipkow-Scheibe und als solche mit strukturierten und unstrukturierten Sektoren ausgeführt, so stellt diese Ausführungsform auch einen Sonderfall der Apertur-Korrelation
dar, bei welchem die Konfokalitätsauswertung durch Verrechnung von sequentiell oder parallel aufgenommenen strukturiert und nicht-strukturiert beleuchteten Bildern erfolgt. Ein Interferometerelement 43 ist optional zur Steigerung der Messgenauigkeit vorgesehen. Dieses kann auch in allen anderen Ausführungsformen vorhanden sein.
Figuren 8 bis 10 zeigen mögliche Ausgestaltungsvarianten zum Einsatz von Filterfunktionen bzw. unterschiedlichen spektralen Verteilungen im Beleuchtungsstrahlengang.
So zeigt Figur 8 die polychromatischen Lichtquelle 1, deren Licht mit einem schnellen Schaltelement 44 in unterschiedliche Kanäle geleitet werden kann, was wiederum in Analogie zum oben besprochenen den zwei Messvorgängen gleich kommt. In beiden Kanälen können nun unterschiedliche Filter 46 und 47
angeordnet sein. Im Prinzip reicht auch nur einer der beiden Filter 46, 47. In jedem Fall findet eine Strahlvereinigung am Strahlvereinigerelement 48 statt, wobei dieses in einer geschickten Variante auch polarisationssensitiv z.B. als Polarisationsstrahlteiler gestaltet sein kann. Wird statt des Strahlvereinigerelementes 48 ein Farbteiler eingesetzt, so kann auf die Filter 46, 47 ggf. verzichtet werden, was in der Gesamtwirkung dem anhand von Fig. 2 beschriebenen Fall in sequentieller Ausführung entspricht.
Fig. 9 zeigt eine Ausgestaltungsvariante der Erfindung, bei der zwei gleichartige Lichtquellen 1 mit jeweils
nachgeschalteten Filtern 46, 47 verwendet werden, die schnell hintereinander geschaltet werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltungvariante gibt Fig. 10 wieder. Hier werden zwei unterschiedliche Beleuchtungsquellen
51 und 52 eingesetzt, die sich hinsichtlich ihrer spektralen Charakteristik unterscheiden. Das Strahlvereinigungselement 53 ist nunmehr als reiner Strahlvereiniger ausgeführt. Die spektralen Charakteristiken ergeben bereits die gewünschten Filterfunktionen. Beispielsweise können die Spektren der
Beleuchtungsquellen 51, 52 leicht zueinander verschoben und gaussförmig sein. Aus dem Intensitätsverhältnis der beiden mit jeweils einer der Beleuchtungsquellen 51, 52 gekoppelten
Messvorgänge ist dann sofort die Wellenlänge ableitbar.
Bezugs zeichenliste
01 Beleuchtungsquelle 32 verspiegelte Struktur
02 Selektionselement 33 erste Detektoreinheit
03 Ablenkeinheit 34 zweite Detektoreinheit
04 strukturiertes Element 35
05 41 Lochblenden-Array
06 Farblängsfehler- 42 Scannereinheit
induzierendes Element 43 Interferometer
07 Objektiv 44 Schaltelement
08 chromatische Aufspaltung 45
09 Lichtleitfaser 46 Filter
10 47 Filter
11 Kollimationslinse 48 Strahlvereinigungselement
12 Strahlteiler 49
13 Strahlteiler 50
14 Probe 51 Beleuchtungsquelle
15 52 Beleuchtungsquelle
16 λ/4-Platte 53 Strahlvereinigungselement
17 Detektoreinheit
18 Polarisationsfilter A, Z - Feldebene
19 Farbteiler
20
21 Abbildungsoptik
22 Kamera
23 Strahlteiler
24 Filter
25
26 Filter
27 Schaltelement
28 Chip-Splitter
29
30
31 Scheibe
Claims
Patentansprüche
Verfahren zum Ermitteln einer ortsaufgelösten
Höheninformation einer Probe (14) mit einem
Weitfeldmikroskop, folgende Schritte umfassend:
Beleuchten der Probe (14) mit einer breitbandigen
Beleuchtungsquelle (1) in einem
Beieuchtungsstrahlengang;
chromatische Modulation des
Beleuchtungsstrahlenganges oder eines
Detektionsstrahlenganges ;
Erfassen mindestens eines Weitfeldbildes aus von der Probe in dem Detektionsstrahlengang reflektierten oder emittierten Probenlichtes mit chromatisch konfokalen Anteilen;
Pixelweises Ermitteln von Höheninformationen der Probe aus dem Weitfeldbild durch Auswerten chromatisch konfokaler Anteile des
Detektionsstrahlenganges in Abhängigkeit von der chromatischen Modulation.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin folgende Schritte umfassend :
Erfassen eines ersten Bildes mit einer ersten
chromatischen Modulationseinstellung;
Erfassen eines zweiten Bildes mit einer zweiten chromatischen Modulationseinstellung zeitgleich oder zeitversetzt zur Erfassung des ersten Bildes;
Ermitteln eines Verhältnisses der Intensitätssignale der beiden Bilder für jeden Bildpunkt;
Bestimmen eines Höhenwertes z(x,y) der Probe (14) für jeden Bildpunkt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Intensitätssignal definiert ist durch
li(x,y,z) = / dX P(x,y,X') R(x,y,X') Τ^χ,γ,λ') gx[z(x,y)]( [z(_x,y)] - λ') , wobei :
P(x,y,Xr) eine spektrale Charakteristik der Lichtquelle und des Geräts;
R{x,y,X') eine spektrale Reflektivität der Probe;
Ti{x,y, ') die chromatische Modulation;
gAmax( max- ) eine spektrale Geräte-Response-Funktion mit Xmax als Parameter;
max eine maximal reflektierte Wellenlänge an einer
Stelle x,y entsprechend einer Höhenfunktion; und z(x,y) die Höhenfunktion der Probe darstellt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnisses der Intensitätssignale der beiden
Bilder für jeden Bildpunkt nach der Vorschrift
l {x,y,z) _ Tx{_x,y,X\z{_x,y )
l2(x,y,z) r2 (x, y, A[z(x, y)])
gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatische Modulation des Beleuchtungsstrahlenganges durch eine sequentielle
Schaltung eines Filters in den Beleuchtungsstrahlengang oder in den Beobachtungsstrahlengang erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Erfassen eines ersten
Weitfeldbildes und eines zweiten Weitfeldbildes in zwei separaten Detektionskanälen erfolgt.
Weitfeldmikroskop umfassend
eine Beleuchtungsquelle (1, 52, 53), die in einem
Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist;
eine erste Detektoreinheit (17, 33) zur Erfassung eines Weitfeldbildes in einem Beobachtungsstrahlengang einer in einer Probenebene (P) beleuchteten Probe (14);
einen Modulator zur chromatischen Modulation des
Beleuchtungsstrahlenganges oder des
Beobachtungsstrahlenganges in einer Richtung senkrecht zur Probenebene (P) ;
eine Auswerteeinheit zur Ermittlung einer chromatisch konfokalen Höheninformation in jedem Bildpunkt des Weitfeldbildes
Weitfeldmikroskop nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass es einen zweiten Detektor umfasst, der gleichartig zum ersten Detektor ist.
Weifeldmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem ersten und dem zweiten Detektor ein Strahlteiler angeordnet ist und in einem der
Beobachtungsstrahlengänge als Modulator ein
wellenlängeabhängiger Filter angeordnet ist.
Weifeldmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Detektor im Beobachtungsstrahlengang einer Einrichtung zur Erfassung chromatisch konfokaler Anteile nachgeordnet angeordnet ist und der zweite Detektor zur Erfassung außerfokaler Anteile im
Beobachtungsstrahlengang angeordnet ist.
Weitfeldmikroskop nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Schaltelement im
Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist.
Weitfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der chromatische Modulator ein Filter ist.
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