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WO2016013541A1 - 分子標的薬を含有する標識剤 - Google Patents

分子標的薬を含有する標識剤 Download PDF

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WO2016013541A1
WO2016013541A1 PCT/JP2015/070676 JP2015070676W WO2016013541A1 WO 2016013541 A1 WO2016013541 A1 WO 2016013541A1 JP 2015070676 W JP2015070676 W JP 2015070676W WO 2016013541 A1 WO2016013541 A1 WO 2016013541A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aromatic ring
group
labeling agent
nitrogen
label
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/070676
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English (en)
French (fr)
Inventor
拓司 相宮
古澤　直子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to EP15823991.3A priority Critical patent/EP3173785B1/en
Priority to US15/327,782 priority patent/US20170205417A1/en
Priority to JP2016535933A priority patent/JP6645427B2/ja
Publication of WO2016013541A1 publication Critical patent/WO2016013541A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/57525—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the present invention relates to a labeling agent that can be used for measuring the binding amount of a molecular target drug to a specific biological substance (target molecule) in a tissue, and more specifically, a molecular target drug that is a compound having an aromatic ring containing a nitrogen atom. And a labeling agent comprising a label linked thereto.
  • Molecular target drugs are drugs that treat diseases by elucidating genes and proteins that cause specific diseases and acting on biological substances involved in their abnormal expression and signal transduction.
  • some low molecular weight compounds or antibodies have been put to practical use as molecular target drugs for cancer, autoimmune diseases and the like.
  • a label such as a radioisotope, an enzyme that reacts with a specific substrate to develop color, or a fluorophore is linked to a candidate drug, the candidate drug is bound to a target molecule, and bound by a signal derived from the label.
  • a technique for measuring quantities is used.
  • Patent Document 1 International Publication WO2012 / 133347 discloses an immune tissue in which an antibody (trastuzumab or the like) used in an antibody drug is labeled and bound to an antigen (HER2 or the like) targeted by the antibody drug.
  • a staining method is described.
  • Quantum dots and fluorescent substance integrated nanoparticles organic fluorescent dye integrated silica nanoparticles, etc.
  • this immunohistological staining method is an antibody drug. It is also described that the method can be applied to a method for determining the effectiveness of.
  • the use of fluorescent substance-integrated nanoparticles as a label for immunostaining is preferable because quantitative determination can be performed with high accuracy compared to the use of quantum dots or color formers using conventional enzymes.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 2007-5213378 discloses a biological substance such as a binder, a labeling compound (organic fluorescent dye, etc.), a therapeutic agent (kinase inhibitor, etc.) at the end of a predetermined divalent linker molecule.
  • the kinase inhibitor includes a compound having an aromatic ring containing a nitrogen atom (hereinafter referred to as “nitrogen-containing aromatic ring-containing compound”).
  • nitrogen-containing aromatic ring-containing compound a compound having an aromatic ring containing a nitrogen atom
  • sorafenib see compound number VI in the table of paragraph [0070]).
  • Patent Document 2 as a site to be bonded to a linker molecule of a compound having an aromatic ring (nitrogen-containing aromatic ring) containing a nitrogen atom, (i) when the nitrogen-containing aromatic ring is located at the end of the compound Selecting the nitrogen atom of the nitrogen-containing aromatic ring or the functional group containing the nitrogen atom directly or indirectly bonded to the nitrogen-containing aromatic ring (amino group, amide group, carbamoyl group, etc.) (Iii) Although an embodiment in which an aromatic ring not containing a heteroatom is located at the terminal of the compound and an aromatic ring carbon atom is selected is disclosed, (iii) When a nitrogen aromatic ring is located, selecting a carbon atom of the nitrogen-containing aromatic ring and its technical significance are not disclosed.
  • Patent Document 2 suggests that a divalent linker molecule is bonded to the nitrogen atom of the carbamoyl group bonded to the nitrogen-containing aromatic ring (pyridyl group) at the end.
  • the embodiment in which the divalent linker molecule is bound to sorafenib as described above is not specifically disclosed.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 2012-533579 includes a compound carrying a carboxyl group and a predetermined oligomer composed of an ⁇ -lysine monomer unit as an invention aimed at targeting to the kidney. Furthermore, conjugates in which an active compound may be covalently bound are described, and examples of the active compound include protein kinase inhibitors such as sorafenib. For example, in Example 8 (paragraphs [0181] to [0189]), a conjugate (DOTA- ⁇ -polylysine) containing DOTA, ⁇ -polylysine as the compound carrying the carboxyl group, and a sorafenib derivative as the active compound.
  • DOTA conjugate
  • ⁇ -polylysine containing DOTA
  • ⁇ -polylysine as the compound carrying the carboxyl group
  • sorafenib derivative as the active compound.
  • sorafenib derivatives The preparation of sorafenib derivatives).
  • ⁇ -polylysine is a hydroxyethyl group (bonded to the nitrogen atom of the carbamoyl group bonded to the pyridyl group) introduced at the terminal of the sorafenib derivative. Is bound to.
  • An object of the present invention is to provide a labeling agent excellent in binding to a target molecule in a bioassay or tissue staining method related to a nitrogen-containing aromatic ring-containing compound.
  • the present inventors When the labeling agent to which the label is bonded via the carbon atom of the nitrogen-containing aromatic ring of the nitrogen-containing aromatic ring-containing compound is different from the conventional one, the present inventors have a signal derived from the label than before. Has been found to be strong, in particular, the fluorescence intensity representing binding to the target molecule is increased, or the number of bright spots is increased, and the present invention has been completed.
  • the present invention in one aspect, is a labeling agent having a structure in which a molecular target drug, which is a compound having an aromatic ring containing a nitrogen atom, and a label are bonded via a divalent linking group. And Provided is a labeling agent wherein one end of the divalent linking group is bonded to a carbon atom of an aromatic ring containing the nitrogen atom.
  • the present invention provides a bioassay characterized by using the labeling agent.
  • the present invention provides a tissue staining method using the labeling agent.
  • the binding ability of the nitrogen-containing aromatic ring-containing compound used as the molecular target drug to the target molecule is improved as compared with the conventional labeling agent. It becomes possible to evaluate more accurately or more accurately quantify the target molecule present in a tissue section (pathological specimen) derived from a patient to estimate the effect of the molecular target drug more accurately.
  • the labeling agent in the present invention is a labeling agent having a structure in which a nitrogen-containing aromatic ring-containing compound as a molecular target drug and a label are bonded via a divalent linking group, One end of the linking group is bonded to the carbon atom of the nitrogen-containing aromatic ring.
  • the molecular target drug used in the present invention can be selected from nitrogen-containing aromatic ring-containing compounds used in the technical field, and is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the nitrogen-containing aromatic ring-containing compound in the present invention generally refers to a compound belonging to a low molecular weight drug rather than an antibody drug among molecular target drugs.
  • the molecular target drug in the present invention may have or may have some ability to bind to or interact with the target molecule. It includes not only drugs but also candidate compounds for selecting molecular target drugs that can be put into practical use, such as derivatives of molecular target drugs that have been put into practical use.
  • nitrogen-containing aromatic ring examples include pyrrole, pyrazole, imidazole, triazole (5-membered monocyclic compound); pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, triazine, tetrazine (6-membered monocyclic compound).
  • Diazepine (seven-membered monocyclic compound): indole, isoindole, benzimidazole, purine (five-membered ring + six-membered bicyclic compound); quinoline, isoquinoline (two-membered six-membered ring + six-membered ring) And those derived from aromatic cyclic compounds containing nitrogen atoms, such as cyclic compounds).
  • the nitrogen-containing aromatic ring is an aromatic cyclic compound containing a hetero atom such as an oxygen atom or a sulfur atom in addition to a nitrogen atom, such as oxazole, benzoxazole containing a nitrogen atom and an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom. It may be derived from thiazole, benzothiazole and the like.
  • These nitrogen-containing aromatic rings have a halogen atom, a lower alkyl group (having about 1 to 4 carbon atoms), an alkoxy group, an alkoxycarbonyl group, a hydroxy group, a carboxy group, a nitro group, and a carbon atom or hetero atom at an appropriate site. It may have a substituent such as a group.
  • the nitrogen-containing aromatic ring may be located at the end of the molecular structure of the compound, or may be located in the middle. A plurality of nitrogen-containing aromatic rings may be contained in one molecule of the compound.
  • examples of the nitrogen-containing aromatic ring-containing compound include axitinib (see the following formula).
  • axitinib derivatives can also be used as molecular target drugs.
  • Axitinib derivatives include a functional group introduced, oxidized, reduced, and atom replacement of axitinib so that the host structure is not significantly changed (especially an aromatic ring containing one nitrogen atom at the end of the divalent linking group (pyridine Various compounds that have been modified (so as not to interfere with bonding to the ring) carbon atoms and that have the same or better molecular target drug action as axitinib are included.
  • the labeled body used in the present invention can be selected from various types of labeled bodies used in the technical field, and is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Representative labels include radioisotopes, enzymes that develop color by reacting with a specific substrate, phosphors, etc., but they can measure fluorescence intensity or number of bright spots as signals, and are excellent in quantitative performance.
  • a phosphor capable of accurately evaluating the binding property of the molecular target drug to the target molecule is preferable.
  • the phosphor can be selected from various known phosphors used in the technical field, and is not particularly limited. Typical phosphors include inorganic semiconductor nanoparticles (also called “quantum dots”), organic fluorescent dyes, and nano-sized aggregates of these phosphors, with each target molecule as a bright spot. Fluorescent substance-integrated nanoparticles, particularly fluorescent dye-containing resin particles, which can emit fluorescence with sufficient intensity to be expressed and can be detected even with a relatively inexpensive low-sensitivity camera, are preferred.
  • the “phosphor” in this specification is irradiated with electromagnetic waves (X-rays, ultraviolet rays, or visible rays) having a predetermined wavelength and absorbs energy to excite electrons and return from the excited state to the ground state.
  • electromagnetic waves X-rays, ultraviolet rays, or visible rays
  • a substance that emits surplus energy as electromagnetic waves that is, a substance that emits "fluorescence” and that can be combined with a “probe”.
  • fluorescence has a broad meaning and includes phosphorescence having a long emission lifetime in which emission is continued even when irradiation of electromagnetic waves for excitation is stopped, and narrow sense fluorescence having a short emission lifetime.
  • Inorganic semiconductor nanoparticles include those containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or group IV elements, such as CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN. , InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, Ge, and the like.
  • those having these inorganic semiconductor nanoparticles as a core and a shell formed on the outside thereof for example, CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge Core / shell type inorganic semiconductor nanoparticles such as / GeO 2 and Ge / ZnS can also be used.
  • Organic fluorescent dyes examples include rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic ring dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, and pyromesene dye molecules. Can do.
  • Alexa Fluor registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • BODIPY registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • Cy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • DY dye molecule registered trademark, manufactured by DYOMICS
  • HiLyte registered trademark, manufactured by Anaspec
  • dye molecule DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific)
  • ATTO registered trademark, manufactured by ATTO-TEC
  • MFP registered trademark, manufactured by Mobitec
  • Fluorescent substance integrated nanoparticles As a representative example of fluorescent substance aggregates, a structure in which particles made of an organic or inorganic substance are used as a base, and a plurality of fluorescent substances are included in and / or adsorbed on the surface thereof. “Fluorescent substance-integrated nanoparticles” which are nano-sized particles having In this case, it is preferable that the base (for example, resin) and the fluorescent substance (for example, organic fluorescent dye) have substituents or sites having charges opposite to each other, and that electrostatic interaction works. .
  • the fluorescent substance to be encapsulated in the fluorescent substance integrated nanoparticles in addition to the inorganic semiconductor nanoparticles and fluorescent dye molecules as described above, for example, Y 2 O 3 , Zn 2 SiO 4 or the like is used as a base, and Mn 2+ , Eu 3 Examples include “long afterglow phosphors” using + or the like as an activator.
  • the organic substance is a resin generally classified as a thermosetting resin such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin; Resins generally classified as thermoplastic resins such as styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer); polylactic acid Other resins such as: polysaccharides can be exemplified, and silica (glass) can be exemplified as the inorganic substance.
  • a thermosetting resin such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin
  • Resins generally classified as thermoplastic resins such as styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, AS resin (acrylonitrile-styrene cop
  • Fluorescent substance-integrated nanoparticles can be produced according to a known method (for example, see JP2013-57937A). More specifically, for example, the fluorescent substance-encapsulating silica particles having silica as a base material and encapsulating the fluorescent substance therein are inorganic substances such as inorganic semiconductor nanoparticles, organic fluorescent dyes, and tetraethoxysilane. It can be produced by dropping a solution in which the silica precursor is dissolved into a solution in which ethanol and ammonia are dissolved and hydrolyzing the silica precursor.
  • a resin solution or a dispersion of fine particles is prepared in advance.
  • it can be prepared by adding a fluorescent substance such as inorganic semiconductor nanoparticles or organic fluorescent dye and stirring the mixture.
  • fluorescent substance-containing resin particles can also be produced by adding a fluorescent dye to the resin raw material solution and then allowing the polymerization reaction to proceed.
  • a thermosetting resin such as a melamine resin
  • a raw material of the resin monomer or oligomer or prepolymer, for example, methylol melamine which is a condensate of melamine and formaldehyde
  • an organic fluorescent dye
  • the organic fluorescent dye-containing resin particles can be prepared by heating a reaction mixture further containing a surfactant and a polymerization reaction accelerator (such as an acid) and advancing the polymerization reaction by an emulsion polymerization method.
  • thermoplastic resin such as a styrene copolymer
  • an organic fluorescent dye is bonded in advance as a resin raw material monomer by a covalent bond or the like.
  • the reaction mixture containing a polymerization initiator (benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, etc.) is heated and the polymerization reaction proceeds by radical polymerization or ionic polymerization.
  • a polymerization initiator benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, etc.
  • the average particle diameter of the fluorescent substance-integrated nanoparticles is not particularly limited as long as it is a particle diameter suitable for immunostaining of a pathological specimen. Considering the ease of detection, etc., it is usually 10 to 500 nm, preferably 50 to 200 nm.
  • the coefficient of variation indicating the variation in particle size is usually 20% or less, preferably 5 to 15%.
  • the fluorescent substance integrated nanoparticles satisfying such conditions can be manufactured by adjusting the manufacturing conditions. For example, when producing fluorescent substance-integrated nanoparticles by emulsion polymerization, the particle size can be adjusted by the amount of surfactant to be added. If the amount of the active agent is relatively large, the particle size tends to be small, and if the amount is relatively small, the particle size tends to be large.
  • the particle diameter of the fluorescent substance-integrated nanoparticles is obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the fluorescent substance-integrated nanoparticles, and assuming that the cross-sectional shape is a circle. Further, it can be calculated as the diameter of a circle corresponding to the cross-sectional area.
  • the average particle size and coefficient of variation of a group consisting of a plurality of fluorescent material-integrated nanoparticles are calculated as described above for a sufficient number (for example, 1000) of fluorescent material-integrated nanoparticles, and the average particle size is The coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle diameter / average particle diameter.
  • the labeled body naturally has a reactive site capable of binding to a divalent linking group, or such a site needs to be introduced after the labeled body is produced.
  • the resin constituting the particle itself when using an organic phosphor such as a fluorescent substance-integrated nanoparticle based on a resin as a label, the resin constituting the particle itself must have a reactive site from the beginning. For example, it is necessary to introduce a reactive site by surface modification after the formation of particles.
  • functional groups such as amino groups can be used for melamine resins, and monomers having functional groups (for example, epoxy groups) in the side chain can be copolymerized for acrylic resins, styrene resins, and the like.
  • the functional group itself or a functional group converted from the functional group for example, an amino group generated by reacting aqueous ammonia
  • Another functional group can also be introduced by using it.
  • the surface is modified with a silane coupling agent to introduce a desired functional group.
  • a silane coupling agent for example, if aminopropyltrimethoxysilane is used as a silane coupling agent and reacted with an inorganic phosphor as described above, an amino group can be introduced on the surface.
  • the amino group possessed by the label as described above can react with a predetermined functional group possessed by the compound serving as a divalent linking group, such as an NHS group, to form a covalent bond.
  • a predetermined functional group possessed by the compound serving as a divalent linking group such as an NHS group
  • the reactive site that can be bonded to the divalent linking group of the label is not limited to an amino group, and may be a predetermined group such as a carboxyl group, a thiol group, an NHS group, a maleimide group, or the like.
  • Various known sites (functional groups) having reactivity with functional groups can be used.
  • the divalent linking group for linking the molecular target drug and the label used in the present invention can be selected from various divalent linking groups used in the technical field. It is not particularly limited as long as the effect is achieved.
  • one end (one end different from the above-described group derived from NHS) of the divalent linking group to be bonded to the molecular target drug is bonded to the carbon atom of the nitrogen-containing aromatic ring.
  • the method for forming such a divalent linking group is not particularly limited, and a known reaction mode can be applied.
  • a compound having a functional group that reacts with a carbon atom of a nitrogen-containing aromatic ring to form a covalent bond (first reagent) is reacted with a molecular target drug, and then a reaction product (intermediate) obtained is obtained.
  • a compound (second reagent) having a functional group having reactivity with a functional group different from the functional group of the first reagent and a label binding functional group such as the group derived from NHS described above The mode of making it react is mentioned.
  • Reactions for bonding a divalent linking group to a carbon atom of a nitrogen-containing aromatic ring include, for example, reactions described in J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (35), pp 12994-12997 Can be applied.
  • a sodium salt of sulfinic acid having a difluoroalkyl azide group is used as a reaction reagent, and the sulfinic acid group reacts with a carbon atom of a nitrogen-containing aromatic ring to form a covalent bond.
  • a functional group (a functional group for binding to the labeled body) having reactivity with the functional group of the labeled body in advance at one end of the divalent linking group on the side to be bonded to the labeled body.
  • a label binding functional group include a group (NHS group) derived from N-hydroxysuccinimide, which is used as a carboxylic acid activation reagent in organic chemistry and biochemistry. N-hydroxysuccinimide undergoes dehydration condensation with a carboxylic acid to form an unstable ester bond (active ester), and this active ester reacts with an amine to form an amide bond. Therefore, a label having an amino group at one end of a divalent linking group can be bound by using an NHS group as a label binding functional group.
  • the coupling mode that can be used for coupling to the label at one end of the divalent linking group is not limited to the covalent bond by the reaction between the NHS group and the amino group as described above.
  • a wide variety of bonding modes can be used. For example, while introducing biotin into one end of a divalent linking group, the surface of the labeled body is modified with avidin (streptavidin), and these are bound by a biotin-avidin reaction. May be indirectly bound (via a divalent linking group).
  • the bioassay of the present invention is performed using the labeling agent of the present invention, and its embodiment is not particularly limited.
  • the labeling agent of the present invention is added to cultured cells, the labeling agent is bound to the target molecule expressed there, and the signal emitted from the labeling substance is obtained quantitatively.
  • the signal emitted from the labeling substance is obtained quantitatively.
  • the labeling agent of the present invention is added to a specimen such as blood (serum) and bound to a specific molecule targeted by a molecular target drug or a cell expressing it, and the molecule or cell is qualitative.
  • a specimen such as blood (serum)
  • a specific molecule targeted by a molecular target drug or a cell expressing it and the molecule or cell is qualitative.
  • Such a bioassay is used in the “staining step” and “signal acquisition step” included in the tissue staining method of the present invention described below, and the “staining step for morphology observation” which may be further included as necessary. Accordingly, it can be carried out with appropriate modification in accordance with the subject of cultured cells and specimens instead of tissue sections. Further, if it is not necessary to acquire a photographed image by a digital camera depending on the purpose of the bioassay, it can be modified, for example, to measure fluorescence intensity with a photomultiplier tube (Photomal, PMT).
  • a photomultiplier tube Photomal, PMT
  • tissue staining method of the present invention is performed using the labeling agent of the present invention, and the embodiment thereof is not particularly limited, and includes, for example, the following steps: (1) A step of making a tissue section embedded in paraffin suitable for staining (pretreatment step); (2) a step of staining a target molecule with a labeling agent (staining step); (3) A step of making the stained tissue section suitable for observation (post-processing step); (4) As an optional step, a step of staining so that the morphology of cells or the like can be observed in a bright field (morphological observation staining step); (5) A step of acquiring a signal emitted from the labeled body from the stained tissue section (signal acquisition step). Specifically, these steps are performed by the following procedure, for example.
  • Tissue sections are usually stored in formalin-fixed state and then embedded in paraffin.
  • a pretreatment step for deparaffinization / hydrophilization of the tissue section is performed in order to enable staining.
  • This pretreatment step may include an activation treatment for bringing the protein into a state suitable for the reaction with the molecular target drug, if necessary.
  • the deparaffinization / hydrophilization treatment may be performed, for example, by immersing the tissue section in xylene to remove paraffin, then immersing in ethanol to remove xylene, and further immersing in water to remove ethanol. . These three operations are usually performed at room temperature. Each immersion time may be about 3 to 30 minutes, and each treatment solution may be replaced with a new one during the immersion as necessary.
  • the activation treatment is generally performed by immersing the tissue section in an activation solution and heating it.
  • an activation solution for example, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer, and the like can be used.
  • the heating device for example, an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the heating temperature and time can be, for example, 50 to 130 ° C. and 5 to 30 minutes.
  • the staining step is a step for staining treatment in which a labeling agent is bound to the target molecule.
  • the staining treatment may be performed, for example, by immersing the tissue section after the pretreatment step in a solution (staining solution) containing a labeling agent.
  • the temperature, time, and other conditions for immersing the tissue section in the staining solution can be appropriately adjusted according to the conventional staining method so that an appropriate signal can be obtained.
  • reference information other than the binding property between the target molecule and the molecular target drug used in the labeling agent is acquired together with the processing for staining the target molecule as described above, if necessary.
  • a process of staining other biological material may be performed.
  • two types of staining treatments are performed by immersing the tissue section after the pretreatment step in a solution containing a labeling agent for staining the target molecule and a labeling agent for staining the reference biological material. Can be done in a lump.
  • the tissue section after the staining step is preferably subjected to treatment such as fixation / dehydration, penetration, and encapsulation so as to be suitable for observation.
  • the immobilization / dehydration treatment may be performed by immersing the tissue section in a fixation treatment solution (crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol).
  • a fixation treatment solution crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol
  • a clearing solution xylene or the like
  • the encapsulating process may be performed by immersing the tissue section after the penetration process in the encapsulating liquid.
  • Conditions for performing these treatments for example, the temperature and immersion time when the tissue section is immersed in a predetermined treatment solution, can be appropriately adjusted according to the conventional staining method so as to obtain an appropriate signal. . If a cover glass is placed on the tissue section after the post-processing step, a specimen having a form suitable for form observation and signal acquisition is obtained.
  • the tissue staining method using the labeling agent of the present invention includes a staining step for morphological observation so that the morphology of cells, tissues, organs, etc. can be observed in a bright field as necessary. Can do.
  • the staining process for morphology observation can be performed according to a conventional method.
  • cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, keratinocytes are stained with red to dark red and / or stained with eosin and / or cell nucleus, lime, cartilage tissue, bacteria, mucus Dyeing using hematoxylin, which is stained blue-blue to light blue, is standard, and the method of simultaneously performing these two stainings is well known as hematoxylin-eosin staining (HE staining).
  • HE staining hematoxylin-eosin stain staining
  • the observation / imaging process is a process of acquiring a signal emitted from the labeled body from a tissue section that has undergone the staining process as described above (and the morphological observation staining process performed as necessary).
  • a stained tissue section is observed with a fluorescence microscope at a desired magnification while irradiating excitation light corresponding to the phosphor, and the fluorescence microscope is provided. What is necessary is just to image
  • fluorescent substance integrated nanoparticles preferable as a phosphor when used, it is easy to observe the fluorescent substance integrated nanoparticles that label the molecular target drug bound to the target molecule as a bright spot, not only measuring the fluorescence intensity but also The score can be measured.
  • the signal acquisition process is performed to acquire the signal emitted by the label contained in the labeling agent that stained the target molecule. Also good.
  • the morphological observation staining step as described above is performed as an optional step, the tissue section stained for morphological observation is observed in the bright field before or after the signal acquisition step, and a stained image is taken. Processing may be performed.
  • the acquired photographed image can be used for quantifying the signal emitted by the label according to the purpose of tissue staining.
  • the intensity of fluorescence emitted from the phosphor can be measured and / or the number of fluorescent bright spots can be measured based on image processing.
  • Examples of software that can be used for image processing include “ImageJ” (open source).
  • image processing software By using such image processing software, bright spots with a predetermined wavelength (color) are extracted from the stained image and the sum of the brightness is calculated, or the number of bright spots with a predetermined brightness or higher is measured. Can be performed semi-automatically and quickly.
  • the obtained quantitative signal data can be used to improve the molecular target drug by evaluating the binding power to the target molecule by comparing the data of labeling agents using different molecular target drug candidates, for example. is there.
  • the target molecule contained therein is quantified. It is also possible to estimate the effect of the molecular target drug and to obtain useful information for pathological diagnosis, such as presuming that it is high.
  • Patent Document 3 a desired substance ( ⁇ -polylysine) is bound using a sorafenib derivative in which a 2-hydroxyethylcarboxamide group is introduced into a pyridine ring, but this time, 2-hydroxyethyl is bound to a benzene ring.
  • An axitinib derivative into which a carboxamide group was introduced was used.
  • Example 1 The slide (USBiomax, Inc., T071) in which spots of renal cell carcinoma tissue sections were arranged on the array was deparaffinized and hydrophilized, and then the labeling agent Z was added onto the tissue. After standing for 2 hours, unreacted labeling agent was removed by washing, and a fluorescent image of the slide was taken using a confocal fluorescence microscope, and the fluorescence intensity was measured.
  • a fluorescence microscope “BX-53” (Olympus Co., Ltd.) was used for excitation light irradiation and fluorescence emission observation in this step, and an immunostained image (400 ⁇ ) was attached to the fluorescence microscope.
  • a digital camera for microscope “DP73” (Olympus Corporation) was used.
  • the wavelength of the excitation light to be irradiated is set to 415 to 455 nm using an optical filter for excitation light (Optline Co., Ltd. “QD655-C”), and the fluorescence of the observed fluorescence The wavelength was set to 648 to 663 nm using a fluorescent optical filter.
  • the intensity of the excitation light at the time of observation and image photographing with a fluorescence microscope was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 30 W / cm 2 .
  • the exposure time at the time of image capturing was adjusted to 400 seconds so that the brightness of the image was not saturated.
  • the fluorescence intensity was measured by processing a photographed image using image processing software “ImageJ” (open source). A region where the luminance of the fluorescence emitted from the phosphor is not less than a predetermined value was extracted, and the sum of the intensities of the fluorescence constituting the region was obtained.
  • ImageJ open source
  • Example 1 The results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in the following table.
  • the stained renal cell carcinoma tissue section is stained more than when the labeling agent (labeling agent Y) based on the conventional binding mode is used. It can be seen that the fluorescence intensity of is strong.
  • the axitinib used in the labeling agent of the present invention whereas axitinib used in the conventional labeling agent is likely to interfere with the binding to the target molecule (such as VEGFR) by Qdot linked as a fluorescent substance. Is less susceptible to interference by Qdot linked as a phosphor, and is presumed to be able to bind strongly to a target molecule (eg, VEGFR).

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Abstract

　本発明は、含窒素芳香環含有化合物に係るバイオアッセイや組織染色法において、標的分子に対する結合性に優れた標識剤を提供することを課題とする。　本発明に係る標識剤は、窒素原子を含む芳香環を有する化合物である分子標的薬と、標識体とが、２価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、前記２価の連結基の一端が前記窒素原子を含む芳香環の炭素原子に結合していることを特徴とする。前記標識体としては蛍光物質集積ナノ粒子が好ましく、前記窒素原子を含む芳香環としてはピリジン環が好ましい。

Description

分子標的薬を含有する標識剤
　本発明は、組織中の特定の生体物質（標的分子）に対する分子標的薬の結合量の測定などに用いることのできる標識剤、詳しくは、窒素原子を含む芳香環を有する化合物である分子標的薬およびそれに連結した標識体からなる標識剤に関する。
　分子標的薬は、特定の疾患の原因を遺伝子やタンパク質を解明し、それらの異常な発現やシグナル伝達などに関与している生体物質に分子レベルで作用することで疾患を治療する医薬品である。近年では、がんや自己免疫疾患などに対して、いくつかの低分子化合物または抗体が分子標的薬として実用化されている。
　このような分子標的薬の創薬において、特定の生体物質（標的分子）に対する薬剤の結合量を測定することは、候補薬のスクリーニングなどにつながるため重要である。そのために、放射線同位体、特定の基質と反応して発色する酵素、蛍光体などの標識体を候補薬に連結し、その候補薬を標的分子と結合させ、その標識体に由来するシグナルによって結合量を測定する手法が用いられている。
　たとえば特許文献１（国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号パンフレット）には、抗体医薬に用いられている抗体（トラスツズマブ等）を標識化して、当該抗体医薬が標的とする抗原（ＨＥＲ２等）に結合させる免疫組織染色法が記載されており、この抗体を標識化するための標識体として量子ドットや蛍光物質集積ナノ粒子（有機蛍光色素集積シリカナノ粒子等）を用いることができること、この免疫組織染色法が抗体医薬の有効性を判定する方法に応用することができることなども記載されている。免疫染色のための標識体として蛍光物質集積ナノ粒子を用いることは、量子ドットや従来の酵素による発色剤を用いることに比べて、高精度の定量が可能であるため好ましい。
　一方、抗体ではなく低分子化合物も従来、様々な疾患に対する分子標的薬として利用されており、治療用の医薬品の有効成分としてのみならず、試料中の標的分子を検出するアッセイに用いられる診断用のコンジュゲートを作製する際などにも利用されている。たとえば、特許文献２（特表２００７－５２１３３８号公報）には、所定の２価のリンカー分子の末端に、結合剤、標識化合物（有機蛍光色素等）、治療薬（キナーゼ阻害剤等）といった生物薬剤または生物分析の用途における有益な成分が結合した構造を有する化合物が記載されており、前記キナーゼ阻害剤としては、窒素原子を含む芳香環を有する化合物（以下「含窒素芳香環含有化合物」と称する。）、たとえばソラフェニブ（段落［００７０］の表中、化合物番号ＶＩ参照）が挙げられている。
　しかしながら、特許文献２には、窒素原子を含む芳香環（含窒素芳香環）を有する化合物のリンカー分子に結合させる部位として、（ｉ）前記化合物の端部に含窒素芳香環が位置する場合はその含窒素芳香環の窒素原子またはその含窒素芳香環に直接的または間接的に結合している窒素原子を含む官能基（アミノ基、アミド基、カルバモイル基等）の窒素原子を選択することや、（ｉｉ）前記化合物の末端にヘテロ原子を含まない芳香環が位置する場合はその芳香環の炭素原子を選択したりする実施形態は開示されているものの、（ｉｉｉ）前記化合物の末端に含窒素芳香環が位置する場合にその含窒素芳香環の炭素原子を選択することやその技術的意義は開示されていない。たとえばソラフェニブについて、特許文献２には、端部の含窒素芳香環（ピリジル基）に結合しているカルバモイル基の窒素原子に、２価のリンカー分子を結合させることが一般記載において示唆されているのみであり、しかも実施例等では、上記のようにソラフェニブに２価のリンカー分子を結合させる実施形態は具体的に開示されていない。
　なお、特許文献３（特表２０１２－５３３５７９号公報）には、腎臓へのターゲティングを目的とする発明として、カルボキシル基を担持する化合物とε－リシンモノマー単位から構成される所定のオリゴマーとを含み、さらに活性化合物が共有結合していてもよい接合体が記載されており、前記活性化合物としてはソラフェニブ等のプロテインキナーゼ阻害剤が挙げられている。たとえば、例８（段落［０１８１］～［０１８９］）には、前記カルボキシル基を担持する化合物としてのＤＯＴＡ、ε－ポリリシン、および前記活性化合物としてのソラフェニブ誘導体を含む接合体（ＤＯＴＡ－ε－ポリリシン－ソラフェニブ誘導体）を作製したことが開示されている。この例８の作製方法で得られる接合体において、ε－ポリリシンは、ソラフェニブ誘導体の末端に導入されているヒドロキシエチル基（ピリジル基に結合しているカルバモイル基の窒素原子に結合しているもの）に結合している。
国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号パンフレット 特表２００７－５２１３３８号公報 特表２０１２－５３３５７９号公報
　低分子化合物の分子標的薬には、腎細胞がんを対象とするアキシチニブのように、窒素原子を含む芳香環を有する化合物が多い。しかしながら、そのような含窒素芳香環含有化合物に関するバイオアッセイにおいて、従来の作製方法で得られる、含窒素芳香環の窒素原子またはその含窒素芳香環に直接的または間接的に結合している窒素原子を含む官能基の窒素原子を介して標識体が結合されている標識剤を用いた場合、その標識体に由来するシグナルが弱いという問題があった。特に、標識体として蛍光物質集積ナノ粒子を用いた場合、標的分子への結合を表す蛍光強度が弱い、ないし輝点数が少なく、分子標的薬の結合性の評価が困難であった。
　本発明は、含窒素芳香環含有化合物に係るバイオアッセイや組織染色法において、標的分子に対する結合性に優れた標識剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、従来と異なり、含窒素芳香環含有化合物の含窒素芳香環の炭素原子を介して標識体が結合されている標識剤を用いた場合、従来よりも標識体に由来するシグナルが強くなる、特に標的分子への結合を表す蛍光強度が強くなる、ないし輝点数が多くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、一つの側面において、窒素原子を含む芳香環を有する化合物である分子標的薬と、標識体とが、２価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、
　前記２価の連結基の一端が前記窒素原子を含む芳香環の炭素原子に結合していることを特徴とする標識剤を提供する。
　また、本発明はもう一つの側面において、前記標識剤を使用することを特徴とするバイオアッセイを提供する。
　本発明はさらなる側面において、前記標識剤を使用することを特徴とする組織染色法を提供する。
　本発明の標識剤は、分子標的薬として利用する含窒素芳香環含有化合物の標的分子に対する結合性が従来の標識剤よりも向上しているため、その分子標的薬（の候補化合物）の効果をより正確に評価したり、患者由来の組織切片（病理標本）中に存在する標的分子をより正確に定量して分子標的薬の効果をより正確に見積もったりすることができるようになる。
　―免疫染色剤―
　本発明における標識剤は、分子標的薬としての含窒素芳香環含有化合物と、標識体とが、２価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、前記２価の連結基の一端が含窒素芳香環の炭素原子に結合しているものである。
　（分子標的薬）
　本発明に用いられる分子標的薬は、当該技術分野において用いられる含窒素芳香環含有化合物の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。なお、本発明における含窒素芳香環含有化合物は一般的に、分子標的薬のうち、抗体医薬ではなく低分子医薬に属する化合物を指す。また、本発明における分子標的薬は、標的分子に対して結合するないし相互作用する能力を多少なりとも有している、ないし有している可能性があればよく、実用化されている分子標的薬のみならず、実用化できる分子標的薬を選抜するための候補化合物、たとえば実用化されている分子標的薬の誘導体をも包含している。
　「含窒素芳香環」としては、たとえば、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール（五員環の単環式化合物）；ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン、テトラジン（六員環の単環式化合物）：ジアゼピン（七員環の単環式化合物）：インドール、イソインドール、ベンゾイミダゾール、プリン（五員環＋六員環の二環式化合物）；キノリン、イソキノリン（六員環＋六員環の二環式化合物）などの、窒素原子を含む芳香族性の環状化合物に由来するものが挙げられる。また、含窒素芳香環は、窒素原子に加えて酸素原子、硫黄原子などのヘテロ原子を含む芳香族性の環状化合物、たとえば窒素原子および酸素原子を含むオキサゾール、ベンゾオキサゾールや、窒素原子および硫黄原子を含むチアゾール、ベンゾチアゾールなどに由来するものであってもよい。これらの含窒素芳香環は、適切な部位の炭素原子またはヘテロ原子に、ハロゲン原子、（炭素原子数１～４程度の）低級アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基などの置換基を有していてもよい。
　含窒素芳香環は、化合物の分子構造の末端に位置していてもよいし、途中に位置していてもよい。また、含窒素芳香環は、化合物の一分子中に複数含まれていてもよい。
　公知の分子標的薬のうち、含窒素芳香環含有化合物としては、たとえばアキシチニブ（下記式参照）が挙げられる。また、本発明では、分子標的薬としてアキシチニブの誘導体を用いることもできる。アキシチニブ誘導体には、アキシチニブに対して官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなど、母体構造を大幅に変えない程度の（特に２価の連結基の一端が窒素原子を含む芳香環（ピリジン環）の炭素原子に結合することを妨げないように）改変がなされた化合物であって、アキシチニブと同程度またはそれよりも優れた分子標的薬としての作用を有する様々な化合物が包含される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　（標識体）
　本発明に用いられる標識体は、当該技術分野において用いられる各種の標識体の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。代表的な標識体としては、放射線同位体、特定の基質と反応して発色する酵素、蛍光体などが挙げられるが、シグナルとして蛍光強度または輝点数を測定することができるため定量性に優れ、標的分子に対する分子標的薬の結合性を正確に評価することのできる蛍光体が好ましい。
　蛍光体は、当該技術分野において用いられている公知の各種の蛍光体の中から選択することができ、特に限定されるものではない。代表的な蛍光体としては、無機半導体ナノ粒子（「量子ドット」とも呼ばれる）、有機蛍光色素、およびこれらの蛍光物質のナノサイズの集積体が挙げられるが、標的分子を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発することができ、比較的安価な低感度型カメラでも検出することが可能である蛍光物質集積ナノ粒子、特に蛍光色素内包樹脂粒子が好ましい。
　なお、本明細書における「蛍光体」は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する、つまり「蛍光」を発する物質であって、「プローブ」と結合させることのできるものを指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。
　・無機半導体ナノ粒子
　無機半導体ナノ粒子としては、II－VI族化合物、III－V族化合物、またはIV族元素を含有するもの、たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。また、これらの無機半導体ナノ粒子をコアとし、その外側にシェルが形成されたもの、たとえば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳなどのコア／シェル型無機半導体ナノ粒子を用いることもできる。
　・有機蛍光色素
　有機蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
　・蛍光物質集積ナノ粒子
　蛍光物質の集積体の代表例として、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である「蛍光物質集積ナノ粒子」が挙げられる。この場合、母体（たとえば樹脂）と蛍光物質（たとえば有機蛍光色素）は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
　蛍光物質集積ナノ粒子に内包させる蛍光物質としては、上述したような無機半導体ナノ粒子、蛍光色素分子のほか、たとえば、Ｙ2Ｏ3、Ｚｎ2ＳｉＯ4等を母体とし、Ｍｎ2+，Ｅｕ3+等を賦活剤とする「長残光蛍光体」を挙げることができる。
　蛍光物質集積ナノ粒子を形作る母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができ、無機物としてはシリカ（ガラス）を例示することができる。
　蛍光物質集積ナノ粒子は、公知の方法（たとえば特開２０１３－５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。より具体的には、たとえば、シリカを母体とし、その中に蛍光物質が内包されている蛍光物質内包シリカ粒子は、無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質と、テトラエトキシシランのようなシリカ前駆体とが溶解している溶液を、エタノールおよびアンモニアが溶解している溶液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。一方、樹脂を母体とし、蛍光物質を樹脂粒子の表面に吸着させるか、樹脂粒子中に内包させるかした蛍光物質内包樹脂粒子は、それらの樹脂の溶液ないし微粒子の分散液を先に用意しておき、そこに無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質を添加して撹拌することにより作製することができる。
　あるいは、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を進行させることにより、蛍光物質内包樹脂粒子を作製することもできる。たとえば、母体となる樹脂としてメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー、たとえばメラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミン）と、有機蛍光色素と、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤（酸など）とを含有する反応混合物を加熱し、乳化重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。また、母体となる樹脂としてスチレン系共重合体のような熱可塑性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料と、有機蛍光色素と（樹脂の原料モノマーとして、あらかじめ有機蛍光色素を共有結合などで結合させたモノマーを用いるようにしてもよい）、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）を含有する反応混合物を加熱し、ラジカル重合法またはイオン重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。
　蛍光物質集積ナノ粒子（特に上記のような製造方法によって得られる蛍光色素内包樹脂粒子）の平均粒径は、病理標本の免疫染色に適した粒径であれば特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、通常は１０～５００ｎｍ、好ましくは５０～２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数は、通常は２０％以下であり、好ましくは５～１５％である。このような条件を満たす蛍光物質集積ナノ粒子は、製造条件を調整することにより製造することができる。たとえば、乳化重合法により蛍光物質集積ナノ粒子を作製する場合は、添加する界面活性剤の量によって粒径を調節することができ、一般的に、蛍光物質集積ナノ粒子の母体原料の量に対する界面活性剤の量が相対的に多ければ粒径は小さくなり、その量が相対的に少なければ粒径は大きくなる傾向にある。
　なお、蛍光物質集積ナノ粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影して蛍光物質集積ナノ粒子の断面積を計測し、その断面形状を円と仮定したときに、その断面積に相当する円の直径として算出することができる。複数の蛍光物質集積ナノ粒子からなる集団の平均粒径および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光物質集積ナノ粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径により算出される。
　・反応性部位（官能基）
　標識体は、２価の連結基と結合することのできる反応性の部位を自ずと備えているか、そうでなければそのような部位を標識体の作製後に導入しておく必要がある。
　たとえば、標識体として樹脂を母体とする蛍光物質集積ナノ粒子のような有機系の蛍光体を用いる場合、その粒子を構成する樹脂自体が当初から反応性の部位を有しているか、そうでなければ粒子の形成後に表面修飾により反応性の部位を導入しておく必要がある。具体的には、メラミン樹脂であればアミノ基等の官能基を利用することができるし、アクリル樹脂、スチレン樹脂等であれば、側鎖に官能基（たとえばエポキシ基）を有するモノマーを共重合させることにより、その官能基自体またはその官能基から変換された官能基（たとえばアンモニア水を反応させることにより生成するアミノ基）を利用することができるし、さらにはそれらの官能基との反応を利用して別の官能基を導入することもできる。
　また、標識体としてシリカを母体とする蛍光物質集積ナノ粒子や無機半導体ナノ粒子のような無機系の蛍光体を用いる場合、それらをシランカップリング剤で表面修飾することにより所望の官能基を導入することができる。たとえば、シランカップリング剤としてアミノプロピルトリメトキシシランを用いて、上述したような無機系の蛍光体と反応させれば、その表面にアミノ基を導入することができる。
　上述したような標識体が有するアミノ基は、２価の連結基の基となる化合物が有する所定の官能基、たとえばＮＨＳ基と反応し、共有結合を形成することができる。しかしながら、標識体が有する、２価の連結基と結合することのできる反応性の部位はアミノ基に限定されるものではなく、たとえばカルボキシル基、チオール基、あるいはＮＨＳ基、マレイミド基など、所定の官能基との反応性を有する公知の様々な部位（官能基）を利用することができる。
　（２価の連結基）
　本発明に用いられる、分子標的薬と標識体とを連結するための２価の連結基は、当該技術分野において用いられる各種の２価の連結基の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。
　本発明では、２価の連結基における、分子標的薬と結合させる側の一端（上述したＮＨＳに由来する基とは異なる一端）は、含窒素芳香環の炭素原子に結合している。そのような２価の連結基を形成するための手法は特に限定されるものではなく、公知の反応様式を応用することができる。たとえば、含窒素芳香環の炭素原子と反応して共有結合を形成する官能基を有する化合物（第１試薬）を分子標的薬に反応させて、つづいて得られた反応物（中間体）に、第１試薬が有する前記官能基とは別の官能基との反応性を有する官能基と、前述したＮＨＳに由来する基のような標識体結合用官能基とを有する化合物（第２試薬）を反応させる様式が挙げられる。
　含窒素芳香環の炭素原子に２価の連結基を結合させるための反応には、たとえば、J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (35), pp 12994－12997に記載されている反応を応用することができる。その反応では、ジフルオロアルキルアジド基を有するスルフィン酸のナトリウム塩を反応試薬として用い、そのスルフィン酸基が含窒素芳香環の炭素原子と反応して共有結合を形成する。また、アジド基はアルキン（炭素－炭素三重結合）と反応して環付加するので、炭素－炭素三重結合を有する標識体、または２価の連結基の一部（前記反応試薬に由来するところ以外の部分）を構成するための炭素－炭素三重結合を有する別の反応試薬を結合させることができる。
　２価の連結基における、標識体と結合させる側の一端には、予め標識体が有する官能基との反応性を有する官能基（標識体結合用官能基）を導入しておくことが好適である。そのような標識体結合用官能基としては、たとえば、有機化学や生化学においてカルボン酸の活性化試薬として用いられているＮ－ヒドロキシスクシンイミドに由来する基（ＮＨＳ基）が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドはカルボン酸と脱水縮合することで不安定なエステル結合（活性エステル）を形成し、この活性エステルはアミンと反応してアミド結合を形成する。したがって、標識体結合用官能基としてＮＨＳ基を利用することにより、２価の連結基の一端にアミノ基を有する標識体を結合させることができる。
　もちろん、２価の連結基の一端における標識体との連結のために利用することのできる結合様式は、上述したようなＮＨＳ基とアミノ基との反応による共有結合に限定されるものではなく、本発明の作用効果が奏される限り、多種多様な結合様式を利用することができる。たとえば、２価の連結基の一端にビオチンを導入する一方、標識体の表面をアビジン（ストレプトアビジン）で修飾しておき、ビオチン・アビジン反応によりそれらを結合させることで、分子標的薬と標識体とを（２価の連結基も介して）間接的に結合させるようにしてもよい。
　－バイオアッセイ－
　本発明のバイオアッセイは、本発明の標識剤を使用して行われるものであり、その実施形態は特に限定されるものではない。たとえば、培養細胞に本発明の標識剤を添加し、そこで発現している標的分子に標識剤を結合させて、その標識体が発するシグナルを定量的に取得するというバイオアッセイが挙げられる。異なる分子標的薬の候補（たとえばアキシチニブ誘導体）を用いた標識剤同士のデータを比較することで標的分子への結合力を評価し、分子標的薬の改良に役立てるといった利用が可能である。あるいは、血液（血清）等の検体に本発明の標識剤を添加し、分子標的薬が対象とする特定の分子またはそれを発現している細胞と結合させて、それらの分子または細胞について定性的または定量的な分析を行うという利用も可能である。
　このようなバイオアッセイは、次に述べる本発明の組織染色法に含まれる「染色工程」および「シグナル取得工程」や、必要に応じてさらに含まれていてもよい「形態観察用染色工程」に準じて、組織切片の代わりに培養細胞や検体を対象とすることにあわせて適宜改変しながら行うことができる。また、バイオアッセイの目的によって、デジタルカメラによる撮影像を取得する必要がなければ、たとえば光電子倍増管（フォトマル、ＰＭＴ）によって蛍光強度を測定するといったように改変することも可能である。
　－組織染色法－
　本発明の組織染色法は、本発明の標識剤を使用して行われるものであり、その実施形態は特に限定されるものではないが、たとえば以下のような工程を含む：
　（１）パラフィンに包埋された組織切片を染色に適した状態にする工程（前処理工程）；
　（２）標的分子を標識剤で染色する工程（染色工程）；
　（３）染色された組織切片を観察に適した状態にする工程（後処理工程）；
　（４）任意工程として、明視野において細胞等の形態を観察できるよう染色する工程（形態観察用染色工程）；
　（５）染色された組織切片から標識体が発するシグナルを取得する工程（シグナル取得工程）。
　これらの工程は、具体的には、たとえば次のような手順で行われる。
　（前処理工程）
　組織切片は通常、ホルマリンで固定された後、パラフィンに包埋された状態で保存されていることが多い。そのような組織切片を染色する場合、染色を可能にするため、組織切片の脱パラフィン・親水化処理のための前処理工程が行われる。この前処理工程には必要に応じて、タンパク質を分子標的薬との反応に適した状態にするための賦活化処理を含んでいてもよい。
　脱パラフィン・親水化処理は、たとえば、組織切片をキシレンに浸漬してパラフィンを除去し、次いでエタノールに浸漬してキシレンを除去し、さらに水に浸漬してエタノールを除去するようにして行えばよい。これら３つの操作は、通常、室温で行えばよい。また、それぞれの浸漬時間は３～３０分程度でよく、必要に応じて浸漬途中でそれぞれの処理液を新しいものに交換してもよい。
　賦活化処理は一般的に、組織切片を賦活化液に浸漬し、加熱するようにして行われる。賦活化液としては、たとえば、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器としては、たとえば、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。加熱の温度および時間は、たとえば、５０～１３０℃、５～３０分とすることができる。
　（染色工程）
　染色工程は、標的分子に標識剤を結合させる染色処理のための工程である。染色処理は、たとえば、前処理工程を終えた組織切片を、標識剤を含む溶液（染色液）に浸漬するようにして行えばよい。染色液に組織切片を浸漬する際の温度、時間、その他の条件は、従来の染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　なお、染色工程では必要に応じて、上述したような標的分子を染色する処理とともに、標的分子と標識剤に用いられている分子標的薬との結合性以外の、参照用の情報を取得するなどの目的のために、他の生体物質（参照生体物質）を染色する処理を行ってもよい。その場合、標的分子を染色するための標識剤と、参照生体物質を染色するための標識剤とを含む溶液に、前処理工程を終えた組織切片を浸漬することで、２種類の染色処理を一括して行うことができる。
　（後処理工程）
　染色工程を終えた組織切片は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。固定化・脱水処理は、組織切片を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた組織切片を透徹液（キシレン等）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織切片を封入液に浸漬すればよい。これらの処理を行う上での条件、たとえば組織切片を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。後処理工程を終えた組織切片にカバーガラスを載せれば、形態観察やシグナル取得に適した形態の標本となる。
　（任意工程：形態観察用染色工程）
　本発明の標識剤を用いた組織染色法には、必要に応じて、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察用染色工程を含めることができる。形態観察用染色工程は、常法に従って行うことができる。組織切片の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色されるエオジンを用いた染色および／または細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色されるヘマトキシリンを用いた染色が標準的に行われており、これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）としてよく知られている。形態観察染色工程を含める場合は、前述した染色工程の後に行うようにしてもよいし、その前に行うようにしてもよい。
　（シグナル取得工程）
　観察・撮影工程は、上述したような染色工程（および必要に応じて行われる形態観察用染色工程）を経た組織切片から、標識体が発するシグナルを取得する工程である。たとえば、本発明における標識体として好ましい蛍光体を用いた場合、その蛍光体に対応した励起光を照射しながら、染色された組織切片を所望の倍率の蛍光顕微鏡で観察し、その蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラを用いて、蛍光強度または輝点数を取得することのできる染色像を撮影すればよい。特に、蛍光体として好ましい蛍光物質集積ナノ粒子を用いた場合、標的分子に結合した分子標的薬を標識する蛍光物質集積ナノ粒子を輝点として観測しやすく、蛍光強度を測定するのみならず、輝点数を計測することができる。
　なお、染色工程において前述したような参照生体物質を染色する処理を行った場合には、シグナル取得工程においてその標的分子を染色した標識剤に含まれる標識体が発するシグナルを取得する処理を行ってもよい。また、任意工程として前述したような形態観察用染色工程を行った場合には、シグナル取得工程の前または後に、明視野において形態観察用に染色された組織切片を観察し、染色像を撮影する処理を行ってもよい。
　取得した撮影像は、組織染色の目的に応じて、標識体が発するシグナルを定量するために用いることができる。たとえば、本発明における標識体として好ましい蛍光体を用いた場合、画像処理に基づき、その蛍光体が発する蛍光の強度を測定する、および／または蛍光の輝点数を計測することができる。
　画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和を算出したり、所定の輝度以上の輝点の数を計測したりする処理を、半自動的に、迅速に行うことができる。
　取得したシグナルの定量データは、たとえば異なる分子標的薬の候補を用いた標識剤同士のデータを比較することで標的分子への結合力を評価し、分子標的薬の改良に役立てるといった利用が可能である。また、分子標的薬が対象とする疾患の患者に由来する組織切片（病理標本）のデータから、そこに含まれる標的分子を定量し、標的分子の発現量が多ければ分子標的薬の有効性が高いと推定するといったように、分子標的薬の効果を見積もり、病理診断のために有用な情報を取得するために利用することも可能である。
　［標識剤Ｚ］アキシチニブのピリジン環の炭素原子に２価連結基を介して量子ドット：Qdot（登録商標）655を結合させた、アキシチニブ含有標識剤
　（合成工程Ｚ－１）アキシチニブ（１）のピリジン環の炭素原子に２価連結基を結合させたアキシチニブ誘導体（１ｂ）を下記のルートで合成した。得られた誘導体は位置異性体の混合物であり、この混合物を次の合成工程に用いた。なお、合成工程Ｚ－１のルートはJ. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (35), pp 12994－12997に記載された手法に基づいている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　（合成工程Ｚ－２）アキシチニブ誘導体(1)を、末端にアミノ基を有するＰＥＧで修飾された量子ドット（Qdot 655 ITK amino (PEG) quantum dots）と反応させることにより、アキシチニブのピリジン環の炭素原子に結合した二価連結基を介してQdotが連結されている標識剤Ｚを得た。
　［標識剤Ｙ］アキシチニブのベンゼン環のアミド基の窒素原子に２価連結基を介して量子ドット：Qdot（登録商標）655を結合させた、アキシチニブ含有標識剤
　（合成工程Ｙ－１）アキシチニブのアミド基（カルバモイル基）の窒素原子に２価連結基を結合させたアキシチニブ誘導体（６）を、特許文献３（特表２０１２－５３３５７９号公報）の段落［０１８１］～［０１８９］に記載されたソラフェニブ誘導体に関する手法を参考にして合成した。特許文献３の記載では、ピリジン環に２－ヒドロキシエチルカルボキサミド基が導入されたソラフェニブ誘導体を利用して所望の物質（ε－ポリリシン）を結合させているが、今回はベンゼン環に２－ヒドロキシエチルカルボキサミド基が導入されたアキシチニブ誘導体を利用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　（合成工程Ｙ－２）アキシチニブ誘導体（６）を、末端にアミノ基を有するＰＥＧで修飾された量子ドット（Qdot 655 ITK amino (PEG) quantum dots）と反応させることにより、アキシチニブのアミド基の窒素原子に結合した二価連結基を介してQdotが連結されている標識剤Ｙを得た。
　［実施例１］
　腎細胞がん組織切片のスポットがアレイ上に配列したスライド（USBiomax, Inc., T071）について、脱パラフィンおよび親水化処理を行った後、標識剤Ｚを組織上に添加した。２時間放置後、未反応の標識剤を洗浄により除去し、そのスライドの蛍光像を共焦点型蛍光顕微鏡を用いて撮影し、蛍光強度を計測した。
　なお、この工程における励起光の照射および蛍光の発光の観察には蛍光顕微鏡「ＢＸ－５３」（オリンパス株式会社）を用い、免疫染色像（４００倍）の撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ７３」（オリンパス株式会社）を用いた。蛍光体として用いたQdot 655に対応させて、照射する励起光の波長は、励起光用光学フィルター（株式会社オプトライン「ＱＤ６５５－Ｃ」）を用いて４１５～４５５ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６４８～６６３ｎｍに設定した。蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが３０Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、４００秒に設定した。
　また、蛍光強度の計測は、画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いて撮影画像を処理することで行った。蛍光体が発する蛍光の輝度が所定の値以上の領域を抽出し、その領域を構成する蛍光の強度の総和を求めた。
　［比較例１］
　標識剤Ｚの代わりに標識剤Ｙを用いた他は実施例１と同様の操作を行い、蛍光強度を計測した。
　［結果］
　実施例１および比較例１の結果を下記表に示す。本発明の結合様式に基づく標識剤（標識剤Ｚ）を用いて染色した場合、従来の結合様式に基づく標識剤（標識剤Ｙ）を用いた場合よりも、染色された腎細胞がん組織切片の蛍光強度が強いことが分かる。この結果から、従来の標識剤に用いられているアキシチニブは蛍光体として連結されたQdotによって標的分子（ＶＥＧＦＲ等）に対する結合が妨害されやすいのに対し、本発明の標識剤に用いられているアキシチニブは蛍光体として連結されたQdotの妨害を受けにくく、標的分子（ＶＥＧＦＲ等）に対して強く結合することができるものと推定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (5)

  1. 　窒素原子を含む芳香環を有する化合物である分子標的薬と、標識体とが、２価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、
    　前記２価の連結基の一端が前記窒素原子を含む芳香環の炭素原子に結合していることを特徴とする標識剤。
  2. 　前記標識体が蛍光物質集積ナノ粒子である、請求項１に記載の標識剤。
  3. 　前記窒素原子を含む芳香環がピリジン環である、請求項１または２に記載の標識剤。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の標識剤を使用することを特徴とするバイオアッセイ。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の標識剤を使用することを特徴とする組織染色法。
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