[go: up one dir, main page]

WO2021230134A1 - 画像形成方法 - Google Patents

画像形成方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021230134A1
WO2021230134A1 PCT/JP2021/017385 JP2021017385W WO2021230134A1 WO 2021230134 A1 WO2021230134 A1 WO 2021230134A1 JP 2021017385 W JP2021017385 W JP 2021017385W WO 2021230134 A1 WO2021230134 A1 WO 2021230134A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescent
substance
fluorescence
tissue
image
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/017385
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
武寿 磯田
愛奈 安藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2022521860A priority Critical patent/JPWO2021230134A1/ja
Publication of WO2021230134A1 publication Critical patent/WO2021230134A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to an image forming method, and more particularly to an image forming method capable of observing a fluorescent color derived from a target substance conspicuously, reducing noise fluorescence such as autofluorescence, and accurately measuring a fluorescence signal.
  • a specific target substance for example, a substance overexpressed in a specific cell or a substance specifically expressed in a specific cell
  • a fluorescent signal is extracted from a fluorescent image obtained by imaging a tissue specimen labeled with a specific target substance using fluorescent nanoparticles containing a large number of fluorescent dyes (fluorescent luminescent substances), and the specific target substance in the fluorescent image is used.
  • the fluorescence brightness derived from the fluorescent nanoparticles that label the target substance is signaled (S), and the brightness of the noise fluorescence derived from a substance other than the fluorescent nanoparticles is measured. If the S / N ratio in the case of noise (N) is low, there is a high possibility that even noise fluorescence will be included in the fluorescence derived from fluorescent nanoparticles, which may cause an error, and thus quantitative analysis is also difficult. there were.
  • Patent Document 1 a technique for improving the fluorescence intensity of a target fluorescent label by labeling with an aminocoumarin compound having a specific structure as a green dye is disclosed (for example).
  • noise fluorescence such as autofluorescence is often detected in green, and the fluorescence signal cannot be measured correctly, so that the red dye is preferable.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and the solution thereof is that the fluorescence color of the target substance can be observed conspicuously, noise fluorescence such as autofluorescence is reduced, and the fluorescence signal is accurately measured. It is to provide an image forming method which can be done.
  • the present inventor identifies the excitation light in the tissue sample by utilizing the fact that the timing of the fading of the autofluorescence and the fading of the fluorescent luminescent substance are different in the process of examining the cause of the above problem.
  • An image forming method using a fluorescent substance which is an image forming method.
  • a tissue sample in which the target substance contained in the tissue section is stained with the fluorescent substance is irradiated with excitation light for at least 5 seconds, and at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent substance is forcibly faded.
  • An image forming method comprising a step of obtaining a forced fading fluorescent image obtained by forcibly fading at least a part of noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent light emitting substance.
  • the image forming method according to item 1 further comprising a step of adding an autofluorescence inhibitor that suppresses autofluorescence generated from the tissue section when preparing the tissue specimen before the step of acquiring the forced fading fluorescence image. ..
  • the present invention it is possible to provide an image forming method capable of observing the fluorescence color of a target substance conspicuously, reducing noise fluorescence such as autofluorescence, and accurately measuring a fluorescence signal.
  • the mechanism of expression or the mechanism of action of the effect of the present invention has not been clarified, it is inferred as follows.
  • a tissue specimen in which the target substance is stained with a fluorescent substance is irradiated with excitation light for at least 5 seconds to forcibly fade at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent substance, or the fluorescent substance.
  • Noise emitted from a substance different from that of The fluorescent color stands out, and the fluorescence intensity of the fluorescent substance is relatively improved. As a result, the fluorescence signal can be accurately measured.
  • the image forming method of the present invention is an image forming method using a fluorescent luminescent substance, and an excitation light is applied to a tissue sample in which the target substance contained in the tissue section is stained with the fluorescent luminescent substance for at least 5 seconds.
  • the forced fading obtained by forcibly fading at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent substance or forcibly fading at least a part of the noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent substance by the above irradiation. It has a step of acquiring a faded fluorescence image.
  • This feature is a technical feature common to or corresponding to each of the following embodiments.
  • the present invention there is a step of adding an autofluorescence inhibitor that suppresses autofluorescence generated from the tissue section when preparing the tissue specimen before the step of acquiring the forced fading fluorescence image.
  • an autofluorescence inhibitor that suppresses autofluorescence generated from the tissue section when preparing the tissue specimen before the step of acquiring the forced fading fluorescence image.
  • the fluorescence signal can be measured more accurately.
  • a sulfonated compound as the autofluorescence inhibitor, and it is particularly preferable to use a sulfonated perylene compound as the sulfonated compound in that the blocking effect on the site that emits autofluorescence is high.
  • the fluorescent substance is fluorescent particles because it is excellent in maintaining labeling performance.
  • the image forming method of the present invention is an image forming method using a fluorescent luminescent substance, and an excitation light is applied to a tissue sample in which the target substance contained in the tissue section is stained with the fluorescent luminescent substance for at least 5 seconds.
  • the forced fading obtained by forcibly fading at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent substance or forcibly fading at least a part of the noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent substance by the above irradiation. It has a step of acquiring a faded fluorescence image. Further, it is preferable to have a step of adding an autofluorescence inhibitor that suppresses autofluorescence generated from the tissue section when preparing the tissue specimen before the step of acquiring the forced fading fluorescence image.
  • noise fluorescence refers to fluorescence derived from a substance other than a fluorescent luminescent substance among the fluorescence emitted from a tissue specimen after immunostaining.
  • noise fluorescence there is typically fluorescence (so-called autofluorescence) that is naturally emitted by a fluorescent substance (coenzyme, amino acid, protein, intracellular pigment substance, etc.) that originally exists in a tissue sample.
  • autofluorescence fluorescence
  • a substance other than the fluorescent luminescent substance contained in the tissue specimen and fluorescence emitted by an instrument such as a slide glass can be mentioned.
  • a sulfonated compound or the like can be used, and in particular, the use of the sulfonated compound has a high blocking effect on the site that emits autofluorescence. preferable.
  • the sulfonated compound it is preferable to use a sulfonated perylene-based compound in terms of blocking effect.
  • the sulfonated perylene-based compound for example, the following compound 1-7 (molecular weight 1399) is preferably used.
  • the step of adding the autofluorescence inhibitor is an activation treatment or blocking treatment of a specimen preparation step, a primary antibody reaction or a secondary antibody reaction or fluorescent labeling treatment of an immunostaining step, and morphological observation staining in a tissue section staining method described later. It is preferable to carry out at least one of the steps. Further, it is more preferable to carry out after the activation treatment or after the morphological observation staining step, and in particular, it is preferable to carry out after the activation treatment step in that the blocking effect on the site emitting autofluorescence is high.
  • the tissue sample is irradiated with excitation light for at least 5 seconds after the self-fluorescence inhibitor addition step to forcibly fade at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent luminescent material.
  • a forced fading fluorescence image obtained by forcibly fading at least a part of noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent light emitting substance is acquired.
  • the excitation light it is preferable to change the wavelength of the excitation light according to the spectral characteristics of the tissue sample, but in general, it is preferable to use the excitation light in the wavelength range of 575 to 600 nm through, for example, an optical filter. ..
  • the excitation light source for irradiating such excitation light for example, it is preferable to use the fluorescence observation illumination "U-HGLGPS" attached to the fluorescence microscope "BX-53" (manufactured by Olympus Corporation).
  • the time for irradiating the excitation light is at least 5 seconds or longer, preferably 60 seconds or longer.
  • the upper limit is preferably 300 seconds or less.
  • the microscopic image acquisition device irradiates the tissue sample with excitation light for at least 5 seconds after the step of adding the autofluorescent inhibitor to forcibly fade at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent luminescent material, or the above-mentioned.
  • a forced fading fluorescence image obtained by forcibly fading at least a part of noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent light emitting substance is acquired.
  • the acquired forced fading fluorescent image is subjected to image processing and analysis steps in, for example, an image processing apparatus.
  • the microscope image acquisition device and the image processing device are connected so as to be able to transmit and receive data via an interface such as a cable.
  • the connection method between the microscope image acquisition device and the image processing device is not particularly limited.
  • the microscope image acquisition device and the image processing device may be connected by a LAN (Local Area Network) or may be wirelessly connected.
  • the microscope image acquisition device is a known fluorescence microscope with a camera, which acquires a microscope image of a tissue section on a slide placed on a slide fixing stage and transmits it to an image processing device.
  • the microscope image acquisition device is configured to include an irradiation means, an image forming means, an imaging means, a communication I / F, and the like.
  • the irradiation means is composed of an excitation light source, an optical filter, etc., and irradiates the tissue section on the slide placed on the slide fixing stage with excitation light for at least 5 seconds or more, and at least a part of the fluorescence emitted from the fluorescent luminescent material. Is forcibly faded, or at least a part of the noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescent luminescent substance is forcibly faded.
  • the excitation light source examples include the above-mentioned light sources, and it is preferable that the excitation light has a wavelength in the range of 575 to 600 nm by passing through, for example, an optical filter. Further, it is preferable that the wavelength range of the fluorescence to be observed is also set within the wavelength range of 612 to 692 nm by passing through an optical filter.
  • the imaging means is composed of an eyepiece, an objective lens, or the like, and forms a transmitted light, a reflected light, or a fluorescence emitted from a tissue section on a slide by the irradiated light.
  • the image pickup means is a microscope-installed camera equipped with a CCD (Charge Coupled Device) sensor or the like, and images an image formed on an image forming surface by the image forming means to generate digital image data of a forced fading fluorescence image.
  • the communication I / F transmits the image data of the generated forced fading fluorescent image to the image processing device.
  • the microscope image acquisition device is provided with a bright-field unit that combines irradiation means and imaging means suitable for bright-field observation, and a fluorescence unit that combines irradiation means and imaging means suitable for fluorescence observation, and the units are switched. This makes it possible to switch between bright field and fluorescence.
  • the microscope image acquisition device is a known fluorescence microscope with a camera, and is not particularly limited, and a microscope in which a camera is installed in any known microscope (for example, a phase contrast microscope, a differential interference microscope, an electron microscope, etc.) is used. It can be used as a microscope image acquisition device. For example, it is preferable to use a fluorescence microscope (“BX-53” manufactured by Olympus Corporation), a digital camera for a microscope (“DP73” manufactured by Olympus Corporation), or the like.
  • the microscope image acquisition device is not limited to a microscope with a camera.
  • a virtual microscope slide creation device for example, a special table
  • a virtual microscope slide creating device it is possible to acquire image data that allows the entire image of the tissue section on the slide to be viewed at once on the display unit.
  • the image processing device identifies the in-focus position of each cell in the tissue section to be observed by analyzing the forced fading fluorescent image transmitted from the microscope image acquisition device.
  • the tissue specimen is a tissue section containing a target substance, which is a specimen stained with a fluorescent luminescent substance contained as an immunostaining agent and to which an autofluorescent inhibitor is added.
  • the tissue specimen after such staining is placed on the stage of the microscope image acquisition device.
  • Target substance A target substance is a substance that is the target of immunostaining using a fluorescent luminescent substance, mainly for detection or quantification from the viewpoint of pathological diagnosis.
  • the target substance is not particularly limited, but in pathological diagnosis, a biomarker such as an antigen according to the purpose is generally selected.
  • a biological substance such as a protein (antigen) expressed in a tissue section can be used as a target substance.
  • a unit smaller than a protein such as a peptide or a biomarker such as RNA may be used as a target substance.
  • the target substance does not have to be unique to the living body as long as it is present in the sample.
  • the target substance may be a drug introduced into the living body from outside the body.
  • Typical target substances include biological substances that are expressed on the cell membranes of various cancer tissues and can be used as biomarkers.
  • the fluorescent luminescent substance according to the present invention is preferably fluorescent luminescent particles because it is excellent in labeling performance.
  • the fluorescent substance is preferably used as a conjugate (immunostainer) bound to an antibody. That is, as an immunostaining agent, in order to improve the efficiency of fluorescent labeling and suppress the passage of time leading to deterioration of fluorescence as much as possible, the primary antibody and fluorescent nanoparticles are shared indirectly, that is, by utilizing an antigen-antibody reaction or the like. It is preferable to use a complex that is linked by a bond other than the bond. In order to simplify the staining operation, a complex in which fluorescent nanoparticles are directly linked to the primary antibody or the secondary antibody can also be used as the immunostaining agent.
  • immunostaining agent examples include [primary antibody against the target substance] ... [antibody against the primary antibody (secondary antibody)] to [fluorescent nanoparticles].
  • "" indicates that they are bound by an antigen-antibody reaction, and the mode of binding indicated by "" is not particularly limited.
  • covalent binding, ion binding, hydrogen binding, coordination binding, antigen-antibody binding examples thereof include biotin avidin reaction, physical adsorption, chemical adsorption, etc., and may be mediated by a linker molecule if necessary.
  • Antibody An antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to a protein as a target substance as an antigen can be used as the primary antibody.
  • an anti-HER2 antibody can be used
  • HER3 is the target substance
  • an anti-HER3 antibody can be used.
  • an antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to the primary antibody as an antigen can be used.
  • Both the primary antibody and the secondary antibody may be polyclonal antibodies, but from the viewpoint of quantitative stability, monoclonal antibodies are preferable.
  • the type of animal (immune animal) that produces an antibody is not particularly limited, and may be selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, and the like as in the past.
  • Fluorescent nanoparticles are nano-sized particles that emit fluorescence when irradiated with excitation light, and have sufficient intensity of fluorescence to represent the target substance as a signal one molecule at a time. It is a particle that can emit light.
  • fluorescent nanoparticles quantum dots (semiconductor nanoparticles) and fluorescence-emitting substance-integrated nanoparticles are preferably used.
  • the brightness of the fluorescent nanoparticles is preferably 5 times or more the brightness of noise fluorescence.
  • Quantum Dots As the quantum dots, semiconductor nanoparticles containing a II-VI group compound, a III-V group compound or an IV group element are used. For example, CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, Ge and the like can be mentioned.
  • the Fluorescent Luminescent Substance Accumulated Nanoparticles are based on particles made of an organic substance or an inorganic substance, and a plurality of fluorescent luminescent substances (for example, the quantum dots, fluorescent dyes, etc.). Is a nano-sized particle having a structure contained therein and / or adsorbed on its surface.
  • the fluorescent substance-accumulated nanoparticles it is preferable that the matrix and the fluorescent substance have substituents or sites having opposite charges and have an electrostatic interaction with each other.
  • quantum dot-accumulated nanoparticles, fluorescent dye-accumulated nanoparticles and the like are used as the fluorescent substance-accumulated nanoparticles.
  • the emission wavelength of the fluorescent substance integrated particles is arbitrary as long as it is within the sensitivity range of the image pickup device of the fluorescence microscope. Specifically, it is preferable that the emission wavelength is in the range of 400 to 700 nm.
  • the average particle size of the fluorescent substance-accumulated particles is not particularly limited, but those with a large particle size have difficulty in accessing the antigen, and those with a small particle size and low brightness value emit fluorescence as background noise (camera noise and cells). Since it is buried in the noise fluorescence of the above, it is preferable to use a particle size of about 20 to 200 nm. Further, it is preferable that the coefficient of variation of the particle size is 15% or less.
  • the average particle size is the diameter of the circle when an electron micrograph is taken using a scanning electron microscope (SEM), the cross-sectional area is measured for a sufficient number of particles, and each measured value is the area of the circle. Obtained as the diameter.
  • SEM scanning electron microscope
  • the arithmetic mean of the particle sizes of 1000 particles is taken as the average particle size.
  • the fluctuation coefficient was also a value calculated from the particle size distribution of 1000 particles.
  • organic substances generally include melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin and the like.
  • Resins classified as thermosetting resins generally heat such as styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer), etc.
  • Resins classified as plastic resins; other resins such as polylactic acid; polysaccharides can be exemplified.
  • examples of the inorganic substance include silica and glass.
  • Quantum dot integrated nanoparticles are structures in which the quantum dots are contained in and / or adsorbed on the surface thereof. Have. When the quantum dots are contained in the mother body, the quantum dots may or may not be chemically bonded to the mother body itself as long as they are dispersed inside the mother body.
  • Fluorescent dye-accumulated nanoparticles have a structure in which a fluorescent dye is contained in the mother body and / or is adsorbed on the surface thereof. ..
  • the fluorescent dye include rhodamine-based dye molecules, squarylium-based dye molecules, cyanine-based dye molecules, aromatic ring-based dye molecules, oxazine-based dye molecules, carbopyronine-based dye molecules, and pyrromesen-based dye molecules.
  • fluorescent dye examples include Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invigen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invigen) dye molecule, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dye molecule, and HiLyte (registered).
  • the method for preparing a tissue section (also referred to simply as a “section” and including a section such as a pathological section) to which this staining method can be applied is not particularly limited, and a tissue section prepared by a known procedure can be used.
  • Specimen preparation step (5.1) Specimen preparation step (5.1.1) Deparaffin treatment
  • the section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably in the range of 3 to 30 minutes. If necessary, xylene may be replaced during immersion.
  • the section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably in the range of 3 to 30 minutes. If necessary, ethanol may be replaced during immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably in the range of 3 to 30 minutes. If necessary, the water may be replaced during the immersion.
  • the activation treatment of the target substance is carried out according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly specified, but the activating solution includes 0.01 M citric acid buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, and 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer.
  • a liquid or the like can be used.
  • the pH condition is such that a signal is emitted from the pH range of 2.0 to 13.0 at 25 ° C. and the tissue roughness is such that the signal can be evaluated, depending on the tissue section to be used.
  • the pH is in the range of 6.0 to 8.0, but for special tissue sections, for example, pH 3.0 is also used.
  • an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used as the heating device.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the temperature can be in the range of 50 to 130 ° C. and the time can be in the range of 5 to 30 minutes.
  • the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS (phosphate buffered saline) and washed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the immersion time is preferably in the range of 3 to 30 minutes. Further, if necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • an autofluorescence inhibitor in the activation treatment.
  • the section after the activation treatment is washed with PBS, and then the above-mentioned autofluorescence inhibitor is added.
  • the amount of the autofluorescence inhibitor added may be as long as it can cover the section, and is preferably in the range of 20 uL to 100 uL per slide. Even after the addition of the autofluorescence inhibitor, it is preferable to further wash with PBS.
  • (5.2) Immunostaining step In the immunostaining step, fluorescent nanoparticles having a site that can directly or indirectly bind to the target substance in order to stain the target substance (fluorescent emission property) based on the immunostaining method.
  • a solution of the immunostaining agent containing the substance) is placed on a section and reacted with the target substance.
  • the solution of the immunostaining agent used in the immunostaining step may be prepared in advance before this step.
  • the immunostaining method is not particularly limited, but the following are typical examples.
  • a method of preparing a fluorescently labeled primary antibody in which a fluorescent substance and a primary antibody are linked, and directly fluorescently labeling and staining the target protein with the fluorescently labeled primary antibody (primary antibody method); Prepare a primary antibody and a fluorescently labeled secondary antibody in which a fluorescent luminescent substance and a secondary antibody are linked, react the primary antibody with the target protein, and then react the primary antibody with the fluorescently labeled secondary antibody. Therefore, a method of indirectly fluorescently labeling and staining the target protein (secondary antibody method).
  • a method in which a phosphor is reacted and the target protein is indirectly fluorescently labeled and stained using the avidin-biotin reaction (primary antibody method in combination with avidin-biotin); Prepare a biotin-modified secondary antibody in which the primary antibody and the secondary antibody are linked to biotin, and an avidin-modified phosphor in which the phosphor is linked to avidin or streptavidin, react the target protein with the primary antibody, and then biotin-modify.
  • a method in which an avidin-modified phosphor is further reacted after the secondary antibody is reacted, and the target protein is indirectly fluorescently labeled and stained using the avidin-biotin reaction (secondary antibody method in combination with avidin-biotin).
  • a hapten which has no immunogenicity but exhibits antigenicity and can react with an antibody
  • a hapten which has no immunogenicity but exhibits antigenicity and can react with an antibody
  • Combinations of low molecular weight substances and anti-hapten antibodies such as dicoxygenin and anti-dicoxygenin antibodies, FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-FITC antigens, as well as other substances with similar specific reactivity can also be utilized. can.
  • the immunostaining method may be performed according to the standard procedure and treatment conditions for each of the various methods as described above.
  • the sample slide on which the sample is placed may be immersed in one or more kinds of reagents according to the immunostaining method under appropriate temperature and time conditions.
  • the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less.
  • reagents required for immunostaining that is, fluorescently labeled primary / secondary antibody, biotin-modified primary / secondary antibody, avidin-modified secondary antibody / phosphor, etc. are dissolved, and BSA (bovine serum albumin) is required.
  • a solution such as a buffer solution to which a blocking agent such as (bovine serum albumin)) is added can be prepared according to a known method and can also be obtained as a commercially available product.
  • the sample slide is preferably washed by immersing it in a washing solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the temperature of the washing treatment using PBS performed after the treatment with this labeling solution is room temperature, and the time is 3 to 30 minutes. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion. It is preferable to drop a known blocking agent such as PBS containing BSA or a surfactant such as Tween 20 before performing the treatment as described above.
  • the autofluorescence inhibitor at least in any of the primary antibody reaction, the secondary antibody reaction and the fluorescent labeling in the various methods described above.
  • the avidin-modified phosphor is further reacted.
  • an autofluorescence inhibitor it is preferable to add an autofluorescence inhibitor.
  • the amount of the autofluorescence inhibitor added may be as long as it can cover the section, and is preferably in the range of 20 uL to 100 uL per slide. It is preferable to wash with PBS after adding the autofluorescence inhibitor.
  • Morphological observation staining step Apart from the immunostaining step, morphological observation staining may be performed so that the morphology of cells, tissues, organs and the like can be observed in a bright field.
  • the morphological observation staining step can be performed according to a conventional method. For morphological observation of tissue specimens, staining with eosin, in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinized cells are stained in red to deep red, is standardly used.
  • hematoxylin which stains cell nuclei, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus in blue-blue to pale blue
  • the method of performing these two stainings at the same time is hematoxylin / eosin staining).
  • HE staining HE staining
  • the morphological observation staining step it may be performed after the immunostaining step or before the immunostaining step.
  • an autofluorescence inhibitor in the morphological observation staining step.
  • the autofluorescence inhibitor is added after hematoxylin staining or, in the case of eosin staining, eosin staining.
  • the amount of the autofluorescence inhibitor added may be as long as it can cover the section, and is preferably in the range of 20 uL to 100 uL per slide. It is preferable to wash with PBS after adding the autofluorescence inhibitor.
  • tissue specimen after the morphological observation staining step is subjected to treatments such as immobilization / dehydration, permeation, and encapsulation so as to be suitable for observation.
  • the tissue specimen may be immersed in an immobilization treatment solution (crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol).
  • the permeation treatment may be performed by immersing the tissue specimen after the immobilization / dehydration treatment in a permeation liquid (xylene or the like).
  • the encapsulation treatment may be performed by immersing the tissue specimen that has been subjected to the permeation treatment in the encapsulation liquid.
  • the conditions for performing these treatments for example, the temperature and soaking time when immersing the tissue specimen in a predetermined treatment solution, may be appropriately adjusted so as to obtain an appropriate signal according to the conventional immunostaining method. can.
  • the tissue sample obtained by staining the tissue section as described above is placed on the stage of the above-mentioned microscopic image acquisition device, and the tissue sample is irradiated with excitation light to expose it for at least 5 seconds or more, and the fluorescence emission is performed.
  • a forced fading fluorescence image is obtained in which at least a part of the fluorescence of the sex substance is forcibly faded, or at least a part of the noise fluorescence emitted from a substance different from the fluorescence emitting substance is forcibly faded.
  • the acquired forced fading fluorescent image is subjected to image processing and analysis steps in, for example, an image processing apparatus.
  • the Rf value of the target product was 0.73 with respect to the Rf value of 0.88 of the raw material, and the convergence of the reaction and the formation of the target product were confirmed from the TLC data.
  • Ice was placed in a 50 mL vial until the 8th minute (30 mL), and the reaction solution was added little by little. A suspension in which the resulting dye was suspended was obtained. The suspension was centrifuged, the supernatant was removed, and the dye was recovered as a precipitate. Disperse the precipitate with 10 mL of pure water, centrifuge this dispersion to remove the supernatant, collect the precipitate, disperse again with 10 mL of pure water, centrifuge this dispersion to obtain the supernatant. It was removed and the precipitate was collected.
  • the recovered precipitate was dispersed with ethanol, the dispersion was centrifuged, and the supernatant was removed to obtain an aminocoumarin compound II represented by the following formula (II) as a precipitate.
  • the yield of aminocoumarin compound II was 80%.
  • the obtained precipitate was dried, the obtained powder was added to pure water, and then neutralized with an aqueous NaOH solution to dissolve the precipitate, and the pH of the solution was adjusted to 7 to 8. This solution was dried in a freeze-dryer to obtain a Na salt of aminocoumarin compound II. It was confirmed that the aminocoumarin compound II has poor solubility in water as a sulfonic acid form, whereas it is rapidly dissolved in water by using a Na salt.
  • 0.3 mL of the obtained organoalkoxysilane compound solution was mixed with 24 mL of 99% ethanol, 0.3 mL of tetraethoxysilane (TEOS), 0.75 mL of ultrapure water, and 0.75 mL of 28% by mass of ammonia water at 25 ° C. 3 Time mixed.
  • the mixed solution prepared in the above step was centrifuged at 10000 G for 20 minutes to remove the supernatant. Ethanol was added to this precipitate to disperse the precipitate, and the precipitate was rinsed again for centrifugation. Further, the same rinse was repeated twice to obtain aminocoumarin compound-encapsulating particles II. SEM observation was performed on 1000 of the obtained particles, and the average particle size was measured. As a result, the average particle size was 60 nm.
  • This streptavidin solution was desalted with a gel filtration column (Zaba Spin Deserting Colors: Funakoshi) to obtain streptavidin capable of binding to the silica-based particles.
  • the total amount of streptavidin (containing 0.04 mg) and 740 ⁇ L of silica-based particles adjusted to 0.67 nM above were mixed with PBS containing 2 mM of EDTA, and reacted at room temperature for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to terminate the reaction.
  • the linker reagent "(+)-Biotin-PEG6-NH-Mal" (PurePEG, product number 246106-250) having a spacer length of 30 angstroms becomes 0.4 mM using DMSO. Adjusted to. 8.5 ⁇ L of this solution was added to the antibody solution, mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • This reaction solution was purified by subjecting it to a desalting column "Zeba Desert Spin Columns" (Cat. # 89882, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.). The absorption of the desalted reaction solution at a wavelength of 300 nm was measured with a spectroscopic altimeter (“F-7000” manufactured by Hitachi) to calculate the amount of protein contained in the reaction solution.
  • the reaction solution was adjusted to 250 ⁇ g / mL with a 50 mM Tris solution, and the solution was used as a solution of the biotinylated secondary antibody.
  • Specimen treatment step (1-1) Deparaffinization treatment step HER2 (3+) and HER2 (-) tissue array slides ("CB-A712 series” manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) are used as tissue sections for staining. board. This tissue array slide was deparaffinized.
  • (1-2) Activation treatment step The deparaffinized tissue array slide was washed by replacing it with water. The washed tissue array slides were autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) at 121 ° C. for 15 minutes to activate the antigen. The tissue array slides after the activation treatment were washed with PBS, and the washed tissue array slides were blocked with PBS containing 1% BSA for 1 hour.
  • tissue sections that had completed the immunostaining step and the morphological observation staining step were washed and dehydrated by immersing them in pure ethanol for 5 minutes four times. Subsequently, the operation of immersing in xylene for 5 minutes was performed four times to perform transparency. Finally, a tissue section was encapsulated using an encapsulant (“Enteran New” manufactured by Merck & Co., Inc.) to prepare a tissue array slide of a sample for observation.
  • an encapsulant (“Enteran New” manufactured by Merck & Co., Inc.
  • the tissue section after the immobilization treatment step was irradiated with a predetermined excitation light to emit fluorescence.
  • the tissue section in that state was observed and imaged with a fluorescence microscope (“BX-53” manufactured by Olympus Corporation) and a digital camera for a microscope (“DP73” manufactured by Olympus Corporation).
  • the excitation light was set to 575 to 600 nm by passing it through an optical filter.
  • the range of the wavelength (nm) of the fluorescence to be observed was also set to 612 to 692 nm by passing through an optical filter.
  • the conditions of the excitation wavelength at the time of microscopic observation and image acquisition were such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was set to 0.5 seconds for imaging.
  • the number of signals in the tissue of HER2 (3+) was taken as the average value of 1000 cells measured by the ImageJ FindMaxims method based on the image taken at 400 times.
  • the number of signals S on the cell membrane in the visual field and the number N of extracellular signals in the visual field were measured, and the S / N ratio was calculated.
  • the number of signals and the S / N ratio are shown in Table I below.
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 1, the excitation light irradiation time was set to 0.05 seconds before image acquisition in "(5) Observation / measurement step", and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was set to 0. The same procedure was performed except that the image was taken with the setting set to 5 seconds.
  • the excitation wavelength condition before image acquisition was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 1, the excitation light irradiation time was set to 0.5 seconds before image acquisition in "(5) Observation / measurement step", and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was set to 0. The same procedure was performed except that the image was taken with the setting set to 5 seconds.
  • the excitation wavelength condition before image acquisition was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • Example 1 In Comparative Example 1, before image acquisition in "(5) Observation / Measurement Step", the excitation light irradiation time was set to 5 seconds and light was irradiated to perform forced fading, and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was performed. The same procedure was performed except that the image was taken with the setting set to 0.5 seconds.
  • the excitation wavelength condition before image acquisition was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • Example 2 In Comparative Example 1, before image acquisition in "(5) Observation / measurement step", the excitation light irradiation time is set to 60 seconds and light is irradiated to perform forced fading, and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition is performed. was set to 0.5 seconds and the image was taken in the same manner. The conditions for the excitation wavelength before image acquisition were such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • Example 3 In Comparative Example 1, before image acquisition in "(5) Observation / Measurement Step", the excitation light irradiation time was set to 300 seconds and light was irradiated to perform forced fading, and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was performed. The same procedure was performed except that the image was taken with the setting set to 0.5 seconds.
  • the excitation wavelength condition before image acquisition was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • the excitation light irradiation time was set to 60 seconds before image acquisition, light irradiation was performed to perform forced fading, and then the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was 0.5. I set it to seconds and took an image.
  • the excitation wavelength condition before image acquisition was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 when excited at 580 nm.
  • Example 5 PBS containing 1% of the following compound 1-7 (sulfonated perylene-based imide) in TrueVIEW (manufactured by Vector) solution (autofluorescence inhibitor) in "(1-2) Activation treatment step". The procedure was the same except that the solution was changed. The addition amount is the same.
  • Example 6 In Comparative Example 1, "(3) Morphological observation and dyeing step” and “(5) Observation / measurement step” were changed as follows, but the same procedure was performed. (3) Morphological observation staining step After immunostaining, hematoxylin staining (H staining) was performed. The immunostained sections were stained with Meyer hematoxylline solution for 1 minute for hematoxylin staining. Then, the tissue section was washed with running water at 45 ° C. for 3 minutes. For the stained tissue array slide, 50 uL of TrueVIEW (manufactured by Vector) solution as an autofluorescence inhibitor was placed on the slide and treated.
  • TrueVIEW manufactured by Vector
  • Example 7 In Example 6, the TrueVIEW (manufactured by Vector) solution (autofluorescent inhibitor) in "(3) Morphological observation staining step" was added to a PBS solution containing 1% of the compound 1-7 (sulfonated perylene-based imide). I did the same except for the change. The addition amount is the same.
  • the present invention can be used as an image forming method capable of observing the fluorescence color derived from the target substance conspicuously, reducing noise fluorescence such as autofluorescence, and accurately measuring the fluorescence signal.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、組織切片に含有される標的物質が前記蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する工程を有する。

Description

画像形成方法
　本発明は、画像形成方法に関し、特に、標的物質由来の蛍光色が際立って観察でき、自家蛍光等のノイズ蛍光を低減して蛍光シグナルを正確に計測することができる画像形成方法に関する。
　病理診断において、組織切片で特定の標的物質（例えば、特定の細胞に過剰に発現されている物質や、特定の細胞の特異的に発現されている物質など）の量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。
　従来、多数の蛍光色素（蛍光発光性物質）を内包した蛍光ナノ粒子を用いて特定の標的物質を標識した組織標本を撮像した蛍光画像から、蛍光シグナルを抽出し蛍光画像における特定の標的物質の量を定量解析する方法が開発されている。
　しかしながら、組織切片のようにノイズ蛍光を発する標本を用いた観察時には、標的物質由来を標識する蛍光ナノ粒子由来の蛍光輝度をシグナル（Ｓ）、蛍光ナノ粒子以外の物質由来のノイズ蛍光の輝度をノイズ（Ｎ）とした場合のＳ／Ｎ比が低いと、ノイズ蛍光まで蛍光ナノ粒子由来の蛍光に含めてしまう可能性が高くなり、誤差の原因となり得るため、やはり定量的な解析が困難であった。
　そこで、ノイズ蛍光の影響を低減するために、緑色色素として特定構造を有するアミノクマリン化合物を用いて標識を行うことにより、目的の蛍光標識の蛍光強度の向上を図る技術が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、自家蛍光などのノイズ蛍光は緑色で検出されることが多く、正しく蛍光シグナルを測定することができず、赤色色素の方が好ましいとされている。
　また、自家蛍光抑制剤として酸化剤を用いることで、自家蛍光を抑制する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら、酸化剤を用いると、酸化剤の酸化反応によって、染色した組織標本中のタンパク質のＳＨ基がＳ－Ｓ結合を形成して３次構造の変性が生じてしまうことがあり、その結果、目的の標的物質の蛍光シグナルの測定に影響が生じる可能性が高い。
国際公開第２０１８／１５１０７１号 国際公開第２０１８／２０４５８３号
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、標的物質の蛍光色が際立って観察でき、自家蛍光等のノイズ蛍光を低減して蛍光シグナルを正確に計測することができる画像形成方法を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、上記問題の原因等について検討する過程において、自家蛍光の褪色と蛍光発光性物質の褪色のタイミングが異なることを利用し、組織標本に励起光を特定時間照射して、強制褪色させることにより、自家蛍光等のノイズ蛍光を低減して蛍光シグナルを正確に計測することができる画像形成方法を提供することができることを見いだし本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、
　組織切片に含有される標的物質が前記蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する工程を有する画像形成方法。
　２．前記強制褪色蛍光画像を取得する工程前で、前記組織標本を作製する際に、前記組織切片から生じる自家蛍光を抑制する自家蛍光抑制剤を添加する工程を有する第１項に記載の画像形成方法。
　３．前記自家蛍光抑制剤として、スルホン化化合物を用いる第２項に記載の画像形成方法。
　４．前記スルホン化化合物として、スルホン化ペリレン系化合物を用いる第３項に記載の画像形成方法。
　５．前記蛍光発光性物質が、蛍光発光性粒子である第１項から第４項までのいずれか一項に記載の画像形成方法。
　本発明の上記手段により、標的物質の蛍光色が際立って観察でき、自家蛍光等のノイズ蛍光を低減して蛍光シグナルを正確に計測することができる画像形成方法を提供することができる。
　本発明の効果の発現機構又は作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。
　標的物質が蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させるので、自家蛍光の褪色と蛍光発光性物質の褪色のタイミングが異なり、褪色の時間差が生じることから、目的の蛍光発光性物質の蛍光色が際立ち、当該蛍光発光性物質の蛍光強度が相対的に向上する。その結果、蛍光シグナルを正確に計測することができる。
　本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、組織切片に含有される標的物質が前記蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する工程を有する。
　この特徴は、下記各実施形態に共通又は対応する技術的特徴である。
　本発明の実施態様としては、前記強制褪色蛍光画像を取得する工程前で、前記組織標本を作製する際に、前記組織切片から生じる自家蛍光を抑制する自家蛍光抑制剤を添加する工程を有することが、蛍光シグナルをより正確に計測できる点で好ましい。
　前記自家蛍光抑制剤として、スルホン化化合物を用いることが好ましく、特に前記スルホン化化合物として、スルホン化ペリレン系化合物を用いることが、自家蛍光を発する部位へのブロッキング効果が高い点で好ましい。
　前記蛍光発光性物質が、蛍光発光性粒子であることが、標識性能を維持できることに優れる点で好ましい。
　以下、本発明とその構成要素及び本発明を実施するための形態・態様について説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
［本発明の画像形成方法の概要］
　本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、組織切片に含有される標的物質が前記蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する工程を有する。
　また、前記強制褪色蛍光画像を取得する工程前で、前記組織標本を作製する際に、前記組織切片から生じる自家蛍光を抑制する自家蛍光抑制剤を添加する工程を有することが好ましい。
　本発明において、「ノイズ蛍光」とは、免疫染色後の組織標本から発せられる蛍光のうち、蛍光発光性物質以外の物質に由来する蛍光をいう。具体的にノイズ蛍光の例として、典型的には組織標本において元から存在する蛍光発光性物質（補酵素、アミノ酸、タンパク質、細胞内色素物質など）が自然に発する蛍光（いわゆる自家蛍光）が挙げられるが、その他にも例えば、組織標本に含まれる蛍光発光性物質以外の物質やスライドガラスなどの器具が発する蛍光が挙げられる。
＜自家蛍光抑制剤添加工程＞
　前記自家蛍光抑制剤添加工程で用いる自家蛍光抑制剤としては、例えば、スルホン化化合物等を用いることができ、特に、スルホン化化合物を用いることが自家蛍光を発する部位へのブロッキング効果が高い点で好ましい。
　前記スルホン化化合物としては、スルホン化ペリレン系化合物を用いることが、ブロッキング効果の点で好ましい。
　前記スルホン化ペリレン系化合物としては、例えば、以下に示す化合物１－７（分子量１３９９）が好適に用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　前記自家蛍光抑制剤添加工程は、後述する組織切片の染色方法における、標本作製工程の賦活化処理又はブロッキング処理、免疫染色工程の１次抗体反応、２次抗体反応又は蛍光標識処理、形態観察染色工程のうち少なくともいずれかで行うことが好ましい。また、前記賦活化処理の後又は形態観察染色工程の後で行うことがより好ましく、特に、賦活化処理工程の後で行うことが、自家蛍光を発する部位へのブロッキング効果が高い点で好ましい。
＜強制褪色蛍光画像取得工程＞
　強制褪色蛍光画像取得工程は、前記自家蛍光抑制剤添加工程後の、組織標本に励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する。
　前記励起光としては、組織標本が有する分光学的特性により励起光の波長を変えることが好ましいが、一般的には、例えば光学フィルターを通して波長５７５～６００ｎｍの範囲内の励起光とすることが好ましい。このような励起光を照射する励起光源としては、例えば、蛍光顕微鏡「ＢＸ－５３」（オリンパス社製）に付属する蛍光観察用照明「Ｕ－ＨＧＬＧＰＳ」等を使用することが好ましい。
　前記励起光を照射する時間は、少なくとも５秒以上であり、好ましくは６０秒以上である。上限値としては、３００秒以下であることが好ましい。
　以下、前記強制褪色蛍光画像取得工程で用いる顕微鏡画像取得装置について説明する。［顕微鏡画像取得装置］
　顕微鏡画像取得装置は、前記自家蛍光抑制剤添加工程後の、組織標本に励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する。取得した強制褪色蛍光画像は、例えば、画像処理装置において、画像処理及び分析工程などが行われる。
　顕微鏡画像取得装置と画像処理装置は、ケーブルなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されている。顕微鏡画像取得装置と画像処理装置との接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置と画像処理装置はＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
　顕微鏡画像取得装置は、公知のカメラ付き蛍光顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置に送信するものである。
　顕微鏡画像取得装置は、照射手段、結像手段、撮像手段及び通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。
　照射手段は、励起光源、光学フィルターなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に励起光を少なくとも５秒以上照射し、蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させる。
　励起光源としては、前記した光源が挙げられ、例えば光学フィルターを通すことで波長５７５～６００ｎｍの範囲内の励起光とすることが好ましい。
　また、観察する蛍光の波長の範囲についても、光学フィルターを通すことで波長６１２～６９２ｎｍの範囲内に設定することが好ましい。
　結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。
　撮像手段は、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して、強制褪色蛍光画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。
　通信Ｉ／Ｆは、生成された強制褪色蛍光画像の画像データを画像処理装置に送信する。
　顕微鏡画像取得装置では、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
　顕微鏡画像取得装置は、公知のカメラ付き蛍光顕微鏡であり、特に限定されるものではなく、公知の任意の顕微鏡（例えば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置として用いることができる。例えば、蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ－５３」）及び顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）等を用いることが好ましい。
　なお、顕微鏡画像取得装置としては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）などを用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
　画像処理装置は、顕微鏡画像取得装置から送信された強制褪色蛍光画像を解析することにより、観察対象の組織切片における細胞ごとの合焦位置を特定する。
　なお、画像処理装置による画像処理等については、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレットや国際公開ＷＯ２０１３／１４７０８１号パンフレット等の記載事項及びその他の一般的な技術的事項に準じた適切なものとし、ここではその記載を省略する。
［組織標本］
　次に、組織標本について説明する。
　前記組織標本は、標的物質を含有する組織切片であって、免疫染色剤として含有される蛍光発光性物質で染色され、かつ、自家蛍光抑制剤が添加された標本である。このような染色後の組織標本は、顕微鏡画像取得装置のステージに設置される。
（１）標的物質
　標的物質とは、主に病理診断の観点からの検出又は定量のために、蛍光発光性物質を用いた免疫染色の対象とするものをいう。
　標的物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原などのバイオマーカーが選択される。例えば、組織切片に発現しているタンパク質（抗原）などの生体物質を標的物質とすることができる。その他にも、ペプチド等のタンパク質より小さな単位や、ＲＮＡなどのバイオマーカーを標的物質としても良い。また、標的物質は、試料に存在するものであれば、生体固有のものでなくても良い。例えば、標的物質は、体外から生体内に導入された薬剤などであっても良い。
　典型的な標的物質としては、各種の癌組織の細胞膜等で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
（２）免疫染色剤（抗体－蛍光ナノ粒子の結合体）
　本発明に係る蛍光発光性物質は、蛍光発光性粒子であることが、標識性能に優れる点で好ましい。具体的には、蛍光発光性物質は、抗体に結合した結合体（免疫染色剤）として用いられることが好ましい。すなわち、免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体及び蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体又は二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
　免疫染色剤の一例として、［標的物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］～［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。
　“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“～”が示す結合の態様としては特に限定されず、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
（３）抗体
　前記一次抗体には、標的物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。例えば、ＨＥＲ２を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
　前記二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
　一次抗体及び二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
（４）蛍光ナノ粒子
　前記「蛍光ナノ粒子」とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、標的物質を１分子ずつシグナルとして表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
　蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光発光性物質集積ナノ粒子が使用される。蛍光ナノ粒子の輝度は、ノイズ蛍光の輝度の５倍以上であることが望ましい。
（４．１）量子ドット
　前記量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物又はＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
（４．２）蛍光発光性物質集積ナノ粒子
　前記蛍光発光性物質集積ナノ粒子は、有機物又は無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光発光性物質（例えば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
　蛍光発光性物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光発光性物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基又は部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
　蛍光発光性物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
　蛍光発光性物質集積粒子の発光波長は、蛍光顕微鏡の撮像素子の感度域内であれば任意である。具体的には、発光波長が４００～７００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
　蛍光発光性物質集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞のノイズ蛍光）に埋もれてしまうことから、２０～２００ｎｍ程度のものが好適である。
　また、粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
　前記平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
（４．２．１）母体
　前記蛍光発光性物質集積ナノ粒子の母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
　前記母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
（４．２．２）量子ドット集積ナノ粒子
　前記「量子ドット集積ナノ粒子」とは、前記量子ドットが、前記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
　量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（４．２．３）蛍光色素集積ナノ粒子
　前記「蛍光色素集積ナノ粒子」とは、蛍光色素が、前記母体の中に内包されている、及
び／又はその表面に吸着している構造を有する。
　蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
　蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
　なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（５）組織切片の染色方法
　組織切片の染色方法の一例について説明する。
　この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
（５．１）標本作製工程
（５．１．１）脱パラフィン処理
　キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（５．１．２）賦活化処理
　公知の方法に倣い、標的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
　ｐＨ条件は用いる組織切片に応じて、２５℃においてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０～８．０の範囲内で行うが、特殊な組織切片では例えばｐＨ３．０でも行う。
　加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃の範囲内、時間は５～３０分の範囲内で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　また、本発明では、賦活化処理において、自家蛍光抑制剤を添加することが好ましい。
　具体的には、賦活処理後の切片をＰＢＳにより洗浄を行った後、前記した自家蛍光抑制剤を添加する。
　このとき自家蛍光抑制剤の添加量としては、切片を覆うことができればよく、スライド１枚に対して２０ｕＬ～１００ｕＬの範囲内とすることが好ましい。
　なお、自家蛍光抑制剤添加後もさらにＰＢＳにより洗浄することが好ましい。
（５．２）免疫染色工程
　免疫染色工程では、免疫染色法に基づいて、標的物質を染色するために、標的物質に直接的又は間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子（蛍光発光性物質）を含む免疫染色剤の溶液を、切片に載せ、標的物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
　免疫染色法には様々な手法があり、標的物質を染色することができれば、特に限定されるものではないが、代表的なものには次のようなものが挙げられる。
　蛍光体と１次抗体を連結した蛍光標識１次抗体を用意し、その蛍光標識１次抗体で目的タンパク質を直接的に蛍光標識し染色する方法（１次抗体法)；
　１次抗体、及び蛍光発光性物質と２次抗体を連結した蛍光標識２次抗体を用意し、目的タンパク質に１次抗体を反応させた後、その１次抗体に蛍光標識２次抗体を反応させることで、目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法（２次抗体法）
　１次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾１次抗体、及び蛍光体とアビジンないしストレプトアビジンを連結したアビジン修飾蛍光体を用意し、目的タンパク質にビオチン修飾１次抗体を反応させた後、さらにアビジン修飾蛍光体を反応させて、アビジン－ビオチン反応を利用して目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法（アビジン－ビオチン併用１次抗体法）；
　１次抗体、２次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾２次抗体、及び蛍光体とアビジンないしストレプトアビジンを連結したアビジン修飾蛍光体を用意し、目的タンパク質に１次抗体を反応させ、次いでビオチン修飾２次抗体を反応させた後、さらにアビジン修飾蛍光体を反応させて、アビジン－ビオチン反応を利用して目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法（アビジン－ビオチン併用２次抗体法）。
　なお、上記のアビジン－ビオチン併用１次抗体法又はアビジン－ビオチン併用２次抗体法において、ビオチン及びアビジンの代わりに、ハプテン（免疫原性を有さないが抗原性を示し抗体と反応しうる比較的分子量の低い物質）及び抗ハプテン抗体、例えばジコキシゲニン及び抗ジコキシゲニン抗体、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及び抗ＦＩＴＣ抗原、さらには同様の特異的な反応性を有するその他の物質の組み合わせを利用することもできる。
　免疫染色法は、上述したような各種の手法のそれぞれにとって標準的な手順及び処理条件にしたがって行えばよい。
　一般的には、検体を載置した検体スライドを免疫染色法に応じた１種類又は２種類以上の試薬に、適切な温度及び時間条件の下、浸漬すればよい。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　免疫染色に必要な各種の試薬、すなわち蛍光標識１次／２次抗体、ビオチン修飾１次／２次抗体、アビジン修飾２次抗体／蛍光体などが溶解し、必要に応じてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin)）等のブロッキング剤が添加された緩衝液等の溶液は、公知の方法にしたがって作製することが可能であり、市販品として入手することもできる。
　標識液を用いた処理後、好ましくは検体スライドをリン酸緩衝液生理的食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｄ　ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）等の洗浄液に浸漬して洗浄する。通常、この標識液での処理後に行われるＰＢＳを用いた洗浄処理の温度は室温であり、時間は３～３０分である。必要により、浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
　また、本発明では、前記した各種の手法において、１次抗体反応、２次抗体反応又は蛍光標識する際の少なくともいずれかで、自家蛍光抑制剤を添加することが好ましい。
　例えば、前記アビジン－ビオチン併用２次抗体法の場合には、目的タンパク質に１次抗体を反応させた後や、その後、ビオチン修飾２次抗体を反応させた後、さらに、アビジン修飾蛍光体を反応させた後に、それぞれ自家蛍光抑制剤を添加することが好ましい。
　また、自家蛍光抑制剤の添加量としては、切片を覆うことができればよく、スライド１枚に対して２０ｕＬ～１００ｕＬの範囲内とすることが好ましい。
　なお、自家蛍光抑制剤添加後にＰＢＳにより洗浄することが好ましい。
（５．３）形態観察染色工程
　免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
　形態観察染色工程は、常法にしたがって行うことができる。
　組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオシンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
　形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
　また、本発明では、形態観察染色工程において、自家蛍光抑制剤を添加することが好ましい。具体的には、ヘマトキシリン染色を行った後や、エオシン染色も行う場合にはエオシン染色を行った後に、自家蛍光抑制剤を添加する。
　また、自家蛍光抑制剤の添加量としては、切片を覆うことができればよく、スライド１枚に対して２０ｕＬ～１００ｕＬの範囲内とすることが好ましい。
　なお、自家蛍光抑制剤添加後にＰＢＳにより洗浄することが好ましい。
（５．４）標本後処理工程
　形態観察染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
　固定化・脱水処理は、組織標本を固定化処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
　これらの処理を行う上での条件、例えば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　以上のようにして、組織切片を染色して得られた組織標本は、前記した顕微鏡画像取得装置のステージに設置し、組織標本に励起光を照射して少なくとも５秒以上露光させ、前
記蛍光発光性物質の蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させた強制褪色蛍光画像を取得する。取得した強制褪色蛍光画像は、例えば、画像処理装置において、画像処理及び分析工程などが行われる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」及び「部」は、それぞれ、「質量％」及び「質量部」を意味する。
［アミノクマリン化合物IIの合成］
　２０ｍＬバイアル管瓶に下記式（６）で表される化合物 ６００ｍｇを入れ、発煙硫酸６ｍＬを加えて、２５℃にて４時間撹拌し、反応を行った。反応の進行はＴＬＣにて確認した。具体的には、反応液の一部をＮａＯＨ水溶液にて中和した後、反応液にエタノールを加え、ＣＨＣｌ３　を２、ＭｅＯＨを３の割合で混合した溶液を用いてＴＬＣを行った。原料のＲｆ値０．８８に対し、目的物のＲｆ値０．７３であり、このＴＬＣのデータより、反応の収束及び目的物の生成を確認した。
　５０ｍＬバイアル管瓶に氷を８分目（３０ｍＬ）まで入れ、この中に反応液を少しずつ加えた。生成した色素が懸濁した懸濁液が得られた。この懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去して色素を沈殿として回収した。沈殿を純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して、上澄み液を除去して、沈殿を回収し、再度、純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して上澄み液を除去して、沈殿を回収した。回収した沈殿をエタノールで分散し、この分散液を遠心分離し、上澄み液を除去して、沈殿として下記式（II）で表されるアミノクマリン化合物IIを得た。アミノクマリン化合物IIの収率は８０％であった。
　得られた沈殿物を乾燥後、得られた粉末を純水に加えた後、ＮａＯＨ水溶液で中和し、沈殿を溶解し、溶液のｐＨを７～８とした。この溶液を凍結乾燥機にて乾燥することにより、アミノクマリン化合物IIのＮａ塩を得た。アミノクマリン化合物IIは、スルホン酸体では水への溶解性が悪いのに対し、Ｎａ塩とすることで、水に速やかに溶解することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［アミノクマリン化合物内包粒子IIの作製］
　アミノクマリン化合物II ３．４ｍｇに塩化チオニル０．１ｍLを加え、６５℃４時間、加熱混合した後、真空乾燥を行なって余剰の塩化チオニルを除去した。得られたアミノクマリン化合物と塩化チオニルの反応物と３－アミノプロピルトリメトキシシラン（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬを１．２ｍＬのＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
　得られたオルガノアルコキシシラン化合物液０．３ｍＬを、９９％エタノール２４ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．３ｍＬ、超純水０．７５ｍＬ、及び２８質量％のアンモニア水０．７５ｍＬと２５℃で３時間混合した。
　上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をするリンスを行った。さらに同様のリンスを２回繰り返し、アミノクマリン化合物内包粒子IIを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は６０ｎｍであった。
［比較例１］
　下記の方法により免疫染色を行った。
　（色素内包粒子のストレプトアジピン修飾）
　アミノクマリン化合物内包粒子IIを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有するＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、５℃で１時間反応させた。
　この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基がついたアミノクマリン化合物内包粒子IIを得た。
　１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２－イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で1時間反応させた。これにより、
ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基（－NH－C（＝NH2 +Cl-）－CH2－CH2－CH2－SH）を導入した。
　このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記シリカ系粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。このストレプトアビジン全量（０．０４ｍｇ含有)とＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記０．６７ｎＭに調整したシリカ系粒子７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。
　１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIを得た。
　（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
　５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「（＋）－Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ6‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製,製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。
　この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン化２次抗体の溶液とした。
　（染色）
（１）標本処理工程
（１－１）脱パラフィン処理工程
　染色用の組織切片として、ＨＥＲ２（３＋）とＨＥＲ２（－）の組織アレイスライド（コスモバイオ社製「ＣＢ－Ａ７１２のシリーズ」）を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。
（１－２）賦活化処理工程
　脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。
（２）免疫染色処理工程
（２－１）１次反応
　ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。
（２－２）２次反応
　１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン化２次抗体と室温３０分間反応させた。
（２－３）蛍光標識処理
　２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIを、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９～７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。
（３）形態観察染色工程
　免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行った。
（４）固定化処理工程
　免疫染色工程及び形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
（５）観察・計測工程
　固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ－５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により観察及び撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５～６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターを通すことで６１２～６９２ｎｍに設定した。
　顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。画像取得時の励起光照射時間は、０．５秒に設定して撮像した。
　ＨＥＲ２（３＋）の組織のシグナル数は、４００倍で撮像した画像をもとにＩｍａｇｅＪ　ＦｉｎｄＭａｘｉｍｓ法により計測した１０００細胞の平均値とした。
　視野内の細胞膜上のシグナル数Ｓ及び視野内の細胞外のシグナル数Ｎを測定し、Ｓ／Ｎ比を算出した。シグナル数及びＳ／Ｎ比を下記表Ｉに示す。
［比較例２］
　比較例１において、「（５）観察・計測工程」における画像取得の前に励起光照射時間を０．０５秒に設定して光照射し、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した以外は同様に行った。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［比較例３］
　比較例１において、「（５）観察・計測工程」における画像取得の前に励起光照射時間を０．５秒に設定して光照射し、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した以外は同様に行った。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例１］
　比較例１において、「（５）観察・計測工程」における画像取得の前に励起光照射時間を５秒に設定して光照射して強制褪色を行い、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した以外は同様に行った。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例２］
　比較例１において、「（５）観察・計測工程」における画像取得の前に励起光照射時間を６０秒に設定して光照射して強制褪色を行い、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した以外は同様に行った。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例３］
　比較例１において、「（５）観察・計測工程」における画像取得の前に励起光照射時間を３００秒に設定して光照射して強制褪色を行い、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した以外は同様に行った。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例４］
　比較例１において、「（１－２）賦活化処理工程」及び「（５）観察・計測工程」を以下のとおりに変更した以外は同様に行った。
（１－２）賦活化処理工程
　脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対して、自家蛍光抑制剤として、ＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）溶液を５０ｕＬをスライドへ載せて処理した。ＰＢＳにより洗浄した後、ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。
（５）観察・計測工程
　比較例１において画像取得の前に励起光照射時間を６０秒に設定して光照射して強制褪色を行い、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例５］
　実施例４において、「（１－２）賦活化処理工程」におけるＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）溶液（自家蛍光抑制剤）を、下記化合物１－７（スルホン化ペリレン系イミド）を１％含有するＰＢＳ溶液に変更した以外は同様に行った。なお、添加量も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［実施例６］
　比較例１において、「（３）形態観察染色工程」及び「（５）観察・計測工程」を以下のとおりに変更した以外は同様に行った。
（３）形態観察染色工程
　免疫染色後、ヘマトキシリン染色（Ｈ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で１分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。染色した組織アレイスライドに対して、自家蛍光抑制剤としてＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）溶液を５０ｕＬをスライドへ載せて処理した。
（５）観察・計測工程
　比較例１において、画像取得の前に励起光照射時間を６０秒に設定して光照射して強制褪色を行い、その後、画像取得時の励起光照射時間を０．５秒に設定して撮像した。なお、画像取得前の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ２となるようにした。
［実施例７］
　実施例６において、「（３）形態観察染色工程」におけるＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）溶液（自家蛍光抑制剤）を、前記化合物１－７（スルホン化ペリレン系イミド）を１％含有するＰＢＳ溶液に変更した以外は同様に行った。なお、添加量も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記表Ｉに示すように、画像取得前の励起光照射時間を５秒以上として強制褪色を行った実施例１～７では、画像取得前の励起光照射時間が５秒未満の比較例１～３に比べて、シグナル数が多く、特に、自家蛍光抑制剤を添加することによって、Ｓ／Ｎ比が向上することが認められる。また、賦活加処理工程後に自家蛍光抑制剤を添加することでよりブロッキング効果が得られることが分かる。
　本発明は、標的物質由来の蛍光色が際立って観察でき、自家蛍光等のノイズ蛍光を低減して蛍光シグナルを正確に計測することができる画像形成方法に利用することができる。

Claims (5)

  1. 　蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、
    　組織切片に含有される標的物質が前記蛍光発光性物質で染色されてなる組織標本に、励起光を少なくとも５秒以上照射して、前記蛍光発光性物質から発せられる蛍光の少なくとも一部を強制褪色させ、又は前記蛍光発光性物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を強制褪色させて得られる強制褪色蛍光画像を取得する工程を有する画像形成方法。
  2. 　前記強制褪色蛍光画像を取得する工程前で、前記組織標本を作製する際に、前記組織切片から生じる自家蛍光を抑制する自家蛍光抑制剤を添加する工程を有する請求項１に記載の画像形成方法。
  3. 　前記自家蛍光抑制剤として、スルホン化化合物を用いる請求項２に記載の画像形成方法。
  4. 　前記スルホン化化合物として、スルホン化ペリレン系化合物を用いる請求項３に記載の画像形成方法。
  5. 　前記蛍光発光性物質が、蛍光発光性粒子である請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の画像形成方法。
PCT/JP2021/017385 2020-05-13 2021-05-06 画像形成方法 Ceased WO2021230134A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022521860A JPWO2021230134A1 (ja) 2020-05-13 2021-05-06

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020084169 2020-05-13
JP2020-084169 2020-05-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021230134A1 true WO2021230134A1 (ja) 2021-11-18

Family

ID=78525705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/017385 Ceased WO2021230134A1 (ja) 2020-05-13 2021-05-06 画像形成方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021230134A1 (ja)
WO (1) WO2021230134A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006342135A (ja) * 2005-06-10 2006-12-21 Kyushu Univ ペリレン誘導体、過酸化脂質計測用試薬及び過酸化脂質の計測方法
WO2012029269A1 (ja) * 2010-09-02 2012-03-08 国立大学法人東北大学 がん発症又はがん発症リスクの判定方法
US20180080874A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-22 University Of Houston System Blue emitting persistent phosphor compositions as diagnostic reporters
JP2018169469A (ja) * 2017-03-29 2018-11-01 Jsr株式会社 表示パネルの製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006342135A (ja) * 2005-06-10 2006-12-21 Kyushu Univ ペリレン誘導体、過酸化脂質計測用試薬及び過酸化脂質の計測方法
WO2012029269A1 (ja) * 2010-09-02 2012-03-08 国立大学法人東北大学 がん発症又はがん発症リスクの判定方法
US20180080874A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-22 University Of Houston System Blue emitting persistent phosphor compositions as diagnostic reporters
JP2018169469A (ja) * 2017-03-29 2018-11-01 Jsr株式会社 表示パネルの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIKAGE ET AL. ET AL.: "Nano-imaging of the lymph network structure with quantum dots", NANOTECHNOLOGY, vol. 21, 2010, pages 185103, XP020174849 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021230134A1 (ja) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10551386B2 (en) Biological substance detection method
EP2833140B1 (en) Method for detecting biological material
EP3124969B1 (en) Biological-material quantitation method based on multiple-antigen immunostaining
EP2966435A1 (en) Resin particles for fluorescent labels
JP6687018B2 (ja) 目的生体物質の検出方法および検出システム
JP6658330B2 (ja) 組織切片から蛍光ナノ粒子の解離を防止する方法
WO2016117054A1 (ja) 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子
EP3441761A1 (en) Fluorescent immunostaining method
JP2015059806A (ja) 蛍光標識用樹脂粒子およびその製造方法、並びに、これを含む免疫染色用蛍光標識剤
US20200165666A1 (en) Diluent for fluorescent nano particles, kit for immunofluorescent staining which utilizes same, solution for immunofluorescent staining, immunofluorescent staining method, and gene staining method
WO2017014196A1 (ja) 目的生体物質の解析方法および解析システム
EP3608669A1 (en) Fluorescent premix particles, fluorescent stain containing same, and fluorescent staining method in which these are used
WO2021230134A1 (ja) 画像形成方法
JP6583011B2 (ja) 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法
JP6645427B2 (ja) 分子標的薬を含有する標識剤
WO2022196203A1 (ja) 画像形成方法
EP3734278B1 (en) Information acquisition system
JP6398419B2 (ja) ソラフェニブを含有する標識剤
WO2017164355A1 (ja) 病理染色用粒子の製造方法、病理染色用粒子および洗浄方法
Fuenmayor Development of an immunoluminescence assay to detect Glypican 1 in urine cells, as a candidate biomarker for diagnosis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21803310

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022521860

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21803310

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1