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WO2016067956A1 - 遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンを含有するマイクロニードルデバイス - Google Patents

遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンを含有するマイクロニードルデバイス Download PDF

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WO2016067956A1
WO2016067956A1 PCT/JP2015/079462 JP2015079462W WO2016067956A1 WO 2016067956 A1 WO2016067956 A1 WO 2016067956A1 JP 2015079462 W JP2015079462 W JP 2015079462W WO 2016067956 A1 WO2016067956 A1 WO 2016067956A1
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WO
WIPO (PCT)
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mass
microneedle
fsh
stimulating hormone
arginine
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2015/079462
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English (en)
French (fr)
Inventor
真平 西村
誠治 徳本
伊藤　毅
一 浅田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Aska Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP15855242.2A priority patent/EP3213764B1/en
Priority to KR1020177014307A priority patent/KR102124690B1/ko
Priority to ES15855242T priority patent/ES2898700T3/es
Priority to JP2016556508A priority patent/JP6621754B2/ja
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    • A61M2037/0053—Methods for producing microneedles

Definitions

  • the present invention relates to a microneedle device containing a recombinant follicle stimulating hormone.
  • a microneedle device is known as one means for transdermally administering a physiologically active substance.
  • the microneedle device has a plurality of microneedles on its main surface.
  • Specific examples of the microneedle device include a microneedle formed with a coating layer containing a physiologically active substance, There are self-dissolving microneedles containing an active substance (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the present inventors When the microneedles are coated using a genetically modified follicle stimulating hormone as a physiologically active substance, the present inventors have low content uniformity of the genetically modified follicle stimulating hormone in the coating, and the microneedle device is stored. It was found that the recombinant follicle stimulating hormone easily aggregates.
  • the content uniformity of the physiologically active substance in the coating is low, absorption of the recombinant follicle stimulating hormone may not be stable when using the microneedle device, and a sufficient therapeutic effect may not be obtained.
  • an object of the present invention is to provide a microneedle device having a coating layer, which is applied so that the recombinant follicle-stimulating hormone hardly aggregates and is uniformly dispersed in the coating layer. That is.
  • the present invention is a microneedle device comprising a substrate, a microneedle disposed on the substrate, and a coating layer formed on the microneedle, the coating layer comprising a genetically modified follicle-stimulating hormone (hereinafter referred to as “recombinant follicle stimulating hormone”).
  • Arginine and glycerin in the coating layer, and the mass of arginine is 0.07 to 0.75 times the mass of FSH, preferably 0.07 to 0.00.
  • a microneedle device is provided that is 6 times and the mass of glycerin is 0.1-2.75 times the mass of FSH.
  • the coating layer contains FSH, arginine and glycerin, an effective amount of FSH can be continuously administered to the user, and the content uniformity and solubility of FSH are excellent. Hard to occur.
  • the coating layer preferably further contains an acid selected from the group consisting of citric acid, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid and lactic acid.
  • the present invention also includes a step of preparing a microneedle array having a substrate and microneedles, a step of mixing FSH, arginine and glycerin to obtain a coating composition, a step of applying the coating composition to the microneedles, A method of manufacturing a microneedle device, comprising: drying a coating composition to form a coating layer on the microneedle.
  • the mass of arginine is 0.07 to 0.75 times, preferably 0.07 to 0.6 times the mass of FSH, and the mass of glycerin is the mass of FSH. It is preferably 1 to 3 times the amount.
  • the coating composition preferably further contains an acid selected from the group consisting of citric acid, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid and lactic acid.
  • the mass of arginine is 0.07 to 0.75 times, preferably 0.07 to 0.6 times the mass of FSH, and the mass of glycerin is 0 to the mass of FSH. It is preferable to carry out the drying until it becomes 1 to 2.75 times.
  • the present invention contains FSH, arginine and glycerin.
  • the content of arginine is 0.07 to 0.75 times, preferably 0.07 to 0.6, based on the mass of FSH.
  • the coating agent for microneedles is doubled and the glycerin content is 1 to 3 times.
  • the coating agent preferably further contains an acid selected from the group consisting of citric acid, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid and lactic acid.
  • the coating layer contains FSH, arginine and glycerin, an effective amount of FSH can be continuously administered to the user, and the content uniformity and solubility of FSH can be improved. And the coating layer is less likely to drip.
  • FIG. 2 is a side cross-sectional view taken along line II-II in FIG. (A), (b) and (c) is a schematic diagram which shows one Embodiment of the manufacturing method of a microneedle device. It is a graph which shows the aggregate content rate of FSH in the coating layer of the microneedle device of one Embodiment.
  • One embodiment of the present invention is a microneedle device comprising a substrate, a microneedle disposed on the substrate, and a coating layer formed on the microneedle, wherein the coating layer includes FSH, arginine, and glycerin. Is a microneedle device.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an embodiment of a microneedle device.
  • a microneedle device 1 shown in FIG. 1 includes a substrate 2, a plurality of microneedles 3 arranged two-dimensionally on the substrate 2, and a coating layer 5 formed on the microneedles 3.
  • the coating layer 5 contains FSH, arginine, and glycerin.
  • the substrate 2 is a base for supporting the microneedles 3.
  • the area of the substrate 2 is preferably 0.5 to 10 cm 2 , more preferably 1 to 5 cm 2 , and still more preferably 1 to 3 cm 2 .
  • a plurality of substrates 2 may be connected to form a substrate having a desired size.
  • the microneedle 3 has a fine structure, and its height (length) is preferably 50 to 600 ⁇ m.
  • the administration of FSH contained in the coating layer is ensured by setting the length of the microneedle 3 to 50 ⁇ m or more.
  • the microneedle can be prevented from coming into contact with the nerve, the possibility of causing pain can be reduced, and the possibility of bleeding can be avoided. become.
  • the length of the microneedle 3 is 500 ⁇ m or less, an amount of FSH that should enter the skin can be efficiently administered, and administration can be performed without perforating the basement membrane.
  • the length of the microneedle 3 is particularly preferably 300 to 500 ⁇ m.
  • the microneedle 3 is a convex structure and means a needle shape in a broad sense or a structure including a needle shape.
  • the microneedle is not limited to a needle shape having a sharp tip, and may have a shape with no sharp tip.
  • the diameter at the base is preferably about 50 to 200 ⁇ m.
  • the microneedle 3 has a conical shape, but may be a polygonal pyramid such as a quadrangular pyramid or a microneedle having another shape.
  • the microneedles 3 are typically spaced so that there is a density of about 1-10 per millimeter (mm) per row of needles. In general, adjacent rows are separated from each other by a substantially equal distance with respect to the space of the needles in the row and have a density of 100-10000 needles per cm 2 . When there is a needle density of 100 or more, the skin can be efficiently perforated. On the other hand, when the needle density exceeds 10,000, it is difficult to maintain the strength of the microneedles 3.
  • the density of the microneedles 3 is preferably 200 to 5000, more preferably 300 to 2000, and still more preferably 400 to 850.
  • Examples of the material of the substrate 2 or the microneedle 3 include silicon, silicon dioxide, ceramic, metal (stainless steel, titanium, nickel, molybdenum, chromium, cobalt, etc.) and synthetic or natural resin materials.
  • biodegradable polymers such as polylactic acid, polyglycolide, polylactic acid-co-polyglycolide, pullulan, capronolactone, polyurethane, polyanhydride
  • non-degradable polymers such as polycarbonate, polymethacryl Synthetic or natural resin materials such as acid, ethylene vinyl acetate, polytetrafluoroethylene, and polyoxymethylene are particularly preferable.
  • polysaccharides such as hyaluronic acid, sodium hyaluronate, pullulan, dextran, dextrin or chondroitin sulfate.
  • the substrate 2 or the microneedle 3 As a manufacturing method of the substrate 2 or the microneedle 3, wet etching processing or dry etching processing using a silicon substrate, precision machining using metal or resin (electric discharge processing, laser processing, dicing processing, hot embossing processing, injection molding) Machining, etc.), machine cutting and the like. By these processing methods, the substrate 2 and the microneedles 3 are integrally molded. As a method for making the microneedle 3 hollow, there is a method in which the microneedle 3 is fabricated and then subjected to secondary processing with a laser or the like.
  • the microneedle device 1 includes a coating layer 5 on the microneedle 3, but the coating layer 5 is preferably formed by applying a coating composition. Examples of the application method include spray coating and dip coating, and dip coating is preferred.
  • the coating layer 5 is formed on all the microneedles 3, but the coating layer 5 may be formed only on a part of the plurality of microneedles 3.
  • the coating layer 5 is formed only on the tip portion of the microneedle 3, but may be formed so as to cover the entire microneedle 3. Furthermore, the coating layer 5 may be formed on the substrate 2.
  • FIG. 2 is a side sectional view taken along line II-II in FIG.
  • the microneedle device 1 includes a substrate 2, a microneedle 3 provided on the substrate 2, and a coating layer 5 formed on the microneedle 3.
  • the coating layer 5 formed on the microneedles contains FSH, arginine and glycerin.
  • the mass of arginine contained in the coating layer is preferably 0.07 to 0.75 times, more preferably 0.07 to 0.6 times, and more preferably 0.07 to 0.6 times the mass of FSH.
  • the ratio is more preferably 0.3 times, and particularly preferably 0.08 to 0.15 times.
  • the lower limit of the mass of glycerin contained in the coating layer is preferably 0.1 times the mass of FSH, more preferably 0.25 times, and even more preferably 0.5 times. preferable.
  • the upper limit of the mass of glycerin contained in the coating layer is preferably 2.75 times, more preferably 1.6 times, and further preferably 1 times the mass of FSH. preferable.
  • the glycerin content is 40% by mass or less based on the mass of the entire coating layer, it is preferable because liquid dripping hardly occurs.
  • the coating layer can be formed using, for example, a coating composition containing FSH, arginine and glycerin.
  • a coating composition containing FSH, arginine, and glycerin When the coating layer contains FSH, arginine, and glycerin, deterioration with time of the coating layer during application of the coating composition or storage of the microneedle device can be further suppressed.
  • the genetically modified follicle-stimulating hormone of the present invention is a glycoprotein produced by gonadotroph of the anterior pituitary gland, and is a genetically modified form of follicle-stimulating hormone, which is a kind of gonadal stimulating hormone (gonadotropin).
  • gonadotropin gonadal stimulating hormone
  • FSH is a heterodimeric glycoprotein consisting of ⁇ - and ⁇ -chains linked by non-covalent bonds, similar to the natural follicle-stimulating hormone, and both ⁇ and ⁇ chains are glycated or glycosylated.
  • the ⁇ -subunit consists of 92 amino acid residues and the ⁇ -subunit consists of 111 amino acid residues, each of which has a glycosylation site attached to two potential asparagines.
  • FSH for example, recombinant human FSH-producing cells prepared by transfecting mammalian cells with an expression vector incorporating human FSH ⁇ -chain cDNA and an expression vector incorporating human FSH ⁇ -chain cDNA are cultured in a serum-free medium.
  • FSH can be secreted into the culture solution and purified from the culture solution.
  • FSH FSH
  • recombinant human FSH-producing cells are removed from the culture, and then cation exchange column chromatography, dye affinity column chromatography, reverse phase column chromatography, phenyl sepharose column chromatography or gel filtration column chromatography.
  • cation exchange column chromatography dye affinity column chromatography
  • reverse phase column chromatography phenyl sepharose column chromatography
  • gel filtration column chromatography gel filtration column chromatography
  • the purified FSH was subjected to SDS-PAGE electrophoresis under non-reducing and non-heating conditions, and then the gel was coomassie stained to recognize a single band with a molecular weight of about 45 kDa. This band was obtained using an anti-human FSH antibody. Stained by Western blotting.
  • the purified FSH is analyzed by isoelectric focusing, and a plurality of bands are observed at pI (isoelectric point) 3.5 to 5.5.
  • the use of the microneedle device of the present embodiment is effective in treating anovulation or rare ovulation associated with hypothalamic-pituitary dysfunction or polycystic ovary syndrome, or infertility.
  • the content of FSH is preferably 21 to 39% by mass, more preferably 29 to 37% by mass, and more preferably 30 to 35% by mass, based on the mass of the entire coating composition. More preferably it is.
  • the content of FSH is 21% by mass or more, the pharmacological action of FSH is sufficiently exerted, and a desired therapeutic effect is easily achieved.
  • the coating composition further contains arginine, FSH aggregates are hardly generated in the coating composition after application.
  • the amount of FSH that can contribute to the treatment decreases, and it becomes difficult to obtain a desired therapeutic effect.
  • the content of arginine is preferably 0.07 to 0.75 times, preferably 0.07 to 0.6 times, based on the mass of FSH contained in the coating composition. More preferably, it is 0.07 to 0.3 times, more preferably 0.08 to 0.15 times.
  • the content of arginine is 0.07 times or more based on the mass of FSH, it becomes difficult to produce FSH aggregates in the coating composition or the coating layer.
  • the solubility with respect to the coating composition of FSH improves more that content of arginine is 0.75 times or less, especially 0.6 times or less.
  • the coating composition contains glycerin
  • the FSH content uniformity when the coating composition is applied to the microneedles is improved.
  • FSH is stably released from the coating layer, and a desired therapeutic effect can be continuously exhibited.
  • glycerin has high solubility of FSH and is suitable as a component of the coating composition.
  • the glycerin content is preferably 1 to 3 times, more preferably 1 to 2.75 times, more preferably 1 to 1 times based on the mass of FSH contained in the coating composition.
  • the ratio is more preferably 8 times, particularly preferably 1 to 1.2 times.
  • the coating composition preferably contains an acid selected from the group consisting of citric acid, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid and lactic acid.
  • the coating composition more preferably contains citric acid.
  • the coating composition containing citric acid, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid or lactic acid tends to suppress the formation of FSH aggregates more than the coating composition containing hydrochloric acid, sulfuric acid or acetic acid.
  • the content of the acid is preferably 1 to 6% by mass, more preferably 1 to 3.5% by mass, and more preferably 1 to 2% by mass based on the mass of the entire coating composition. Further preferred.
  • the acid content is preferably 0.2 to 0.6 times, more preferably 0.3 to 0.6 times the mass of arginine contained in the coating composition, More preferably, it is 0.3 to 0.4 times.
  • the coating composition may contain other components such as a solvent, a polymer carrier (viscosity imparting agent), a solubilizer, an absorption accelerator, a stabilizer, an antioxidant, an emulsifier, a surfactant, and salts as necessary. Furthermore, you may contain.
  • a solvent include water such as purified water and distilled water, and alcohols such as methanol and ethanol.
  • the coating composition contains a solvent
  • the solvent is removed in the drying step, so the composition ratio of the components in the coating composition is not reflected in the coating layer.
  • the coating layer is formed by drying the coating composition applied on the microneedle.
  • the solvent contained in the coating composition is removed, and glycerin is evaporated, so that the content of glycerin can be reduced.
  • Glycerin itself does not become a solid, for example, under reduced pressure drying at room temperature.
  • the weight average molecular weight of polyethylene glycol used as the polymer carrier is preferably more than 600 and 500,000 or less.
  • a carrier having high compatibility with the physiologically active substance (properly intersecting property) is preferable, and hydroxypropyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, pullulan and the like are particularly preferable.
  • the content of the polymer carrier in the coating composition 10 is 0.005 to 30% by mass, preferably 0.01 to 20% by mass, more preferably 0, based on the total mass of the coating composition 10. .05 to 10% by mass.
  • this polymer carrier may require a certain degree of viscosity so as not to sag, and the viscosity is preferably 100 to 100,000 mPa ⁇ s at room temperature (25 ° C.). A more preferable viscosity is 500 to 60000 mPa ⁇ s.
  • the coating composition 10 may contain propylene carbonate, crotamiton, L-menthol, mint oil, limonene, diisopropyl adipate, etc. as a solubilizing agent or absorption accelerator, as needed, and methyl salicylate as a medicinal aid.
  • a solubilizing agent or absorption accelerator as needed
  • methyl salicylate as a medicinal aid.
  • Salicylic acid glycol, L-menthol, thymol, mint oil, nonylic acid vanillylamide, pepper extract and the like may be added.
  • any of a nonionic surfactant and an ionic surfactant may be used, but from the viewpoint of safety, a nonionic surfactant usually used for a pharmaceutical base is desirable.
  • these compounds include sugar alcohol fatty acid esters such as sucrose fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene glycerin fatty acid esters, polyethylene glycol fatty acid esters, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene Examples include oxyethylene hydrogenated castor oil.
  • the method for producing a microneedle device includes a step of preparing a microneedle array having a substrate and microneedles, a step of obtaining a coating composition by mixing FSH, arginine and glycerin, and a step of applying the coating composition to the microneedles And drying the coating composition to form a coating layer on the microneedles.
  • the drying conditions for forming the coating layer are as follows.
  • the mass of arginine is 0.07 to 0.75 times, preferably 0.07 to 0.6 times the mass of FSH, and Drying is preferably performed until the mass of glycerin is 0.1 to 2.75 times the mass of FSH.
  • the lower limit of the mass of glycerin in the coating layer is preferably 0.1 times, more preferably 0.25 times, and more preferably 0.5 times the mass of FSH. preferable.
  • the upper limit of the mass of glycerin in the coating layer is preferably 2.75 times, more preferably 1.6 times, and even more preferably 1 times the mass of FSH.
  • drying conditions can be suitably adjusted for the degree of vacuum, temperature, and time, and are preferably performed so that the masses of arginine and glycerin fall within the above ranges.
  • drying conditions for example, the drying can be performed under conditions of 0 to 40 ° C. and 1 to 100 hours at a degree of vacuum of 1 to 100 Pa. Is preferred. More specifically, for example, the drying conditions are room temperature and 10 Pa.
  • the manufacturing method shown in FIG. 3 is also referred to as “immersion method using a mask plate”.
  • FIGS. 3A, 3B and 3C are schematic views showing an embodiment of a method for manufacturing the microneedle device 1.
  • FIG. 3A the coating composition 10 is swept in the direction of arrow A with a spatula 12 on a mask plate 11.
  • the opening 13 is filled with the coating composition 10.
  • FIG. 3B the microneedle 3 is inserted into the opening 13 of the mask plate 11.
  • FIG. 3C the microneedle 3 is pulled out from the opening 13 of the mask plate 11.
  • the coating composition 10 may be attached on the substrate 2.
  • the volatile components of the coating composition 10 on the microneedles 3 are removed by a method such as air drying, vacuum drying, or a combination thereof.
  • the coating layer 5 adheres firmly on the microneedle 3 and typically becomes vitreous or solid, and the microneedle device 1 is manufactured.
  • the water content of the coating layer 5 is usually 55% by mass or less, preferably 30% by mass or less, more preferably 10% by mass or less based on the total amount of the coating layer 5. According to the above method, dripping of the applied coating composition 10 is prevented, but dripping refers to dripping of the coating composition from the tip of the needle, and in FIG. Means that.
  • the height H of the coating layer 5 formed on the microneedle 3 is adjusted by a clearance (gap) C shown in FIG.
  • This clearance C is defined by the distance from the base of the microneedle 3 to the surface of the mask plate 11 (the thickness of the substrate 2 is not involved), and is set according to the tension of the mask plate 11 and the length of the microneedle 3.
  • the distance range of the clearance C is preferably 0 to 500 ⁇ m. That is, when the distance of the clearance C is 0, it means that the coating composition 10 is applied to the entire microneedle 3.
  • the height H of the coating composition 10 formed on the microneedles 3 can vary depending on the height of the microneedles 3, but is usually 10 to 500 ⁇ m, preferably 30 to 300 ⁇ m, more preferably 40 to 250 ⁇ m.
  • the FSH is concentrated on a part of the microneedle, that is, the tip part of the needle.
  • it is preferably present on the average from the tip of the microneedle 3 to 200 ⁇ m, more preferably to 150 ⁇ m, more preferably to 120 ⁇ m More preferably, it is made.
  • the coating layer 5 is easily formed on a part of the microneedles.
  • the coating composition 10 deposited on the microneedle 3 by such a method forms a coating layer 5 that is preferably substantially spherical or teardrop-shaped at the tip of the microneedle 3 after the volatile components are removed.
  • the microneedle 3 is punctured into the skin, it is inserted into the skin at the same time.
  • the thickness of the coating layer 5 after drying is preferably less than 50 ⁇ m, more preferably less than 40 ⁇ m, and even more preferably 1 to 30 ⁇ m. In general, the thickness of the coating layer 5 is an average thickness measured over the surface of the microneedle 3 after drying.
  • the thickness of the coating layer 5 can be arbitrarily increased by applying a plurality of coatings of the coating composition 10, that is, by repeating the step of applying the coating composition 10.
  • the temperature and humidity of the installation environment of the apparatus are preferably controlled to be constant.
  • the coating composition 10 contains water, it can also be filled with water as needed. Thereby, transpiration of water in the coating composition 10 can be prevented as much as possible.
  • the formation of aggregates can be suppressed.
  • the evaluation of the aggregate content can be performed by separating the coating composition using chromatography and calculating the aggregate content from the peak area.
  • As an evaluation method of the aggregate content for example, using a phosphate buffer containing 0.01% polysorbate 80, after extracting from the coating composition applied to the microneedles, using size exclusion chromatography, The obtained extract is separated, and the protein contained in the fraction having a shorter retention time than FSH is evaluated as an aggregate.
  • the method for applying the micro needle device of the present invention for treatment includes, for example, a method of causing the microneedle device to collide or press against the skin surface of the user using the apparatus described in WO2014 / 097837. . Specifically, at least a part of the tip of the micro needle is pierced into the skin, and the genetically modified FSH can be absorbed into the body of the user from the coating in the pierced part of the microneedle. It becomes a state. Thereafter, after maintaining a state where the genetically modified FSH can be absorbed into the body of the user, the microneedle device is removed from the skin surface.
  • the time (puncture time) for maintaining the state in which the micro needle is penetrated into the skin may be within 10 minutes, within 1 minute, within 30 seconds or within 10 seconds, and may be over 0.5 seconds. . From the viewpoint of reducing the burden on the user, the puncture time is preferably shorter. The longer the puncture time, the greater the risk that the micro needle will damage the dermal tissue or cause a trace amount of bleeding in the skin.
  • a microneedle device comprising a coating layer formed by applying a composition containing genetically modified FSH (30 to 600 IU) to the tip of a microneedle is applied to the above-described method (for example, puncture time).
  • a method of administering recombinant FSH comprises applying to the skin of the user in 0.5 seconds to 1 minute).
  • the time (Tmax) from the application of the microneedle device to the maximum concentration of FSH in plasma is, for example, about 3 to 8 hours. Considering that endogenous hormones are physiologically released in the form of pulses, if Tmax is within the above range, the microneedle device is likely to exhibit the expected medicinal effects and hardly cause side effects. Conceivable.
  • (1) Content uniformity test 1 The coating agents of Reference Examples 1 to 3 prepared according to the description in Table 1 were applied to the microneedles. In addition, the number in Table 1 means the mass% with respect to the whole coating agent. Next, Reference Examples 1 and 2 were applied to 10 sheets under a condition of about 40% RH, and Reference Example 3 was applied to 20 sheets under a condition of 90% RH. Each coating agent applied to the microneedles was collected, and the content of genetically modified follicle stimulating hormone (hereinafter also simply referred to as “FSH”) in each coating agent was measured. The average value of the obtained FSH content, the standard deviation SD, and the coefficient of variation CV were calculated. The coefficient of variation CV is a value obtained by dividing the standard deviation by the average value.
  • FSH genetically modified follicle stimulating hormone
  • Example 1 using arginine + citric acid was excellent in suppressing the formation of FSH aggregates.
  • Liquid Drip Suppression Test According to the description in Table 8, FSH, glycerin, arginine, citric acid and purified water were mixed to prepare coating compositions of Examples 14 to 16 and Reference Example 13. About the obtained coating composition, the presence or absence of the insoluble matter was observed visually. The case where no insoluble material was present was evaluated as “ ⁇ ”, and the case where an insoluble material was present was evaluated as “x”. Moreover, the obtained coating composition was applied to the tip of the microneedle of the microneedle array by an immersion method using a mask plate, and the microneedle array was dried under reduced pressure to obtain a microneedle device.
  • Example 17 Effect of drying After coating the coating composition of Example 17 on microneedles, the contents of FSH, arginine, glycerin and citric acid in the coating composition before drying under reduced pressure were measured by gas chromatography. . Next, after drying under reduced pressure at room temperature and 10 Pa, the contents of FSH, arginine, glycerin and citric acid in the coating layer were similarly measured by a gas chromatography method. In addition, the coating composition of Example 17 was obtained by mixing FSH, glycerin, arginine, citric acid and water at the ratio before drying under reduced pressure in Table 10.
  • Example 20 The coating agent of Example 20 was prepared according to the description in Table 13. The obtained coating agent was applied to the tip of the microneedle of the microneedle array by an immersion method using a mask plate, and the microneedle array was dried under reduced pressure. Next, after the obtained microneedle device was packaged and stored at 40 ° C. for 2 weeks, the aggregate content was evaluated. The aggregate content rate was evaluated in the same manner as in the aggregation test 1, and no protein was contained in the fraction having a longer retention time than FSH.
  • the coating agent of Example 20 had an aggregate content of 3.8% even after being stored at 40 ° C. for 2 weeks.
  • microneedle device After applying a coating agent prepared by mixing 100 parts by mass of glycerin, 10 parts by mass of arginine and 100 parts by mass of other components to 100 parts by mass of FSH, on the tip of the microneedle And dried to obtain a microneedle device. Using the application device, the resulting microneedle device was applied to the skin of the user. At this time, the puncture time was set to 10 seconds. The blood of the recipient was collected over time, and the concentration of FSH in plasma was measured.
  • the time (Tmax) required for the maximum concentration of FSH in plasma was about 8 hours.

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Abstract

　本発明は、基板と、基板上に配置されたマイクロニードルと、マイクロニードル上に形成されたコーティング層と、を備えるマイクロニードルデバイスであって、コーティング層は、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン、アルギニン及びグリセリンを含有し、コーティング層において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．７５倍であり、グリセリンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．１～２．７５倍である、マイクロニードルデバイスを提供する。

Description

遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンを含有するマイクロニードルデバイス
　本発明は、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンを含有するマイクロニードルデバイスに関する。
　生理活性物質を経皮投与する手段の一つとして、マイクロニードルデバイスが知られている。マイクロニードルデバイスは、その主要面上に複数のマイクロニードルを有しており、その具体的な態様としては、例えば、マイクロニードル上に生理活性物質を含有するコーティング層を形成させたものや、生理活性物質を内包する自己溶解型マイクロニードルがある（例えば、特許文献１，２）。
特表２００８－５２８５０９号公報 特表２０１４－５０７４７３号公報
　本発明者らは、生理活性物質として遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンを用いて、マイクロニードルをコーティングした場合に、コーティングにおける遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの含量均一性が低く、マイクロニードルデバイスの保存中に遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンが凝集しやすいことを見出した。
　コーティング中の生理活性物質の含量均一性が低いと、マイクロニードルデバイス使用時に遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの吸収が安定せず、充分な治療効果が得られない場合がある。
　したがって、本発明の目的は、コーティング層を有するマイクロニードルデバイスであって、コーティング層中に遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンが凝集しにくく、均一に分散するように塗布されたマイクロニードルデバイスを提供することである。
　本発明は、基板と、基板上に配置されたマイクロニードルと、マイクロニードル上に形成されたコーティング層と、を備えるマイクロニードルデバイスであって、コーティング層は、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン（以下、単に「ＦＳＨ」ともいう。）、アルギニン及びグリセリンを含有し、上記コーティング層において、アルギニンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．０７～０．７５倍、好ましくは０．０７～０．６倍であり、グリセリンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．１～２．７５倍である、マイクロニードルデバイスを提供する。
　上記コーティング層がＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有することにより、使用者に有効量のＦＳＨを持続的に投与することができ、ＦＳＨの含量均一性及び溶解性にも優れ、コーティング層の液ダレも生じにくい。
　上記コーティング層は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有することが好ましい。
　また、本発明は、基板及びマイクロニードルを有するマイクロニードルアレイを準備する工程と、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを混合してコーティング組成物を得る工程と、マイクロニードルにコーティング組成物を塗布する工程と、コーティング組成物を乾燥させてマイクロニードル上にコーティング層を形成する工程と、を備える、マイクロニードルデバイスの製造方法を提供する。
　上記製造方法におけるコーティング組成物では、アルギニンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．０７～０．７５倍、好ましくは０．０７～０．６倍であり、グリセリンの質量が、ＦＳＨの質量に対して１～３倍であることが好ましい。
　上記コーティング組成物は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有することが好ましい。
　上記コーティング層において、アルギニンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．０７～０．７５倍、好ましくは０．０７～０．６倍となり、かつグリセリンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．１～２．７５倍となるまで乾燥を行うことが好ましい。
　さらに、本発明は、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有し、上記コーティング剤において、ＦＳＨの質量を基準として、アルギニンの含有量が０．０７～０．７５倍、好ましくは０．０７～０．６倍であり、かつグリセリンの含有量が１～３倍である、マイクロニードル用コーティング剤を提供する。
　上記コーティング剤は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有することが好ましい。
　本発明のマイクロニードルデバイスによれば、コーティング層がＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有することにより、使用者に有効量のＦＳＨを持続的に投与することができ、ＦＳＨの含量均一性及び溶解性にも優れ、コーティング層の液ダレも生じにくい。
マイクロニードルデバイスの一実施形態を示す斜視図である。 図１のＩＩ－ＩＩ線に沿った側面断面図である。 （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、マイクロニードルデバイスの製造方法の一実施形態を示す模式図である。 一実施形態のマイクロニードルデバイスのコーティング層におけるＦＳＨの凝集体含有率を示すグラフである。
　以下、図面を参照しながら、好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面は理解を容易にするため一部を誇張して描いており、寸法比率は説明のものとは必ずしも一致しない。
　本発明の一実施形態は、基板と、基板上に配置されたマイクロニードルと、マイクロニードル上に形成されたコーティング層と、を備えるマイクロニードルデバイスであって、コーティング層は、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有する、マイクロニードルデバイスである。
　図１は、マイクロニードルデバイスの一実施形態を示す斜視図である。図１に示すマイクロニードルデバイス１は、基板２と、基板２上に二次元状に配置された複数のマイクロニードル３と、マイクロニードル３上に形成されたコーティング層５とを備えている。コーティング層５は、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有するものである。
　基板２は、マイクロニードル３を支持するための土台である。基板２の面積は、０．５～１０ｃｍ２であることが好ましく、より好ましくは１～５ｃｍ２、さらに好ましくは１～３ｃｍ２である。この基板２を複数個つなげることで所望の大きさの基板を構成するようにしてもよい。
　マイクロニードル３は微小構造であり、その高さ（長さ）は、好ましくは５０～６００μｍである。ここで、マイクロニードル３の長さを５０μｍ以上とすることにより、コーティング層に含まれるＦＳＨの投与が確実になる。また、マイクロニードル３の長さを６００μｍ以下とすることにより、マイクロニードルが神経に接触するのを回避して、痛みを生じる可能性を減少させるとともに、出血の可能性を回避することができるようになる。また、マイクロニードル３の長さが５００μｍ以下であると、皮内に入るべき量のＦＳＨを効率良く投与することができ、基底膜を穿孔させずに投与することも可能である。マイクロニードル３の長さは、３００～５００μｍであることが特に好ましい。
　ここで、マイクロニードル３とは、凸状構造物であって、広い意味での針形状、又は針形状を含む構造物を意味する。もっとも、マイクロニードルは、鋭い先端を有する針形状のものに限定されるものではなく、先の尖っていない形状のものであってもよい。マイクロニードル３が円錐状構造である場合には、その基底における直径は５０～２００μｍ程度であることが好ましい。本実施形態ではマイクロニードル３は円錐形であるが、四角錐形などの多角錐形や、別の形状のマイクロニードルであってもよい。
　マイクロニードル３は、典型的には、針の横列について１ミリメートル（ｍｍ）当たり約１～１０本の密度となるように間隔を空けて設けられる。一般に、隣接する横列は横列内の針の空間に対して実質的に等しい距離だけ互いに離れており、１ｃｍ２当たり１００～１００００本の針密度を有する。１００本以上の針密度があると、効率良く皮膚を穿孔することができる。一方、１００００本を超える針密度では、マイクロニードル３の強度を保つことが難しくなる。マイクロニードル３の密度は、好ましくは２００～５０００本、より好ましくは３００～２０００本、さらに好ましくは４００～８５０本である。
　基板２又はマイクロニードル３の材質としては、シリコン、二酸化ケイ素、セラミック、金属（ステンレス、チタン、ニッケル、モリブテン、クロム、コバルト等）及び合成又は天然の樹脂素材等が挙げられるが、マイクロニードルの抗原性及び材質の単価を考慮すると、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸－ｃｏ－ポリグリコリド、プルラン、カプロノラクトン、ポリウレタン、ポリ無水物等の生分解性ポリマーや、非分解性ポリマーであるポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオキシメチレン等の合成又は天然の樹脂素材が特に好ましい。また、多糖類であるヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、プルラン、デキストラン、デキストリン又はコンドロイチン硫酸等も好適である。
　基板２又はマイクロニードル３の製造方法としては、シリコン基板を用いたウエットエッチング加工又はドライエッチング加工、金属若しくは樹脂を用いた精密機械加工（放電加工、レーザー加工、ダイシング加工、ホットエンボス加工、射出成型加工等）、機械切削加工等が挙げられる。これらの加工法により、基板２とマイクロニードル３は一体に成型される。マイクロニードル３を中空にする方法としては、マイクロニードル３を作製後、レーザー等で２次加工する方法が挙げられる。
　マイクロニードルデバイス１は、マイクロニードル３上にコーティング層５を備えているが、コーティング層５は、コーティング組成物を塗布することにより形成されることが好ましい。塗布方法としては、噴霧コーティング及び浸漬コーティング等が挙げられ、浸漬コーティングが好ましい。なお、図１では、全てのマイクロニードル３にコーティング層５が形成されているが、コーティング層５は複数存在するマイクロニードル３の一部のみに形成されていてもよい。図１ではまた、コーティング層５はマイクロニードル３の先端部分だけに形成されているが、マイクロニードル３の全体を覆うように形成されていてもよい。さらには、コーティング層５は基板２の上に形成されていてもよい。
　図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線に沿った側面断面図である。図２に示すように、マイクロニードルデバイス１は、基板２と、基板２上に設けられたマイクロニードル３と、マイクロニードル３上に形成されたコーティング層５と、を備えている。マイクロニードル上に形成されているコーティング層５は、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有する。
　コーティング層に含有されるアルギニンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．０７～０．７５倍であることが好ましく、０．０７～０．６倍であることがより好ましく、０．０７～０．３倍であることがさらに好ましく、０．０８～０．１５倍であることが特に好ましい。
　コーティング層に含有されるグリセリンの質量の下限値は、ＦＳＨの質量に対して０．１倍であることが好ましく、０．２５倍であることがより好ましく、０．５倍であることがさらに好ましい。また、コーティング層に含有されるグリセリンの質量の上限値は、ＦＳＨの質量に対して２．７５倍であることが好ましく、１．６倍であることがより好ましく、１倍であることがさらに好ましい。
　また、コーティング層全体の質量を基準として、グリセリン含有量が４０質量％以下であると、液ダレが生じにくい点から好ましい。
　コーティング層は、例えば、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有するコーティング組成物を用いて形成することができる。コーティング層がＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを含有することにより、コーティング組成物の塗布時またはマイクロニードルデバイスの保存時におけるコーティング層の経時劣化をより抑制することができる。
　本願発明の遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンは、下垂体前葉のゴナドトロフで作られる糖タンパクであり、性腺刺激ホルモン（ゴナドトロピン）の一種である卵胞刺激ホルモンの遺伝子組換型である。男性では、ＦＳＨは睾丸の精細管成長を促進し、精子の形成を維持する。女性では、ＦＳＨは卵巣の卵胞発育を促進する。
　ＦＳＨの構造は天然型の卵胞刺激ホルモンと同様に、非共有結合により結合されたα鎖とβ鎖から成るヘテロダイマー糖タンパク質であり、α鎖とβ鎖はいずれも糖化すなわちグリコシル化されている。α－サブユニットは９２個のアミノ酸残基からなり、β－サブユニットは１１１個のアミノ酸残基からなり、その各々は２つの潜在的なアスパラギンに結合されるグリコシル化部位を有する。
　ＦＳＨは、例えば、ヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター及びヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトして作成した組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞を無血清培地中で培養することにより、培養液中にＦＳＨを分泌させ、該培養液から精製することにより得ることができる。
　ＦＳＨの精製は、該培養液から組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞を除いたのち、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、色素アフィニティーカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーまたはゲルろ過カラムクロマトグラフィーを組み合わせて用いることで、ＦＳＨ活性画分を回収することにより行われ、極めて純度の高いＦＳＨを得ることができる（例えば、特許第２５２３８４３号公報、特開２００１－３２３０００号公報および特開２００９－２７３４２７号公報など）。得られたＦＳＨは、無血清培地を用いて組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞を培養することから、ウイルスの混入を防止することができるため、高い有用性を有する。
　精製されたＦＳＨは非還元・非加熱条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動をした後、ゲルをクマジー染色することにより分子量約４５ｋＤａに単一バンドが認められ、このバンドは抗ヒトＦＳＨ抗体を用いたウェスタンブロッティングで染色される。
　また、精製されたＦＳＨは等電点電気泳動で分析することにより、ｐＩ（等電点）３．５～５．５に複数のバンドを認める。
　ＦＳＨを投与することにより、視床下部－下垂体機能障害または多嚢胞性卵巣症候群に伴う無排卵または希発排卵における排卵誘発作用を示す。したがって、本実施形態のマイクロニードルデバイスを使用することにより、視床下部－下垂体機能障害もしくは多嚢胞性卵巣症候群に伴う無排卵もしくは希発排卵、または不妊症の治療に効果的である。
　コーティング組成物において、ＦＳＨの含有量は、コーティング組成物全体の質量を基準として、２１～３９質量％であることが好ましく、２９～３７質量％であることがより好ましく、３０～３５質量％であることがさらに好ましい。ＦＳＨの含有量が２１質量％以上であると、ＦＳＨの薬理作用が充分に発揮され、所望の治療効果を奏しやすい。
　また、コーティング組成物がさらにアルギニンを配合することにより、塗布後のコーティング組成物中において、ＦＳＨの凝集体が生じにくくなる。ＦＳＨの凝集体が生じると、治療に寄与しうるＦＳＨの量が低下し、所望の治療効果が得られにくくなる。
　コーティング組成物において、アルギニンの含有量は、コーティング組成物に含まれるＦＳＨの質量を基準として、０．０７～０．７５倍であることが好ましく、０．０７～０．６倍であることがより好ましく、０．０７～０．３倍であることがさらに好ましく、０．０８～０．１５倍であることが特に好ましい。アルギニンの含有量が、ＦＳＨの質量を基準として０．０７倍以上であると、コーティング組成物中またはコーティング層中においてＦＳＨの凝集体が生成しにくくなる。また、アルギニンの含有量が０．７５倍以下、特に０．６倍以下であると、ＦＳＨのコーティング組成物に対する溶解性がより向上する。
　コーティング組成物がグリセリンを含有することにより、コーティング組成物をマイクロニードルに塗布した際のＦＳＨの含量均一性が改善する。ＦＳＨの含量均一性が改善することにより、当該マイクロニードルデバイスの使用時に、コーティング層からＦＳＨが安定的に放出され、所望の治療効果を持続的に発揮できる。また、グリセリンはＦＳＨの溶解性が高く、コーティング組成物の成分として好適である。
　コーティング組成物において、グリセリンの含有量は、コーティング組成物に含まれるＦＳＨの質量を基準として、１～３倍であることが好ましく、１～２．７５倍であることがより好ましく、１～１．８倍であることがさらに好ましく、１～１．２倍であることが特に好ましい。グリセリンの含有量が、ＦＳＨの質量を基準として１倍以上であると、コーティング層におけるＦＳＨの含量均一性及び溶解性がさらに優れ、マイクロニードルに塗布した際に液ダレが生じにくい点からより好ましい。
　さらに、コーティング組成物は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸を含有することが好ましい。特に、コーティング組成物は、クエン酸を含有することがより好ましい。コーティング組成物が特定の酸を含有することにより、ＦＳＨの凝集体の生成がさらに抑制される傾向がある。
　クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸または乳酸を含有するコーティング組成物は、塩酸、硫酸または酢酸を含有するコーティング組成物と比べて、ＦＳＨの凝集体の生成がより抑制される傾向がある。
　酸の含有量は、コーティング組成物全体の質量を基準として、１～６質量％であることが好ましく、１～３．５質量％であることがより好ましく、１～２質量％であることがさらに好ましい。
　また、酸の含有量は、コーティング組成物に含まれるアルギニンの質量に対して、０．２～０．６倍であることが好ましく、０．３～０．６倍であることがより好ましく、０．３～０．４倍であることがさらに好ましい。
　コーティング組成物は、必要に応じて、溶剤、高分子担体（粘度付与剤）、溶解補助剤、吸収促進剤、安定化剤、抗酸化剤、乳化剤、界面活性剤、塩類等のその他の成分をさらに含有してもよい。溶剤としては、例えば、精製水、蒸留水等の水、メタノール、エタノール等のアルコールが挙げられる。コーティング組成物が溶剤を含有することにより、マイクロニードルに塗布する際の取り扱い性を向上することができ、乾燥工程によって容易に除去することができる。
　コーティング組成物が溶剤を含有する場合には、乾燥工程において溶剤が除去されるため、コーティング組成物中の成分の組成比がコーティング層に反映されるわけではない。
　すなわち、マイクロニードルデバイスを製造する際に、マイクロニードル上に塗布されたコーティング組成物を乾燥させることで、コーティング層を形成させる。乾燥工程において、コーティング組成物中に含まれる溶剤が除去されるとともに、グリセリンが蒸発し、グリセリンの含有量が低下しうる。グリセリン自体は、例えば、常温における減圧乾燥においては固体となることはない。
　高分子担体としては、ポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、アラビアゴム等が挙げられる。なお、高分子担体として用いられるポリエチレングリコールの重量平均分子量は、６００を超え、５０００００以下であることが好ましい。高分子担体としては、生理活性物質と相溶性（均一に交わる性質）の高い担体が好ましく、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、プルランなどが特に好ましい。
　コーティング組成物１０の高分子担体の含有量は、コーティング組成物１０の全質量を基準として、０．００５～３０質量％であり、好ましくは０．０１～２０質量％であり、より好ましくは０．０５～１０質量％である。また、この高分子担体は、液ダレすることのないようある程度の粘性が必要である場合があり、粘度として室温（２５℃）で１００～１０００００ｍＰａ・ｓであることが好ましい。より好ましい粘度は、５００～６００００ｍＰａ・ｓである。
　上記の他、コーティング組成物１０には、必要に応じて溶解補助剤又は吸収促進剤として、炭酸プロピレン、クロタミトン、Ｌ－メントール、ハッカ油、リモネン、ジイソプロピルアジペート等や、薬効補助剤として、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、Ｌ－メントール、チモール、ハッカ油、ノニル酸ワニリルアミド、トウガラシエキス等が添加されていてもよい。
　界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、イオン界面活性剤（カチオン、アニオン、両性）のいずれでもよいが、安全性の面から通常医薬品基剤に用いられる非イオン界面活性剤が望ましい。これらの化合物としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステルなどの糖アルコール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が挙げられる。
　マイクロニードルデバイスの製造方法は、基板及びマイクロニードルを有するマイクロニードルアレイを準備する工程と、ＦＳＨ、アルギニン及びグリセリンを混合してコーティング組成物を得る工程と、マイクロニードルにコーティング組成物を塗布する工程と、コーティング組成物を乾燥させてマイクロニードル上にコーティング層を形成する工程と、を備える。
　コーティング層を形成する際の乾燥条件としては、上記コーティング層において、アルギニンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．０７～０．７５倍、好ましくは０．０７～０．６倍となり、かつグリセリンの質量が、ＦＳＨの質量に対して０．１～２．７５倍となるまで乾燥を行うことが好ましい。なお、コーティング層におけるグリセリンの質量の下限値は、ＦＳＨの質量に対して、０．１倍であることが好ましく、０．２５倍であることがより好ましく、０．５倍であることがさらに好ましい。また、コーティング層におけるグリセリンの質量の上限値は、ＦＳＨの質量に対して、２．７５倍であることが好ましく、１．６倍であることがより好ましく、１倍であることがさらに好ましい。
　このような乾燥条件は、減圧度、温度、時間を適宜調整することができ、アルギニン及びグリセリンの質量が上記範囲となるように行うことが好ましい。乾燥条件としては、例えば、減圧度１～１００Ｐａにて、０～４０℃、１～１００時間の条件で行うことができ、減圧度５～２０Ｐａ、室温、１０～５０時間の条件で乾燥することが好ましい。より具体的には、例えば、乾燥条件は、室温、１０Ｐａの条件である。
　次に、図３を用いて、マイクロニードルデバイスの製造方法を説明する。なお、本明細書において、図３に示す製造方法を「マスク版を用いた浸漬法」ともいう。
　図３（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、マイクロニードルデバイス１の製造方法の一実施形態を示す模式図である。この方法では、まず、図３（ａ）に示すように、コーティング組成物１０をマスク版１１上でヘラ１２により矢印Ａ方向に掃引する。これにより、開口部１３にコーティング組成物１０が充填される。続いて、図３（ｂ）に示すように、マスク版１１の開口部１３にマイクロニードル３を挿入する。その後、図３（ｃ）に示すように、マスク版１１の開口部１３からマイクロニードル３を引き出す。これにより、マイクロニードル３上にコーティング組成物１０を付着させる。なお、コーティング組成物１０は基板２上に付着させてもよい。その後、風乾、真空乾燥、又はそれらの組み合わせ等の方法により、マイクロニードル３上のコーティング組成物１０の揮発成分を除去する。これにより、マイクロニードル３上にコーティング層５が強固に付着し、典型的にはガラス質又は固形状になり、マイクロニードルデバイス１が製造される。コーティング層５の水分含有量は通常、コーティング層５の全量基準で５５質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。上記方法により、塗布されたコーティング組成物１０の液ダレが防止されるが、液ダレとは、針先からコーティング組成物が垂れてくることを指し、図３（ｃ）ではＨ部分が長くなることを意味する。
　マイクロニードル３上に形成されているコーティング層５の高さＨは、図３（ｂ）に示すクリアランス（ギャップ）Ｃで調整される。このクリアランスＣは、マイクロニードル３の基底からマスク版１１表面までの距離（基板２の厚みは関与しない）で定義され、マスク版１１のテンションとマイクロニードル３の長さに応じて設定される。クリアランスＣの距離の範囲は、好ましくは、０～５００μｍである。すなわち、クリアランスＣの距離が０の場合には、コーティング組成物１０がマイクロニードル３の全体に対して塗布されることを意味する。マイクロニードル３上に形成されているコーティング組成物１０の高さＨはマイクロニードル３の高さによって変動しうるが、通常１０～５００μｍであり、好ましくは３０～３００μｍであり、より好ましくは４０～２５０μｍである。コーティング組成物１０中のＦＳＨを有効に皮内に投与するためには、マイクロニードルの一部分、すなわちニードルの先端部分に集中的に存在させた方が好ましい。また、皮膚に対する刺激及びＦＳＨの皮膚への移行効率の観点からも、マイクロニードル３の先端から平均して２００μｍまでに存在させることが好ましく、１５０μｍまでに存在させることがより好ましく、１２０μｍまでに存在させることが更に好ましい。コーティング組成物１０が、高い粘度を有すると、マイクロニードルの一部分にコーティング層５を形成しやすくなる。このような方法によりマイクロニードル３上に付着されたコーティング組成物１０は、揮発成分が除去された後、マイクロニードル３の先端部分で、好ましくは略球状又は涙滴状のコーティング層５を形成することができ、マイクロニードル３を皮膚へ穿刺させたときに同時に皮内へ挿入される。
　コーティング層５の乾燥後の厚さは５０μｍ未満であることが好ましく、４０μｍ未満であることがより好ましく、１～３０μｍであることがさらに好ましい。一般に、コーティング層５の厚さは、乾燥後にマイクロニードル３の表面にわたって測定される平均の厚さである。コーティング層５の厚さは、コーティング組成物１０の複数の被膜を適用することにより増大させること、すなわち、コーティング組成物１０を塗布する工程を繰り返すことで任意に増大させることができる。
　コーティング組成物１０をマイクロニードル３に塗布する際には、装置の設置環境の温湿度は、一定に制御されることが好ましい。また、コーティング組成物１０が水を含有する場合は、必要に応じて、水を充満させることもできる。これにより、コーティング組成物１０中の水の蒸散を極力防ぐことができる。
　本実施形態に係るコーティング組成物によれば、凝集体の生成を抑制することができる。凝集体含有率の評価は、クロマトグラフィーを用いてコーティング組成物を分離し、ピーク面積から凝集体含有率を算出することができる。凝集体含有率の評価方法としては、例えば、０．０１％ポリソルベート８０を含むリン酸緩衝液を用いて、マイクロニードルに塗布されたコーティング組成物から抽出した後、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、得られた抽出液を分離して、ＦＳＨよりも保持時間が短いフラクションに含まれるタンパク質を凝集体として評価する。
　本発明のマイクロニ一ドルデバイスを治療のために施用する方法は、例えば、ＷＯ２０１４／０９７８３７に記載された装置を用いて、マイクロニードルデバイスを被施用者の皮膚面に衝突または圧着させる方法が挙げられる。具体的には、マイクロニ一ドルの先端部の少なくとも一部分が当該皮膚へ穿入され、マイクロニードルの穿入された部分にあるコーティングから、遺伝子組換型ＦＳＨが被施用者の体内へ吸収され得る状態となる。その後、遺伝子組換型ＦＳＨが被施用者の体内へ吸収され得る状態を保持した後、マイクロニードルデバイスを皮膚面から取り去る。マイクロニ一ドルを皮膚に穿入させた状態を保持する時間（穿刺時間）は、１０分以内、１分以内、３０秒以内または１０秒以内であってよく、０．５秒以上であってよい。
　被施用者の負担を軽減する観点から、穿刺時間はより短いことが好ましい。穿刺時間が長くなるほど、マイクロニ一ドルが真皮組織を損傷させるか、または皮膚に極微量の出血を生じる虞が高まる。
　また、例えば、遺伝子組換型ＦＳＨ（３０～６００ＩＵ）を含有する組成物をマイクロニードルの先端部に塗布して形成させたコーティング層を備えるマイクロニードルデバイスを、上述の方法（例えば、穿刺時間が０．５秒～１分）で被施用者の皮膚に適用することを含む、遺伝子組換型ＦＳＨの投与方法が提供される。マイクロニードルデバイスの適用時から、血漿中のＦＳＨの濃度が最高となるまでの時間（Ｔｍａｘ）は、例えば、約３～８時間である。内因性ホルモンが生理的には、パルス状に放出されることを鑑みると、Ｔｍａｘが上記範囲内であると、マイクロニードルデバイスは、期待する薬効を発揮しやすくなり、かつ、副作用も生じ難いと考えられる。
　以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明する。
（１）含量均一性試験１
　表１の記載にしたがって調製した参考例１～３のコーティング剤を、マイクロニードルに塗布した。なお、表１中の数字は、コーティング剤全体に対する質量％を意味する。
　次に、参考例１，２は約４０％ＲＨの条件下で１０枚、参考例３は９０％ＲＨの条件下で２０枚に塗布した。マイクロニードルに塗布されたコーティング剤をそれぞれ回収し、各コーティング剤における遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン（以下、単に「ＦＳＨ」ともいう。）の含有量を測定した。得られたＦＳＨの含有量の平均値、標準偏差ＳＤ、変動係数ＣＶを算出した。なお、変動係数ＣＶとは、標準偏差を平均値で除した値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果を表２に示す。グリセリンを含む参考例１では、変動係数が７．２であり、プロピレングリコールを含む参考例２及びプルランを含む参考例３と比較して、含有量のバラツキが小さかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）凝集試験１
　表３の記載にしたがって、参考例４～７及び実施例１のコーティング剤を調製した。得られたコーティング組成物を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥した。次に、得られたマイクロニードルデバイスを包装し、４０℃で２週間保存した後、凝集体含有率を以下のように評価した。なお、ＦＳＨよりも保持時間が長いフラクションには、タンパク質は含まれていなかった。
＜凝集体含有率の評価方法＞
　０．０１％ポリソルベート８０を含むリン酸緩衝液を用いて、マイクロニードルに塗布されたコーティング組成物から抽出した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、得られた抽出液を分離して、ＦＳＨよりも保持時間が短いフラクションに含まれるタンパク質を凝集体として評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　結果を図４に示す。図４に示すように、アルギニン＋クエン酸を用いた実施例１は、ＦＳＨの凝集体の生成を抑制する点で優れるものであった。
（３）凝集試験２
　表４の記載にしたがってＦＳＨ、グリセリン、アルギニン、酸及び精製水を混合し、ｐＨ８のコーティング組成物をそれぞれ調製した。酸として、５Ｎ塩酸、リン酸、５Ｎ硫酸、ホウ酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸を使用した。得られたコーティング組成物を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥した。次に、得られたマイクロニードルデバイスを包装し、４０℃で２週間保存した後、凝集体含有率を評価した。なお、凝集体含有率の評価は、凝集試験１と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果を表５に示す。実施例２～９の中では、５Ｎ塩酸、５Ｎ硫酸または酢酸を含有する実施例２，４または８では、ＦＳＨの凝集体が少量生成したが、実施例３，５～７または９ではＦＳＨの凝集体が全く生成しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（４）性状試験１
　表６の記載にしたがい、ＦＳＨ、グリセリン、アルギニン、クエン酸及び精製水を含有する実施例１０～１３および参考例１０～１２のコーティング組成物を調製した。得られたコーティング組成物を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥した。次に、得られたマイクロニードルデバイスを包装し、４０℃で２週間保存した後、コーティング層におけるＦＳＨの溶解性、及びＦＳＨの凝集体含有率を評価した。なお、凝集体含有率の評価は、凝集試験１と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結果を表７に示す。実施例１０～１３のコーティング組成物を用いたマイクロニードルデバイスでは、コーティング層におけるＦＳＨの溶解性に優れ、ＦＳＨの凝集体の生成も抑制された。一方、参考例１０のコーティング組成物を用いた場合には、ＦＳＨの凝集体が含有しており、参考例１１および１２のコーティング組成物を用いた場合には、ＦＳＨの溶解性が低下していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（５）液ダレ抑制試験
　表８の記載にしたがって、ＦＳＨ、グリセリン、アルギニン、クエン酸、精製水を混合し、実施例１４～１６および参考例１３のコーティング組成物を調製した。得られたコーティング組成物について、不溶物の有無を目視にて観察した。不溶物が存在しなかった場合を「○」、不溶物が存在した場合を「×」として評価した。
　また、得られたコーティング組成物を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥して、マイクロニードルデバイスを得た。次に、デジタルマイクロスコープ（キーエンス社製）を使用して、得られたマイクロニードルデバイスのコーティング層の性状（液ダレの有無）を観察した。液ダレが見られなかった場合を「Ａ」、液ダレが見られた場合を「Ｂ」として評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　結果を表９に示す。実施例１４～１６のコーティング組成物を用いたマイクロニードルデバイスでは、ＦＳＨが充分に溶解されていた。一方、参考例１３のコーティング組成物を用いたマイクロニードルデバイスでは、液ダレが見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（６）乾燥による影響
　実施例１７のコーティング組成物をマイクロニードルに塗布した後、減圧乾燥前のコーティング組成物におけるＦＳＨ、アルギニン、グリセリン及びクエン酸の含有量を、ガスクロマトグラフィー法にて測定した。次に、室温、１０Ｐａの条件で減圧乾燥を行った後、同様に、コーティング層におけるＦＳＨ、アルギニン、グリセリン及びクエン酸の含有量を、ガスクロマトグラフィー法にて測定した。なお、実施例１７のコーティング組成物は、表１０中の減圧乾燥前の割合でＦＳＨ、グリセリン、アルギニン、クエン酸及び水を混合して得られたものである。
　結果を表１０に示す。減圧乾燥前のコーティング組成物における各成分の含有率は、コーティング組成物を調製したときの各成分の配合割合とほぼ同一であった。一方、減圧乾燥後のコーティング層において、水の含有率だけでなく、グリセリンの含有率も低下した。すなわち、水とともにグリセリンが蒸発することにより、ＦＳＨの含量均一性に優れ、液ダレがより抑制されたものといえる。また、減圧乾燥の時間を長くすることによりグリセリンの含有率はさらに低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（７）含量均一性試験２
　表１１の記載にしたがって調製した実施例１８および１９のコーティング剤を、マイクロニードルに塗布した。なお、表１１中の数字は、コーティング剤全体に対する質量％を意味する。
　次に、実施例１８および１９は約４０％ＲＨの条件下で２０枚に塗布した。マイクロニードルに塗布されたコーティング剤をそれぞれ回収し、各コーティング剤における遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン（以下、単に「ＦＳＨ」ともいう。）の含有量を測定した。得られたＦＳＨの含有量の平均値、標準偏差ＳＤ、変動係数ＣＶを算出した。なお、変動係数ＣＶとは、標準偏差を平均値で除した値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　結果を表１２に示す。実施例１８および１９のコーティング剤は、ともに含有量のバラツキが小さかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（８）凝集試験３
　表１３の記載にしたがって、実施例２０のコーティング剤を調製した。得られたコーティング剤を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥した。次に、得られたマイクロニードルデバイスを包装し、４０℃で２週間保存した後、凝集体含有率を評価した。なお、凝集体含有率の評価は、凝集試験１と同様に行い、ＦＳＨよりも保持時間が長いフラクションには、タンパク質は含まれていなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　実施例２０のコーティング剤は、４０℃で２週間保存した後であっても、凝集体含有率は３．８％であった。
（９）性状試験２
　表１４の記載にしたがい、ＦＳＨ、グリセリン、アルギニン、クエン酸及び精製水を含有する実施例２１および２２のコーティング剤を調製した。得られたコーティング剤を、マスク版を用いた浸漬法により、マイクロニードルアレイのマイクロニードルの先端部に塗布して、マイクロニードルアレイを減圧乾燥した。次に、得られたマイクロニードルデバイスを包装し、４０℃で２週間保存した後、コーティング層におけるＦＳＨの溶解性、及びＦＳＨの凝集体含有率を評価した。なお、凝集体含有率の評価は、凝集試験１と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　結果を表１５に示す。実施例２１および２２のコーティング剤を用いたマイクロニードルデバイスでは、コーティング層におけるＦＳＨの溶解性に優れ、ＦＳＨの凝集体の生成も抑制された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（１０）マイクロニードルデバイスの適用
　ＦＳＨ１００質量部に対して、グリセリン１００質量部、アルギニン１０質量部及びその他の成分１００質量部を混合して調製したコーティング剤を、マイクロニードルの先端部に塗布した後、乾燥させて、マイクロニードルデバイスを得た。施用装置を用いて、得られたマイクロニードルデバイスを被施用者の皮膚に適用した。このとき、穿刺時間は１０秒間に設定した。経時的に被施用者の血液を採取し、血漿中のＦＳＨの濃度を測定した。
　血漿中のＦＳＨの濃度が最大となるまでに要した時間（Ｔｍａｘ）は、約８時間であった。
　１…マイクロニードルデバイス、２…基板、３…マイクロニードル、５…コーティング層、１０…コーティング組成物、１１…マスク版、１２…ヘラ、１３…開口部。

Claims (12)

  1. 　基板と、基板上に配置されたマイクロニードルと、マイクロニードル上に形成されたコーティング層と、を備えるマイクロニードルデバイスであって、
    　コーティング層は、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン、アルギニン及びグリセリンを含有し、
    　コーティング層において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．７５倍であり、グリセリンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．１～２．７５倍である、マイクロニードルデバイス。
  2. 　コーティング層において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．６倍である、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
  3. 　コーティング層は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有する、請求項１又は２に記載のマイクロニードルデバイス。
  4. 　基板及びマイクロニードルを有するマイクロニードルアレイを準備する工程と、
    　遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン、アルギニン及びグリセリンを混合してコーティング組成物を得る工程と、
    　マイクロニードルにコーティング組成物を塗布する工程と、
    　コーティング組成物を乾燥させてマイクロニードル上にコーティング層を形成する工程と、を備え、
    　コーティング層において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．７５倍となり、かつグリセリンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．１～２．７５倍となるまで乾燥を行う、マイクロニードルデバイスの製造方法。
  5. 　コーティング層において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．６倍となり、かつグリセリンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．１～２．７５倍となるまで乾燥を行う、請求項４に記載のマイクロニードルデバイスの製造方法。
  6. 　コーティング組成物において、
    　アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．７５倍であり、
    　グリセリンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して１～３倍である、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　コーティング組成物において、アルギニンの質量が、遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量に対して０．０７～０．６倍である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　コーティング組成物は、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有する、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　請求項４～８のいずれか一項に記載の方法により製造されるマイクロニードルデバイス。
  10. 　遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン、アルギニン及びグリセリンを含有し、
    　遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量を基準として、アルギニンの含有量が０．０７～０．７５倍であり、かつグリセリンの含有量が１～３倍である、マイクロニードル用コーティング剤。
  11. 　遺伝子組換型卵胞刺激ホルモン、アルギニン及びグリセリンを含有し、
    　遺伝子組換型卵胞刺激ホルモンの質量を基準として、アルギニンの含有量が０．０７～０．６倍である、請求項１０に記載のマイクロニードル用コーティング剤。
  12. 　クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸及び乳酸からなる群から選択される酸をさらに含有する、請求項１０又は１１に記載のコーティング剤。
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