WO2015015655A1

WO2015015655A1 - フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法

Info

Publication number: WO2015015655A1
Application number: PCT/JP2013/071096
Authority: WO
Inventors: 範子小泉; 直毅奥村; 木下　茂
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2015-02-05
Anticipated expiration: 2016-01-30

Abstract

本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系を提供すること。本発明はフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を提供する。この細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIIIおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を含む。

Description

フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法

　本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系、および同疾患、またはその障害または状態の処置または予防するための技術、方法等に関する。

　視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
　ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因の詳細は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着し、グッテー（Ｃｏｒｎｅａｌ　ｇｕｔｔａｅ）を形成したりデスメ膜の肥厚を生じ、羞明、霧視の原因となる。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
　従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止（細胞老化）したり、形質転換をきたす。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという不均質性の問題に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされる。
　フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養（非特許文献１および３）や不死化の報告（非特許文献２）があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。

Ｚａｎｉｏｌｏ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．；９４（１）：２２−３１．２０１２Ａｚｉｚｉ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．２；５２（１３）：９２９１−９２９７．２０１１Ｋｅｌｌｉｈｅｒ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　Ｖｏｌ．９３（６），８８０−８８８，２０１１

　本発明者らは、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴをフックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞に導入することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの病態、特に、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能（たとえば、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能している）を少なくとも１つ、好ましくはすべて良好に保存した不死化細胞を供給することができることを見出し、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系を提供することに成功した。したがって、本願発明は以下のような発明を提供する。
（１）フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞。
（２）前記細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を含む、項目１に記載の細胞。
（３）前記細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能からなる群より選択される特徴をすべて含む、項目１または２に記載の細胞。
（４）前記細胞外マトリクスタンパク質および／またはＥＭＴ関連マーカー発現亢進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答性を含む、項目２または３に記載の細胞。
（５）前記正常細胞機能は、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現を含む、項目２~４のいずれか１項に記載の細胞。
（６）項目１~５のいずれか１項に記載の細胞を用いるフックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングする方法。
（７）ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴをフックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞に導入することを含む、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の生産方法。
（８）前記フックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞を、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養することを含む、項目７に記載の方法。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　本発明により、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系が提供され、フックス角膜内皮ジストロフィ治療や予防の薬のためのスクリーニング等の技術に関する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。

図１は、健常者およびフックス角膜内皮ジストロフィ患者より樹立した不死化角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図１は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来角膜内皮細胞はＳＶ４０およびｈＴＥＲＴの遺伝子をレンチウイルスにより導入し不死化細胞株を作製した結果を示す。フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（ＤＭＥＫ）を実施された患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地（実施例参照）により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来角膜内皮細胞はＳＶ４０およびｈＴＥＲＴの遺伝子をレンチウイルスにより導入し不死化細胞株を作製した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をドナー別に図１ｄ，ｅ，ｆに示す。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）の位相差顕微鏡像をドナー別に図１ａ，ｂ，ｃに示す。図１ａ，ｂ，ｃおよび図１ｄ，ｅ，ｆ全て、正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。図２は、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＣＥＤの機能関連タンパク質の発現を示す。図２は、作製した不死化細胞株が正常な機能を維持しているかどうかを試験した結果を示す。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能についてそれぞれのマーカーとしてＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色を行った。左側はＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、右側はＺＯ−１を示す。上側はｉＨＣＥＣを示し、下側はｉＦＥＣＤを示す。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤともに全ての細胞でＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１を発現しており、作製した不死化細胞株が正常な機能を維持していることが示された。図３は、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＣＥＤの透過型電子顕微鏡像を示す。図３は、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの透過型電子顕微鏡による形態観察像を示す。ｉＨＣＥＣ（左）およびｉＦＥＣＤ（右）をＤＭＥＭにより無血清でＴｒａｎｓｗｅｌｌ上に培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定して透過型電子顕微鏡により形態を観察したところ、形態的に明らかな異常を認めない一層の細胞であることが示された。図４は、ｉＦＥＣＤにおけるタンパク質産生の亢進を示す。図４は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞の細胞外マトリックスの免疫染色およびリアルタイムＰＣＲによる結果を示す。フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞は細胞外マトリックスを過剰に産生しｇｕｔｔａｅの形成およびデスメ膜の肥厚を生じることが知られている。そこで、細胞外マトリックスを構成するタンパク質であるＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現について、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤを培養皿で培養し免疫染色を行った。上パネルは、免疫染色写真であり、下グラフは遺伝子発現量を示す。上パネルの写真中上段はｉＨＣＥＣを示し、下段はｉＦＥＣＤを示す。そして、右側からＩ型コラーゲンを示し。中央はＩＶ型コラーゲンを示し、右側はフィブロネクチンを示す。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較してＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が増加していることが示された。また、培養したｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲ法により検討したところＩ型コラーゲン、フィブロネクチンは有意に発現レベルの亢進を認め、ＩＶ型コラーゲンにおいては発現亢進の傾向を認めた。図５は、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＣＥＤの細胞外マトリックス産生の亢進を示す。図５は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮同様にｉＦＥＣＤが細胞外マトリックスを過剰に産生するかどうかについて検討した結果を示す。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＴｒａｎｓｗｅｌｌ上にＤＭＥＭにより無血清で培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定してＨＥ染色を行った。左側にＨＥ染色の写真を示す。写真中上はｉＨＣＥＣであり、下はｉＦＥＣＤである。右グラフは、厚さの表示である。左バーはｉＨＣＥＣであり、右バーはｉＦＣＥＣである。＊はｐ＜０．０１での統計学的有意を示す。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較して有意に肥厚した細胞外マトリックスの産生を認めた。図６は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来角膜内皮細胞においてＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現が亢進していることを示す。図６は、細胞外マトリックスの産生に関わる上皮間葉系移行（ＥＭＴ）にかかわる遺伝子についてリアルタイムＰＣＲを用いて発現量の解析を行った結果を示す。ｉＦＥＣＤはフックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（ＤＭＥＫ）を実施された患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得て培養したものを用いた。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来角膜内皮細胞をＳＶ４０およびｈＴＥＲＴの遺伝子をレンチウイルスにより導入し不死化細胞株を作製した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。リアルタイムＰＣＲによりＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１においてｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較して有意に発現の亢進を認めた。図７は、ＴＧＦβがＳｎａｉｌ１、ＺＥＢ１および生体外マトリックス構成タンパク質の発現を上昇させることを示す。図７は、Ｓｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現亢進が細胞外マトリックスの産生に関わるかどうかを確認するために、Ｓｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現を促進することが知られているＴＧＦβにて刺激を行った結果である。ＴＧＦβによりｉＦＥＣＤにおいてＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現は有意に促進されることを確認した（Ａ，Ｂ）。そこで、細胞外マトリックスの構成タンパク質の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより解析したところ、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が有意に促進された。

　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（定義）
　本明細書において「眼細胞」とは、広義に用いられ、眼に存在する任意の細胞を意味し、眼瞼、強膜、角膜、ぶどう膜、水晶体、硝子体、網膜、視神経に存在する任意の細胞が包含される。
　本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
　本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｕｃｈｓ’　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｏｒｎｅａｌ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
　本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
　本明細書において「角膜組織」とは、通常の意味で使用され、角膜を構成する組織自体をいう。角膜組織というときは、角膜を構成する角膜上皮、ボーマン膜、実質層、デスメ膜、および角膜内皮の全部（ヒトの場合。それ以外の動物の場合は、それに対応する区分に応じてその全部）を含んでいてもよく一部欠損していてもよく、あるいは、角膜のほか他の組織（強膜）を含んでいてもよく、その場合は特に強角膜ということがある。
　本明細書において「未分化細胞」とは、分化能がある任意の細胞をいう。従って、未分化細胞には、幹細胞のほか、一定程度分化しているが、さらになお分化しうる細胞を包含する。
　本明細書において「不死化細胞」とは、その決定的な特徴として、ここでは培養中見かけ上無限の寿命を示す（無限数の分裂を通じて増殖する能力を有する）細胞株（系統）を指す。このような不死化細胞は、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得させることができ、あるいは、特定の遺伝子を目的とする細胞に導入することで不死化能力を付与することもできる。ただし、従来のこのような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失するといわれている。特にフックス角膜内皮ジストロフィでは本来有していた形態や機能が維持された例は非特許文献１−３のような技術を含め従来方法では報告されていない。このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいため、所望の特徴を維持する不死化細胞を提供することは難しい。他方、本発明の技術では、フックス角膜内皮ジストロフィについて、所望の特徴を維持する不死化細胞を提供することができた。
　本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。通常不死化された細胞は、所望の特徴を備えることが多いことから、樹立された細胞に該当することが多い。
　本明細書において「形質転換（細胞）」とは、制御できない増殖状態へ自然発症的に変換されたこと（細胞）をいう。形質転換細胞は培養器において無限の分裂回数を通じて増殖する能力を獲得する。形質転換細胞は、それらの増殖制御の欠損に関し、腫瘍性、未分化性及び／又は過形成性のような用語を用いて呼称してもよい。
　本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。
　本明細書において「細胞外マトリクス層の肥厚」とは、ある細胞について言及するとき、その細胞の正常形態における細胞外マトリクス層よりも厚い細胞外マトリクス層を有することをいう。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常が約３μｍ程度であるため、細胞外マトリクス層の肥厚とは、約３μｍより厚いことであり、好ましくは、その厚さは約５μｍ以上であり、より好ましくは約６μｍ以上でありうる。
　本明細書において「細胞外マトリクス」とは、（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。ここで、代表的な細胞外マトリクスを構成する物質としては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などを挙げることができるがそれらに限定されず、細胞接着を担う細胞外マトリクスであれば、種々のものが本発明において利用され得る。
　本明細書では、「細胞外マトリクスタンパク質」とは、細胞外マトリクスを構成するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディンを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明では、特にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンの少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つなおさらに好ましくは４つを指標として、フックス角膜内皮ジストロフィの性状を維持しているかどうかを判定することができる。
　本明細書において「細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生」とは、ある細胞について言及するとき、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、およびフィブロネクチン等の細胞外マトリクスタンパク質が、正常形態における細胞外マトリクスにおいて産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常における細胞外マトリクスの量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよい。
　本明細書において「上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー」とは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）において指標となるマーカーをいい、ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１等を挙げることができる。
　本明細書において「ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進」とは、ある細胞について言及するとき、正常形態におけるＺＥＢ１またはＳｎａｉｌ１において産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常における細胞外マトリクスの量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよい。
　本明細書において「非線維芽形態」とは、細胞の形態についていい、線維芽細胞を有していないことをいう。具体的には、正常細胞同様に多角形の形態を維持して、著しい重層化を生じず、ポンプ機能およびバリア機能を有するもののような形態をいうがこれらに限定されない。線維芽細胞は、正常組織ではめだった機能を有しないが、損傷が加わると揖傷部に遊走し、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの産生を始める結合組織の固有細胞であり、細胞外マトリックスを更新する。
　本明細書において細胞の「正常細胞機能」とは、角膜内皮細胞等の具体的細胞について言う場合、その細胞が本来有している機能をいう。角膜内皮細胞についていえば、そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｋｅｙ：ａ　ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｍｏｎｋｅｙ：ａｎ　ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，Ｈｙｎｄｉｕｋ　ＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｗｏｕｎｄ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｔｅｃｏｒｎｅａ，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎＨｏｒｎ　ＤＬ，Ｓｅｎｄｅｌｅ　ＤＤ，Ｓｅｉｄｅｍａｎ　Ｓ，Ｂｕｃｏ　ＰＪ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｄ　ｃａｔ，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９７７，１６：５９７−６１３）等が挙げられるがそれらに限定されない。
　ＺＯ−１およびＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅは、遺伝子の発現を免疫的な手段またはＲＴ−ＰＣＲ等の核酸レベルでの発現をみることによって評価することができる。Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能していることを確認することによって、対象の細胞が正常の機能を有しているかどうかを確認することができる。
　角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９７７，１６：５９７−６１３）。したがって、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
　本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官（眼）あるいは細胞等）をいう。
　本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「ＳＶ４０」とは、サル液胞性ウイルス（ｓｉｍｉａｎ（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ）ｖｉｒｕｓ）４０の略称であり、ポリオーマウイルスの一種でヒトを含む霊長類において見出される、腫瘍ウイルスの一種であり、高等動物細胞用のベクターや発癌機構の研究に利用される。詳細な情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ／ｍｅｓｈ／２０１３／ＭＢ＿ｃｇｉ？ｆｉｅｌｄ＝ｕｉｄ＆ｔｅｒｍ＝Ｄ０２７６０１に見出すことができ、Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ＩＤ：１０６３３である。本発明において、そのラージＴ抗原（ＳＶ４０ラージＴ抗原）の遺伝子（核酸配列）を形質転換において使用する。
　本明細書において「マーカー（物質、タンパク質または遺伝子（核酸））」とは、ある状態（例えば、正常細胞状態、形質転換状態、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子（核酸＝ＤＮＡレベル）、遺伝子産物（ｍＲＮＡ、タンパク質など）、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、眼細胞、特に角膜内皮細胞への関連が示されていない遺伝子産物（すなわち、ＣＤ９８等の分子など）が眼細胞、特に角膜内皮細胞の正常かどうか（形質転換したかどうか）の指標として使用可能であることが見出された。
　本明細書において「テロメラーゼ逆転酵素（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＴＥＲＴ）」（ヒトの場合ｈＴＥＲＴ）は、テロメラーゼ逆転酵素の一種であり、テロメラーゼ酵素の触媒サブユニットであり、テロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）とともに、テロメラーゼ複合体の重要な成分を構成する。ＣＭＭ９；ＤＫＣＡ２；ＤＫＣＢ４；ＥＳＴ２；ＰＦＢＭＦＴ１；ＴＣＳ１；ＴＰ２；ＴＲＴ；ｈＥＳＴ２；ｈＴＲＴとも呼ばれる。そのＩＤは、Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：７０１５であり、ＮＭ＿００１１９３３７６（ヒトｍＲＮＡ）、ＮＰ＿００１１８０３０５（ヒトタンパク質）である。ｈＴＥＲＴとしては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
　本明細書において「Ｓｎａｉｌ１」は転写を制御するＣ２Ｈ２タイプのジンクフィンガーファミリーのタンパク質であり、上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカーのひとつである。ＳＬＵＧＨ２；ＳＮＡ；ＳＮＡＨ；ＳＮＡＩＬ；ＳＮＡＩＬ１；ｄＪ７１０Ｈ１３．１とも称される。そのＩＤは、Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６６１５であり、ＮＭ＿００５９８５（ヒトｍＲＮＡ）、ＮＰ＿００５９７６（ヒトタンパク質）である。Ｓｎａｉｌ１としては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
　本明細書において「ＺＥＢ１」とは、ジンクフィンガーＥボックス結合ホメオボックス１（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ−ｂｏｘ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　１）をさし、上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカーのひとつである。ＡＲＥＢ６；ＢＺＰ；ＤＥＬＴＡＥＦ１；ＦＥＣＤ６；ＮＩＬ２Ａ；ＰＰＣＤ３；ＴＣＦ８；ＺＦＨＥＰ；ＺＦＨＸ１Ａとも称される。そのＩＤは、Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６０３５であり、ＮＭ＿００１１２８１２８（ヒトｍＲＮＡ）、ＮＰ＿００１１２１６００（ヒトタンパク質）である。ＺＥＢ１としては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
　本明細書で使用される「誘導体」または「類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本発明では、ヒトについて主に論じられるが、他の種例えば霊長類内の他の種あるいはこのほかの属の動物の種のものにも当てはまることが理解され、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
　本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、テロメラーゼ活性等の生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７~１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１~２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１~３８、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃ１ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８~２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１~５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
　本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのＴＥＲＴ等の分子は、それぞれ、ヒトにおいて、対応するＴＥＲＴ等の分子を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス、ラット）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子（例えば、ヒトのもの）の基準となる遺伝子として遺伝子アクセッション番号に見出される配列をクエリ配列として用いてその動物の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
　本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。
　本発明で用いられるＴＥＲＴ等の分子の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　（好ましい実施形態の説明）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
　（フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞）
　１つの局面において、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を提供する。
　本発明のフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態、（５）正常細胞機能（たとえば、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能している）からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を含み、好ましくは、これらの特徴の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、あるいはすべての特徴を有していてもよい。より好ましくは、本発明の細胞は、これらの特徴をすべて有する。１つの実施形態では、前記細胞外マトリクスタンパク質および／またはＥＭＴ関連マーカー発現亢進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答性を含む。別の実施形態では、前記正常細胞機能は、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現を含む。フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞のモデル細胞として従来達成できなかった特徴を備えるものであり、フックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングするために適切な細胞が提供されるからである。
　各々の特徴は以下のように評価することができる
（１）細胞外マトリクス層の肥厚
　正常細胞（通常２−４μｍ）より厚くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の厚さであることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。
（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生
　正常細胞の発現量より多くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の発現量であることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。あるいは、ＴＧＦβに対して応答して細胞外マトリクスタンパク質の発現が亢進しているかどうかをも判断の基礎とすることができる。
（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進
　正常細胞の発現量より多くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の発現量であることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。あるいは、ＴＧＦβに対して応答してＥＭＴ関連マーカーの発現が亢進しているかどうかをも判断の基礎とすることができる。
（４）非線維芽形態
　細胞の形状から判断する。正常細胞同様に多角形の形態を維持して、著しい重層化を生じず一層の上皮細胞様形態を示すことを確認することにより判断することができる。
（５）正常細胞機能
　Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同様に免疫染色などにより発現が確認でき、正常細胞と同程度の発現により判断することができる。
　別の局面において、本発明は、本発明のフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いるフックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
　（フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の調製方法）
　別の局面において、本発明は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴをフックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞に導入することを含む、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の生産方法を提供する。
　従来、このような不死化細胞は、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得させることができ、あるいは、特定の遺伝子を目的とする細胞に導入することで不死化能力を付与することもできる。ただし、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失するため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいといわれている。特にフックス角膜内皮ジストロフィでは本来有していた形態や機能が維持された例は非特許文献１−３のような技術を含め従来方法では報告されていない。所望の特徴を維持する不死化細胞を提供することは難しかった。しかしながら、本発明は、上記特定の遺伝子導入技術を用いることによって、所望の特徴、すなわち、フックス角膜内皮ジストロフィが有する特徴を維持し、正常細胞と同様の機能を保持する（すなわち、形質転換していない）細胞を提供することができた。
　初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失することが多い。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養（Ｚａｎｉｏｌｏ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．；９４（１）：２２−３１．２０１２）や不死化の報告（Ａｚｉｚｉ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．２；５２（１３）：９２９１−７．２０１１）があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はない。一方、本発明ではフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞の特徴である細胞外マトリックスの過剰産生という特性を維持している。これまでは、初代細胞にｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であることがある。特に、特殊な疾患の細胞や、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であり、フックス角膜内皮ジストロフィについても同様な困難性があった。特に、フックス角膜内皮ジストロフィについては、そもそも角膜内皮では正常細胞の維持も困難な中、病態モデルの作出、および培養細胞として維持することはより困難であり、正常機能を保った病態モデルの作製は不可能と思われていた。
　そこで、本発明では、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いることに加えて、導入遺伝子として、テロメラーゼ逆転酵素（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＴＥＲＴ）を導入することによって、フックス角膜内皮ジストロフィの特徴を維持しつつ、不死化することに成功した。このようなフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、フックス角膜内皮ジストロフィを標的とした医薬品等の有用物質のスクリーニングにも耐える細胞を提供することに成功した。
　本発明におけるＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴの導入方法としては、当該分野で公知の遺伝子（核酸分子）の導入技術（形質転換、形質導入、トランスフェクション等）または遺伝子産物（タンパク質）の導入手法であればどのような技術であっても利用することができ、通常核酸分子の導入によりこれらの遺伝子の導入を実現することができる。本明細書では「遺伝子導入」とは、外来性の遺伝子、好ましくは機能遺伝子を適宜の導入技術により、その遺伝子を、例えば染色体ゲノム等に導入することをいう。また、当該分野で公知の標的遺伝子組換え法を利用すれば、内在性の機能遺伝子と置換させることによって外来性の機能遺伝子を導入することもできる。なお、外来性の機能遺伝子は、その生物の染色体ゲノムに元来存在しない遺伝子であり、他の生物種由来の遺伝子やＰＣＲ等で作製した合成遺伝子等でありうる。例えば、このような遺伝子の導入の手法としては、トランスフェクション手法が挙げられる。このようなトランスフェクションとしては、目的の遺伝子（本発明では、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子等）を適宜のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターであるがこれに限定されない）に導入する。ここでは、必要に応じてヘルパープラスミドを用いて（例えば、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ等）、適切な細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）に感染させる。適宜の条件で培養した後、感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、目的とする細胞（本発明では、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞）の培養液にこの培養上清を、適宜の試薬（ここでは、ポリブレンであるがこれに限定されない）とともに添加してフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を生産することができる。あるいは、別の例としては、形質転換遺伝子をコードするＤＮＡを含む外来性ＤＮＡは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルスベクター）への形質移入の技術を用いて目的の細胞に導入され得る。例えば、組換えレトロウイルスは、パッケージング細胞株中に産生されて、高力価のウイルス粒子を有する（一般に、１０^５~１０^６ｐｆｕ／ｍｌであるがこれに限定されない）培養物上清を産生する。組換えウイルス粒子は、目的とする細胞の培養物に、細胞培養物をウイルス粒子と適宜の濃度（例えば、５~１０μｇ／ｍｌであるがこれに限定されない）のポリブレン等の試薬とを含む培地と共に適宜の時間（例えば、１~１２時間程度であるがこれに限定されない）インキュベートすることによって感染させるために使用される。レトロウイルスへの感染後、細胞は、リンスされて標準培地中で培養される。次いで、感染細胞は、外来性ＤＮＡの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。あるいは、外来性ＤＮＡは、リン酸カルシウム媒介型形質移入の技術を用いて導入されてもよい。目的の遺伝子、例えば形質転換遺伝子をコードするＤＮＡを含むリン酸カルシウム沈殿物は、Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：１３７３−１３７６の技術を用いて調製されてもよい。形質移入後、細胞は、外来性ＤＮＡの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。このような技術は、実施例において具体的に開示した例のほか、特表２０１３−５０９１７９、特開２００４−２５４５０９に例示されているがこれらに限定されない。
　本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、本発明の不死化細胞株を培養し、該細胞における細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の厚さの増減の程度を測定・評価することができ、あるいはアポトーシスの有無、増減等を測定、評価することができ、あるいは、他のマーカーの増減の程度を測定・評価することができる。被検物質の存在下、上記不死化細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することもでき、不死化細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供することができる。
　上記不死化細胞における有用物質のスクリーニングは、不死化細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に、細胞数や細胞の形態、発現したマーカータンパク質の量等の指標を検出・測定し、被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行うことができる。
　これらスクリーニング方法により得られる不死化細胞における有用物質は、フックス角膜内皮ジストロフィを有する患者を治療するのに用いられる治療薬、予防及び／又は症状改善剤として使用できる可能性があり、有用である。
　不死化させる際に、追加的にあれば有用な詳細な条件としては以下をあげることができる。たとえば、好ましい実施形態では、前記フックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞を、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）およびＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養することで、好ましい細胞を得ることができる。この培地は、好ましくは実施例中で使用したＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地であってもよいが、これに限定されない。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下に、本発明の角膜内皮細胞の細胞を正常に培養する例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイル）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅ^ＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜内皮細胞が細胞死に至り、残存する角膜内皮細胞が、ポンプ機能、バリア機能を代償できなくなると角膜の透明性を維持できなくなり角膜混濁による失明に至る。また、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞は細胞外マトリックスを過剰に産生しグッテー（ｇｕｔｔａｅ）の形成およびデスメ膜の肥厚を生じることが知られている。グッテーの形成およびデスメ膜の肥厚は光の散乱などを生じるために視力低下、羞明、霧視の原因とない患者のＱＯＬを著しく傷害する。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。
　（実施例１：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の作製）
　本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。
　（培養方法）
　シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ　ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％　コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」という）で培養した。
　（取得方法）
　フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３順か培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤ；Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて２９３Ｔ細胞（ＲＣＢ２２０２；Ｒｉｋｅｎ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をドナー別に図１ｄ，図１ｅ，図１ｆに示す。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）の位相差顕微鏡像をドナー別に図１ａ，図１ｂ，図１ｃに示す。図１ａ，図１ｂ，図１ｃおよび図１ｄ，図１ｅ，図１ｆ全て、正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。
　（実施例２：不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認）
　本実施例では、不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認を行った。
　（Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色）
　まず、不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の正常機能の確認のために、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色を行った。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。
　（染色等の細胞観察方法（組織学的試験））
　細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養した細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ^ＴＭ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅｓ^ＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れ、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。具体的には、Ｌａｂ−Ｔｅｋ^ＴＭＣｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅｓ^ＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上の培養細胞を室温で１０分間４％ホルムアルデヒド中で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。細胞の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）の免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてＺＯ−１およびＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを使用した。ＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの染色は、それぞれ、ＺＯ−１ポリクローナル抗体、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅモノクローナル抗体の１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ２　ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
　図２にその結果を示す。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤともに全ての細胞でＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１を発現しており、作製した不死化細胞株が正常な機能を維持していることが示された。
　（透過型電子顕微鏡による形態観察）
　本実施例では、さらに、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの透過型電子顕微鏡による形態観察像を撮影した。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＴｒａｎｓｗｅｌｌ　Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　Ｓｕｐｐｏｒｔｓ：０．４μｍ，６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ　ｎｏ．：３４５０）上にダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ、Ｃａｔ　ｎｏ．：０８４５６−９４）により無血清で培養し１週間後にコンフルエントの状態で２．５％グルタールアルデヒド、２％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、Ａｒａｌｄｉｔｅ　ｒｅｓｉｎ（Ａｇａｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｒｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に包埋し、切片を作製し透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ１０１０；ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察した。
　図３にｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの透過型電子顕微鏡による形態観察像を示す。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＤＭＥＭにより無血清でＴｒａｎｓｗｅｌｌ上に培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定して透過型電子顕微鏡により形態を観察したところ、形態的に明らかな異常を認めない一層の細胞であることが示された。
　（実施例３：不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の細胞外マトリックス産生）
　本実施例では、不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の細胞外マトリックス産生を確認した。
　（免疫染色）
　実施例２と同様の手法を用いて、抗体としてＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンに対する抗体を用いたこと以外は実施例２の手法に準じた。使用した抗体は以下のとおりである。
・Ｉ型コラーゲンに対する抗体：Ａｎｔｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ（Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）（ＲＯＣＫＬＬＡＮＤＴＭ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ａｓｓａｙｓ、Ｃａｔ　ｎｏ．：６００−４０１−１０３Ｓ）
・ＩＶ型コラーゲンに対する抗体：ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　ＩＶ（Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ　ｎｏ．：ａｂ６５８６）
・フィブロネクチンに対する抗体：Ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ　ｎｏ．：６１００７７）
　組織染色検査のために、培養した細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ^ＴＭ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅｓ^ＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れ、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。具体的には、Ｌａｂ−Ｔｅｋ^ＴＭＣｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅｓ^ＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上の培養細胞を室温で１０分間４％ホルムアルデヒド中で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。細胞の産生する細胞外マトリックの発現を調べるために、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンに対する抗体をそれぞれ１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｉｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ２　ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
　結果を図４に示す。フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞は細胞外マトリックスを過剰に産生しｇｕｔｔａｅの形成およびデスメ膜の肥厚を生じることが知られている。そこで、細胞外マトリックスを構成するタンパク質であるＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現について、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤを培養皿で培養し免疫染色を行った。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較してＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が増加していることが示された。また、培養したｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤの遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲ法により検討したところＩ型コラーゲン、フィブロネクチンは有意に発現レベルの亢進を認め、ＩＶ型コラーゲンにおいては発現亢進の傾向を認めた。
　（リアルタイムＰＣＲ）
　また、以下の方法にてＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンに対するＴａｑｍａｎ法にてＰＣＲを行った。ＴａｑｍａｎプローブはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから購入した。Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンのｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ法により調べた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはＲＮＥａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号：７４１０６）を用いた。抽出したＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社、カタログ番号：ＴＲＴ−１０１）により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、反応試薬ＴａｑＭａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンを増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプローブを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍにより行った。
Ｉ型コラーゲン　Ｈｓ００１６４００４＿ｍｌ　ＣＯＬ１Ａ１
ＩＶ型コラーゲン　Ｈｓ００２６６３２７＿ｍｌ　ＣＯＬ４Ａ１
フィブロネクチン　Ｈｓ０１５４９９７６＿ｍｌ　ＦＮ１
ＧＡＰＤＨ　ＴａｑＭａｎＲｐｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｈｕｍａｎ　ＧＡＤＰＨ（ｃａｔ　ｎｏ．：４３３３７６４Ｆ）
　（不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の細胞外マトリックスの過剰産生）
　この実験では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮同様にｉＦＥＣＤが細胞外マトリックスを過剰に産生するかどうかについて検討した。
　結果を図５に示す。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤをＴｒａｎｓｗｅｌｌ　Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　Ｓｕｐｐｏｒｔｓ：０．４μｍ，６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ　ｎｏ．：３４５０）上にダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ、Ｃａｔ　ｎｏ．：０８４５６−９４）により無血清で培養し１週間後にコンフルエントの状態で固定してＨＥ染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを１０分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを３０秒間行った。その後、流水水洗を５分行い、塩酸エオジン１０倍希釈液で２分間染色し、脱水し、透徹し、封入した。ｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較して有意に肥厚した細胞外マトリックスの産生を認めた。
　以上より、フックス角膜内皮ジストロフィ患者における過剰な細胞外マトリックスの産生という特徴を有する疾患モデル細胞を作製した。疾患モデル細胞を用いた解析により不明点の多いフックス角膜内皮ジストロフィの病態解明に寄与することが期待される。
　（実施例４：不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の更なる細胞マーカーとしての上皮間葉系移行（ＥＭＴ）にかかわる遺伝子）
　本実施例では、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤについて、細胞外マトリックスの産生に関わる上皮間葉系移行（ＥＭＴ）にかかわる遺伝子についてリアルタイムＰＣＲを用いて発現量の解析を行った結果を示す。
　（リアルタイムＰＣＲ）
　また、以下の方法にてＳｎａｉｌ１、Ｓｎａｉｌ２またはＺＥＢ１に対するＴａｑｍａｎ法にてＰＣＲを行った。ＴａｑｍａｎプローブはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから購入した。Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンのｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ法により調べた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはＲＮＥａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号：７４１０６）を用いた。抽出したＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社、カタログ番号：ＴＲＴ−１０１）により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、反応試薬ＴａｑＭａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンを増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプローブを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍにより行った。
Ｓｎａｉｌ１　　Ｈｓ００１９５５９１＿ｍｌ　ＳＮＡＩ１
Ｓｎａｉｌ２　　Ｈｓ００９５０３４４＿ｍｌ　ＳＮＡＩ２
ＺＥＢ１　　Ｈｓ００２３２７８３＿ｍｌ　ＺＥＢ１
ＧＡＰＤＨ　ＴａｑＭａｎＲｐｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｈｕｍａｎ　ＧＡＤＰＨ（ｃａｔ　ｎｏ．：４３３３７６４Ｆ）
　（結果）
　結果を図６に示す。リアルタイムＰＣＲによりＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１においてｉＦＥＣＤにおいてｉＨＣＥＣと比較して有意に発現の亢進を認めた。
　（ＴＧＦβによるＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現亢進）
　Ｓｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現亢進が細胞外マトリックスの産生に関わるかどうかを確認するために、Ｓｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現を促進することが知られているＴＧＦβにて刺激を行った結果である。手法は以下のとおりである。ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣを１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで培養し、１０％ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭにて一晩培養したのちにリアルタイムＰＣＲ法にてＳｎａｉｌ１、ＺＥＢ１、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現を調べた。ＰＣＲ反応には下記に示すプローブを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍにより行った。
Ｓｎａｉｌ１　　Ｈｓ００１９５５９１＿ｍｌ　ＳＮＡＩ１
ＺＥＢ１　　Ｈｓ００２３２７８３＿ｍｌ　ＺＥＢ１
Ｉ型コラーゲン　Ｈｓ００１６４００４＿ｍｌ　ＣＯＬ１Ａ１
ＩＶ型コラーゲン　Ｈｓ００２６６３２７＿ｍｌ　ＣＯＬ４Ａ１
ＶＩＩＩ型コラーゲン　Ｈｓ００６９７０２５＿ｍｌ　ＣＯＬ８Ａ２
フィブロネクチン　Ｈｓ０１５４９９７６＿ｍｌ　ＦＮ１
ＧＡＰＤＨ　ＴａｑＭａｎＲｐｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｈｕｍａｎ　ＧＡＤＰＨ（ｃａｔ　ｎｏ．：４３３３７６４Ｆ）
　結果を図７に示す。ＴＧＦβによりｉＦＥＣＤにおいてＳｎａｉｌ１およびＺＥＢ１の発現は有意に促進されることを確認した（Ａ、Ｂ）。そこで、細胞外マトリックスの構成タンパク質の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより解析したところ、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が有意に促進された。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

　フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系が提供され、フックス角膜内皮ジストロフィ治療に関する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。

Claims

フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞。
前記細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を含む、請求項１に記載の細胞。
前記細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態ならびに（５）正常細胞機能からなる群より選択される特徴をすべて含む、請求項１に記載の細胞。
前記細胞外マトリクスタンパク質および／またはＥＭＴ関連マーカー発現亢進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答性を含む、請求項２または３に記載の細胞。
前記正常細胞機能は、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現を含む、請求項２または３に記載の細胞。
請求項１に記載の細胞を用いるフックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングする方法。
ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴをフックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞に導入することを含む、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の生産方法。
前記フックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞を、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養することを含む、請求項７に記載の方法。