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WO2015005491A1 - 疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法 - Google Patents

疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2015005491A1
WO2015005491A1 PCT/JP2014/068691 JP2014068691W WO2015005491A1 WO 2015005491 A1 WO2015005491 A1 WO 2015005491A1 JP 2014068691 W JP2014068691 W JP 2014068691W WO 2015005491 A1 WO2015005491 A1 WO 2015005491A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
splicing
gene
abnormal
disease
Prior art date
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PCT/JP2014/068691
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English (en)
French (fr)
Inventor
萩原正敏
吉田優
細谷孝充
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Medical and Dental University NUC
Kyoto University NUC
Original Assignee
Tokyo Medical and Dental University NUC
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to IL243564A priority patent/IL243564B/en
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    • C07D473/40—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present disclosure relates to a screening method, a pharmaceutical composition, and a kit for a substance capable of suppressing abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease.
  • Patent Document 1 discloses a reporter system that can detect alternative splicing and a method for identifying a compound that affects alternative splicing using the reporter system.
  • Familial Dysautonomia is a congenital / lethal autosomal recessive disorder with sensory and autonomic disturbances due to abnormal development, degeneration, and decline of nerves.
  • Most FD patients have a single base substitution (IVS20 + 6T ⁇ C mutation) within the 20th intron of the IKBKAP gene (FIG. 1A). Due to this mutation, abnormal splicing (exon skipping) in which exon 20 is not incorporated into mRNA occurs mainly in nervous system tissues, and normal IKBKAP protein is not produced. (FIG. 1A).
  • US Pat. No. 7,737,110 discloses that one of the cytokinins, Kinetin, can suppress aberrant splicing in the IVS20 + 6T ⁇ C mutant IKBKAP gene.
  • exons 9 and 10 undergo mutually exclusive splicing.
  • the product when exon 9 remains is PKM1 mRNA, and isoform PKM1 is produced.
  • the product when exon 10 remains is PKM2 mRNA, and isoform PKM2 is produced.
  • Expression of these isoforms is tissue specific, and PKM1 is expressed in cells with high energy requirements, such as nerve cells and muscle cells.
  • PKM2 is expressed in most cancers, organs with active cell proliferation, and undifferentiated cells (FIG. 5).
  • HSV-2 herpes simplex virus
  • the present disclosure provides compounds and pharmaceutical compositions, their use, or methods for searching for genetic diseases, cancers, infectious diseases, and the like. In one or more other embodiments, the present disclosure provides compounds and pharmaceutical compositions, their use, or methods for searching for familial autonomic ataxia.
  • the present disclosure relates to a compound represented by the following formula (I) or (I ′), a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or substituted or An unsubstituted heteroaryl group;
  • R 3 represents a hydrogen atom, a linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group, or CH 2 OC (O) R 4 —;
  • R 4 is a linear, branched or cyclic alkyl
  • the present disclosure provides a pharmaceutical comprising a compound represented by the formula (I) or (I ′) according to the present disclosure, a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Relates to the composition.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition of a disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing in one or a plurality of embodiments, and includes an active ingredient capable of suppressing the abnormal splicing.
  • the disclosure provides, in one or more embodiments, pre-- of an mutated IKBKAP gene having an abnormal splicing that contributes to a genetic disease in a mammalian cell or an individual or an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or an individual.
  • Methods to alter splicing that occurs in mRNA, abnormal splicing that contributes to genetic disease in mammalian cells or individuals, or occur in pre-mRNA of mutant IKBKAP genes with IVS20 + 6T ⁇ C mutation in human cells or individuals method for increasing the ratio of wild-type splicing to an abnormal splicing, or increases the existence ratio of exon 20 in the mRNA transcribed from mutated IKBKAP gene having IVS20 + 6T ⁇ C mutations in human cells or human individual.
  • a method Including contacting the cell with a human cell or a human individual with a compound represented by formula (I) or (I ′) or a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition according to the present disclosure. Regarding the method.
  • the present disclosure is a method for preventing, ameliorating, suppressing progression, and / or treating a genetic disease, wherein the pharmaceutical composition according to the present disclosure is administered to a subject in need thereof. Relates to the method of including.
  • the present disclosure is a screening method for a substance capable of suppressing abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease, (A) Introducing into a eukaryotic cell or eukaryotic organism a DNA construct fused and arranged or configured so that different reporter genes are expressed in a wild-type splice variant and an abnormal splice variant that contributes to the onset or progression of disease.
  • the present disclosure is a method for testing whether a substance suppresses abnormal splicing caused by the IVS20 + 6T ⁇ C mutation of the IKBKAP gene,
  • Introducing into a eukaryotic cell or eukaryote a DNA construct fused and arranged or configured to express a different reporter gene from the aberrant splice variant produced (B) contacting or expressing the substance to be tested in the eukaryotic cell or eukaryote;
  • the present disclosure provides a DNA construct fused and arranged or configured to express different reporter genes between a wild-type splice variant and an abnormal splice variant that contributes to the onset or progression of a disease. And a kit containing cells capable of causing the abnormal splicing.
  • a gene including exon a having a length of 3n + 1 or 3n + 2 bases and an intron having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation of an IKBKAP gene and two different reporter genes include exon a.
  • the present invention relates to a DNA construct in which a wild type splice variant and an abnormal splice variant in which exon a is skipped are fused and arranged or configured to express different reporter genes.
  • FIG. 1A is a diagram for explaining a single base substitution mutation (IVS20 + 6T ⁇ C mutation) in the 20th intron of the IKBKAP gene which most patients with familial autonomic dysfunction (FD) have.
  • IVS20 + 6T ⁇ C mutation abnormal splicing (exon skipping) mainly occurs in nerve tissue, and normal IKBKAP protein cannot be produced. This is considered to be the cause of FD.
  • FIG. 1B is a diagram illustrating one or more embodiments of a splicing reporter DNA construct. This construct was prepared by introducing an IVS20 + 6T ⁇ C mutation into a partial genomic region of the normal human IKBKAP gene and using the sequence.
  • FIG. 2 shows an example of the results of splicing products confirmed by RT-PCR after transfecting HeLa cells with wild type reporter construct and FD type reporter construct, respectively. Normal splicing products were confirmed in cells transfected with the wild type reporter construct, and abnormal splicing products were confirmed in cells transfected with the FD type reporter construct.
  • FIG. 3 is a diagram showing the fluorescence signal ratio of GFP (normal splicing) / RFP (abnormal splicing) after culturing HeLa cells transfected with the FD type reporter construct together with compound 1 (after 24 hours and 48 hours). .
  • Compound 1 increased the GFP / RFP ratio in a concentration-dependent manner, and the effect was superior to Kinetin.
  • FIG. 4 is a diagram in which the spliced product mRNA of the endogenous IKBKAP gene in FD patient cells was confirmed by RT-PCR after FD patient cells were cultured with Compound 1 (60 hours later). By adding Compound 1, abnormal splicing products were suppressed, normal splicing products were increased, and the effect was superior to Kinetin.
  • FIG. 1 is a diagram showing the fluorescence signal ratio of GFP (normal splicing) / RFP (abnormal splicing) after culturing HeLa cells transfected with the FD type reporter construct together
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating mutually exclusive splicing in exons 9, 10 of the PKM (pyruvate kinase M) gene. Isoform PKM2, which leaves exon 10, is expressed in most cancers.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating one or more embodiments of a splicing reporter DNA construct. Genomic regions of exons 8 to 11 of the PKM gene were ligated to RFP, GFP and cDNA ligated in different frames. If 9 is selected, the frame is matched to RFP, and if 10 is selected, the frame is designed to fit RFP. If 9 or 10 is not selected and skipped, either When both are selected, the frame is designed so that neither the RFP nor the GFP fits.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, A substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heteroaryl group.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in R 1 and R 2 may be a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, a 2-propyl group, 2-methyl -1-propyl group, 2-methyl-2-propyl group, 1-butyl group, 2-butyl group, 1-pentyl group, 2-pentyl group, 3-pentyl group, 2-methyl-1-butyl group, 3 -Methyl-1-butyl group, 2-methyl-2-butyl group, 3-methyl-2-butyl group, 2,2-dimethyl-1-propyl group, 1-hexyl group, 2-hexyl group, 3 -Hexyl group, 2-methyl-1-pentyl group, 3-methyl-1-pentyl group, 4-methyl-1-pentyl group, 2-methyl-2-pentyl group, 3-methyl-2-pentyl group, 4-methyl-2-pentyl group, 2-methyl-2-pentyl group,
  • Heteroaryl (including heteroaryl in heteroarylmethyl group) in R 1 and R 2 is, in one or more embodiments, a 5- to 6-membered monocyclic group containing 1 to 2 nitrogen atoms, a nitrogen atom 5 to 6-membered monocyclic group containing 1 to 2 and one oxygen atom or one sulfur atom, a 5-membered monocyclic group containing one oxygen atom or one sulfur atom, And bicyclic groups containing 1 to 4 nitrogen atoms and fused with a 6-membered ring and a 5- or 6-membered ring.
  • the aryl group for R 1 and R 2 include aryl groups having 10 or less carbon atoms such as a phenyl group and a naphthyl group.
  • the substituent for the aryl group and heteroaryl group in R 1 and R 2 may be one or the same or different, and in one or a plurality of embodiments, a halogen atom, a cyano group, a trifluoromethyl group, Nitro group, hydroxyl group, methylenedioxy group, lower alkyl group, lower alkoxy group, benzyloxy group, lower alkanoyloxy group, amino group, mono-lower alkylamino group, di-lower alkylamino group, carbamoyl group, lower alkylaminocarbonyl group A di-lower alkylaminocarbonyl group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkylthio group, a lower alkylsulfinyl group, a lower alkylsulfonyl group, a lower alkanoylamino group, or a lower alkylsulfonamide group.
  • R 3 represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, A substituted or unsubstituted heteroaryl group, or CH 2 OC (O) R 4 —;
  • R 4 is a linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heteroaryl group.
  • the straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in R 3 and R 4 may be methyl group, ethyl group, 1-propyl group, 2-propyl group, 2-methyl group.
  • Heteroaryl (including heteroaryl in heteroarylmethyl group) in R 3 and R 4 is, in one or more embodiments, a 5- to 6-membered monocyclic group containing 1 to 2 nitrogen atoms, a nitrogen atom 5 to 6-membered monocyclic group containing 1 to 2 and one oxygen atom or one sulfur atom, a 5-membered monocyclic group containing one oxygen atom or one sulfur atom, And bicyclic groups containing 1 to 4 nitrogen atoms and fused with a 6-membered ring and a 5- or 6-membered ring.
  • the aryl group for R 1 and R 2 include aryl groups having 10 or less carbon atoms such as a phenyl group and a naphthyl group.
  • the substituent for the aryl group and heteroaryl group in R 3 and R 4 may be one or the same or different, and in one or a plurality of embodiments, a halogen atom, a cyano group, a trifluoromethyl group, Nitro group, hydroxyl group, methylenedioxy group, lower alkyl group, lower alkoxy group, benzyloxy group, lower alkanoyloxy group, amino group, mono-lower alkylamino group, di-lower alkylamino group, carbamoyl group, lower alkylaminocarbonyl group A di-lower alkylaminocarbonyl group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkylthio group, a lower alkylsulfinyl group, a lower alkylsulfonyl group, a lower alkanoylamino group, or a lower alkylsulfonamide group.
  • X represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group, an amino group substituted with the aforementioned R 1 and R 2 , an azide group, a cyano group, a nitro group, a hydroxyl group, or a carbon number of 1 -6 linear, branched or cyclic alkyloxy groups, substituted or unsubstituted aryloxy groups, substituted or unsubstituted heteroaryloxy groups, mercapto groups, straight chain, branched or cyclic groups having 1-6 carbon atoms Alkylthio group, substituted or unsubstituted arylthio group, substituted or unsubstituted heteroarylthio group, linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, benzyl or heteroarylmethyl group, substituted or unsubstituted Or a substituted or unsubstituted heteroaryl group.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in X is, in one or more embodiments, in one or more embodiments, a methyl group Ethyl group, 1-propyl group, 2-propyl group, 2-methyl-1-propyl group, 2-methyl-2-propyl group, 1-butyl group, 2-butyl group, 1-pentyl group, 2-pentyl Group, 3-pentyl group, 2-methyl-1-butyl group, 3-methyl-1-butyl group, 2-methyl-2-butyl group, 3-methyl-2-butyl group, 2,2-dimethyl-1 -Propyl group, 1-hexyl group, 2-hexyl group, 3-hexyl group, 2-methyl-1-pentyl group, 3-methyl-1-pentyl group, 4-methyl-1-pentyl group, 2 -Methyl-2-pentyl group, 3 Methyl
  • C1-C6 cyclic alkyl group (including the alkyl group in an alkyloxy group and an alkylthio group) in X, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl are mentioned in one or some embodiment.
  • the heteroaryl in X is, in one or more embodiments, a 5- to 6-membered monocyclic ring having 1 to 2 nitrogen atoms Groups of the formula, 5- to 6-membered monocyclic groups containing 1 to 2 nitrogen atoms and 1 oxygen atom or 1 sulfur atom, 5 members containing 1 oxygen atom or 1 sulfur atom A monocyclic group, a bicyclic group containing 1 to 4 nitrogen atoms and condensed with a 6-membered ring and a 5- or 6-membered ring is exemplified.
  • Examples of the aryl group in X include aryl groups having 10 or less carbon atoms such as a phenyl group and a naphthyl group.
  • the substituent for the aryl group and heteroaryl group in X may be one or the same or different, and in one or a plurality of embodiments, a halogen atom, a cyano group, a trifluoromethyl group, a nitro group, a hydroxyl group , Methylenedioxy group, lower alkyl group, lower alkoxy group, benzyloxy group, lower alkanoyloxy group, amino group, mono-lower alkylamino group, di-lower alkylamino group, carbamoyl group, lower alkylaminocarbonyl group, di-lower alkyl Examples thereof include an aminocarbonyl group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkylthio group, a lower alkylsulfinyl group, a lower alkylsulfonyl group, a lower alkanoylamino group, and a lower alkylsulfonamide group.
  • the halogen atom in X includes fluorine, chlorine, bromine, or iodine atoms.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) does not contain Kinetin in one or a plurality of embodiments, and in one or a plurality of embodiments, the compounds of the formulas (I) and (I ′) In which R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and X are Kinetin (R 1 and R 2 are 2-furylmethyl and a hydrogen atom, R 3 is a hydrogen atom and X is a hydrogen atom) Absent.
  • each isomer Or a mixture thereof when the compound represented by the formula (I) or (I ′) has an asymmetric carbon atom and / or has a stereoisomer, in one or a plurality of embodiments, each isomer Or a mixture thereof.
  • the “prodrug” includes, in one or a plurality of embodiments, those that are easily hydrolyzed in vivo to regenerate the compound represented by the formula (I) or (I ′).
  • the compound having a group include a compound in which the carboxyl group is an alkoxycarbonyl group, a compound in which the alkylthiocarbonyl group is formed, or a compound in which the alkylaminocarbonyl group is formed.
  • a compound having an amino group a compound in which the amino group is substituted with an alkanoyl group to become an alkanoylamino group, a compound in which the amino group is substituted with an alkoxycarbonyl group to become an alkoxycarbonylamino group, an acyloxymethylamino group, Or a compound that has become hydroxylamine.
  • a compound having a hydroxyl group a compound in which the hydroxyl group is substituted with the acyl group to become an acyloxy group, a compound that has become a phosphate ester, or a compound that has become an acyloxymethyloxy group can be given.
  • alkyl moiety of the group used for forming a prodrug examples include the alkyl group, and the alkyl group may be substituted (for example, with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms).
  • the alkyl group may be substituted (for example, with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms).
  • lower alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, methoxymethoxycarbonyl, ethoxymethoxy, etc.
  • Examples include lower (eg, having 1 to 6 carbon atoms) alkoxycarbonyl substituted with an alkoxy group such as carbonyl, 2-methoxyethoxycarbonyl, 2-methoxyethoxymethoxycarbonyl, and pivaloyloxymethoxycarbonyl.
  • the “pharmaceutically acceptable salt” includes a pharmaceutically, pharmacologically, and / or pharmaceutically acceptable salt.
  • an inorganic acid salt, an organic acid salt, an inorganic base salt, an organic base examples include salts, acidic or basic amino acid salts and the like.
  • Preferable examples of the inorganic acid salt include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like, and preferable examples of the organic acid salt include, for example, acetate, succinate, Examples thereof include fumarate, maleate, tartrate, citrate, lactate, stearate, benzoate, methanesulfonate, and p-toluenesulfonate.
  • Preferred examples of the inorganic base salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
  • Preferable examples of the organic base salt include diethylamine salt, diethanolamine salt, meglumine salt, N, N′-dibenzylethylenediamine salt and the like.
  • Preferred examples of the acidic amino acid salt include aspartate and glutamate.
  • Preferable examples of the basic amino acid salt include arginine salt, lysine salt, ornithine salt and the like.
  • the “salt of a compound” may include a hydrate that can be formed by absorbing moisture when the compound is left in the air. Further, in the present disclosure, the “salt of a compound” may include a solvate that can be formed by absorbing a certain kind of other solvent.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) is a compound of the following formula (II).
  • Y is a halogen atom.
  • the halogen atom in Y includes fluorine, chlorine, bromine, or iodine atoms in one or more embodiments.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition containing a compound represented by formula (I) or (I ′) or a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is used for use in suppressing abnormal splicing that contributes to a genetic disease. sell.
  • abnormal splicing that contributes to a genetic disease is abnormal splicing that contributes to a genetic disease caused by a genetic mutation in a gene to be spliced in one or a plurality of embodiments.
  • Abnormal splashing that contributes to genetic disease includes, but is not limited to, in one or more embodiments, pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation that causes familial autonomic dysfunction (FD) (See above and FIG. 1A).
  • FD familial autonomic dysfunction
  • many genetic diseases caused by abnormal splicing are known.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in one or a plurality of embodiments, exhibits abnormal splicing that contributes to a genetic disease in a mammalian cell or a mammalian individual. It can be used for changing applications.
  • the abnormal splicing that contributes to the genetic disease is, in one or more embodiments, abnormal splicing due to a genetic mutation in the spliced gene, and in one or more embodiments, an IVS20 + 6T ⁇ C mutation. Splicing that occurs in the pre-mRNA of the mutated IKBKAP gene.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is a wild type against abnormal splicing that contributes to a genetic disease in a mammalian cell or a mammalian individual. It can be used in applications to increase the splicing ratio.
  • the abnormal splicing that contributes to the genetic disease is, in one or more embodiments, abnormal splicing due to a genetic mutation in the spliced gene, and in one or more embodiments, an IVS20 + 6T ⁇ C mutation. Splicing that occurs in the pre-mRNA of the mutated IKBKAP gene.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is, in one or a plurality of embodiments, a mutant IKBKAP having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual. It can be used in applications to alter the splicing that occurs in the gene pre-mRNA.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is a mutant IKBKAP having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual. It can be used in applications to increase the ratio of wild-type splicing to aberrant splicing occurring in the gene pre-mRNA.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is, in one or more embodiments, a mutation having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual. It can be used in applications to increase the abundance of exon 20 in mRNA transcribed from the IKBKAP gene.
  • mammalian cells or human cells include in vivo, in vitro, or ex vivo cells in one or more embodiments.
  • the mammalian cell is a human cell or a non-human mammalian cell.
  • the human cell is, in one or more embodiments, a human nerve cell.
  • the human cell and the human individual have an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in the endogenous IKBKAP gene in one or a plurality of embodiments.
  • the IVS20 + 6T ⁇ C mutation is a single base substitution (T ⁇ C) in the 20th intron of the IKBKAP gene, as shown in FIG. 1A.
  • Whether or not a human cell and a human individual have an IVS20 + 6T ⁇ C mutation includes, but is not limited to, a method capable of detecting single base substitution in one or a plurality of embodiments, or a base sequence sequence, an array, various genes An amplification method is mentioned.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is used to prevent or improve a genetic disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing. It can be used for progress inhibition and / or therapeutic applications.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure develops or progresses abnormal splicing due to gene mutation in the spliced gene. It can be used for prevention, amelioration, progression inhibition, and / or treatment of genetic diseases that contribute to the above.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure is an abnormality caused by a pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation. It can be used for prevention, amelioration, progression inhibition, and / or treatment of diseases involving splicing.
  • the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in one or a plurality of embodiments, prevents, improves, suppresses progression of familial autonomic dysfunction (FD), and / Or can be used for therapeutic applications.
  • the “pharmaceutical composition” may be a dosage form suitable for an administration form by applying a well-known formulation technique in one or a plurality of embodiments.
  • the dosage form include, but are not limited to, oral administration in a dosage form such as a tablet, capsule, granule, powder, pill, troche, syrup, and liquid.
  • parenteral administration in dosage forms such as injections, liquids, aerosols, suppositories, patches, lotions, liniments, ointments, eye drops and the like can be mentioned.
  • These preparations can be produced by known methods using additives such as, but not limited to, excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, and diluents.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure does not contain other active ingredients having a therapeutic effect, or further contains one or more active ingredients.
  • excipient examples include, but are not limited to, starch such as starch, potato starch, and corn starch, lactose, crystalline cellulose, calcium hydrogen phosphate, and the like.
  • coating agent examples include, but are not limited to, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, shellac, talc, carnauba wax, paraffin, and the like.
  • binder include, but are not limited to, polyvinyl pyrrolidone, macrogol and the same compound as the excipient.
  • disintegrant examples include, but are not limited to, compounds similar to the excipients and chemically modified starch and celluloses such as croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • stabilizer examples include, but are not limited to, paraoxybenzoates such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; phenol, cresol Mention may be made of such phenols; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid.
  • flavoring agent examples include, but are not limited to, sweeteners, acidulants, and fragrances that are commonly used.
  • the solvent is not limited to these, but ethanol, phenol, chlorocresol, purified water, distilled water and the like can be used, and a surfactant or an emulsifier can also be used as necessary.
  • a surfactant or an emulsifier include, but are not limited to, polysorbate 80, polyoxyl 40 stearate, lauromacrogol, and the like.
  • the method of using the pharmaceutical composition according to the present disclosure may vary depending on symptoms, age, administration method, and the like.
  • the method of use is not limited to these, but is intermittent or continuous so that the concentration in the body of the compound represented by the formula (I) or (I ′) as the active ingredient is between 100 nM and 1 mM.
  • the lower limit is 0.01 mg as converted into the compound represented by the formula (I) or (I ′) per day for a subject (adult if human) (Preferably 0.1 mg),
  • 2000 mg preferably 500 mg, more preferably 100 mg
  • the lower limit is 0.001 mg (preferably 0.01 mg) and the upper limit is 500 mg (preferably 50 mg) per day for a subject (adult if human). Is divided into one or several times and administered according to symptoms.
  • the present disclosure may relate to the following method.
  • A Aberrant splicing that contributes to the development or progression of a genetic disease in a mammalian cell or individual, or changes splicing that occurs in a pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or individual Method.
  • B Wild against abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a genetic disease in a mammalian cell or individual, or abnormal splicing that occurs in a pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or individual A method to increase the rate of mold splicing.
  • (C) A method for increasing the abundance of exon 20 in mRNA transcribed from a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or human individual. These methods (a) to (c) can be achieved by contacting the human cell or the human individual with the compound represented by the formula (I) or (I ′) or the pharmaceutical composition according to the present disclosure. .
  • the mammalian cells or human cells in the methods (a) to (c) above include in vivo, in vitro, or ex vivo cells.
  • the mammalian cell is a human cell in one or more embodiments, and the human cell is a human nerve cell in one or more embodiments.
  • the human cells and human individuals in the methods (a) to (c) have an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in the endogenous IKBKAP gene.
  • a method of contacting a compound represented by formula (I) or (I ′) or a pharmaceutical composition according to the present disclosure with an invitro or ex vivo mammalian cell or human cell is not limited to one or a plurality of embodiments.
  • Examples include adding a compound represented by the formula (I) or (I ′) or a salt thereof or a pharmaceutical composition according to the present disclosure to a cell culture medium.
  • Examples of the concentration of addition include, but are not limited to, addition in such a manner that the concentration of the compound represented by the formula (I) or (I ′) is between 100 nM and 1 mM.
  • a method of contacting a human cell and a human individual of in vivo with a compound represented by (I) or (I ′) or a pharmaceutical composition according to the present disclosure includes the above-described pharmaceutical composition. It can conform to the method of use.
  • the present disclosure further includes administering a pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject in need thereof, a disease or familial autonomic dysfunction that contributes to the onset or progression of abnormal splicing
  • the present invention relates to a method for preventing, improving, suppressing progression and / or treating (FD).
  • the subject is affected by the disease, a genetically mutated gene carrier that contributes to the onset or progression of abnormal splicing, an FD patient, or an IVS20 + 6T ⁇ C mutation Examples include mutant IKBKAP gene carriers.
  • the administration method of the pharmaceutical composition which concerns on this indication, it can apply to the usage method of the above-mentioned pharmaceutical composition in one or some embodiment.
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or substituted or An unsubstituted heteroaryl group;
  • R 3 represents a hydrogen atom, a linear or branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group, or CH 2 OC (O) R 4 —;
  • R 4 is a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzyl or heteroarylmethyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group, or CH 2
  • [A2] A pharmaceutical composition comprising the compound according to [A1] or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • [A3] To alter splicing that occurs in pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual, or abnormal splicing that contributes to a genetic disease in a mammalian cell or a mammalian individual , Abnormal splicing that contributes to genetic disease in mammalian cells or mammalian individuals, or the ratio of wild-type splicing to aberrant splicing that occurs in pre-mRNA of mutant IKBKAP gene with IVS20 + 6T ⁇ C mutation in human cells or human individuals To increase or The pharmaceutical composition according to [A2] for increasing the abundance ratio of exon 20 in mRNA transcribed from a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual.
  • [A4] The pharmaceutical composition according to [A3], wherein the cells are nerve cells.
  • [A5] The pharmaceutical composition according to any one of [A2] to [A4] for prevention, improvement, progression inhibition, and / or treatment of a genetic disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing.
  • [A6] The pharmaceutical composition according to [A5], wherein the abnormal splicing is abnormal splicing caused by a gene mutation in a gene to be spliced.
  • [A7] The pharmaceutical composition according to [A6], wherein the genetic disease is familial autonomic dysfunction (FD).
  • [A8] A method of changing splicing occurring in pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having abnormal splicing that contributes to a genetic disease in a mammalian cell or an individual or an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or an individual, a mammalian cell Or a method of increasing the ratio of wild-type splicing to aberrant splicing that contributes to genetic disease in a mammalian individual or aberrant splicing that occurs in a pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or human individual, Or a method for increasing the abundance ratio of exon 20 in mRNA transcribed from a mutant IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human cell or a human individual, wherein the compound described in [A1] Or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutical composition according to any one of [A2]
  • [A9] A method of altering splicing that occurs in pre-mRNA of a mutant IKBKAP gene having abnormal IVS20 + 6T ⁇ C mutation in human individuals, which contributes to genetic diseases in mammalian individuals, a cause of genetic diseases in mammalian individuals
  • a method of increasing the ratio of wild-type splicing to aberrant splicing occurring in pre-mRNA of the IKBKAP gene that has an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human individual, or an IVS20 + 6T ⁇ C mutation in a human individual A method for increasing the abundance ratio of exon 20 in mRNA transcribed from a mutated IKBKAP gene having, comprising administering to said individual the pharmaceutical composition according to any of [A2] to [A7] .
  • the compound according to [A1] the compound according to [A1], a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or any one of [A2] to [A7] Use of the described pharmaceutical composition.
  • the present disclosure relates to a splicing reporter DNA construct that is fused and arranged or configured to express different reporter genes between a wild-type splice variant and an abnormal splice variant that contributes to disease onset or progression.
  • abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease refers to, in one or more embodiments, alternative splicing in a disease, alternative splicing specific to a disease, or more splices in a disease than normal.
  • Diseases include genetic diseases, cancer, or infectious diseases.
  • Abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a genetic disease includes, but is not limited to, in one or more embodiments, abnormal splicing resulting from genetic mutations in the spliced gene, in one or more further embodiments Examples include splicing that occurs in the pre-mRNA of the mutant IKBKAP gene having the IVS20 + 6T ⁇ C mutation, which is the cause of familial autonomic dystonia (FD) (described above and FIG. 1A). In addition to FD, many genetic diseases caused by abnormal splicing are known.
  • FD familial autonomic dystonia
  • Abnormal splicing that contributes to the development or progression of cancer includes, but is not limited to, in one or more embodiments, a mutually exclusive splicing of exons 9, 10 of the PKM (pyruvate kinase M) gene, and a PKM2 isoform ( Exon 10) Splicing selected is mentioned (above and FIG. 5).
  • PKM2 is expressed in most cancers and is thought to contribute to tumor growth.
  • alternative splicing that contributes to the onset or progression of cancer is considered to exist.
  • Abnormal splashing that contributes to the onset or progression of infection includes, but is not limited to, one or more embodiments of PML (promyelocyticeloleukemia) isoforms in cells infected with type 2 herpes simplex virus (HSV-2).
  • PML promyelocyticeloleukemia
  • HSV-2 herpes simplex virus
  • Alternative splicing that results in expression switching is known (Nojima et al., Nucleic Acid Research, 2009).
  • Infectious diseases include, but are not limited to, infections caused by viruses, bacteria, fungi, parasites.
  • the mammalian cell or the human cell includes an in vivo, in vitro, or ex vivo cell in one or a plurality of embodiments.
  • the mammalian cell is a human cell or a non-human mammalian cell.
  • the cell is a nerve cell, a cancer cell, or an infected cell.
  • a splicing reporter DNA construct according to the present disclosure is a DNA construct that can function as a splicing reporter capable of detecting abnormal splicing of a gene region containing an IVS20 + 6T ⁇ C mutation.
  • the DNA construct according to this embodiment includes a gene containing exon a having a length of 3n + 1 or 3n + 2 bases and an intron having an IVSKAP gene IVS20 + 6T ⁇ C mutation and two different reporter genes.
  • a wild type splice variant containing exon a and an abnormal splice variant in which exon a is skipped are fused and arranged or configured to express different reporter genes.
  • the reporter construct according to the present embodiment includes a region of exons 19 to 21 of the human IKBKAP gene having an IVS20 + 6T ⁇ C mutation and two different reporter genes, A wild type splice variant containing 20 exons and an abnormal splice variant in which exon 20 is skipped are fused and arranged or configured to express different reporter genes.
  • the region part from exon 19 to exon 21 is a part of exon 19 and / or 21 exon, as long as aberrant splicing occurs in which exon 20 is exon skipped. May be deleted.
  • the reporter gene in the DNA construct according to this embodiment is a gene of various fluorescent proteins in one or more embodiments that are not limited.
  • the DNA construct according to the present embodiment can be described as a reporter construct shown in FIG. 1B in one or a plurality of non-limiting embodiments.
  • the GST protein gene, the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene, RFP (red fluorescent protein), and GFP (green fluorescent protein) are connected in this order downstream of the CAG promoter.
  • the GST protein gene and the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene become mRNA of 3n + 1 base length, and the stop codon (UAA) of the RFP gene is out-of-frame.
  • UAA stop codon
  • the GST protein gene and the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene become 3n-base mRNA, and the RFP gene and its stop codon (UAA) are translated in-frame. And red fluorescent protein is expressed.
  • the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure is a splicing reporter DNA construct fused and arranged or configured so that different reporter genes are expressed by mutually exclusive splicing of exons 9 and 10 of the PKM gene.
  • the DNA construct according to this embodiment can be described as a reporter construct shown in FIG. 6 in one or a plurality of non-limiting embodiments. Genomic regions of exons 8 to 11 of the PKM gene were ligated to RFP, GFP and cDNA ligated in different frames. If 9 is selected, the frame is matched to RFP, and if 10 is selected, the frame is designed to fit RFP. If 9 or 10 is not selected and skipped, either When both are selected, the frame is designed so that neither the RFP nor the GFP fits.
  • the present disclosure is a method for screening a substance that can suppress abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease, (A) introducing the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure into a eukaryotic cell or eukaryote, and setting the introduced cell or organism as necessary to cause the abnormal splicing; (B) contacting or expressing the test substance in the eukaryotic cell or eukaryote; (C) detecting at least one of wild-type splicing and abnormal splicing by expression of the reporter gene; and (D) determining whether the ratio of wild-type splicing reporter gene expression to aberrant splicing reporter gene expression has changed as compared to a control that does not contact
  • eukaryotic cells or eukaryotes include mammalian or human cells or individuals in one or more embodiments.
  • in vivo, in vitro, or ex vivo cells can be used as the screening method according to the present disclosure.
  • the mammalian cell is a human cell, and in one or more embodiments, the cell is a nerve cell, a cancer cell, or an infected cell.
  • “Making the introduced cell or organism a condition under which the abnormal splicing occurs” means that in one or more non-limiting embodiments, the oxygen concentration is set to 0.5 so as to be the same as the condition of the tumor cell. % And the presence of oligomycin, an ATP synthesis inhibitor.
  • test substance is a protein in one or more embodiments
  • a cDNA expression vector encoding the protein is further introduced into a eukaryotic cell or eukaryote into which the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure has been introduced. You may make it express.
  • the test substance is expressed by introducing a vector capable of expressing the test substance into the eukaryotic cell or eukaryote.
  • a gene expression library or an expression vector incorporating cDNA can be used as appropriate.
  • test substance is a low molecular compound in one or a plurality of embodiments
  • eukaryotic cells or eukaryotic organisms into which the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure has been introduced are cultured in the presence of the low molecular compound. You may make it contact.
  • the screening method according to the present disclosure is a screening method for a candidate compound that becomes an active ingredient of a pharmaceutical composition for a disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing.
  • the disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing is a genetic disease, cancer, or infectious disease in one or more embodiments.
  • the genetic disease includes, in one or more non-limiting embodiments, familial autonomic dysfunction (FD).
  • the screening method according to the present disclosure is, in one or more other embodiments, a method for testing whether a substance suppresses abnormal splicing caused by the IVS20 + 6T ⁇ C mutation of the IKBKAP gene, (A) introducing a reporter DNA construct according to the present disclosure into a eukaryotic cell or eukaryotic organism, (B) contacting or expressing the substance to be tested in the eukaryotic cell or eukaryote; (C) detecting at least one of wild-type splicing or abnormal splicing by expression of the reporter gene; and (D) determining whether the ratio of wild-type splicing reporter gene expression to abnormal splicing reporter gene expression has changed as compared to a control that does not contact the substance to be tested.
  • step (C) of the screening method according to the present disclosure at least one of wild-type splicing and abnormal splicing is detected by expression of the reporter gene.
  • detection of a fluorescent signal, RT-PCR, etc. Is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the reporter gene.
  • step (D) of the screening method according to the present disclosure when the ratio of wild-type splicing in cells contacted with a test substance is increased, it can be selected as a candidate substance that can suppress abnormal splicing .
  • the test substance may be a low molecular weight compound in one or more other embodiments.
  • the present disclosure provides a method for screening a low molecular weight compound capable of suppressing abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease, wherein (A) the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure is a eukaryotic Introducing into a cell or eukaryote and making the introduced cell or organism as a condition under which the abnormal splicing occurs, and (B) applying a low molecular compound to be tested to the eukaryotic cell or eukaryote.
  • the present invention also relates to a screening method for a low molecular weight compound that suppresses abnormal splicing caused by the IVS20 + 6T ⁇ C mutation of the IKBKAP gene, and (A) introduces a reporter DNA construct according to the present disclosure into a eukaryotic cell or a eukaryotic organism.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition for a disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing, including an active ingredient capable of suppressing the abnormal splicing.
  • the present disclosure relates to a kit including the splicing reporter DNA construct according to the present disclosure and a cell capable of causing the abnormal splicing.
  • the kit can be used in a screening method according to the present disclosure.
  • the kit may further include a vector capable of expressing the test substance.
  • a screening method for a substance capable of suppressing abnormal splicing that contributes to the onset or progression of a disease (A) Introducing into a eukaryotic cell or eukaryotic organism a DNA construct fused and arranged or configured so that different reporter genes are expressed in a wild-type splice variant and an abnormal splice variant that contributes to the onset or progression of disease.
  • [B3] The method according to [B1] or [B2], which is a screening method for a candidate compound serving as an active ingredient of a pharmaceutical composition for a disease in which abnormal splicing contributes to onset or progression.
  • [B4] The method according to any one of [B1] to [B3], wherein the disease is a genetic disease, cancer, or infectious disease.
  • [B5] A method for testing whether or not a substance suppresses abnormal splicing caused by the IVS20 + 6T ⁇ C mutation of the IKBKAP gene, (A) A gene containing 3n + 1 or 3n + 2 bases in length exon a and an intron having an IKBKAP gene IVS20 + 6T ⁇ C mutation and two different reporter genes are skipped by a wild-type splice variant containing exon a and exon a Introducing into a eukaryotic cell or eukaryote a DNA construct fused and arranged or configured to express a different reporter gene from the aberrant splice variant produced, (B) contacting or expressing the substance to be tested in the eukaryotic cell or eukaryote; (C) detecting at least one of wild-type splicing or abnormal splicing by expression of the reporter gene; and (D) determining whether the ratio of wild-type splicing reporter gene expression to aberrant splicing reporter gene expression
  • a pharmaceutical composition comprising an active ingredient capable of suppressing abnormal splicing for the prevention, amelioration, progression suppression, and / or treatment of diseases that contribute to the onset or progression of abnormal splicing.
  • the pharmaceutical composition according to [B6], wherein the disease that contributes to the onset or progression of abnormal splicing is a genetic disease, cancer, or infectious disease.
  • [B8] A 3n + 1 or 3n + 2 base-length exon a and a gene containing an IKBKAP gene IVS20 + 6T ⁇ C intron and two different reporter genes are skipped by a wild-type splice variant containing exon a and exon a
  • a DNA construct fused and arranged or configured to express a different reporter gene between a wild-type splice variant and an abnormal splice variant that contributes to the onset or progression of a disease, and a cell capable of causing the abnormal splicing Including kit.
  • the kit according to [B9] further comprising a vector capable of expressing the test substance.
  • Production of Compound 1 Compound 1 was synthesized as follows with reference to the method disclosed in WO2010 / 118367. Acetonitrile of 2,6-dichloro-1H-purine (189 mg, 1.00 mmol, commercial product) and furfurylamine (97.0 mg, 1.00 mmol, commercial product) To a solution of (acetonitrile) (20 mL), triethylamine (0.15 mL, 1.08 mmol) was added at room temperature. The mixture was stirred at room temperature for 6 hours and then stirred at 60 ° C. for 3 hours. The mixed solution was concentrated under reduced pressure, water was added, and the resulting white precipitate was collected by filtration.
  • Reference compound 1 The reference compound 1 is Kinetin, and a product manufactured by Nacala Iraq was used.
  • a reporter construct (FD type) as shown in FIG. 1B was prepared using the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene having the IVS20 + 6T ⁇ C mutation shown in FIG. 1A. That is, a construct was produced in which the GST protein gene, the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene, RFP (red fluorescent protein), and GFP (green fluorescent protein) were linked in this order downstream of the CAG promoter.
  • the GST protein gene and the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene become mRNA of 3n + 1 base length, and the stop codon (UAA) of the RFP gene is Out of frame, the GFP gene is translated in frame and green fluorescent protein is expressed.
  • the GST protein gene and the 19-21 exon portion of the mutant human IKBKAP gene become 3n-base mRNA, and the RFP gene and its stop codon (UAA) are translated in-frame. And red fluorescent protein is expressed.
  • a reporter construct wild type was also prepared which was the same as the above reporter construct (FD type) except that the mutant human IKBKAP gene was a wild type human IKBKAP gene.
  • the prepared FD-type reporter construct and wild-type reporter construct were transfected into HeLa cells, and it was confirmed whether abnormal splicing in FD patients could be reproduced.
  • FD type reporter construct Using the FD type reporter construct, a compound capable of suppressing abnormal splicing that occurs in pre-mRNA transcribed from the construct was screened. Specifically, the HeLa cells transfected with the FD type reporter construct are contacted with a test compound and cultured, and after a predetermined time, fluorescence observation is performed, and fluorescence of GFP (normal splicing product) and RFP (abnormal splicing product) is observed. A substance having a stronger intensity ratio (GFP / RFP) than the control (for example, solvent alone or Kinetin (reference compound 1)) was selected. As a result, Compound 1 was selected as a candidate compound for a compound that suppresses abnormal splicing.
  • GFP normal splicing product
  • RFP abnormal splicing product
  • the graph of FIG. 3 shows the relationship between the administration concentration and the fluorescence intensity ratio (GFP / RFP) for control (solvent only), Kinetin, and Compound 1.
  • GFP / RFP fluorescence intensity ratio
  • Compound 1 had an increase in the fluorescence intensity ratio (GFP / RFP) in a concentration-dependent manner, and the degree of increase was significantly superior to that of Kinetin. Therefore, it was shown that Compound 1 can suppress abnormal splicing caused by the IVS20 + 6T ⁇ C mutation more effectively than Kinetin.
  • Compound 1 and Kinetin were added to the patient cell culture solution at a concentration of 2 ⁇ M or 50 ⁇ M, cultured for 60 hours, and then the cells were collected and subjected to RT-PCR. As controls, untreated cells and DMSO (solvent) treated cells were used. The result is shown in FIG.
  • Compound 1 can suppress abnormal splicing at a concentration as low as 2 ⁇ M. Moreover, it was shown that the abnormal splicing inhibitory activity is comparable to Kinetin at a concentration of 50 ⁇ M.

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Abstract

異常スプライスバリアントが関わる疾病に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらの探索方法の提供。一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。その他の一又は複数の実施形態において、野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを利用したスクリーニング方法。

Description

疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法
　本開示は、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法、医薬組成物、キットに関する。
　特許文献１は、選択的スプライシングを検出できるレポーターシステム及びそれを用いて選択的スプライシングに影響を及ぼす化合物を同定する方法を開示する。
国際公開第2011/152043号
　家族性自律神経失調症（ＦＤ: Familial Dysautonomia）は、神経の発達異常、変性、衰退により、感覚神経と自律神経に障害を持つ先天性・致死性の常染色体劣性遺伝病である。ＦＤ患者のほとんどは、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第２０イントロン内に一塩基置換（ＩＶＳ２０+6T→C変異）を持つ（図１Ａ）。この変異のために、主に神経系の組織において第２０エクソンがｍＲＮＡに組み込まれない異常スプライシング（エクソンスキッピング）が起き、正常なＩＫＢＫＡＰタンパク質が産生されなくなることが、病気の原因であると考えられている（図１Ａ）。
　米国特許第７７３７１１０号は、サイトカイニンの１つであるＫｉｎｅｔｉｎが、ＩＶＳ２０+6T→C変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子における異常スプライシングを抑制できることを開示する。
　ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子は、エクソン９、１０が相互排他的スプライシングを受ける。エクソン９が残るときの産物はＰＫＭ１ｍＲＮＡであり、アイソフォームＰＫＭ１が産生される。エクソン１０が残るときの産物はＰＫＭ２ｍＲＮＡであり、アイソフォームＰＫＭ２が産生される。これらのアイソフォームの発現は組織特異性があり、ＰＫＭ１はエネルギー要求性の高い細胞、例えば、神経細胞や筋細胞で発現する。一方、ＰＫＭ２は、ほとんどの癌、細胞増殖が活発な臓器、未分化細胞で発現する（図５）。
　低酸素状態など、vivoにおけるがん組織に近い環境下では、ＰＫＭ２アイソフォームを発現する細胞のほうがＰＫＭ１を発現する細胞よりも増殖能が高い。また、各アイソフォームを発現させた腫瘍細胞の移植実験では、ＰＫＭ２アイソフォームを発現する腫瘍の方がＰＫＭ１を発現する腫瘍よりも腫瘍の増大が顕著である（Chrisofk et al., Nature (Letters) 2008）。
　２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）は、ウイルス感染した細胞において、選択的スプライシングの改変によってＰＭＬ（promyelocytic leukemia）アイソフォームの発現をスイッチングさせることが知られている（Nojima et al., Nucleic Acid Research, 2009）。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝病、がん、又は感染症等に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらの探索方法を提供する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらの探索方法を提供する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
　Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
　Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4－である；
　Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
　Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
　本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
　前記細胞に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は本開示に係る医薬組成物をヒト細胞又はヒト個体に接触させることを含む方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、本開示に係る医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
　（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
　（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
　（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
　（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
　（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキットに関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトに関する。
図１Ａは、家族性自律神経失調症（ＦＤ）患者のほとんどが有する、IKBKAP遺伝子の第20イントロン内の一塩基置換変異（ＩＶＳ２０+6T→C変異）を説明する図である。ＩＶＳ２０+6T→C変異があると主に神経組織において異常スプライシング（エクソンスキッピング）が起き、正常なIKBKAPタンパク質が産生されなくなる。このことがＦＤの原因と考えられている。 図１Ｂは、スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの一又は複数の実施形態を説明する図である。このコンストラクトは、正常ヒトIKBKAP遺伝子の一部のゲノム領域に対してＩＶＳ２０+6T→C変異を導入し、その配列を用いて作製された。このコンストラクトにおいて、野生型スプライシングの場合、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳される。一方、異常スプライシングの場合には、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳される。 図２は、野生型レポーターコンストラクト及びＦＤ型レポーターコンストラクトをそれぞれＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ＲＴ－ＰＣＲによりスプライシング産物を確認した結果の一例を示す。野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクトした細胞では正常スプライシング産物が確認され、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクトした細胞では異常スプライシング産物が確認された。 図３は、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を化合物１とともに培養した後（２４時間及び４８時間後）のＧＦＰ（正常スプライシング）／ＲＦＰ（異常スプライシング）の蛍光シグナル比を示す図である。化合物１は、濃度依存的にＧＦＰ／ＲＦＰ比を高め、その効果はＫｉｎｅｔｉｎよりも優れていた。 図４は、ＦＤ患者細胞を化合物１とともに培養した後（６０時間後）、ＦＤ患者細胞の内在性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のスプライシング産物ｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲにより確認した図である。化合物１を添加することにより、異常スプライシング産物が抑制され、正常スプライシング産物が増加され、その効果はＫｉｎｅｔｉｎよりも優れていた。 図５は、ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子の、エクソン９、１０における相互排他的スプライシングを説明する概略図である。エクソン１０が残るアイソフォームＰＫＭ２は、ほとんどの癌で発現する。 図６は、スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの一又は複数の実施形態を説明する図である。ＰＫＭ遺伝子のエクソン８から１１のゲノム領域を、フレームの異なるよう連結させたＲＦＰ、ＧＦＰ、ｃＤＮＡに連結させた。９を選択した場合には、ＲＦＰにフレームが合い、１０を選択した場合にはＲＦＰにフレームが合うように設計し、９、１０どちらも選択されず、スキップしてしまった場合、また、どちらとも選択された場合にはＲＦＰ及びＧＦＰのどちらにもフレームが合わないように設計されている。
　［一般式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物］
　本開示は、一態様において、下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
　Ｒ1及びＲ2における炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、２－メチル－１－プロピル基、２－メチル－２－プロピル基、１－ブチル基、２－ブチル基、１－ペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、２－メチル－１－ブチル基、３－メチル－１－ブチル基、２－メチル－２－ブチル基、３－メチル－２－ブチル基、２，２－ジメチル－１－プロピル基、１－へキシル基、２－へキシル基、３－へキシル基、２－メチル－１－ペンチル基、３－メチル－１－ペンチル基、４－メチル－１－ペンチル基、２－メチル－２－ペンチル基、３－メチル－２－ペンチル基、４－メチル－２－ペンチル基、２－メチル－３－ペンチル基、３－メチル－３－ペンチル基、２，３－ジメチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－１－ブチル基、２，２－ジメチル－１－ブチル基、２－エチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－２－ブチル基、２，３－ジメチル－２－ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ1及びＲ2における炭素数１―６の環状アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
　Ｒ1及びＲ2におけるヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１～２個含む５～６員単環式の基、窒素原子を１～２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５～６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１～４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－チエニル、３－チエニル、３－オキサジアゾリル、２－イミダゾリル、２－チアゾリル、３－イソチアゾリル、２－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、２－フリル、３－フリル、３－ピロリル、２－キノリル、８－キノリル、２－キナゾリニル、８－プリニルが挙げられる。Ｒ1及びＲ2におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
　Ｒ1及びＲ2におけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。ハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
　式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4－である。
　Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
　Ｒ3及びＲ4における炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、２－メチル－１－プロピル基、２－メチル－２－プロピル基、１－ブチル基、２－ブチル基、１－ペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、２－メチル－１－ブチル基、３－メチル－１－ブチル基、２－メチル－２－ブチル基、３－メチル－２－ブチル基、２，２－ジメチル－１－プロピル基、１－へキシル基、２－へキシル基、３－へキシル基、２－メチル－１－ペンチル基、３－メチル－１－ペンチル基、４－メチル－１－ペンチル基、２－メチル－２－ペンチル基、３－メチル－２－ペンチル基、４－メチル－２－ペンチル基、２－メチル－３－ペンチル基、３－メチル－３－ペンチル基、２，３－ジメチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－１－ブチル基、２，２－ジメチル－１－ブチル基、２－エチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－２－ブチル基、２，３－ジメチル－２－ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ3及びＲ4における炭素数１―６の環状アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
　Ｒ3及びＲ4におけるヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１～２個含む５～６員単環式の基、窒素原子を１～２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５～６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１～４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－チエニル、３－チエニル、３－オキサジアゾリル、２－イミダゾリル、２－チアゾリル、３－イソチアゾリル、２－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、２－フリル、３－フリル、３－ピロリル、２－キノリル、８－キノリル、２－キナゾリニル、８－プリニルが挙げられる。Ｒ1及びＲ2におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
　Ｒ3及びＲ4におけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。ハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
　式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、前述のＲ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
　Ｘにおける炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基（アルキルオキシ基及びアルキルチオ基におけるアルキル基を含む）としては、一又は複数の実施形態において、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、２－メチル－１－プロピル基、２－メチル－２－プロピル基、１－ブチル基、２－ブチル基、１－ペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、２－メチル－１－ブチル基、３－メチル－１－ブチル基、２－メチル－２－ブチル基、３－メチル－２－ブチル基、２，２－ジメチル－１－プロピル基、１－へキシル基、２－へキシル基、３－へキシル基、２－メチル－１－ペンチル基、３－メチル－１－ペンチル基、４－メチル－１－ペンチル基、２－メチル－２－ペンチル基、３－メチル－２－ペンチル基、４－メチル－２－ペンチル基、２－メチル－３－ペンチル基、３－メチル－３－ペンチル基、２，３－ジメチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－１－ブチル基、２，２－ジメチル－１－ブチル基、２－エチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－２－ブチル基、２，３－ジメチル－２－ブチル基等が挙げられる。また、Ｘにおける炭素数１―６の環状アルキル基（アルキルオキシ基及びアルキルチオ基におけるアルキル基を含む）としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
　Ｘにおけるヘテロアリール（ヘテロアリールオキシ基、ヘテロアリールチオ基及びヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１～２個含む５～６員単環式の基、窒素原子を１～２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５～６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１～４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－チエニル、３－チエニル、３－オキサジアゾリル、２－イミダゾリル、２－チアゾリル、３－イソチアゾリル、２－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、２－フリル、３－フリル、３－ピロリル、２－キノリル、８－キノリル、２－キナゾリニル、８－プリニルが挙げられる。Ｘにおけるアリール基（アリールオキシ基及びアリールチオ基におけるヘテロアリールを含む）としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
　Ｘにおけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。
　Ｘにおけるハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
　また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、Ｋｉｎｅｔｉｎを含まず、また、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）及び（Ｉ'）におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＸはＫｉｎｅｔｉｎとなる組み合わせ（Ｒ1及びＲ2が２－フリルメチル及び水素原子、Ｒ3が水素原子、かつ、Ｘが水素原子の組み合わせ）ではない。
　また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物は、不斉炭素原子が存在する場合、及び／又は、立体異性体が存在する場合、一又は複数の実施形態において、各異性体の混合物、又は、単離されたものである。
　本開示において「プロドラッグ」は、一又は複数の実施形態において、生体内で容易に加水分解され、式（Ｉ）又は（Ｉ'）で表される化合物を再生するものが挙げられ、例えばカルボキシル基を有する化合物であればそのカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物、アルキルチオカルボニル基となった化合物、又はアルキルアミノカルボニル基となった化合物が挙げられる。また、例えばアミノ基を有する化合物であれば、そのアミノ基がアルカノイル基で置換されアルカノイルアミノ基となった化合物、アルコキシカルボニル基により置換されアルコキシカルボニルアミノ基となった化合物、アシロキシメチルアミノ基となった化合物、又はヒドロキシルアミンとなった化合物が挙げられる。また例えば水酸基を有する化合物であれば、その水酸基が前記アシル基により置換されてアシロキシ基となった化合物、リン酸エステルとなった化合物、又はアシロキシメチルオキシ基となった化合物が挙げられる。これらのプロドラッグ化に用いる基のアルキル部分としては前記アルキル基が挙げられ、そのアルキル基は置換（例えば炭素原子数１～６のアルコキシ基等により）されていてもよい。一又は複数の実施形態において、例えばカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物を例にとれば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどの低級（例えば炭素数１～６）アルコキシカルボニル、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２－メトキシエトキシカルボニル、２－メトキシエトキシメトキシカルボニル、ピバロイロキシメトキシカルボニルなどのアルコキシ基により置換された低級（例えば炭素数１～６）アルコキシカルボニルが挙げられる。
　本開示において「製薬上許容される塩」とは、薬学的、薬理的、及び／又は医薬的に許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
　前記無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
　前記無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。前記有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
　前記酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。前記塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
　本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
　式（Ｉ）又は（Ｉ'）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、下記式（ＩＩ）の化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　式（ＩＩ）において、Ｙはハロゲン原子である。Ｙにおけるハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
　［医薬組成物］
　本開示は、一態様において、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
　式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、遺伝病の一因となる異常スプライシングを抑制するための用途に使用されうる。本開示において「遺伝病の一因となる異常スプライシング」は、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する、遺伝病の一因となる異常スプライシングである。
　遺伝病の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の原因であるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングが挙げられる（上述及び図１Ａ）。ＦＤ以外にも、異常スプライシングが原因である遺伝病は多く知られている。
　よって、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体において遺伝病の一因となる異常スプラシングを変化させるための用途に使用されうる。該遺伝病の一因となる異常スプラシングは、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであり、さらなる一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングである。
　式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体において遺伝病の一因となる異常スプラシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための用途に使用されうる。該遺伝病の一因となる異常スプラシングは、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであり、さらなる一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングである。
　よって、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための用途に使用されうる。
　また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための用途に使用されうる。
　さらにまた、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための用途に使用されうる。
　上記実施形態において、哺乳類細胞若しくはヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞又はヒト以外の哺乳類の細胞である。ヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの神経細胞である。上記実施形態において、ヒト細胞及びヒト個体は、一又は複数の実施形態において、内在性のＩＫＢＫＡＰ遺伝子にＩＶＳ２０+6T→C変異を有する。本開示において、ＩＶＳ２０+6T→C変異とは、図１Ａで示すとおり、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第２０イントロン内における一塩基置換（Ｔ→Ｃ）である。ヒト細胞及びヒト個体がＩＶＳ２０+6T→C変異を有するか否かは、限定されない一又は複数の実施形態において、一塩基置換を検出できる方法が挙げられ、或いは、塩基配列シーケンス、アレイ、各種遺伝子増幅方法が挙げられる。
　式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
　式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングが関与する疾病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
　式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
　本開示において「医薬組成物」は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。
　本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、治療効果を有する他の有効成分を含まず、或いは、さらに一又は複数の有効成分を含有する。
　前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記コーティング剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
　また、液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
　本開示に係る医薬組成物の使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分である式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物の体内濃度が１００ｎＭ～１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
　［方法及び使用］
　本開示は、その他の一態様において、以下の方法に関しうる。
（ａ）哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の発症若しくは進行の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法。
（ｂ）哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の発症若しくは進行の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法。
（ｃ）ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法。
　これら（ａ）～（ｃ）の方法は、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を前記ヒト細胞又は前記ヒト個体に接触させることにより達成されうる。
　上記（ａ）～（ｃ）の方法における哺乳類細胞又はヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は一又は複数の実施形態においてヒト細胞であり、ヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの神経細胞である。上記（ａ）～（ｃ）の方法におけるヒト細胞及びヒト個体は、一又は複数の実施形態において、内在性のＩＫＢＫＡＰ遺伝子にＩＶＳ２０+6T→C変異を有する。
　in vitro又はex vivoの哺乳類細胞若しくはヒト細胞に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を接触させる方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞培養液に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはその塩又は本開示に係る医薬組成物を添加することが挙げられる。添加濃度としては、限定されない一又は複数の実施形態において式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物の濃度が１００ｎＭ～１ｍＭの間のいずれかになるように添加することが挙げられる。in vivoのヒト細胞及びヒト個体に（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を接触させる方法は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。
　本開示は、さらにその他の一態様において、本開示に係る医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる疾病又は家族性自律神経失調症（ＦＤ）の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法に関する。前記対象は、一又は複数の実施形態において、該疾病の罹患者、異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる遺伝病の変異遺伝子保有者、ＦＤ患者、又は、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子保有者が挙げられる。本開示に係る医薬組成物の投与方法については、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。
　したがって、本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
　［Ａ１］　下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。
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 ［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
　Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
　Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4－である；
　Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
　Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
　［Ａ２］　［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
　［Ａ３］　哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための、
　哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための、又は、
　ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための、［Ａ２］記載の医薬組成物。
　［Ａ４］　前記細胞が、神経細胞である、［Ａ３］記載の医薬組成物。
　［Ａ５］　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、［Ａ２］から［Ａ４］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［Ａ６］　前記異常スプライシングが、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングである、［Ａ５］に記載の医薬組成物。
　［Ａ７］　遺伝病が、家族性自律神経失調症（ＦＤ）である、［Ａ６］に記載の医薬組成物。
　［Ａ８］　哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を哺乳類細胞、ヒト細胞、哺乳類個体又はヒト個体に接触させることを含む、方法。
　［Ａ９］　哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、前記個体に［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
　［Ａ１０］　前記異常スプライシングが、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングである、［Ａ７］又は［Ａ８］に記載の方法。
　［Ａ１１］　異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる遺伝病又は家族性自律神経失調症の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む方法。
　［Ａ１２］　［Ａ８］から［Ａ１１］のいずれかに記載の方法における、［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
　［Ａ１３］　［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための［Ａ１］の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩の使用。
　［スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクト］
　本開示は、その他の態様において、野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトに関する。
　本開示において「疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシング」は、一又は複数の実施形態において、疾病における選択的スプライシング、疾病に特異的な選択的スプライシング、疾病において正常時よりも多く起る選択的スプライシング、又は、疾病の発症若しくは進行の一因となる選択的スプライシングをいう。疾病としては、遺伝病、がん、又は感染症が挙げられる。
　遺伝病の発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであって、さらなる一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の原因であるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングが挙げられる（上述及び図１Ａ）。ＦＤ以外にも、異常スプライシングが原因である遺伝病は多く知られている。
　がんの発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子のエクソン９、１０の相互排他的スプライシングで、ＰＫＭ２アイソフォーム（エクソン１０）選択されるスプライシングが挙げられる（上述及び図５）。ＰＫＭ２は、ほとんどのがんで発現し、腫瘍の増大に寄与するものと考えられている。ＰＫＭ遺伝子以外にも、がんの発症又は進行の一因となる選択的スプライシングは存在すると考えられる。
　感染症の発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）が感染した細胞における、ＰＭＬ（promyelocytic leukemia）アイソフォームの発現スイッチングをもたらす選択的スプライシングが知られている（Nojima et al., Nucleic Acid Research, 2009）。感染症としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫による感染症が挙げられる。
　上記実施形態において、哺乳類細胞若しくはヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞又はヒト以外の哺乳類の細胞である。細胞は、一又は複数の実施形態において、神経細胞、がん細胞、又は感染細胞である。
　本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を含む遺伝子領域の異常スプライシングを検出できるスプライシングレポーターとして機能しうるＤＮＡコンストラクトである。本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子を含み、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成される。
　本実施形態に係るレポーターコンストラクトは、その他の一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有するヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第１９エクソンから第２１エクソンの領域と２つの異なるレポーター遺伝子を含み、第２０エクソンを含む野生型スプライスバリアントと第２０エクソンがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成される。一又は複数の実施形態において、第１９エクソンから第２１エクソンの領域部分は、第２０エクソンがエクソンスキップされる異常スプライシングが起る範囲であれば、第１９エクソン及び／又は第２１エクソンが部分的に欠失してもよい。
　本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトにおけるレポーター遺伝子は、限定されない一又は複数の実施形態において、各種蛍光蛋白質の遺伝子である。
　本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、限定されない一又は複数の実施形態において、図１Ｂに示すレポーターコンストラクトで説明されうる。図１ＢのＤＮＡコンストラクトは、ＣＡＧプロモーターの下流にＧＳＴタンパク質の遺伝子、変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）、及びＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）をこの順に連結されている。このコンストラクトにおいて、野生型スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分が、３ｎ＋１塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子のストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームとなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳され緑色蛍光タンパク質が発現する。一方、異常スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分が、３ｎ塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳され赤色蛍光タンパク質が発現する。
　本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９、１０の相互排他的スプライシングで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトに関する。本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、限定されない一又は複数の実施形態において、図６に示すレポーターコンストラクトで説明されうる。ＰＫＭ遺伝子のエクソン８から１１のゲノム領域を、フレームの異なるよう連結させたＲＦＰ、ＧＦＰ、ｃＤＮＡに連結させた。９を選択した場合には、ＲＦＰにフレームが合い、１０を選択した場合にはＲＦＰにフレームが合うように設計し、９、１０どちらも選択されず、スキップしてしまった場合、また、どちらとも選択された場合にはＲＦＰ及びＧＦＰのどちらにもフレームが合わないように設計されている。
　本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの製造方法は、国際公開第2011/152043号を参照でき、本文献を参照により本開示に組み込む。
　［異常スプライシングを抑制するか否かをテストする方法］
　本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した細胞を用いれば、該細胞に接触させた物質が異常スプライシングを抑制できるか否かをテストできる。したがって、本開示はその他の態様において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
　（Ａ）本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
　（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
　（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
　真核細胞又は真核生物としては、一又は複数の実施形態において、哺乳類又はヒトの細胞又は個体が挙げられる。本開示に係るスクリーニング方法としては、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を使用しうる。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞であり、細胞は、一又は複数の実施形態において、神経細胞、がん細胞、感染細胞である。
　「導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、腫瘍細胞の条件と同じになるように、酸素濃度を０．５％とし、ＡＴＰ合成阻害剤であるオリゴマイシンを存在させることが挙げられる。
　テスト物質が、一又は複数の実施形態において、タンパク質であれば、該タンパク質をコードしたｃＤＮＡの発現ベクターを、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した真核細胞又は真核生物にさらに導入することで発現させてもよい。テスト物質の発現は、一又は複数の実施形態において、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる。前記ベクターとしては、一又は複数の実施形態において、適宜、遺伝子発現ライブラリー、又は、ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを使用できる。一方、テスト物質が、一又は複数の実施形態において、低分子化合物であれば、該低分子化合物の存在下で、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した真核細胞又は真核生物を培養することで接触させてもよい。
　本開示に係るスクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である。異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病は、上述のとおり、一又は複数の実施形態において、遺伝病、がん、又は感染症である。前記遺伝病としては、限定されない一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）が挙げられる。
　したがって、本開示に係るスクリーニング方法は、その他の一又は複数の実施形態において、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入すること、
（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
　本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｃ）における、野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現による検出は、一又は複数の実施形態において、蛍光シグナルの検出、ＲＴ－ＰＣＲなどが挙げられ、特に制限されず、レポーター遺伝子に応じて適宜選択できる。
　本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｄ）の一又は複数の実施形態において、テスト物質を接触させた細胞における野生型スプライシングの割合が高くなった場合、異常スプライシングを抑制できる候補物質として選択できる。
　テスト物質としては、その他の一又は複数の実施形態において、低分子化合物が挙げられる。したがって、本開示は、その他の態様において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる低分子化合物のスクリーニング方法であって、（Ａ）本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、（Ｂ）テストする低分子化合物を前記真核細胞又は真核生物に接触させること、（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該低分子化合物を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。また、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する低分子化合物のスクリーニング方法であって、（Ａ）本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入すること、（Ｂ）テストする低分子化合物を前記真核細胞又は真核生物に接触させること、（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、低分子化合物を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
　本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｄ）の一又は複数の実施形態において、テスト低分子化合物を接触させた細胞における野生型スプライシングの割合が高くなった場合、異常スプライシングを抑制できる候補低分子化合物として選択できる。よって、本開示は、その他の態様において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物に関する。
　［キット］
　本開示は、その他の態様において、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキットに関する。該キットは、本開示に係るスクリーニング方法に使用できる。また、該キットは、さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含んでもよい。
　したがって、本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
　［Ｂ１］　疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
　（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
　（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
　（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法。
　［Ｂ２］　テスト物質の発現が、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる、［Ｂ１］記載の方法。
　［Ｂ３］　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
　［Ｂ４］　前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、［Ｂ１］から［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
　［Ｂ５］　ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
　（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
　（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触又は発現させること、
　（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法。
　［Ｂ６］　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物。
　［Ｂ７］　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、［Ｂ６］に記載の医薬組成物。
　［Ｂ８］　３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクト。
　［Ｂ９］　野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキット。
　［Ｂ１０］　さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含む、［Ｂ９］記載のキット。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。
　製造例１：化合物１の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　化合物１は、ＷＯ２０１０／１１８３６７に開示される方法を参考に、以下のように合成した。
　２，６－ジクロロ－１Ｈ－プリン（2,6-dichloro-1H-purine）（１８９ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ、商用品）とフルフリルアミン（furfurylamine）（９７．０ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ、商用品）のアセトニトリル（acetonitrile）（２０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（triethylamine）（０．１５ｍＬ，１．０８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。混合物を室温にて６時間撹拌した後、６０℃にて３時間撹拌した。この混合溶液を減圧下で濃縮した後、水を加え、生じた白色沈殿をろ取した。得られた固体は、水、ジエチルエーテルで順次洗浄し、２－クロロ－Ｎ－（２－フラニルメチル）－７Ｈ－プリン－６－アミン（2-chloro-N-(2-furanylmethyl)-7H-purin-6-amine）（化合物１）（１９．８ｍｇ，０．０７９５ｍｍｏｌ，８．０％）を白色固体として得た。
TLC Rf ０．２２ (酢酸エチル); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 4.56-4.67 (br, 2H), 6.24-6.28 (br, 1H), 6.35-6.40 (br, 1H), 7.54-7.57 (br, 1H), 8.11-8.15 (br, 1H), 8.54-8.64 (br, 1H), 13.05-13.17 (br, 1H).
　参考化合物１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　上記参考化合物１は、Ｋｉｎｅｔｉｎであり、ナカライラスク社製のものを用いた。
　［２色蛍光タイプのスプライシングレポーターコンストラクトの作製］
　図１Ａに示されるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分を利用して、図１Ｂに示すようなレポーターコンストラクト（ＦＤ型）を作製した。すなわち、ＣＡＧプロモーターの下流にＧＳＴタンパク質の遺伝子、変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）、及びＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）をこの順に連結したコンストラクトを作製した。なお、前記コンストラクトにおいて、野生型スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分が、３ｎ＋１塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子のストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳され緑色蛍光タンパク質が発現する。一方、異常スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９～２１エクソン部分が、３ｎ塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳され赤色蛍光タンパク質が発現する。
　図１Ｂに開示されるレポーターコンストラクトを用いることで、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングが野生型スプライスか、異常スプライスかの判断が容易となる。
　前記レポーターコンストラクト（ＦＤ型）において変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子が野生型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子である他は同様であるレポーターコンストラクト（野生型）もさらに作製した。
　作製したＦＤ型レポーターコンストラクト及び野生型レポーターコンストラクトをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、ＦＤ患者における異常スプライシングが再現できるか確認した。
　まず、蛍光顕微鏡観察を行ったところ、野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞ではＧＦＰが発現することが確認され、正常スプライシングが起きていることが確認された（データ示さず）。また、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞ではＲＦＰが発現することが確認され、異常スプライシングが起きていることが確認された（データ示さず）。
　さらに、ＲＴ－ＰＣＲを使用して確認したところ、図２に示すとおり、野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞では正常スプライシング産物が確認され、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞では異常スプライシング産物が確認された。なお、内部コントロールとして、内因性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。
　［異常スプライシングを抑制する化合物のスクリーニング］
　ＦＤ型レポーターコンストラクトを用いて、該コンストラクトから転写されるｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングを抑制できる化合物をスクリーニングした。具体的には、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞に、テスト化合物を接触させて培養し、所定の時間後に蛍光観察を行い、ＧＦＰ（正常スプライシング産物）とＲＦＰ（異常スプライシング産物）の蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）がコントロール（例えば、溶媒のみ、又はＫｉｎｅｔｉｎ（参考化合物１））と比べて強いものを選択した。その結果、異常スプライシングを抑制する化合物の候補化合物として、前記化合物１が選択された。
　［化合物１の異常スプライシング抑制効果の確認］
　ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞に、化合物１を接触させて培養した（化合物濃度０．４、２．０、１０．０、及び５０．０μＭ）。２４時間及び４８時間後に蛍光観察を行い、蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）を求めた。その結果を図３に示す。
　図３のグラフは、コントロール（溶媒のみ）、Ｋｉｎｅｔｉｎ、及び化合物１について、投与濃度と蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）との関係を示す。同図に示す通り、化合物１は、濃度依存的に蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）が増加しており、その増加度は、Ｋｉｎｅｔｉｎより著しく優れていた。よって、化合物１は、Ｋｉｎｅｔｉｎよりも効果的にＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制できることが示された。
　［ＦＤ患者の細胞における化合物１の異常スプライシング抑制効果の確認］
　ＦＤ患者細胞は、Coriell Instituteより得たものを使用した。なお、該ＦＤ患者細胞の内在性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子は、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有していた。
　該患者細胞の培養液に化合物１及びＫｉｎｅｔｉｎを２μＭ又は５０μＭの濃度で添加し、６０時間培養後、細胞を回収してＲＴ－ＰＣＲを行った。コントロールとしては、未処理細胞、及び、ＤＭＳＯ（溶媒）処理細胞を使用した。その結果を図４に示す。
　図４に示すとおり、化合物１は、２μＭという低い濃度で異常スプライシングを抑制できることが示された。また、その異常スプライシング抑制活性は、５０μＭの濃度のＫｉｎｅｔｉｎと同程度であることが示された。

Claims (20)

  1. 　疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
    　（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
    　（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
    　（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
    　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、
    を含む方法。
  2. 　テスト物質の発現が、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる、請求項１記載の方法。
  3. 　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物。
  6. 　前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、
    　該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキット。
  8. 　さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含む、請求項７記載のキット。
  9. 　下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
    　Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
    　Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4－である；
    　Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
    　Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
  10. 　請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
  11. 　ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための、
    　ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための、又は、
    　ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 　前記細胞が、神経細胞、がん細胞、又は感染細胞である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１０から１２のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 　哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、
    　哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、
    　ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
    　前記細胞に請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を哺乳類細胞、ヒト細胞、哺乳類個体又はヒト個体に接触させることを含む、方法。
  15. 　哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、
    　哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、
    　ヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
    　前記個体に請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  16. 　遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、
    　請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、方法。
  17. 　請求項１４から１６のいずれかに記載の方法における、請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  18. 　請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩の使用。
  19. 　ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
    　（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
    　（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
    　（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
    　（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、
    を含む方法。
  20. 　３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクト。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016115434A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 The General Hospital Corporation Compounds for improving mrna splicing
WO2017175842A1 (ja) * 2016-04-07 2017-10-12 国立大学法人京都大学 スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物
WO2018151326A1 (ja) * 2017-02-20 2018-08-23 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
JP2022520822A (ja) * 2019-02-13 2022-04-01 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド 家族性自律神経失調症を処置するためのチオエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－アミン化合物
WO2024101337A1 (ja) 2022-11-07 2024-05-16 国立大学法人京都大学 キナゾリン誘導体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020167624A1 (en) * 2019-02-13 2020-08-20 Ptc Therapeutics, Inc. Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine compounds for treating familial dysautonomia

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002504553A (ja) * 1998-02-26 2002-02-12 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド ６，９−ジ置換２−［トランス−（４−アミノシクロヘキシル）アミノ］プリン
US6413974B1 (en) * 1998-02-26 2002-07-02 Aventis Pharmaceuticals Inc. 6,9,-disubstituted 2-[trans-(4-aminocyclohexyl) amino] purines
US20060014763A1 (en) * 2003-10-03 2006-01-19 Slaugenhaupt Susan A Methods for altering mRNA splicing and treating familial dysautonomia and other mechanistically related disorders
WO2008073619A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 The Regents Of The University Of California Wnt pathway mutations in cancer stem cells
WO2010118367A2 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Antiviral pyrimidines
WO2011152043A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Kyoto University Transgenic reporter system that reveals expression profiles and regulation mechanisms of alternative splicing in mammalian organisms

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4172829A (en) * 1978-05-09 1979-10-30 Bristol-Myers Company 2,9-Disubstituted adenine derivatives and their use as non-adrenergic bronchodilators
US4232155A (en) * 1979-09-13 1980-11-04 Bristol-Myers Company Purine compounds
AU753015B2 (en) 1998-03-04 2002-10-03 Cyclacel Limited Cyclin dependent kinase inhibitor
DE60023268T2 (de) * 1999-02-01 2006-06-01 CV Therapeutics, Inc., Palo Alto INHIBITEURS PURIQUES DE KINASE 2 DEPENDANTE DES CYCLINES et IkB-alpha
FR2818642B1 (fr) * 2000-12-26 2005-07-15 Hoechst Marion Roussel Inc Nouveaux derives de la purine, leur procede de preparation, leur application a titre de medicaments, compositions pharmaceutiques et nouvelle utilistion
US6897220B2 (en) * 2001-09-14 2005-05-24 Methylgene, Inc. Inhibitors of histone deacetylase
US20040137472A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-15 Ryszard Kole Methods and compositions for modification of splicing of pre-mRNA
BRPI0516751A (pt) * 2004-09-30 2008-09-16 Tibotec Pharm Ltd pirimidinas bicìclicas que inibem hcv
US20080089957A1 (en) * 2006-10-11 2008-04-17 Shui-Tein Chen Monocotyledon plant indications extract compositions, method of preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP2132208A1 (en) * 2007-03-28 2009-12-16 NeuroSearch AS Purinyl derivatives and their use as potassium channel modulators
WO2010135664A1 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of identifying and using general or alternative splicing inhibitors
CU24245B1 (es) * 2009-06-12 2017-02-02 Centre Nat Rech Scient QUINOLIN-6 AMINA Y QUINOLINA-7-AMINA DERIVADOS DE LA FÓRMULA (Id) y (Ir), Y SALES DERIVADAS
US9475824B2 (en) 2012-07-20 2016-10-25 Cleave Biosciences, Inc. Fused pyrimidines as inhibitors of p97 complex
WO2014083327A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Md Pharma Ab Adenine derivatives suitable for the treatment of (inter alia) muscular dystrophy
WO2014134750A1 (zh) 2013-03-08 2014-09-12 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002504553A (ja) * 1998-02-26 2002-02-12 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド ６，９−ジ置換２−［トランス−（４−アミノシクロヘキシル）アミノ］プリン
US6413974B1 (en) * 1998-02-26 2002-07-02 Aventis Pharmaceuticals Inc. 6,9,-disubstituted 2-[trans-(4-aminocyclohexyl) amino] purines
US20060014763A1 (en) * 2003-10-03 2006-01-19 Slaugenhaupt Susan A Methods for altering mRNA splicing and treating familial dysautonomia and other mechanistically related disorders
US7737110B2 (en) 2003-10-03 2010-06-15 The General Hospital Corporation Methods for altering mRNA splicing and treating familial dysautonomia and other mechanistically related disorders
WO2008073619A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 The Regents Of The University Of California Wnt pathway mutations in cancer stem cells
WO2010118367A2 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Antiviral pyrimidines
WO2011152043A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Kyoto University Transgenic reporter system that reveals expression profiles and regulation mechanisms of alternative splicing in mammalian organisms

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISOFK ET AL., NATURE (LETTERS, 2008
J.HOYER ET AL.: "Peptide Vectors for the Nonviral Delivery of Nucleic Acids", ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH, vol. 45, no. 7, 2012, pages 1048 - 1056, XP055306549 *
NOJIMA ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, 2009
NOJIMA ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 2009
S.R.BRESHEARS ET AL.: "Purines. VIII. The Aminolysis of Certain Chlorosubstituted Purines", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 81, 1959, pages 3789 - 3792, XP000917842 *
See also references of EP3020829A4

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL253291B (en) * 2015-01-16 2021-10-31 Massachusetts Gen Hospital Compounds to enhance mrna splicing
WO2016115434A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 The General Hospital Corporation Compounds for improving mrna splicing
EP3244891A4 (en) * 2015-01-16 2018-12-19 The General Hospital Corporation Compounds for improving mrna splicing
US11702417B2 (en) 2015-01-16 2023-07-18 The General Hospital Corporation Compounds for improving mRNA splicing
EP4115882A1 (en) 2015-01-16 2023-01-11 The General Hospital Corporation Compounds for improving mrna splicing
AU2016206589B2 (en) * 2015-01-16 2020-09-10 The General Hospital Corporation Compounds for improving mRNA splicing
TWI727939B (zh) * 2015-01-16 2021-05-21 美商通用醫院公司 改善ｍＲＮＡ剪接之化合物
WO2017175842A1 (ja) * 2016-04-07 2017-10-12 国立大学法人京都大学 スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物
JP7360206B2 (ja) 2017-02-20 2023-10-12 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
US20210205314A1 (en) * 2017-02-20 2021-07-08 Kyoto University Pharmaceutical composition and treatment method for genetic disease associated with splicing abnormalities
JP2022078297A (ja) * 2017-02-20 2022-05-24 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
JP7129095B2 (ja) 2017-02-20 2022-09-01 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
JPWO2018151326A1 (ja) * 2017-02-20 2019-12-12 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
CN110312528A (zh) * 2017-02-20 2019-10-08 国立大学法人京都大学 用于起因于剪接异常的遗传性疾病的药物组合物及治疗方法
WO2018151326A1 (ja) * 2017-02-20 2018-08-23 国立大学法人京都大学 スプライシング異常に起因する遺伝性疾病のための医薬組成物及び治療方法
US12023338B2 (en) 2017-02-20 2024-07-02 Kyoto University Pharmaceutical composition and treatment method for genetic disease associated with splicing abnormalities
JP2022520822A (ja) * 2019-02-13 2022-04-01 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド 家族性自律神経失調症を処置するためのチオエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－アミン化合物
WO2024101337A1 (ja) 2022-11-07 2024-05-16 国立大学法人京都大学 キナゾリン誘導体
KR20250093507A (ko) 2022-11-07 2025-06-24 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 퀴나졸린 유도체
EP4617268A1 (en) 2022-11-07 2025-09-17 Kyoto University Quinazoline derivatives

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