JP2010077081A - 体内時計周期延長剤およびそれを含む概日リズム障害治療薬 - Google Patents

Abstract

【課題】概日リズム障害を治療するための医薬を提供する。
【解決手段】プロゲステロンまたはその誘導体を含む、体内時計周期延長剤およびそれを含む概日リズム障害を治療するための医薬。
【選択図】図１

Description

本発明は、体内時計周期延長剤及び該体内時計周期延長作用に基づく概日リズム障害治療薬に存する。

多くの生物は、内因性に約２４時間の生体リズム（概日リズム、ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍ）を有する。
概日リズムには、いくつかの遺伝子が関与することが示唆され、これらの遺伝子は時計遺伝子と呼ばれている。時計遺伝子としては、例えば、Ｐｅｒ２遺伝子が知られている。
哺乳類においては概日リズムの発振中枢は脳視床下部視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus; SCN）に存在することが知られている。またSCNと同様の体内時計機構は肝臓など末梢組織にも存在することが判明している。

概日リズム睡眠障害は、夜間に正常な睡眠が得られないことなどを主症状とする疾患であり、睡眠障害のために通常の社会行動に支障をきたす場合もある。したがって、体内時計の発振機構を制御することができれば、概日リズム睡眠障害の治療などに有用と考えられる。
概日リズム睡眠障害に対する薬物としてメラトニンが知られているが、我が国では認可されておらず、概日リズム睡眠障害に対する十分な治療効果を発揮する薬物は知られていない。

非特許文献１には、プロゲステロンがエストロゲンによる概日リズム周期短縮効果をブロックしたものの、単独では概日リズム周期に影響を与えなかったことが記載されている。
American Journal of Physiology vol. 239, R497-R504, 1980

本発明の目的は、体内時計周期延長剤及び該薬剤を用いる概日リズム障害治療薬を提供することである。

本発明者らは、上記した課題を達成すべく鋭意研究した結果、プロゲステロンおよびその誘導体が体内時計の周期を延長させることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、プロゲステロンまたはその誘導体を含む、体内時計周期延長剤を提供する。プロゲステロン誘導体は１７−ヒドロキシプロゲステロン及びその誘導体から選択されることが好ましい。
本発明はまた、前記体内時計周期延長剤を含む、概日リズム障害治療薬を提供する。

本発明によれば、体内時計周期を延長することで、概日リズム障害を治療することができる。プロゲステロンまたはその誘導体は医薬として既に使用されているため、安全に使用できる。

本発明の体内時計周期延長剤はプロゲステロンまたはその誘導体を有効成分として含む
。
ここで、プロゲステロン誘導体としては、例えば、１７−ヒドロキシプロゲステロン及びその誘導体（１７−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸など）、メドロキシプロゲステロン（酢酸メドロキシプロゲステロンとも呼ばれる）などが挙げられる。
プロゲステロン及びその誘導体は公知であり、当業者は容易に入手可能である。

本発明において、「体内時計周期延長作用」とは、Per2などの時計遺伝子の発現で表わされる体内時計の周期を延長させる作用であり、より具体的には、細胞における体内時計の周期を本来の周期（２４時間）より長くする作用を意味する。「体内時計周期延長作用」は、例えば、細胞内でPer2プロモーターにより発現制御されたレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子など）の発現周期を調べることによって確認することができる。

プロゲステロンまたはその誘導体は、概日リズム障害、特に、概日リズムが２４時間よりも短くなることに起因する概日リズム障害を治療するための医薬として使用することができる。
このような概日リズム障害としては、例えば、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）、睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）、老人性概日リズム睡眠障害、時間帯域変化症候群（ジェット時差症候群）、交代勤務性睡眠障害、不規則型睡眠・覚醒パターン、非２４時間型睡眠・覚醒障害などの内因的または外因的概日リズム睡眠障害などが挙げられる。
また、本発明の医薬は、加齢に伴う概日リズム異常によって引き起こされる睡眠障害に伴う症状、例えば、せん妄や夜間徘徊などの治療にも用いることができる。

ここで、プロゲステロンもしくはその誘導体は、それらの薬学的に許容される塩、水和物、あるいはそれらの溶媒和物であってもよい。
プロゲステロンもしくはその誘導体の生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩、ギ酸塩、クエン酸塩、又はパラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
溶媒和物を形成しうる溶媒は生理学的に許容される溶媒であれば特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、又は酢酸エチル等を挙げることができる。

プロゲステロンもしくはその誘導体またはその薬学的に許容される塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質は、それ自体をヒトを含む哺乳類に投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記物質と薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物として患者に投与することが好適である。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、若しくは液剤などの経口投与用の製剤、または注射剤、点滴剤、座剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、吸入剤、若しくは経皮吸収型の貼付剤等の非経口投与用の製剤を挙げることができる。

薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊
剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、 Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。

プロゲステロンもしくはその誘導体の製剤中の含有量は、製剤全体の０.０１ないし１００重量％である。
プロゲステロンもしくはその誘導体の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより異なり特に制限されないが、一般的に、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。

実施例１：培養細胞での体内時計周期に対する効果
＜細胞の構築＞
マウスPer2遺伝子プロモーター（mPer2 プロモーター）にルシフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトを含むプラスミド（mPer2-Luc）はNat Genet 38, 312, 2006に記載の方法で作成した。
mPer2-LucとpIREShyg3プラスミド（BD Biosciences）を、FuGene6 （Roche）を用いてNIH3T3細胞にコトランスフェクションし、200μg/mlのハイグロマイシンB（Invitrogen）を含む培地でセレクションを行い、mPer2-Lucを安定発現する細胞を得た（NIH3T3-mPer2-Luc）。

ヒトPer2遺伝子プロモーター（hPer2 プロモーター）にルシフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトを含むプラスミドは以下の方法で作成した。
エクソン１から数えて上流616〜264塩基に位置するヒトPer2遺伝子プロモーターを含む３５３ｂｐのフラグメントをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにはPrimeSTAR DNAポリメラーゼ（Takara）と配列番号１，２のプライマーを用いた。得られたフラグメントを制限酵素KpnIとHindIIIを用いてpGL4.14（Promega）に組み込んで、ヒトPer2遺伝子（hPer2）プロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトを含むプラスミド（hPer2-Luc）を得た。
hPer2-LucとpIREShyg3プラスミド（BD Biosciences）を、FuGene6 （Roche）を用いてU2OS細胞（ATCCより購入）にコトランスフェクションし、200μg/mlのハイグロマイシンB（Invitrogen）を含む培地でセレクションを行い、hPer2-Lucを安定発現する細胞を得た（U2OS-hPer2-Luc）。

＜化合物の評価＞
NIH3T3-mPer2-Luc細胞を384ウェルプレートに、１×１０⁴細胞／ウェルとなるようにまき、25mM HEPES (Gibco)と10%牛胎児血清（JRH）を添加したDMEM（phenol redなし）50μlを培地に用いて培養を行った。４日間培養した後、30nMのforskolin（Nakarai tesque）、600μMのルシフェリン（Promega）および75μMの化合物（DMSO溶液）を含む25μlの培地を加えた（最終濃度：10nM forskolin、200μMルシフェリン、25μM化合物）。各ウェルに異なる化合物を加え、各化合物の評価を行った。

U2OS-hPer2-Luc細胞を384ウェルプレートに、１．２×１０⁴細胞／ウェルとなるようにまき、25mM HEPES (Gibco)と10%牛胎児血清（JRH）を添加したDMEM（phenol redなし）60μlを培地に用いて培養を行った。３日間培養した後、30nMのforskolin（Nakarai tesque）、600μMのルシフェリン（Promega）および150μMの化合物（DMSO溶液）を含む30μlの培地を加えた（最終濃度：10nM forskolin、200μMルシフェリン、50μM化合物）。各ウェルに異なる化合物を加え、各化合物の評価を行った。

それぞれ３０℃で培養を継続し、CCDカメラを用いて各ウェルの発光を１時間ごとに４日間（NIH3T3-mPer2-Luc）または６日間（U2OS-hPer2-Luc）モニターした。

＜結果＞
発光の経時変化から、各化合物がPer2遺伝子プロモーターからの転写の周期を変化させるかどうかを調べた。すなわち、化合物を加えない場合（DMSOのみ）、Per2遺伝子プロモーターからの転写はNIH3T3-mPer2-Luc細胞では約22時間、U2OS-hPer2-Luc細胞では約26時間周期のパターンを示すが、この周期を変化させる化合物を選択した。
その結果、１７−ヒドロキシプロゲステロンがPer2遺伝子プロモーターの転写の周期を延長する効果を有する化合物として選択された。

また、１７−ヒドロキシプロゲステロンの濃度を変化させて上記と同様の実験を行ったところ、濃度を上げるほど周期はより延長され、１７−ヒドロキシプロゲステロンは濃度依存的にPer2遺伝子プロモーターからの転写の周期を延長することがわかった（図１）。

実施例２：プロゲステロンの評価
上記と同様にして、NIH3T3-mPer2-Luc細胞およびU2OS-hPer2-Luc細胞を用いてPer2遺伝子プロモーターからの転写周期に対するプロゲステロンの効果を調べた。
その結果、プロゲステロンも濃度依存的にPer2遺伝子プロモーターからの転写の周期を延長することがわかった（図２）。

実施例３：視交叉上核組織切片における評価
マウスPer2遺伝子にLuciferase遺伝子をノックインしてPer2遺伝子の代わりにPer2-Luc融合遺伝子が発現するようにしたマウス（mPer2^Lucマウス：Proc Natl Acad Sci USA, vol. 101, p5339, 2004）から脳を摘出して、視交叉上核を含む部分について300μｍの厚さの脳の冠状断面を作製した。
得られた切片を培養膜（MilliCell-CM, Millipore）上に移し、1.2mlの培地（1.2g/l NaHCO₃（Nakarai tesque）, 15ml HEPES（Dojindo）, 20mg/l kanamycin（Invitrogen）, 5μg/ml insulin（Sigma）, 20nM putrescin（Sigma）, 100μg/ml apo-transferrin（Sigma）, 20nM progesterone（Sigma）, 30nM sodium selenite（Sigma）, 1/50 B-27 supplement（Gibco）, 100μM ルシフェリンおよび１７−ヒドロキシプロゲステロンを添加したDMEM）を含む培養皿で培養した。３７℃でインキュベートし、切片からの発光を高感度生物発光検出システム（LM-2400, 浜松ホトニクス）によって検出した。
化合物がPer2発現の周期に与える影響については、上記の細胞実験と同様に評価した。
その結果、１７−ヒドロキシプロゲステロンは、mPer2^Lucマウスの視交叉上核においても濃度依存的にPer2遺伝子発現の周期を延長することがわかった（図３）。

実施例４：マウス胎児繊維芽細胞における評価
胎生１３〜１５日のmPer2^Lucマウスの胚を摘出し、100U/mlのペニシリンと100U/mlのストレプトマイシンを含むPBSで洗浄した。胎盤と臓器を完全に除いた後、胚を細かく切り刻み、0.1%トリプシン-0.02% EDTAを加えて３７℃で３０分間インキュベートして、細胞を分離させた。得られた細胞（マウス胎児繊維芽細胞：mPer2^Luc MEF）を10%牛胎児血清および3.5mg/mlグルコースを含むDMEMで培養した。

mPer2^Luc MEFを２４ウェルプレートに、１．０×１０⁵細胞／ウェルとなるようにまき、25mM HEPES、20%牛胎児血清、100μMルシフェリン、100U/mlのペニシリンおよび100U/mlのストレプトマイシンを添加したDMEM（phenol redなし）500μlを培地に用いて培養を行った。４日間培養した後、30nMのforskolin、600μMのルシフェリンおよび１７−ヒドロキシプロゲステロン（DMSO溶液）を含む250μlの培地を加えた（最終濃度：10nM forskolin、200μMルシフェリン、25、8.33または2.77μM １７−ヒドロキシプロゲステロン）。
発光の検出とPer2周期の分析は実施例１と同様にして行った。
その結果、１７−ヒドロキシプロゲステロンは、mPer2^Lucマウス由来の胎児繊維芽細胞においても濃度依存的にPer2遺伝子発現の周期を延長することがわかった（図４）。

NIH3T3-mPer2-Luc細胞(○、破線)およびU2OS-hPer2-Luc細胞（●、実線）における１７−ヒドロキシプロゲステロンのPer2遺伝子プロモーターへの効果を示す図。縦軸はCircadian Time、すなわち0μM条件下の周期を24.0時間になるよう補正した時の周期の長さ（時間）を示し、横軸は濃度（μＭ）を示す。それぞれの細胞について独立した２回の実験結果を表記している。 NIH3T3-mPer2-Luc細胞およびU2OS-hPer2-Luc細胞におけるプロゲステロンのPer2遺伝子プロモーターへの効果を示す図。縦軸はCircadian Time （時間）を示し、横軸は濃度（μＭ）を示す。それぞれの細胞について独立した２回の実験結果を表記している。 mPer2^Lucマウスの視交叉上核組織切片における１７−ヒドロキシプロゲステロンのPer2遺伝子プロモーターへの効果を示す図。縦軸は１周期にかかる時間（左軸はCircadian Timeで、右軸は実時間で表記）を示し、横軸は濃度（μＭ）を示す。各点におけるエラーバーは標準誤差を示す mPer2^Lucマウスの胎児繊維芽細胞における１７−ヒドロキシプロゲステロンのPer2遺伝子プロモーターへの効果を示す図。縦軸は１周期にかかる時間（左軸はCircadian Timeで、右軸は実時間で表記）を示し、横軸は濃度（μＭ）を示す。各点におけるエラーバーは標準誤差を示す

Claims (3)

1. プロゲステロンまたはその誘導体を含む、体内時計周期延長剤。
2. プロゲステロン誘導体が、１７−ヒドロキシプロゲステロン及びその誘導体から選択される、請求項１記載の体内時計周期延長剤。
3. 請求項１または２記載の体内時計周期延長剤を含む、概日リズム障害治療薬。

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