WO2014094312A1

WO2014094312A1 - 一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法

Info

Publication number: WO2014094312A1
Application number: PCT/CN2012/087204
Authority: WO
Inventors: 李金亮; 张仙; 赵楠; 金圣芳
Original assignee: Shanghai Desano Chemical Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Desano Chemical Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-06-26
Anticipated expiration: 2015-06-21

Abstract

本发明公开了一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法，包括步骤：在蛋白酶或脂肪酶的催化下，核苷化合物和L-氨基酸酯反应，从而得到核苷氨基酸衍生物。该方法不需额外添加其他溶剂。

Description

一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法

技术领域

本发明属于生物催化合成技术领域，具体涉及一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法。背景技术

近年来，核苷类药物用于治疗病毒类疾病受到了广泛的关注。然而，临床上使用的核苷类药物存在毒副作用大、耐药性等问题。核苷类前药可改善核苷类药物口服生物利用度及药动学，靶向药物到特定病变部位，延长作用时间，降低毒副作用，提高抗病毒效果，扩大抗病毒谱，是修饰核苷类药物结构的一个重要方向。如伐昔洛韦为阿昔洛韦 L-缬氨酸甲酯，能改善阿昔洛韦口服给药吸收不良的缺点，口服后能在胃肠道极好地吸收，并通过酶的水解完全转变为阿昔洛韦，这可使阿昔洛韦的生物利用度增加 3〜5倍，达到 65%。泰诺福韦的氨基酸酯前药衍生物的抗病毒活性和抗 HIV活性都较泰诺福韦显著提高。而阿糖胞昔 (Cytarabine)主要用于急性白血病治疗，包括肺癌、消化道癌、头颈部癌及恶性淋巴瘤等，是一种抗代谢的药物，通过药物分子结构修饰是改善提高其功能的重要途径。

通过传统的化学合成法对核苷类药物分子结构进行修饰，需要经过酰化、催化氢解等复杂的步骤，并需要使用特殊的化学催化剂，通常产率不高、选择性较差、存在污染和毒性等种种缺点。酶促合成具有条件温和、选择性好等特点，被广泛应用于多官能团药物特别是核苷类药物的衍生化反应，近年来已出现了许多有关生物催化的方法对核苷类药物进行结构修饰的报道，如 Riva等（J Am Chem Soc , 1988， 110 : 584)首次报导了用枯草杆菌蛋白酶在 DMF中选择性酯化腺苷和尿苷的伯羟基，该方法反应周期长（需 7〜8天），反应选择性较差，有多种产物。 Hanson等 (Bioorg. Med. Chem. , 2000， 8 : 2681)报道了用 ChiroCLECTM- BL 和来源于洋葱假单胞菌 {Pseudomonas ce ^ci^的固定化脂肪酶在丙酮和 DMF 中催化制备洛布卡韦 (Lobucavir, BMS 180194)的缬氨酸前药，此药可用于治疗疱疹病毒和乙型肝炎。但该反应底物浓度较低（10g/l)，反应副产物较多，选择性较低，后处理复杂。 Tamarez 等（Org Process Res Dev, 2003 , 7 : 951)揭示了一种 CAL 脂肪酶在无水四氢映喃中催化合成利巴韦林氨基酸衍生物的方法，该方法需要大量无水四氢呋喃作为溶剂，不利于环保，且后处理烦琐。 Kathleen McClean 等人（Tetrahedron Letters , 2011， 52 : 215)报道了利用商品化枯草杆菌蛋白酶的固定化酶 (ChiroCLEC-BL)催化 L_缬氨酸甲酯与阿昔洛韦发生酯交换反应合成了伐昔洛韦，而该反应规模较小，且酶源 ChiroCLEC-BL不能通过简单商业途径获得，增加了此工艺工业化应用的难度。林贤福等（Bioorg Med Chem Lett , 2005， 15 : 4064)报道了用枯草杆菌碱性蛋白酶在有机介质中催化合成阿糖胞苷前药，该方法选择性差，生成了包括可聚合 5' -0-酰基阿糖胞苷衍生物和 4-N-酰基阿糖胞苷衍生物等多种产物；还报道了用南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB)为催化剂在有机介质中催化合成阿糖胞苷前药，仅选择性酯化阿糖胞苷的 5' -0羟基位，然而该反应转化率很低。

现有的酶催化合成核苷类前药的方法通常具有需要采用大量的有机溶剂，选择性低或者需选用特定的蛋白酶等问题，从而导致存在环境不友好、转化率低、后处理复杂、工艺繁琐、原料或试剂不易得、经济成本高等问题。因此，研发一种转化率高、工艺简单、环境友好的酶催化合成核苷类前药的方法是抗病毒药物研究的重要方向。发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种操作简单、选择性高、条件温和、无溶剂低污染的蛋白酶或脂肪酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法。

本发明第一方面提供了一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法，包括步骤：在蛋白酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物；其中，

所述的核苷化合物为阿昔洛韦、更昔洛韦、肌苷、鸟苷、腺苷或阿糖胞苷；所述的 L-氨基酸酯为液态的 L-丝氨酸酯、液态的 L-丙氨酸酯、液态的 L-半胱氨酸酯或液态的 L-苯丙氨酸酯；

所述的核苷氨基酸衍生物为阿昔洛韦 -L-丝氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯、阿昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、阿昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-丝氨酸酯、更昔洛韦 -L-丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、更昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、肌苷 -L- 丝氨酸酯、肌苷 -L-丙氨酸酯、肌苷 -L-半胱氨酸酯、肌苷 -L-苯丙氨酸酯、鸟苷 -L- 丝氨酸酯、鸟苷 -L-丙氨酸酯、鸟苷 -L-半胱氨酸酯、鸟苷 -L-苯丙氨酸酯、腺苷 -L- 丝氨酸酯、腺苷 -L-丙氨酸酯、腺苷 -L-半胱氨酸酯、腺苷 -L-苯丙氨酸酯、阿糖胞苷 -L-丝氨酸酯、阿糖胞苷 -L-丙氨酸酯、阿糖胞苷 -L-半胱氨酸酯或阿糖胞苷 -L- 苯丙氨酸酯；

所述的蛋白酶为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、碱性蛋白酶 3. 0T、碱性蛋白酶 2. 4L FG、赛威蛋白酶 8. 0T、赛威蛋白酶 16. 0 L、益瑞蛋白酶 8. 0 L、艾威蛋白酶 16. 0 L或嗜热菌蛋白酶。

在另一优选例中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶 3. 0T。

在另一优选例中，所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄酯；和 /或所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 d-₄酯；和 /或所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸(^₄酯；和 /或所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸 d-₄酯。

在另一优选例中，所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸甲酯、 L-丝氨酸乙酯、 L-丝氨酸正丙酯或 L-丝氨酸甲酯。

在另一优选例中，所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸甲酯。

在另一优选例中，所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸甲酯。

在另一优选例中，所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸甲酯。

本发明第二方面提供了一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法，包括步骤：在脂肪酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物；其中，

所述的核苷化合物为阿昔洛韦、更昔洛韦、肌苷、鸟苷或腺苷；

所述的 L-氨基酸酯为液态的 L-缬氨酸酯、液态的 L-丝氨酸酯、液态的 L-丙氨酸酯、液态的 L-半胱氨酸酯或液态的 L-苯丙氨酸酯；

所述的核苷氨基酸衍生物为阿昔洛韦 -L-缬氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丝氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯、阿昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、阿昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-缬氨酸酯、更昔洛韦 -L-丝氨酸酯、更昔洛韦 -L-丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、更昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、肌苷 -L-缬氨酸酯、肌苷 -L-丝氨酸酯、肌苷 -L- 丙氨酸酯、肌苷 -L-半胱氨酸酯、肌苷 -L-苯丙氨酸酯、鸟苷 -L-缬氨酸酯、鸟苷 -L- 丝氨酸酯、鸟苷 -L-丙氨酸酯、鸟苷 -L-半胱氨酸酯、鸟苷 -L-苯丙氨酸酯、腺苷 -L- 缬氨酸酯、腺苷 -L-丝氨酸酯、腺苷 -L-丙氨酸酯、腺苷 -L-半胱氨酸酯或腺苷 -L- 苯丙氨酸酯；

所述的脂肪酶为丽波脂肪酶 100T、 Νονο435脂肪酶、脂肪酶 PS 天野 SD、脂肪酶 AS 天野、脂肪酶 AK 天野、脂肪酶 G、脂肪酶 AYS天野、南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB)或碱性脂肪酶 Greasex 50L。

在另一优选例中，所述的 L-缬氨酸酯为 L-缬氨酸 C1-4酯；和 /或所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄酯；和 /或所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 d-₄酯；和 /或所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸 CH酯；和 /或所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸 d— ₄酯。

在另一优选例中，所述的 L-缬氨酸酯为 L-缬氨酸甲酯或 L-缬氨酸乙酯。在另一优选例中，所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸甲酯、 L-丝氨酸乙酯、 L-丝氨酸正丙酯或 L-丝氨酸甲酯。

在另一优选例中，所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸甲酯。

在另一优选例中, 所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸甲酯。

在另一优选例中, 所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸甲酯。

在另一优选例中, 所述的 L-氨基酸酯为 L-缬氨酸甲酯。

在另一优选例中，所述的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶 B。

在另一优选例中，所述的核苷化合物为阿昔洛韦或更昔洛韦。

在另一优选例中, 所述的核苷化合物在反应体系中的浓度为 10〜50 g/L o 在另一优选例中, 所述的核苷化合物在反应体系中的浓度为 20〜30 g/L o 在另一优选例中, 所述的蛋白酶或脂肪酶在反应体系中的浓度为 8〜65g/L。在另一优选例中, 所述的蛋白酶或脂肪酶在反应体系中的浓度为 15〜30 g/L o 在另一优选例中,所述的反应在 20〜70 °C下进行；和 /或所述的反应进行 24〜

120 小时。

在另一优选例中, 所述的反应在 30〜50 °C下进行。

在另一优选例中, 所述的反应进行 72〜96 小时。

在另一优选例中, 所述的反应在相对真空度为 -100〜- 500mbar下进行。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施例

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现以蛋白酶或脂肪酶为催化剂，将核苷化合物与在反应温度下呈液态的 L-氨基酸酯进行无溶剂反应制备核苷氨基酸衍生物，该反应经济、环保、反应条件温和、转化率高、产物纯化简单、纯度高。在此基础上，发明人完成了本发明。术语

如本文所用，所述的 L-缬氨酸 d-₄酯为 L-缬氨酸垸基酯，例如 L-缬氨酸甲酯、 L-缬氨酸乙酯、 L-缬氨酸正丙酯、 L-缬氨酸异丙酯、 L-缬氨酸正丁酯、 L-缬氨酸异丁酯、 L-缬氨酸叔丁酯、或其类似物。

所述的 L-丝氨酸 d-₄酯为 L-丝氨酸 d-₄垸基酯，例如 L-丝氨酸甲酯、 L-丝氨酸乙酯、 L-丝氨酸正丙酯、 L-丝氨酸异丙酯、 L-丝氨酸正丁酯、 L-丝氨酸异丁酯、 L- 丝氨酸叔丁酯、或其类似物。

所述的 L-丙氨酸 d-₄酯为 L-丙氨酸 CH垸基酯，例如 L-丙氨酸甲酯、 L-丙氨酸乙酯、 L-丙氨酸正丙酯、 L-丙氨酸异丙酯、 L-丙氨酸正丁酯、 L-丙氨酸异丁酯、 L- 丙氨酸叔丁酯、或其类似物。

所述的 L-半胱氨酸 d-₄酯为 L-半胱氨酸 CH垸基酯，例如 L-半胱氨酸甲酯、 L- 半胱氨酸乙酯、 L-半胱氨酸正丙酯、 L-半胱氨酸异丙酯、 L-半胱氨酸正丁酯、 L- 半胱氨酸异丁酯、 L-半胱氨酸叔丁酯、或其类似物。

所述的 L-苯丙氨酸 d-₄酯为 L-苯丙氨酸 d-₄垸基酯，例如 L-苯丙氨酸甲酯、 L- 苯丙氨酸乙酯、 L-苯丙氨酸正丙酯、 L-苯丙氨酸异丙酯、 L-苯丙氨酸正丁酯、 L- 苯丙氨酸异丁酯、 L-苯丙氨酸叔丁酯、或其类似物。

如本文所用，所述的 "核苷氨基酸衍生物"为表 1所示的化合物。

阿糖胞苷 -L-丝氨酸酯

阿糖胞苷 -L-丙氨酸酯

阿糖胞苷 -L-半胱氨酸酯

阿糖胞苷 -L-苯丙氨酸酯

酶催化反应

本发明提供了一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的优选方法，其包括步骤：在蛋白酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物。

所述的核苷化合物优选为阿昔洛韦、更昔洛韦、肌苷、鸟苷、腺苷或阿糖胞苷。所述的 L-氨基酸酯优选为液态的 L-丝氨酸酯、液态的 L-丙氨酸酯、液态的 L- 半胱氨酸酯或液态的 L-苯丙氨酸酯。优选地，所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄ 酯；所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 CH酯；所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸 d-₄ 酯；所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸(^₄酯。

所述的蛋白酶优选为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、碱性蛋白酶（Alcalase) 3. 0T、碱性蛋白酶（Alcalase) 2. 4L FG、赛威（Savinase)蛋白酶 8. 0T、赛威蛋白酶 ( Savinase ) 16. 0 L、益瑞蛋白酶 ( Esperase ) 8. 0 L、艾威蛋白酶 ( Everlase ) 16. 0 L或嗜热菌蛋白酶（thermolys in)；较佳地，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶 (Alcalase) 3. 0T，其催化效果更佳，催化效率、选择性都更高。所述的核苷氨基酸衍生物为：阿昔洛韦 -L-丝氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯、阿昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、阿昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-丝氨酸酯、更昔洛韦 -L-丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、更昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、肌苷 -L- 丝氨酸酯、肌苷 -L-丙氨酸酯、肌苷 -L-半胱氨酸酯、肌苷 -L-苯丙氨酸酯、鸟苷 -L- 丝氨酸酯、鸟苷 -L-丙氨酸酯、鸟苷 -L-半胱氨酸酯、鸟苷 -L-苯丙氨酸酯、腺苷 -L- 丝氨酸酯、腺苷 -L-丙氨酸酯、腺苷 -L-半胱氨酸酯、腺苷 -L-苯丙氨酸酯、阿糖胞苷 -L-丝氨酸酯、阿糖胞苷 -L-丙氨酸酯、阿糖胞苷 -L-半胱氨酸酯或阿糖胞苷 -L- 苯丙氨酸酯。

本发明提供了另一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的优选方法，其包括步骤：在脂肪酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物。

所述的核苷化合物优选为阿昔洛韦、更昔洛韦、肌苷、鸟苷或腺苷；所述的 L-氨基酸酯优选为液态的 L-缬氨酸酯、液态的 L-丝氨酸酯、液态的 L- 丙氨酸酯、液态的 L-半胱氨酸酯或液态的 L-苯丙氨酸酯。优选地，所述的 L-氨基酸酯优选为液态的 L-缬氨酸酯、液态的 L-丝氨酸酯、液态的 L-丙氨酸酯、液态的 L-半胱氨酸酯或液态的 L-苯丙氨酸酯。优选地，所述的 L-缬氨酸酯为 L-缬氨酸 d-₄ 酯、所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄酯；所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 d-₄酯；所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸酯;所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸 d-₄ 酯。

所述的脂肪酶为丽波脂肪酶 (Lipolas e) 100T、 Novo435脂肪酶、脂肪酶 PS 天野 SD ( Lipase PS Amano SD ) , 脂肪酶 AS 天野（Lipase AS Amano)、脂肪酶 AK 天野（Lipase AK Amano ) ,脂肪酶 G ( Lipase G)、脂肪酶 AYS 天野（L ipase AYS Amano ) , 南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB)或碱性脂肪酶 Greasex 50L。优选为所述的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶 B，其催化效果更佳，催化效率、选择性都更高。

所述的核苷氨基酸衍生物为：阿昔洛韦 -L-缬氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丝氨酸酯、阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯、阿昔洛韦 -L-半胱氨酸酯、阿昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、更昔洛韦 -L-缬氨酸酯、更昔洛韦 -L-丝氨酸酯、更昔洛韦 -L-丙氨酸酯、更昔洛韦 -L- 半胱氨酸酯、更昔洛韦 -L-苯丙氨酸酯、肌苷 -L-缬氨酸酯、肌苷 -L-丝氨酸酯、肌苷 -L-丙氨酸酯、肌苷 -L-半胱氨酸酯、肌苷 -L-苯丙氨酸酯、鸟苷 -L-缬氨酸酯、鸟苷 -L-丝氨酸酯、鸟苷 -L-丙氨酸酯、鸟苷 -L-半胱氨酸酯、鸟苷 -L-苯丙氨酸酯、腺苷 -L-缬氨酸酯、腺苷 -L-丝氨酸酯、腺苷 -L-丙氨酸酯、腺苷 -L-半胱氨酸酯或腺苷 -L-苯丙氨酸酯。

本发明上述的两种方法采用在反应温度下为液态的 L-氨基酸酯 (优选 L-氨基酸 —₄酯），利用其呈液态的特性，可以在不添加其它溶剂的情况下进行酶促反应，液态的 L-氨基酸酯既作为反应物又作为溶剂， L-氨基酸酯投料量的提高，可以提高产物的转化效率，而且过量的 L-氨基酸酯可以回收再利用。因此，该方法具有选择性好、转化率高、收率高（收率均超过了 65 %，较佳地为 65-95 %或 70-90% )、质量好、成本低、环境污染少、操作简单等特点，适合工业化。

本发明所述方法中，由 L-氨基酸酯和核苷化合物构成反应体系，加入蛋白酶或脂肪酶，在酶的催化下，于一定温度（如 20〜70°C ; 较佳地为 30〜50°C)下反应一段时间（如 24〜120小时；较佳地为 72〜96小时），合成了一系列核苷氨基酸衍生物。所述的反应时间是指至催化反应转化率基本上不变所需要的时间，所谓的 "转化率基本上不变的时间"是指每 24小时转化率变化 5%的时间。所述的核苷化合物在反应体系中的浓度为 10〜50 g/L，优选 20〜30 g/Lo

增加蛋白酶或脂肪酶的用量可提高催化效果，但使用过多的酶易影响酶在反应体系中的分散，不利于底物在酶催化位点的进出，从而阻碍反应的发生。因此，本发明选用合适的蛋白酶或脂肪酶的用量，以利于反应的进行。所述的蛋白酶或脂肪酶在反应体系中的浓度为 8〜65 g/L，优选 15〜30 g/L。较佳地，所述的蛋白酶或脂肪酶为无水的或基本无水的。与现有技术相比，本发明采用酶促合成核苷氨基酸化合物的方法主要以下优占.

1、该方法所用的酶来源方便、无需经过特殊的处理程序，就能作为催化剂催化核苷化合物和 L一氨基酸酯的反应，从而制得高光学纯度、高收率的产物。本发明的酶具有选择性好、转化率高的特性。

2、该方法中 L-氨基酸酯既是反应物又是溶剂，在不添加其它溶剂的情况下进行反应，反应底物浓度高、产物转化效率高、质量好，并且过量的 L-氨基酸酯可以回收再利用，既降低了成本，又减少了环境污染。

3、该方法反应条件温和，操作简单，后处理简便、工业应用前景广泛，在核苷前药的制备及研究中具有重要的应用价值。下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明所用阿昔洛韦、更昔洛韦、肌苷、鸟苷、腺苷、阿糖胞苷、 L-氨基酸酯盐酸盐等原料或试剂，若无特别说明，均为市售产品。实施例 1

1. 1 L-缬氨酸甲酯的制备

往 500ml 具塞三角瓶中加入 L-缬氨酸甲酯盐酸盐（30g， 178. 9mmol)加入水 (50ml)和二氯甲垸 (30ml)，磁力搅拌溶解 L_缬氨酸甲酯盐酸盐，待其完全溶解后，向三角瓶中加入碳酸氢钠（18g， 214. 2匪₀1， 1. 2倍当量），快速搅拌反应至无气泡生成。转移至分液漏斗，分出二氯甲垸层，水层用二氯甲垸 (30ml X 2)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩，即得淡黄色透明液体 (L-缬氨酸甲酯 22g， 93. 7%) o

其它的 L-氨基酸酯的制备同此法，不同的是采用不同的 L-氨基酸酯盐酸盐代替 L-缬氨酸甲酯盐酸盐。

1. 2枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的制备

1) 枯草芽孢杆菌 SO 地衣芽孢杆菌 S02的发酵培养

枯草芽孢杆菌 S01，地衣芽孢杆菌 S02 从中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC) 购买获得。

枯草芽孢杆菌 S01发酵培养基 (g/L) :酵母浸粉 20，蔗糖 10，吐温 -80 5，硫酸镁 0· 2 , pH 9。

地衣芽孢杆菌 S02发酵培养基（g/L) : 蔗糖 50，酵母膏 20， NaCl 5, 磷酸氢二钾 5. 3，磷酸二氢钠 0. 3，碳酸钠 0. 56，硫酸锰 0. 02， pH 8. 7。

上述 2种培养基 121 °C灭菌 15 min，灭菌后冷却、接种枯草芽孢杆菌 S01或地衣芽孢杆菌 S02，接种量 4%，在 37°C，转速 200 r/min条件下发酵培养 36 h， 7500 rcf离心 10 min, 收集发酵液上清。

2) 枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶提取

取 100 mL发酵液上清，在冰浴条件下，缓慢滴入 2倍体积的冷冻丙酮，持续搅拌 1〜2 h后，在 4°C、 7500 rcf离心 10 min获得蛋白沉淀，将沉淀在室温下晾干，所得蛋白分别为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶。用于后续实施例中。实施例 2 酶催化反应

向反应体系中加入阿昔洛韦 40 mg、碱性蛋白酶 Alcalase 3. 0T 20 mg，再加入 L-丙氨酸甲酯 2 ml，混匀之后加入 4A分子筛 0. 1 g，放入 50°C恒温振荡培养箱中反应 24h，转速 250 rpm/min o 通过液相色谱测定上述反应的转化率，评估酶催化剂的催化活力（见表 2)。

转化率 (%) =产物峰面积 / (产物峰面积 +底物峰面积) *100% 含量测定方法- 阿昔洛韦和产物阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯的含量使用高效液相色谱测定，分析条件如下：采用 C18— XDB色谱柱（250 X 4. 6 mm, Agi lent) , 流动相为甲醇 /水（体积比为 20/80)，柱温 30°C ; 流速 0. 8 ml/min，检测波长 254 nm, 进样量 5 μ 1。阿昔洛韦标准品出峰时间为 3. 4min, 阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯标准品出峰时间为 5. 3 min。实施例 3-10 酶催化反应

实验方法同实施例 2，不同点在于，反应体系分别采用如表 2所示的条件进行

9 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶按实施例 1步骤 1. 2制备 65 +

10 地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶按实施例 1步骤 1. 2制备 65 + + 注：当转化率低于 5%时，催化活力标记为 " + "; 当转化率在 5〜10%时，催化活力标记为" ++"; 当转化率在 10〜15%时，催化活力标记为" +++";当转化率在 15〜 20%时，催化活力标记为 "++++"。

结果表明：选择碱性蛋白酶 (Alcalase 3. 0T和 Alcalase 2. 4L FG)为催化剂，催化阿昔洛韦合成阿昔洛韦 -L-丙氨酸酯的催化活力最高，而 CALB等脂肪酶也表现出了与 Alcalase 3. 0T和 Alcalase 2. 4L FG相当的催化效果。实施例 11 酶催化反应

向反应体系中加入肌苷 40 mg，再加入 L-丙氨酸甲酯 2 ml，形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入 Savinase 8. 0 T 40 mg和 4A分子筛 0. 1 g，放入 50°C 恒温振荡培养箱中反应 48 h，转速 250 rpm, 通过液相色谱测定上述反应 48小时时的转化率，评估酶催化剂的催化活力，其中，将肌苷与 L-丙氨酸酯进行酯交换反应 48h时的反应活力定为 100%。结果如表 3所示。实施例 12— 21 酶催化反应

实验方法同实施例 11，不同点在于，采用如表 3所示的原料或酶催化剂，通过液相色谱测定上述反应的转化率，评估酶催化剂的催化活力。

结果如表 3所示。

表 3 商品化酶合成几种核苷氨基酸衍生物

结果表明：选择碱性蛋白酶或脂肪酶为催化剂，能催化多种核苷化合物选择性进行酯交换反应，可对含有多官能团的核苷化合物进行结构修饰，其中利用脂肪酶 CALB对阿昔洛韦进行 L-缬氨酸甲酯修饰，催化活力最大，为阿糖胞苷的 5倍左右。实施例 22

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 200 mg (0. 89mmol) , 再加入 L-丝氨酸甲酯 20 ml , 形成底物浓度为 10 g/L的反应体系，加入嗜热菌蛋白酶 0. 8g，在 70°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 72h，通过液相色谱测定反应的转化率为 45. 3%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 68. 3%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 78. 2%。继续反应 24h，测定反应的转化率为 81. 9%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到阿昔洛韦 -L-丝氨酸酯盐酸盐 240. 7mg (0. 69腿 ol，摩尔收率 77. 5%) ，光学纯度 99. 2%。实施例 23

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 200 mg (0. 89mmol) , 再加入 L-半胱氨酸甲酯 10 ml，形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入碱性蛋白酶 (Alcalase) 2. 4L FG 0. 2 g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度 -700 mbar)反应 72h，通过液相色谱测定反应的转化率为 43. 3%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 61. 3%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 76. 5%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 79. 6%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到阿昔洛韦 -L-半胱氨酸酯盐酸盐 251. 7mg (0. 69mmol,摩尔收率 77. 5%) ，光学纯度 99. 1%。实施例 24

向 50 ml圆底烧瓶中加入更昔洛韦 100 mg (0. 39mmol) , 再加入 L-丝氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 10 g/L的反应体系，加入碱性蛋白酶 (Alcalase) 3. 0T 0. 2 g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度 -500 mbar)反应 72h，通过液相色谱测定反应的转化率为 46. 2%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 69. 3%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 81. 3%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 86. 1%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到更昔洛韦 -L-丝氨酸酯盐酸盐 149. Omg (0. 32腿 ol，摩尔收率 82. 0%) ，光学纯度 99. 5%。实施例 25

向 50 ml圆底烧瓶中加入肌苷 200 mg (0. 74mmol)，再加入 L-丙氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入赛威蛋白酶（Savinase ) 16. O L O. 5 g，在 60°C、磁力搅拌条件下减压（真空度 -700 mbar)反应 72h，通过液相色谱测定反应的转化率为 41. 2%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 59. 8%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 74. 5%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 78. 8%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到肌苷 -L-丙氨酸酯盐酸盐 214. 2mg (0. 57mmol，摩尔收率 77. 0%) ，光学纯度 99. 6%。实施例 26

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿糖胞苷 200 mg (0. 82mmol) , 再加入 L-苯丙氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入艾威蛋白酶（Everlase ) 16. 0 L 0. 3 g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度 -700 mbar)反应 72h，通过液相色谱测定反应的转化率为 40. 1%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 58. 3%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 73. 5%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 78. 2%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到阿糖胞苷 - L- 苯丙氨酸酯盐酸盐 269. Omg (0. 61腿 ol，摩尔收率 74. 4%) ，光学纯度 99. 2%。实施例 27

向 50 ml圆底烧瓶中加入鸟苷 200 mg (0. 70mmol)，再加入 L-丝氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入实施例 1制得的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶 0. 6 g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 33. 8%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 51. 7%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 64. 7%。再继续反应 24h，测定反应的转化率为 74. 3%。再继续反应 24h，测定反应的转化率为 80. 6%, 再继续反应 24h，测定反应的转化率为 84. 5%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、乙醇重结晶得到鸟苷 -L-丝氨酸酯盐酸盐 227. 8mg (0. 56腿 ol，摩尔收率 80. 0%) ，光学纯度 99. 7%。实施例 28

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 200 mg (0. 89mmol) , 再加入 L-缬氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L 的反应体系，加入南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB) 0. 3g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 38. 1%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 79. 8%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 86. 6%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 91. 3%，反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到伐昔洛韦盐酸盐 285. Omg (0. 79mmol,摩尔收率 88. 8%) ，光学纯度 99. 4%。实施例 29

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 700 mg (3. 11 mmol)，再加入 L_缬氨酸甲酯 20 ml , 形成底物浓度为 35 g/L的反应体系，加入丽波脂肪酶（Lipolase) 100T 0. 5 g，在 55°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 40. 8%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 78. 6%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 89. 6%,再继续反应 24h，测定反应的转化率为 90. 7%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到伐昔洛韦盐酸盐 970. 6mg ( 2. 69腿 ol，摩尔收率 86. 5%) ，光学纯度 99. 6%。实施例 30

向 50ml圆底烧瓶中加入更昔洛韦 300mg (l. 17mmol)，再加入 L-缬氨酸乙酯 20 ml , 形成底物浓度为 15g/L的反应体系，加入 Novo435脂肪酶 0. 3g，在 37°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 37. 7%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 75. 8%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 87. 6%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、乙醇重结晶得到更昔洛韦 -L-缬氨酸酯盐酸盐 488. 0mg(0. 98mmol,摩尔收率 83. 7%),光学纯度 98. 5%。实施例 31

向 50 ml圆底烧瓶中加入肌苷 200 mg (0. 74mmol)，再加入 L-丝氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入脂肪酶 PS 天野 SD 0. 2 g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 41. 5%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 73. 7%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 85. 9%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、乙醇重结晶得到肌苷 -L-丝氨酸酯盐酸盐 239. Omg (0. 61腿 ol，摩尔收率 82. 4%) ，光学纯度 99. 0%。实施例 32

向 50 ml圆底烧瓶中加入鸟苷 200 mg (0. 70mmol)，再加入 L_半胱氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入脂肪酶 AK 天野 0. 4 g，在 30°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 35. 1%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 51. 3%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 65. 6%。再继续反应 24h，测定反应的转化率为 73. 6%。再继续反应 24h，测定反应的转化率为 79. 6%,再继续反应 24h，测定反应的转化率为 82. 9%。反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、乙醇重结晶得到鸟苷 -L-半胱氨酸酯盐酸盐 232. 6mg (0. 55mmol，摩尔收率 78. 6%) ，光学纯度 99. 5%。实施例 33

向 50 ml圆底烧瓶中加入腺苷 200 mg (0. 75mmol)，再加入 L-丙氨酸甲酯 10 ml , 形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入碱性脂肪酶 Greasex 50L 0. 3g，在 40 V、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 41. 1%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 78. 8%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 85. 9%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 90. 1%，反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到腺苷 -L-丙氨酸酯盐酸盐 175. 3mg (0. 65mmol，摩尔收率 86. 7%) ，光学纯度 99. 4%。实施例 34 (对比例 1)

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 400 mg (l. 78mmol)，再加入 L_缬氨酸甲酯 10 ml和二甲基亚砜（DMSO) 10ml，形成底物浓度为 20 g/L的反应体系，加入南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB) 0. 3g，在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 31. 2%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 55. 8%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 63. 6%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 66. 7%，反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到伐昔洛韦盐酸盐 389. 7mg ( 1. 08mmol,摩尔收率 60. 7%)。实施例 35 (对比例 2 )

向 50 ml圆底烧瓶中加入阿昔洛韦 400 mg (l. 78mmol)，再加入 L_缬氨酸甲酯 ^！^和去离子水？!^，形成底物浓度为 33. 3 g/L的反应体系，加入南极假丝酵母脂肪酶 B (CALB) 0. 3g, 在 50°C、磁力搅拌条件下减压（真空度为 -300 mbar)反应 48h，通过液相色谱测定反应的转化率为 16. 7%，继续反应 24h，测定反应的转化率为 25. 6%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 29. 7%，再继续反应 24h，测定反应的转化率为 34. 3%，反应结束，经过盐酸酸化，过滤、浓缩、 50%乙醇重结晶得到伐昔洛韦盐酸盐 182. 5mg (0. 51mmol,摩尔收率 28. 7%)。实施例 34和 35实验结果表明在添加有机溶剂例如二甲基亚砜或水后，转化率较差。实验证明，有机溶剂或水在反应体系当中对酶的活性有较大的影响，不利于反应的继续进行，对后处理也会产生较大影响。可见，本发明所述的制备方法中，采用的蛋白酶或脂肪酶市售获得或者通过简单的发酵方法即可获得，无需经过一些特殊的处理过程。该方法无需另外添加溶剂，即可获得高纯度的产物。在本发明的蛋白酶或脂肪酶的催化下，该方法转化率高、选择性高、副产物少、后处理更简便。因此，该方法更简便、更经济、更环保，十分适合工业化。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1 . 一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法，其特征在于，包括步骤：在蛋白酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物；其中，

2. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，

所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄酯；和 /或

所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 d-₄酯；和 /或

所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸(^₄酯；和 /或

所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸 CH酯。

3. 一种酶催化合成核苷氨基酸衍生物的方法，其特征在于，包括步骤：在脂肪酶的催化下，核苷化合物和 L-氨基酸酯进行反应，从而得到核苷氨基酸衍生物；其中，

所述的脂肪酶为丽波脂肪酶 100T、 Νονο435脂肪酶、脂肪酶 PS 天野 SD、脂肪酶 AS 天野、脂肪酶 AK 天野、脂肪酶 G、脂肪酶 AYS天野、南极假丝酵母脂肪酶 B或碱性脂肪酶 Greasex 50L。

4. 如权利要求 3所述的方法，其特征在于，

所述的 L-缬氨酸酯为 L-缬氨酸 C1-4酯；和 /或

所述的 L-丝氨酸酯为 L-丝氨酸 d-₄酯；和 /或

所述的 L-丙氨酸酯为 L-丙氨酸 d-₄酯；和 /或

所述的 L-半胱氨酸酯为 L-半胱氨酸(^₄酯；和 /或

所述的 L-苯丙氨酸酯为 L-苯丙氨酸 CH酯。

5. 如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶 B。

6. 如权利要求 1或 3所述的方法，其特征在于，所述的核苷化合物为阿昔洛韦或更昔洛韦。

7. 如权利要求 1或 3所述的方法，其特征在于，所述的核苷化合物在反应体系中的浓度为 10〜50 g/L o

8. 如权利要求 1或 3所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶或脂肪酶在反应体系中的浓度为 8〜65g/L。

9. 如权利要求 1或 3所述的方法，其特征在于，所述的反应在 20〜70°C下进行；和 /或所述的反应进行 24〜120 小时。

10. 如权利要求 1或 3所述的方法，其特征在于，所述的反应在相对真空度为 -100〜- 500mbar下进行。