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WO2014068238A1 - Production d'acide hyaluronique dans les algues - Google Patents

Production d'acide hyaluronique dans les algues Download PDF

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WO2014068238A1
WO2014068238A1 PCT/FR2013/052578 FR2013052578W WO2014068238A1 WO 2014068238 A1 WO2014068238 A1 WO 2014068238A1 FR 2013052578 W FR2013052578 W FR 2013052578W WO 2014068238 A1 WO2014068238 A1 WO 2014068238A1
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WO
WIPO (PCT)
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production
genome
algae
algal cell
gene
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2013/052578
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English (en)
Inventor
Ghislaine Tissot-Lecuelle
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Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP13801614.2A priority Critical patent/EP2914716A1/fr
Publication of WO2014068238A1 publication Critical patent/WO2014068238A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01212—Hyaluronan synthase (2.4.1.212)

Definitions

  • the present invention relates to the production of hyaluronic acid (HA) in algae or algal cells in culture and transformed. These cells or algae are capable of producing hyaluronic acid in the chloroplast or cytosolic compartments, at lower cost, with a higher yield.
  • HA hyaluronic acid
  • the production in one of the plastid compartments makes it possible to regulate the molecular weight of this glycosaminoglycan.
  • Hyaluronic acid is a linear, non-sulfated glycosaminoglycan composed of several repetitive doses of a disaccharide lneumatic consisting of beta-1,3-N-acetylglucosamine (GIcNac) and beta-1 acid, 4- glucuronic (GIcUA) (Weissman and Meyer, 1954). It was isolated for the first time by Meyer and Palmer in 1,934. The disaccharide repeat number is greater than 10,000 (Weigel and DeAngelis, 2007). Molecular weights of ⁇ from different sources are highly variable, ranging from 10 4 to 10 7 Da.
  • HA is a naturally occurring biopolymer in all vertebrates and some pathogenic bacteria and whose unique structure is highly conserved.
  • HA is also present in the capsules of certain strains of bacteria (for example, strains of streptococci).
  • ⁇ is produced in the form of hyaluronate salt and is found in high concentrations in young and healthy tissues, mainly in connective, epithelial and nervous tissues (in the skin, vitreous humor and synovial fluid) .
  • HA hyaluronic acid synthase
  • the industrial HA is of either animal or bacterial origin (Liu et al, 2011). Indeed, commonly, this polysaccharide is extracted either:
  • animal tissues (cartilage of cockerel crest),
  • recombinant bacteria such as Bacillus subtilis (Widner et al., 2005, US2007 / 0166793A1 and US 2011/0014662 A1).
  • Other recombinant HA production systems from plants or other transformed microorganisms (Lactococcus lactis, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, see review by Liu et al., 2011) have been tested but are not available. have not been developed further for the production of industrial HA.
  • Microbial fermentations require growth media containing sugars so expensive and expensive facilities.
  • E. coli there are problems such as lack of protein processing or degradation by proteases, inclusion bodies may be formed, etc.
  • the purification costs can become extremely high in order to prevent contamination by endotoxins.
  • a number of enzymes are involved in bi biosynthesis. These enzymes include:
  • HAS hyaluronic acid synthase
  • U D P-glucuronic acid U D P-Glucose dehydroogenase (UG D), U D P-Glucose pyrophophorylase (UGPase), phosphoglucomutase,
  • UDP-N-acetylglucosamine glucose-6-phosphate isomerase (or phosphoglucose isomerase), glutamine amido-transferase, phosphoglu cosa minemase, acetyl transferase and UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase,
  • HAS is a key enzyme in de production that catalyzes chain elongation of this glycosaminoglycan.
  • HASs of various origins have been characterized including bacteria (such as Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus, Pasteurella multocida), vertebrates (mammals, of avian origin) and viruses.
  • Class I Streptococcus spp., Mammalian, avian, viral
  • Class II Prasteurella multocida
  • the Class II enzyme from Pasteurella multocida is a membrane protein but is attached only by a domain located at the COOH end to the plasma membrane, unlike class I enzymes that have 6-8 transmembrane domains.
  • the present invention generally relates to a method for producing hyaluronic acid of variable molecular weight in algae, or to algal cells genetically modified either at the level of the nuclear genome and / or the plastid genome so as to give them an ability to produce hyaluronic acid, and methods for obtaining these transgenic algae cells.
  • Algae are ideal systems that can produce their own carbohydrates through photosynthesis.
  • the present invention also relates to the custom modulation of the degree of polymerization of ⁇ by using the differences in oxidation-reduction property of cellular compartments of algae.
  • one of the objects of the present invention is a transformed algal cell characterized in that it comprises a construct stably integrated in its genome for the production of hyaluronic acid synthetase (HAS).
  • HAS hyaluronic acid synthetase
  • the construct comprises a nucleic acid encoding the HAS, the vertebrate of which can be vertebrate, especially the human, the mouse, the rabbit, the chicken, the cattle or the amphibian, such as Xenopus laevis, of microorganisms.
  • the term "construct” includes, in particular, a nucleic acid sequence encoding an enzyme operably linked to suitable regulatory sequences for the production of said enzyme.
  • ⁇ may require the introduction of other nucleic acids allowing the production of enzyme intervening upstream of the HAS.
  • the invention also relates to an algal cell comprising either in the construct producing the HAS or, in one or more different constructs, at least one of the following nucleic acids stably integrated (s) in its genome and allowing the production of the following enzymes:
  • UDP-G hydric acid (UG D) and / or UD P-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), and / or phosphoglucomutase and / or
  • glucose-6-phosphate isomerase or phosphoglucose isomerase
  • the origin of the nucleic acids encoding these enzymes may be variable and in particular of plant origin, and / or algae, and / or microorganisms, and / or viruses, and / or vertebrates.
  • constructs according to the invention are stably integrated into the genome of the algal cells. This integration can be done according to the cellular compartment in which the production of HA is desired in the nuclear and / or plastid genome of said cell. In a particular embodiment of the invention, the construct (s) are stably integrated into the chloroplast genome.
  • the oxydo-reductive properties of the chloroplast stroma whether from plants or algae, it is possible to modulate the size of the HA molecules produced (thus the molecular weight), depending on the growth conditions ( culture medium, lighting ...) algae and / or the activity and / or overproduction of enzymes of the bi biosynthetic pathway (such as UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase)).
  • UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase
  • the integration of a transgene into the plastid genome offers several novel advantages related to their prokaryotic origin (Dubald et al., 2007; Goldschmidt-Clermont, 2011).
  • the transgene is integrated by homologous recombination at a well-defined plastome locus. It is interesting to note that in some algae, such as Nannochloropsis, the integration of transgenes in the nuclear genome as in the plastome also occurs by homologous recombination. Chloroplasts can be transformed with multiple genes, due to the availability of multiple insertion sites.
  • the number of copies of plastome can be up to 10,000 in a single plant photosynthetic cell compared to 80 in algae (as for example Chlamydomonas). These levels of production are also explained by the absence of gene silencing mechanisms existing at the level of the nuclear genome and reducing the production of recombinant proteins.
  • HA hydroxyacetylglucosamine
  • Plastid production of HA therefore involves manipulating genetically in chloroplasts two other synthetic metabolic pathways of the two precursors of ⁇ , in addition to introducing that of ⁇ .
  • the present invention also provides a method for obtaining an algal cell comprising the steps of: (1) transforming the algal cell into a transforming cell comprising a construct,
  • said construct which comprises a DNA sequence coding for HAS, (3) culturing cells transformed in conditions suitable for the production of HA HA being produced in the cytosolic or plastid compartment.
  • the present invention also provides a method of obtaining an algal cell comprising the steps of: (1) algal cell transformation by at least one transformation vector comprising at least one construct
  • a single construct which comprises a nucleic acid encoding HAS and at least one nucleic acid encoding UDP-Glucose dehydrogenase (UGD) and / or UDP-Glucose Pyrophosphorylase (UGP-ase), and / or phosphoglucomutase and / or phosphoglucose isomerase, glutamine amido transferase and / or phosphoglucosamine mutase and / or acetyltransferase and / or UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase and / or hexokinase,
  • the at least one HAS comprising a nucleic acid coding for: U DP-Glucose dehydrogenase ( UGD) and / or U DP-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), and / or phosphoglycanase and / or phosphoglucose isomerase, glutamine amido transferase and / or phosphoglucosamine mutase and / or acetyltransferase and / or or U DP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase and / or hexokinase.
  • UGD U DP-Glucose dehydrogenase
  • UDP-ase U DP-Glucose pyrophosphorylase
  • / or phosphoglycanase and / or phosphoglucose isomerase glutamine amido transferase and / or phosphoglucosamine mutase and
  • the algal cells or the algae are transformed with the DNA coding for a protein having a hyaluronic acid synthase activity and possibly DNA coding for an enzyme involved in the biosynthesis of precursor sugar under the control of regulatory elements (promoter, 5'UTR (UnTranslated Region), 3'UTR ”) able to work in algae.
  • regulatory elements promoter, 5'UTR (UnTranslated Region), 3'UTR .
  • the protein having hyaluronic acid synthase activity synthesizes hyaluronic acid from 2 substrates UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylglucosamine.
  • HAS from animals, microorganisms, viruses and the like can be used.
  • HAS derived from vertebrates such as humans, mice, rabbits, chickens, cattle and amphibians (Xenopus laevis)
  • microorganisms such as Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus and Pasteurella multocida
  • viruses such as chlorella virus and or nucleic acids similar to those mentioned above can be used.
  • nucleotide-activated sugars which can be: UDP-N-acetylglucosamine, UDP-glucuronic acid, UDP-N-acetylgalactosamine , UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-xylose, GDP-fucose, GDP-mannose, CMP-neuraminic acid.
  • nucleotide-activated sugars or nucleotide sugars
  • UDP-N-acetylglucosamine UDP-glucuronic acid
  • UDP-N-acetylgalactosamine UDP-glucose
  • UDP-galactose UDP-xylose
  • GDP-fucose GDP-mannose
  • CMP-neuraminic acid CMP-neuraminic acid
  • UDP-glucuronic acid nucleotide sugars in general
  • UDP-N-acetylglucosamine The enzymes associated with the biosynthetic pathways of UDP-glucuronic acid (nucleotide sugars in general) and UDP-N-acetylglucosamine are as follows: UDP-Glucose dehydrogenase (UGD) UDP-Glucose pyrophosphorylase (UGPase), phosphoglucomutase, phosphoglucoisomerase, glutamine amido transferase, phosphoglucosamine mutase, acetyl transferase and UDP-Glucosamine pyrophosphorylase (UGPase).
  • UDP-Glucose dehydrogenase UDP-Glucose pyrophosphorylase
  • phosphoglucomutase phosphoglucoisomerase
  • glutamine amido transferase phosphoglucosamine mutase
  • nucleotide-activated sugar production increases the levels of UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylglucosamine (substrates for HAS) in algal cells. This improvement in the production levels of these sugars is achieved by introducing into the nuclear and / or plastid genome (ex: chloroplast) the gene (s) coding for one (or more) enzyme (s) of the biosynthetic pathway. of these precursors nucleotides.
  • genes can be of various origins, of any organism capable of synthesizing these precursors, such as bacteria (Streptococcus spp, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, etc.), plants, algae (such as C. reinhardtii, .. .), ... etc.
  • bacteria Streptococcus spp, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, etc.
  • plants algae (such as C. reinhardtii, .. .), ... etc.
  • HAS is expressed from the nuclear genome to evaluate the amounts of HA produced and test the possibility of excretion of polysaccharide out of algal cells according to the different growth conditions of Chlamydomonas reinhardtii.
  • the coding sequence of the gene coding for HAS is resynthesized in order to optimize its codon use with respect to that of the nuclear genome (very rich in GC) of C. reinhardtii, and therefore to optimize the production of this enzyme (at the level of translation).
  • the transformation of the algal cells and the construction of the transformation vectors are carried out as described in the article by Kindie et al. (1990).
  • the selection of the transformants may be carried out, for example, on a Tris Acetate Phosphate (TAP) medium containing paromomycin (15 ⁇ g / ml).
  • TAP Tris Acetate Phosphate
  • Example 4 Production of HA in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast stroma HAS and the enzymes of the biosynthetic pathway of HA precursors were expressed in the chloroplast compartment in order to benefit from the many conventional advantages of chloroplast transformation and previously described. Construction of chloroplast transformation vectors
  • the genes of the HAS chosen the genes encoding the U DP-Glucose pyrophosphorylase (UGPase) and the UDP-glucose dehydrogenase as well as all the other genes (coding phosphoglucoisomerase, U DP-glucosamine pyrophophorylase ...) necessary for a large production of plastidial HA will be synthetic genes (or transgene) with a codon usage optimized with respect to the codon use of the C. reinhardtii chloroplast genome, to facilitate their translation.
  • chloroplast or plastome genome transformation vectors that allow the generation of transplastomic C. reinhardtii strains lacking selection markers and expressing the genes of interest (such as HAS and / or enzymes for the synthesis of one or more precursors).
  • transplastomic is intended to mean algae which have stably incorporated into their plastome a functional cholesteric gene in plastids, in particular in chloroplasts.
  • Plastome is the genome of non-nucleus cellular organelles, in particular the chloroplast genome.
  • chimeric gene is meant a coding region of a gene to be expressed from the chloroplast genome comprising upstream a promoter (hereinafter denoted P and allowing the initiation of transcription) and a 5 'untranslated region but present on mRNA (hereinafter referred to as 5'-UTR allowing ribosome binding and translation) of a gene and downstream a 3 'regulatory region untranslated but present on mRNA (3'-UTR).
  • P upstream a promoter
  • 5'-UTR allowing ribosome binding and translation
  • chimeric operon is meant a succession of at least two coding regions of genes (polycistron) separated between them by a 5'-UTR and comprising upstream a P / 5'UTR and downstream a regulatory region 3 '. translated (3'-UTR).
  • cis-acting elements such as promoters and nontranslated regions, for the efficient expression of localized transgenes in the chloroplast genome is well documented in vascular plants (Ruhlman et al., 2010). ) and Chiamydomonas (Barnes et al., 2005).
  • the cis-acting elements (P / 5'-UTR) can exert their effects at different levels such as transcription, mRNA stability, and translation (Ruhlman et al, 2010, Michelet et al., 201 1).
  • cis (P / 5'UTR) regulatory elements of chloroplast genes more or less strongly expressed (depending on the desired ratio of enzymes produced) were chosen.
  • PITR UTR of psaA-exon1 Michelet et al., 201 1
  • Other chimeric genes have been constructed using the P / 5'-UTR of the psbD and atpA genes to allow high levels of expression (Barnes et al., 2005, Michelet et al., 201 1).
  • Another preferred promoter according to the invention consists of the promoter r constitutive operon ribosomal RNA, denoted Prrn (promoter 1 6S rRNA) Chiamydomonas reinhardtii fused to a 5'UTR, to allow the initiation of translation, either a native chloroplast gene of algae (for example of Chiamydomonas), a heterologous bacterial or bacteriophage gene (such as the 5'UTR gene G10L bacteriophage T7), or synthetic.
  • Prrn promoter 1 6S rRNA
  • P / 5'-UTRs may be used, such as the psbA genes (coding for the D1 protein of Photosystem II) and rbcL (encoding the broad subunit of Rubisco) (Barnes et al., 2005, Michelet et al. al., 201 1, Rasala et al., 201 0, Rasala et al., 201 1). It is important to note that in the Chiamydomonas chloroplast, expression levels of chimeric transgenes controlled by the cis-acting elements of psbA are higher when the endogenous psbA gene has been deleted.
  • the P / 5'UTR algae such as Chiamydomonas reinhardtii but regulatory elements of other origins are used such as those of chlorella, diatom.
  • heterologous promoters such as, for example, tobacco psbA P / 5'UTR or corn Prrn fused to bacteriophage T7 G10L 5'UTR, etc.
  • the expression of the chimeric genes of interest coding for HAS and / or one or more enzymes involved in the synthesis of precursors of ⁇ can be regulated by inducible promoters, for example the P / 5'UTR of psbD. light-inducible, or the copper-sensitive cytochrome C6 promoter and fused to the coding region of the Nac2 protein (regulatory element acting in trans on the psbD gene promoter) (Surzycki et al., 2007), or using the Lake Escherichia coli regulation system (Kato et al., 2007), or by ribosome switches (Verhounig et al., 2010), etc.
  • any factor acting in trans and participating in anterograde signaling can be used to create systems for inducing or repressing the expression of the gene in the chloroplast (in plastids in general) of algae or of plants.
  • chloroplast mRNAs have an AU-rich 3 'untranslated end (denoted 3'-UTR) with an inverted terminal repeat that acts in cis. The latter is involved not only in the maturation and stability of the mRNA but also serves to promote the initiation of translation and the association of polysomes.
  • the 3'-UTR of the rbcL, atpA, psbA and tRNAarg genes can be exemplified (Barnes et al., 2005).
  • the 3'-UTR rbcL of Chiamydomonas reinhardtii is a preferred embodiment. But other 3'UTRs of other plastid genes of Chiamydomonas, or other algae or other organisms can be too.
  • any regulatory element P, 5'-UTR, 3'-UTR, or N-terminal region of the coding region, etc.
  • a plastome gene of algae or plants or from any organism possessing a plastome, or a bacterial gene is suitable, and the person skilled in the art will be able to make the appropriate choice among the various available regulatory elements so as to obtain a desired expression mode (constitutive and / or inducible).
  • transplastomic cells In order to select plastids and effectively transformed cells (ie transplastomic cells), i.e. those having incorporated the chimeric gene (s) (or construct or operon) (s) ) in their plastome, a selection marker is used. It also makes it possible to obtain algae trans n spl astom ic in the state of homoplasm.
  • the term "homoplasmy” means that all the plastome copies of each transformed cell (each transplastomic cell) have integrated the transgenes.
  • the chimeric aadA gene coding for a 3 "-adenyltransferase aminoglycoside (most commonly used) conferred an antibiotic resis tance.
  • kanamycin resistance genes such as, for example, neo-genes encoding neomycin phosphotransferase and aphA-6 encoding an aminoglycoside phosphotransferase.
  • antibiotic resistance Day and Goldschmidt-Clermont, 201
  • Other non-dominant genes can be used such as the betaine aldehyde tolerance gene such as the gene coding for betaine aldehyde dehydrogenase, but also genes for tolerance to antibiotics.
  • herbicides such as the bar gene for tolerance to bialaphos, the EPSPS gene for glyphosate tolerance.
  • GUS enzyme beta-glucuronidase
  • GFP green fluorescent protein
  • Another selection strategy consists in choosing as a host a photosynthetic mutant.
  • the chimeric gene of interest will then be bound to a wild-type copy of the affected gene in order to restore the photosynthetic function.
  • photosynthetic mutants of Chlamydomonas deleted in the atpB gene Michelet et al., 2011.
  • selectable chimeric marker genes means a coding region of a selectable marker gene capable of being expressed from the chloroplast genome and comprising upstream P / 5'-UTR and downstream a 3'-UTR. .
  • the transformation vectors of the plastid genome thus comprise a chimeric marker gene of selection and / or a gene making it possible to restore a mutated gene and its function, and at least one chimeric gene of interest, adjacent.
  • the chimeric marker gene of selection will comprise a regulatory element (P / 5'-UTR or 3'-UTR) identical to a regulatory element of the chimeric gene of adjacent interest so as to allow spontaneous excision by the sequence of the homologous recombination selection marker gene (Dufourmantel et al., 2007, Michelet et al., 2011).
  • the group of chimeric genes is flanked on both sides by two plastid DNA fragments, "RRHD” (Upstream Right Homologous Recombination Region) and "RRHG” (Downstream Homologous Left Recombination Region), facilitating integration by homologous recombination of chimeric genes into the plastid genome of algae, or plant.
  • RRHD Upstream Right Homologous Recombination Region
  • RRHG Downstream Homologous Left Recombination Region
  • Choosing the insertion site in the plastome can have a profound effect on the level of protein accumulation. Insertion of a transgene into the repeat region of the plastome doubles the number of transgene copies per genome, relative to insertions in particular regions.
  • insertion of the chimeric genes into the plastome according to the chosen RRHs will be done either in a silent intergenic zone (and conferring new functions), or in a coding region of a gene leading to the deletion of its function and therefore a phenotype, either in a gene previously mutated and causing the restoration of its function and thus the disappearance of the phenotype (Michelet et al., 2011).
  • plastid sequences have been used as insertion sites for chimeric genes, as for example the trnV / rps12, trnl / trnA, rps7 / ndhB, ndhF / trnL, rbcL / accD, .. .
  • the two RRHG and RRHD homologous recombination regions according to the invention correspond to contiguous sequences allowing integration of the chimeric genes into the intergenic region between the ribosomal RNAs and the psbA gene.
  • Another transformation vector containing the wild-type atpB gene (on one of the RRHs) allows by replacement to restore the atpB gene as well as its function in a Chlamydomonas mutant (Michelet et al., 2011).
  • This chloroplast transformation vector is used to transform Chlamydomonas cells using the common helium gun bombardment technique of tungsten micro-projectiles or gold complexed with transforming DNA, as described for example in the article Michelet et al. (2011).
  • the transformants After bombardment with a helium gun of the plastid transformation vectors, the transformants (from the mutant strain) were selected on a minimal solid medium rich in salts, under illumination (60 microE / m 2 / s) and subcultured several times for to obtain homoplasmic strains. In the case of wild strains, the transformants were selected on a solid TAP medium supplemented with 100 microgram / ml spectinomycin and subcultured several times to obtain homoplasmic strains for the transgenes. They were then cultured on an antibiotic-free solid TAP medium to allow complete excision of the chimeric aadA gene. Wild transformants were grown under light (60 microE / m 2 / s). Detection of homoplasmic lines
  • Transgene integration and homoplasmic status of all spectinomycin-resistant transformants were assessed by PCR on total DNA extract.
  • Those skilled in the art will be able to draw specific sense and antisense primers to detect PCR amplification bands of different sizes corresponding either to the insertion of the chimeric genes into the plastome or to the wild copies of Remaining plastid DNA.
  • the loss of the PCR amplification signal with the wild-type plastome-specific primers indicates that the insertion of transgenes occurred in all plastome copies.
  • Glycosaminoglycans can be quantified and analyzed by NMR, MS, LC-MS, reverse phase HPLC, or high performance anion exchange chromatography as an example.
  • the HA produced in the algae or algal cells is measured in a crude extract according to the Carbazole method (Bitter et al., 1962). This is measures the amount of glucuronic acid released after hydrolysis with m 2 so 4 .
  • the HA contained in the crude extract of recombinant algal cells may also be quantified, for example, using the HA quantization kit marketed by Corgenix. Selected samples were analyzed for HA content using an Elisa test based on the interaction of ⁇ with a biotinylated protein specific for ⁇ (see manufacturer's protocol).
  • Gel filtration chromatography in combination with light scattering may be used to determine the average molecular weight.
  • Kumar A (ed) IK International Publishers. New Delhi, pp 36-59.
  • Rasala BA Muto M., Lee PA, Jager M., Cardoso RM., Behnke CA, Hokanson CA, Crea R, Mendez M, and Mayfield SP. (2010) Production of therapeutic proteins in algae, analysis of expression of seven human proteins in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. Plant Biotechnol J.8: 719-33.

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Abstract

La présente invention a pour objet une cellule algale transformée caractérisée en ce qu'elle comprend un construit intégré de façon stable dans son génome permettant la production de l'acide hyaluronique synthétase (HAS) ainsi qu'un procédé de production d'acide hyaluronique.

Description

Production d'acide hyaluronique dans les algues
La présente invention concerne la production d'acide hyaluronique (HA) dans une algue ou des cellules algales en culture et transformées. Ces cell ules ou algues sont capables de produ ire, dans les compartiments chloroplastiques ou cytosoliques, de l'acide hyaluronique, à moindre coût, avec un rendement plus élevé. La production dans un des compartiments des plastes permet de réguler le poids moléculaire de ce glycosaminoglycane.
L'acide hyaluronique (HA) est un glycosaminoglycane linéaire, non sulfaté, composé de plusieurs un ités répétées d'un disaccharide l inéaire constitué de beta-1 ,3-N-acétylglucosam ine (GIcNac) et d'acide beta-1 ,4- glucuronique (GIcUA) (Weissman and Meyer, 1 954). Il a été isolé pour la première fois par Meyer et Palmer en 1 934. Le nombre de répétition de disaccharide est supérieur à 10 000 (Weigel and DeAngelis, 2007). Les poids moléculaires de ΙΉΑ provenant de différentes sources sont très variables, allant de 104 à 107 Da.
L'HA est un biopolymère naturellement présent chez tous les vertébrés et certaines bactéries pathogènes et dont la structure unique est hautement conservée.
Dans des cond itions normales de croissance, les algues ne peuvent pas produire d'HA. Cependant, il a été observé que la chlorelle lorsqu'elle est infectée par le virus Paramecium bursaria 1 (PBCV-1 ) est capable de produire et d'excréter de ΙΉΑ (DeAngelis et al., 1997).
L'HA est aussi présent dans les capsules de certaines souches de bactéries (par exemple, des souches de streptocoques). Dans le corps humain, ΙΉΑ est produit sous forme de sel d e hyaluronate et se trouve en concentrations élevées dans les tissus jeunes et sains, principalement dans les tissus conjonctifs, épithéliaux et nerveux (dans la peau, l'humeur vitrée et le liquide synovial).
C'est un des principaux composants de la matrice extracellulaire avec un rôle important dans l'hydratation, la tonicité et l'élasticité de la peau.
Son absence d'immunogénicité et de toxicité lui ont permis de trouver une large gamme d'applications dans les industries cosmétiques et biomédicales.
Le poids moléculaire est un paramètre de qualité important pour
ΙΉΑ commerciale. I l détermine les propriétés rhéologiques de ΙΉΑ produit, affecte la réponse physiologique, et entraine des applications spécifiques. L'HA de haut poids moléculaire a été utilisé pour le traitement de l'arthrose, en chirurgie ophtalmologique, pour la prévention des adhérences, l'accélération de la cicatrisation des plaies et les cosmétiques. Au contraire, l'HA de faible poids moléculaire a des effets physiologiquement actifs ouvrant de nouvelles utilisations de celui-ci à des biomatériaux ou pour des usages médicaux. Plusieurs facteurs peuvent influencer le poids moléculaire de ΙΉΑ (Liu et al., 2011) comme les conditions de culture des cellules transformées (pH, oxygénation,...). D'autres peuvent influencer le taux de synthèse d'HA comme par exemple le rapport entre l'acide hyaluronique synthase (HAS) et les enzymes impliquées dans la synthèse des précurseurs de l'HA.
Compte-tenu de la forte demande dans cette molécule due à une population vieillissante, le marché de l'HA est en continuelle augmentation.
L'HA industrielle est d'origine soit animale, soit bactérienne (Liu et al, 2011). En effet, de manière courante, ce polysaccharide est extrait soit:
- de tissus animaux (de cartilage de crêtes de coq),
- de bactéries le synthétisant naturellement, comme Streptoccocus zooepidemicus et Pasteurella multocida
(procédés de fermentation bactérienne),
- de bactéries recombinantes, comme Bacillus subtilis (Widner et al., 2005; US2007/0166793A1 et US 2011/0014662 A1). D'autres systèmes de production d'HA recombinant à partir de plantes ou d'autres micro-organismes transformés (Lactococcus lactis, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, cf. revue de Liu et al., 2011 ), ont été testés mais n'ont pas été développés plus avant pour la production d'HA industriel. Dans le cas du système végétal, des plantes de tabac (US20060168690A1 ), de pomme de terre, de tomate et de riz (EP1805312B1 ) ont été génétiquement modifiées uniquement au niveau de leur génome nucléaire par le gène de l'HAS du virus de la chlorelle, avec une production d'HA uniquement dans le cytosol des cellules végétales. La production de l'HA par des cellules de mammifères soulève d'autres problèmes : ces cellules sont coûteuses à développer et à entretenir (Elles ont besoin de milieux de croissance chers et se développent lentement (Potvin et al., 2010). De plus, le risque de contamination, par exemple, par des encéphalopathies spongiformes transmissibles (prions) ou la transmission de virus à l'homme a été évoqué pour l'extraction d'HA à partir de tissus d'animaux.
Les fermentations microbiennes exigent quant à elles des milieux de croissance contenant des sucres donc chers et des installations coûteuses. Chez E. coli, il existe des problèmes tels que l'absence de processing des protéines ou de dégradation par des protéases, des corps d'inclusion peuvent être formés, etc. Lorsque des substances thérapeutiques sont produites dans des micro-organismes, les coûts de purification peuvent devenir extrêmement élevés afin de prévenir la contamination par des endotoxines.
Au contraire, les algues possédant une croissance très rapide et produisant leurs propres glucides par voie photosynthétiques, sont des systèmes industriels parfaitement adaptés avec de faibles consommations énergétiques, et donc très avantageux pour la production d'HA. De plus, ces organ ismes sont réputés comme sûrs car ne présentant aucun agent pathogène (virus, prions, toxines...) pour l'homme.
Un certain nombre d'enzymes sont impliquées dans la biosynthèse de ΙΉΑ. Ces enzymes incluent :
- l'acide hyaluronique synthase (HAS),
- les enzymes de la voie de biosynthèse du premier précurseur d e Ι Ή Α , l ' U D P-acide glucuronique : l ' U D P-Glucose déhyd rogénase (U G D), l ' U D P-Glucose pyrophophorylase (UGPase), la phosphoglucomutase,
- les enzymes de la voie de biosynthèse du deuxième précurseur de ΙΉΑ, l'UDP-N-acétylglucosamine : la glucose-6-phosphate isomérase (ou phosphoglucose isomérase), la glutamine amido- transférase, la phosphoglu cosa m i n e m utase, l 'acétyl- transférase et l'UDP-N-acétylglucosamine pyrophophorylase,
- une héxokinase. L'HAS est une enzyme clé dans la production de ΙΉΑ qui catalyse l'élongation de la chaîne de ce glycosaminoglycane. Des HAS de diverses origines ont été caractérisées incluant des bactéries (comme Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus, Pasteurella multocida), des vertébrés (mammifères, d'orig ine aviaire) et de virus. Basé sur les similarités de structure et des propriétés enzymatiques, ces HAS ont été classées en deux catégories très différentes, désignées Classe I (Streptococcus spp., mammifères, d'origine aviaire, viral) et Classe II (de Pasteurella multocida). Par exemple, l'enzyme de la Classe I I (de Pasteurella multocida) est une protéine membranaire mais attachée uniquement par un domaine situé à l'extrémité COOH à la membrane plasmique, contrairement aux enzymes de la Classe I qui possèdent 6 à 8 domaines transmembranaires (DeAngelis, 2012). La présente invention concerne de manière générale un procédé de production d'acide hyaluronique de poids moléculaire modulable dans des algues, ou des cellules algales génétiquement modifiées soit au niveau du génome nucléaire et/ou du génome plastidial de manière à leur conférer une aptitude à produire de l'acide hyaluronique, et des procédés d'obtention de ces cellules transgéniques d'algues. Les algues sont des systèmes idéaux qui peuvent produire leurs propres glucides grâce à la photosynthèse.
La présente invention concerne également la modulation à façon du degré de polymérisation de ΙΉΑ en utilisant les différences de propriété d'oxydoréduction des compartiments cellulaires des algues.
Ainsi, l'un des objets de la présente invention est une cellule algale transformée caractérisée en ce qu'elle comprend un construit intégré de façon stable dans son génome permettant la production de l'acide hyaluronique synthétase (HAS).
Dans le cadre de la présente invention le construit comprend un acide nucléique codant pour la HAS dont l'orignie peut être vertébrée notamment l'homme, la souris, le lapin, le poulet, les bovins ou amphibienne comme Xenopus laevis, de micro-organismes notamment Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus, ou Pasteurella multocida...), de virus, ou encore être choisi parmi les séquences E.C.2.4.1 .212 De manière générale, dans le cadre de la présente invention, le terme construit comprend notamment une séquence d'acice nucléique codant pour une enzyme opérationnellement liée à des séquences régulatrices adaptées permettant la production de ladite enzyme.
La production de ΙΉΑ peut nécessiter l'introduction d'autres acides nucléiques permettant la production d'enzyme intervenant en amont de l'HAS.
Ainsi, dans un autre aspect, l'invention a également pour objet une cellule algale comprenant soit dans le construit produisant la HAS soit, dans un ou plusieurs construits différents, au moins l'un des acides nucléiques suivants intégré(s) de manière stable dans son génome et permettant la production des enzymes suivantes :
- l'UDP-G l u cose d é hyd rog én ase ( U G D) et/ou l ' U D P-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), et/ou la phosphoglucomutase et/ou
- la glucose-6-phosphate isomérase (ou phosphoglucose isomérase), la glutamine amido-transférase et/ou, la phosphoglucosamine mutase et/ou, l'acétyl-transférase et/ou l'UDP-N-acétylglucosamine pyrophosphorylase et/ou
- une hexokinase
L'origine des acides nucléiques codant pour ces enzymes peut être variable et notamment d'origine de plantes, et/ou d'algues, et/ou de micro- organismes, et/ou de virus, et/ou de vertébrés.
Les construits selon l'invention sont intégrés de manière stable dans le génome des cellules algales. Cette intégration peut se faire en fonction du compartiment cellulaire dans lequel la production d'HA est souhaitée dans le génome nucléaire et/ou plastidial de ladite cellule. Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, le(s) construit(s) sont intégré(s) de manière stable dans le génome chloroplastique. Grâce aux propriétés oxydo-réductrices du stroma du chloroplaste qu'il soit de plante ou d'algues, il est possible de moduler à façon la taille des molécules d'HA produites (donc le poids moléculaire), en fonction des conditions de croissance (milieu de culture, éclairage...) des algues et/ou de l'activité et/ou de la surproduction des enzymes de la voie de biosynthèse de ΙΉΑ (comme par exemple l'UDP- glucose pyrophophorylase (UGPase)).
Comparée à la transformation nucléaire classique, l'intégration d'un transgène dans le génome plastidial (ou plastome) offre plusieurs avantages originaux liés à leur origine procaryotique (Dubald et al., 2007; Day and Goldschmidt-Clermont, 2011). Tout d'abord, le transgène est intégré par recombinaison homologue à un locus bien défini du plastome. Il est intéressant de noter que chez certaines algues, comme Nannochloropsis, l'intégration des transgènes dans le génome nucléaire comme dans le plastome se produit aussi par recombinaison homologue. Les chloroplastes peuvent être transformés avec des gènes multiples, en raison de la disponibilité de sites d'insertion multiples. Comme chez les bactéries, plusieurs groupes de gènes plastidiaux sont organisés en opérons, offrant la possibilité d'exprimer plusieurs transgènes sous forme d'un seul polycistron régulé par un promoteur unique et donc de manipuler des voies métaboliques complexes dans un seul événement. Chez les plantes, les niveaux d'expression des protéines recombinantes dans les chloroplastes sont souvent très élevés jusqu'à 70% des protéines solubles totales chez les plantes (De Cosa et al., 2001; Dufourmantel et al., 2007; Tissot et al., 2008; Oey et al., 2009) grâce à des machineries de transcription et de traduction très actives dans les chloroplastes ainsi qu'au grand nombre de copies de plastome dans les cellules. En effet, le nombre de copies de plastome peut s'élever à 10000 dans une seule cellule photosynthétique de plante par rapport à 80 chez les algues (comme par exemple Chlamydomonas). Ces niveaux de production s'expliquent aussi par l'absence de mécanismes d'extinction génique existant au niveau du génome nucléaire et réduisant la production de protéines recombinantes.
Le développement de la transformation chloroplastique chez les algues pour la production de protéines d'intérêt est plus récent que chez les plantes et nécessite des améliorations. En effet, les niveaux d'expression plastidiale obtenus ne dépassent pas 10% des protéines solubles totales chez Chlamydomonas reinhardtii (Rasala et al., 2010). De plus, certaines protéines ne sont pas facilement exprimées (Rasala et al., 2010).
La production plastidiale d'HA dans les algues comporte plusieurs difficultés techniques. Tout d'abord, la production de quantités importantes d'HA cause une augmentation de la viscosité du milieu de culture. De plus, il existe une forte concurrence entre la synthèse d'HA et la croissance cellulaire qui consomment les mêmes précurseurs tels que par exemple, le glucose-1- phosphate, l'UDP-glucose, l'UDP-acide glucuronique, et l'UDP-N- acétylglucosamine. La production plastidiale d'HA implique donc de manipuler génétiquement dans les chloroplastes deux autres voies métaboliques de synthèse des deux précurseurs de ΙΉΑ, en plus d'introduire celle de ΙΉΑ.
La présente invention a également pou r objet u n procédé d'obtention de cellule algale comprenant les étapes de : (1 ) transformation de cell u le algale p a r u n ve cte u r d e transformation comprenant un construit,
(2) obtention de ladite cellule algale ayant intégré de façon stable dans son génome ledit construit, lequel comprend une séquence d'ADN codant pour la HAS, (3) culture des cel l ules transformées dans des cond itions appropriées à la production de HA, le HA étant produit dans le compartiment cytosolique ou plastidial.
La présente invention a également pou r objet u n procédé d'obtention de cellule algale comprenant les étapes de : (1 ) transformation de cellule algale par au moins un vecteur de transformation comprenant au moins un construit
(2) obtention de ladite cellule algale ayant intégré de façon stable dans son génome
- soit un construit unique lequel comprend un acide nucléique codant pour la HAS et au moins un acide nucléique codant pour l'UDP-Glucose déhydrogénase (UGD) et/ou l'UDP-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), et/ou la phosphoglucomutase et/ou la phosphoglucose isomérase, la glutamine amido-transférase et/ou , la phosphoglucosamine mutase et/ou, l'acétyl- transférase et/ou l'UDP-N-acétylglucosamine pyrophosphorylase et/ou une hexokinase,
- soit un ou plusieurs construits différents intégré(s) de manière stable dans son génome comprenant - en plus du constru it permettant l'expression de la HAS- au moins construit comprenant un acide nucléique codant pour: l'U DP-Glucose déhydrogénase (UGD) et/ou l'U DP-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), et/ou la phosphog l ucom utase et/ou la phosphogl ucose isomérase, la g l utam ine am ido-transférase et/ou , la phosphoglucosam ine mutase et/ou , l'acétyl-transférase et/ou l 'U DP-N- acétylglucosamine pyrophosphorylase et/ou une hexokinase. (3) culture des cell ules transformées dans des cond itions appropriées à la production de HA, le HA étant produit dans le compartiment cytosolique ou plastidial.
Exemple 1 : l'acide hyaluronique synthase
Les cellules algales ou les algues sont transformées avec l'ADN codant pour une protéine ayant une activité d'acide hyaluronique synthase et éventuellement d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse de sucre précurseurs sous le contrôle d'éléments régulateurs (promoteur, 5'UTR (UnTranslated Région), 3'UTR... ) capable de fonctionner dans des algues.
Dans la présente invention, la protéine ayant une activité d'acide hyaluronique synthase synthétise l'acide hyaluronique à partir de 2 substrats l'UDP-acide glucuronique et de l'UDP-N-acétylglucosamine.
Les HAS provenant d'animaux, de micro-organismes, de virus et autres peuvent être utilisés. En particulier, l'HAS dérivée de vertébrés comme les humains, les souris, les lapins, les poulets, les bovins et d'amphibiens (Xenopus laevis), de micro-organismes tels que Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus et Pasteurella multocida, de virus tels que le virus de la chlorelle et ou encore des acides nucléiques analogues à ceux cités ci-dessus peuvent être utilisés.
Exemple 2: co-expression d'autres enzymes La production de ΙΉΑ peut être complétée par la production de sucres activés comme des sucres activés par un nucléotide (ou sucres à nucléotides) qui peuvent être: l'UDP-N-acétylglucosamine, l'UDP-acide glucuronique, UDP-N-acétylgalactosamine, UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-xylose, GDP-fucose, GDP-mannose, CMP- acide neuraminique. Parmi les sucres à nucléotides, les sucres UDP sont préférés, comme l'UDP-N- acétylglucosamine et UDP- acide glucuronique sont préférés.
Les enzymes associées avec les voies de biosynthèse de l'UDP- acide glucuronique (sucres à nucléotide en général) et de l'UDP-N-acétylglucosamine sont les suivantes : l'UDP-Glucose déhydrogénase (UGD) l'UDP- Glucose pyrophophorylase (UGPase), la phosphoglucomutase, la phosphoglucoisomérase, la glutamine amido-transférase, la phosphoglucosamine mutase, l'acétyl-transférase et l'UDP-Glucosamine pyrophophorylase (UGPase).
L'amélioration des niveaux de production de sucres activés par un nucléotide, permet d'augmenter les niveaux d'UDP-acide glucuronique et d'UDP-N-acétylglucosamine (substrats pour l'HAS) dans des cellules d'algues. Cette amélioration des niveaux de production de ces sucres est réalisée par introduction dans le génome nucléaire et/ou plastidial (ex : chloroplastique) du (des) gène(s) codant pour une (ou plusieurs) enzyme(s) de la voie de biosynthèse de ces précurseurs nucléotides.
Ces gènes peuvent être d'origines diverses, de tout organisme capable de synthétiser ces précurseurs, comme de bactéries (Streptococcus spp, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis,...), de plantes, d'algues (comme C. reinhardtii,...), ...etc.
Il est constaté que l'introduction simultanée d'une protéine ayant une activité d'acide hyaluronique synthase et d'au moins une des enzymes précurseurs dans les cellules algales permet une augmentation de la synthèse d'acide hyaluronique grâce à l'augmentation d'UDP-acide glucuronique et d'UDP-N-acétylglucosamine en tant que substrats, dans lequel l'acide hyaluronique est un polymère constitué d'unités répétées d'acide glucuronique et de N-acétylglucosamine. Exe m p l e 3 : production d'HA dans le cytosol de Chlamydomonas reinhardtii
L'HAS est exprimée à partir du génome nucléaire pour évaluer les quantités d'HA produit et tester la possibilité d'excrétion du polysaccharide hors des cellules d'algues en fonction des différentes conditions de croissance de Chlamydomonas reinhardtii.
Quelque soit son origine (cf exemple 1 ), la séquence codante du gène codant pour l'HAS est resynthétisée de manière à optimiser son usage codon par rapport à celu i du génome nucléaire (très riche en GC) de C. reinhardtii, et donc à optimiser la production de cette enzyme (au niveau de la traduction).
Les enzymes co-exprimées avec l'HAS et listées dans l'exemple 2 sont également exprimées:
soient à partir du génome nucléaire produites dans le cytosol et/ou adressées dans un des compartiments chloroplastiques,
soient à partir du génome chloroplastique et produites dans un des compartiments chloroplastiques.
La transformation des cellules algales et la construction des vecteurs de transformation sont réalisées comme décrit dans l'article de Kindie et al. (1990). La sélection des transformants pourra être réalisée par exemple sur un milieu Tris Acétate Phosphate (TAP) contenant de la paromomycine (15 μg/m\).
Exemple 4 : Production d'HA dans le stroma du chloroplaste de Chlamydomonas reinhardtii L'HAS et les enzymes de la voie de biosynthèse des précurseurs de l ' HA ont été exprimés dans le compartiment chloroplastique afin de bénéficier des nombreux avantages classiques de la transformation chloroplastique et précédemment décrits. Construction de vecteurs de transformation chloroplastique
Les gènes de l'HAS choisis, les gènes codant l'U DP-Glucose pyrophophorylase (UGPase) et l'UDP-glucose déhydrogénase ainsi que tous les autres gènes (codant la phosphoglucoisomérase, l'U DP-glucosamine pyrophophorylase ...) nécessaires à une production importante d'HA plastidial seront des gènes synthétiques (ou transgène) avec un usage codon optimisé par rapport à l'usage codon du génome chloroplastique de C. reinhardtii, pour faciliter leur traduction.
Da ns ce trava i l, nous avons d éveloppé des vecteurs de transformation du génome chloroplastique (ou plastome) qui permettent la génération de souches de C. reinhardtii transplastomiques dépourvues de marqueurs de sélection et exprimant les gènes d'intérêt (comme celui de l'HAS et/ou des enzymes pour la synthèse d'un ou plusieurs précurseurs).
Par « transplastomique », on entend selon l'invention des algues ayant intégré de man ière stable dans leu r plastome u n gène ch imère fonctionnel dans les plastes, en particul ier dans les ch loroplastes. Le « plastome » est constitué par le génome des organites cellulaires autres que le noyau, en particulier le génome des chloroplastes.
Ces gènes seront exprimés dans le génome chloroplastique à partir de construits comprenant soit un (ou des) gène(s) chimérique(s), soit un (ou des) opéron(s) chimérique(s). Par « gène chimérique », on entend une région codante d'un gène à exprimer à partir du génome chloroplastique comportant en amont un promoteur (noté par la suite P et permettant l'initiation de la transcription) et une région 5' non traduite mais présente sur l'ARNm (noté par la suite 5'-UTR permettant la fixation des ribosomes et la traduction) d'un gène et en aval une région régulatrice 3' non traduite mais présente sur l'ARNm (3'- UTR). Par « opéron chimérique », on entend une succession d'au moins deux régions codantes de gènes (polycistron) séparées entre elle par un 5'-UTR et comportant en amont un P/5'UTR et en aval une région régulatrice 3' non traduite (3'-UTR). L'importance des éléments agissant en cis, tels que les promoteurs et les régions 5' non tradu ites, pour l'expression efficace de transgènes local isés dans le génome chloroplastique est bien docu mentée dans les plantes vasculaires (Ruhlman et al., 2010) et chez Chiamydomonas (Barnes et al., 2005). Les éléments ag issant en cis (P/5'-UTR) peuvent exercer leurs effets à différents niveaux tels que la transcription, la stabilité des ARNm et la traduction (Ruhlman et al, 2010; Michelet et al., 201 1 ).
D'autres facteurs protéiques agissant en trans et codés par le génome nucléaire ont été identifiés. Ils affectent, la maturation, la stabilité, l'accumulation et la traduction des ARNm dans les chloroplastes.
Pour diriger l'expression des transgènes dans les chloroplastes d'algues, des éléments régulateurs cis (P/5'UTR) de gènes chloroplastiques plus ou moins fortement exprimés (en fonction du ratio souhaité d'enzymes produites) ont été choisis. De manière préférée, nous avons choisis le PI 5 UTR de psaA-exon1 (Michelet et al., 201 1 ) qui permet de forte expression de transgène. D'autres gènes chimériques ont été construits en utilisant le P/5'- UTR des gènes psbD et atpA pour permettre des niveaux élevés d'expression (Barnes et al., 2005; Michelet et al., 201 1 ). Un autre promoteur préféré selon l' i nvention est constitué d u promoteu r constitutif de l'opéron des ARN ribosomaux, noté Prrn (promoteur 1 6S rRNA) de Chiamydomonas reinhardtii fusionné à un 5'UTR, pour permettre l'initiation de la traduction, soit d'un gène chloroplastique natif d'algue (par exemple de Chiamydomonas), soit d'un gène hétérologue de bactérie ou de bactériophage (comme le 5'UTR de gène G10L du bactériophage T7), soit synthétique.
D'autres P/5'-UTR pourront être utilisés comme celui des gènes psbA (codant pour la protéine D1 du Photosystème II) et rbcL (codant la large sous-unité de la Rubisco) (Barnes et al., 2005 ; Michelet et al., 201 1 ; Rasala et al. , 201 0; Rasala et al., 201 1 .). Il est important d e noter q u e da n s l e chloroplaste de Chiamydomonas, les n iveaux d'expression de transgènes chimères contrôlés par les éléments agissant en cis de psbA sont plus élevés lorsque le gène endogène psbA a été supprimé. Cet effet a été attribué à la concurrence pour des activateurs et aux boucles régulatrices par rétrocontrôle négatif (Rasala et al., 2010). De manière préférée, les P/5'UTR d'algues comme Chiamydomonas reinhardtii mais des éléments régulateurs d'autres origines sont utilisés comme ceux par exemple de la chlorelle, de diatomée. De la même manière des promoteurs hétérologues (comme par exemple, le P/5'UTR de psbA de tabac ou le Prrn de maïs fusionné au 5'UTR de gène G10L du bactériophage T7,...) peuvent être utilisés pour la construction des nombreux gènes chimériques et éviter les recombinaisons homologues avec des éléments régulateurs endogènes et donc des éliminations intempestives des gènes d'intérêt (alors que cet effet pourra être recherché au contraire pour l'élimination des gènes de sélection).
L'expression des gènes chimériques d'intérêt codant l'HAS et/ou une ou des enzymes impliquées dans la synthèse des précurseurs de ΙΉΑ est susceptible d'être régulée par des promoteurs inductibles, comme par exemple le P/5'UTR de psbD inductible par la lumière, ou le promoteur du cytochrome C6 sensible au cuivre et fusionné à la région codante de la protéine Nac2 (élément régulateur agissant en trans sur le promoteur du gène psbD) (Surzycki et al., 2007), ou en utilisant le système de régulation lac d'Escherichia coli (Kato et al., 2007), ou par des commutateurs à ribosomes (Verhounig et al., 2010), etc. D'une manière générale, tout facteur agissant en trans et participant à la signalisation antérograde peut être utilisé pour créer de systèmes d'induction ou de répression de l'expression du gène dans le chloroplaste (dans les plastes en général) d'algues ou de plantes.
La plupart des ARNm des chloroplastes ont une extrémité 3' non traduite riche en AU (notée 3'-UTR) avec une répétition terminale inversée qui agit en cis. Cette dernière est impliquée non seulement dans la maturation et la stabilité de l'ARNm mais aussi sert à promouvoir l'initiation de la traduction et l'association des polysomes.
Parmi les 3'-UTR fonctionnels dans le chloroplaste de Chiamydomonas, on peut noter à titre d'exemple le 3'-UTR des gènes rbcL, atpA, psbA et tRNAarg (Barnes et al., 2005).
Les 3'-UTR de rbcL de Chiamydomonas reinhardtii constituent un mode de réalisation préférée. Mais d'autres 3'UTR d'autres gènes plastidiaux de Chiamydomonas, ou d'autres algues ou d'autres organismes peuvent l'être également. D'une manière générale, tout élément régulateur (P, 5'-UTR, 3'- UTR, ou région N-terminal de la région codant...) issu d'un gène du plastome d'algues ou de plantes ou de tout organisme possédant un plastome, ou d'un gène de bactérie convient, et l'homme du métier saura faire le choix adéquat parmi les différents éléments régulateurs disponibles de manière à obtenir un mode d'expression désiré (constitutif et/ou inductible).
Le choix de ces éléments régulateurs est important par rapport aux rations d 'expression de Ι ΉΑ synthase vis-à-vis des d iverses enzymes permettant la synthèse des précurseurs et pour contrôler la tail le et les quantités d'HA produit.
Afin de sélectionner les plastes et les cellules effectivement transformées (c'est-à-dire les cellules transplastomiques), c'est-à-dire celles ayant incorporé le(s) gène(s) (ou construit ou opéron) chimérique(s) dans leur plastome, un marqueur de sélection est utilisé. Il permet également d'obtenir des algues tra n spl astom iq u es à l 'état d ' homopl asm i e . Le term e « homoplasmie » signifie que toutes les copies de plastome de chaque cellule transformée (chaque cellule transplastomique) ont intégré les transgènes. Parmi les gènes utilisés comme marqueurs de sélection, et à titre d'exemple, le gène chimérique aadA codant pour une aminoglycoside 3"-adényltransférase (m a rq u e u r dom i n a nt) conféra n t u n e rés i sta n ce a ux a n ti b ioti q u es spectinomycine et streptomycine est le plus couramment utilisé pour transformer les plastome d'algues. On peut citer aussi les gènes de résistance kanamycine tel que par exemple, les gènes neo codant pour une néomycine phosphotransférase et aphA-6 codant pour une am inoglycoside phosphotransferase de résistance aux antibiotiques (Day and Goldschmidt- Clermont, 201 1 ). D'autres gènes non dominants peuvent être utilisés comme le gène de tolérance à la bétaïne aldéhyde tel que le gène codant pour la bétaïne aldéhyde déshydrogénase, mais aussi des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS pour la tolérance au glyphosate. On peut également utiliser des gènes rapporteurs codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS (Béta- glucuronidase) ou la GFP (green fluorescent protein), des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments ou d'acides aminés essentiels dans les cellules transformées (Day and Goldschmidt- Clermont, 2011).
Une autre stratégie de sélection consiste à choisir comme hôte un mutant photosynthétique. Dans le vecteur de transformation chloroplastique, le gène chimérique d'intérêt sera alors lié à une copie sauvage du gène affecté afin de restaurer la fonction photosynthétique. Par exemple, les mutants photosynthétiques de Chlamydomonas délétés dans le gène atpB (Michelet et al., 2011).
On entend par « gènes marqueurs chimérique de sélection », une région codante d'un gène marqueur de sélection capable d'être exprimée à partir du génome chloroplastique et comportant en amont un P/5'-UTR et en aval un 3'-UTR.
D'une manière générale, les vecteurs de transformation du génome plastidial comportent donc un gène chimérique marqueur de sélection et/ou un gène permettant de restaurer un gène muté et sa fonction, et au moins un gène chimérique d'intérêt, adjacents. Il est important de noter que le gène chimérique marqueur de sélection comportera un élément régulateur (P/5'-UTR ou 3'-UTR) identique à un élément régulateur du gène chimérique d'intérêt adjacent de manière à permettre l'excision spontanée par la suite du gène marqueur de sélection par recombinaison homologue (Dufourmantel et al., 2007 ; Michelet et al., 2011).
De plus, le groupe de gènes chimériques est encadré de part et d'autre par deux fragments d'ADN plastidial, "RRHD" (Région de Recombinaison Homologue Droite amont) et "RRHG" (Région de Recombinaison Homologue Gauche aval), facilitant l'intégration par recombinaison homologue des gènes chimériques dans le génome plastidial d'algue, ou de plante.
Le choix du site d'insertion dans le plastome peut avoir un profond effet sur le niveau d'accumulation des protéines. L'insertion d'un transgène dans la région répétée du plastome double le nombre de copies du transgène par génome, par rapport aux insertions dans des régions particulières.
L'insertion des gènes chimériques dans le plastome selon les RRHs choisis se fera soit dans une zone intergénique silencieuse (et conférant de nouvelles fonctions), soit dans une région codante d'un gène entraînant la délétion de sa fonction et donc un phénotype, soit dans un gène préalablement muté et provoquant la restauration de sa fonction et donc la disparition du phénotype (Michelet et al., 2011 ).
À ce jour, plusieurs séquences plastidiales ont été utilisées comme sites d'insertion de gènes chimériques, comme à titre d'exemple, les régions trnV/rps12, trnl/trnA, rps7/ndhB, ndhF/trnL, rbcL/accD, ...
De façon préférentielle, les deux régions de recombinaison homologues RRHG et RRHD selon l'invention correspondent à des séquences contigues permettant l'intégration des gènes chimériques dans la région intergénique entre les ARN ribosomaux et le gène psbA. Un autre vecteur de transformation contenant le gène atpB sauvage (sur une des RRHs) permet par remplacement de restaurer le gène atpB ainsi que sa fonction dans un mutant de Chlamydomonas (Michelet et al., 2011 ).
Transformation du génome chloroplastique et culture de Chlamydomonas
Ce vecteur de transformation chloroplastique est utilisé pour transformer des cellules de Chlamydomonas en utilisant la technique courante de bombardement avec un canon à hélium de micro-projectiles de tungstène ou d'or complexés à l'ADN transformants, comme décrit par exemple dans l'article de Michelet et al. (2011 ).
Les souches de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage, ou mutante (suppression de atpB) ont été cultivées dans du milieu Tris Acétate Phosphate (TAP) à des densités de 1-2x106 cellules/ml dans l'obscurité ou sous un éclairage fluorescent (60 microE/m2/s) à 25°C.
Après bombardement avec un canon à hélium des vecteurs de transformation plastidial, les transformants (issus de la souche mutante) ont été sélectionnés sur un milieu solide minimal riche en sels, sous éclairage (60 microE/m2/s) et repiquées plusieurs fois pour obtenir des souches homoplasmiques. Dans le cas des souches sauvages, les transformants ont été sélectionnés sur un milieu TAP solide complétés par des 100 microgramme/ml de spectinomycine et repiquées à plusieurs reprises pour obtenir des souches homoplasmiques pour les transgènes. Elles ont ensuite été cultivées sur un milieu solide TAP sans antibiotique pour permettre l'excision complète du gène chimérique aadA. Les transformants sauvages ont été cultivés à la lumière (60 microE/m2/s). Détection de lignées homoplasmiques
L'intégration du transgène et l'état d'homoplasmie de tous les transformants résistants à la spectinomycine ont été évalués par PCR sur un extrait d'ADN total. L'homme de l'art sera a même de dessiner des amorces sens et anti-sens spécifiques pour détecter des bandes d'amplification PCR de tailles différentes et correspondant soit à l'insertion des gènes chimériques dans le plastome soit aux copies sauvages d'ADN plastidial restantes. La perte du signal d'amplification PCR avec les amorces spécifiques du plastome sauvage indique que l'insertion des transgènes s'est faite dans toutes les copies de plastome.
Détection des protéines recombinantes
De m a n i è re à d étecter et quantifier les protéines d'intérêt exprimées dans les plastes, des expériences de Western Blot ont été réalisées sur des extraits protéiques totaux des lignées transplastomiques et homoplasmiques. Les membranes de nitrocellulose ont ensuite été incubées en présence d'anticorps spécifiques dirigées contre la protéine d'intérêt. Dans le cas où aucun anticorps n'était disponible, la protéine d'intérêt était produite avec 6 histidines ou un Tag HA (YPYDVPDYA, SEQ ID No. 1 ) en COOH- terminale, reconnus par un anticorps monoclonal spécifiques anti-Histidine ou anti-Tag HA. Exemple 5: Une des méthodes de mesures de quantification de l'HA recombinant produit
Les glycosaminoglycanes peuvent être quantifiés et analysés à titre d'exemple par RMN, MS, LC-MS, HPLC en phase inverse, ou par chromatographie échangeuse d'anions haute performance.
L'HA produit dans les algues ou cellules algales est mesuré, dans un extrait brut, selon la méthode au Carbazole (Bitter et al., 1962). Ce test mesure la quantité d'acide glucuronique relargué après hydrolyse avec de m2so4.
L'HA contenu dans l'extrait brut de cellules algales recombinantes peut aussi être quantifié par exemple grâce au kit de quantification d'HA commercialisé par Corgenix. Des échantillons choisis ont été analysés pour la teneur en HA en utilisant un test Elisa basé sur l'interaction de ΙΉΑ avec une protéine biotinylée spécifique de ΙΉΑ (cf protocole du fabricant).
La chromatographie par gel filtration en combinaison avec diffusion de lumière pourra être utilisée pour déterminer le poids de masse moléculaire moyenne.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Cellule algale transformée caractérisée en ce qu'elle comprend un construit intégré de façon stable dans son génome permettant la production de l'acide hyaluronique synthétase (HAS).
2. Cellule algale transformée selon la revendication 1 caractérisée en ce que le construit comprend un acide nucléique codant pour la HAS d'origine
- vertébrée notamment l'homme, la souris, le lapin, le poulet, les bovins ou les amphibiens comme Xenopus laevis, ou de micro-organismes notamment Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, Streptococcus equi subsp zooepidemicus, ou Pasteurella multocida...),
ou de virus,
ou choisi parmi les séquences E.C.2.4.1 .212
3. Cellule algale selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle comprend également soit dans le construit produisant la HAS soit dans un ou plusieurs constru its différents au moins l'un des acides nucléiques suivant intégré(s) de manière stable dans son génome et codant pour :
- l'UDP-G l u cose d é hyd rog én ase ( U G D) et/ou l ' U D P-Glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), et/ou la phosphoglucomutase et/ou
- la phosphoglucose isomérase, la glutamine amido-transférase et/ou, la phosphoglucosam ine mutase et/ou , l'acétyl-transférase et/ou l 'U DP-N- acétylglucosamine pyrophosphorylase et/ou
- une hexokinase.
4. Cellule algale selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'un quelconque des acides nucléiques est d'origine végétale, et/ou d'algues, et/ou de micro-organismes, et/ou de virus, et/ou de vertébrés.
5. Cellule algale transformée selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qui le ou les construits sont intégré(s) de manière stable dans le génome nucléaire et/ou plastidial de ladite cellule.
6. Cellule algale transformée selon la revendication 5 caractérisée en ce que le ou les construits sont intégré(s) de manière stable dans le génome chloroplastique.
7. Cellule algale transformée selon l'une des revendications précédentes choisie parm i les Ch lorophytes notam ment la ch lorel le, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella sp., Haematoccoccus pluvialis, les Rhodophytes, les algues brunes Phaeophyte, les d iatomées notamment Phaeodactylum tricornutum, les Euglénides, les dinoflagellés, ou des espèces de Nannochloropsis comme Nannochloropsis oculata ou Nannochloropsis gaditana ou Nannochloropsis salina.
8. Procédé de production d'HA caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la mise en culture des cellules selon l'une des revendications 1 à 7 dans des conditions adaptées permettant la production d'HA et éventuellement
- la purification de ΙΉΑ synthétisé.
9. Utilisation d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 8 pour la production d'HA
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