JP2000116382A - ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の遺伝子ターゲッティング用ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒアルロン酸合成酵素１（ＨＡＳ１）遺伝子
の遺伝子ターゲッティングに使用できるＤＮＡを提供す
る 【解決手段】 宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入すべき導
入ＤＮＡと、前記導入ＤＮＡの5'側及び3'側にそれぞれ
連結された第１相同領域ＤＮＡ及び第２相同領域ＤＮＡ
と、第１相同領域ＤＮＡの5'側及び第２相同領域ＤＮＡ
の3'側に連結された、宿主細胞内において発現可能な陰
性マーカー遺伝子とを含むＤＮＡであって、前記導入Ｄ
ＮＡは、宿主細胞内において発現可能な陽性マーカー遺
伝子を含み、前記導入ＤＮＡ並びに該導入ＤＮＡに連結
された前記第１相同領域ＤＮＡ及び前記第２相同領域Ｄ
ＮＡと、前記染色体ＤＮＡのヒアルロン酸合成酵素１の
細胞内ループをコードする領域とが相同組換えを起こす
ことができるように構築されているＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒアルロン酸合成
酵素遺伝子の遺伝子ターゲッティングに使用されるＤＮ
Ａに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」ともい
う）は、高分子量のグリコサミノグリカンであり、関節
軟骨などの細胞外マトリクスの主要構成分子である。Ｈ
Ａは、グルクロン酸がＮ−アセチルグルコサミンにβ−
１，３結合した二糖単位（GlcUAβ1-3GlcNAc：GlcUAは
グルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンを
それぞれ表す）のβ−１，４結合による繰り返しから構
成され、ヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」とも
いう）により生体内で合成される。

【０００３】ＨＡは、ＨＡ結合タンパク質とともに細胞
表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分
化等のような多くの細胞の挙動を調節している。さら
に、ＨＡは、形態形成、再生、創傷治癒、腫瘍浸潤、お
よびガン転移等の多くの現象に関与している。これらの
機能は、ＨＡの濃度や鎖長のような多くの要因に依存し
ている。例えば、高分子量のＨＡは高濃度で、内皮細胞
の成長を抑制する一方、低分子量のＨＡは細胞成長を刺
激し、血管形成を誘導することが示されている。同様
に、高分子量のＨＡは高濃度で、滑膜細胞及びある種の
線維芽細胞の成長を抑制するが、低分子量のＨＡは低濃
度でこれらの細胞の成長を刺激する。

【０００４】ＨＡの細胞制御機構を解明するのに有力な
手段は、ＨＡ合成機構を解明し、ＨＡの合成制御法を開
発することであると考えられる。

【０００５】ＨＡＳについては、ＨＡＳ１、２及び３が
同定され、これらは酵素活性や合成するヒアルロン酸の
分子サイズにおいて異なっていることが明らかとなって
いる（特開平９−２２４６７４号、WO97/38113号国際公
開パンフレット、Spicer, A.P., Augustine, M.L., and
Mcdonald, J.A. (1996)J. Biol. Chem. 271, 23400-23
406; Spicer, A.P., Olson, J.S. and Mcdonald, J.A.
(1997) J. Biol. Chem.272, 8957-8961; WO98/00551号
国際公開パンフレット）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＨＡ
ＳのうちのＨＡＳ１の活性を制御し、個体レベルでのヒ
アルロン酸の機能解析を可能にするための、ＨＡＳ１遺
伝子の遺伝子ターゲッティングに使用できるＤＮＡを提
供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、研究の結
果、ＨＡＳ１遺伝子の特定の位置に変異を導入できるよ
うに相同領域を設定したＤＮＡを用いる相同組換えによ
って、ＨＡＳ１の活性を効率よく制御できることを見い
出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、宿主細胞の染色体Ｄ
ＮＡに導入すべき導入ＤＮＡと、前記導入ＤＮＡの5'側
及び3'側にそれぞれ連結された第１相同領域ＤＮＡ及び
第２相同領域ＤＮＡと、第１相同領域ＤＮＡの5'側及び
第２相同領域ＤＮＡの3'側に連結された、宿主細胞内に
おいて発現可能な陰性マーカー遺伝子とを含むＤＮＡで
あって、前記導入ＤＮＡは、宿主細胞内において発現可
能な陽性マーカー遺伝子を含み、前記導入ＤＮＡ並びに
該導入ＤＮＡに連結された前記第１相同領域ＤＮＡ及び
前記第２相同領域ＤＮＡと、前記染色体ＤＮＡのヒアル
ロン酸合成酵素１の細胞内ループをコードする領域とが
相同組換えを起こすことができるように構築されている
ＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）を提供する。

【０００９】本発明ＤＮＡにおいては、ＨＡＳ１の細胞
内ループをコードする領域は、好ましくは、ＨＡＳ１遺
伝子のエキソン５の少なくとも一部である。

【００１０】宿主細胞は、好ましくは、マウス由来の細
胞である。宿主細胞がマウス由来の細胞である場合、第
１相同領域ＤＮＡは、好ましくは、ヒアルロン酸合成酵
素１遺伝子の染色体ＤＮＡから制限酵素ＢａｍＨＩ及び
ＨｉｎｄIIIでの消化により切り出すことができかつヒ
アルロン酸合成酵素１遺伝子のエキソン４の少なくとも
一部を含むＤＮＡであり、第２相同領域ＤＮＡは、好ま
しくは、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子の染色体ＤＮＡ
から制限酵素ＨｐａＩ及びＨｉｎｄIIIでの消化により
切り出すことができかつヒアルロン酸合成酵素遺伝子１
の終止コドンを含むＤＮＡである。

【００１１】導入ＤＮＡは、好ましくは、宿主細胞内に
おいて発現可能な陽性マーカー遺伝子である。陽性マー
カー遺伝子は、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子で
ある。陰性マーカー遺伝子は、好ましくは、ジフテリア
毒素Ａ遺伝子である。

【００１２】本発明は、また、本発明ＤＮＡを含むター
ゲッティングベクターを提供する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。本発明ＤＮＡは、ＨＡＳ１遺伝子の遺伝子ター
ゲッティングのためのターゲッティングベクターとして
使用できるものである。遺伝子ターゲッティングには、
遺伝子のノックアウト、コンディショナルジーンターゲ
ティング、点変異導入、ノックインなどが含まれる。

【００１４】本発明ＤＮＡは、宿主細胞の染色体ＤＮＡ
に導入すべき導入ＤＮＡを、染色体ＤＮＡのＨＡＳ１の
細胞内ループをコードする領域に相同組換えによって導
入できるように、相同組換えを起こすことのできる相同
領域ＤＮＡが導入ＤＮＡの５’側及び３’側に連結され
ていることを特徴とする。すなわち、導入ＤＮＡ並びに
該導入ＤＮＡの５’側及び３’側にそれぞれ連結された
第１相同領域ＤＮＡ及び第２相同領域ＤＮＡと、染色体
ＤＮＡのヒアルロン酸合成酵素１の細胞内ループをコー
ドする領域とが相同組換えを起こすことができるように
第１相同領域ＤＮＡ及び第２相同領域ＤＮＡが構築され
ていることを特徴とする。

【００１５】本明細書において、ＨＡＳ１とは、ＨＡＳ
のうち、ＨＡＳ１と特定されているもの（マウス：特開
平９−２２４６７４号、ヒト：WO97/38113号国際公開パ
ンフレット、その他の脊椎動物：Spicer, A.P. et al.
(1998), J. Biol. Chem., 273, 1923-1932）、及び、こ
れに対しアミノ酸配列において高い相同性（通常８５％
以上）を有するものを意味する。

【００１６】ＨＡＳ１の細胞内ループとは、細胞膜から
ＨＡＳ１が細胞内に突出した部分を意味する（図１参
照）。この部分は、厳密な境界を有するものではない
が、例えば、マウスＨＡＳ１では、配列番号２に示すア
ミノ酸配列において、Ｎ末端から２２７番目〜２２８番
目付近から、Ｎ末端から４０９番目〜４２０番目付近ま
での領域である。なお、マウスＨＡＳ１では、エキソン
５にコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に示すア
ミノ酸配列において、Ｎ末端から３６０〜５８３番目に
相当する。

【００１７】本明細書において「導入」とは、相同組換
えにより、染色体ＤＮＡの一部の置換、または、染色体
ＤＮＡへの挿入を生じさせることを意味する。

【００１８】ＨＡＳ１の活性部位は細胞内ループ上（特
にその特にＣ末端領域）にあるため、導入ＤＮＡを、染
色体ＤＮＡ中のＨＡＳ１の細胞内ループをコードする領
域に導入することにより、当該ループ部分をコードする
部分を改変することで、ＨＡＳ１の活性を効率的に制御
することが可能である。また、ＨＡＳ１の染色体遺伝子
のプロモーター領域での転写が通常通りに開始されるこ
とで他の発現系、特にＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現に対
する影響が少なくなると考えられるので、ＨＡＳ１の翻
訳領域の最終領域に当たる第５エキソン領域（エキソン
５）の少なくとも一部で細胞内ループを改変するように
導入ＤＮＡを導入することが好ましい。例えば、ノック
アウトの場合には、この部分を欠失させるように導入Ｄ
ＮＡを導入することができる。

【００１９】このような導入を可能にする相同領域ＤＮ
Ａの選択は、公知のＨＡＳ１の染色体ＤＮＡに関する情
報に基づいて行うことができる。すなわち、改変対象の
塩基配列の前後の塩基配列に相同な塩基配列を有するＤ
ＮＡを第１相同領域ＤＮＡ及び第２相同領域ＤＮＡとし
てそれぞれ選択すればよく、例えば、マウスＨＡＳ１の
場合には、第１相同領域ＤＮＡは、ヒアルロン酸合成酵
素１遺伝子の染色体ＤＮＡから制限酵素ＢａｍＨＩ及び
ＨｉｎｄIIIでの消化により切り出すことができかつヒ
アルロン酸合成酵素１遺伝子のエキソン４の少なくとも
一部をを含む約２．１ｋｂのＤＮＡとすることができ、
第２相同領域ＤＮＡは、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子
の染色体ＤＮＡから制限酵素ＨｐａＩ及びＨｉｎｄIII
での消化により切り出すことができかつヒアルロン酸合
成酵素遺伝子１の終止コドンを含む約４．２ｋｂのＤＮ
Ａとすることができる。ＨＡＳ１のアミノ酸配列には、
種間での相違があることや、同種内でも相違があること
（対応する遺伝子の存在）が予想されるが、このような
相違がある場合でも、上記相同領域ＤＮＡに相当するＤ
ＮＡを選択することは、当業者であれば容易である。

【００２０】上記相同領域ＤＮＡ以外の本発明ＤＮＡを
構成する要素は、従来のターゲッティングベクターのも
のと同様のものが使用できる（例えば、「ジーンターゲ
ティングファイル〜’９７」, 実験医学増刊, Vol. 14,
No. 20 (1996), 羊土社発行、「バイオマニュアルシリ
ーズジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マ
ウスの作製−」, 実験医学別冊, 相沢慎一著, 羊土社発
行(1995)、米国特許第５，４６４，７６４号明細書参
照）。

【００２１】導入ＤＮＡは、遺伝子ターゲッティングの
目的に合わせて適宜選択される。ノックアウトが目的の
場合には、陽性マーカー遺伝子のみから成っていてもよ
い。

【００２２】陽性マーカー遺伝子は、陽性選別を行うた
めのものであり、導入ＤＮＡ中に含まれる。陽性マーカ
ー遺伝子としては、宿主細胞内において発現可能な遺伝
子であって、陽性選別可能なものであれば限定されず、
例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシンＢ耐
性遺伝子、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子などが挙げられ
る。好ましくは、陽性マーカー遺伝子は、ネオマイシン
耐性遺伝子である。通常には適切なプロモーターと結合
させることにより宿主細胞内で発現可能にされる。この
ようなプロモーターとしては、宿主細胞内において強い
発現活性を有するものが好ましく、例えば宿主細胞とし
て哺乳類動物由来の細胞を用いる場合は、ホスホグリセ
レートキナーゼ１のプロモーターなどが挙げられる。

【００２３】陰性マーカー遺伝子は、陰性選別を行うた
めのものであり、目的の相同組換えが起こらなかった場
合に発現して選別を行うことができるものである。本発
明ＤＮＡにおいては、第１相同領域ＤＮＡの５’側及び
第２相同領域ＤＮＡの３’側に配置される。陰性マーカ
ー遺伝子としては、染色体ＤＮＡに導入されたときに宿
主細胞において発現するものであれば特に限定されず、
例えば、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺
伝子などが挙げられる。好ましくは、ジフテリア毒素Ａ
遺伝子である。陰性マーカー遺伝子は、適切なプロモー
ターと結合させることにより宿主細胞内で発現可能にさ
れる。このようなプロモーターとしては、適度な発現活
性を有するものが好ましく、宿主細胞として哺乳類動物
由来の細胞を用いる場合は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
プロモーターなどが挙げられる。

【００２４】また、上記陽性マーカー及び陰性マーカー
と組み合わせて、polyA選別に使用される要素を組み込
んで組換え体の選別に使用することもできる。

【００２５】宿主細胞は、従来の遺伝子ターゲッティン
グに使用されるものでよく、通常には、培養下で多数の
細胞として使うことができ、選び出した後で動物個体に
再生する能力のある細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細
胞）が使用される。この細胞は、通常には、哺乳類動物
由来、好ましくは、マウス由来である。

【００２６】宿主細胞へのＤＮＡの導入及び相同組換え
体の同定は、従来の方法と同様に行うことができ、例え
ば、宿主細胞へのＤＮＡの導入方法としては、エレクト
ロポレーションによる方法等が挙げられ、相同組換え体
の同定方法としては、ＰＣＲ又はサザンハイブリダイゼ
ーションによる方法等が挙げられる。

【００２７】本発明ＤＮＡを用いて得られる相同組換え
体からのノックアウト動物の作成も、従来の方法と同様
にして行うことができる。

【００２８】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術
的範囲が限定されるべきものではない。

【００２９】１．マウスＨＡＳ１の活性中心の特定 ＜１＞野生型マウスＨＡＳ１発現ベクターの構築 特開平９−２２４６７４号公報に記載の方法で取得さ
れ、配列番号１に示す塩基配列を有するマウスＨＡＳ１
ｃＤＮＡを用いた。

【００３０】マウスＨＡＳ１ｃＤＮＡを、常法に従って
制限酵素ＢｇｌIIアダプターを結合させてから、ｐＦＬ
ＡＧ−ＣＭＶ−２ベクター（イーストマン・コダック）
のＢｇｌII部位にサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡ
Ｓ１を構築した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターは、
ＣＭＶプロモーター及び８アミノ酸からなるＦＬＡＧペ
プチドをコードする配列を含んでおり、クローン化断片
がコードするペプチドは、ＦＬＡＧとの融合蛋白質とし
て該ベクターが導入された細胞内に産生される。

【００３１】＜２＞部位特異的変異ＨＡＳ発現ベクター
の構築 Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ^TM部位特異的変異キットを用
い、ＨＡＳ１に、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に
置換する変異（Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ）、３４４位のＡｓ
ｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ａｓｐ３４４Ｇｌ
ｕ）、３８０位のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基に置換する変
異（Ｇｌｎ３８０Ａｓｎ）、３８３位のＡｒｇ残基をＬ
ｙｓ残基に置換する変異（Ａｒｇ３８３Ｌｙｓ）、３８
４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基に置換する変異（Ｔｒｐ
３８４Ｔｙｒ）、または３１２位にＧｌｙ残基をＰｒｏ
残基に置換する変異（Ｇｌｙ３１２Ｐｒｏ）が導入され
るような変異をｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１に導入した。

【００３２】ＨＡＳタンパク質中における、２４２位の
Ａｓｐ残基、３４４位のＡｓｐ残基、３８０位のＧｌｎ
残基、３８３位のＡｒｇ残基及び３８４位のＴｒｐ残基
の位置を図１に示す。

【００３３】さらに、ＨＡＳ１に、３３７位のＴｈｒ残
基をＳｅｒ残基に置換する変異（Ｔｈｒ３３７Ｓｅ
ｒ）、及び同変異に加えて３３８位のＨｉｓ残基をＬｙ
ｓ残基に置換する変異（Ｔｈｒ３３７Ｓｅｒ，Ｈｉｓ３
３８Ｌｙｓ(=T337S,H338K)）が導入されるような変異を
ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１に導入した。

【００３４】目的どおりの変異が導入されたことは、塩
基配列決定により確認した。

【００３５】＜３＞ＨＡ合成アッセイ （１）ＦＬＡＧ−タグ標識ＨＡＳ発現ベクターのＣＯＳ
−１細胞への導入 上記のようにして構築された、野生型ＨＡＳ１及び変異
型ＨＡＳ１を発現するＦＬＡＧ−タグ標識ベクターを、
ＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーションによりトラン
スフェクトした。コントロールとして、ｐＦＬＡＧ−Ｃ
ＭＶ−２ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクト
した。エレクトロポレーションは、市販の装置（Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒ、バイオラッド社）を用い、装置のマ
ニュアルに従って行った。トランスフェクトされた細胞
は、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭＬ−グルタミンを
含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃で３日間培養
した。

【００３６】（２）ＨＡ合成量の測定 培養した細胞から粗膜画分を調製し、０．２ｍｌの２５
ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、５ｍＭジチ
オスレイトール、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社）、０．１ｍＭＵＤＰ−Ｇｌｃ
Ａ（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、および２．５μ
ＣｉＵＤＰ−［¹⁴Ｃ］ＧｌｃＡ（２８．５ｍＣｉ／ｍｍ
ｏｌ、デュポンＮＥＮ社）に懸濁させた。タンパク質量
は、ＢＩＯ−ＲＡＤプロテインアッセイキット（バイオ
ラッド社）を用いて定量した。ＨＡＳ活性は、Ng, K.F.
and Schwartzm, N.B. (1989) J. Biol. Chem., 264, 1
1776-11783に記載の方法を改変して測定した。すなわ
ち、上記懸濁液を３７℃で１時間保温後、１ＴＲＵのス
トレプトマイセスヒアルロニダーゼ（生化学工業
（株））を添加し、あるいは添加しないで、３７℃で１
時間さらにインキュベートした。その後、１％（Ｗ／
Ｖ）ＳＤＳを添加して煮沸した。

【００３７】放射活性を有するＨＡを、ＨｉＬｏａｄ１
６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇ（ファルマシアバイ
オテック社）を用いたクロマトグラフィーにより分離し
た。溶出は、０．２Ｍ酢酸アンモニウムを用いて行い、
１ｍｌずつ分画し、放射活性を測定した。ＨＡに取り込
まれた放射活性を、ストレプトマイセスヒアルロニダー
ゼ感受性のカウントを計算することにより測定した。こ
のＨＡに取り込まれた放射活性から、ＨＡＳ活性（ピコ
モル／分／μｇタンパク質）を算出した（表１）。

【００３８】

【表１】表１ ─────────────────── 変異体 相対活性（％） ─────────────────── 野生型ＨＡＳ１ １００ Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ ＜１ Ｇｌｙ３１２Ｐｒｏ １００〜１１０ Ｔｈｒ３３７Ｓｅｒ １５０ T337S,H338K ５８０ Ａｓｐ３４４Ｇｌｕ ＜１ Ｇｌｎ３８０Ａｓｎ １０〜２０ Ａｒｇ３８３Ｌｙｓ １０〜２０ Ｔｒｐ３８４Ｔｙｒ ＜１ ───────────────────

【００３９】細胞内ループ上にある特定のアミノ酸を別
のアミノ酸に置換した変異型ＨＡＳタンパク質を用いた
結果、変異型ＨＡＳタンパク質の野生型ＨＡＳタンパク
質に対する相対活性が極端に変化することから、ＨＡＳ
１の活性部位は細胞内ループ上（特にその特にＣ末端領
域）にあることが示され、当該ループ部分をコードす
る、染色体上の遺伝子の部分を変異させることで、ＨＡ
Ｓ１の活性を制御することが可能であることが示唆され
た。

【００４０】２．マウスＨＡＳ１染色体遺伝子の単離及
び同定 マウスＨＡＳ１染色体遺伝子はマウスＨＡＳ１ｃＤＮＡ
をプローブに用いたハイブリダイゼーションにより、マ
ウスゲノムDNAライブラリーからYamadaらの方法（Yamad
a, Y., Itano, N., Zako, M., Yoshida, M., Lenas,
P., Niimi, A.,Ueda, M., and Kimata, K., Biochem.
J.,(1998) 330, pp1223-1227）に従って単離し、その構
造解析を制限酵素を用いて行った。構造解析の結果は、
同文献に記載されている染色体ＤＮＡの構造に合致する
ものであった（図１）。

【００４１】３．ノックアウト用ターゲッティングベク
ターの設計 ＜１＞ターゲッティングベクターの構築 ＨＡＳ１の活性部位が細胞内ループ（染色体ＤＮＡの第
２エクソンの５’側末端近辺から第５エクソンの５’側
近辺に当たる領域）上の特にＣ末端領域（第５エクソン
の５’領域）に存在していると考えられたこと、及びＨ
ＡＳ１の染色体遺伝子のプロモーター領域での転写が通
常通りに開始されることで他の発現系、特にＨＡＳ２及
びＨＡＳ３の発現に対する影響が少なくなると考え、Ｈ
ＡＳ１の翻訳領域の最終領域に当たる第５エクソン領域
とその上流の第４イントロン領域の部分を陽性マーカー
遺伝子で置換したターゲッティングベクターを設計した
（図２）。

【００４２】その陽性マーカーには、抗生物質耐性能を
採用し、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ−１）
のプロモーターとその下流にネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）を含んだＤＮＡカセット（ＰＧＫｎｅｏ）を
用いた(Gene(Amst), (1987) 60, 65-74及びNucleic Aci
ds Res., (1991) 19, 5755-5761)。この陽性マーカー遺
伝子中には制限酵素ＢａｍＨ１切断部位が含まれている
ため、後述するように相同組み換えにより染色体のＨＡ
Ｓ１遺伝子にターゲッティングベクターが置換されたこ
とを再確認するために有利である。

【００４３】さらに陰性マーカーとして、毒素産生能を
採用し、ＴＫプロモーターとその下流にジフテリア毒素
Ａ遺伝子（ＤＴＡ）を含んだＤＮＡカセットを用いて、
陽性マーカー遺伝子に対して、相同組み換え領域を挟ん
だ上流及び下流の２カ所に設定した。

【００４４】また、構築のための基本ベクターにはブル
ースクリプトII ＳＫ＋プラスミドベクター（pBluescr
ipt II SK+：ストラタジーン社製）を用いた。

【００４５】上記ブルースクリプトII ＳＫ＋プラスミ
ドベクターのＥｃｏＲIサイト及びＨｉｎｄIIIサイトに
ＰＧＫｎｅｏｐＵＣプラスミド（ｐＫＪ−１：Dr. Mike
McBurney（オタワ大学）より恵与）からクローニング
したＰＧＫｎｅｏｐＡカセットをサブクローニングし
て、陽性マーカー遺伝子を挿入したブルースクリプトII
ＳＫ＋プラスミドベクターを得た。当該ベクターのＥｃ
ｏＲIサイトに染色体ＨＡＳ１遺伝子のＢａｍＨ１−Ｈ
ｉｎｄIII断片（第３エキソンの一部から第４イントロ
ンの一部までを含む；領域III）を平滑化して挿入し、
次いで前記ベクター中のＨｉｎｄIIIサイトに染色体Ｈ
ＡＳ１遺伝子のＨｐａI−ＨｉｎｄIII断片（第５エキソ
ンの一部とそれ以降の部分を含む；領域V）を平滑化し
て挿入した。さらに、ＴＫプロモーターとその下流にジ
フテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴＡ）を有するカセット（M
r. Piccotto（パスツール研究所）より恵与, Nature, 1
995,374, 65-67）を制限酵素ＮｏｔIで切り出して陰性
マーカー遺伝子断片とし、前記陰性マーカー遺伝子断片
を上記ベクターのＮｏｔIサイトに挿入し、また、平滑
化して上記ベクターの平滑化したＸｈｏIサイトに挿入
した。構築の概要を図３に示す。

【００４６】＜２＞エレクトロポレーション 上記のコンストラクトを、Andrewらの方法（Andrew P.
Spicer, Gerald J. Rowse, Thomas K. Lindner, and Sa
ndra J. Gendler, J. Biol. Chem., (1995) 270, 50, 3
0093-30101）に従って、ＥＳ細胞（GK129）にBTXエレク
トロポレーターを用いてエレクトロポレーションした。
すなわち、上記の＜１＞のターゲッティングベクターを
ＳａｃIIで切断して線状化したDNA（25mg）をフェノー
ル／クロロホルム処理後、エタノール沈殿し、遠心後、
沈殿を70%エタノールで洗浄し、乾燥させた。その乾燥
物をＴＥ緩衝液（10 mM Tris-HCl(pH8.0)/1 mM EDTA）3
00μlに溶解した。前日に培養液を交換しておいたＥＳ
細胞をトリプシン処理によって培養皿から剥離して、ト
リプシン処理とピペッティングにより細胞を単細胞とし
て遊離させて細胞数をカウント後、ＥＳ細胞をリン酸緩
衝生理的食塩水（PBS）で洗浄して、４×１０⁷／ｍｌと
なるようにPBSに浮遊させた。細胞浮遊液５００μｌを
プラスミド溶液と混合した後、エレクトロポレーション
用ディスポーザブルキュベット内に移し、室温で５分間
放置した。その後、細胞にパルス（４００Ｖ、２５ｍ
Ｆ）を加えた。室温に５分間放置後、１２．５ｍｌのＥ
Ｓ培地を添加し（１．５×１０⁵／ｍｌ）、予めフィー
ダー細胞をまいてある１００mm培養皿に２ｍｌ（３×１
０⁶）の細胞をまいた。その後、３６時間後からＧ４１
８（１５０ｍｇ／ｍｌ）を含む培地を用いて陽性選択を
開始した。

【００４７】＜３＞相同組み換え体の同定 顕微鏡下で培養中のＥＳ細胞を観察して、４３２個のコ
ロニーを採取した。それらのコロニーから、ＰＣＲ法及
びサザンハイブリダイゼーション法により２個のクロー
ン（#166及び#185）を相同組み換え体として選択した。

【００４８】（１）ＰＣＲ法による同定 それぞれのコロニーを形成するＥＳ細胞から常法に従っ
て、DNAを抽出した。第３エキソンに含まれる配列と陽
性マーカーＰＧＫｎｅｏ領域に含まれる配列に基づいて
それぞれ２０乃至４０merのオリゴヌクレオチド（図２
中、プライマー＃１及び＃２）を合成し、それらをプラ
イマーとしてＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６０
０（パーキンエルマー社製）を用いて、以下の条件でＰ
ＣＲ反応を行った。すなわち、８０℃で２分間保持した
後、続いて９４℃の変性１０秒、６５℃のアニーリング
３０秒及び６８℃の伸長反応５分間からなるサイクルを
１０回繰り返し、更に同サイクルを伸長反応を５分間か
ら１サイクル毎に１５秒ずつ延長して２５回繰り返し、
最後に７２℃で１０分間伸長反応を行った。それぞれの
コロニー由来のＥＳ細胞からＰＣＲによって増幅したDN
A断片のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブ
ロマイドで染色して紫外線によりバンドを検出した。増
幅によって生じた約２．１ｋｂのDNA断片を切り出し
て、塩基配列を解析したところ、２個のＥＳ細胞のコロ
ニー由来のDNA断片にＨＡＳ１の第３イントロン、第４
エクソン、及び陽性マーカに隣接して挿入した第４イン
トロンの一部の配列が含まれていることが明かとなり、
これらの２個のコロニーを形成するＥＳ細胞（#166及び
#185）は目的の相同組み換え体であることが明かとなっ
た。

【００４９】（２）サザンハイブリダイゼーション法に
よる同定 選択したコロニー（#166及び#185）からトータルDNAを
調製し、該DNAを制限酵素ＨｉｎｄIII（3 U/mg）又はＢ
ａｍＨＩ（3 U/mg）で３７℃１８時間消化した後、該DN
A消化物の１％アガロースゲル電気泳動を常法に従って
行った。そしてアガロースゲル電気泳動で分離したDNA
断片をニトロセルロース膜に転写した。

【００５０】また、ＨＡＳ１染色体遺伝子中の第２イン
トロン（第２エキソンと第３エキソンに挟まれた領域）
に含まれ、ＥｃｏＲIで切り出した約１ｋｂのＤＮＡ断
片を「プローブ３」（図２中、「３」）とし、ターゲッ
ティングベクターの第４エキソンと陽性マーカーＰＧＫ
ｎｅｏ領域にまたがり、ＰｓｔI及びＢａｍＨIで切り出
した約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を「内部プローブ」（図
２中、「ｉｎｔ」）とした。それぞれのプローブを常法
に従って³²Pで放射能ラベルし、ＤＮＡ断片を転写した
上記ニトロセルロース膜にハイブリダイズさせた。当該
ニトロセルロース膜を充分に洗浄後、オートラジオグラ
フィーによって生じたバンドを検出した。

【００５１】その結果、ＨｉｎｄIII消化断片では、プ
ローブ３でハイブリダイズしても内部プローブでハイブ
リダイズしても、正常細胞（ワイルドタイプ）では約
３．５ｋｂのバンドのみが観察されたのに対し、組み換
え体細胞では２個のコロニー（#166及び#185）ともに約
９ｋｂのバンドが新たに観察された。また、ＢａｍＨI
消化断片では内部プローブとハイブリダイズすることに
より、正常細胞では約１４ｋｂのバンドのみが観察され
るのに対し、組み換え体細胞では２個のコロニー共に約
２．５ｋｂのバンドが観察された。

【００５２】これらの結果から、２個の組み換え体は、
ターゲッティングベクターによりＨＡＳ１染色体遺伝子
の位置に目的通りの相同組み換えが起こったものである
ことが裏付けられた。

【００５３】この相同組換えにより、発現するＨＡＳ１
の活性部位が欠失し、従って、ＨＡＳ１遺伝子がノック
アウトされると考えられる。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、ＨＡＳ１の活性を制御
し、個体レベルでのヒアルロン酸の機能解析を可能にす
るための、ＨＡＳ１遺伝子の遺伝子ターゲッティングに
使用できるＤＮＡが提供される。

【００５５】

【配列表】 <110> 生化学工業株式会社 <120> ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の遺伝子ターゲッティング用ＤＮＡ <130> P-6032 <160> 2 <210> 1 <211> 2102 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> 49..1800 <400> 1 CTAAAGAGAA CAAGACGGAG AAGAGAGAAT CCAGGAGGAC CCACAGCC ATG AGA CAG 57 Met Arg Gln 1 GAC ATG CCA AAG CCC TCA GAG GCA GCG CGT TGC TGC TCT GGC CTG GCC 105 Asp Met Pro Lys Pro Ser Glu Ala Ala Arg Cys Cys Ser Gly Leu Ala 5 10 15 AGG CGA GCA CTC ACG ATC ATC TTT GCC CTG CTC ATC CTG GGC CTC ATG 153 Arg Arg Ala Leu Thr Ile Ile Phe Ala Leu Leu Ile Leu Gly Leu Met 20 25 30 35 ACC TGG GCC TAC GCC GCA GGC GTT CCT CTG GCT TCA GAT CGC TAT GGA 201 Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser Asp Arg Tyr Gly 40 45 50 CTC CTG GCC TTT GGC CTC TAT GGG GCA TTC CTC AGC GCA CAC CTA GTG 249 Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser Ala His Leu Val 55 60 65 GCA CAG AGC CTC TTC GCT TAC CTG GAG CAC CGA AGG GTG GCA GCG GCT 297 Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg Val Ala Ala Ala 70 75 80 GCG CGG CGC TCC TTG GCG AAG GGG CCC CTG GAT GCG GCC ACT GCA CGC 345 Ala Arg Arg Ser Leu Ala Lys Gly Pro Leu Asp Ala Ala Thr Ala Arg 85 90 95 AGC GTG GCA CTC ACC ATC TCA GCC TAC CAA GAG GAT CCC GCT TAC CTG 393 Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 115 CGC CAG TGC TTG ACC TCC GCG CGC GCC TTG CTG TAC CCG CAC ACG AGG 441 Arg Gln Cys Leu Thr Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro His Thr Arg 120 125 130 TTA CGC GTG CTC ATG GTG GTG GAC GGC AAC CGC GCT GAG GAT CTG TAC 489 Leu Arg Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu Asp Leu Tyr 135 140 145 ATG GTG GAC ATG TTC CGA GAA GTC TTC GCC GAT GAG GAC CCC GCC ACT 537 Met Val Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp Pro Ala Thr 150 155 160 TAT GTG TGG GAT GGC AAC TAC CAT CAG CCC TGG GAA CCA GCG GAG GCT 585 Tyr Val Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro Ala Glu Ala 165 170 175 ACG GGC GCT GTC GGT GAA GGT GCC TAC CGG GAG GTG GAG GCG GAG GAC 633 Thr Gly Ala Val Gly Glu Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu Ala Glu Asp 180 185 190 195 CCC GGG CGG TTG GCG GTG GAG GCG CTG GTG AGA ACA CGC AGG TGC GTG 681 Pro Gly Arg Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg Arg Cys Val 200 205 210 TGC GTG GCT CAG CGT TGG GGC GGC AAA CGT GAG GTC ATG TAC ACA GCT 729 Cys Val Ala Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala 215 220 225 TTC AAG GCA CTG GGC GAC TCC GTG GAC TAC GTG CAG GTC TGT GAC TCA 777 Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val Cys Asp Ser 230 235 240 GAC ACA AGA CTA GAC CCC ATG GCA CTG CTG GAG CTT GTG CGA GTG TTG 825 Asp Thr Arg Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val Arg Val Leu 245 250 255 GAT GAA GAC CCC CGG GTA GGG GCT GTT GGA GGG GAT GTG AGG ATC CTT 873 Asp Glu Asp Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val Arg Ile Leu 260 265 270 275 AAC CCT CTG GAC TCC TGG GTC AGC TTC TTG AGC AGT CTT CGA TAC TGG 921 Asn Pro Leu Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu Arg Tyr Trp 280 285 290 GTA GCC TTC AAT GTG GAA CGA GCT TGT CAG AGC TAC TTC CAC TGT GTG 969 Val Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe His Cys Val 295 300 305 TCC TGC ATC AGT GGT CCT CTG GGT CTA TAC AGA AAC AAT CTC CTG CAG 1017 Ser Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn Leu Leu Gln 310 315 320 CAG TTC TTG GAG GCC TGG TAC AAC CAA AAG TTC CTG GGC ACC CAC TGC 1065 Gln Phe Leu Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly Thr His Cys 325 330 335 ACA TTT GGG GAT GAC AGG CAC CTC ACC AAC CGA ATG CTT AGC ATG GGC 1113 Thr Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu Ser Met Gly 340 345 350 355 TAT GCT ACC AAG TAT ACC TCG CGC TCC AGA TGC TAC TCG GAG ACG CCC 1161 Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser Glu Thr Pro 360 365 370 TCC TCC TTC CTT CGT TGG TTG AGC CAA CAG ACC CGC TGG TCC AAA TCT 1209 Ser Ser Phe Leu Arg Trp Leu Ser Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser 375 380 385 TAC TTC CGA GAG TGG CTA TAC AAT GCT CTG TGG TGG CAT CGC CAC CAC 1257 Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Leu Trp Trp His Arg His His 390 395 400 GCA TGG ATG ACC TAT GAA GCG GTG GTC TCG GGC CTC TTC CCT TTC TTC 1305 Ala Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Leu Phe Pro Phe Phe 405 410 415 GTG GCT GCC ACG GTG TTG AGG CTC TTC TAT GCA GGG CGC CCG TGG GCT 1353 Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Leu Phe Tyr Ala Gly Arg Pro Trp Ala 420 425 430 435 CTG CTC TGG GTG CTG CTC TGT GTG CAG GGC GTA GCA CTG GCA AAG GCA 1401 Leu Leu Trp Val Leu Leu Cys Val Gln Gly Val Ala Leu Ala Lys Ala 440 445 450 GCC TTT GCA GCC TGG CTG CGT GGC TGC GTG CGC ATG GTG CTG CTG TCA 1449 Ala Phe Ala Ala Trp Leu Arg Gly Cys Val Arg Met Val Leu Leu Ser 455 460 465 CTC TAT GCA CCA CTC TAC ATG TGC GGC CTC CTG CCT GCC AAA TTC CTA 1497 Leu Tyr Ala Pro Leu Tyr Met Cys Gly Leu Leu Pro Ala Lys Phe Leu 470 475 480 GCG TTG GTT ACC ATG AAT CAA AGT GGT TGG GGT ACC TCG GGC CGG AAG 1545 Ala Leu Val Thr Met Asn Gln Ser Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys 485 490 495 AAA CTG GCT GCT AAC TAT GTC CCC GTG TTG CCC CTG GCA CTC TGG GCT 1593 Lys Leu Ala Ala Asn Tyr Val Pro Val Leu Pro Leu Ala Leu Trp Ala 500 505 510 515 CTA CTG CTG CTT GGA GGC CTG GCC CGC AGT GTG GCC CAG GAG GCC AGA 1641 Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Ala Arg Ser Val Ala Gln Glu Ala Arg 520 525 530 GCT GAC TGG AGT GGC CCA TCC CGA GCA GCT GAA GCC TAC CAC CTT GCT 1689 Ala Asp Trp Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala Glu Ala Tyr His Leu Ala 535 540 545 GCT GGG GCT GGT GCC TAT GTG GCC TAC TGG GTG GTA ATG TTA ACT ATC 1737 Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ala Tyr Trp Val Val Met Leu Thr Ile 550 555 560 TAC TGG GTA GGT GTG AGG AGG CTG TGC AGA CGT CGG AGC GGT GGT TAC 1785 Tyr Trp Val Gly Val Arg Arg Leu Cys Arg Arg Arg Ser Gly Gly Tyr 565 570 575 CGT GTC CAA GTA TGAGTCCGGG CATGAAGATG CAGCTGAGGG CTCTTAAAGG 1837 Arg Val Gln Val 580 AGGAGTCCTT GTGAGGCACC CCCTGGAGTC ATGGCTTTCT GGGGACTCAG TTTACCTTCT 1897 CTTTGAAATG AGGGAGTTAT TTAAGATTCT TCAATATGGA CTGTATTGGA ACTCAGATCT 1957 AGGTCTCTGG GGAGGGGTAA TTTATTGATC AGGGAGTGGG ATTGTAGGAC CAGGGCCAGA 2017 ACGTCTCCAT TTTCTCCCTG TTGCTATTTA ATGTTTGTAC TGTAAGATTA TATAATAAAT 2077 TTTTTATTTA TTTTCTTCTT TAGAG 2102 <210> 2 <211> 583 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Arg Gln Asp Met Pro Lys Pro Ser Glu Ala Ala Arg Cys Cys Ser 1 5 10 15 Gly Leu Ala Arg Arg Ala Leu Thr Ile Ile Phe Ala Leu Leu Ile Leu 20 25 30 Gly Leu Met Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser Asp 35 40 45 Arg Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser Ala 50 55 60 His Leu Val Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg Val 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ser Leu Ala Lys Gly Pro Leu Asp Ala Ala 85 90 95 Thr Ala Arg Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro 100 105 110 Ala Tyr Leu Arg Gln Cys Leu Thr Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro 115 120 125 His Thr Arg Leu Arg Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu 130 135 140 Asp Leu Tyr Met Val Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp 145 150 155 160 Pro Ala Thr Tyr Val Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro 165 170 175 Ala Glu Ala Thr Gly Ala Val Gly Glu Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu 180 185 190 Ala Glu Asp Pro Gly Arg Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg 195 200 205 Arg Cys Val Cys Val Ala Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met 210 215 220 Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val 225 230 235 240 Cys Asp Ser Asp Thr Arg Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val 245 250 255 Arg Val Leu Asp Glu Asp Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val 260 265 270 Arg Ile Leu Asn Pro Leu Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu 275 280 285 Arg Tyr Trp Val Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe 290 295 300 His Cys Val Ser Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn 305 310 315 320 Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly 325 330 335 Thr His Cys Thr Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu 340 345 350 Ser Met Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser 355 360 365 Glu Thr Pro Ser Ser Phe Leu Arg Trp Leu Ser Gln Gln Thr Arg Trp 370 375 380 Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Leu Trp Trp His 385 390 395 400 Arg His His Ala Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Leu Phe 405 410 415 Pro Phe Phe Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Leu Phe Tyr Ala Gly Arg 420 425 430 Pro Trp Ala Leu Leu Trp Val Leu Leu Cys Val Gln Gly Val Ala Leu 435 440 445 Ala Lys Ala Ala Phe Ala Ala Trp Leu Arg Gly Cys Val Arg Met Val 450 455 460 Leu Leu Ser Leu Tyr Ala Pro Leu Tyr Met Cys Gly Leu Leu Pro Ala 465 470 475 480 Lys Phe Leu Ala Leu Val Thr Met Asn Gln Ser Gly Trp Gly Thr Ser 485 490 495 Gly Arg Lys Lys Leu Ala Ala Asn Tyr Val Pro Val Leu Pro Leu Ala 500 505 510 Leu Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Ala Arg Ser Val Ala Gln 515 520 525 Glu Ala Arg Ala Asp Trp Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala Glu Ala Tyr 530 535 540 His Leu Ala Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ala Tyr Trp Val Val Met 545 550 555 560 Leu Thr Ile Tyr Trp Val Gly Val Arg Arg Leu Cys Arg Arg Arg Ser 565 570 575 Gly Gly Tyr Arg Val Gln Val 580

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＨＡＳ１遺伝子の構造（上）、及び、マ
ウスＨＡＳ１の、細胞膜における構造（下）を示す模式
図である。遺伝子の構造において、Ｅ１〜Ｅ５はエキソ
ンを示し、上のラインは制限酵素切断部位を示す。ま
た、ＨＡＳ１の構造において、下側が細胞内である。

【図２】マウスＨＡＳ１遺伝子の染色体ＤＮＡ、ターゲ
ッティングベクター、及び、変異型遺伝子の染色体ＤＮ
Ａの構造を示す模式図である。

【図３】ターゲッティングベクターの構築の説明図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA35 CB01 DA13 DA20 FB01 FB02 FB07 4B024 BA07 BA10 CA01 CA03 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 FA02 FA10 GA14 GA18 GA25 HA13 HA14 4B050 CC04 CC05 DD11 LL01 LL03 LL10 4B063 QQ08 QQ42 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX01 QX07

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入すべき導
   入ＤＮＡと、前記導入ＤＮＡの5'側及び3'側にそれぞれ
   連結された第１相同領域ＤＮＡ及び第２相同領域ＤＮＡ
   と、第１相同領域ＤＮＡの5'側及び第２相同領域ＤＮＡ
   の3'側に連結された、宿主細胞内において発現可能な陰
   性マーカー遺伝子とを含むＤＮＡであって、前記導入Ｄ
   ＮＡは、宿主細胞内において発現可能な陽性マーカー遺
   伝子を含み、前記導入ＤＮＡ並びに該導入ＤＮＡに連結
   された前記第１相同領域ＤＮＡ及び前記第２相同領域Ｄ
   ＮＡと、前記染色体ＤＮＡのヒアルロン酸合成酵素１の
   細胞内ループをコードする領域とが相同組換えを起こす
   ことができるように構築されているＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸合成酵素１の細胞内ループ
   をコードする領域が、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子の
   エキソン５の少なくとも一部であることを特徴とする請
   求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 宿主細胞がマウス由来の細胞である請求
   項１または２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 前記第１相同領域ＤＮＡが、ヒアルロン
   酸合成酵素１遺伝子の染色体ＤＮＡから制限酵素Ｂａｍ
   ＨＩ及びＨｉｎｄIIIでの消化により切り出すことがで
   きかつヒアルロン酸合成酵素１遺伝子のエキソン４の少
   なくとも一部を含むＤＮＡであり、前記第２相同領域Ｄ
   ＮＡが、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子の染色体ＤＮＡ
   から制限酵素ＨｐａＩ及びＨｉｎｄIIIでの消化により
   切り出すことができかつヒアルロン酸合成酵素遺伝子１
   の終止コドンを含むＤＮＡである請求項３記載のＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 前記導入ＤＮＡが、宿主細胞内において
   発現可能な陽性マーカー遺伝子からなる請求項１〜４の
   いずれか一項に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 前記陽性マーカー遺伝子が、ネオマイシ
   ン耐性遺伝子である請求項１〜５のいずれか一項に記載
   のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 前記陰性マーカー遺伝子がジフテリア毒
   素Ａ遺伝子である請求項１〜６のいずれか一項に記載の
   ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡを含むターゲッティングベクター。