WO2014059797A1

WO2014059797A1 - 伊维菌素及其衍生物的用途

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Publication number: WO2014059797A1
Application number: PCT/CN2013/077796
Authority: WO
Inventors: 李勇; 金利华; 冯需辉
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2014-04-24
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: US10052340B2; MX2015004884A; CN105473148A; KR20150081433A; CA2889047A1; CN103356687A; US20150306123A1; CN102872066A; CN102872066B; CN103356687B; EP2918274A1; RU2015118579A; JP2015534954A; BR112015008908A2; AU2013330877A1

Abstract

本发明涉及伊维菌素（ivermectin）、阿维菌素（abamectin/avermectin）和多拉克汀（doramectin）等抗寄生虫药物的新用途，以及用于该新用途的衍生物的设计方法。所述化合物在制备用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体（Famesoid X receptor, FXR）介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的药物中的应用。所述化合物涉及大环内酯阿维菌素、伊维菌素和多拉克汀，以及它们的衍生物。

Description

说明书

发明名称：伊维菌素及其衍生物的用途

技术领域

[ 1] 本发明涉及一种法尼醇受体 (Famesoid X receptor, FXR)的新的有效的配体伊维菌素 (ivermectin) 、多拉克汀 (doramectin)和阿维菌素 (abamectin/avermectin)及其衍生物区别于抗寄生虫药物的新用途，以及用于新用途的衍生物的设计和优化方法。

背景技术

[2] 核受体是一种配体激活的转录因子。 FXR是人体 48种核受体中非常重要的一员，在代谢、炎症、肿瘤等重大疾病及相关生理功能中起着重要的调控作用。 FXR的配体介导的药理作用原理是配体通过与 FXR的配体结合域（LBD ) 结合，招募各类辅激活因子（或辅抑制因子）来调节下游靶基因。在体内，胆汁酸是 FXR的内源性配体， FXR的激活能够维持胆汁酸在肝脏和小肠中的正常循环和稳态，同时能够调节糖类、脂类和胆固醇的水平。 FXR牵涉到许多代谢相关的信号通路，成为治疗代谢疾病如高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症、胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等出色的药物靶分子。最近， FXR被发现能够调节肝脏的再生，小鼠 FXR基因敲除会导致肝癌的形成。鹅去氧胆酸（英文名 chenodeoxycholic acid, 缩写 CDC A) 是一种能结合并激活 FXR 的胆酸，用于治疗胆结石。 CDCA是能结合 FXR的配体中唯一用于临床的药物。但是 CDCA 对 FXR的亲和性远远低于人工合成的 FXR的配体 GW4064, 而且 CDCA还能结合胆酸结合蛋白（I-BABP ) 和胆酸转运蛋白（Bile Acid Transporter) 等其它蛋白，因此， CDCA也不是特异性以 FXR为靶标的药物。现有药物中约 13%都是以核受体为靶标的，基于 FXR参与调控的重要生理作用，筛选以 FXR为靶标的新配体药物以及对配体药物进行优化、设计和开发具有重要的应用价值。

[3] 伊维菌素 (ivermectin)和多拉克汀（Doramectin) 是链霉菌产生的大环内酯阿维菌素 (abamectin/avermectin)的衍生物，具有高效广谱的抗寄生虫作用，伊维菌素、多拉克汀和阿维菌素主要应用于家畜寄生虫控制和人虫感染的治疗。已有报道表明伊维菌素在无脊椎动物中的靶标是 Y -氨基丁酸（GABA) 的受体（英文名 gamma-aminobutyric acid receptor)和谷氨酸介导的氯离子通道受体（GluClR) 等受体。迄今为止尚未报道在哺乳动物中存在阿维菌素及其衍生物的高亲和力和特异性的靶标。

发明内容

[4] 本发明的目的在于提供伊维菌素（ ivermectin)、阿维菌素（abamectin/avermectin) 禾口多拉克汀（doramectin) , 及其衍生物的用途。

[5] 所述伊维菌素（记为结构式 I ) 是链霉菌产生的大环内酯阿维菌素的一种衍生物，具有高效广谱的抗寄生虫作用，主要应用于家畜寄生虫控制和人丝虫感染的治疗。

结构式 I

[6] 所述伊维菌素具有完全不同于抗寄生虫作用的新功能。该功能的特征在于，首次提出法尼醇受体是伊维菌素在哺乳动物体内特异性结合的靶标蛋白。伊维菌素通过高亲和力并特异性结合法尼醇受体 (FXR)，调节哺乳动物血清中糖、脂和胆固醇的代谢，有效降低糖尿病动物模型血清中糖、脂和胆固醇的水平，改善相应的症状。伊维菌素还能通过法尼醇受体介导抑制炎症反应。因此，伊维菌素及其衍生物在制备用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的药物中具有很好的应用前景。

[7] 所述伊维菌素的衍生物或类似物，例如阿维菌素（结构式 11)、多拉克汀（结构式 III) 等，有伊维菌素相似的特性及用途。

结构式 Π

结构式 III

[8] 阿维菌素是在伊维菌素结构式中 C22-C23位为双键。我们发现阿维菌素能高亲和力特异性结合 FXR，也是 FXR的配体，能有效降低高脂词料喂养的小鼠血清中糖、脂和胆固醇的水平以及附睾脂肪垫的重量。因此，阿维菌素具有用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。

[9] 多拉克汀（Doramectin)，是在伊维菌素结构式中 C22-C23位为双键， C25位是苯环侧链取代。我们发现多拉克汀能高亲和力特异性结合 FXR，也是 FXR的配体，能有效降低高脂词料喂养的小鼠血清中糖、脂和胆固醇的水平以及附睾脂肪垫的重量。因此，多拉克汀具有用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。

[10] 根据以上阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀的结构与功能，我们推测阿维菌素和伊维菌素的其他能与 FXR结合的结构类似物或衍生物可能也具有类似的功能及用途。

[11] 阿维菌素、伊维菌素及其衍生物二十多年来一直主要用于家畜寄生虫控制和人丝虫感染的治疗，其作用机制是选择性的与无脊椎动物神经和肌肉细胞中谷氨酸介导的氯离子通道受体结合，中断神经冲动向肌细胞的传递，导致寄生虫麻痹致死或被排除体外。伊维菌素及其衍生物还能与 Y -氨基丁酸的受体结合，发挥同样作用。但是哺乳动物中尚未报道存在谷氨酸介导的氯离子通道受体，哺乳动物中 Y -氨基丁酸受体仅位于中枢神经系统，而哺乳动物有血脑屏障，能有效阻止阿维菌素、伊维菌素及其衍生物进入中枢神经系统，因此，正常情况下阿维菌素、伊维菌素及其衍生物在哺乳动物中安全系数高。鉴于阿维菌素、伊维菌素及其衍生物在人体内临床应用已经超过二十年，其对人体的安全性已经得到了保证，本发明发现阿维菌素、伊维菌素及其衍生物能有效调节哺乳动物血清中糖、脂和胆固醇的代谢，有效降低动物模型血清中糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇的水平，表明了阿维菌素、伊维菌素及其衍生物在糖代谢、脂代谢等法尼醇受体介导的相关疾病治疗中的很好的应用前景。

[ 12] 本发明充分说明了阿维菌素、伊维菌素及其衍生物在哺乳动物中治疗法尼醇受体介导的代谢性疾病等相关疾病的新颖性、安全性、有效性，药物产量多、成本低并具有巨大的社会价值和经济效益。另外，本发明通过 X射线晶体衍射，从原子水平上提供了伊维菌素与法尼醇受体结合的独特结构模式，为以法尼醇受体为靶标的配体药物设计提供了安全的先导药物小分子以及药物优化结构模板和设计方法。

[ 13] 以法尼醇受体与伊维菌素结合的三维晶体结构模式为根据（附录 1 )，以伊维菌素结构式（如结构式 I ) 为结构基础，进行药物设计、药物合成和药物筛选的方法，具体步骤为：以结构式 I为结构基础，对该结构式中 C3-C4， C8-C9, C10-C11 , C14-C15碳碳双键进行改造；对 C5、 C7、 C4"位羟基进行改造；对 C4、 C12、 C14、 C24、 C25位的侧链进行改造；对 C13位的糖基进行水解以及其他基团进行取代等改造方法。特征在于以上任何单一改造和不同方式改造的组合在制备治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病中的应用。

[ 14] 本发明的技术方案是：

[ 15] 通过高通量筛选得到抗寄生虫药物伊维菌素（ivermectin^ 阿维菌素

( abamectin/avermectin) 和多拉克汀 ( doramectin) 是 FXR的特异性配体。

[ 16] 基于体外转染实验中荧光素酶报告基因活性分析及分子结构水平阐述这种受体与配体间的特异的选择性识别；通过小鼠原代肝细胞培养和小鼠模型检测伊维菌素处理后相关靶基因的表达及相关信号通路的调节状态，阐述对下游信号通路的影响；检测阿维菌素、伊维菌素和多拉克汀处理的小鼠模型中各项生化指标的变化并结合相应的信号通路的变化阐述致病的分子机理；用糖尿病肥胖症模型小鼠经阿维菌素、伊维菌素和多拉克汀药物处理，确定这几种药物在用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等疾病的效果，以及代谢相关的法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病中的用途。通过炎症反应靶基因的调节确定伊维菌素在治疗炎症反应中的用途。

[ 17] 同样的方法，用阿维菌素、伊维菌素和多拉克汀分别对高脂词料喂养的野生型小鼠和 FXR基因敲除小鼠进行注射处理，发现这些衍生物能有效降低野生型小鼠的附睾脂肪垫 / 体重比例，血清葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平。从而确定阿维菌素、伊维菌素和多拉克汀在用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等疾病，以及代谢相关的法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病中的用途是通过 FXR实现的。

[ 18] 将 FXR与伊维菌素制备复合物，通过结晶学手段，对该复合物进行结晶、 X射线晶体衍射以及结构解析，从原子水平阐明了 FXR与伊维菌素相互结合的独特结合模式，为以 FXR为靶标的哺乳动物的上述疾病的治疗药物的设计提供了安全的先导药物小分子以及以该分子结构为模板的衍生物药物设计与合成方法。

附图说明

[19] 图 1为 Abamectin、 Ivermectin^ Doramectin与 FXR结合后募集辅调节因子 SRC1的活性。 GW4064作为 FXR激活剂阳性对照。

[20] 图 2为 0.5 μΜ Ivermectin对 FXR受体的特异性转录激活。用 FXR等不同核受体的全长表达质粒和不同核受体相应的内源结合元件构建的报告基因共同转染 COS-7细胞。转染后，用 DMSO、 0.5 μΜ Ivermectin或针对各核受体的特异性激动剂分别处理细胞。

[21] 图 3为 FXR蛋白与 Ivermectin结合复合体的晶体衍射结构图。结合在 FXR的 LBD 配体口袋的 Ivermectin用棒状结构式表示。 NCoR2表示与 FXR和 Ivermectin形成复合体的辅调节因子 NCoR中与 FXR结合序列的多肽。

[22] 图 4为结合在 FXR上的 Ivermectin电子云图谱。

[23] 图 5为与 Ivermectin相互作用的 FXR的关键氨基酸位点的突变影响 Ivermectin和 GW4064激活 FXR的转录活性。全长表达 FXR (wt)或相应点突变的表达质粒与 EcRE报告基因共转染于 COS-7细胞，用 Ivermectin和 GW4064处理细胞， 24小时后检测转录活性。横坐标表示野生型的 FXR (wt) 和 4个氨基酸位点的 FXR突变体。

[24] 图 6是 Abamectin和 Doramectin处理对野生型和 FXR基因敲除小鼠摄食量无影响，但降低了野生型小鼠血清葡萄糖水平。 **为 p<0.01。

[25] 图 7为 Ivermectin处理后分别降低了高脂词料喂养的野生型小鼠（WT) 血清中糖，胰岛素和胆固醇的水平。在 FXR基因敲除型小鼠（KO) 中，这些指标未受药物处理影响。 * 为 p<0.05; **为 p<0.01。

[26] 图 8为 Ivermectin处理后下调小鼠体内胆固醇水平包括高密度脂蛋白和低密度 /极低密度脂蛋白中的胆固醇。在 FXR基因敲除型小鼠（KO) 中，这些指标未受药物处理影响。 *为 p<0.05; **为 p<0.01， ***为 p<0.001。

[27] 图 9是说明 Abamectin和 Doramectin处理降低高脂词料喂养的野生型小鼠血清胆固醇包括高密度脂蛋白和低密度 /极低密度脂蛋白水平中的胆固醇。 *为 p<0.05; ***为 p<0.001。

[28] 图 10是 Abamectin和 Doramectin处理后降低了高脂词料喂养的野生型小鼠血清甘油三酯水平和附睾脂肪垫 /体重。 *为 p<0.05_; ***为 p<0.001。

[29] 图 11为 Ivermectin处理后对野生型小鼠的谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性无影响。

[30] 图 12为 Ivermectin处理后野生型小鼠的肝脏组织切片苏木精 /伊红染色表明 Ivermectin 无肝脏损伤。 Vehicle表示注射不加药物的空白对照。

[31] 图 13为利用实时荧光定量 PCR方法检测 Ivermectin处理后野生型小鼠肝脏内 FXR 靶基因及和糖类、甘油三酯和胆固醇代谢相关的基因表达。 *为 p<0.05; **为 p<0.01。

[32] 图 14为 Ivermectin处理对 KK-Ay糖尿病模型小鼠摄食量无影响，但降低了体重。 * 为 p<0.05。

[33] 图 15为 Ivermectin处理后降低了 KK-Ay小鼠血清中葡萄糖和胰岛素水平。 **为 p<0.01 o

[34] 图 16为 Ivermectin处理后降低了 KK-Ay小鼠血清中胆固醇，甘油三酯水平和自由脂肪酸水平。 **为 p<0.01。

[35] 图 17是 Abamectin和 Doramectin处理后对 KK-Ay小鼠摄食无影响，降低了高脂词料喂养的 KK-Ay的相对体重和血清葡萄糖水平。 ***为 ρθ.001。

[36] 图 18是 Abamectin和 Doramectin处理后降低了高脂词料喂养的 KK-Ay小鼠血清胆固醇（包括高密度脂蛋白和低密度 /极低密度脂蛋白中的胆固醇）水平以及血清甘油三酯水平。 *为 p<0.05; **为 p<0.01， ***为 p<0.001。

[37] 图 19为 Ivermectin能抑制 LPS诱导的炎症反应相关基因表达（包括 iNOS， TNFa, IL-6 和 MIP-la)。 *为 p<0.05 ; **为 p<0.01。

具体实施方式

[38] 蛋白纯化

[39] 1. 克隆

[40] (1)以人的 FXR 表达质粒（pCMX-FXR ) 为模板， 0.5 μL 50 mM 前向引物 5 ' GATATGGATCCAATCCAGAGTCCGCTGACCTC, 0.5 μL 50 mM 反向弓 | 物 3 ' GATATCTCGAGCTAGTACAAGTCCTTGTAGATC为引物， 4 10 X PC buffer, 1 10 mM dNTP及 5 U pfu酶（Invitrogen) 加水（Milli-Q) 补足至 50 μL体系进行 PCR反应以获得含有双酶切位点 BamH l和 Xho I的人源 FXR LBD (配体结合域）（氨基酸残基数 243-472) 的 PCR产物。 PCR反应程序为： 94°C 2min_; 94 °C 30s, 58 °C lmin, 72 °C 1 min, 30个循环; 72V lO mino

[41] (2)酶切 PCR所得的 DNA片段和原核细胞表达载体 pET24a (Novagen)用 BamH I和 Xho I对 PCR产物及 pET24a载体进行酶切。酶切体系为： FXR LBD PC 产物或 pET24a载体 1 ug (10 μί)， BamH I (Thermo) 0.5 μL, Xho I (Thermo) 0.5 μL, 10 X酶切缓冲液（Thermo) 4 μί， dd¾0 (Milli-Q) 25 μί。 37°C温育 1.5 h。酶切后的 PCR产物和 pET24a载体通过加有 SYB DNA染料的 1%琼脂糖凝胶分离并通过 Promega胶回收试剂盒回收 DNA。

[42] (3)将回收片段和载体以摩尔比 3： 1连接。连接体系为： FXR LBD DNA片段 2 μL, pET24a (Novagen)载体 2 μί， 5 X连接缓冲液（Invitrogen) 2 μί， T4 DNA连接酶（Invitrogen) 0.5 μL, 力 B ddH₂0至 10 μί。室温反应 30 min。

[43] (4)取 2 μL连接产物转化入 50 μL Trans 109感受态细胞，冰浴 30 min后 42°C热激 30 S o 加入无抗生素的 LB液体培养基 250 μί，于 225 rpm 37°C预摇 40 min后，取 150 转化产物涂于添加有 50 g/ml 卡那霉素的 LB固体培养基平板， 37°C过夜培养。次日，挑取单克隆于 2 ml含 50 μ_§/ηι1卡那霉素的 LB液体培养基， 37°C摇床培养 10 h。

[44] (5)采用 Qiagen MiniPrep 质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提取。

[45] (6)对提取的质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定体系：质粒 1 μ_§ (2 μL), BamH I (Thermo) 0.5 μί， Xho I (Thermo) 0.5 μί， 10 X酶切缓冲液（Thermo) 2 μί， ddH₂0 (Milli-Q) 15 μί。 37°C恒温箱酶切反应 30 min后用 1%琼脂糖凝胶进行检测以确定目的片段成功插入表达载体。最后将获得的质粒进行测序鉴定。得到六聚组氨酸标记的人类核受体 FXR LBD的表达质粒，表示为 pET24a-His6-FXR LBD。

[46] 2. 目的蛋白表达和纯化

[47] (1)转化。将 pET24a-His6-FXR LBD转化进 BL21 (DE3 ) 感受态细胞。取 1 质粒转化入 50 μL BL21感受态细胞，冰浴 30 min后放入 42°C水浴锅中热激 30 s。加入无抗生素的 LB液体培养基 250 μL于 225 rpm 37°C预摇 40 min后取 15 μL涂于添加有 50 g/ml卡那霉素的 LB固体培养基平板， 37°C过夜培养。

[48] (2)摇菌。次日挑单克隆于 50 ml含 50 g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中 37°C 预摇 8 h后转入含 50 μ_§/ηι1卡那霉素的 1.5 L LB液体培养基中，当 OD₆₍₎₍₎达到 1.0左右时，加入 0.1 mM的 IPTG在 16°C下低温诱导表达。

[49] (3) 收集含有诱导目的蛋白的菌体细胞。诱导表达过夜的 1.5 L菌液于 4°C 3,000 rpm 离心 10 min收集细菌，用纯化缓冲液 100 ml (20 mM Tris pH8.0, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 25 mM imidazole) 重悬菌液，冻存于 -80°C。

[50] (4) 蛋白质提取。采用 Fisher Scientific Sonic Dismembrator超声破碎仪以振幅 60%， 5 s工作 10 s休息的频率超声波处理 10 min。以 20,000 rpm 4°C离心 30 min后取上清。

[51] (5) 蛋白质纯化。将上清过 5 ml 的镍离子交换 ί主 (NiS04-loaded HisTrap HP column, GE Healthcare), 使目的蛋白质充分富集到镍柱上。采用 GE公司 AKTA蛋白质纯化系统及 UNICORN软件操作。洗泵：先用水洗，再用缓冲液洗。操作步骤为：在 System Control 窗口中，依次选择： Manual→ Pump→ Pumpwashbasic→ Pump A, PumpB→ On→ Excute 层析柱连接：先启动系统泵，待有溶液流出时，将层析柱动态接入系统，使流出的蛋白质可以经过 UV检测到峰值，打开 UNICORN软件，编辑蛋白洗脱的程序： 20 ml洗脱缓冲液进行柱平衡； 25-500 mM咪唑进行梯度竞争性结合柱子以洗脱目的蛋白质； 15 ml缓冲液进行柱平衡。蛋白质洗脱：用洗脱缓冲液 A、B梯度洗脱该柱子上的蛋白（洗脱缓冲液 A成分： 25 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazole和 10%甘油， pH 7.5；洗脱缓冲液 B成分： 25 mM Tris, 150 mM Imidazole和 10%甘油， pH7.5 )，通过控制咪唑浓度梯度变化在 25~500 mM，以在合适浓度竞争下洗脱含相似结构的组氨酸标签的目的蛋白质。将镍离子交换柱洗脱出来的目的蛋白溶液进一步采用 Hiload26分子筛层析柱（GE Healthcare)利用分子量不同进一步纯化目的蛋白质，步骤如下：将镍柱收集的蛋白质溶液经注射器注入 AKTA上样环后开始程序运行，方法同上。蛋白洗脱缓冲液换为含有 10 mM NaCl的洗脱缓冲液 C (洗脱缓冲液 C: 25 mM Tris, pH7.5)。

[52] (6) 制备蛋白质复合体。采用从金斯瑞定制合成的 NcoR2 多肽 (PASNLGLEDIIRKALMGS)与 FXR LBD蛋白制备复合体：分子筛柱层析得到的 20 ml蛋白质与 NcoR2多肽及 Ivermectin按摩尔比 1 : 1 : 1混合加入 10 kD MILLIPORE 15 ml浓缩管中浓缩， 4°C 4,000rpm离心浓缩，将蛋白浓缩到 10 mg/ml的终浓度。

[53] 3. 蛋白结晶，晶体数据收集与结构解析

[54] 采用悬滴法进行结晶筛选， FXMvermectin/NcoR2复合物在室温条件下，悬滴液成分为 1.0 μΐ上述蛋白多肽配体复合体溶液与 1.0 μΐ结晶缓冲液（50 mM HEPES pH7.0, 3.5 M sodium formate)混合。生长成熟的晶体用液氮进行急速冷冻保存。在上海光源的 BL17U1线站进行数据采集。经 X光照射处理后，所得衍射数据通过 HKL2000软件处理确定每个不对称单元含有两个分子，晶体空间基团为 1 21 21 21 ( a=53.01 , b=161.76, c=169.02， α=90°， β=90。， γ=90°)，具体结构解析使用由 CCP4程序包（http://www.ccp4.ac.uk) 中的 Molrep、 Phaser等通过分子置换确定出大致结构模型，通过 Coot 的人工模型精细构建及 REFMAC 和 phenix.refme 深入修饰的多次循环，得到最终蛋白复合物结构，这一结构模型的 Rwork和 Rfree分别为 25.4%和 28.2%，分辨率为 2.8lA。具体的三维晶体结构空间元素见附录 1。

[55] 4.辅因子结合实验

[56] 通过 Alphascreen分析方法，用 Alpha Screen nickel chelate detection kit试齐 Ll盒

( Perkins-Elmer) 检测配体诱导核受体募集各种辅调节因子的结合能力。该实验的反应体系是 20 nM^]融合组氨酸标签的受体 LBD蛋白， 20 nM生物素化标记的辅因子多肽， 5 g/ml 的供体和受体珠子，缓冲液（50 mM MOPS, 50 mM NaF, 0.05 mM CHAPS, and 0.1 mg/ml bovine serum albumin, pH7.4 ), 反应体系 50 μL于 384孔板中室温反应 1 h后用 AlphaScreen检测仪读取 680 nm激发光下 520-620 nm的发射光信号。用于 Alphascreen分析的生物素标记的多肽及序列是 SRC1-2, SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP。

[57] 5. 瞬时转染实验

[58] 1. 质粒：

[59] (1) FX 全长质粒:将人类 FXR全长 cDNA表达序列采用经典克隆方法克隆到 pCMX 表达载体。

[60] (2)获得关键结合位点的 FXR 点突变表达载体。使用 Quick-Change site-directed mutagenesis试剂盒（Stratagene)进行突变，突变反应体系如下：野生型质粒 pCMX-FXR (50 ng) 0.5 μ∑,突变引物（100 μΜ) 0.2 μ∑, pfu DNA聚合酶（Invitrogen) (2 U) 1 μ∑, 10 mM dNTPs 1 μ∑, 10 X PC buffer 5 μί, ddH20 43 L。 PCR程序为： 94°C 2 min; 94°C 30 s， 55 °C 1 min, 72V 7 min, 15个循环。 20 μ∑ PCR产物用 Dpn I甲基化酶消化后取 2 μ∑消化产物转化入大肠杆菌 Transl09感受态细胞，冰浴 30 min后 42°C热激 30 s。加入无抗生素的 LB液体培养基 250 μL于 225 rpm 37°C预摇 40 min后取 150 μL涂于添加有 100 g/ml氨苄青霉素的 LB固体培养基平板， 37°C过夜培养。次日，挑取单克隆于 2 ml 含 100 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基， 37 °C过夜培养。采用 Qiagen MiniPrep 质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提取。对质粒进行测序鉴定。

[61] 2. 转染：

[62] 使用含有 10%胎牛血清的 DMEM培养基进行猴肾上皮细胞 COS-7细胞培养，转染前一天在 24孔板进行 COS-7细胞接种，接种密度为 5 X 10⁴细胞 /每孔，第二天进行转染。转染使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 进行瞬时转染。在报告基因分析实验中，使用 200 ng 的核受体全长表达质粒或其突变体表达质粒与 200 ng的内源启动子报告基因以及 30 ng的 Renilla荧光素酶表达质粒进行共转染。每孔添加 500 LOpti-MEM培养 5 h后，添加稀释在 Opti-MEM的配体药物至相应浓度，处理 18 h。各种核受体及相应的报告基因使用如下：人 FX , EcRE-Luc; A PPA s (α, δ, and γ), PP E-Luc; 人 RORs (α, β禾口 γ)， Pcp2/ ORE-Luc_; 人 GR禾口 PR， MMTV-Luc; 人 RARa禾口 RARp， pRE-LuCo

[63] 3. 报告基因分析：

[64] 按上述转染方法处理的细胞转染 4-6 h后加入配体药物，实施例中用于报告基因分析的 Ivermectin浓度均为 0.5 μΜ。附图 2中针对各核受体的特异性配体及浓度为： FXR, 0.5 μΜ GW4064; PPA a, 1 μΜ GW590735; PPARS, 1 μΜ GW0472; PPA y, 1 μΜ rosiglitazone (罗Ϊ "列酮)； glucocorticoid receptor (G ), 0.1 μΜ dexamethasone (地塞米松)； rogesterone receptor (PR), 0.1 μΜ progesterone (黄体激素)； A and RA p, 1 μΜ all-trans-retinoic acid (全反 ^视黄酸); PX , 10 μΜ rifampicin (利福平)； CAR, 5 μΜ CITCO ((6-(4-氯苯基)咪唑并 [2,l-b][l,3]噻唑 -5-甲醛—0-(3,4-二氯苄基)乙酮肟)。配体药物处理 18 h后，用 Promega公司的双荧光素梅报告基因分析试剂盒进行报告基因活性分析。裂解细胞用于荧光素酶检测实验，取 10 细胞裂解细胞转移到 96孔板，加入 50 μL荧光素酶反应液后使用 EnSpire^TM2300多功能酶标仪 (Perkin Elmer)检测在 560 nm下的发射光信号，后加入 Stop&Glo®反应液终止荧光素酶反应并检测 renilla荧光素酶活力。报告基因的活性以 renilla活性为内参。

[65] 6. 小鼠试验

[66] 使用 9-10周的野生型 C57BL/6J小鼠和同样背景的 FXR基因缺失纯合子小鼠

(FXR"⁷")以及糖尿病肥胖症模型小鼠（KK-Ay)，在厦门大学实验动物中心 SPF级别动物房，用高脂词料 (Research Diets, D12492)喂养，自由饮水。按对照组、伊维菌素或其衍生物处理组和 I或 GW4064 处理组分，每组 6 只，分别通过腹腔注射对照（40%的 HBC (2-hydro_Xypropyl-p-cyclode_Xtrin))溶液、用对照溶液稀释的伊维菌素或其衍生物（按药物质量 / 小鼠体重来算，注射量为 1.3 mg/kg)，和用对照溶液稀释的 GW4064 ( 30 mg/kg)。每天早上 9点腹腔注射一次，连续注射 14天，每隔一天称小鼠体重和小鼠摄食量。 14天结束后，给小鼠自由进水，饥饿 6 h后，称小鼠体重，用最后体重相对注射试验处理前的初始体重百分比表示小鼠体重的变化。然后从眼球取血，分离得到血清。血清中成分分别是由以下试剂盒测得：糖-氧化酶法（北京普利莱）；胰岛素（Crystal Chem. Inc., USA) ；总胆固醇及高、低密度脂蛋白中的胆固醇（Bioassay Systems, USA); 甘油三酯（北京普利莱和 WAKO Chemicals Inc., Japan); 自由脂肪酸（Bioassay Systems, USA); 谷草转氨酶和谷丙转氨酶（中生北控生物科技有限公司，中国北京）。取下小鼠肝脏，部分多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后苏木精 /伊红染色；部分液氮冻存，供提取 RNA进行荧光定量 PCR检测基因表达使用。

[67] 7.荧光定量 PCR检测基因表达

[68] 从对照 (40% HBC)或 Ivermectin处理的野生型和 FXR敲除的小鼠模型中获得肝脏组织，从对照、 GW4064或 Ivermectin处理过的 KK-Ay小鼠模型中获得肝脏组织，冻存于 -80 度冰箱。用 RNA提取试剂盒 (Omega Bio-Tek， GA)从组织中提取总 RNA。采用 TAKA A反转录试剂盒进行反转录，采用 SYBR绿色荧光染料在 CFX^TM96系统（BIO-RAD)实时监测系统下进行荧光定量 PCR分析基因表达水平。结果以 Actin基因的表达水平为内参。反应体系如下： SYBR Premix Ex Taq (2 X ) 12.5 μί， PCR前引物（ΙΟ μΜ) 1 μί， PCR后引物（ΙΟ μΜ) 1 μί， cDNA模版 2 μL,灭菌蒸馏水 8.5 μL, 总计 25 μLo两步法扩增 PCR程序：预变性 95°C 30s, PCR反应 95°C 5s， 60 °C 40s ₀ 40个循环。

[69] 以下给出具体实施例：

[70] 实施例 1，证明 Ivermectin是一种高亲和力和高特异性的新型 FXR配体。

[71] 因为配体结合 FXR后能有诱导 FXR募集辅调节因子的能力，因而可以来检测配体对 FXR的亲和力。通过 AlphaScreen来筛选 FXR的特异性配体，发现伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀对 FXR的亲和力与人工合成的 GW4064相差不到一个数量级，在该实验中， GW4064 对 FXR的亲和力半数有效浓度（EC50)是 140 nM，伊维菌素、多拉克汀和阿维菌素的 EC50 分别是 400 nM、 500 nM和 1.25 μΜ (图 1 )。表明伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀与 FXR的结合有很高的亲和力。为了证明伊维菌素能够特异性的结合 FXR，我们用 FXR的内源报告基因 EcRE和表达全长 FXR的质粒共转染 COS-7细胞。结果发现，在检测的不同核受体中，伊维菌素只能特异性激活 FXR的转录活性，而对其它被检测的核受体没影响（图 2)。这体现了伊维菌素作为 FXR配体的高特异性。

[72] 实施例 2， FXR/ivermectin复合物的晶体结构解析

[73] 为了从分子水平揭示伊维菌素和 FXR相互识别和结合的分子机制，我们解析了分辨率达 2.8人的 FXR/ivermectin与辅抑制因子 NCoR核受体结合基序形成复合物的晶体结构（附录 1，图 3 )。结构显示伊维菌素与 FXR配体结合域的结合符合经典的"三明治"构象。从电子云图看，伊维菌素清晰的存在于 FXR的配体结合口袋（图 4)。从该结构中可以看出，伊维菌素的结合导致 FXR羧基末端 AF-2经典的螺旋结构发生了变构（图 3 )，说明伊维菌素在诱导 FXR募集结合辅激活因子和辅抑制因子的作用方面与人工合成的 FXR配体 GW4064存在不同的作用方式，伊维菌素以一种的独特结合方式调节 FXR的功能。 FXR与伊维菌素结合模式的具体信息见附录 1。

[74] 实施例 3，伊维菌素在 FXR配体结合口袋中独特的结合位点

[75] 为了验证 FXR配体结合口袋中与伊维菌素直接结合的氨基酸位点，我们根据 FXR 与伊维菌素复合体的结构对两者相互结合的关键位点进行了点突变，检测这些突变后的 FXR 受配体调节的转录活性的变化以确定这些结合位点对于伊维菌素结合 FXR的重要性。

[76] 291位的丙氨酸（A) 对于 FXR配体结合域大小的调节有着重要的作用。当把 A291 突变为色氨酸（W)时，由于色氨酸比丙氨酸大得多的侧链基团占据了配体结合口袋的空间，会导致 FXR的配体结合口袋变小，从而影响 FXR配体的结合。与我们所期望的一致，报告基因分析实验结果表明， A291W的突变导致 GW4064和 ivermectin都不能激活 FXR的转录活性（图 5 )。表明 FXR的 291位丙氨酸残基对 GW4064或 ivermectin结合并激活 FXR转录活性是极其关键的。

[77] 在疏水链上的 284位苯丙氨酸（F) 分别能够与 GW4064和 ivermectin形成疏水相互作用，从而稳定配体和受体的结合。当 F284突变为组氨酸（H) 时，这两种疏水相互作用就会消失。但是另一方面，对于 GW4064 而言，突变成组氨酸后组氨酸的侧链基团可能与 GW4064形成氢键相互作用，因此，疏水相互作用的消失导致 ivermectin不能激活 FXR的转录活性，但 GW4064的激活能力却没有受到影响（图 5 )。这说明 ivermectin与 FXR配体结合口袋的结合模式具有区别于 GW4064的独特的结合方式。

[78] 另夕卜， L287T和 H447F的突变明显降低了 GW4064介导的 FXR的转录活性，但却显著地增加了 ivermectin对 FXR转录活性的激活（图 5 )。这也说明 GW4064和 ivermectin与

FX 的结合方式有着很大的区别，说明对于 FXR功能的调节也有明显的不同。 [79] 实施例 4，伊维菌素能有效调节哺乳动物的糖类和脂类的代谢

[80] FX 作为一种重要的核受体，它首先被作为胆酸的受体而调节肝脏和小肠内胆汁酸的循环和平衡。近来发现， FXR 能够调节生物体内糖类和脂类的代谢。合成的 FXR配体 GW4064能够通过 FXR降低血脂和胆固醇的水平，但由于 GW4064的细胞毒性和药效限制性导致其不能临床使用；另外，有报道表明 GW4064能缓解高血糖症和肥胖症，但同时一些文章也提到 GW4064对于机体的血糖没有明显的效果，甚至还有报道表明长期服用 GW4064能导致小鼠肥胖。因此， GW4064对血糖的调节尚存在争议。发现新的 FXR的配体药物显得更加重要和有意义。

[81] 为了检测 ivermectin对小鼠模型的生理调节功能，我们采用野生型和 FXR基因敲除小鼠进行试验。高脂词料喂养的小鼠，按照具体实施方法所述进行两周腹腔注射对照试剂和 ivermectin或其衍生物后发现，在药物对小鼠的进食没有影响的前提下 (图 6)，阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀处理显著降低了野生型小鼠的血清中葡萄糖（图 6、图 7)和胆固醇（图 7，图 8、图 9) 水平，但在 FXR敲除的小鼠中没有明显变化。 ivermectin处理显著降低了野生型小鼠的血清中胰岛素的水平（图 7)，说明 ivermectin可能通过增加胰岛素的敏感性达到了降血糖的效果。但是在 FXR基因敲除小鼠中药物处理对血糖、胰岛素和胆固醇的水平没有显著变化，说明阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀调节血清中血糖、胰岛素和胆固醇是通过 FXR进行的。阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀下调小鼠血清胆固醇水平，不仅包括了显著下调的高密度脂蛋白中的胆固醇水平，同时也下调了低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白中的胆固醇水平（图 8、图 9)。另外，阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀也显著降低了野生型小鼠血清中甘油三酯（Tg) 水平（图 10)。重要的是，阿维菌素和多拉克汀处理的小鼠体内附睾脂肪垫的比重也受到了显著的下调（图 10)表明了它们对肥胖症的治疗作用。通过检测血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性（图 11 )，表明 ivermectin对转氨酶活性无影响。通过对 ivermectin处理的小鼠肝脏进行石蜡包埋、切片和苏木精 /伊红染色（图 12)，表明 ivermectin对肝脏细胞无损伤。

[82] 通过荧光定量实时 PCR检测配体药物处理过的小鼠肝脏中糖、脂、胆固醇代谢相关基因的表达。结果表明， ivermectin达到降血糖、血脂和胆固醇的生理功能与糖、脂、胆固醇代谢相关基因的表达调控一致 (图 13)，说明 ivermectin通过 FXR调节代谢相关基因的表达从而实现生理功能的调节。这些结果表明， ivermectin是 FXR的特异性配体，同时证明 ivermectin 在体内生理功能的调节是通过 FXR实现的。

[83] 实施例 5，阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀在糖尿病小鼠模型中的作用

[84] 既然阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀作为 FXR的配体能够在正常小鼠的体内发挥重要的代谢调节功能，那么它们是否能够对病理小鼠具有改善疗效？为了检测阿维菌素、伊维菌素及其衍生物多拉克汀在糖尿病肥胖症模型小鼠体内的药效，我们选择了糖尿病肥胖症模型小鼠 KK-Ay小鼠作为实验对象。这种小鼠在 8-12周左右表现出明显的高血糖和肥胖的症状。在实验中，我们采用 9-10周的 KK-Ay小鼠，高脂词料喂养并腹腔注射药物 14 天，在对小鼠摄食无影响的情况下（图 14)， ivermectin和 GW4064都显著地降低了血清中胆固醇、甘油三酯和自由脂肪酸的含量（图 16); 但在血糖方面， ivermectin显著降低了血清中糖和胰岛素的水平，表明 ivermectin可能通过增加胰岛素的敏感性达到了降低血糖的效果，在这方面 ivermectin作为 FXR的配体的功能要显著优越于 GW4064 (图 15 )。并且， ivermectin 处理显著降低了 KK-Ay小鼠的体重，这点相比 GW4064也有明显的优越性（图 14)。这些结果表明， ivermectin对糖尿病、肥胖症模型小鼠具有很好的平衡血糖、血脂和胆固醇以及抑制体重增加的效果，而且相比合成的配体 GW4064具有更优的功能和疗效。

[85] 将阿维菌素和多拉克汀在 KK-Ay小鼠上做同样的试验，发现阿维菌素和多拉克汀在不影响小鼠摄食量的情况下（图 17)，也能显著降低高脂词料喂养的 KK-Ay小鼠血清中葡萄糖（图 17)、包括高密度脂蛋白和低密度 /极低密度脂蛋白的胆固醇水平和甘油三酯（图 18) 水平，还能显著降低肥胖小鼠的相对体重（图 17)。这些数据表明伊维菌素及其衍生物对糖尿病、肥胖症具有很好的疗效。

[86] 实施例 6， Ivermectin通过 FXR介导抑制 LPS诱导的炎症反应

[87] 近来一些报道证明， ivermectin能够抑制 LPS诱导的炎症发应，并减少由于过量 LPS 诱导的小鼠的死亡。同时， ivermectin对于过敏性哮喘的治疗有明显的疗效，但其具体的作用机制还不清楚。我们用 ivermectin和 LPS处理野生型和 FXR敲除的小鼠肝脏细胞。在野生型小鼠肝脏细胞中， ivermectin能够明显的抑制炎症因子的表达，例如： iNOS， TNFa, IL-6和 ΜΙΡ-la (图 19); 但在 FXR敲除的小鼠肝脏细胞中没有明显的变化。该结果表明， ivermectin 对于 LPS诱导的炎症反应的抑制是通过 FXR实现的。

[88] 实施例 7，基于 FXR/ivermectin复合物结构的 ivermectin衍生物药物设计

[89] 通过上述实施例发现，伊维菌素具有区别于抗寄生虫药物作用的完全不同的功能，可用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。再根据我们解出的 FXR与 ivermectin相互结合的三维晶体结构模式（；附录 1)，以 ivermectin作为一个安全的先导化合物，以 ivermectin的分子结构为药物设计模板，以 ivermectin和 FXR受体的结合位点及其构效关系为依据，对 ivermectin 的某些基团进行适当的修饰，可能提高配体与受体结合的亲和力和特异性，而达到最佳的药物疗效，从而以最少的配体药物量，达到最佳的药物治疗效果，减少药物对细胞和机体的毒性。 Ivermectin结构式如下：

[90] 以该结构式为结构基础，对该结构式中 C3-C4， C8-C9, C10-C11 , C14-C15碳碳双键进行改造；对 C5、 C7、 C4"位羟基进行改造；对 C4、 C12、 C14、 C24、 C25位的侧链进行改造；对 C13位的糖基进行水解以及其他基团进行取代等改造方法。以上任何单一改造和不同方式改造的组合在制备治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病中都具有应用价值。根据上述设计原则，阿维菌素、多拉克汀等也是符合该原则的衍生物，且小鼠试验证明这些化合物在哺乳动物糖脂代谢方面也具有很好的调节功能和疗效。

工业实用性

[91] 本发明提供了阿维菌素、伊维菌素及多拉克汀等衍生物或含有它们中任何一种的组合物在制备用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症的药物中的应用。申请日前与本发明有关的参考资料

1. 中国专利 CN1933856。

2. 中国专利 CN1777433。

PROGRAM ： REFMAC 5. 6. 0117

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Claims

权利要求书

[权利要求 1] 伊维菌素及其衍生物在制备一种调控法尼醇受体 (Farnesoid X receptor, FXR) 活性的化合物或组合物中的应用，所述伊维菌素的结构式为：

结构式 I

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的伊维菌素及其衍生物的应用，其特征在于所述的衍生物或结构类似物为阿维菌素，其结构是式 II的化合物：

结构式 II 。

[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的伊维菌素及其衍生物的应用，其特征在于所述的衍生物为多拉克汀，其结构是式 III的化合物：

结构式 III 。

[权利要求 4] 如权利要求 1或 2或 3所述的应用，其特征在于所述化合物或组合物包括伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀的衍生物。

[权利要求 5] 如权利要求 1或 2或 3所述的应用，其特征在于所述的伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀在制备用于治疗与法尼醇受体相关的疾病，包括代谢相关疾病，胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症的药物中的应用。

[权利要求 6] 如权利要求 1或 2或 3所述的应用，其特征在于在制备用于治疗哺乳动物代谢相关疾病的药物中的应用。

[权利要求 7] 如权利要求 6所述的应用，其特征在于所述代谢相关疾病包括高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病或肥胖症。

[权利要求 8] 如权利要求 6所述的应用，其特征在于所述代谢相关疾病包括糖代谢相关疾病。

[权利要求 9] 如权利要求 6所述的应用，其特征在于所述代谢相关疾病包括脂代谢相关疾病。

[权利要求 10] 如权利要求 5-9所述的应用，其特征在于所述衍生物是基于伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀设计和合成的的新衍生物。

[权利要求 11] 如权利要求 10所述的新衍生物设计和合成的方法，具体特征在于：以伊维菌素、阿维菌素和多拉克汀结构式为结构基础，对该结构式中 C3-C4,C8-C9， C10-C11 , C14-C15 , C22-C23碳碳双键进行改造；对 C5、 C7、 C4"位羟基进行改造；对 C4、 C12、 C14、 C24、 C25位的侧链进行改造；对 C13位的糖基进行水解以及其他基团进行取代改造方法。

[权利要求 12] 如权利要求 10所述的新衍生物设计和合成的方法，具体特征在于：通过高亲和力并特异性结合法尼醇受体来设计和合成的的新衍生物。

[权利要求 13] 如权利要求 11或 12所述的新衍生物设计和合成的方法，其特征在于包括以上任何单一改造或不同方式改造的组合。

[权利要求 14] 如权利要求 1 至 10之一所述的应用，其特征在于按照权利要求 1至 3、

10至 12所述的化合物在药学上可接受的盐。

[权利要求 15] 如权利要求 1至 10之一所述的应用，其特征在于按照权利要求 1至 3、

10至 12所述的化合物在药学上可接受的赋型剂。