CN102872066A - 伊维菌素及其衍生物的用途 - Google Patents

Abstract

伊维菌素及其衍生物的用途，涉及一种伊维菌素。所述伊维菌素是链霉菌产生的大环内酯阿维菌素的一种衍生物，所述伊维菌素及其衍生物在制备用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的药物中的应用。

Description

伊维菌素及其衍生物的用途

技术领域

本发明涉及一种法尼醇受体(Farnesoid X receptor,FXR)的新型有效的配体伊维菌素(ivermectin)及其衍生物区别于抗寄生虫药物的新用途，以及用于新用途的伊维菌素的衍生物的设计、优化和合成的方法。

背景技术

核受体是一种配体激活的转录因子。FXR是人体48种核受体中非常重要的一员，在代谢、炎症、肿瘤等重大疾病及相关生理功能中起着重要的调控作用。FXR的配体介导的药理作用原理是配体通过与FXR的配体结合域（LBD）结合，招募各类辅激活因子（或辅抑制因子）来调节下游靶基因。在体内，胆汁酸是FXR的内源性配体，FXR的激活能够维持胆汁酸在肝脏和小肠中的正常循环和稳态，同时能够调节糖类、脂类和胆固醇的水平。FXR牵涉到许多代谢相关的信号通路，成为治疗代谢疾病如胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化和糖尿病等出色的药物靶分子。最近，FXR被发现能够调节肝脏的再生，小鼠FXR基因敲除会导致肝癌的形成。鹅去氧胆酸（英文名chenodeoxycholic acid，缩写CDCA）是一种能结合并激活FXR的胆酸，用于治疗胆结石。CDCA是能结合FXR的配体中唯一用于临床的药物。但是CDCA对FXR的亲和性远远低于人工合成的FXR的配体GW4064，而且CDCA还能结合胆酸结合蛋白（I-BABP）和胆酸转运蛋白（Bile AcidTransporter）等其它蛋白，因此，CDCA也不是特异性以FXR为靶标的药物。目前，世界销售额前100名的药物中有高于13%的药物都是以核受体为靶标的，基于FXR参与调控的重要生理作用，筛选以FXR为靶标的新配体药物以及对配体药物进行优化、设计和开发具有重要的应用价值。

伊维菌素(ivermectin)是链霉菌产生的大环内酯阿维菌素(avermectin)的一种衍生物，具有高效广谱的抗寄生虫作用，主要应用于家畜寄生虫控制和人丝虫感染的治疗。已有报道表明伊维菌素在无脊椎动物中的靶标是GABA和GluClR等离子通道受体。Hibbs研究组首先解析了GluClR/ivermectin复合物的结构，揭示了ivermectin抗寄生虫的作用机制，但这些无脊椎动物中的离子通道受体不存在于脊椎动物。多拉克汀（Doramectin）也是阿维菌素的衍生物。也广泛用于家畜寄生虫控制和人丝虫感染的治疗。迄今为止尚未报道在哺乳动物中存在伊维菌素的靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供伊维菌素及其衍生物的用途。

所述伊维菌素(ivermectin)是链霉菌产生的大环内酯阿维菌素(avermectin)的一种衍生物，具有高效广谱的抗寄生虫作用，主要应用于家畜寄生虫控制和人丝虫感染的治疗，其结构式（记为结构式Ⅰ）为：

结构式Ⅰ

所述伊维菌素具有完全不同于抗寄生虫作用的新功能。该功能的特征在于，首次提出伊维菌素在哺乳动物体内存在特异性靶标蛋白法尼醇受体，伊维菌素通过高亲和力并特异性结合法尼醇受体(FXR)，调节哺乳动物血清中糖、脂和胆固醇的代谢，有效降低糖尿病动物模型血清中糖、脂和胆固醇的水平，改善相应的症状。伊维菌素还能通过法尼醇受体介导抑制炎症反应。因此，所述伊维菌素及其衍生物在制备用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的药物中的应用。

所述伊维菌素衍生物，例如阿维菌素（avermectin）、多拉克汀（Doramectin）等。

阿维菌素（avermectin）是在伊维菌素结构式中C22-C23位为双键。我们发现阿维菌素能高亲和力特异性结合FXR，也是FXR的配体。因此，阿维菌素具有用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。

多拉克汀（Doramectin），是在伊维菌素结构式中C22-C23位为双键，C25位是苯环侧链取代。我们发现多拉克汀能高亲和力特异性结合FXR，也是FXR的配体。因此，多拉克汀具有用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。

伊维菌素作为抗寄生虫药物用于家畜和人体，其使用的安全性已经在全世界得到认证。因此，本发明通过X射线晶体衍射，从原子水平上提供了伊维菌素与法尼醇受体结合的独特结构模式，为以法尼醇受体为靶标的配体药物设计提供了安全的先导药物小分子以及药物优化结构模板和设计方法。

以法尼醇受体与伊维菌素结合的结构模式为根据（附录1），以伊维菌素结构式（如结构式Ⅰ）为结构基础，进行药物设计、药物合成和药物筛选的方法，具体步骤为：以结构式Ⅰ为结构基础，对该结构式中C3-C4，C8-C9，C10-C11，C14-C15碳碳双键进行改造；对C5、C7、C4”位羟基进行改造；对C4、C12、C14、C24、C25位的侧链进行改造；对C13位的糖基进行水解以及其他基团进行取代等改造方法。特征在于以上任何单一改造和不同方式改造的组合在制备治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病中的应用。

本发明的技术方案是：

通过高通量筛选得到抗寄生虫药物伊维菌素(ivermectin)是FXR的特异性配体。根据对伊维菌素的结构优化设计方案，发现多拉克汀和阿维菌素也是FXR的特异性配体。

基于体外转染实验中荧光素酶报告基因活性分析及分子结构水平阐述这种受体与配体间的特异的选择性识别；通过体外的细胞培养和小鼠模型检测ivermectin处理后相关靶基因的表达及相关信号通路的调节状态，阐述对下游信号通路功能的影响；检测ivermectin处理的小鼠模型中各项生化指标的变化并结合相应的信号通路的功能变化阐述致病的分子机理；用糖尿病肥胖症模型小鼠经伊维菌素药物处理，确定伊维菌素在用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等疾病，以及代谢相关的法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病中的用途，确定伊维菌素在治疗炎症反应中的用途。并根据FXR在癌症细胞中具有调节作用衍生出ivermectin在癌症中的治疗作用。

将FXR/ivermectin制备复合物，通过结晶学手段，对该复合物进行结晶、X射线晶体衍射以及结构解析，从原子水平阐明了FXR与伊维菌素相互结合的独特结合模式，为以FXR为靶标的哺乳动物的上述疾病的治疗药物的设计提供了安全的先导药物小分子以及药物设计的结构模板和设计方法。

附图说明

图1为GW4064与ivermectin分别和FXR结合促进了FXR募集辅调节因子。在图1中，横坐标表示生物素标记的几种辅调节因子与FXR结合序列的多肽。

图2为0.5μM ivermectin对FXR受体的特异性转录激活。用FXR等不同核受体的全长表达质粒和不同核受体相应的内源结合元件构建的报告基因共同转染COS-7细胞。转染后，用DMSO或0.5μM ivermectin处理细胞。

图3为ivermectin对FXR受体转录活性的激活是受配体浓度影响的。在图3中，横坐标表示配体浓度的对数值。

图4为FXR/ivermectin蛋白复合体的结构图。结合在FXR LBD配体口袋的ivermectin用棒状结构式表示。在图4中，NcoR2表示与FXR和ivermectin形成复合体的辅调节因子NcoR中与FXR结合序列的多肽。

图5为结合在FXR上的ivermectin电子云图谱。

图6为Ivermectin和FXR结合的关键位点及其对FXR转录活性的影响与ivermectin相互作用的关键氨基酸的突变对ivermectin和GW4064激活FXR转录活性的影响。全长表达FXR(wt)或相应点突变的表达质粒与EcRE报告基因公转染于COS-7细胞后用ivermectin和GW4064处理细胞后检测转录活性。在图6中，横坐标表示野生型的FXR（WT）和4个氨基酸位点的突变体。

图7为Ivermectin通过FXR下调血清中糖的水平。

图8为Ivermectin通过FXR下调血清中胰岛素的水平。

图9为Ivermectin通过FXR下调血清中胆固醇的水平。

图10为Ivermectin能下调血清中甘油三酯的水平。

图11为Ivermectin处理对小鼠摄食量无影响。

图12为Ivermectin处理后小鼠的体重没有变化。

图13为利用实时荧光定量PCR方法检测Ivermectin处理后小鼠肝脏内FXR靶基因及和糖类、甘油三酯和胆固醇代谢相关的基因表达。10~12周龄野生型小鼠和FXR基因敲除型小鼠通过腹腔注射40%HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)或由40%HBC稀释的ivermectin 14天，摄食量每隔一天称一次，Kcal，kilocalories；BW，body weight。处理14天后饥饿6h，称体重（F）。眼球取血收集血清用于糖脂水平检测。取肝脏冻存用于提取RNA检测基因表达水平。

在图7~13中，WT表示野生型小鼠，KO表示FXR基因敲除型小鼠。白色柱子表示用HBC溶剂处理的对照组小鼠，黑色柱子表示ivermectin处理的实验组小鼠。每组6只小鼠。*表示相对对照组的数据具有显著差异性，*为p<0.05；**为p<0.01，***为p<0.001。

图14为Ivermectin处理对KK-Ay糖尿病模型小鼠摄食量无影响。

图15为Ivermectin处理后降低了KK-Ay糖尿病模型小鼠体重。

图16为Ivermectin处理后降低了KK-Ay小鼠中血糖水平。

图17为Ivermectin处理后降低了KK-Ay小鼠中胰岛素水平。

图18为Ivermectin处理后降低了KK-Ay小鼠中胆固醇水平。

图19为Ivermectin处理后降低了KK-Ay小鼠中甘油三酯水平。

图20为Ivermectin处理后降低了KK-Ay小鼠中自由脂肪酸水平。

图21为Ivermectin处理后检测和血糖、胆固醇、甘油三酯和脂肪酸代谢的相关基因表达。10~12周龄KK-Ay小鼠分别腹腔注射HBC对照、GW4064(30mg/kg)和ivermectin(1.3mg/kg）14天，摄食量每隔一天称一次，Kcal，kilocalories；BW，body weight。处理14天后饥饿6h，称体重（B）。眼球取血收集血清用于糖脂水平检测。取肝脏冻存用于提取RNA检测基因表达水平。

在图14~21中，白色柱子表示HBC溶剂处理的对照组小鼠，斜纹柱子表示用用GW4064处理的实验组小鼠，黑色柱子表示ivermectin处理的实验组小鼠。每组6只小鼠。*表示相对对照组的数据具有显著差异性，*为p<0.05；**为p<0.01。

图22为Ivermectin通过FXR介导抑制LPS诱导的炎症反应相关基因表达（iNOS）。

图23为Ivermectin通过FXR介导抑制LPS诱导的炎症反应相关基因表达（TNFa）。

图24为Ivermectin通过FXR介导抑制LPS诱导的炎症反应相关基因表达（IL-6）。

图25为Ivermectin通过FXR介导抑制LPS诱导的炎症反应相关基因表达（MIP-1a）。

在图22~25中，WT表示野生型小鼠，KO表示FXR基因敲除型小鼠。白色柱子表示用HBC溶剂处理的对照组小鼠，斜纹柱子表示用用GW4064处理的实验组小鼠，黑色柱子表示ivermectin处理的实验组小鼠。每组6只小鼠。*表示相对对照组的数据具有显著差异性，*为p<0.05；**为p<0.01。

图26为Ivermectin通过FXR介导抑制NF-κB(p65)的转录活性。

图27为Ivermectin通过RXR介导抑制NF-κB(p65)的转录活性。

图28为阿维菌素和多拉克汀具有与伊维菌素相似的FXR高亲和力。在图28中，横坐标表示配体浓度的对数值。

图29为阿维菌素与多拉克汀具有与伊维菌素类似的诱导FXR募集各种辅调节因子的能力。

具体实施方式

蛋白纯化

1．克隆

(1)以pcDNA-FXR质粒为模板，0.5μL 50mM前向引物5ˊGATATGGATCCAATCCAGAGTCCGCTGACCTC,0.5μL 50mM反向引物3ˊGATATCTCGAGCTAGTACAAGTCCTTGTAGATC为引物，4μL 10×PCR buffer，1μL 10mM dNTP及5U pfu酶（Invitrogen）加水（Milli-Q）补足至50μL体系进行PCR反应以获得含有双酶切位点BamH Ⅰ和Xho Ⅰ的人源FXR LBD（配体结合域）（氨基酸残基数243-472）的PCR产物。PCR反应程序为：

94℃ 2min

72℃ 10min

(2)酶切克隆插入DNA片段和pET24a（Novagen）载体用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对PCR产物及pET24a载体进行酶切。

酶切体系为：

37℃ 1.5h。

(4)酶切后的PCR产物和pET24a载体通过加有SYBR DNA染料的1%琼脂糖凝胶分离并通过Promega胶回收试剂盒进行片段回收处理。

(5)将回收片段和载体以摩尔比3∶1连接。

连接体系为：

室温反应30min。

(6)取2μL连接产物转化入50μL Trans109感受态细胞，冰浴30min后42℃热激30s。加入无抗生素的LB液体培养基250μL，于225rpm 37℃预摇40min后，取150μL转化产物涂于添加有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养。

(7)次日，挑取单克隆于2ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养10h。

(8)采用Qiagen MiniPrep质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提取。

(9)对提取的质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定体系：

37℃恒温箱酶切反应30min后用1%琼脂糖凝胶进行检测以确定目的片段成功插入表达载体。最后将获得的质粒进行测序鉴定。得到六聚组氨酸标记的人类核受体FXR LBD的表达质粒，表示为pET24a-His6-FXR LBD。

2.目的蛋白表达和纯化

(1)转化

将pET24a-His6-FXR LBD转化进BL21（DE3）感受态细胞，取1μL质粒转化入50μLBL21感受态细胞，冰浴30min后放入42℃水浴锅中热激30s。加入无抗生素的LB液体培养基250μL于225rpm 37℃预摇40min后取15μL涂于添加有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养。

(2)摇菌

次日挑单克隆于50ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃预摇8h后转入含50μg/ml卡那霉素的1.5L LB液体培养基中，当OD600达到1.0左右时，加入0.1mM的IPTG在16℃下低温诱导表达。

(3)收集含有诱导目的蛋白的菌体细胞

诱导表达过夜的1.5L菌液于4℃ 3,000rpm离心10min收集细菌，用纯化缓冲液100ml（20mM Tris pH8.0,150mM NaCl,10%glycerol,25mM imidazole）重悬菌液，冻存于-80℃。

(4)蛋白质提取

采用Fisher Scientific Sonic Dismembrator超声破碎仪以振幅60%，5s工作10s休息的频率超声波处理8min。

BECKMAN离心机以20,000rpm 4℃离心30min后取上清。

(5)蛋白质纯化

将上清过5ml的镍离子交换柱（NiSO4-loaded HisTrap HP column，GE Healthcare），使目的蛋白质充分富集到镍柱上。

采用GE公司AKTA蛋白质纯化系统及UNICORN软件操作。

洗泵：先用水洗，再用缓冲液洗。操作步骤为：在System Control窗口中，依次选择：Manual→Pump→Pumpwashbasic→PumpA,PumpB→On→Excute。

层析柱连接：先启动系统泵，待有溶液流出时，将层析柱动态接入系统，使流出的蛋白质可以经过UV检测到峰值，打开UNICORN软件，编辑蛋白洗脱的程序：

20ml洗脱缓冲液进行柱平衡

25-500mM咪唑进行梯度竞争性结合柱子以洗脱目的蛋白质

15ml缓冲液进行柱平衡。

蛋白质洗脱：用洗脱缓冲液A、B梯度洗脱该柱子上的蛋白（洗脱缓冲液A成分：25mMTris,150mM NaCl,25mM Imidazole和10%甘油，pH 7.5；洗脱缓冲液B成分：25mM Tris,150mM Imidazole和10%甘油，pH7.5），通过控制咪唑浓度梯度变化在25~500mM，以在合适浓度竞争下洗脱含相似结构的组氨酸标签的目的蛋白质。

采用Q阴离子交换柱利用目的蛋白质所带负电荷进一步分离纯化过镍柱后的蛋白质，方法同上。蛋白洗脱缓冲液换为洗脱缓冲液C、D (洗脱缓冲液C：25mM Tris，pH7.5；洗脱缓冲液D：25mM Tris，1.0M NaCl，pH7.5)。

采用Hiload26分子筛层析柱（GE Healthcare）利用分子量不同进一步纯化目的蛋白质，步骤如下：

将Q柱收集的蛋白质盛入Millipore 10kD的浓缩管，4℃ 4,000g，20min离心到终体积10ml后，经注射器注入AKTA端口后开始程序运行，方法同上。蛋白洗脱缓冲液换为含有10mM NaCl的洗脱缓冲液C(洗脱缓冲液C：25mM Tris，pH7.5)。

(6)制备蛋白质复合体

采用从金斯瑞定制合成的NcoR2多肽(PASNLGLEDIIRKALMGS)与FXR LBD蛋白复合体：分子筛柱层析得到的20ml蛋白质与NcoR2多肽及ivermectin按摩尔比1∶1∶1混合加入10kD MILLIPORE 15ml浓缩管中浓缩，4℃4,000离心浓缩，将蛋白浓缩到10mg/ml的终浓度。

蛋白结晶，晶体数据收集与结构解析

采用悬滴法进行结晶筛选，FXR/ivermectin/NcoR2复合物在室温条件下，悬滴液成分为1.0μl上述蛋白多肽配体复合体溶液混合上1.0μl结晶缓冲液（50mM HEPES pH7.0,3.5Msodium formate）。生长成熟的蛋白晶体用液氮进行急速冷冻保存。在上海光源的BL17U1线站进行数据采集。经X光照射处理后，所得衍射数据通过HKL2000软件处理确定每个不对称单元含有两个分子，晶体空间基团为I 212121（a=53.01，b=161.76，c=169.02，α=90°，β=90°，γ=90°），具体结构解析使用由CCP4程序包（http://www.ccp4.ac.uk）中的Molrep、Phaser等通过分子置换确定出大致结构模型，通过Coot的人工模型精细构建及REFMAC和phenix.refine深入修饰的多次循环，得到最终蛋白复合物结构，这一结构模型的Rwork和Rfree分别为25.4%和28.2%，分辨率为

具体的三维晶体结构空间元素见附录1。

辅因子结合实验

通过Alphascreen分析方法，用Alpha Screen nickel chelate detection kit试剂盒（Perkins-Elmer）检测配体诱导核受体募集各种辅调节因子的结合能力（Li et al.2005）。该实验的反应体系是20nM的融合组氨酸标签的受体LBD蛋白，20nM生物素化标记的辅因子多肽，5μg/ml的供体和受体珠子，缓冲液（50mM MOPS,50mM NaF,0.05mM CHAPS,and 0.1mg/ml bovine serum albumin，pH7.4），反应体系50μL于384孔板中室温反应1h后用AlphaScreen检测仪读取680nm激发光下520-620nm的发射光信号。用于Alphascreen分析的生物素标记的多肽序列如下：

SRC1-2,SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP;

SRC2-3,QEPVSPKKKENALLRYLLDKDDTKD;

SRC3-3,PDAASKHKQLSELLRGGSG;

NCOR-2,GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF.

瞬时转染实验

1.质粒：

(1)FXR全长质粒：将人类FXR全长cDNA表达序列采用经典克隆方法克隆到pCMX表达载体。

(2)获得关键结合位点的FXR点突变表达载体。使用Quick-Change site-directedmutagenesis试剂盒（Stratagene）进行突变，突变反应体系如下：

94℃ 2min

4℃ forever

20μLPCR产物用Dpn Ⅰ甲基化酶消化后取2μL消化产物转化入大肠杆菌Trans109感受态细胞，冰浴30min后42℃热激30s。加入无抗生素的LB液体培养基250μL于225rpm37℃预摇40min后取150μL涂于添加有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养。

次日，挑取单克隆于2ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养。采用Qiagen MiniPrep质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提取。对质粒进行测定鉴定。

(3)各内源结合元件的报告基因直接商业购买。

2.转染：

使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行猴肾上皮细胞COS-7细胞培养，转染前一天在24孔板进行COS-7细胞接种，接种密度为5×10⁴细胞/每孔，第二天进行转染。转染使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行瞬时转染（Li et al.2005）。在报告基因分析实验中，使用200ng的核受体全长表达质粒或其突变体表达质粒与200ng的内源启动子报告基因以及30ng的Renilla荧光素酶表达质粒进行共转染。每孔添加500μLOpti-MEM培养5h后，添加稀释在Opti-MEM的配体药物至相应浓度，处理18h。各种核受体及相应的报告基因使用如下：人FXR，EcRE-Luc；人PPARs(α,δ,and γ)，PPRE-Luc；人RORs(α,β和γ)，Pcp2/RORE-Luc；人GR和PR，MMTV-Luc；人RARα和RARβ，βRE-Luc。用于检测炎症反应相关的报告基因分析中，转染p65使用的是含NF-κB(p65)的靶基因启动子结合元件的两种报告基因(IL6)×3-luc和NF-κB-luc。

3.报告基因分析：

配体药物处理18h后，用Promega公司的双荧光素梅报告基因分析试剂盒进行报告基因活性分析。裂解细胞用于荧光素酶检测实验，取10μL细胞裂解细胞转移到96孔板，加入50μL荧光素酶反应液后使用EnSpire^TM2300多功能酶标仪(Perkin Elmer)检测在560nm下的发射光信号，后加入反应液终止荧光素酶反应并检测renilla荧光素酶活力。报告基因的活性以renilla活性为内参。

小鼠试验

使用10-12周的野生型C57BL/6J小鼠和同样背景的FXR基因缺失纯合子小鼠（FXR^-/-）以及糖尿病肥胖症模型小鼠（KK-Ay），在厦门大学实验动物中心SPF级别动物房，用高脂饲料(Research Diets,D12492)喂养，自由饮水。按对照组、伊维菌素处理组和/或GW4064处理组分，每组6只，分别通过腹腔注射对照（40%的HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)）溶液、用对照溶液稀释的ivermectin（按药物质量/小鼠体重来算，注射量为1.3mg/kg），和/或用对照溶液稀释的GW4064（30mg/kg）。每天早上9点腹腔注射一次，连续注射14天，每隔一天称小鼠体重和小鼠摄食量。14天结束后，给小鼠饥饿6h，自由进水。禁食6h后，称小鼠体重，用最后体重相对注射试验处理前的初始体重百分比表示小鼠体重的变化（附图4F和5B）。然后从眼球取血，分离得到血清。血清中成分分别是由以下试剂盒测得：糖-氧化酶法（北京普利莱）；胰岛素（Crystal Chem.Inc.,USA）；胆固醇（Bioassay Systems，USA）；甘油三酯（北京普利莱和WAKO Chemicals Inc.,Japan）；自由脂肪酸（BioassaySystems，USA）。取下小鼠肝脏，液氮冻存，供提取RNA进行荧光定量PCR检测基因表达使用。

荧光定量PCR检测基因表达

从对照(40%HBC)或ivermectin处理的野生型和FXR敲除的小鼠模型中获得肝脏组织；从对照、GW4064或ivermectin处理过的KK-Ay小鼠模型中获得肝脏组织，冻存于-80度冰箱。用RNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek，GA)从组织中提取总RNA。采用TAKARA反转录试剂盒进行反转录，采用SYBR绿色荧光染料在CFX^TM96系统(BIO-RAD)实时监测系统下进行荧光定量PCR分析基因表达水平。

反应体系如下：

两步法扩增PCR程序：

预变性

95℃    30s

PCR反应

以下给出具体实施例:

实施例1，证明ivermectin是一种高亲和力和高特异性的新型FXR配体。

通过AlphaScreen来筛选FXR的特异性配体，并检测FXR与辅激活因子或辅抑制因子的作用。检测发现ivermectin能够诱导FXR募集辅激活因子，如：SRC1，SRC2和SRC3，该能力略低于配体GW4064；相对于GW4064而言，FXR对于辅抑制因子也有一定的募集能力（图1）。因此，ivermectin作为FXR部分激活剂以一种独特方式发挥其调节功能。

为了证明ivermectin能够特异性的结合FXR，我们用FXR的内源报告基因EcRE和表达全长FXR的质粒共转染COS-7细胞。结果发现，在检测的不同核受体中，ivermectin只特异性激活了FXR的转录活性（图2）。这体现了ivermectin作为FXR配体的高特异性。

为了证明ivermectin激活FXR的转录活性的工作浓度，我们用表达全长FXR的质粒和EcRE报告基因共转染COS-7细胞，用不同浓度梯度的ivermectin处理转染后的细胞，检测FXR的转录活性。结果显示FXR的转录活性是和ivermectin的浓度成正相关的，当ivermectin浓度达到1uM时，FXR的转录活性达到饱和（图3）。而且从该结果可以看出，ivermectin对激活FXR转录活性的半数有效浓度与GW4064很接近，激活饱和浓度与GW4064相同，进一步表明了ivermectin对FXR的高亲和力。

实施例2，FXR/ivermectin复合物的晶体结构解析

为了从分子水平揭示ivermectin和FXR相互识别和结合的分子机制，我们解析了分辨率达

的FXR/ivermectin与辅抑制因子NcoR核受体结合基序形成复合物的晶体结构（附录1，图4）。结构显示ivermectin与FXR配体结合域的结合符合经典的“三明治”构象。从电子云图看，ivermectin清晰的存在与FXR的配体结合口袋（图5）。在复合物结构中，电子密度图不能清晰的看出FXR羧基末端AF-2的螺旋结构，是因为ivermectin的结合导致AF-2螺旋的不稳定性造成的（图4）。这从分子机制方面解释了ivermectin在诱导FXR转录活性和辅激活因子的能力方面要比合成的FXR的配体GW4064弱，同时ivermectin对辅抑制因子NcoR也有一定的募集能力的现象（图1），进一步说明ivermectin以一种的独特结合方式调节FXR的功能。FXR与ivermectin结合模式的具体信息见附录1。

实施例3，Ivermectin在FXR配体结合口袋中独特的结合位点

为了验证FXR配体结合口袋中与ivermectin直接结合的氨基酸位点，我们根据FXR与ivermectin复合体的结构对两者相互结合的关键位点进行了点突变，检测这些突变后的FXR收配体调节的转录活性以确定这些结合位点对于ivermectin结合的重要性。

A291对于FXR配体结合域大小的调节有着重要的作用。当把291位的丙氨酸（A）突变为色氨酸（W）时，由于色氨酸比丙氨酸大得多的侧链基团占据了配体结合口袋的空间，会导致FXR的配体结合口袋会变小，从而影响FXR配体的结合。与我们所期望的一致，报告基因分析实验结果表明，A291W的突变导致GW4064和ivermectin都不能激活FXR的转录活性（图6）。表明FXR的291位丙氨酸残疾对GW4064或ivermectin结合并激活FXR转录活性是极其关键的。

在疏水链上的284位苯丙氨酸（F）分别能够与GW4064和ivermectin形成疏水相互作用，从而稳定配体和受体的结合。当F284突变为组氨酸（H）时，这两种疏水相互作用就会消失。但是另一方面，对于GW4064而言，突变成组氨酸后可能形成氢键相互作用，因此，疏水相互作用的消失导致ivermectin不能激活FXR的转录活性，但GW4064的激活能力却没有受到影响（图6）。这说明ivermectin与FXR配体结合口袋的结合具有区别与GW4064的独特的结合方式。

另外，L287T和H447F的突变明显降低了GW4064介导的FXR的转录活性，但却显著地增加了ivermectin对FXR转录活性的激活（图6）。这也说明GW4064和ivermectin与FXR的结合方式有着很大的区别，说明对于FXR功能的调节也有明显的不同。

实施例4，Ivermectin通过FXR介导来调节糖类和脂类的代谢

FXR作为一种重要的核受体，它首先被作为胆酸的受体调节肝脏和小肠内胆汁酸的循环和平衡。近来发现，FXR能够调节生物体内糖类和脂类的代谢。合成的FXR配体GW4064能够通过FXR降低血糖、血脂和胆固醇的水平，能够缓解高血糖症和肥胖的症状，但由于GW4064的细胞毒性和药效限制性导致其不能临床使用；同时一些文章也提到GW4064对于机体的血糖没有明显的效果。因此，GW4064对血糖的调节尚存在争议。发现新的FXR的配体药物显得更加重要和有意义。

为了检测ivermectin对小鼠模型生理功能，我们采用野生型和FXR基因敲除小鼠进行试验。高脂饲料喂养的小鼠，两周腹腔注射对照和ivermectin后发现，ivermectin对小鼠的进食和体重没有影响(图11、12)。在野生型小鼠的肝脏中，ivermectin处理显著降低了血清中糖类和胆固醇水平，但在FXR敲除的小鼠中没有明显变化（图7和9）。在野生型小鼠的血清中，ivermectin处理显著降低了胰岛素的水平（图8），说明ivermectin可能通过增加胰岛素的敏感性达到了降血糖的效果。但是在FXR基因敲除小鼠中药物处理对胰岛素的水平没有显著变化，说明ivermectin调节血清中血糖、胰岛素和胆固醇是通过FXR进行的。另外，ivermectin也显著降低了野生型小鼠血清中甘油三酯（Tg）水平，虽然在FXR敲除小鼠中，ivermectin也明显降低了甘油三酯的水平，但在野生型小鼠中，这种程度降低幅度更大，显著性更强（图10），这说明ivermectin对于小鼠血清中甘油三酯水平的降低在一定的程度上部分依赖于FXR受体。通过荧光定量实时PCR检测配体药物处理过的小鼠肝脏糖、脂、胆固醇代谢相关基因的表达结果表明，ivermectin达到降血糖、血脂和胆固醇的生理功能与糖、脂、胆固醇代谢相关基因的表达调控一致(图13)，说明ivermectin通过FXR调节代谢相关基因的表达从而实现生理功能的调节。这些结果表明，ivermectin是FXR的特异性配体，同时证明ivermectin在体内生理功能的调节是通过FXR实现的。

实施例5，Ivermectin在糖尿病小鼠模型中的作用

既然ivermectin作为FXR的配体能够在正常小鼠的体内发挥重要的代谢调节功能，那么ivermectin是否能够对病理小鼠具有改善疗效？为了检测ivermectin在糖尿病肥胖症模型小鼠体内的药效，我们选择了KK-Ay小鼠作为实验对象。这种小鼠在8-10周左右表现出明显的高血糖和肥胖的症状。在实验中，我们用GW4064作为阳性对照。高脂饲料喂养下，十四天的腹腔注射后，ivermectin和GW4064都显著地降低了血清中胆固醇、甘油三酯和自由脂肪酸的含量（图18~20）；但在血糖方面，ivermectin显著降低了血清中糖和胰岛素的水平，表明ivermectin可能通过增加胰岛素的敏感性达到了降低血糖的效果，在这方面ivermectin作为FXR的配体的功能要显著优越于GW4064（图16~17）。另一方面，ivermectin处理的小鼠肝脏中糖、脂和胆固醇合成相关基因的表达显著下调，GW4064处理后大多数检测基因也达到了类似的效果，但是在很多基因尤其是胆固醇合成相关基因的表达调控中，GW4064的调控功能明显差于ivermectin（图21）。这些结果表明，ivermectin对糖尿病、肥胖症模型小鼠具有很好的平衡血糖、血脂和胆固醇的效果，而且相比合成的配体GW4064具有更优的功能和疗效。

实施例6，Ivermectin通过FXR介导抑制LPS诱导的炎症反应

近来一些报道证明，ivermectin能够抑制LPS诱导的炎症发应，并减少由于过量LPS诱导的小鼠的死亡。同时，ivermectin对于过敏性哮喘的治疗有明显的疗效，但其具体的作用机制还不清楚。为了证明ivermectin对于LPS诱导的炎症反应的抑制是否与FXR相关，我们用ivermectin和LPS处理野生型和FXR敲除的小鼠肝脏细胞。在野生型小鼠肝脏细胞中，ivermectin能够明显的抑制炎症因子的表达，例如：iNOS，TNFa，IL-6和MIP-1a（图22~25）；但在FXR敲除的小鼠肝脏细胞中没有明显的变化。同时，为了检测由ivermectin激活的FXR受体对于促进炎症基因表达的转录因子NF-κB的转录活性的影响，我们共转表达全长FXR和RXR的质粒、p65的质粒和NF-κB的两种内源报告基因。结果证明：在FXR/RXR存在的条件下，ivermectin能够明显地抑制p65的转录活性（图26和图27），进一步证明了ivermectin在抑制炎症反应功能方面是依赖于FXR进行的。

实施例7，基于FXR/ivermectin复合物结构的ivermectin衍生物药物设计

通过上述实施例发现，伊维菌素具有区别与抗寄生虫药物作用的完全不同的功能，可用于治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病的新用途。再根据对FXR与ivermectin相互结合的结构模式，以ivermectin作为一个安全的先导化合物，以ivermectin的分子结构为药物设计模板，以ivermectin和FXR受体的结合位点及其构效关系为依据，对ivermectin的某些基团进行适当的修饰，可能提高配体与受体结合的亲和力和特异性，而达到最佳的药物疗效，从而以最少的配体药物量，达到最佳的药物治疗效果，减少药物对细胞和机体的毒性。Ivermectin结构式如下：

以该结构式为结构基础，对该结构式中C3-C4，C8-C9，C10-C11，C14-C15碳碳双键进行改造；对C5、C7、C4”位羟基进行改造；对C4、C12、C14、C24、C25位的侧链进行改造；对C13位的糖基进行水解以及其他基团进行取代等改造方法。以上任何单一改造和不同方式改造的组合在制备治疗哺乳动物高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症等代谢相关疾病，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病中的应用。根据上述设计原则，阿维菌素和多拉克汀也是符合该原则的伊维菌素衍生物，发现阿维菌素和多拉克汀也是FXR的高亲和力特异性配体（图28），能诱导FXR特异性地募集多种辅调节因子（图29）。

附录1

Claims (3)

1.伊维菌素及其衍生物在制备用于治疗哺乳动物代谢相关疾病的药物，以及用于治疗法尼醇受体介导的胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、炎症、癌症的药物中的应用，所述伊维菌素的结构式为：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述代谢相关疾病包括高血糖、胰岛素抗性、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病或肥胖症。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述衍生物包括阿维菌素或多拉克汀。

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