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WO2013030620A2 - Gen codiert für ein mhc-klasse-i-molekül, plasmid, expressionssystem protein, multimer, reagenz und kit zum analysieren einer t-zellen-frequenz - Google Patents

Gen codiert für ein mhc-klasse-i-molekül, plasmid, expressionssystem protein, multimer, reagenz und kit zum analysieren einer t-zellen-frequenz Download PDF

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WO2013030620A2
WO2013030620A2 PCT/IB2011/003373 IB2011003373W WO2013030620A2 WO 2013030620 A2 WO2013030620 A2 WO 2013030620A2 IB 2011003373 W IB2011003373 W IB 2011003373W WO 2013030620 A2 WO2013030620 A2 WO 2013030620A2
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WO
WIPO (PCT)
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cell
peptide
mhc class
helix
reagent
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PCT/IB2011/003373
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WO2013030620A3 (de
Inventor
Sebastian SPRINGER
Martin ZACHARIAS
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Jacobs University gGmbH
Original Assignee
Jacobs University gGmbH
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Publication date
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Priority to US13/583,933 priority patent/US9494588B2/en
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Definitions

  • the invention relates to a gene encoded for an MHC class I molecule, a plasmid and an expression system which comprise the gene, and proteins and multimers which have been produced by means of the explosion system.
  • MHC class I molecules are transmembrane proteins of the cellular immune response, peptides from within the cell, such as from the cytosol or lumen of the endocytotic Organelles, bind and present on the cell surface cytotoxic T cells (CTL, cytotoxic T lymphocytes). This is the so-called Antigen sharingation.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • Binding of a T cell receptor of a CTL to a class I peptide complex of an antigen presenting cell will result (depending on the location of the response in the body, the type of APC (B cell, dendritic cell, etc .) and the activation state of the CTL) for activating the CTL and / or for inducing the cell death (apoptosis) of the APC by the CTL.
  • APC antigen presenting cell
  • the immune response is effective because the CTL, which react with self-peptides (which are produced from the body's own proteins), are eliminated in the thymus. Therefore, recognition of a peptide by the CTL implies that the APC produces foreign proteins derived from viruses or intracellular parasites (bacteria, protozoa); also overproduction of endogenous peptides into malignant degenerated tumor cells can lead to recognition reactions.
  • MHC class I molecules also plays a role in allergic reactions, rejection of transplants, and a number of autoimmune diseases such as multiple sclerosis and rheumatoid arthritis.
  • MHC class I molecules For the detection of such epitope-specific CTL, recombinant MHC class I molecules have been used, which are produced in bacteria and are present as insoluble inclusion bodies, which are present in a solution of a chotropotropic agent be denatured. The chaotrope is then removed in the presence of the desired peptide (e.g., by renaturation and refolding) and the peptide class I complex separated from the unfolded protein by gel filtration chromatography. Since the low affinity of a single class I peptide complex for a single T cell receptor does not result in a tight binding, multimers of class I peptide complexes are used which are sufficiently tight to the T cells due to the avidity effect.
  • Bind receptors of a T-cell in order to establish a permanent bond possible.
  • Such multimers are achieved, for example, by streptravidin-mediated tetramerization of biotinylated class I peptide complexes (class I tetramers) or by pentamerization by self-assembling coiled coil domain (class I pentamers).
  • Class I multimers are generally labeled with fluorescent dyes that allow their microscopic or flow cytometric detection. Thus, epitope-specific CTL can be stained directly.
  • the object of the invention is to improve the disadvantages of the prior art.
  • the object is achieved by a gene which is encoded for an MHC class I molecule, wherein the MHC class I molecule has an ALPHA-1 helix and an ALPHA-2 helix and thus encodes the gene is that a connection between the ALPHA-1 helix and the ALPHA-2 helix is formed in the MHC class I molecule.
  • a gene can advantageously be provided which forms such a compound.
  • a “gene” is a sequence of nucleotides that can be used to program cells (especially bacteria, yeast cells, insect cells, or mammalian cells) or a cell-free expression system that the "heavy chain" of a MHC class I molecule is synthesized.
  • genes are the gene sequence of murine MHC class I molecule H-2K b (atggtaccgtgcacgctgctcctgctgttggcggccgccctggctccgactcagacccgcgcgggcccacactcgctgag gtatttcgtcaccgccgtgtcccggcccggcctcggggagcccggtacatggaagtcggctacgtggacgacacggagtt cgtgcgcttcgacagcgcgcggagaatccgagatatgagccgcgggcgcggtggatggagcaggaggggcccgagtat tgggagcgggagacacagaaagccaagggcaatgagcagagtttccgagtggacctgggagc
  • MHC class I molecule is a major histocompatibility complex class I molecule, which are transmembrane proteins of the zullular immune response, which bind peptides from within the cell, such as from the cytosol or lumen of the endocytotic In addition, these present at the cell surface the cytotoxic T cells an antigen presentation.
  • MHC class I molecule to MHC class I molecules similar molecules that are encoded in the MHC and also bind peptides, such as for example, HLA-E and HLA-G.
  • This "antigen presentation" is - the delivery through the antigen-presenting cell - of a complex of MHC class I molecule and peptide on the cell surface for recognition by the T cell receptor of a CTL, and the cellular antigen Processes in the antigen-presenting cell that lead directly, eg, decomposition (proteolysis) of the cellular proteins, transport of the resulting peptides into the endoplasmic reticulum (a membrane-enclosed compartment within the cell), binding of the peptides to class I molecules, class I transporters -Peptide complexes to the cell surface.
  • the "ALPHA-1 helix” and the “ALPHA-2 helix” are helical structures of the MHC class I molecule, which are located substantially opposite to each other in the molecule and between which the binding site of the peptide is located.
  • the "compound” may in particular be designed as a covalent bond.
  • the distance of the ALPHA-1 helix and the ALPHA-2 helix is between 2 angstroms and 10 angstroms, especially between 2 angstroms and 5 angstroms, which span the junction.
  • the compound may be designed as a disulfide bridge.
  • bridges can also be formed by attaching amino acids with opposite side chains at opposite points on the ALPHA-1 and the ALPHA-2 helix, in particular negatively charged amino acids (aspartate, glutamate). on the one helix and positively charged amino acids (histidine, arginine, lysine) on the other helix, so that the opposite charges attract each other electrostatically.
  • the molecule has a placeholder for a peptide between the ALPHA-1 helix and the ALPHA-2 helix, and the compound keeps the placeholder free so that the peptide can be introduced into the placeholder.
  • the peptides listed here are in particular commercially available peptides, which are provided depending on the application, such as for the disease specifically to be investigated.
  • the object is achieved by a plasmid which has a previously described gene.
  • a plasmid can be provided which realizes transcription of the gene.
  • the object can be achieved by an expression system, wherein the expression system comprises the gene described above.
  • the expression system comprises a bacterial cell, in particular an Escherichia coli cell, a yeast cell, in particular Saccharomyces cerevisiae cell, an insect cell, in particular a Spodoptera Frugiperda cell, mammalian cell, in particular CHO cell, CHO being Chinese hamster ovary, a cell-free expression system, in particular as a reticulocyte lysate.
  • the expression system has several cells, in particular a number of cells of the order of 10 6 cells.
  • the object can be achieved by a protein which has been prepared by using the previously described expression system.
  • a signal generator can be arranged on the protein, wherein in particular the signal generator is a fluorescent dye.
  • the protein has an anchor element.
  • this anchoring element is a biotin molecule which is characterized by either a natural biotinylation sequence genetically encoded in the gene and a biotinylating enzyme, in particular BirA, or by chemical methods, in particular use of an N-hydroxy-succinimide derivative of biotin, on the protein is attached; or a polyhistidine or polyarginine sequence, in particular a hexahistidine sequence, which is genetically encoded in the gene.
  • the object can be achieved by a multimer, in particular a tetramer and / or a pentamer, which has at least two proteins, wherein at least one protein is a previously described protein.
  • a signal generator is arranged on the multimer, in particular signal generator is a fluorescent dye.
  • the multimer can have an anchor element.
  • these anchor elements as in the anchor elements for the peptides, more molecules can be coupled to the multimer or to the peptide, thus affecting physical, chemical or mechanical properties of the multimer or of the peptide.
  • the object is achieved by a reagent, in particular for diagnostic purposes, comprising a previously described protein or a previously described multimer and a peptide, in particular a commercially available peptide.
  • a reagent may be provided by controlling the peptide over which specific T-cell chip is to be analyzed.
  • a recording molecule has been created, in which the peptide is introduced.
  • the object may be achieved by a kit for analyzing a T cell frequency comprising a first storage means with a previously described protein and / or a previously described multimer and a second storage with a peptide, wherein the contents of the storage means are particularly merge manually.
  • the peptide may be a commercially available peptide.
  • the kit may also provide a number of different peptide choices. May the kit have MHC class I molecules with different alleles.
  • the object is achieved by a method for frequency analysis of T cells, the method comprising the steps of combining a previously described protein and / or a previously described multimer with a peptide, so that a Reagent, pooling the reagent with a cell sample so that the reagent complexes with specific elements of the cell sample.
  • the cell samples may include blood samples from humans, animals, especially mammals, to cartilaginous fish.
  • Complexation in this context means the specific binding of the reagent through interactions between the atomic elements of the reagent and the cell sample, especially ionic bonds, hydrophobic interactions, and hydrogen bonds.
  • the signal generator is detected.
  • the detection of the signal generator can be done inter alia by convection and microscopy.
  • the method may include the cell sample before the reagent is combined with the cell sample. be cleaned, this being done in particular by a density gradient centrifugation.
  • MHC class I molecules in particular alleles of the MHC class I molecules being determined. This determination is made, in particular, by the determination of the gene sequences for MHC class I molecules by polymerase chain reaction, in particular as described in US Pat. No. 5,452,512 "Methods and reagents for HLA class IA locus DNA typing", Raymond J. Apple et al US Pat. No. 5,5500,339, "Oligonucleotide primers for HLA class IB locus DNA typing," Elizabeth A. Trachtenberg.
  • the object can be achieved by a method of separating T cells from a cell sample, comprising the steps of combining a previously described peptide and / or a previously described multimer with a cell sample Peptide so that a reagent is formed by combining the reagent with a cell sample so that the reagent is combined with specific elements of the cell sample into a complex separating the complex, in particular by means of chromatographic methods.
  • Reagent and cell sample correspond to the definitions described above, after performing this method, both the separated T cells as a separation result and the rest of the cell sample of the previously presented cell sample is present.
  • the complex has an anchor element and the separation is carried out using the anchor element.
  • the retention rates can be influenced.
  • the object is achieved by a dialysis machine, which is set up so that the previously described separation result or the remainder described above is present.
  • FIGURE 1 shows a schematic spatial representation of an MHC class I molecule with introduced peptide.
  • the subject of the invention is a novel mutation in MHC class I molecules 100 which has not previously been described in the literature. It consists in the modification of amino acids 139 (usually alanine) on the one hand and either 84 or 85 (usually tyrosine) on the other hand. These amino acids are mutated by altering the gene sequence to cysteines.
  • the folding of the protein forms a disulfide bridge 110 between Cys-139 and Cys-84 and Cys-85.
  • This disulfide bridge 110 has a stabilizing effect on the ALPHA-1 helix 170 and the ALPHA-2 helix 150, so that no peptide 190 is required for the refolding of the protein in vitro, and the peptide-free class I molecule remains stable in solution.
  • the invention extends to the MHC class I alleles encoded in the gene loci for HLA-A, HLA-B and HLA-C. It also extends to class I-like molecules encoded in MHC that also bind peptides, ie HLA-E and HLA-G. [57]
  • the following applications can be realized with the invention: tetramers, pentamers, other oligomers for staining specific T cells. MHC oligomers for the isolation of CTL of specific specificities. Immobilization of the MHC monomers or oligomers on solid bodies (capsules or particles in the micro or nanometer size range) for the purpose of specific stimulation of the immune response
  • PCR polymerase chain reaction
  • the forward primer has the sequence 5 'xy 3', where x is the cut sequence of a restriction enzyme and y is the beginning of the gene of the class I molecule (20 base pairs).
  • the reverse primer has the sequence 5 'e-TTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGGGATCC-f 3', where e is the cut sequence of a restriction enzyme and f is a sequence that is complementary to the end of the gene of the class I molecule but does not include the stop codon.
  • the PCR product is cloned into an expression vector containing a T7 promoter, in particular by tailoring the ends of the PCR product with restriction enzymes and tailing the ends of the expression vector with restriction enzymes which produce tailed sequences to the ends of the PCR product and subsequent ligation of the PCR product into the expression vector using Enyzms ligase; or by cloning the PCR product into an expression vector using a commercially available PCR cloning kit, in particular a TOPO TA kit from Invitrogen, or a CloneJet kit from Fermentas. The sequence of the product is then verified by sequencing.
  • amino acid 139 is first mutated to a cysteine.
  • the plasmid remaining in the reaction mixture with the original sequence is decomposed with the aid of the restriction enzyme Dpn 1 and the reaction product is transformed into competent E.coh cells, in particular by production of competent cells by treatment of E. coli cells with dimethyl sulfoxide or with Calcium chloride, incubation of the treated cells with the expression plasmid, and selection of the cells thus transformed on agar plates to which the antibiotic is added, which is degraded by the enzyme which is encoded by the present on the expression plasmid resistance gene .. The sequence of the product then verified by sequencing. d) As a second step, either amino acid 84 or amino acid 85 is mutated to a cysteine.
  • the plasmid remaining with the original sequence is digested with the aid of the restriction enzyme DpnI, and the reaction product is transformed into competent E. coli cells, in particular by preparation of competent cells by treatment of E.coli cells with dimethyl sulfoxide or with calcium chloride, incubation of the treated Cells with the expression plasmid, and selection of the thus transformed cells on agar plates to which the antibiotic added is degraded by the enzyme encoded by the resistance gene present on the expression plasmid. The sequence of the product is then sequenced verified. 2) Preparation of the expression strain. a) The expression plasmid is in an ii.co/i-Expressionsstamm (eg
  • BL21DE3 (pLysS)), in particular by production of competent cells by treatment of E.coh cells with dimethyl sulfoxide or with calcium chloride, incubation of the treated cells with the expression plasmid, and selection of the thus transformed cells on agar plates to which the antibiotic has been added which is degraded by the enzyme encoded by the resistance gene present on the expression plasmid.
  • the expression strain is frozen as a liquid culture with 20% glycerol and can be stored at -80 ° C for several years. 3) Production of the class I protein.
  • the suspension is transferred to a 50 ml centrifuge tube and frozen in the freezer.
  • Cell lysis The centrifuge tube with the cell suspension is thawed in a 30 ° C. water bath with shaking. After thawing, work continues on ice or in the cold room.
  • Fragmentation of the DNA The suspension is sonicated with the probe of an ultrasound machine until it is no longer viscous.
  • the suspension is centrifuged (40,000 xg, 15 minutes, 4 ° C), the supernatant discarded, and the sediment resuspended by sonication in 20 ml of detergent buffer (25 wt .-% sucrose, 1 vol .-% Triton X-100, 5mM EDTA, 2mM DTT, 50mM Tris, pH 8.0).
  • the suspension is centrifuged (40,000 xg, 15 minutes, 4 ° C), the supernatant discarded, and the sediment resuspended by sonication in 20 ml urea buffer (2 M NaCl, 2 M urea, 2 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.4 ).
  • the sediment is again discarded and the clear solution filtered through a 0.22 ⁇ filter, aliquoted and stored at -20 ° C until further use.
  • the protein concentration is determined by measuring the absorbance at 280 nm against water.
  • the extinction coefficient ⁇ of a class I molecule under these conditions is about 85,000 M -1 .
  • Refolding the class I protein a) One liter of refolding buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M arginine, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidized glutathione, 5 mM reduced glutathione) is added Stir at 4 ° C dropwise with either 10 mg denatured 2m and 30 mg denatured heavy subunit or 20 mg of heavy and light chain fusion protein in denaturing solution. The solution is stirred for a further 12 hours.
  • refolding buffer 100 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M arginine, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidized glutathione, 5 mM reduced glutathione
  • the peak of the refolded class I molecule is identified by analyzing the samples with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: it contains both heavy and light chains and has an apparent molecular weight of about 60,000 Da. d) The respective fractions are united. The protein concentration is determined as above.
  • tetramerization is induced by the addition of 20 ⁇ fluorescently labeled avidin or streptavidin (eg phycoerythrin UltraAvidin, Leinco) and the reaction is incubated for 15 minutes at 4 ° C.
  • the tetramer complexes are purified by gel filtration with a Superdex S-200 column (equilibrated in TBS (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl)).
  • TBS 25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl
  • 200,000 isolated T cells (the number is determined using a Neugebauer counting chamber under the microscope) in 1 ml of FACS buffer (TBS plus 2% fetal calf serum and 5 mM NaN 3 ) with purified peptide-tetramer complex to a final concentration of 0.5 mg / ml. The reaction is incubated at 4 ° C for one hour.
  • the cells are centrifuged (800 xg, 5 minutes, 4 ° C) and the supernatant removed. The cells are washed twice with FACS buffer and then resuspended in fixation buffer (PBS, 2% paraformaldehyde).
  • fixation buffer PBS, 2% paraformaldehyde

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Abstract

Zum Nachweis Epitop- spezifischen CTL bedient man sich bisher rekombinanter MHC- Klasse-I-Moleküle, die in Bakterien hergestellt werden und als unlösliche Anschluss¬ körper vorliegen. Diese werden in einer Lösung eines chaotropen Agens zunächst dena- turiert. Das Chaotrop wird dann in Gegenwart des gewünschten Peptids entfernt (Rena¬ turierung, Rückfaltung) und der Peptid Klasse-I Komplex durch Gelfiltrationschroma¬ tographie von dem ungefalteten Protein getrennt. Das Herstellen dieser spezieller MHC-Klasse-I-Moleküle ist ein langwieriger und auf¬ wendiger Prozess, welcher nur in speziell dafür vorgesehenen Laboren von Fachleuten durchgeführt werden kann. Die Erfindung stellt ein Gen zum kodieren für eine MHC-Klasse-I-Molekül vor, wobei das MHC-Klasse-I-Molekül eine Alpha 1 Helix und eine Alpha 2 Helix aufweist und das Gen so kodiert ist, dass ein Verbindung zwischen der Alpha 1 Helix und der Alpha 2 Helix in dem MHC-Klasse-I-Molekül ausgebildet ist. Dadurch kann ein Kit zum Analysieren von T-Zellenfrequenzen bereitgestellt werden.

Description

Gen codiert für ein MHC-Klasse-I-Molekül, Plasmid, Expressionssystem, Protein, Multimer, Reagenz und Kit zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz
[01] Die Erfindung betrifft ein Gen codiert für ein MHC-Klasse-I-Molekül, ein Plasmid und ein Expressionssystem, welche das Gen aufweisen sowie Proteine und Multi- mere, welche mittels des Explosionssystems hergestellt wurden.
[02] MHC-Klasse I-Moleküle (Major Histocompatibility Complex Class I molecules, Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse I-Moleküle) sind Transmembranproteine der zellulären Immunantwort, die Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytotischen Organellen, binden und an der Zell- Oberfläche den zytotoxischen T-Zellen (CTL, cytotoxic T lymphocytes) präsentieren. Dies ist die sogenannte Antigenpräsentation.
[03] Die Bindung eines T-Zell-Rezeptors einer CTL an einen Klasse I-Peptid- Komplex einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) führt (abhängig vom Ort der Reaktion im Körper, dem Typ der APC (B-Zelle, dendritische Zelle, etc.) und dem Aktivie- rungszustand der CTL) zur Aktivation der CTL und/oder zur Induktion des Zelltods (Apoptose) der APC durch die CTL.
[04] Die Immunantwort ist effektiv, weil die CTL, die mit Selbst-Peptiden (die aus körpereigenen Proteinen erzeugt werden) reagieren, im Thymus eliminiert werden. Deswegen bedeutet die Erkennung eines Peptids durch die CTL, dass die APC fremde Proteine produziert, die von Viren oder intrazellulären Parasiten (Bakterien, Protozoen) stammen; auch Überproduktion endogener Peptide in maligne entarteten Tumorzellen kann zu Erkennungsreaktionen führen. Nahezu alle in der Zelle vorhandenen Proteine werden am Ende ihrer Lebensdauer in Peptide zersetzt, die dann im Endoplasmatischen Retikulum (einer membranumgrenzten Organelle im Zellinneren) an MHC-Klasse I- Moleküle binden; anschließend wird der Komplex aus Peptid und MHC-Klasse I- Molekül an die Zelloberfläche transportiert und steht dort für die Erkennung durch CTL zur Verfügung. Wenn nun aufgrund einer tumorigenen malignen Entartung neuartige oder mutierte Proteine produziert werden, oder wenn durch eine virale Infektion virale Proteine aus dem genetischen Material des Virus produziert werden, dann werden diese neuartigen' Proteine ebenfalls in Peptide zersetzt, die dann im Komplex mit MHC- Klasse I-Molekülen auf der Zelloberflüche präsentiert werden. Diese neuartigen' Peptide sind verschieden von den zelleigenen und lösen eine Erkennung durch die CTL aus.
[05] Präsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle spielt ebenfalls eine Rolle in allergischen Reaktionen, der Abstoßung von Transplantaten und einer Anzahl von Autoim- munkrankheiten wie multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis.
[06] Die Untersuchung der Immunantworten, die durch MHC-Klasse-I-Moleküle vermittelt werden, erfordert oft den Nachweis der CTL, die mit einem bestimmten Klasse I-Peptid-Komplex (Epitop) reagieren. Reaktionen auf ein einziges immuno dominantes Epitop machen oft 10-20% der gesamten T-Zell-Population in einem Organismus aus, und die Verfolgung der CTL-Frequenz erlaubt es daher, die Immunantwort (und z.B. Gelingen oder Fehlschlagen einer Therapie) genau zu verfolgen. Aus diesem Grund sind Reagenzien, die CTL identifizieren können, die ein bestimmtes definiertes Epitop erkennen, unabdingbar.
[07] Zum Nachweis solcher Epitop-spezifischen CTL bedient man sich bisher re- kombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, die in Bakterien hergestellt werden und als unlösliche Einschlusskörper (inclusion bodies) vorliegen, die in einer Lösung eines cha- otropen Agens zunächst denaturiert werden. Das Chaotrop wird dann in Gegenwart des gewünschten Peptids entfernt (bspw. Durch Renaturierung und Rückfaltung), und der Peptid-Klasse I-Komplex durch Gelfiltrationschromatographie von dem ungefalteten Protein getrennt. Da die niedrige Affinität eines einzelnen Klasse I-Peptid-Komplexes zu einem einzelnen T-Zell-Rezeptor nicht zu einer festen Bindung führt, verwendet man Multimere von Klasse I-Peptid-Komplexen, die aufgrund des Aviditätseffektes fest genug an die T-Zell-Rezeptoren einer T-Zelle binden, um eine dauerhafte Bindung zu er- möglichen. Solche Multimere werden z.B. durch Streptravidin vermittelte Tetramerisie- rung von biotinylierten Klasse-I-Peptid-Komplexen (class I tetramers) oder durch Pen- tamerisierung durch self-assembling coiled coil domain (class I pentamers) erreicht.
[08] Die Klasse-I-Multimere sind im Allgemeinen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die ihre mikroskopische oder durchflusszytometrische Detektion ermöglichen. So können epitop-spezifische CTL direkt angefärbt werden.
[09] Andere Anwendungen für rekombinante Klasse I-Peptid-Komplexe sind:
- In vitro - Selektion und Expansion monospezifischer T-Zellen zur Reinfusion bei Krebs und Viruskrankheiten. (Die Selektion kann durch Cytofluorimetrie (Durch- flusszytometrie) oder - für erhöhten Durchsatz - in Mikroarrays erfolgen)
- Ex vivo - Isolierung und Expansion von CTL zur adoptiven Therapie nach alloge- neischer Stammzell-Transplantation.
- Ex vivo - Entfernung von alloreaktiven T-Zellen nach Transplantation von peripheren Stammzellen. Ebenso interessant ist die Entfernung von autoreaktiven T- Zellen, die Typ I-Diabetes, Arthritis, und andere Autoimmun- Krankheiten hervorrufen, wie für MHC-Klasse II-Reagenzien bereits beschrieben. Der Gebrauch von isotopmarkierten Multimeren ist in US. Pat. US 2003/0228258 AI "Suicide tetramers and uses thereof ', David Scheinberg et al., beschrieben.
[10] Die Herstellung rekombinanter Klasse I-Peptid-Komplexe ist kompliziert und teuer. Zum einen existieren mehrere tausend MHC-Klasse-I-Allotypen (von denen allerdings bereits fünf Allele von HLA-A etwa 50% der Welt-Bevölkerung abdecken). Vor allem aber muss für jedes Peptid, das als Epitop untersucht werden soll, ein neues Multimer hergestellt werden, so dass für jeden Patienten oder für jedes Experiment neue Multimere erforderlich sind, die spezifisch hergestellt werden müssen. [11] Es wäre einfacher, die Multimere ohne die Peptide herzustellen und die jeweils erforderlichen Peptide dann je nach Bedarf zuzugeben, aber das ist bisher nicht möglich, weil die Rückfaltung der Klasse I-Moleküle ohne Peptid extrem ineffizient ist. In der Vergangenheit ist ein Ausweg beschrieben worden. Dabei wurde Gebrauch von einem lichtempfindlichen Peptid gemacht, welches durch UV-Bestrahlung oder Perio- dat- Behandlung zerfällt und dann durch ein zugegebenes Peptid ersetzt werden kann.
[12] Diese Methodologie ist aber immer noch teuer und funktioniert nicht mit allen Peptiden oder Klasse I-Molekülen.
[13] Die Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu verbessern.
[14] Gelöst wird die Aufgabe durch ein Gen, welches für ein MHC-Klasse-I-Molekül codiert ist, wobei das MHC-Klasse-I-Molekül eine ALPHA- 1 Helix und eine ALPHA-2 Helix aufweist und das Gen so codiert ist, dass eine Verbindung zwischen der ALPHA- 1 Helix und der ALPHA-2 Helix in dem MHC-Klasse-I-Molekül ausgebildet ist. Da- durch kann vorteilhafter Weise ein Gen bereitgestellt werden, welche eine solche Verbindung ausprägt.
[15] Dabei sei folgendes begrifflich erläutert:
[16] Ein„Gen" ist eine Sequenz von Nukleotiden, die verwendet werden kann, um Zellen (insbesondere Bakterien, Hefezellen, Insektenzellen, oder Säugerzellen) oder ein zellfreies Expressionssystem dahingend zu programmieren, dass die„schwere Kette" (heavy chain) eines MHC-Klasse I-Moleküls synthetisiert wird. Beispiele für solche Gene sind die Gensequenz des murinen MHC-Klasse I-Moleküls H-2Kb (atggtaccgtgcacgctgctcctgctgttggcggccgccctggctccgactcagacccgcgcgggcccacactcgctgag gtatttcgtcaccgccgtgtcccggcccggcctcggggagccccggtacatggaagtcggctacgtggacgacacggagtt cgtgcgcttcgacagcgacgcggagaatccgagatatgagccgcgggcgcggtggatggagcaggaggggcccgagtat tgggagcgggagacacagaaagccaagggcaatgagcagagtttccgagtggacctgaggaccctgctcggctactacaa ccagagcaagggcggctctcacactattcaggtgatctctggctgtgaagtggggtccgacgggcgactcctccgcgggtac cagcagtacgcctacgacggctgcgattacatcgccctgaacgaagacctgaaaacgtggacggcggcggacatggcggc gctgatcaccaaacacaagtgggagcaggctggtgaagcagagagactcagggcctacctggagggcacgtgcgtggagt ggctccgcagatacctgaagaacgggaacgcgacgctgctgcgcacagattccccaaaggcccatgtgacccatcacagc agacctgaagataaagtcaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgctgacatcaccctgacctggcagttgaatgg ggaggagctgatccaggacatggagcttgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcatctgtggt ggtgcctcttgggaaggagcagtattacacatgccatgtgtaccatcaggggctgcctgagcccctcaccctgagatgggag cctcctccatccactgtctccaacatggcgaccgttgctgttctggttgtccttggagctgcaatagtcactggagctgtggtggc ttttgtgatgaagatgagaaggagaaacacaggtggaaaaggaggggactatgctctggctccaggctcccagacctctgat ctgtctctcccagattgtaaagtgatggttcatgaccctcattctctagcgtga) und die Gensequenz des menschlichen MHC-Klasse I-Moleküls HLA-B*4402
(ATGCGGGTCACGGCGCCCCGAACCCTCCTCCTGCTGCTCTGGGGGGCAGTG GCCCTGACCGAGACCTGGGCCGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCG CC ATGTCCCGGCCC GGCCGCGGGGAGCCCCGC TTC ATC ACCGTGGGCT ACGT GGACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCACGAGTCCGAGGAA GGAGCCGCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACC GGGAGACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAACCTGC GCACCGCGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACATCATCC AGAGGATGTACGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGT ATGACCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACC TGAGCTCCTGGACCGCGGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGT GGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGGACAGAGCCTACCTGGAGGGCCTGT GCGTGGAGTCGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGC GCGCGGACCCCCCAAAGACACATGTGACCCACCACCCCATCTCTGACCATG AGGTCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACT GACCTGGC AGCGGGATGGCGAGG ACC A AACTC AGGAC ACCGAGCTTGTGGA GACCAGACCAGCAGGAGATAGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGT GCCTTCTGGAGAAGAGCAGAGATACACATGCCATGTACAGCATGAGGGGCT GCCGAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCGTCTTCCCAGTCCACCGTCCCC ATCGTGGGCATTGTTGCTGGCCTGGCTGTCCTAGCAGTTGTGGTCATCGGAG CTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGT AGGAGG AAGAGCTCAGGTGGAAAAGGAG GGAGCTACTCTCAGGCTGCGTGCAGCGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTC TCTCACAGCTTGA).
[17] Ein„MHC-Klasse-I-Molekül" ist ein Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse-I- Molekül, welche Transmembranproteine der zullulären Immunantwort sind. Diese binden Peptide aus dem Zellinnerem wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytotischen Organellen. Zudem präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen eine Antigenpräsentation. Zudem umfasst der Begriff MHC- Klasse-I-Molekül zu eigentlichen MHC-Klasse-I-Molekülen ähnlichen Moleküle, die im MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, wie beispielsweise HLA-E und HLA-G.
[18] Diese„Antigenpräsentation" ist - die Bereitstellung - durch die antigenpräsen- tierende Zelle - eines Komplexes aus MHC-Klasse I-Molekül und Peptid an der Zell- Oberfläche zwecks Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor einer CTL, und die zellulären Prozesse in der antigenpräsentierenden Zelle, die unmittelbar dazu führen, z.B. Zersetzung (Proteolyse) der zellulären Proteine, Transport der entstehenden Peptide ins Endoplasmatische Retikulum (ein membranumschlossenes Kompartiment innerhalb der Zelle), Bindung der Peptide an die Klasse I-Moleküle, TRansport der Klasse I-Peptid- Komplexe an die Zelloberfläche.
[19] Die„ALPHA- 1 Helix" und die„ALPHA-2 Helix" sind helixartigen Strukturen des MHC-Klasse-I-Moleküls, welche im Wesentlichen gegenüber in dem Molekül angeordnet sind und zwischen denen sich die Bindungsstelle des Peptids befindet.
[20] Die„Verbindung" kann insbesondere als eine kovalente Bindung ausgestaltet sein. [21] In einer weiteren Ausprägungsform ist der Abstand der ALPHA- 1 Helix und der ALPHA-2 Helix zwischen 2 Angström und 10 Angström, insbesondere zwischen 2 An- geström und 5 Angström, welche die Verbindung überbrücken.
[22] Somit kann gewährleistet werden, dass die ALPHA- 1 Helix und die ALPHA-2 Helix über die ausgebildete Verbindung aneinander gekoppelt sind. Dabei kann es vorteilhaft sein, wenn der Abstand möglichst gering ist.
[23] Um die größtmögliche Stabilität der verbundenen Struktur zu gewährleisten und gleichzeitig eine Herstellung des verbundenen Klasse I-Moleküls in Zellen zu ermöglichen, kann die Verbindung als eine Disulfidbrücke ausgestaltet sein. [24] Als Alternative für die Disulfidbrücke können auch Brücken ausgebildet werden, indem an gegenüberliegenden Stellen der ALPHA- 1 und der ALPHA-2-Helix Aminosäuren mit solchen Seitenketten angebracht sind, die entgegengesetzte Ladungen aufweisen, insbesondere negativ geladene Aminosäuren (Aspartat, Glutamat) auf der einen Helix und positiv geladene Aminosäuren (Histidin, Arginin, Lysin) auf der ande- ren Helix, solcherart dass die entgegengesetzten Ladungen einander elektrostatisch anziehen.
[25] In einer weiteren Ausprägungsform weist das Molekül einen Platzhalter für einen Peptid zwischen der ALPHA- 1 Helix und der ALPHA-2 Helix auf und die Verbindung hält den Platzhalter frei, sodass das Peptid in den Platzhalter einbringbar ist. [26] Die hier aufgeführten Peptide sind insbesondere käufliche Peptide, die je nach dem Anwendungsfall vorgesehen sind, wie beispielsweise für die speziell zu untersuchenden Krankheit.
[27] In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein Plasmid, welches ein zuvor beschriebenes Gen aufweist. Somit kann ein Plasmid bereit- gestellt werden, das eine Transkription des Gens realisiert. [28] Um ein Protein bereit zu stellen, kann in einem weiteren Aspekt der Erfindung die Aufgabe gelöst werden, durch ein Expressionssystem, wobei das Expressionssystem das zuvor beschriebene Gen aufweist.
[29] In einer diesbezüglichen Ausführungsform weist das Expressionssystem eine Bakterienzelle, insbesondere eine Escherichia coli-Zelle, eine Hefezelle, insbesondere Saccharomyces Cerevisiae-Zelle, eine Insektenzelle, insbesondere eine Spodoptera Frugiperda-Zelle, Säugerzelle, insbesondere CHO-Zelle, wobei CHO für Chinese hamster ovary steht, ein zellfreies Expressionssystem, insbesondere als Retikulozyten- Lysat aufweist. [30] Um ein möglichst hohe Ausbeute zu erhalten, weist das Expressionssystem mehrere Zellen auf, insbesondere eine Anzahl von Zellen in einer Größenordnung von 106 Zellen.
[31] In einer weiteren Ausprägung der Erfindung kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Protein, welches durch das Verwenden des zuvor beschriebenen Expressions- Systems hergestellt wurde.
[32] Um beispielsweise eine spezifische T-Zellenkonzentration in einer Probe zu bestimmen, kann an dem Protein ein Signalgeber angeordnet sein, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Somit können einfache Methoden zur Identifizierung bereitgestellt werden. [33] In einer diesbezüglichen Ausprägungsform weist das Protein ein Ankerelement auf.
[34] Dieses Ankerelement ist insbesondere ein Biotinmolekül, das entweder durch eine natürliche Biotinylierungssequenz, die in dem Gen genetisch kodiert ist, und ein biotinylierendes Enzym, insbesondere BirA, oder durch chemische Methoden, insbe- sondere Verwendung eines N-hydroxy-succinimid-Derivats von Biotin, an dem Protein angebracht wird; oder eine Polyhistidin-oder Polyarginin-Sequenz, insbesondere eine Hexahistidin- Sequenz, die in dem Gen genetisch kodiert ist.
[35] Um den Aviditätseffekt auszunutzen, kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Multimer, insbesondere ein Tetramer und/oder ein Pentamer, welches mindestens zwei Proteine aufweist, wobei mindestens ein Protein ein zuvor beschriebenes Protein ist.
[36] In einer diesbezüglichen Ausprägungsform ist an dem Multimer ein Signalgeber angeordnet, wobei insbesondere Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Somit wird abermals eine einfache Möglichkeit zur Detektion der T-Zellenkonzentration bereitgestellt. [37] Um das Multimer durch Filtration oder Chromatographie zurück zu erhalten, kann das Multimer ein Ankerelement aufweisen. Zudem können diese Ankerelemente, wie auch bei den Anker elementen für die Peptide, weitere Moleküle an das Multimer oder an das Peptid angekoppelt werden, um somit physikalisch, chemische oder mechanische Eigenschaften des Multimers oder des Peptids zu beeinflussen. [38] In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Reagenz, insbesondere zu diagnostischen Zwecken, umfassend ein zuvor beschriebenes Protein oder ein zuvor beschriebenes Multimer und ein Peptid, insbesondere ein käufliches Peptid. Somit kann ein Reagenz bereitgestellt werden, in dem über das Peptid gesteuert wird, welcher spezifische T-Zellchip analysierbar sein soll. Zudem ist durch das Multimer und das Protein ein Aufnahmemolekül geschaffen worden, in welches das Peptid einbringbar ist.
[39] Um im Arzte- oder Krankenhauslabor zügige Analysen in Bezug auf eine T- Zellkonzentration zur Verfügung zu stellen, kann in einem weiteren Aspekt der Erfindung die Aufgabe gelöst werden durch ein Kit, zum Analysieren einer T-Zellen- Frequenz umfassend ein erstes Aufbewahrungsmittel mit einem zuvor beschriebenen Protein und/oder einem zuvor beschriebenen Multimer und einem zweiten Aufbewah- rungsmittel mit einem Peptid, wobei die Inhalte der Aufbewahrungsmittel insbesondere händisch zusammenführbar sind. Auch in diesem Falle kann das Peptid ein käufliches Peptid sein.
[40] Weiterhin kann das Kit auch eine Reihe von verschiedener Peptidauswahl bereit stellen. Kann das Kit MHC-Klasse-I Moleküle mit unterchiedlichen Allelen aufweisen.
[41] In einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch ein Verfahren zur Frequenzanalyse von T-Zellen, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist ein Zusammenführen eines zuvor beschriebenen Proteins und/oder eines zuvor beschriebenen Multimers mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet, ein Zusammenführen des Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe komplexiert.
[42] Dabei können die Zellproben insbesondere Blutproben von Menschen, Tieren, insbesondere Säuger bis zum Knorpelfisch umfassen. [43] Komplexieren in diesem Zusammenhang bedeutet: die spezifische Bindung des Reagenz durch Wechselwirkungen zwischen den atomaren Elementen von Reagenz und Zellprobe, insbesondere ionische Bindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Was- serstoffbrücken.
[44] In einer diesbezüglichen Ausprägungsform des Verfahrens erfolgt nach dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe ein Detektieren des Signalgebers. Dabei kann das Detektieren des Signalgebers unter anderem mittels Durchilusszytometrie und Mikroskopie geschehen.
[45] Um ein schnelles und effektives Analyseergebnis zu erhalten, kann bei dem Verfahren vor dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe die Zellprobe aufge- reinigt werden, wobei dies insbesondere durch eine Dichtegradientenzetrifugation er- folgt.
[46] Um die unterschiedlichen Varianten der in der Probe vorliegenden MHC- Klasse-I-Moleküle zu bestimmen, kann anfänglich ein Bestimmen der MHC-Klasse-I- Moleküle erfolgen, wobei insbesondere Allele der MHC-Klasse-I- Moleküle bestimmt werden. Dieses Bestimmen erfolgt insbesondere durch die Bestimmung der Gensequenzen für MHC-Klasse I-Moleküle durch Polymerase-Kettenreaktion, insbesondere wie beschrieben in US Pat. 5451512„Methods and reagents for HLA class I A locus DNA typing ,„ Raymond J. Apple et al, und US Pat. 5550039,„ Oligonucleotide primers for HLA class I B locus DNA typing ,„ Elizabeth A. Trachtenberg.
[47] Um die T-Zellen als Trennergebnis einer Zellprobe zu erhalten, kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Verfahren zum Abtrennen von T-Zellen aus einer Zellprobe umfassend die Schritte ein Zusammenführen eines zuvor beschriebenen Peptids und/oder eines zuvor beschriebenen Multimers mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe zu einem Komplex zusammengefügt wird ein Abtrennen des Komplexes, insbesondere mittels chromatographischer Verfahren. [48] Reagenz und Zellprobe entsprechen den zuvor beschriebenen Definitionen, wobei nach Durchführung dieses Verfahrens sowohl die abgetrennten T-Zellen als Trenn- ergebnis als auch der Rest der Zellprobe der zuvor vorgelegten Zellprobe vorliegt.
[49] In einer besondere Ausprägungsform des Verfahrens weist der Komplex ein Ankerelement auf und das Abtrennen erfolgt unter einem Verwenden des Ankerele- ments. Somit können die Retentionsgeschwindigkeiten beeinflusst werden. [50] In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch eine Dialysemaschine, welche so eingerichtet ist, dass das zuvor beschriebene Trennergebnis oder der zuvor beschriebene Rest vorliegt.
[51] Im Weiteren wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Zuhil- fenahme der Figur 1 näher erläutert.
[52] Dabei zeigt die einzige Figur 1 eine schematische räumliche Abbildung eines MHC-Klasse-I Moleküls mit eingebrachten Peptid.
[53] Der Gegenstand der Erfindung ist eine neuartige Mutation in MHC-Klasse-I- Molekülen 100, die bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Sie besteht in der Veränderung der Aminosäuren 139 (gewöhnlich Alanin) einerseits und entweder 84 oder 85 (gewöhnlich Tyrosine) andererseits. Diese Aminosäuren werden durch Veränderung der Gensequenz zu Cysteinen mutiert.
[54] Dadurch bildet sich bei der Faltung des Proteins eine Disulfidbrücke 110 zwischen Cys- 139 und Cys-84 bzw. Cys-85. Diese Disulfidbrücke 110 wirkt stabilisierend auf die ALPHA- 1 Helix 170 und die ALPHA- 2 Helix 150, so dass für die Rückfaltung des Proteins in vitro kein Peptid 190 erforderlich ist, und das peptidfreie Klasse-I- Molekül in Lösung stabil bleibt.
[55] Dadurch können Klasse I-Oligomere ohne Peptid hergestellt und vertrieben werden. Wenn die Oligomere dann gebraucht werden sollen, kann das Peptid direkt zugegeben werden, und man erhält ein gebrauchsfertiges Klasse I-Oligomer-Reagenz mit entsprechendem Peptid. Die Spezifität dieser Disulfid-Oligomere für die T-Zell- Rezeptoren ist identisch der Spezifität der Wildtyp-Oligomere.
[56] Die Erfindung erstreckt sich auf die MHC-Klasse I-Allele, die in den Genloci für HLA-A, HLA-B und HLA-C kodiert sind. Sie erstreckt sich auch auf die Klasse I - ähnlichen Moleküle, die im MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, d.h. HLA- E und HLA-G. [57] Folgende Anwendungen sind mit der Erfindung realisierbar Tetramere, Penta- mere, andere Oligomere zur Färbung von spezifischen T-Zellen. MHC-Oligomere zur Isolierung von CTL bestimmter Spezifitäten. Immobilisierung der MHC-Monomere oder Oligomere auf festen Körpern (Kapseln oder Partikeln im Mikro- oder Nanometer- Größenbereich) zwecks spezifischer Stimulation der Immunantwort
Beschreibung der Herstellung eines MHC-Klasse I-Tetramers
1) Mutagenese. a) Zur Anbringung der Biotinylierungssequenz LAAIFEAQKIEWR an den C- Terminus des rekombinanten Proteins wird von einem Klasse I- Expressionsplasmid eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Der Vorwärtsprimer hat die Sequenz 5' x-y 3', wobei x die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und y den Beginn des Genes des Klasse I-Moleküls (20 Basenpaare) darstellt. Der Rückwärtsprimer hat die Sequenz 5' e-TTAACGAT- GATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGGGATCC-f 3', wobei e die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und f eine Sequenz darstellt, die komplementär zum Ende des Gens des Klasse I-Moleküls ist, aber das Stop-Codon nicht beinhaltet. b) Das PCR-Produkt wird in einen Expressionsvektor kloniert, der einen T7- Promoter enthält, insbesondere durch Zuschneiden der Enden des PCR-Produkts mit Restriktionsenzymen und Zuschneiden der Enden des Expressionsvektors mit Restriktionsenzymen, die zu den Enden des PCR-Produkts passende Überhangsequenzen erzeugen, und anschließende Ligation des PCR-Produkts in den Expressionsvektor mit Hilfe des Enyzms Ligase; oder durch Klonierung des PCR-Produkts in einen Expressionsvektor mit Hilfe eines handelsüblichen PCR- Klonierungskits, insbesondere einen TOPO TA Kit der Firma Invitrogen, oder einen CloneJet Kit der Firma Fermentas. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert. c) Um die Disulfid- Mutanten herzustellen, wird zunächst die Aminosäure 139 zu einem Cystein mutiert. Dies geschieht durch sog. QuikChange-Mutagenese (Kit, Stratagene; U.S. Patent No. 5,789,166, 5,932,419, 6,391,548, 7, 132,265, 7, 176,004, 5,286,632). Dabei wird das Expressionsplasmid durch zwei überlappende gegenläufige Primer (insbesondere für das murine MHC-Klasse I- Molekül H-2Db die Primer 5'-tgaaaacgtggacggcagctgacatgtgtgcgcagatcacccgac- 3' und 3'-acttttgcacctgccgtcgactgtacacacgcgtctagtgggctg-5'), die am Ort der erwünschten Mutation im Sinne der erwünschten Mutation von der ursprünglichen Gen-Sequenz abweichen, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion amplifi- ziert. Das im Reaktionsansatz verbleibende Plasmid mit der ursprünglichen Sequenz wird mit Hilfe des Restriktionsenzyms Dpn 1 zersetzt, und das Reaktionsprodukt wird in kompetente E.coh-Zellen transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E.coli - Zellen mit Di- methylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird.. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert. d) Als zweiten Schritt wird entweder die Aminosäure 84 oder die Aminosäure 85 zu einem Cystein mutiert. Dies geschieht durch sog. QuikChange-Mutagenese (Kit, Stratagene; U.S. Patent No. 5,789, 166, 5,932,419, 6,391,548, 7, 132,265, 7, 176,004, 5,286,632). Dabei wird das Expressionsplasmid durch zwei überlappende gegenläufige Primer (insbesondere für das murine MHC-Klasse I- Molekül H-2D und für die Mutation an Position 85 die Primer 5'- gcctgaggaacctcctaggctactgcaaccagagcgcg-3' und 5'- cgcgctctggttgcagtagcctaggaggttcctcaggc-3'), die am Ort der erwünschten Mutation im Sinne der erwünschten Mutation von der ursprünglichen Gen-Sequenz abweichen, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das im Re- aktionsansatz verbleibende Plasmid mit der ursprünglichen Sequenz wird mit Hilfe des Restriktionsenzyms Dpnl zersetzt, und das Reaktionsprodukt wird in kompetente E.coh -Zellen transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E.coh - Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressi- onsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird.. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert. 2) Herstellung des Expressionsstamms. a) Das Expressionsplasmid wird in einen ii.co/i-Expressionsstamm (z.B.
BL21DE3(pLysS)) transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E.coh - Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplas- mid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird. b) Der Expressionsstamm wird als Flüssigkultur mit 20% Glycerol eingefroren und ist bei -80 °C für mehrere Jahre lagerbar. 3) Produktion des Klasse-I-Proteins. a) 20 ml LB- Medium mit entsprechendem Antibiotikum (z.B. 100 μg/ml Ampicillin) werden mit 100 μΐ einer Vorkultur eines Expressionsstamms von Escherichia coli, der ein Plasmid mit einem Klasse-I-Gen (Disulfidmutante) trägt, inokuliert und bei 37 °C in einem Schüttelinkubator über Nacht bis zur stationären Phase angezogen. b) Die Kultur wird zentnfugiert (3000 x g, 10 Minuten, 25 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment (Zellen) zur Inokulation einer 1 -Liter- Kultur desselben Mediums verwendet. Die Kultur wird in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bis zu einer Extinktion von 0.4-0.5 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvetten- durchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys
10UV) gemessen wird, gezogen. c) Die Kultur wird mit Isopropyl-ß-D-l-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer finalen Konzentration von 0.5 mM versetzt und dann unter den gleichen Bedingungen bis zu einer Extinktion von 1.0 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvet- tendurchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys
10UV) gemessen wird, gezogen. d) Die Kultur wird zentnfugiert (13000 x g, 10 Minuten, 25 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment in 20 ml Saccharoselösung resuspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Phe- nylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 8.0). Dis Suspension wird in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert und im Gefrierschrank eingefroren. e) Zell-Lyse: Das Zentrifugenröhrchen mit der Zellsuspension wird im 30 °C- Wasserbad unter Schütteln aufgetaut. Nach dem Auftauen wird auf Eis oder im Kühlraum weitergearbeitet. f) Fragmentierung der DNA: Die Suspension wird mit der Sonde eines Ultraschallgeräts beschallt, solange bis sie nach Anschauung nicht mehr viskos ist. g) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 x g, 15 Minuten, 4 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Detergens-Puffer re- suspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 Vol.-% Triton X-100, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8.0). h) Die Suspension wird zentnfugiert (40000 x g, 15 Minuten, 4 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Harnstoffpuffer resuspendiert (2 M NaCl, 2 M Harnstoff, 2 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.4). i) Die Suspension wird zentnfugiert (40000 x g, 15 Minuten, 4 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml TBS resuspendiert (150 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 20 mM Tris pH 7.5). j) Die Suspension wird zentnfugiert (40000 x g, 15 Minuten, 4 °C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 10 ml Denaturierungslösung resuspendiert (8 M Harnstoff, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazin- ethansulfonsäure (HEPES), 100 μΜ ß-mercaptoethanol, pH 6.5), und die Suspension für 48 Stunden bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. k) Die Suspension wird zentnfugiert (40000 x g, 15 Minuten, 4 °C). Das Sediment wird verworfen und die Zentrifugation wiederholt. Das Sediment wird wiederum verworfen und die klare Lösung durch einen 0.22 μιη - Filter filtriert, aliquotiert und bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wird duch Messung der Extinktion bei 280 nm gegen Wasser bestimmt. Der Extinktionskoeffizient ε eines Klasse-I-Moleküls unter diesen Bedingungen beträgt etwa 85000 M' 1.
1) Auf die hier beschriebene Weise werden entweder die schwere Untereinheit von MHC Klasse I und die leichte Untereinheit (beta-2 microglobulin, p2t ) getrennt in zwei verschiedenen Ansätzen hergestellt (um später bei der Rückfaltung gemischt zu werden), oder ein Fusionsprotein aus der schweren und der leichten Kette wird entsprechend als einziges Protein hergestellt.
Rückfaltung des Klasse-I-Proteins. a) Ein Liter Rückfaltungspuffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M Arginin, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidiertes Glutathion, 5 mM reduziertes Glutathion) wird unter Rühren bei 4 °C tropfenweise mit entweder 10 mg denaturiertem 2m und 30 mg denaturierter schwerer Untereinheit oder mit 20 mg eines Fusionsproteins aus der schweren und der leichten Kette in Denaturierungslösung versetzt. Die Lösung wird 12 Stunden weiter gerührt. b) Die Lösung wird in einem Druckiiltrationsgerät auf etwa 100 ml und dann in einem zentrifugalen Konzentrationsgerät (Trenngrenze: 30000 Da) auf etwa 1 ml konzentriert und dann zentrifugiert (16000 x g, 4 °C, 15 min); das Sediment wird verworfen. c) Der Überstand wird filtriert (0.22 μιη) und auf eine in TBS (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl pH 7.5) äquilibrierte Gelfiltrationssäule (z.B. GE Healthcare HiLo- ad 16/60 Superdex 75 prep grade) aufgetragen. Der Peak des rückgefalteten Klasse I-Moleküls wird durch Analyse der Proben mit SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese identifiziert: er enthält sowohl schwere als auch leichte Kette und weist ein apparentes Molekulargewicht von etwa 60000 Da auf. d) Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.
Herstellung eines Klasse I-Tetramers. a) Rückgefaltete Klasse I-Proteine werden in einer Konzentration von 5 μΜ in Bio- tinylierungspuffer (50 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM Biotin; 5 mM Adenosintriphosphat; 5 mM MgC ) aufgenommen und mit 0.1 μΜ rekombinan- ten BirA-Biotinylierungsenzym versetzt. Die Reaktion wird für 12 Stunden bei 25 °C inkubiert. b) Die Tetramerisierung wird durch Zugabe von 20 μΜ fluoreszenzmarkiertem Avidin oder Streptavidin (z.B. phycoerythrin-UltraAvidin, Leinco) induziert, und die Reaktion wird für 15 Minuten bei 4 °C inkubiert. c) Die Tetramer-Komplexe werden durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl) äquilibriert) gereinigt. d) Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt. ) Zugabe des Peptids. a) Um ein peptidgebundenes Tetramer zu erhalten, wird eine Lösung des Tetramers in TBS mit 10 μΜ des entsprechenden Peptids versetzt. Die Reaktion wird bei 25 °C für 15 Minuten inkubiert. b) Falls erforderlich, werden die Peptid-Tetramer-Komplexe durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS äquilibriert) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt. ) Reaktion des Tetramers mit T-Zellen und Zytofluorimetrie. a) 200 000 isolierte T-Zellen (die Zahl wird mit Hilfe einer Neugebauer- Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt) werden in 1 ml FACS-Puffer (TBS plus 2% fötalem Kälberserum und 5 mM NaN3) mit gereinigtem Peptid- Tetramer-Komplex zu einer finalen Konzentration von 0.5 mg/ml versetzt. Die Reaktion wird bei 4 °C für eine Stunde inkubiert. b) Die Zellen werden zentrifugiert (800 x g, 5 Minuten, 4 °C) und der Überstand entfernt. Die Zellen werden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und dann in Fixierungspuffer (PBS, 2% Paraformaldehyd) resuspendiert. c) Zytofluorimetrie erfolgt mit einem handelsüblichen Gerät (z.B. BectonDickin- son FACSAria).

Claims

S chutz anspräche :
1. Gen, welches für ein MHC-Klasse-I Molekül codiert ist, wobei das MHC- Klasse-I Molekül eine ALPHA- 1 Helix und eine ALPHA-2 Helix aufweist und das Gen so codiert ist, dass eine Verbindung zwischen der ALPHA- 1 Helix und ALPHA-2 Helix in dem MHC-Klasse-I Molekül ausgebildet ist.
2. Gen nach Anspruch 1, wobei ein Abstand zwischen der ALPHA- 1 Helix und der ALPHA-2 Helix zwischen 2 und 10 Angström, insbesondere zwischen 2 und 5 Angström, durch die Verbindung überbrückt wird.
3. Gen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung Disulfidbrücke ist.
4. Gen, nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Molekül einen Platzhalter für ein Peptid zwischen der ALPHA- 1 Helix und der ALPHA-2 Helix aufweist und die Verbindung den Platzhalter freihält, sodass das Peptid in den Platzhalter einführbar ist.
5. Plasmid, welches ein Gen nach einem der vorherigen Ansprüche aufweist.
6. Plasmid nach Anspruch 5, wobei das so Plasmid ausgestaltet ist, dass eine Transkription des Gens realisierbar ist.
7. Expressionssystem, wobei das Expressionssystem das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist und das Expressionssystem ein Protein erzeugt.
8. Expressionssystem nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Bakterienzel- le, insbesondere eine E.Coli-Zelle, eine Hefezelle, insbesondere S.Cerevisiae-
Zelle, eine Insektenzelle, insbesondere S.Frugiperda-Zelle, Säugerzelle, insbesondere CHO-Zelle, ein zellfreies Expressionssystem, insbesondere als etiku- lozyten-Lysat ausgestaltet.
9. Expressionssystem, welches mehrere Zellen, insbesondere eine Anzahl von Zellen in einer Größenordnung von 10Λ6 Zellen, aufweist.
10. Protein, welches durch ein Verwenden des Expressionssystems nach einem der Ansprüche 7 bis 9 hergestellt ist.
11. Protein nach Anspruch 10, wobei an dem Protein ein Signalgeber angeordnet ist, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
12. Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei das Protein ein Ankerelement aufweist.
13. Multimer, insbesondere Tetramer und/oder Pentamer, welches mindestens zwei Proteine aufweist, wobei wenigstens ein Protein ein Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.
14. Multimer nach Anspruch 13, wobei an dem Multimer ein Signalgeber angeordnet ist, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
15. Multimer nach einem der Anspruch 13 oder 14, wobei das Multimer ein Ankerelement aufweist.
16. Reagenz, insbesondere zu diagnostischen Zwecken, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und ein Peptid, insbesondere ein käufliches Peptid.
17. Kit zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz umfassen einem ersten Aufbe- wahrungsmittel mit einem Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und einem zweiten Aufbe- wahrungsmittel mit einem Peptid, wobei die Inhalte der Aufbewahrungsmittel insbesondere händisch zusammenführbar sind.
18. Analyseergebnis erhaltend durch ein Verfahren zur Frequenzanalyse von T- Zellen, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist
- ein Zusammenführen eines Proteins nach Anspruch 10 und/oder eines Multimers nach Anspruch 11 mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet
- ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe komplexiert.
19. Analyseergebnis nach Anspruch 18, wobei nach dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe ein Detektieren des Signalgebers erfolgt, insbesondere durch eine Durchflusszytometrie.
20. Analyseergebnis nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Zellprobe vor dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe aufgereinigt wird, wobei dies insbesondere durch eine Dichtegradientenzetrifugation erfolgt.
21. Analyseergebnis nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei anfänglich ein Bestimmen der MHC-Klasse-I-Moleküle erfolgt, wobei insbesondere Allele der MHC-Klasse-I-Moleküle bestimmt werden.
22. Trennergebnis oder Rest erhaltend durch ein Verfahren zum Abtrennen von T- Zellen aus einer Zellprobe umfassend die Schritte
- ein Zusammenführen eines Peptids nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet
- ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe zu einem Komplex zusammenfügt wird, ein Abtrennen des Komplexes, insbesondere mittels chromatographischer Verfahren.
23. Trennergebnis oder Rest nach Anspruch 22, wobei der Komplex ein Ankerelement aufweist und das Abtrennen unter einem Verwenden des Ankerelements erfolgt.
24. Dialysemaschine, welche so eingerichtet ist, dass das Trennergebnis oder der Rest nach einem der Ansprüche 22 oder 23 vorliegt.
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