[go: up one dir, main page]

WO2013020663A1 - "laser-scanning-mikroskop mit einem beleuchtungsarray" - Google Patents

"laser-scanning-mikroskop mit einem beleuchtungsarray" Download PDF

Info

Publication number
WO2013020663A1
WO2013020663A1 PCT/EP2012/003254 EP2012003254W WO2013020663A1 WO 2013020663 A1 WO2013020663 A1 WO 2013020663A1 EP 2012003254 W EP2012003254 W EP 2012003254W WO 2013020663 A1 WO2013020663 A1 WO 2013020663A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
illumination
laser scanning
scanning microscope
light
lens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2012/003254
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Bathe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority to US14/127,544 priority Critical patent/US20140192406A1/en
Priority to JP2014523230A priority patent/JP6189839B2/ja
Publication of WO2013020663A1 publication Critical patent/WO2013020663A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G02B21/004—Scanning details, e.g. scanning stages fixed arrays, e.g. switchable aperture arrays

Definitions

  • the invention relates to a laser scanning microscope which simultaneously scans a sample with a plurality of spots and thus enables a shortened image acquisition time.
  • FIG. 5 shows an LSM beam path on the basis of the 2EISS LSM 710.
  • a confocal scanning microscope contains a laser module, which preferably consists of a plurality of laser beam sources that generate illumination light of different wavelengths.
  • a scanning device in which the illumination light is coupled as an illumination beam, has a main color splitter, an x-y scanner and a scanning objective and a microscope objective to guide the illumination beam by beam deflection over a sample which is located on a microscope stage of a microscope unit.
  • a measurement light beam coming from the sample generated thereby is directed via a main color splitter and imaging optics to at least one confocal detection aperture (detection pinhole) of at least one detection channel.
  • the light of two laser or laser groups LQ1 and LQ2 passes in FIG. 5 respectively via main color splitters HFT 1 and HFT 2 for the separation of the illumination and detection beam paths, which can be switchably configured as dichroic filter wheels and can also be exchangeable in order to flexibly select the wavelengths Design, initially via a scanner, preferably consisting of two independent galvanometric scanning mirrors for X and Y deflection, in the direction of a (not shown) scanning optics SCO and on this and the microscope objective O in the usual way to the sample.
  • the sample light passes in the return direction through the dividers HFT 1, HFT 2 in the direction of detection D.
  • the detection light passes first through a pinhole PH via a Pinholeoptik upstream and downstream Pinholeoptik PHO and a filter assembly F Narrow-band filtering unwanted radiation components, consisting for example of notch filters, and passes through a beam splitter BS, which optionally with appropriate circuit via a transmissive portion enables a coupling to external detection modules, a mirror M and other deflections on a grid G for spectral splitting of the detection radiation.
  • a beam splitter BS which optionally with appropriate circuit via a transmissive portion enables a coupling to external detection modules, a mirror M and other deflections on a grid G for spectral splitting of the detection radiation.
  • the divergent spectral components split by the grating G are collimated by means of an imaging mirror IM and pass in the direction of a detector arrangement consisting of individual PMT 1, PMT 2 in the edge region and a centrally arranged multichannel detector MPMT.
  • a lens L1 In front of a lens L1, there are two prisms P1, P2, which are displaceable perpendicular to the optical axis, in the edge region; which combine a part of the spectral components which are focused on the individual PMT 1 and 2 via the lens L1.
  • the remaining part of the detection radiation is collimated after passage through the plane of the PMT1 and 2 via a second lens L2 and spectrally separated directed to the individual detection channels of the MPMT.
  • a limiting factor of laser scanning microscopes is their scanning speed. With current systems can be scanned about 5-10 frames / s, under average conditions.
  • resonance scanner One approach for shortening the image acquisition time is the use of resonance scanner. With this principle, video rates can be achieved, however, resonance scanners have other disadvantages such as e.g. the fixed scanning frequency.
  • the pixel times at high scanning speeds must be very short, and thus the intensity in this time very high in order to detect enough light from the sample can.
  • LSM are generally limited in their speed with a spot.
  • Another approach is to use a "spinning disk” system (eg Zeiss Cell Observer SD) These systems use rotating disks with holes that serve as confocal pinholes, the number of holes can be very large, high image pickup is achievable
  • the flexibility is very low, for example, the hole size can not be adjusted, and all the benefits of an xy scanner such as variable image sizes and zoom factors are lost.
  • the detected light intensity is very low.
  • the object of the invention is to increase the scanning speed without these described disadvantages.
  • the invention presented below solves the problem of generating and detecting multiple spots for use in a conventional scanner.
  • the n-spot scan can reduce the image capture time to 1 / n of the time required by a single-spot scanner. Flexibility is limited only by a given grid of scan spots.
  • the core element for generating multiple spots is a lens array with n lenses.
  • a lens array is provided for filtering in the detection.
  • JP 1031 1950 A a microlens array is described which cooperates with a perforated plate as a "pinhole array”.
  • a lens array is now preferably located between the main color splitter and the scanner, but in any case in the common illumination / excitation and detection beam path.
  • n foci arise, corresponding to the number of n Lenses. All foci can be telecentrically illuminated, their main beam then runs parallel to the axis of the optical system.
  • multi-spot lens Through another lens (multi-spot lens) all Foki are collimated, at the same time the collimated rays are refracted towards the optical axis of the system. They meet - with telecentric illumination of the foci - in the rear focal point of the multi-spot lens.
  • the scanner of the system can be arranged.
  • the further arrangement corresponds to that of an ordinary LSM.
  • the intermediate image is mapped as usual via the lens into a sample.
  • fluorescent light is generated by the excitation in the sample.
  • This is - as usual - imaged by the lens in an intermediate image and descended by the scanner.
  • the multi-spot lens generates another intermediate image with separate detection spots. These spots are now individually displayed by the mini-lens array to infinity.
  • This single image now essentially produces collimated rays of all individual spots. They pass through the main color divider and are preferably imaged with a pinhole lens into a single pinhole.
  • all spots in the pinhole plane "collide" at different angles, making it possible to use a common pinhole for all the beams.
  • the pinhole can have an adjustable diameter, the diameter then acts practically on all the rays the same (the angles of the beams to each other are only small and the projected area is almost the same for all beams)
  • the detection is also possible with separate beam paths.
  • a pinhole lens array and a pinhole array are used instead of the pinhole lens and a single pinhole.
  • the advantage of this design is less crosstalk between the channels.
  • a slight disadvantage is the higher complexity, it is an additional lens array and in particular a pinhole array needed. All beam paths must be precisely coordinated so that all spots hit their pinholes centrically.
  • the relationship between spot size and distance can be freely determined by the size of the lenses of the lens array, their distance and their focal length.
  • the lens array may be interchangeable with another.
  • the lenses of the lens array must be as close as possible, because excitation light that hits into the areas between the lenses is not utilized.
  • the efficiency can be increased again up to the theoretical limit by an upstream telescope array in the excitation beam path.
  • a telescope array is introduced, which has a high filling factor on the input side, while at the same time reducing the spots.
  • beams are created at a distance. This distance is chosen according to the lens array. In some cases, a scan with fewer spots may be required.
  • the excitation beam path can be simply dimmed so that fewer miniature lenses are illuminated. The rest of the excitation light is then lost.
  • a better variant results from the use of a variable optics, which, for example, reduces the collimated excitation beam. This is advantageously achieved by introducing an alternating collimator.
  • a smaller lens generates, in exchange for the collimator lens, which expands the light from a cross-section that detects a plurality of individual lenses a beam that illuminates only one lens of the lens array. So only one spot is created, the whole system behaves like an ordinary LSM.
  • the excitation intensity of one spot can be n times larger. On the detection side, it is sufficient to read only the corresponding detector. The other detectors can still be read out with, for example, to obtain additional information about the thickness of the sample.
  • the production of the spots could also be shifted in the direction of illumination before the HFT. Detection side arise then separate foci, which can be discriminated with a pinhole array. Such a variant minimizes the components in the detection beam path and thus minimizes the detection light losses. However, complex components are required, the errors of the mini-lens array do not compensate because it is used only excitation side.
  • intermediate image For example: intermediate image
  • ZB1, ZB2 intermediate picture layers
  • PHA pinhole array
  • MLAPH Pinhole microlens array
  • the illumination light emerges divergently from a fiber F and collimated via a collimator KO, reflected by the main color splitter HFT of the microscope in the direction of the sample, onto a lens array LA.
  • the illumination spots generated by the LA in an intermediate image ZB1 are collimated via the multi-lens L and refracted towards the optical axis and meet with telecentric illumination in the rear focal point of L in which the scanner SC is seconded.
  • the foci generated in the intermediate image ZB2 after the scanning lens SCO are further imaged on the microscope objective O, not shown on the sample whereby the illumination points are moved on the sample by the at least one-dimensional scanner.
  • the light coming from the sample passes through the same elements in the direction of detection DE, which is shown in detail in part c) of the figure.
  • the illumination and detection beam path on the HFT can also be reversed so that the illumination light transmits through the HFT in the direction of the sample and the HFT reflects the sample light in the direction of the detection.
  • the individual illuminated sample points are corresponding detectors DE 1... N for detecting the fluorescence distribution generated on the sample.
  • a pinole array is used, which in turn is followed by a detector array DE1-n.
  • the fiber collimator KO is additionally followed by a telescope array consisting of two mini-lens arrays arranged one behind the other in front of the HFT for generating individual collimated beam bundles, which in turn pass via MLA in the direction of the sample.
  • a replacement unit AW shown in phantom is shown to pass between the collimator of Fig. 1 and a single lens to produce a single central beam in TA and LA only through a central axis and a respective lens and thereby generates a point illumination on the sample to be able to change.
  • the invention is not bound to the described embodiments but can be configured in a professional manner further advantageous.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Laser- Scanning-Mikroskop (LSM) bestehend aus mindestens einer Lichtquelle, von der ein Beleuchtungsstrahlengang in Richtung einer Probe ausgeht, mindestens einem Detektionsstrahlengang zur Übertragung von Probenlicht vorzugsweise Fluoreszenzlicht, auf eine Detektoranordnung, einem Hauptfarbteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, einem Mikrolinsenarray zur Erzeugung eines Lichtquellenrasters aus mindestens zwei Lichtquellen, einem Scanner zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Beleuchtungslicht und der Probe in mindestens einer Richtung, und einem Mikroskopobjektiv wobei das Linsenarray in einem gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang angeordnet ist.

Description

Titel: Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsarray
Die Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop, das mit mehreren Spots gleichzeitig eine Probe abrastert und so eine verkürzte Bildaufnahmezeit ermöglicht.
Ein derartiges Mikroskop ist beispielsweise in US 6028306 beschrieben.
Eine Einrichtung zur Mehrstahlerzeugung wurde beispielsweise in DE19904592 A1 beschrieben.
Fig.5 zeigt beispielhaft anhand des 2EISS LSM 710 einen LSM Strahlengang.
Es wird zusätzlich auf DE 19702753 A1 als Bestandteil der Offenbarung verwiesen die ausführlich einen weiteren LSM Strahlengang beschreibt.
Ein konfokales Scanmikroskop enthält ein Lasermodul, das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen besteht, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen. Eine Scaneinrichtung, in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler, einen x-y-Scanner und ein Scanobjektiv sowie ein Mikroskopobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über eine Probe zu führen, die sich auf einem Mikroskoptisch einer Mikroskopeinheit befindet. Ein dadurch erzeugter von der Probe kommender Messlichtstrahl wird über einen Hauptfarbteiler und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale Detektionsblende (Detektionspinhole) mindestens eines Detektionskanals gerichtet.
Das Licht zweier Laser oder Lasergruppen LQ1 und LQ2 gelangt in Fig.5 jeweils über Hauptfarbteiler HFT 1 und HFT 2 zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, die schaltbar als dichroitische Filterräder ausgebildet sein können und auch auswechselbar sein können um die Auswahl der Wellenlängen flexibel zu gestalten, zunächst über einen Scanner, bestehend vorzugsweise aus zwei unabhängigen galvanometrischen Scanspiegeln für die X - und Y Ablenkung, in Richtung einer (nicht dargestellten) Scanoptik SCO und über diese und das Mikroskopobjektiv O in üblicher Weise auf die Probe. Das Probenlicht gelangt in Rückrichtung durch die Teiler HFT 1 , HFT 2 hindurch in Richtung der Detektion D. Hier passiert das Detektionslicht zunächst ein Pinhole PH über eine dem Pinhole vor- und nachgeordnete Pinholeoptik PHO und eine Filteranordnung F zur schmalbandigen Ausfilterung unerwünschter Strahlungsanteile, bestehend beispielsweise aus Notchfiltern, und gelangt über einen Strahlteiler BS, der optional bei entsprechender Schaltung über einen transmissiven Anteil eine Auskopplung auf externe Detektionsmodule ermöglicht, einen Spiegel M sowie weitere Umlenkungen auf ein Gitter G zur spektralen Aufspaltung der Detektionsstrahlung.
Die vom Gitter G aufgespalteten divergenten Spektralanteile werden mittels eines abbildenden Spiegels IM kollimiert und gelangen in Richtung einer Detektoranordnung, die aus einzelnen PMT 1 , PMT2 im Randbereich und einem zentral angeordneten Mehrkanaldetektor MPMT besteht.
Anstelle des Mehrkanaldetektors kann auch ein weiterer Einzeldetektor verwendet werden.
Vor einer Linse L1 befinden sich zwei senkrecht zur optischen Achse verschiebbare Prismen P1 , P2 im Randbereich; die einen Teil der Spektralanteile vereinigendie über die Linse L1 auf die einzelnen PMT 1 und 2 fokussiert werden. Der restliche Teil der Detektionsstrahlung wird nach Durchgang durch die Ebene der PMT1 und 2 über eine zweite Linse L2 kollimiert und spektral separiert auf die einzelnen Detektionskanäle des MPMT gerichtet.
Durch Verschiebung der Prismen P1 , P2 kann in flexibler Weise eingestellt werden, welcher Teil des Probenlichtes über den MPMT spektral separiert detektiert wird und welcher Teil über die Prismen P1 , P2 zusammengefasst durch PMT1 und 2 detektiert wird.
Ein limitierender Faktor von Laser-Scanning-Mikroskopen ist deren Scangeschwindigkeit. Mit aktuellen Systemen können ca. 5-10 Bilder/s gescannt werden, unter durchschnittlichen Bedingungen.
Ein Ansatz zur Verkürzung der Bildaufnahmezeit liegt im Einsatz von Resonanzscanner. Mit diesem Prinzip lassen sich Videoraten erreichen, allerdings haben Resonanzscanner andere Nachteile wie z.B. die feste Scanfrequenz.
Ganz grundsätzlich müssen auch die Pixelzeiten bei hohen Scangeschwindigkeiten sehr kurz, und damit die Intensität in dieser Zeit sehr hoch werden um noch genügend Licht von der Probe detektieren zu können. Dadurch sind LSM mit einem Spot in ihrer Geschwindigkeit grundsätzlich limitiert. Ein anderer Ansatz besteht in der Verwendung eines„Spinning Disk" - Systems. (z.B. Cell Observer SD von Zeiss) Diese Systeme verwenden rotierende Scheiben mit Löchern, die als konfokale Pinholes dienen. Die Anzahl der Löcher kann sehr groß werden, hohe Bildaufnahmen sind erreichbar. Allerdings ist bei diesen Systemen die Flexibilität sehr gering, z.B. kann die Lochgröße nicht angepasst werden. Ebenfalls gehen alle Vorteile eines xy-Scanners verloren wie z.B. variable Bildgrößen und Zoomfaktoren.
Die detektierte Lichtintensität ist sehr gering.
Aufgabe der Erfindung ist es, ohne diese beschriebenen Nachteile die Scangeschwindigkeit zu erhöhen.
Beschreibung der Erfindung:
Die Aufgabe der Erfindung wird durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die nachfolgend dargestellte Erfindung löst das Problem der Erzeugung und Detektion mehrerer Spots zum Einsatz in einem konventionellen Scanner. Durch den Scan mit n Spots lässt sich die Bildaufnahmezeit auf 1/n der von einem Einzelspotscanner benötigten Zeit verkürzen. Die Flexibilität wird nur durch ein vorgegebenes Raster der Scanspots eingeschränkt.
Das Kernelement zur Erzeugung mehrerer Spots ist ein Linsenarray mit n Linsen.
In EP 785447 A2 ist ein Linsenarray zur Filterung in der Detektion vorgesehen.
In JP 1031 1950 A ist ein Mikrolinsenarray beschrieben das mit einer Lochplatte als „Pinhole - Array" zusammenwirkt.
In US 6028306 wird ebenfalls ein Pinhole- Array eingesetzt.
Erfindungsgemäß befindet sich nun ein Linsenenarray vorzugsweise zwischen Hauptfarbteiler und Scanner, auf jeden Fall aber im gemeinsamen Beleuchtungs/ Anregungs- und Detektionsstrahlengang.
Es wird mit einem großflächigen, vorzugsweise kollimierten Anregungsstrahl beleuchtet. Beleuchtungsseitig entstehen so n Foki, entsprechend der Anzahl der n Linsen. Alle Foki können telezentrisch beleuchtet werden, ihr Hauptstrahl verläuft dann parallel zur Achse des optischen Systems.
Durch eine weitere Linse (Multispotobjektiv) werden alle Foki kollimiert, gleichzeitig werden die kollimierten Strahlen zur optischen Achse des Systems hin gebrochen. Sie treffen sich - bei telezentrischer Beleuchtung der Foki - im rückwärtigen Brennpunkt des Multispotobjektivs.
In diesem Punkt lässt sich der Scanner des Systems anordnen. Die weitere Anordnung entspricht der eines gewöhnlichen LSM.
Dementsprechend folgt ein Scanobjektiv, das ein Zwischenbild erzeugt. Dieses enthält jetzt nicht mehr nur einen sondern n Spots anregungsseitig. Mit der Scannerauslenkung werden diese Spots gemeinsam im Zwischenbild bewegt.
Das Zwischenbild wird wie üblich über das Objektiv in eine Probe abgebildet.
In der Probe wird durch die Anregung insbesondere Fluoreszenzlicht erzeugt. Dieses wird - wie üblich - durch das Objektiv in ein Zwischenbild abgebildet und durch die Scanner descannt. Das Multispotobjektiv erzeugt ein weiteres Zwischenbild mit getrennten Detektionsspots. Diese Spots werden nun vom Minilinsenarray einzeln nach unendlich abgebildet.
Durch diese einzelne Abbildung entstehen nun im Wesentlichen kollimierte Strahlen aller Einzelspots. Sie passieren den Hauptfarbteiler und werden mit einem Pinhole- Objektiv vorzugsweise in ein einziges Pinhole abgebildet. Durch den zuvor parallelen Verlauf „treffen" sich alle Spots in der Pinhole-Ebene unter unterschiedlichen Winkeln. Dadurch wird es möglich, ein gemeinsames Pinhole für alle Strahlen zu verwenden. Das Pinhole kann einen einstellbaren Durchmesser besitzen, der Durchmesser wirkt dann auf alle Strahlen praktisch gleich. (Die Winkel der Strahlen zueinander sind nur gering und die projizierte Fläche ist für alle Strahlen fast gleich groß)
Nach dem Durchgang der Strahlen durch das Pinhole teilen sie sich wieder. Dies ermöglicht die getrennte Detektion aller Strahlen mit je einem eigenen Detektor.
Die wesentlichen Elemente und Vorteile der Erfindung sind:
• Die Erzeugung mehrerer Spots mit einem Linsenarray
• Die Benutzung desselben Linsenarrays zur parallelen Kollimation der Detektionsspots • Ein gemeinsames Pinhole für mehrere Detektionsspots unter Ausnutzung des zur Verfügung stehenden Raumwinkels
• Ein kleines Winkelspektrum auf dem Hauptfarbteiler durch Parallelisierung der Strahlen als Folge des eingesetzten des Minilinsenarrays, was die spektrale Flankensteilheit der Filter falls diese wie üblich dichroitisch sind, verbessert.
Die Detektion ist auch mit getrennten Strahlengängen möglich.
Anstelle des Pinhole-Objektivs und eines einzelnen Pinholes werden ein Pinhole- Linsenarray und ein Pinhple-Array eingesetzt. Der Vorteil dieser Ausführung ist ein geringeres Übersprechen zwischen den Kanälen. Ein leichter Nachteil ist der höhere Aufwand, es wird ein zusätzliches Linsenarray sowie insbesondere ein Pinhole-Array benötigt. Alle Strahlengänge müssen präzise aufeinander abgestimmt sein, damit alle Spots ihre Pinholes zentrisch treffen.
Das Verhältnis zwischen Spotgröße und Abstand lässt sich durch die Größe der Linsen des Linsenarrays, deren Abstand sowie deren Brennweite frei festlegen.
Vorteilhaft kann das Linsenarray gegen ein anderes austauschbar sein.
Zur Erreichung einer optimalen Anregungseffizienz müssen die Linsen des Linsenarrays möglichst dicht liegen, weil Anregungslicht, das in die Bereiche zwischen den Linsen trifft nicht verwertet wird.
uss der Füllfaktor niedrig sein, so kann durch ein vorgelagertes Teleskoparray im Anregungsstrahlengang die Effizienz wieder bis zum theoretischen Limit gesteigert werden. Dazu wird ein Teleskoparray eingeführt, das eingansseitig einen hohen Füllfaktor hat, dabei die Spots gleichzeitig verkleinert. Ausgangsseitig entstehen dann Strahlen mit Abstand. Dieser Abstand wird gemäß dem Linsenarray gewählt. In manchen Fällen mag ein Scan mit weniger Spots erforderlich sein. Prinzipiell lässt sich der Anregungsstrahlengang einfach abblenden, so dass weniger Minilinsen beleuchtet werden. Der Rest des Anregungslichtes ist dann verloren. Eine bessere Variante ergibt sich durch Verwendung einer variablen Optik, die z.B. den kollimierten Anregungsstrahl verkleinert. Dies wird vorteilhaft durch Einführung eines Wechselkollimators erreicht. Er enthält zwei Linsen, die beide das Licht aus der Faser kollimieren. Eine kleinere Linse erzeugt im Austausch zur Kollimatorlinse die das Licht aus einen Querschnitt aufweitet, die mehrere Einzellinsen erfasst, dabei ein Strahlenbündel, das nur eine Linse des Linsenarrays beleuchtet. So entsteht nur ein Spot, das gesamte System verhält sich nun wie ein gewöhnliches LSM. Die Anregungsintensität des einen Spots kann n mal größer sein. Detektionsseitig reicht es, nur den korrespondierenden Detektor auszulesen. Die anderen Detektoren können trotzdem mit ausgelesen werden, um z.B. zusätzliche Informationen über die Dicke der Probe zu erlangen.
Die Erzeugung der Spots könnte auch in Beleuchtungsrichtung vor dem HFT verlagert werden. Detektionsseitig entstehen dann getrennte Foki, die mit einem Pinhole-Array diskriminiert werden können. Eine solche Variante minimiert die Bauelemente im Detektionsstrahlengang und minimiert somit die Detektionslichtverluste. Es sind jedoch aufwändige Bauelemente erforderlich, die Fehler des Minilinsenarrays kompensieren sich nicht, weil es nur anregungsseitig verwendet wird.
Nachstehend werden die vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung anhand der Fig. 1-4 näher erläutert.
Folgende Bezugszeichen werden verwendet:
F: Faser
KO: Faserkollimatorlinse
Hft.: Hauptfarbteiler des Mikroskops
LA 1 ...n>: Linsenarray aus n Einzellinsen
L: Multispotlinse
SC: Scanner
SCO: Scanobjektiv
ZB: Zwischenbild
O: Mikroskopobjektiv
DE: Detektionsstrahlengang
PHO: Pinholeobjektiv
PH: Einzelpinhole
ZB1 , ZB2: Zwischenbildebenen
DE1..n: Detektorenarray aus n Einzeldetektoren
PHA: Pinholearray MLAPH: Pinhole- Mikrolinsenarray
MLT: Minilinsenteleskop
AW: Wechselkollimator
Den Abbildungen 1-4 gemeinsam ist dass jeweils im Teil a) die Beleuchtungsrichtung in Richtung der Probe, im Teil b) die Detektionsrichtung des Detektierten Probenlichtes und im Teil c) der Strahlengang vor dem Detektor dargestellt ist.
Die jeweils anhand der Abbildungen 1 a), 2a, 3a), 4a) anhand der Bezugszeichen dargestellten Elemente sind entsprechend ohne Bezugszeichen Bestandteil der Zeichnungen 1b, 2b, 3b und 4b.
Das Beleuchtungslicht tritt aus einer Faser F divergent aus und gelangt über einem Kollimator KO kollimiert, vom Hauptfarbteiler HFT des Mikroskops in Richtung der Probe reflektiert, auf ein Linsenarray LA. Die in einem Zwischenbild ZB1 vom LA erzeugten Beleuchtungsspots werden über die Multispotlinse L kollimiert und zur optischen Achse hin gebrochen und treffen sich bei telezentrischer Beleuchtung im rückwärtigen Brennpunkt von L in der der Scanner SC abgeordnet ist.
Die im Zwischenbild ZB2 nach den Scanobjektiv SCO erzeugten Foki werden weiter über das nicht dargestellte Mikroskopobjektiv O auf die Probe abgebildet wodurch durch den mindestens eindimensionalen Scanner die Beleuchtungspunkte auf der Probe bewegt werden.
Das von der Probe kommende Licht gelangt über dieselben Elemente in Richtung der Detektion DE, die jeweils im Teils c) der Abbildung im Detail dargestellt ist.
Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang am HFT können auch vertauscht sein so dass das Beleuchtungslicht durch den HFT transmittiert in Richtung der Probe gelangt und der HFT das Probenlicht in Richtung der Detektion ausspiegelt.
In Fig. 1c) werden die nach dem Durchgang durch LA kollimierten Einzelstrahlen von einem Pinholeobjektiv in der Ebene eines Pinholes gebündelt, es ist also nur ein einziges Pinhole erforderlich.
In der doppelten Brennweite des PHO liegen den einzelnen beleuchteten Probenpunkten entsprechende Detektoren DE 1...n zur Detektion der auf der Probe erzeugten Fluoreszenzverteilung. In Abb. 2c wird anstelle des Einzelpinholes in den Brennpunkten der Mikrolinsen des LA ein Pinolearray eingesetzt dem wiederum ein Detektorenarray DE1-n nachgeordnet ist.
In Fig. 3a ist dem Faserkollimator KO zusätzlich ein aus zwei hintereinander angeordneten Minilinsenarrays bestehendes Teleskoparray vor dem HFT zur Erzeugung einzelner kollimierter Strahlenbündel nachgeordnet die wiederum über MLA in Richtung Probe gelangen.
In Fig. 4a ist eine gestrichelt dargestellte Auswechseleinheit AW dargestellt um zwischen dem Kollimator aus Fig. 1 und einer Einfachlinse zur Erzeugung eines einzigen mittleren Strahles der in TA und LA nur durch eine Mittelachse und jeweils eine Linse hindurchgeht und dadurch eine Punktbeleuchtung auf der Probe erzeugt, wechseln zu können.
Hierdurch kann zwischen einem Einzelpunkt- LSM und einem Mehrpunkt- LSM auf einfache Weise umgeschaltet werden.
Die beschriebenen Ausführungen der Erfindung können in einen beliebigen LSM Strahlengang implementiert werden.
Beim Strahlengang gemäß Fig. 5 wäre dies nach einem der dargestellten Hauptfarbteiler HFT1 oder HFT 2 in Beleuchtungsrichtung vor dem Scanner denkbar.
Die Erfindung ist nicht an die beschriebenen Ausführungen gebunden sondern kann in fachmännischer Weise weiter vorteilhaft ausgestaltet werden.

Claims

Patentansprüche:
1.
Laser- Scanning- ikroskop (LSM)
bestehend aus
mindestens einer Lichtquelle, von der ein Beleuchtungsstrahlengang in Richtung einer Probe ausgeht,
mindestens einem Detektionsstrahlengang zur Übertragung von Probenlicht vorzugsweise Fluoreszenzlicht, auf eine Detektoranordnung,
einem Hauptfarbteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, einem Mikrolinsenarray zur Erzeugung eines Lichtquellenrasters aus mindestens zwei Lichtquellen,
einem Scanner zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Beleuchtungslicht und der Probe in mindestens einer Richtung,
einem Mikroskopobjektiv
dadurch gekennzeichnet dass
das Linsenarray in einem gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang angeordnet ist.
2.
Laser- Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass das Linsenarray zwischen dem Hauptfarbteiler und dem Scanner angeordnet ist.
3.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
in Beleuchtungsrichtung dem Linsenarray eine Optik zur Erzeugung eines aufgeweiteten, vorzugsweise kollimierten Lichtstrahls vorgeordnet ist der in seinem Querschnitt mehrere Linsen des Linsenarrays erfasst.
4.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass eine Übertragungsoptik zur Übertragung der von den Minilinsen aus dem aufgeweiteten Lichtstrahl erzeugten Beleuchtungspunkte über den Scanner und eine Scanoptik in ein Zwischenbild vor dem Mikroskopobjektiv vorgesehen ist.
5.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
in Detektionsrichtung die durch das Minilinsenarray kollimierten Einzelstrahlen aus vom Beleuchtungsraster durch Anregung, Streuung und/ oder Reflektion erzeugtem Probenlicht über eine Pinholeoptik in ein einzelnes Pinhole fokussiert sind.
6.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
in Detektionsrichtung die durch das Linsenarray kollimierten Einzelstrahlen über eine zweite Linsenanordnung einzeln auf Pinholes eines Pinholerasters fokussiert sind.
7.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
dem Pinhole eine Detektoranordnung nachgeordnet ist
die jedem Einzelstrahl einen Detektor zuordnet.
8.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
in Beleuchtungsrichtung vor dem Pinholearray und vorzugsweise vor dem HFT eine dritte Linsenanordnung zur Erzeugung von kollimierten Einzelstahlen
vorgesehen ist, die auf die Einzellinsen des Linsanarrays auftreffen.
9.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
die dritte Linsenanordnung aus zwei Linsenrastern besteht, die einen teleskopischen Strahlengang von Einzelstrahlen erzeugen.
10.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet dass
in der Beleuchtung eine Umschalteinheit zur Umschaltung zwischen Einzelpunktbeleuchtung und einer Mehrpunktbeleuchtung vorgesehen ist.
PCT/EP2012/003254 2011-08-06 2012-07-31 "laser-scanning-mikroskop mit einem beleuchtungsarray" Ceased WO2013020663A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/127,544 US20140192406A1 (en) 2011-08-06 2012-07-31 Laser scanning microscope having an illumination array
JP2014523230A JP6189839B2 (ja) 2011-08-06 2012-07-31 照明アレイを備えるレーザ走査顕微鏡

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011109653.5 2011-08-06
DE102011109653.5A DE102011109653B4 (de) 2011-08-06 2011-08-06 Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsarray

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013020663A1 true WO2013020663A1 (de) 2013-02-14

Family

ID=46690465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2012/003254 Ceased WO2013020663A1 (de) 2011-08-06 2012-07-31 "laser-scanning-mikroskop mit einem beleuchtungsarray"

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20140192406A1 (de)
JP (1) JP6189839B2 (de)
DE (1) DE102011109653B4 (de)
WO (1) WO2013020663A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015092027A1 (de) * 2013-12-19 2015-06-25 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mehrfarben-scanning-mikroskop
WO2021140052A1 (de) * 2020-01-09 2021-07-15 Hochschule für angewandte Wissenschaften Kempten Körperschaft des öffentlichen Rechts Konfokale messvorrichtung zur 3d-vermessung einer objektoberfläche

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013018672B4 (de) * 2013-11-07 2024-05-08 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Multispot-scanning mikroskop
WO2015164844A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Vutara, Inc. Super resolution microscopy
JP2016218282A (ja) * 2015-05-21 2016-12-22 国立研究開発法人産業技術総合研究所 微粒子配列の作成および配向制御方法
DE102015217908A1 (de) * 2015-09-18 2017-03-23 Robert Bosch Gmbh Lidarsensor
DE102016110433B4 (de) * 2016-06-06 2022-01-27 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Mikroskopieverfahren
JP2020502558A (ja) 2016-11-10 2020-01-23 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 大型試料のための高速・高解像度イメージング方法
GB201711699D0 (en) * 2017-07-20 2017-09-06 Univ Bristol Microfluidics analysis system
CN109212687B (zh) * 2018-10-22 2021-09-21 武汉锐奥特科技有限公司 一种光路控制系统及其光模块
DE102019129932B4 (de) * 2019-11-06 2023-12-21 Technische Universität Braunschweig Optische Detektionseinrichtung und Verfahren zum Betreiben einer optischen Detektionseinrichtung
CN110967817A (zh) * 2019-11-29 2020-04-07 哈尔滨工业大学 基于双微透镜阵列的图像扫描显微成像方法与装置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0785447A2 (de) 1996-01-19 1997-07-23 Dainippon Screen Mfg. Co., Ltd. Bildaufnahmevorrichtung, System zur Messung der optischen Dichte und optisches Abtastmikroskop
DE19702753A1 (de) 1997-01-27 1998-07-30 Zeiss Carl Jena Gmbh Laser-Scanning-Mikroskop
JPH10311950A (ja) 1997-05-14 1998-11-24 Olympus Optical Co Ltd 走査型顕微鏡
DE19904592A1 (de) 1999-02-05 2000-09-28 Lavision Gmbh Optische Vorrichtung
US6288382B1 (en) * 1998-12-17 2001-09-11 Takaoka Electric Mfg. Co., Ltd. Micro-scanning multislit confocal image acquisition apparatus
DE10127137A1 (de) * 2001-06-02 2002-12-19 Leica Microsystems Verfahren zur Scanmikroskopie und Scanmikroskop
WO2003069391A1 (de) * 2002-02-14 2003-08-21 Carl Zeiss Microelectronic Systems Gmbh Vorrichtung zur konfokalen optischen mikroanalyse
US20050094261A1 (en) * 2002-05-03 2005-05-05 Stefan Hell Confocal microscope comprising two microlens arrays and a pinhole diaphragm array

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3576685B2 (ja) * 1996-02-07 2004-10-13 キヤノン株式会社 露光装置及びそれを用いたデバイスの製造方法
US6639201B2 (en) * 2001-11-07 2003-10-28 Applied Materials, Inc. Spot grid array imaging system
EP2075615B1 (de) * 2006-10-19 2016-07-20 Olympus Corporation Mikroskop
JP5558162B2 (ja) * 2010-03-29 2014-07-23 オリンパス株式会社 落射蛍光照明装置、及び、それを用いた蛍光顕微鏡

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0785447A2 (de) 1996-01-19 1997-07-23 Dainippon Screen Mfg. Co., Ltd. Bildaufnahmevorrichtung, System zur Messung der optischen Dichte und optisches Abtastmikroskop
DE19702753A1 (de) 1997-01-27 1998-07-30 Zeiss Carl Jena Gmbh Laser-Scanning-Mikroskop
JPH10311950A (ja) 1997-05-14 1998-11-24 Olympus Optical Co Ltd 走査型顕微鏡
US6028306A (en) 1997-05-14 2000-02-22 Olympus Optical Co., Ltd. Scanning microscope
US6288382B1 (en) * 1998-12-17 2001-09-11 Takaoka Electric Mfg. Co., Ltd. Micro-scanning multislit confocal image acquisition apparatus
DE19904592A1 (de) 1999-02-05 2000-09-28 Lavision Gmbh Optische Vorrichtung
DE10127137A1 (de) * 2001-06-02 2002-12-19 Leica Microsystems Verfahren zur Scanmikroskopie und Scanmikroskop
WO2003069391A1 (de) * 2002-02-14 2003-08-21 Carl Zeiss Microelectronic Systems Gmbh Vorrichtung zur konfokalen optischen mikroanalyse
US20050094261A1 (en) * 2002-05-03 2005-05-05 Stefan Hell Confocal microscope comprising two microlens arrays and a pinhole diaphragm array

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015092027A1 (de) * 2013-12-19 2015-06-25 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mehrfarben-scanning-mikroskop
JP2017502344A (ja) * 2013-12-19 2017-01-19 カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｍｂｈ 多色走査型顕微鏡
US10502940B2 (en) 2013-12-19 2019-12-10 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Multi-color scanning microscope
WO2021140052A1 (de) * 2020-01-09 2021-07-15 Hochschule für angewandte Wissenschaften Kempten Körperschaft des öffentlichen Rechts Konfokale messvorrichtung zur 3d-vermessung einer objektoberfläche
US12235094B2 (en) 2020-01-09 2025-02-25 Hochschule für angewandte Wissenschaften Kempten Körperschaft des öffentlichen Rechts Confocal measuring apparatus for 3D measurement of an object surface

Also Published As

Publication number Publication date
DE102011109653A1 (de) 2013-02-07
DE102011109653B4 (de) 2021-11-25
US20140192406A1 (en) 2014-07-10
JP2014524589A (ja) 2014-09-22
JP6189839B2 (ja) 2017-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102011109653B4 (de) Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsarray
EP3526634B1 (de) Optikgruppe für detektionslicht für ein mikroskop, verfahren zur mikroskopie und mikroskop
DE10004191B4 (de) Fluoreszenz-Scanmikroskop
DE102010060121B4 (de) SPIM-Mikroskop mit sequenziellem Lightsheet
DE102013015931B4 (de) Mikroskop und Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskope
EP3033646B1 (de) Hochauflösende scanning-mikroskopie
DE102013001238B4 (de) Lichtmikroskop und Mikroskopieverfahren
EP2860567B1 (de) Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
EP2904442B1 (de) Konfokales mikroskop mit frei einstellbarer probenabtastung
DE102020209889A1 (de) Mikroskop und Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme mit variabler Beleuchtung
EP2825908A1 (de) Hochauflösende scanning-mikroskopie
EP0011709A2 (de) Lichtleiteinrichtung zur Auflichtbeleuchtung
DE102015112960B3 (de) Vorrichtung für die konfokale Beleuchtung einer Probe
DE102012017917A1 (de) Mikroskopmodul und Lichtmikroskop
DE3328821C2 (de) Autofokus für Mikroskope
DE102016000415A1 (de) Vorrichtung zum dreidimensionalen Erfassen einer Oberflächenstruktur
DE102016116309A1 (de) Beleuchtungsmodul für winkelselektive Beleuchtung
EP3440498A1 (de) Mehrwege-prisma
DE102008062791A1 (de) Mikroskop
WO2005033767A1 (de) Konfokales laser-scanning-mikroskop
DE102023005252A1 (de) Mikroskop mit schneller quasikonfokaler Detektion
EP3440492B1 (de) Verfahren und mikroskop zum untersuchen einer probe
DE102012101344A1 (de) Optisches Rastermikroskop mit zwei Scaneinheiten
DE10206004A1 (de) Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse
WO2008043459A2 (de) Anordnung zur aufteilung von detektionslicht

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12748164

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014523230

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14127544

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12748164

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1