DE102023005252A1

DE102023005252A1 - Mikroskop mit schneller quasikonfokaler Detektion

Info

Publication number: DE102023005252A1
Application number: DE102023005252.3A
Authority: DE
Inventors: Tiemo Anhut; Daniel Schwedt; Matthias Wald
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2023-12-19
Filing date: 2023-12-19
Publication date: 2025-06-26
Also published as: CN120178490A; US20250208396A1

Abstract

2.1. Die simultane Aufnahme mehrerer Bilder im Mikroskop soll mit größerer Flexibilität ermöglicht werden. Darüber hinaus soll die simultane Aufnahme mit geringerem Aufwand ermöglicht werden.
2.2. In einem Mikroskop (1) mit einem Hauptstrahlteiler (22) und einer einstellbaren Strahlablenkeinheit (21) zum Bewegen des Beleuchtungslichts durch den Probenraum (P) wird zu diesem Zweck die Strahlablenkeinheit (21) optisch zwischen der Lichtquelle (12) und dem Hauptstrahlteiler (22) angeordnet, so dass das Probenlicht abseits der Strahlablenkeinheit (21) zum Sensor (28) gelangt, wobei dass sowohl das Beleuchtungslicht als auch das Probenlicht durch dasselbe Zwischenbild (ZB) verlaufen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektionsstrahlengang und einem Hauptstrahlteiler, wobei der Detektionsstrahlengang einen Probenraum, ein Mikroskopobjektiv, eine Tubuslinse, ein durch die Tubuslinse erzeugtes Zwischenbild und einen zweidimensional ortsauflösenden optoelektronischen Sensor mit einer Detektionsoptik zum Abbilden des Zwischenbilds auf den Sensor aufweist und wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine Lichtquelle und eine einstellbare Strahlablenkeinheit zum Bewegen („Abtasten“, „Rastern“) des Beleuchtungslichts durch den Probenraum aufweist, wobei der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang mittels des Hauptstrahlteilers optisch derart zu einem gemeinsamen Strahlengang gekoppelt sind, dass Beleuchtungslicht von der Lichtquelle über den Hauptstrahlteiler durch das Mikroskopobjektiv in den Probenraum gelangt und Probenlicht aus dem Probenraum durch das Mikroskopobjektiv über den Hauptstrahlteiler zum Sensor gelangt.
Die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung liefert kontrastreiche, hochaufgelöste Bilder biologischer Proben. Dabei wird die Probe wie in DE 197 02 753 A1 mittels Laserbeleuchtung punktweise abgetastet und das erzeugte Fluoreszenzlicht konfokal durch eine Lochblende (engl. „pinhole“) detektiert. Durch diese Blende wird außerfokales Licht höchst effektiv abgeblendet, was den hohen Kontrast bewirkt. Nachteilig ist allerdings die vergleichsweise hohe Aufnahmedauer durch das punktweise Abtasten. Dabei kommt es zwangsläufig auch zu einer hohen phototoxischen Probenbelastung durch das Anregungslicht.
Die Nachteile der punktweisen Bildgebung können durch eine Parallelisierung reduziert werden. Beispiele hierfür sind Konfokalmikroskope mit Nipkow-Scheibe und Lichtblattmikroskope, wobei letztere eine zusätzliche Beleuchtungsoptik benötigen. Eine Parallelisierung kann alternativ über eine linienförmige Beleuchtung erfolgen wie in EP 1 617 258 A1 . Um Konfokalität wenigstens in einer Dimension (quer zur Linie) zu erreichen, ist hier außerdem eine linienförmige Detektion mit einer Schlitzblende notwendig.
Anstelle einer mechanischen Schlitzblende kann ein Sensor mit elektronischer Schlitzblende, insbesondere in Form eines rollierenden Verschlusses (engl. „rolling shutter“), verwendet werden, mit dem die Strahlablenkeinheit synchronisiert wird. Solche elektronischen Schlitzblenden sind beispielsweise bekannt aus „Virtual slit scanning microscopy" von R. Fiolka et al. in „Histochemistry and Cell Biology", Band 128 (6), 2007 (DOI 10.1007/s00418-007-0342-2) und aus „Inexpensive and Flexible Slit-Scanning Confocal Imaging Using a Rolling Electronic Aperture" von M. S. Muller et al. in „Microscopy Instrument and Software Developments (FWW)" auf der Konferenz „Frontiers in Optics 2008" (DOl 10.1364/FIO.2008.FWW2). Das Probenlicht gelangt abseits der Strahlablenkeinheit zum Sensor, was als nichtenttastete (engl. „non-descanned“) Detektion bezeichnet werden kann.
Zur weiteren Parallelisierung kann das Probenlicht wie in DE 10 2021 134 427 A1 mittels Strahlteilern so aufgeteilt werden, dass unterschiedliche Probenebenen oder unterschiedliche Spektralbereiche simultan auf disjunkte Bereiche des Sensors abgebildet werden. Das verringert die Aufnahmedauer um einen entsprechenden ganzzahligen Faktor. Diese Anordnung hat jedoch den Nachteil, zwei Ausgänge (engl. „ports“) des Mikroskops zu belegen, einen für den Beleuchtungsstrahlengang und einen für den Detektionsstrahlengang. Dadurch wird das Mikroskop in seiner Flexibilität eingeschränkt. Zudem sind für Beleuchtung und Detektion zwei separate Module erforderlich, was kostenaufwendig ist.
Nachteilig ist daran außerdem, dass mindestens eines der Bildfelder bezogen auf die optische Achse der Detektion verschoben ist. Die linienförmige Beleuchtung erfolgt hingegen zentriert, da objektseitig ein zentraler Bereich der Probe angeregt wird. Dieser Symmetriebruch zwischen Anregung und Detektion führt zu Verkippungen des Bildes des Fokusvolumens auf dem Sensor. Bei großen Feldern kann das Bild dadurch aus dem Bereich einer Schlitzblende, insbesondere eines „Rolling Shutters“ hinausragen. Eine linienkonfokale Detektion ist dann nicht mehr möglich, da sie zwangsläufig streng entlang einer Pixelzeile des Sensors ausgerichtet erfolgt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs genannten Art zu verbessern, so dass eine flexiblere, weniger aufwendige Nutzung ermöglicht wird.
Darüber hinaus sollen in besonderen Ausführungsformen größere Felder aufnehmbar sein.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Strahlablenkeinheit optisch zwischen der Lichtquelle und dem Hauptstrahlteiler angeordnet ist, so dass das Probenlicht abseits der Strahlablenkeinheit zum Sensor gelangt, und dass sowohl das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv als auch das Probenlicht auf seinem Weg zum Sensor durch dasselbe von der Tubuslinse erzeugte Zwischenbild verlaufen. Das Probenlicht gelangt abseits der Strahlablenkeinheit zum Sensor, was als nichtenttastete (engl. „non-descanned“) Detektion bezeichnet werden kann.
Durch die gemeinsame Nutzung desselben Zwischenbilds für Beleuchtung und Detektion wird vorteilhafterweise nur ein einzelner Ausgang des Mikroskops belegt. Eventuelle weitere Ausgänge stehen für andere Nutzungen zur Verfügung, so dass das Mikroskop - unter Beibehaltung einer kurzen Aufnahmedauer - eine größere Flexibilität aufweist als bekannte Mikroskope. Insbesondere kann die schnelle quasikonfokale Mikroskopie mit anderen Methoden, welche einen eigenen Ausgang benötigen, in multimodaler Weise kombiniert werden. Beleuchtung und Detektion können vorteilhafterweise in einem einzelnen Modul integriert werden, was den Herstellungs- und Installationsaufwand verringert und eine kompaktere und stabilere Bauweise ermöglicht. Gegenüber Lichtblattmikroskopen wird zudem nur eine einzelne Beleuchtungsoptik in Form des Mikroskopobjektivs benötigt.
Vorteilhaft ist eine Ausführungsform, in welcher der gemeinsame Strahlengang optisch zwischen dem Zwischenbild und dem Hauptstrahlteiler eine Optik, vorzugsweise eine Abtastoptik (engl. „scan lens“), zum Erzeugen einer zu einer Pupille (rückwärtigen Brennebene) des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene auf oder in der Nähe der Strahlablenkeinheit aufweist. Dadurch ist zum einen der Hauptstrahlteiler in kollimiertem Licht angeordnet, so dass eventuelle Verschmutzungen nur geringen Einfluss auf seine Übertragungsqualität haben. Zum anderen kann auf diese Weise eine kompakte Kopplung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang erfolgen, ohne dass es - wie im Stand der Technik - einer zusätzlichen Kollimierung bedürfte. Insbesondere kann dadurch auf eine zusätzliche Relaisoptik verzichtet werden.
Besonders vorteilhaft kann in dieser Ausführungsform die konjugierte Pupillenebene durch Reflexion am Hauptstrahlteiler entstehen, so dass die Strahlablenkeinheit in oder in der Nähe der reflektierten konjugierten Pupillenebene liegt, insbesondere mit Transmission der konjugierten Pupillenebene in den Detektionsstrahlengang in die Nähe eines Nebenstrahlteilers, so dass der Nebenstrahlteiler in oder in der Nähe der transmittierten konjugierten Pupillenebene liegt. Auf diese Weise wird keine zusätzliche Relaisoptik im Detektionsstrahlengang benötigt. Die Transmission in den Detektionsstrahlengang führt (gegenüber einer Anordnung in Reflexion) zu einer besseren Auslöschung des Anregungslichtes, so dass am Detektor ein verbesserter Kontrast von Messsignal zu Anregungssignal erreicht wird. Insbesondere kann der Nebenstrahlteiler dadurch in kollimiertem Licht angeordnet werden, so dass eventuelle Verschmutzungen nur geringen Einfluss auf seine Übertragungsqualität haben.
Vorzugsweise ist die Detektionsoptik so angeordnet, dass ihre optische Achse gegenüber einer (gegebenenfalls durch mindestens eine Reflexion umgelenkten) optischen Achse des Mikroskopobjektivs um einen von Null verschiedenen (ebenen) Winkel verkippt ist, so dass ein Bild des Probenraums auf dem Sensor um eine Versatzweite, beispielsweise um ein Viertel der Sensorbreite, von der optischen Achse wegversetzt ist, und die Strahlablenkeinheit (insbesondere ihre Abtastdrehachse, um welche ein einstellbarer Ablenkspiegel drehbar ist), ist um einen von Null verschiedenen zweiten (ebenen) Winkel um eine zu ihrer Abtastdrehachse senkrechte Achse verkippt (innerhalb einer Ebene, welche von den Sensorzeilen und der optischen Achse des Mikroskopobjektivs aufgespannt wird), so dass ein aus der Verkippung der Detektionsoptik resultierender erster Abbildungsfehler, insbesondere eine Verzeichnung, und ein aus der Verkippung der Strahlablenkeinheit resultierender zweiter Abbildungsfehler, insbesondere ebenfalls eine Verzeichnung, einander zumindest teilweise kompensieren (so dass das Beleuchtungsfokusvolumen besser mit dem Detektionsfokusvolumen übereinstimmt und insbesondere das Beleuchtungsfokusvolumen in einem größeren Probenbereich parallel zu den Sensorzeilen auf den Sensor abgebildet wird). Dadurch können die Abbildungsfehler verringert werden, so dass größere Felder aufnehmbar sind. Insbesondere können der erste Verkippwinkel und der zweite Verkippwinkel gleich groß sein.
Zur Minimierung von Abbildungsfehlern kann eine senkrechte Anordnung der optischen Achse der Detektionsoptik zu einer Oberfläche des Sensors vorgesehen sein. Der Einfallswinkel des Beleuchtungslichts auf den Hauptstrahlteiler von der Strahlablenkeinheit her ist derart eingerichtet, dass die optische Achse des Beleuchtungsstrahlengangs und die des Mikroskopobjektivs im gemeinsamen (gekoppelten) Strahlengang (zwischen dem Hauptstrahlteiler und dem Mikroskopobjektiv) zusammenfallen. Typischerweise beträgt der Einfallswinkel trotz der Verkippung der Strahlablenkeinheit 45° - wie im herkömmlichen Auflicht-Rastermikroskop. Zu diesem Zweck ist zwischen der Lichtquelle und der Strahlablenkeinheit zweckmäßigerweise ein vorzugsweise justierbarer Umlenkspiegel angeordnet. Alternativ zu einem Einfallswinkel von 45° auf den Hauptstrahlteiler können auch kleine Einfallswinkel von weniger als 15° oder weniger als 10° vorgesehen sein.
Ohne Verkippung der Strahlablenkeinheit würde als Ergebnis der Verkippung der Detektionsoptik die Abbildung des Beleuchtungsfokusvolumens auf den Sensor in Abhängigkeit der Position x (x ist die Richtung längs der Sensorzeilen und parallel zur linienkonfokalen Schlitzblende) sowie in Abhängigkeit der sensorseitigen Brennweite f der Detektionsoptik gemäß $y (x) = y_{0} \cdot (1 + \frac{x \cdot Δ x}{f^{2}})$
- also y-positionsabhängig schräg - verlaufen (siehe 3a), wobei y die Richtung quer zu den Sensorzeilen und quer zur linienkonfokalen Schlitzblende ist und y₀ die Entfernung von der optischen Achse längs dieser Richtung und Δx die aus der Verkippung resultierende Versatzweite angibt. Dieser Abbildungsfehler (Schräglage, Verzeichnung) ist äquivalent zu einem Abbildungsfehler, der bei einer Nutzung eines Abtastspiegels (engl. „scan mirror“) abseits der optischen Achse entsteht, wenn also die Abtastdrehachse des Abtastspiegels nicht senkrecht zu der durch den Normalenvektor des Abtastspiegels und den Ausbreitungsvektor (mittlerer k-Vektor) des einfallenden Beleuchtungslichts aufgespannten Ebene angeordnet ist. Bildhafter ausgedrückt liegt durch die verkippte Strahlablenkeinheit das Beleuchtungsfokusvolumen schräg im Probenraum. Durch die verkippte Detektionsoptik blickt der Sensor y-Positions-abhängig genauso schräg auf den Probenraum, wodurch er die Beleuchtungslinie parallel zu seinen Pixelzeilen sieht. Erfindungsgemäß ist die Abtastdrehachse der Strahlablenkeinheit vorzugsweise parallel zu der durch den Normalenvektor des Abtastspiegels und den Ausbreitungsvektor (mittlerer k-Vektor) des einfallenden Beleuchtungslichts aufgespannten Ebene angeordnet, um eine maximale Kompensation der Abbildungsfehler zu erreichen. Dann ist der Einfallswinkel des Beleuchtungslichts auf den Abtastspiegel in dessen Nullstellung (neutrale Lage ohne künstliche Krafteinwirkung auf den Abtastspiegel) gleich dem Verkippwinkel der Detektionsoptik.
Der (insbesondere identische) Verkippwinkel der Detektionsoptik und der Strahlablenkeinheit beträgt vorzugsweise näherungsweise arctan(Δx/f), worin Δx die Versatzweite und f die (sensorseitige) Brennweite der Detektionsoptik ist. Mit diesem Verkippwinkel gelingt eine weitgehende Kompensation der Abbildungsfehler. Zur Kompensation von Restfehlern der Detektionsoptik kann der Verkippwinkel auch zu einem vorgegebenen Maß davon abweichen. Beispielsweise können Linienverkrümmungen durch eine Verzeichnung der Detektionsoptik so vermittelt werden, dass sie sich auf dem Sensor nur minimal auswirken.
Insbesondere kann die Strahlablenkeinheit - zusätzlich zur Verkippung - so um ihre Abtastdrehachse gedreht sein, dass das Beleuchtungslicht die Strahlablenkeinheit erreicht, ohne eine optische Achse des gemeinsamen Strahlengangs zu schneiden. Auf diese Weise kann das Beleuchtungslicht räumlich um den Hauptstrahlteiler herum zur Strahlablenkeinheit geführt werden, indem das Beleuchtungslicht in einer Ebene, die echt parallel zu einer von der optischen Achse des Mikroskopobjektivs und der Längsrichtung der Pixelzeilen des Sensors aufgespannt wird (also außerhalb dieser Ebene), am Hauptstrahlteiler vorbeigeführt wird, was eine kompakte Anordnung von Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang ermöglicht, insbesondere in einem gemeinsamen Modul.
Die Strahlablenkeinheit kann das Beleuchtungslicht eindimensional oder zweidimensional ablenken. Im zweidimensionalen Fall handelt es sich vorzugsweise um eine punktweise Abtastung der Probe mit einem punktförmigen Beleuchtungsfleck beziehungsweise Beleuchtungsvolumen.
Demgegenüber bevorzugt sind Ausführungsformen mit linienförmiger Beleuchtung und Detektion, in welchen der Beleuchtungsstrahlengang vorteilhafterweise einen Strahlformer (beispielsweise eine Zylinderlinse) zum Erzeugen einer linienförmigen Verteilung des Beleuchtungslichts und der Sensor eine zeilenförmige Blende aufweist, wobei die Blende konfokal mit dem Zwischenbild angeordnet ist und insbesondere eine elektronische Blende, insbesondere in Form eines „Rolling Shutters“, sein kann. Die linienförmige Beleuchtung ermöglicht eine kürzere Aufnahmedauer. Dabei kann insbesondere eine Einstellung der Strahlablenkeinheit synchronisierbar mit einer dynamischen Position (Bewegung) der Blende sein, insbesondere durch eine Steuereinheit, welche elektrisch mit dem Sensor und der Strahlablenkeinheit verbunden ist. Das ermöglicht eine Minimierung der Aufnahmedauer. Zu diesem Zweck kann der Sensor vorzugsweise über einen Lichtblatt-Auslesemodus (von Hamamatsu als „Lighsheet Readout Mode“ bezeichnet) verfügen und einen Ausgang aufweisen, an welchem eine Information über die Position und/oder Bewegung der Blende anliegt, insbesondere ein Signal, das einen Beginn eines Bildes (engl. „frame“) auf dem Sensor anzeigt. Kommerziell sind Sensoren mit einem solchen Modus und einem entsprechenden Ausgang von Hamamatsu verfügbar: https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmoscameras/liqhtsheet-readout-mode.html. Der Ausgang wird von Hamamatsu als „external trigger output“ bezeichnet.
Vorteilhafterweise kann der Detektionsstrahlengang zwischen dem Hauptstrahlteiler und der Detektionsoptik einen Nebenstrahlteiler und mindestens einen Reflektor, insbesondere in Form eines Prismas, aufweisen, wobei der Nebenstrahlteiler das Probenlicht in zwei Anteile aufteilt und auf disjunkte Bereiche des Sensors oder auf einen jeweiligen Sensor leitet, so dass zwei disjunkte Bilder des Probenraums entstehen, insbesondere mit identischen Versatzweiten für beide Bilder (und identischen Winkeln zwischen den optischen Achsen der Bilder und der optischen Achse der Detektionsoptik, insbesondere mit Punktsymmetrie zwischen den Anteilen bezüglich der optischen Achse der Detektionsoptik), wobei nur einer der Anteile über den Reflektor zum betreffenden Sensor gelangt. Dadurch können zur Verkürzung der Aufnahmedauer zwei Bilder simultan aufgenommen werden, insbesondere in unterschiedlichen Spektralbereichen durch Ausbildung des Nebenstrahlteilers zur Farbteilung, insbesondere in Form eines Dichroiten. Bei identischen Versatzweiten (und identischen Winkeln zur optischen Achse der Detektionsoptik, insbesondere mit Punktsymmetrie bezüglich der optischen Achse der Detektionsoptik) sind die durch die Verkippung der Detektionsoptik entstehenden Abbildungsfehler in beiden Bildern maximal kompensiert.
In einer solchen Ausführungsform kann der Beleuchtungsstrahlengang vorzugsweise eine zweite Lichtquelle mit einer anderen Emissionswellenlänge als die erste Lichtquelle aufweisen und/oder der Nebenstrahlteiler kann ein Farbteiler sein, insbesondere ein Hochpassfilter oder ein Tiefpassfilter. Auf diese Weise können simultan zwei zu den Emissionswellenlängen gehörende Spektralbereiche, insbesondere von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, mit geringen Bildfehlern in kurzer Zeit aufgenommen werden. Die erste und die zweite Lichtquelle können dieselbe Lichtquelle sein, beispielsweise in Form eines Multilinien-Lasers oder einer Breitbandlichtquelle, insbesondere einer Weißlichtquelle.
In einem vorteilhaften Verfahren zur abtastenden (rasternden) Bildaufnahme mittels eines Rastermikroskops mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der mindestens eine Lichtquelle mit drei oder mehr selektiv emittierbaren disjunkten Spektralbändern aufweist, einem Detektionsstrahlengang, der ein Mikroskopobjektiv und einen zweidimensional ortsauflösenden Sensor zum Aufnehmen von Licht aus einem Probenraum aufweist, einem als spektraler N-fach-Kerb-Filter (mit N=3,4,5,6 spektralen Kerben) ausgebildeten Hauptstrahlteiler, der den Beleuchtungsstrahlengang und den Detektionsstrahlengang optisch miteinander koppelt (so dass Beleuchtungslicht von der Lichtquelle, insbesondere die Spektralbänder, durch das Objektiv in den Probenraum und Probenlicht, insbesondere Fluoreszenzemissionen, von dort durch das Objektiv zum Sensor gelangt), wobei jede Kerbe (engl. „notch“) des Kerbfilters spektral einem jeweiligen der Spektralbänder der Lichtquelle entspricht, und einem als Hoch- oder Tiefpassfilter mit einer spektralen Kante ausgebildeten, optisch zwischen dem Hauptstrahlteiler und dem Sensor angeordneten Nebenfarbteiler wird jeder der abzutastenden Orte im Probenraum sequentiell mit dem ersten Spektralband und dem zweiten Spektralband beleuchtet und während des Beleuchtens mit dem ersten Spektralband auch mit dem dritten Spektralband beleuchtet, wobei das erste und das zweite Spektralband spektral auf einer ersten spektralen Seite und das dritte Spektralband auf einer zweiten, von der ersten Seite verschiedenen spektralen Seite der spektralen Kante des Nebenfarbteilers liegen. Auf diese Weise können drei oder mehr Fluoreszenzfarbstoffe in kurzer Zeit angeregt und ihre Fluoreszenzemission in separate Bilder aufgenommen werden. Ein Spektralband kann insbesondere die betreffende Breite einer jeweiligen einzelnen Emissionslinie eines Lasers aufweisen. Der N-fach-Kerb-Filter kann beispielsweise wie in US 2014/0092460 A1 ausgebildet sein.
Die Auswahl der simultan beleuchtenden und der Wechsel der sequentiell beleuchtenden Spektralbänder kann vorzugsweise frei von mechanischen Bewegungen erfolgen, insbesondere mittels eines oder mehrerer akustooptischer Elemente, beispielsweise mittels eines akustooptischen, einstellbaren Filters (AOTF). In Kombination mit dem Mehrfach-Kerbfilter des Hauptfarbteilers und der spektralen Zweiteilung durch den Nebenfarbteiler können auf diese Weise an jeden abzutastenden Ort im Probenraum drei oder mehr Spektralbänder in sehr kurzer Zeit geleitet werden, insbesondere zum Aufnehmen einer entsprechenden Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen in separate Bilder.
Besonders bevorzugt werden Mikroskope mit vier Beleuchtungslicht-Spektralbändern und einem Vierfach-Kerbfilter mit diesen spektral entsprechenden Kerben als Hauptstrahlteiler oder Mikroskope mit sechs oder mehr Beleuchtungslicht-Spektralbändern und gegeneinander austauschbaren Mehrfach-Kerbfiltern mit verschiedenen Untergruppen der den Spektralbändern spektral entsprechenden Kerben als Hauptstrahlteiler verwendet, beispielsweise zwei Vierfach-Kerbfilter auf einem Filterrad oder -schieber oder ein Vierfach-Kerbfilter und ein Zweifach-Kerbfilter auf einem Filterrad oder -schieber, vorzugsweise jeweils mit elektrischem Antrieb.
Vorzugsweise wird jeder abzutastende Ort des Probenraums in diesen Mikroskopen sequentiell mit Paaren der Spektralbänder beleuchtet (erstes und drittes Spektralband simultan, zuvor oder danach zweites und viertes Spektralband simultan), wobei in jedem dieser Paare jeweils eines der Spektralbänder auf der ersten spektralen Seite und das andere Spektralband auf der zweiten spektralen Seite der spektralen Kante des Nebenfarbteilers liegt. Auf diese Weise kann die Farbteilung optimal zur schnellstmöglichen Aufnahme einer geraden Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen genutzt werden.
Die Paare (insbesondere das aus dem ersten und dem dritten Spektralband bestehende) können dabei entweder an jedem der abzutastenden Orte im Probenraum während jeweils (nahezu) konstanter Stellung der Strahlablenkeinheit unmittelbar aufeinanderfolgend oder aber jeweils nach einem vollständigen Abtastvorgang über alle abzutastenden Orte des Probenraums hinweg wechselnd eingestrahlt werden.
Derartige Verfahren können vorteilhafterweise mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop mit verkippter Detektionsoptik und verkippter Strahlablenkeinheit genutzt werden, um 2n+2 (n=1,2,...) spektral unterschiedliche Bilder des Probenraums insbesondere von n verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen, in sehr kurzer Zeit aufzunehmen. Ein solches sequentiell-simultanes Verfahren kann aber auch mit herkömmlichen Rastermikroskopen genutzt werden. Die Umschaltung der Wellenlängen-Paare muss möglichst schnell erfolgen. Dies gelingt beispielsweise mit akustooptischen Filtern (AOTF) oder Mikrospiegeln (DMD), insbesondere mit mikroelektro-mechanischen Systemen (MEMS). Für derartige Verfahren werden eine oder mehrere Lichtquellen mit einer insgesamt entsprechenden Anzahl von selektiv emittierbaren Spektralbändern benötigt. Alternativ kann eine Breitband- oder Weißlichtquelle eingesetzt werden. Bei nur einer Lichtquelle ist der Einsatz eines AOTF zweckmäßig, der programmierbar mehrere spektrale Bänder gleichzeitig zum Mikroskopobjektiv lenkt. Es kann aber auch für jede Lichtquelle oder für Gruppen von Lichtquellen ein jeweiliger AOTF vorgesehen sein.
Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen eine Differenz zwischen einer Anzahl von Reflexionen des ersten Anteils bis zum Sensor und einer Anzahl von Reflexionen des zweiten Anteils bis zum Sensor - einschließlich von Reflexionen am Nebenstrahlteiler selbst -, eine ungerade Zahl ist, wobei die optischen Achsen der beiden Anteile durch die Detektionsoptik vorzugsweise in derselben Ebene und im gleichen Abstand von und im gleichen Winkel zu der optischen Achse der Detektionsoptik verlaufen, jedoch auf entgegengesetzten Seiten dieser Achse. Durch die ungerade Anzahl von Reflexionen ist das Strahlenbündel des ersten Anteils gerade spiegelverkehrt zu dem Strahlenbündel des zweiten Anteils. Da die Detektionsoptik vorzugsweise rotationssymmetrisch ausgebildet ist, unterliegen dann beide Anteile denselben Abbildungsfehlern, so dass ihre Bilder auf dem Sensor vergleichbare Eigenschaften aufweisen. Die Abbildungsfehler beider Anteile können deswegen durch eine Verkippung der Strahlablenkeinheit um eine zu ihrer Abtastdrehachse senkrechte Achse wie oben beschrieben weitgehend kompensiert werden. Dann ist eines der Bilder vertikal (um die y-Achse) gespiegelt und muss entsprechend umgedreht werden, bevor es weiterverarbeitet werden kann.
In einer möglichen aufwendigeren Ausführungsform umfasst der Detektionsstrahlengang eine zweite Detektionsoptik und der erste Anteil gelangt abseits des Reflektors durch die erste Detektionsoptik zum Sensor und der zweite Anteil gelangt über den Reflektor durch die zweite Detektionsoptik zum selben Sensor oder zu einem separaten Sensor. Die optischen Achsen jedes Anteils können hier mit der jeweiligen optischen Achse einer der beiden Detektionsoptiken zusammenfallen, wodurch weniger Abbildungsfehler auftreten. Insbesondere kann so auf eine Verkippung der Strahlablenkeinheit und der Detektionsoptiken verzichtet werden.
Vorteilhafterweise kann die Strahlablenkeinheit MEMS-Mikrospiegel umfassten und insbesondere das Beleuchtungslicht nur eindimensional einstellbar ablenken. Das ermöglicht eine kompakte Konstruktion und hohe Ablenkfrequenzen. Eine Strahlablenkeinheit, welche zweidimensional einstellbare MEMS-Mikrospiegel umfasst, hat alternativ den Vorteil, dass eine Abtastung entlang der Längsrichtung der Beleuchtungslinie möglich ist, um die Ausleuchtung des Probenraums entweder zu erweitern, zu homogenisieren oder kohärente Effekte zu minimieren. Zu diesen Zweck erfolgt die Abtastung entlang der Längsrichtung der Linie im Probenraum schneller als der quer zur Längsrichtung der Linie. Besonders vorteilhaft für diesen Zweck sind resonant-quasistatische MEMS-Scanner. Alternativ kann ein in beiden Achsen quasistatischer MEMS-Scanner eingesetzt werden, um nur die kohärenten Störeffekte in der Beleuchtung zu minimieren. Dann kann es vorteilhaft sein, die Achse zum Abtasten entlang der Längsrichtung der Beleuchtungslinie mit weißem Rauschen vorgegebener Amplitude anzusteuern. Alternativ kann die Strahlablenkeinheit einen oder mehrere Galvanometer-Scanner umfassen. Die Längsrichtung der Beleuchtungslinie erstreckt sich in der Richtung ihrer längsten Ausdehnung.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen das Mikroskop ein Stativ aufweist, an welchem das Mikroskopobjektiv, insbesondere in einem Objektivrevolver, angeordnet ist, wobei das Stativ einen ersten Ausgang, in dessen Bereich die Tubuslinse und das Zwischenbild angeordnet ist, und mindestens einen weiteren Ausgang mit einer weiteren Tubuslinse und einem weiteren Zwischenbild aufweist, wobei das Probenlicht mittels mindestens eines Strahlteilers, insbesondere eines wiederholt entfernbaren Strahlteilers, oder mittels eines Spiegels simultan oder sequentiell zu beiden Ausgängen leitbar ist, wobei der Hauptstrahlteiler, die Detektionsoptik, der Sensor, die Strahlablenkeinheit und eine Abtasteinheit innerhalb eines Moduls angeordnet sind, welches mit einem der Ausgänge lösbar mechanisch und optisch verbunden ist. So kann ein flexibel nutzbares Mikroskopsystem mit geringen Abbildungsfehlern bei kurzer Aufnahmedauer bereitgestellt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:

1 ein Mikroskop,
2 Strahlengänge eines Mikroskops und
3 geometrische Verläufe der Bilder des Detektionsfokus auf dem Sensor.

In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
1 zeigt in schematischer Darstellung ein Mikroskop 1. Es besteht aus einem Stativ 2, einem Scanmodul 3 und einem Lasermodul 4. Das Stativ 2 weist ein Mikroskopobjektiv 5 mit Tubuslinsen 6 auf, die im Bereich zweier Ausgänge 7 jeweils ein Zwischenbild ZB erzeugen. Das Stativ weist zudem einschwenkbare Strahlteiler 9 auf, beispielsweise Neutralteiler oder Farbteiler, um selektiv konfigurierbar Licht anteilig zu den Ausgängen und/oder zum Okular 10 und/oder Licht von einer Lampe 11 zum Mikroskopobjektiv 5 und von dort in den Probenraum P zu leiten.
Das Lasermodul 4 umfasst rein beispielhaft vier Laser 12 mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, deren jeweilige Intensität mittels eines jeweiligen AOTF 13 einstellbar ist. Alternativ (nicht abgebildet) können einer oder mehrere der Laser direkt modulierbar sein. Ihr Beleuchtungslicht wird über Einkoppeloptiken 14 in Lichtleitfasern 15 eingekoppelt und zum Scanmodul 3 geleitet, wo es mittels beispielsweise längsverschieblicher Kollimatoren 16 kollimiert wird. Die Kollimatoren 16 können zur Kompensation von Farblängsfehlern und/oder zur Fokussierung des Beleuchtungslichts in unterschiedliche Tiefen des Probenraums P dienen. Alternativ (nicht abgebildet) können die unterschiedlichen Emissionswellenlängen beispielsweise schon im Lasermodul vereinigt werden, so dass nur ein einzelne Lichtleitfaser 15 benötigt wird und auf Kollimatoren 16 verzichtet werden kann. Über einen Spiegel 17 und einen Strahlvereiniger 18 gelangt das derart vereinigte Beleuchtungslicht zu einem Umlenkspiegel 19, welcher das Beleuchtungslicht so ablenkt, dass es, nachdem es eine Zylinderlinse 20 passiert hat, unter einem Einfallswinkel α auf die Strahlablenkeinheit 21 fällt, welche ihrerseits gegenüber einer optischen Achse OA des Mikroskopobjektivs 5, welche mittels eines Hauptstrahlteilers 22 umgelenkt wird, um einen identischen Winkel α um eine zu ihrer Abtastdrehachse senkrechte Achse verkippt ist. Vom Hauptstrahlteiler 22 gelangt das Beleuchtungslicht über die Abtastoptik 23, das Zwischenbild ZB und eine der Tubuslinsen 6 zum Mikroskopobjektiv 5 und von dort in den Probenraum P. Da die Zylinderlinse das Beleuchtungslicht in einer Dimension in die auf der Strahlablenkeinheit 21 liegende, mit der Pupille des Mikroskopobjektivs 5 konjugierte Ebene fokussiert, resultiert im Probenraum ein im Grundsatz linienförmiges Beleuchtungsfokusvolumen. Aufgrund der Verkippung der Strahlablenkeinheit 21 liegt das linienförmige Beleuchtungsfokusvolumen mit zunehmender Entfernung von der optischen Achse des Mikroskopobjektivs 5 zunehmend schräg im Probenraum P.
Probenlicht, insbesondere auch in der Probe durch das Beleuchtungslicht angeregte Fluoreszenz, gelangt auf dem umgekehrten Weg über das Zwischenbild ZB bis zum Hauptstrahlteiler 22. Der in der Probe und unterwegs dorthin reflektierte Anteil des Beleuchtungslichts wird durch den Hauptstrahlteiler 22, der beispielsweise als dichroitischer Kerbfilter (engl. „notch filter“) ausgestaltet ist, zurück zur Strahlablenkeinheit reflektiert. Im Probenlicht enthaltene Fluoreszenz wird, insbesondere aufgrund der Stokes-Verschiebung, durch den Hauptstrahlteiler 22 zu einem Nebenstrahlteiler 24, der beispielsweise als dichroitischer Tiefpassfilter ausgebildet ist, transmittiert. Die Abtastoptik 23 ist so ausgebildet, dass einerseits auf der Strahlablenkeinheit 21 und andererseits im Bereich des Nebenstrahlteilers 24 eine zur Pupille des Mikroskopobjektivs 5 konjugierte Ebene liegt. Der Nebenstahlteiler 24 teilt das an dieser Stelle verbliebene Probenlicht (typischerweise Fluoreszenzemission) durch seine spektrale Tiefpasswirkung in zwei Anteile auf. Der erste Anteil A1 gelangt durch Transmission unmittelbar in eine Detektionsoptik 25. Der zweite Anteil A2 wird zunächst an zwei Innenflächen 26 eines Prismas 27 gespiegelt, so dass der zweite Anteil eine ungerade Anzahl von Reflexionen erfährt, bevor er ebenfalls in die Detektionsoptik 25 eintritt. Die Detektionsoptik 25 ist jedoch gegenüber der optischen Achse OA des Mikroskopobjektivs 5 innerhalb einer von den Pixelzeilen des Sensors und der optischen Achse OA des Mikroskopobjektivs 5 aufgespannten Ebene um beispielsweise denselben Winkel α verkippt wie die Strahlablenkeinheit 21, wodurch die beiden am Nebenstrahlteiler 24 getrennten Anteile A1, A2 unter einem entgegengesetzt gleichgroßen Winkel in die Detektionsoptik 25 fallen und auf diese Weise symmetrisch entgegengesetzte Abbildungsfehler erfahren. Diese kompensieren jedoch gerade einen durch die Verkippung der Strahlablenkeinheit 21 dem Beleuchtungslicht aufgeprägten Abbildungsfehler. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können die Verkippwinkel von Detektionsoptik 25 und Strahlablenkeinheit 21 voneinander abweichen, um einen anderen Abbildungsfehler zu kompensieren. In allen Fällen sind die beiden Verkippwinkel jedoch von Null verschieden. Die beiden Anteile gelangen als disjunkte, weitestgehend fehlerkorrigierte Bilder (ein jeweiliges „Anteil-Bild“) auf den Sensor 28, der einen „Rolling Shutter“ als linienkonfokale Schlitzblende aufweist, mit dem die Bewegung der Strahlablenkeinheit 21 synchronisiert ist, beispielsweise durch Starten der Scannerbewegung in Abhängigkeit eines von dem in einem Lichtblatt-Auslesemodus betriebenen Sensor 28 abgegebenen Signals, welches den Beginn eines neuen Bildes auf dem Sensor 28 anzeigt. Durch die Kompensation wird das im Probenraum P positionsabhängig schräge linienförmige Detektionsfokusvolumen pixelzeilenparallel und dadurch mit minimierter Verzeichnung auf die jeweils aktive, geradlinige Zeile des „Rolling Shutters“ abgebildet. Eine nicht abgebildete Steuereinheit liest den Sensor aus, beispielsweise nach der Aufnahme eines vollständigen Sensor-Frames, weist seine Daten zwei jeweiligen digitalen Bildern zu und spiegelt die Daten des dem zweiten Probenlicht-Anteils entsprechenden digitalen Bilds vertikal, damit beide digitalen Bilder dieselbe Perspektive aufweisen.
Der Verkippwinkel α der Detektionsoptik 25 und der Strahlablenkeinheit 21 entspricht dabei α=arctan(Δx/f) mit Δx als Versatzweite der Bilder auf dem Sensor (projiziert relativ zur optischen Achse der Detektionsoptik 25) und f als sensorseitiger Brennweite der Detektionsoptik 25.
Das Scanmodul kann besonders kompakt und effizient ausgebildet werden, weil (neben den Zwischenbildebenen ZB an den Ausgängen des Stativs 2) nur auf dem Sensor 28 eine Bildebene angeordnet ist und in Detektionsrichtung hinter dem Hauptstrahlteiler 22 in jedem Zweig des Detektionsstrahlengangs nur genau eine zum Mikroskopobjektiv 5 konjugierte Pupillenebene PE' angeordnet ist.
In 2 sind die Strahlengänge eines Mikroskops 1 schematisch dargestellt. 2A zeigt sie in der Draufsicht, 2B in der Seitenansicht. Gut erkennbar sind die Pupillenebene PE des Mikroskopobjektivs 5, die dazu konjugierten Pupillenebenen PE' und die Zwischenbildebene ZB. Insoweit entspricht die gezeigte Anordnung derjenigen in 1. Auch hier umfasst der Detektionsstrahlengang zwischen dem Mikroskopobjektiv 5 und dem Sensor 28 nur genau ein Zwischenbild ZB und zwischen der Tubuslinse 6 und dem Sensor 28 in jedem Zweig nur genau eine konjugierte Pupillenebene PE'. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können mittels zusätzlicher Relaisoptiken weitere konjugierte Pupillenebenen und/oder Zwischenbildebenen vorhanden sein.
In Abweichung von 1 wird das Beleuchtungslicht räumlich um den Hauptstrahlteiler 22 herum zur Strahlablenkeinheit 21 geführt - die Laser 12 sind oberhalb der optischen Achse OA des Mikroskopobjektivs 5 angeordnet, wie in der seitlichen Ansicht ersichtlich ist. Zu diesem Zweck ist die Strahlablenkeinheit 21 zusätzlich um ihre Abtastdrehachse verkippt. Über einen Umlenkspiegel (nicht abgebildet), beispielsweise denjenigen, welcher das Beleuchtungslicht so ablenkt, dass es, nachdem es die Zylinderlinse 20 passiert hat, unter einem Einfallswinkel α auf die Strahlablenkeinheit 21 fällt, gelangt das Beleuchtungslicht zunächst schräg in die Ebene, die von der optischen Achse OA des Mikroskopobjektivs 5 und der Längsrichtung x der Sensorzeilen aufgespannt wird, wo es auf die Strahlablenkeinheit 21 trifft. Die Strahlablenkeinheit 21 ist gerade so verdreht, dass die Reflexion des Beleuchtungslichts innerhalb der genannten Ebene zum Mikroskopobjektiv 5 hin erfolgt.
3 zeigt zur visuellen Verdeutlichung der Wirkung der Erfindung schematisch das auf den Sensor per Strahlteilung in zwei Anteil-Bilder abgebildete Detektionsfokusvolumen zu unterschiedlichen Zeitpunkten eines Abtastvorganges in drei verschiedenen, beispielhaften Konfigurationen.
In Teilfigur a) ist das Resultat einer fiktiven Konfiguration dargestellt, in welcher gegenüber der optischen Achse des Mikroskopobjektivs 5 zwar die Detektionsoptik, nicht aber die Strahlablenkeinheit verkippt ist. Die abtastende Beleuchtung des Probenraums P ist hier auf konventionelle Weise um die optische Achse des Mikroskopobjektivs zentriert. Aufgrund der Verkippung der Detektionsoptik ergibt sich zu beiden vertikalen Bildrändern hin, also in y-Richtung, eine jeweils zunehmende Schräglage, im Ergebnis eine Verzeichnung, des Detektionsfokusvolumens DV. Ebenfalls eingezeichnet ist die momentane Position der elektronischen Blende eines „Rolling Shutters“ RS. Deutlich erkennbar ist, dass aufgrund der Schräglage nur kleine Teile des Detektionsfokusvolumens vom aktiven Bereich des Sensors erfasst werden können. Zwar könnte das gesamte Detektionsfokusvolumen erfasst werden, indem die Breite der elektronischen Schlitzblende RS vergrößert wird. Um eine stärkere Unterdrückung von außerfokalem Licht zu erreichen, wäre es jedoch notwendig, auch schmalere elektronischen Schlitzblenden RS, insbesondere mit einer Breite von nur einer Pixelzeile, zu verwenden.
Teilfigur b) ist das Resultat einer Konfiguration, in welcher sowohl die Detektionsoptik als auch die Strahlablenkeinheit verkippt sind, wobei jedoch das rechte Anteil-Bild nach der Nebenstrahlteilung einer geradzahligen Anzahl von Reflexionen ausgesetzt ist, während das linke Anteil-Bild nach der Nebenstrahlteilung gar nicht reflektiert wird. Dadurch wird die Schräglage und werden die resultierenden Verzeichnungen nicht kompensiert, sondern tendenziell sogar eher vergrößert.
Schließlich zeigt c) das Resultat einer Konfiguration, in welcher sowohl die Detektionsoptik als auch die Strahlablenkeinheit verkippt sind und das rechte Anteil-Bild nach der Nebenstrahlteilung einer ungeradzahligen Anzahl von Reflexionen ausgesetzt ist, während das linke Anteil-Bild nach der Nebenstrahlteilung wiederum gar nicht reflektiert wird. Dadurch werden die Schräglage und damit die zuvor vorhandenen Verzeichnungen weitestgehend kompensiert.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
2: Stativ
3: Scanmodul
4: Lasermodul
5: Mikroskopobjektiv
6: Tubuslinsen
7: Ausgang
8 9: Strahlteiler
10: Okular
11: Lampe
12: Laser
13: AOTF
14: Einkoppeloptik
15: Lichtleitfaser
16: Kollimator
17: Spiegel
18: Strahlvereiniger
19: Umlenkspiegel
20: Zylinderlinse
21: Strahlablenkeinheit
22: Hauptstrahlteilers
23: Abtastoptik
24: Nebenstrahlteiler
25: Detektionsoptik
26: Prisma-Innenfläche
27: Prisma
28: Sensor 8
P: Probenraum
OA: Optische Achse
ZB: Zwischenbild
PE: Pupillenebene
PE': Konjugierte Pupillenebene
DV: Detektionsfokusvolumen
RS: „Rolling Shutter“
α: Verkippwinkel
A1: Erster Anteil
A2: Zweiter Anteil

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 197 02 753 A1 [0002]
EP 1 617 258 A1 [0003]
DE 10 2021 134 427 A1 [0005]
US 2014/0092460 A1 [0024]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Virtual slit scanning microscopy“ von R. Fiolka et al. in „Histochemistry and Cell Biology“, Band 128 (6), 2007 (DOI 10.1007/s00418-007-0342-2 [0004]
Inexpensive and Flexible Slit-Scanning Confocal Imaging Using a Rolling Electronic Aperture“ von M. S. Muller et al. in „Microscopy Instrument and Software Developments (FWW)“ auf der Konferenz „Frontiers in Optics 2008“ (DOl 10.1364/FIO.2008.FWW2 [0004]

Claims

Mikroskop (1) mit einem Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektionsstrahlengang und einem Hauptstrahlteiler (22), wobei der Detektionsstrahlengang einen Probenraum (P), ein Mikroskopobjektiv (5), eine Tubuslinse (6), ein durch die Tubuslinse erzeugtes Zwischenbild (ZB) und einen zweidimensional ortsauflösenden optoelektronischen Sensor (28) mit einer Detektionsoptik (25) zum Abbilden des Zwischenbilds (ZB) auf den Sensor (28) aufweist und wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine Lichtquelle (12) und eine einstellbare Strahlablenkeinheit (21) zum Bewegen des Beleuchtungslichts durch den Probenraum (P) aufweist, wobei der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang mittels des Hauptstrahlteilers (22) optisch derart zu einem gemeinsamen Strahlengang gekoppelt sind, dass Beleuchtungslicht von der Lichtquelle (12) über den Hauptstrahlteiler (22) durch das Mikroskopobjektiv (5) in den Probenraum (P) gelangt und Probenlicht aus dem Probenraum (P) durch das Mikroskopobjektiv (5) über den Hauptstrahlteiler (22) zum Sensor (28) gelangt, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkeinheit (21) optisch zwischen der Lichtquelle (12) und dem Hauptstrahlteiler (22) angeordnet ist, so dass das Probenlicht abseits der Strahlablenkeinheit (21) zum Sensor (28) gelangt, und dass sowohl das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv (5) als auch das Probenlicht auf seinem Weg zum Sensor (28) durch dasselbe von der Tubuslinse (6) erzeugte Zwischenbild (ZB) verlaufen.
Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der gemeinsame Strahlengang optisch zwischen dem Zwischenbild und dem Hauptstrahlteiler eine Optik zum Erzeugen einer mit einer Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene auf oder in der Nähe der Strahlablenkeinheit aufweist, insbesondere mit Entstehung dieser konjugierten Pupillenebene durch Reflexion am Hauptstrahlteiler, insbesondere mit Transmission der konjugierten Pupillenebene in den Detektionsstrahlengang in die Nähe eines Nebenstrahlteilers.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektionsoptik so angeordnet ist, dass ihre optische Achse gegenüber einer optischen Achse des Mikroskopobjektivs um einen von Null verschiedenen ersten Winkel verkippt ist, so dass ein Bild des Probenraums auf dem Sensor um eine Versatzweite von der optischen Achse wegversetzt ist, und die Strahlablenkeinheit um einen von Null verschiedenen, insbesondere nahezu gleichgroßen zweiten Winkel um eine zu ihrer Abtastdrehachse senkrechte Achse verkippt ist, so dass ein aus der Verkippung der Detektionsoptik resultierender erster Abbildungsfehler und ein aus der Verkippung der Strahlablenkeinheit resultierender zweiter Abbildungsfehler einander zumindest teilweise kompensieren, insbesondere mit senkrechter Anordnung der optischen Achse der Detektionsoptik zu einer Oberfläche des Sensors .
Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Verkippwinkel arctan(Δx/f) entspricht, worin Δx die Versatzweite auf dem Sensor und f die (sensorseitige) Brennweite der Detektionsoptik ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Beleuchtungsstrahlengang einen Strahlformer zum Erzeugen einer linienförmigen Verteilung des Beleuchtungslichts aufweist und wobei der Sensor eine zeilenförmige Blende aufweist, die konfokal zu dem Zwischenbild angeordnet ist, insbesondere eine elektronische Blende, insbesondere in Form eines Rolling Shutters, insbesondere mit Synchronisierbarkeit einer Einstellung der Strahlablenkeinheit mit einer dynamischen Position der Blende, insbesondere durch eine Steuereinheit, welche elektrisch mit dem Sensor und der Strahlablenkeinheit verbunden ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektionsstrahlengang zwischen dem Hauptstrahlteiler und der Detektionsoptik einen Nebenstrahlteiler und mindestens einen Reflektor aufweist, wobei der Nebenstrahlteiler das Probenlicht in zwei Anteile aufteilt und auf disjunkte Bereiche des Sensors oder auf einen jeweiligen Sensor leitet, so dass zwei disjunkte Bilder des Probenraums entstehen, insbesondere mit identischen Versatzweiten für beide Bilder, wobei nur einer der Anteile über den Reflektor zum betreffenden Sensor gelangt, insbesondere mit Ausbildung des Nebenstrahlteilers zur Farbteilung, insbesondere in Form eines Dichroiten oder eines Neutralteilers.
Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine zweite Lichtquelle mit einer anderen Emissionswellenlänge als die erste Lichtquelle aufweist und wobei der Nebenstrahlteiler ein Farbteiler, insbesondere ein Hochpassfilter oder ein Tiefpassfilter, ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei eine Differenz zwischen einer Anzahl von Reflexionen des ersten Anteils bis zum Sensor und einer Anzahl von Reflexionen des zweiten Anteils bis zum Sensor eine ungerade Zahl ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, soweit diese nicht auf Anspruch 3 oder 4 rückbezogen sind, wobei der Detektionsstrahlengang eine zweite Detektionsoptik umfasst und der erste Anteil abseits des Reflektors durch die erste Detektionsoptik zum Sensor gelangt und der zweite Anteil über den Reflektor durch die zweite Detektionsoptik zum Sensor gelangt.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Strahlablenkeinheit MEMS-Mikrospiegel umfasst und insbesondere das Beleuchtungslicht nur eindimensional einstellbar ablenken kann.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Strahlablenkeinheit so um ihre Abtastdrehachse gedreht ist, dass das Beleuchtungslicht die Strahlablenkeinheit in einer Ebene erreicht, welche von einer Ebene, die von der optischen Achse (OA) des Mikroskopobjektivs (5) und einer Längsrichtung einer Pixelzeile des Sensors aufgespannt wird, verschieden ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mikroskop ein Stativ aufweist, an welchem das Mikroskopobjektiv, insbesondere in einem Objektivrevolver, angeordnet ist, wobei das Stativ einen ersten Ausgang, in dessen Bereich die Tubuslinse und das Zwischenbild angeordnet ist, und mindestens einen weiteren Ausgang mit einer weiteren Tubuslinse und einem weiteren Zwischenbild aufweist, wobei das Probenlicht mittels mindestens eines Strahlteilers, insbesondere eines wiederholt entfernbaren Strahlteilers, oder mittels eines Spiegels simultan oder sequentiell zu beiden Ausgängen leitbar ist, wobei der Hauptstrahlteiler, die Detektionsoptik, der Sensor, die Strahlablenkeinheit und eine Abtasteinheit innerhalb eines Moduls angeordnet sind, welches mit einem der Ausgänge lösbar mechanisch und optisch verbunden ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle drei oder mehr selektiv emittierbare disjunkte Spektralbänder aufweist und der Hauptstrahlteiler als spektraler N-fach-Kerb-Filter (N=3,4,5,6) ausgebildet ist und jede Kerbe des Kerbfilters spektral einem jeweiligen der Spektralbänder der Lichtquelle entspricht, insbesondere ausgerüstet mit einer Steuereinheit, die zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der folgenden Ansprüche eingerichtet ist.
Verfahren zur abtastenden Bildaufnahme mittels eines Rastermikroskops mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der mindestens eine Lichtquelle mit drei oder mehr selektiv emittierbaren disjunkten Spektralbändern aufweist, einem Detektionsstrahlengang, der ein Mikroskopobjektiv und einen zweidimensional ortsauflösenden Sensor zum Aufnehmen von Licht aus einem Probenraum aufweist, einem als spektraler N-fach-Kerb-Filter (N=3,4,5,6) ausgebildeten Hauptstrahlteiler, der den Beleuchtungsstrahlengang und den Detektionsstrahlengang optisch miteinander koppelt, wobei jede Kerbe des Kerbfilters spektral einem jeweiligen der Spektralbänder der Lichtquelle entspricht, und einem als Hoch- oder Tiefpassfilter mit einer spektralen Kante ausgebildeten, optisch zwischen dem Hauptstrahlteiler und dem Sensor angeordneten Nebenfarbteiler, wobei jeder der abzutastenden Orte im Probenraum sequentiell mit dem ersten Spektralband und dem zweiten Spektralband beleuchtet wird und während des Beleuchtens mit dem ersten Spektralband auch mit dem dritten Spektralband beleuchtet wird, wobei das erste und das zweite Spektralband spektral auf einer ersten spektralen Seite und das dritte Spektralband auf einer zweiten, von der ersten Seite verschiedenen, spektralen Seite der spektralen Kante des Nebenfarbteilers liegen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Auswahl der simultan beleuchtenden und der Wechsel der sequentiell beleuchtenden Spektralbänder frei von mechanischen Bewegungen erfolgt, insbesondere mittels eines oder mehrerer akustooptischer Elemente.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei Mikroskope mit vier Beleuchtungslicht-Spektralbändern und einem Vierfach-Kerbfilter mit diesen spektral entsprechenden Kerben als Hauptstrahlteiler oder Mikroskope mit sechs oder mehr Beleuchtungslicht-Spektralbändern und gegeneinander austauschbaren Mehrfach-Kerbfiltern mit verschiedenen Untergruppen der den Spektralbändern spektral entsprechenden Kerben als Hauptstrahlteiler verwendet werden, insbesondere zwei Vierfach-Kerbfilter auf einem Filterrad oder -schieber oder ein Vierfach-Kerbfilter und ein Zweifach-Kerbfilter auf einem Filterrad oder - schieber, insbesondere jeweils mit elektrischem Antrieb.
Verfahren nach Anspruch 13, 14 oder 15, wobei jeder abzutastende Ort des Probenraums sequentiell mit Paaren der Spektralbänder beleuchtet wird, wobei in jedem dieser Paare jeweils eines der Spektralbänder auf der ersten spektralen Seite und das andere Spektralband auf der zweiten spektralen Seite der spektralen Kante des Nebenfarbteilers liegt, insbesondere mit Einstrahlung der Paare an jedem der abzutastenden Orte im Probenraum während jeweils konstanter Stellung der Strahlablenkeinheit unmittelbar aufeinanderfolgend.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei ein Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12 verwendet wird.