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WO2013060478A1 - Miniaturisiertes mikroskopiesystem zur zustandsbestimmung von zellen - Google Patents

Miniaturisiertes mikroskopiesystem zur zustandsbestimmung von zellen Download PDF

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Publication number
WO2013060478A1
WO2013060478A1 PCT/EP2012/004507 EP2012004507W WO2013060478A1 WO 2013060478 A1 WO2013060478 A1 WO 2013060478A1 EP 2012004507 W EP2012004507 W EP 2012004507W WO 2013060478 A1 WO2013060478 A1 WO 2013060478A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
optical
cells
microscopy system
unit
sensor surface
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2012/004507
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Velten
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of WO2013060478A1 publication Critical patent/WO2013060478A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure

Definitions

  • the present invention relates to a
  • Microscopy system for determining the state of biological cells comprising an optical imaging unit with an optical sensor and an optional illumination unit.
  • the invention also relates to a use of such a microscopy system in a cell-populated sealed environment, for example in a bioreactor.
  • Bioreactors can only be used efficiently for bacterial growth and / or metabolite synthesis if optimum conditions for the cells are present everywhere in the bioreactor. However, especially in large bioreactors, the same conditions do not prevail everywhere (eg temperature, nutrient concentrations, etc.). It would therefore be desirable to be able to detect the state of the cells at different locations within the bioreactor. So far, however, no technique is known with the state of cells in the bioreactor quasi-continuous and can be detected on-line. State of the art
  • Microscope can bring in a bioreactor. Even more impossible it is several microscopes in one
  • Bioreactor so as to detect the state of cells in different locations of the bioreactor.
  • Microscopy system includes an optical sensor chip and a lighting unit. For the determination of
  • Incubators can be added to the bioreactor / incubator look inside and observe cells adhering to the silicon nitride membrane.
  • the described system is not suitable for use in a bioreactor.
  • the object of the present invention is to provide a microscopy system for determining the
  • microscopy system according to claim 1.
  • Advantageous embodiments of the microscopy system are the subject of the dependent claims or can be the following
  • the proposed microscopy system for determining the state of biological cells which can also be regarded as a cell microscope, has a
  • optical image capture unit with an optical sensor or detector and an optional lighting unit on.
  • the optical image acquisition unit is enclosed by a water-tight and moisture-tight envelope, which extends over the sensor surface of the optical sensor or at least one region used for the state determination of this sensor surface by an optical
  • the state determination is carried out by evaluating an image recorded with the image acquisition unit, which is caused by the interaction of the illumination unit
  • Lighting unit can through the generated image
  • Reflection of the light can be obtained at the cells or in the form of a shadow projection of the cells.
  • Secondary radiation can also be used for image recording, for example luminescence light emitted by the cells or substances associated therewith.
  • the microscopy system can remain for several days in the cell-populated environment, in particular in a bioreactor, and the recorded image data to an outside of this
  • the images can then be displayed and / or appropriately evaluated for the condition of the cells
  • the microscopy system is preferably equipped with a wireless transmission unit, which is likewise located within the enclosure and can transmit the image data recorded by the image generation unit wirelessly to the external reception unit.
  • a power supply for the individual components of the microscope system, in particular for the electronics of the image acquisition unit, the illumination unit and the transfer unit, which is arranged within the envelope, is also preferably also
  • the power supply unit can be designed to be rechargeable and designed such that the recharging by inductive coupling of energy from outside the Serving is made possible. The charging can then be continuous during the operation of the
  • the rechargeable power supply unit electrical contacts are led to the outside, which can be connected to a charging electronics.
  • the power supply unit can then be charged after each use via these contacts.
  • the sensor surface of the optical sensor is composed in a known manner from a two-dimensional grid or array of individual detector elements, also referred to as pixels.
  • Sensor surface must be arranged at a small distance to the sensor surface and be made sufficiently thin to an evaluation of the state such as the cell morphology, the division behavior or the
  • the outwardly directed surface of the optically transparent layer which faces away from the sensor surface, is at a distance from the sensor surface, in which the optical resolution of the cells resting on this surface is limited by the size of the pixels of the sensor surface and not by diffraction effects in the case of shadow projection ,
  • the thickness of the optically transparent layer and the air gap should be chosen so that the resolution of the selected camera chip through the pixels of the chip and not by the diffraction effects in the
  • Shadow projection can be determined or limited. The following applies: R s ⁇ Rc- This results in the following d 2
  • optically transparent layer can also be applied directly or via one or more intermediate layers on the sensor surface
  • Patent application to understand that the layer is transparent in an optical wavelength range. This does not have the entire wavelength range of
  • optical wavelengths but can be one
  • Wavelength range of the optical wavelengths is to be understood as the range from the infrared via the visible wavelengths to the ultraviolet.
  • the proposed microscopy system has
  • the optically transparent layer can rest directly on the sensor surface via one or more intermediate layers.
  • the one or more intermediate layers may in turn form or include an optical filter that filters out unwanted wavelength ranges for imaging. Different application examples of such a filter can be found in the following embodiments.
  • the one or more intermediate layers may also include a leveling layer if the sensor surface is not planar. This may be the case with a sensor chip with integrated microlenses, in which the surface is due to the external shape of the
  • Microlenses is structured. By a leveling layer of a suitable material that compensates for the bumps, these bumps do not disturb the planarity of the optically transparent layer and possibly an intermediate filter layer or filter layer sequence.
  • the water and moisture proof enclosure is preferably formed of one or more biocompatible materials or coated with a thin layer of biocompatible material. Through this biocompatible encapsulation or wrapping is the use within a bioreactor or another
  • the wrapper can also be designed so that they open and close again several times leaves, for example, to allow a battery change.
  • the envelope for this purpose can be formed from two halves screwed together with an intermediate seal.
  • an embodiment with integrated wireless data transmission unit and integrated power supply is preferably used, so that no cables run from the microscopy systems through the bioreactor, since these would represent a potential leak for both the microscopy systems and for the wall of the bioreactor.
  • the proposed microscopy system and the proposed method cells in a bioreactor can be observed or microscoped over a long period of time virtually quasi-continuously. The method thus allows on-line monitoring of the condition of cells in a bioreactor or other open or closed environment.
  • Fig. 1 shows an example of an encapsulated microscope system according to an embodiment of the present invention, in which the imaging of the cells on the optical sensor means
  • FIG. 2 shows an example of an encapsulated microscope system according to a further embodiment of the present invention, in which the light of the illumination unit strikes the optically transparent layer;
  • FIG. 3 shows an example of an encapsulated microscopy system according to another embodiment of the present invention, in which the optically transparent layer simultaneously functions as an optical waveguide;
  • FIG. 4 shows an example of an encapsulated microscope system according to another embodiment of the present invention in which between the optically transparent layer and optical
  • FIG. 5 shows an example of an encapsulated microscope system according to a further embodiment of the present invention, in which an indicator layer which can be used for spatially resolved detection of the concentration of one or more substances is immobilized on the optically transparent layer.
  • an extremely highly miniaturized microscope consisting of a lighting unit 20, an optical detector or sensor 6, a
  • Power supply unit 10 constructed and in a suitable water and moisture sealed as well
  • sterilizable housing 8 introduced.
  • Such a system can remain in a bioreactor for several days and transmit the recorded image data wirelessly to a reception unit 9 located outside the bioreactor.
  • the external receiving unit 9 can either display the images themselves on a screen and / or the image data can be sent to a
  • the microscopy system according to the invention in this example thus consists of an extremely highly miniaturized microscope, a wireless data transmission unit, a power supply unit, a suitable water and moisture proof and sterilizable housing and a receiving unit located outside the bioreactor which receives the wirelessly transmitted image data.
  • the compactness of the system is preferably achieved by constructing the microscope lens-free.
  • the image of the cells is therefore not imaged by means of lenses on the optical detector. Instead, it is located directly on the detector, e.g. a CCD chip, a very thin optically transparent layer on which the cells adhere.
  • Data transmission unit 7 a power supply unit 10 a housing 8, at least the
  • Components 5, 6, 7 and 10 encloses one
  • Fixing device 3 which connects the lighting unit 20 to the housing 8 and an external
  • Illumination device 20 can also be used together with the fastening device from the housing 8
  • the image of the cells on the optical detector 6 is preferably formed by shadow projection.
  • the light of a nearly punctiform light source 1 (for example LED) is parallelized by means of a suitable device, a so-called collimator 2, which may be, for example, a thin tube with a blackened inner wall a few centimeters long and placed on the cells located on the slide 5.
  • the light is preferably incident
  • the shadows of the cells are from the located directly below the slide 5 optical
  • Detector 6 detected.
  • the distance between the cells and the optical detector 6 is kept very low. This is preferably done by
  • the slide 5 can be designed, for example, as approximately 1 ⁇ m thin silicon nitride layer. This can be realized, for example, by using silicon dioxide (PECVD) (plasma enhanced chemical vapor deposition) of the desired thickness (for example, about 1 ⁇ m) on a substrate, for example on a silicon wafer.
  • PECVD silicon dioxide
  • PECVD plasma enhanced chemical vapor deposition
  • Substrate selectively removed by means of an etching process in the case of a silicon substrate, for example by wet chemical etching with potassium hydroxide solution.
  • the result is a silicon nitride membrane of the desired size, which is surrounded by a silicon frame or a frame of another material. This frame is designated in FIG. 1 as substrate 4.
  • the lateral etching process in the case of a silicon substrate, for example by wet chemical etching with potassium hydroxide solution.
  • the substrate 4 e.g., a silicon frame
  • a suitable device e.g. be brought to the desired size by means of a wafer saw.
  • the substrate 4 facilitates that
  • the preferred substrate material is metal.
  • the metal substrate is made of the same material as the housing 8 of the miniaturized microscopy system.
  • the incidence of light is not perpendicular to the slide 5.
  • the light source 1 of the illumination unit is arranged such that the light beam 21 strikes the slide 5 in a grazing manner.
  • the light beam 21 can furthermore be formed by a suitably shaped diaphragm, which, for example, can be split. is executed shaped (not shown), limited.
  • the reflectivity of the slide 5 has almost the value 1, ie the light coming directly from the light source can not practically pass through the slide 5 and therefore can not reach the optical detector 6. Only the light which is reflected or scattered on the cells located on the slide 5 is able to reach the optical detector 6. The from the
  • Optical image 6 recorded image thus contains information about the adhering to the slide 5 cells.
  • Optical image 6 recorded image thus contains information about the adhering to the slide 5 cells.
  • This method of grazing illumination has the advantage that the overall system can be made even more compact than the system shown in FIG.
  • Light source 1 of the illumination unit coupled in a suitable manner in the very thin slide 5.
  • the slide 5 fulfills the purpose of an optical waveguide and conducts the light.
  • the light coupling which is carried out with the aid of a coupling-22, can be done by known methods. This includes, for example, the
  • grating couplers Coupling by means of prisms or by means of suitable grating structures, so-called grating couplers. It is known that the electromagnetic field of the light guided in a waveguide is not completely in the waveguide. Part of the electromagnetic The field also projects out of the waveguide, eg into the bioreactor. This is known as that
  • This evanescent wave field decays exponentially with distance and typically protrudes only fractions of a micron out of the waveguide, and in the bioreactor it hits either parts of a cell adhering to the slide 5 or liquid
  • Light is scattered or reflected at the cells and parts of the scattered or reflected light
  • an optical filter 23 is located between the cells to be observed and the optical detector 6 in order to filter out or transmit light of specific wavelengths.
  • filters can consist of a plurality of superimposed thin dielectric layers (interference filter) and be produced by means of suitable thin-film technology.
  • the optical filter 23 is located directly on one side of the thin slide 5.
  • the filter layers are preferably deposited directly on the slide 5.
  • the filter layers are deposited directly on the optical detector 6.
  • CCD chips can be used as optical detectors 6. These are usually with a variety
  • microlenses microscopic lenses
  • a thin optically transparent is first applied to the microlenses of the CCD chip
  • This leveling layer 24 applied, which has a leveling effect. This results in a relatively flat surface.
  • the thickness of this leveling layer 24 should preferably be in the range of a few micrometers.
  • the filter layers 23 are applied to the leveling layer 24.
  • the leveling layer 24 is made of a relatively soft polymer material which conforms to the object carrier 5 when pressed against it. In this way, small cavities are prevented between the leveling layer 24 and the slide 5, which fill with a medium having a different optical refractive index than the planar end Alternatively, these voids may be filled with a material, eg a suitable liquid, having the same refractive index as the planarizing material or as used
  • Slide 5 e.g., silicon nitride layer.
  • immersion oil such liquids are known as "immersion oil.” If the leveling layer 24 is omitted, the small cavities forming between the microlenses and the thin slide 5 (eg, silicon nitride layer) should be filled with a material, such as a suitable liquid, which contains the same refractive index as the material has the
  • the optical filter 23 consists of a self-contained thin film (polymer or glass) and is placed between slide 5 and CCD chip or between slide 5 and leveling layer 24, e.g. inserted, clamped or glued. Also in this case, the between the filter 23 and the leveling layer 24 and between the filter 23 and the
  • Microlens forming cavities with a material e.g. a suitable liquid, which has the same refractive index as the planarizing material or like the microlenses.
  • optical filter 23 can advantageously be used if, in addition to or as an alternative to the image of the cells, further optical effects, such as luminescence, are to be detected.
  • at least some of the cells in the bioreactor can be provided with so-called fluorescent markers, which are present either from the outset are, or only when a certain
  • Fluorescence radars do not emit light but are usually excited by photons (photoluminescence).
  • the above-described optical filters 23 can be used to filter out the excitation light which may originate from a light source 1 of the microscopy system according to the invention or also from a light source independent thereof, and only the resulting one
  • microscopy system according to the invention can be used to detect chemiluminescence or bioluminescence occurring in the cells. In these latter cases, no excitation light is necessary for exciting the luminescence.
  • Microscopy system according to the invention for detecting chemo- or bioluminescence can thus be constructed without its own light source 1 or illumination unit.
  • a lighting unit in addition to the chemo- or bioluminescence also an image of the cells can be detected.
  • the slide 5 is provided with a thin layer of an indicator molecule whose
  • the indicator molecules are embedded in a polymer matrix in order to ensure a fixed retention of the indicator molecules on the slide surface, even over a longer period
  • the polymer material is dissolved together with the indicator molecules in a solvent and the resulting liquid by methods such spin-on, spray, print or any other method known in the art on the
  • Polystyrene matrix immobilized The solvent used was chloroform.
  • a thus prepared indicator film 25 has
  • Indicator molecule is sensitive, with a high
  • indicator layers 25 can also be produced. which are suitable for the detection of other substances, such as glucose, lactate or other substances.
  • the indicator layer does not have to be applied as a necessarily homogeneous layer, but can also be applied to the slide 5 as a structured layer.
  • photolithographic methods can be used, as they are known from microsystems technology.
  • the indicator layer can be realized as a structured layer already during printing.
  • Printing techniques falling within this invention include e.g. Gravure, high pressure, offset printing, pad printing and the
  • micro contact printing which was developed especially for the realization of microstructures, but the invention is not limited to the mentioned printing techniques
  • the structure consists of a single coated strip and an adjacent uncoated strip. Further preferred is the
  • the circles or rectangles are about the size of a single light-sensitive pixel of the optical detector 6 (e.g., CCD chip) or a
  • Coated bodies can be used, for example, as
  • the indicator layer 25 may consist of regions of various indicator substances. Again, in addition to the for the
  • Concentration of substance can be detected. It is averaged over all areas coated with the respective indicator molecule and also averaged over all reference ranges. In this case it is advantageous to nest the reference areas and the measuring areas.
  • Data transmission methods usable This includes e.g. the use of radio or optical methods.
  • Corresponding standardized transmission modules and protocols are present in large numbers.
  • radio for example, ZigBee, Bluetooth, WLA or MICS standard can be used.
  • WLA Wireless Local Area Network
  • MICS Wireless Local Area Network
  • IrDA Infrared Data Association
  • the commercially available data transmission modules are usually equipped with a microcontroller. This can be used to control the flow of an image acquisition and transmission sequence
  • this and the data transmission unit 7 must be encapsulated in a suitable manner. Suitable methods, packaging techniques and materials are, for example, in the field of active
  • the housing 8 is preferably made of metal, preferably a metal that meets the requirement
  • Biocompatibility (eg according to ISO 10993 1-20).
  • all materials contacting the cells in the bioreactor should have biocompatibility according to ISO 10993 1-20.
  • a suitable metal is eg titanium. Since the slide 5 come directly into contact with cells and thus a part of Housing must form, the slide 5 and the substrate 4, on which the thin slide 5 is deposited, to connect in a suitable manner with the rest of the housing 8. This can be methods like
  • the entire system can be coated with a thin layer of an optically transparent and biocompatible material.
  • a suitable material is, for example, Parylene C.
  • a suitable thickness of the protective layer may be, for example, 1-5 ⁇ .
  • the housing 8 When using an optical data transmission method, the housing 8 is preferably provided with an optical window.
  • an optical window For this purpose, for example, glass can be used, which is connected by means of one of the methods described above with the rest of the housing.
  • data transmission by electromagnetic waves is usually a
  • Ceramic bushings can be realized. These are usually designed so that they are directly in one
  • Metal housing can be welded. Alternatively, the above-mentioned methods soldering and gluing can also be used here.
  • the antenna itself can be coated, for example, by means of a thin Parylene C layer. Alternatively or in addition The antenna can be embedded in biocompatible silicone.
  • a battery can be used, as it is also used in active medical implants, for example. Pacemaker.
  • active medical implants for example. Pacemaker.
  • the invention is not disclosed on the
  • the lighting unit need not necessarily be connected to the imaging unit or its housing or enclosure, but may also form a separate unit with its own power supply.
  • the embodiments of the individual embodiments can also be combined with each other.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein miniaturisiertes Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor (6) und eine optionale Beleuchtungseinheit (20) aufweist. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung (8) umschlossen, die über einer Sensorfläche des optischen Sensors (6) oder zumindest einem Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht (5) gebildet ist. Die von der Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht (5) weist dabei einen Abstand zur Sensorfläche auf, bei dem eine Schattenprojektion von auf der Oberfläche aufliegenden Zellen auf die Sensorfläche eine optische Auflösung ermöglicht, die durch eine Pixelgröße von Pixeln des optischen Sensors (6) bestimmt wird. Durch die Übertragung der aufgenommenen Bilddaten von Zellen, die an der optisch transparenten Schicht anhaften, an eine externe Empfangseinheit lässt das Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von Zellen direkt in einen Bioreaktor einsetzen.

Description

MINIATURISIERTES MIKROSKOPIESYSTEM ZUR ZUSTANSBESTIMMUNG
VON ZELLEN
Technisches Anwendungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein
Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor und eine optionale Beleuchtungseinheit aufweist. Die Erfindung betrifft auch eine Verwendung eines derartigen Mikroskopie- Systems in einer von Zellen besiedelten abgeschlossenen Umgebung, beispielsweise in einem Bioreaktor.
Bioreaktoren können nur dann für bakterielles Wachstum und/oder Metaboliten-Synthese effizient genutzt werden, wenn überall im Bioreaktor optimale Bedingungen für die Zellen vorliegen. Vor allem in großen Bioreaktoren herrschen allerdings nicht überall die gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Nährstoff - konzentrationen, etc.). Es wäre daher erstrebenswert, den Zustand der Zellen an verschiedenen Orten innerhalb des Bioreaktors erfassen zu können. Bisher ist jedoch keine Technik bekannt, mit der der Zustand von Zellen im Bioreaktor quasi -kontinuierlich und on-line erfasst werden kann. Stand der Technik
Heutzutage wird die Effizienz der im Bioreaktor ablaufenden Prozesse anhand der entstehenden Produkte beurteilt. Wenn die gewünschten Produkte in ausreichender Menge produziert wurden, dann wird davon ausgegangen, dass die von außen eingestellten und konstant gehaltenen Parameter (wie z.B. Temperatur) einen optimalen Zustand der Zellen ermöglichten. Der Zustand der Zellen selbst wird nicht überwacht. Eine heutige etablierte Methode um den Zustand der
Zellen selbst zu messen ist die Beobachtung von Zellen mit Hilfe eines Mikroskops. Man kann z.B. aus der
Teilungsrate auf die Vitalität der Zellen schließen. Außerdem kann die Zellmorphologie oder das Anhaft- verhalten der Zellen als Kriterium herangezogen werden. Diese Untersuchungen sind jedoch nur außerhalb eines Bioreaktors möglich, da man nicht ein komplettes
Mikroskop in einen Bioreaktor einbringen kann. Noch unmöglicher ist es mehrere Mikroskope in einen
Bioreaktor zu bringen, um so den Zustand von Zellen an verschiedenen Orten des Bioreaktors zu erfassen.
Ein Konzept zur Realisierung eines sehr kompakten Mikroskopiesystems wurde von Li et al . (Wei Li ;
Knoll, T.; Thielecke, H.; „On-chip integrated
lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells", Engineering in
Medicine and Biology Society (EMBC) , 2010 Annual
International Conference of the IEEE, Aug. 31 2010- Sept. 4 2010, Pages 1012 - 1015) beschrieben. Das
Mikroskopiesystem umfasst einen optischen Sensorchip und eine Beleuchtungseinheit. Zur Bestimmung des
Zustands von Zellen wird ein stark miniaturisierter Bioreaktor bzw. Inkubator auf den Sensorchip aufge- setzt. Das Mikroskopiesystem befindet sich also
außerhalb des Bioreaktors/Inkubators . Durch eine optisch transparente dünne Siliziumnitridmembran hindurch, die die Bodenfläche des Bioreaktors/
Inkubators bildet, kann man in den Bioreaktor/Inkubator hinein schauen und auf der Siliziumnitrid-Membran anhaftende Zellen beobachten. Für den Einsatz in einem Bioreaktor ist das beschriebene System jedoch nicht geeignet .
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des
Zustands von biologischen Zellen anzugeben, das auch in einem Bioreaktor einsetzbar ist.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe wird mit dem Mikroskopiesystem gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Mikroskopiesystems sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche oder lassen sich der nachfolgenden
Beschreibung sowie den Ausführungsbeispielen entnehmen.
Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das auch als Zellmikroskop angesehen werden kann, weist eine
optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor oder Detektor sowie eine optionale Beleuchtungs- einheit auf. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung umschlossen, die über der Sensorfläche des optischen Sensors oder zumindest einem für die ZustandsbeStimmung genutzten Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch
transparente Schicht gebildet ist. Bei diesem Mikroskopiesystem erfolgt die Zustands- bestimmung durch Auswertung eines mit der Bilderfassungseinheit aufgezeichneten Bildes, das durch Wechselwirkung des von der Beleuchtungseinheit
abgestrahlten Lichts mit Zellen erhalten wird, die auf der optisch transparenten Schicht über der Sensorfläche aufliegen oder an dieser Schicht anhaften. In
Abhängigkeit von der Lichteinstrahlung durch die
Beleuchtungseinheit kann das erzeugte Bild durch
Reflexion des Lichtes an den Zellen oder in Form einer Schattenprojektion der Zellen erhalten werden. Auch sekundäre Strahlung kann für die Bildaufzeichnung genutzt werden, beispielsweise von den Zellen oder mit diesen verbundenen Stoffen ausgestrahltes Lumineszenz- licht.
Aufgrund der wasser- und feuchtedichten Umhüllung bzw. Verkapselung kann das Mikroskopiesystem über mehrere Tage in der von Zellen besiedelten Umgebung, insbesondere in einem Bioreaktor, verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten an eine außerhalb dieser
Umgebung befindliche Empfangseinheit übermitteln. Die Bilder können dann dargestellt und/oder geeignet ausgewertet werden, um den Zustand der Zellen
beispielsweise über deren Größe oder Form zu bestimmen. Vorzugsweise ist das Mikroskopiesystem hierzu mit einer drahtlosen Übertragungseinheit ausgestattet, die sich ebenfalls innerhalb der Umhüllung befindet und die mit der Bilderzeugungseinheit aufgezeichneten Bilddaten drahtlos an die externe Empfangseinheit übermitteln kann. Auch eine Energieversorgung für die einzelnen Komponenten des Mikroskopiesystems, insbesondere für die innerhalb der Umhüllung angeordnete Elektronik der Bilderfassungseinheit, die Beleuchtungseinheit und die Übertragungseinheit, ist vorzugsweise ebenfalls
innerhalb der Umhüllung angeordnet. Die Energieversorgungseinheit kann wiederaufladbar ausgebildet und so ausgestaltet sein, dass die Wiederaufladung durch induktives Einkoppeln von Energie von außerhalb der Umhüllung ermöglicht wird. Das Aufladen kann dann kontinuierlich während des Betriebs des
Mikroskopiesystems oder jeweils nach einem Einsatz erfolgen. In einer anderen Ausgestaltung einer
wiederaufladbaren Energieversorgungseinheit sind elektrische Kontakte nach außen geführt, die mit einer Ladeelektronik verbunden werden können. Die Energieversorgungseinheit lässt sich dann nach jedem Einsatz über diese Kontakte aufladen. Die Sensorfläche des optischen Sensors setzt sich in bekannter Weise aus einem zweidimensionalen Raster bzw. Array von einzelnen Detektorelementen zusammen, auch als Pixel bezeichnet.
Die optisch transparente Schicht über der
Sensorfläche muss in geringem Abstand zur Sensorfläche angeordnet und ausreichend dünn ausgebildet sein, um eine Auswertung des Zustands wie bspw. der Zell- morphologie, des Teilungsverhaltens oder des
Anhaftverhaltens der aufliegenden Zellen aus dem erzeugten Bild zu ermöglichen. Hierzu weist die nach außen gerichtete, d.h. von der Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht einen Abstand zur Sensorfläche auf, bei dem die optische Auflösung der auf dieser Oberfläche aufliegenden Zellen bei einer Schattenprojektion durch die Größe der Pixel der Sensorfläche und nicht durch Beugungseffekte begrenzt ist. So ist bspw. die optische Auflösung Rc eines Kamerachips, wie er als optischer Sensor bei dem vorliegenden Mikroskopiesystem eingesetzt werden kann, durch die zweifache Pixelgröße SP gegeben, d.h. Rc =
2SP. Die Auflösung bei einer Schattenprojektion Rs ist gegeben durch Rs = dLufl) . Hierbei bezeichnen ds
Figure imgf000007_0001
die Dicke der optisch transparenten Schicht, ns den Brechungsindex dieser Schicht, dLuft die Dicke des
Luftspalts zwischen der optisch transparenten Schicht und der Sensorfläche und λ die Wellenlänge des einfallenden und für die Schattenprojektion genutzten Lichts. Die Dicke der optisch transparenten Schicht sowie des Luftspalts sollen dabei so gewählt werden, dass bei dem gewählten Kamerachip die Auflösung durch die Pixel des Chips und nicht durch die Beugungseffekte bei der
Schattenprojektion bestimmt bzw. begrenzt werden. Es soll somit gelten: Rs ^ Rc- Damit ergibt sich folgende d 2
Bedingung : + dLufl <--S/
ns λ
Die optisch transparente Schicht kann dabei selbstverständlich auch direkt oder über eine oder mehrere Zwischenschichten auf der Sensorfläche
aufliegen, wobei sich eine ähnliche Beziehung ergibt, bei der lediglich der Term dLUft wegfällt oder durch Terme dZSi/nzsi für die einzelnen Zwischenschichten i mit Dicken dZSi und Brechungsindizes nzsi ersetzt wird. Unter der optischen Transparenz ist in der vorliegenden
Patentanmeldung zu verstehen, dass die Schicht in einem optischen Wellenlängenbereich transparent ist. Dies muss nicht der gesamte Wellenlängenbereich der
optischen Wellenlängen sein, sondern kann einen
kleineren Bereich daraus betreffen. Unter dem
Wellenlängenbereich der optischen Wellenlängen ist hierbei der Bereich vom Infraroten über die sichtbaren Wellenlängen bis ins Ultraviolette zu verstehen. Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem weist
vorzugsweise keine zusätzlichen Linsen zwischen der Sensorfläche und der optisch transparenten Schicht auf, so dass das Bild der Zellen vorzugsweise als reine Schattenprojektion auf die Sensorfläche abgebildet wird. Dadurch wird das Mikroskopiesystem sehr kompakt.
Die optisch transparente Schicht kann über eine oder mehrere Zwischenschichten direkt auf der Sensorfläche aufliegen. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können wiederum einen optischen Filter bilden oder umfassen, der unerwünschte Wellenlängenbereiche für die Bilderzeugung ausfiltert. Unterschiedliche Anwendungsbeispiele eines derartigen Filters sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen zu finden. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können auch eine Einebnungsschicht umfassen, falls die Sensoroberfläche nicht plan ausgebildet ist. Dies kann bei einem Sensorchip mit integrierten Mikrolinsen der Fall sein, bei dem die Oberfläche durch die äußere Form der
Mikrolinsen strukturiert ist. Durch eine Einebnungsschicht aus einem geeigneten Material, das die Unebenheiten ausgleicht, stören diese Unebenheiten nicht die Planität der optisch transparenten Schicht und ggf. einer zwischenliegenden Filterschicht oder Filterschichtfolge .
Die wasser- und feuchtedichte Umhüllung ist vorzugsweise aus einem oder mehreren biokompatiblen Materialien ausgebildet oder mit einer dünnen Schicht aus biokompatiblem Material beschichtet. Durch diese biokompatible Kapselung bzw. Umhüllung ist der Einsatz innerhalb eines Bioreaktors oder einer anderen
Umgebung, bspw. innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers, problemlos möglich, um dort den Zustand von Zellen, bspw. das Zellwachstum, beobachten zu können. Die Umhüllung kann auch so ausgebildet sein, dass sie sich mehrmals öffnen und wieder verschließen lässt, um beispielsweise einen Batteriewechsel zu ermöglichen. In einer Ausgestaltung kann die Umhüllung hierzu aus zwei miteinander verschraubbaren Hälften mit zwischenliegender Dichtung gebildet sein.
Bei dem vorgeschlagenen Verfahren zur Erfassung des Zustande von Zellen in einer von Zellen besiedelten Umgebung werden mehrere der vorgeschlagenen miniaturisierten Mikroskopiesysteme innerhalb der Umgebung angeordnet und von den optischen Sensoren erzeugte
Bilddaten ausgewertet. Durch die geringe Baugröße und in sich geschlossene Ausführung der Mikroskopiesysteme lassen sich diese problemlos in einem Bioreaktor einsetzen. Vorzugsweise wird hierzu eine Ausgestaltung mit integrierter drahtloser Datenübertragungseinheit und integrierter Energieversorgung genutzt, damit keine Kabel von den Mikroskopiesystemen aus durch den Bioreaktor verlaufen, da diese eine potentielle Leckstelle sowohl für die Mikroskopiesysteme als auch für die Wand des Bioreaktors darstellen würden. Mit dem vorgeschlagenen Mikroskopiesystem sowie dem vorgeschlagenen Verfahren lassen sich Zellen in einem Bioreaktor über einen langen Zeitraum quasi -kontinuierlich beobachten bzw. mikroskopieren. Das Verfahren ermöglicht somit eine on-line Überwachung des Zustands von Zellen in einem Bioreaktor oder einer anderen offenen oder geschlossenen Umgebung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das vorgeschlagene Verfahren und das zugehörige miniaturisierte und in sich gekapselte Mikroskopiesystem werden nachfolgend anhand eines Ausführungs- beispiels in Verbindung mit den Zeichnungen nochmals kurz erläutert. Hierbei zeigen: Fig. 1 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die Abbildung der Zellen auf den optischen Sensor mittels
Schattenprojektion erfolgt;
Fig. 2 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem das Licht der Beleuchtungseinheit streifend auf die optisch transparente Schicht einfällt;
Fig. 3 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die optisch transparente Schicht gleichzeitig als Lichtwellenleiter fungiert;
Fig. 4 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bei dem zwischen der optisch transparenten Schicht und optischem
Sensor ein optisches Filter verwendet wird; und
Fig. 5 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem auf der optisch transparenten Schicht eine Indikatorschicht immobilisiert ist, die zur ortsaufgelösten Detektion der Konzentration eines oder mehrerer Stoffe verwendet werden kann.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Bei den im Folgenden beschriebenen Ausführungs- beispielen wird ein extrem stark miniaturisiertes Mikroskop bestehend aus einer Beleuchtungseinheit 20, einem optischen Detektor bzw. Sensor 6, einer
drahtlosen Datenübertragungseinheit 7 und einer
Energieversorgungseinheit 10 aufgebaut und in ein geeignetes wasser- und feuchtedichtes sowie
sterilisierbares Gehäuse 8 eingebracht. Ein solches System kann über mehrere Tage in einem Bioreaktor verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten drahtlos an eine außerhalb des Bioreaktors befindliche Empfangs - einheit 9 übermitteln. Die externe Empfangseinheit 9 kann die Bilder entweder selbst auf einem Bildschirm darstellen und/oder die Bilddaten können an einen
Computer weitergeleitet werden. Das erfindungsgemäße Mikroskopiesystem in diesem Beispiel besteht somit aus einem extrem stark miniaturisierten Mikroskop, einer drahtlosen Datenübertragungseinheit, einer Energieversorgungseinheit, einem geeigneten wasser- und feuchtedichten und sterilisierbaren Gehäuse und einer außerhalb des Bioreaktors befindlichen Empfangseinheit, welche die drahtlos übermittelten Bilddaten empfängt. Die Kompaktheit des Systems wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass das Mikroskop linsenfrei aufgebaut wird. Das Bild der Zellen wird also nicht mittels Linsen auf den optischen Detektor abgebildet. Stattdessen befindet sich unmittelbar auf dem Detektor, z.B. einem CCD-Chip, eine sehr dünne optisch transparente Schicht, auf der sich die Zellen anhaften.
In einer ersten Ausgestaltung besteht das
erfindungsgemäße System aus den in Fig. 1 gezeigten Grundkomponenten: Einer Beleuchtungseinheit 20,
bestehend aus Lichtquelle 1 und einem Kollimator 2, einer optisch transparenten dünnen Schicht als
Objektträger 5, einem optischen Detektor 6, einer
Datenübertragungseinheit 7, einer Energieversorgungs- einheit 10, einem Gehäuse 8, das wenigstens die
Komponenten 5, 6, 7 und 10 umschließt, einer
Befestigungsvorrichtung 3, die die Beleuchtungseinheit 20 mit dem Gehäuse 8 verbindet und einer externen
Empfangseinheit 9. Die elektrischen Teile der
Beleuchtungseinrichtung 20 können zusammen mit der Befestigungseinrichtung ebenfalls vom Gehäuse 8
umschlossen oder auch in einer separaten wasser- und feuchtedichten Umhüllung untergebracht sein, wobei dann die elektrische Verbindung mit der Energieversorgungs- einheit 10 ebenfalls geeignet abgedichtet sein muss.
Nach Einbringen dieses Systems in einen Bioreaktor setzen sich im Bioreaktor befindliche Zellen auf dem System, vor allem aber auf dem Objektträger 5 ab. Das Bild der Zellen auf dem optischen Detektor 6 entsteht vorzugsweise durch Schattenprojektion. Dazu wird das Licht einer nahezu punktförmigen Lichtquelle 1 (z.B. LED) mittels einer geeigneten Vorrichtung, eines sogenannten Kollimators 2, der beispielsweise als wenige Zentimeter langes dünnes Röhrchen mit geschwärzter Innenwand ausgeführt sein kann, parallelisiert und auf die auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen geleitet. Der Lichteinfall erfolgt vorzugsweise
senkrecht zur Fläche des Objektträgers 5, d.h.
vorzugsweise parallel zur Normalen auf dem Objektträger 5. Die Schatten der Zellen werden von dem unmittelbar unter dem Objektträger 5 befindlichen optischen
Detektor 6 detektiert. Um den Einfluss von Beugung- seffekten auf die Bildqualität zu minimieren, wird der Abstand zwischen Zellen und optischem Detektor 6 sehr gering gehalten. Dies wird vorzugsweise dadurch
erreicht, dass der Objektträger 5 sehr dünn ist. Der Objektträger 5 kann z.B. als ca. 1 μτη dünne Siliziumnitridschicht ausgeführt sein. Diese kann beispielsweise realisiert werden, indem mittels PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition) Silizium- nitrid mit der gewünschten Dicke (z.B. ca. 1 am) auf einem Substrat, z.B. auf einem Siliziumwafer ,
abgeschieden wird. In dem Bereich in dem sich später der optische Detektor 6 befinden soll, wird das
Substrat mittels eines Ätzprozesses (im Falle eines Siliziumsubstrats z.B. durch nasschemisches Ätzen mit Kaliumhydroxidlauge) selektiv entfernt. Es resultiert eine Siliziumnitridmembran der gewünschten Größe, welche von einem Siliziumrahmen oder einem Rahmen eines anderen Materials umgeben ist. Dieser Rahmen ist in Fig. 1 als Substrat 4 bezeichnet. Die lateralen
Abmessungen des Substrats 4 (z.B. eines Siliziumrahmens) können mittels einer geeigneten Vorrichtung, z.B. mittels einer Wafersäge, auf die gewünschte Größe gebracht werden. Das Substrat 4 erleichtert das
Handhaben des extrem dünnen Objektträgers 5 und kann verwendet werden, um den Objektträger 5 mit dem Gehäuse 8 des Gesamtsystems zu verbinden. Ein weiteres
bevorzugtes Substratmaterial ist Metall. Vorzugsweise besteht das Metallsubstrat aus dem gleichen Material wie das Gehäuse 8 des miniaturisierten Mikroskopie - Systems .
In einer weiteren erfindungsgemäßen und in Fig. 2 skizzierten Ausgestaltung erfolgt der Lichteinfall nicht senkrecht zum Objektträger 5. Stattdessen ist die Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit so angeordnet, dass der Lichtstrahl 21 streifend auf den Objektträger 5 fällt. Der Lichtstrahl 21 kann weiterhin durch eine geeignet geformte Blende, die beispielsweise spalt- förmig ausgeführt ist (nicht dargestellt) , begrenzt werden. Bei streifendem Einfall hat die Reflektivität des Objektträgers 5 nahezu den Wert 1, d.h. das direkt von der Lichtquelle kommende Licht kann praktisch nicht durch den Objektträger 5 hindurchtreten und kann daher den optischen Detektor 6 nicht erreichen. Lediglich das Licht, das an den auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen reflektiert oder gestreut wird, ist in der Lage, den optischen Detektor 6 zu erreichen. Das vom
optischen Detektor 6 aufgenommene Bild enthält also Informationen über die auf dem Objektträger 5 anhaftenden Zellen. Durch eine räumliche Begrenzung des Lichtstrahls werden nur die unmittelbar auf dem Objektträger 5 sitzenden Zellen bestrahlt, so dass nur von diesen Licht in Richtung des optischen Detektors 6 gestreut oder reflektiert werden kann.
Diese Methode der streifenden Beleuchtung hat den Vorteil, dass das Gesamtsystem noch kompakter aufgebaut werden kann als das in Fig. 1 gezeigte System.
In einer weiteren erfindungsgemäßen und in Fig. 3 dargestellten Ausgestaltung wird das Licht der
Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit in geeigneter Weise in den sehr dünnen Objektträger 5 eingekoppelt. Der Objektträger 5 erfüllt den Zweck eines optischen Lichtwellenleiters und leitet das Licht. Die Lichteinkopplung, welche mit Hilfe einer Einkoppel- vorrichtung 22 vorgenommen wird, kann mit bekannten Methoden erfolgen. Dazu zählt beispielsweise das
Einkoppeln mittels Prismen oder mittels geeigneter Gitterstrukturen, sogenannter Gitterkoppler . Es ist bekannt, dass sich das elektromagnetische Feld des in einem Wellenleiter geführten Lichts nicht vollständig im Wellenleiter befindet. Ein Teil des elektromagne- tischen Felds ragt auch aus dem Wellenleiter heraus, z.B. in den Bioreaktor. Dies ist bekannt als das
sogenannte „evaneszente Wellenfeld". Dieses evaneszente Wellenfeld klingt exponentiell mit dem Abstand ab und ragt typischerweise nur Bruchteile eines Mikrometers aus dem Wellenleiter heraus. Im Bioreaktor trifft es entweder auf an dem Objektträger 5 anhaftende Teile einer Zelle oder auf Flüssigkeit. Ein Teil dieses
Lichts wird an den Zellen gestreut oder reflektiert und Teile des gestreuten oder reflektierten Lichts
erreichen den optischen Detektor 6 und ergeben dort ein Bild, das eine Aussage über das Anhaftverhalten der Zellen auf dem Objektträger 5 ermöglicht. Eine
Beobachtung des Anhaftverhaltens über einen längeren Zeitraum gibt weiterhin Informationen über die Bewegung der Zellen auf dem Objektträger 5. Anhand des Anhaftmusters ist weiterhin eine Zellteilung erkennbar. Man kann so also auch eine Aussage über das Proliferations- verhalten der Zellen gewinnen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems gemäß Fig. 4 befindet sich zwischen den zu beobachtenden Zellen und dem optischen Detektor 6 ein optisches Filter 23, um Licht bestimmter Wellenlängen herauszufiltern oder durchzulassen. Beispielsweise können solche Filter aus mehreren übereinanderliegenden dünnen dielektrischen Schichten bestehen (Interferenzfilter) und mittels geeigneter Dünnschichttechnik hergestellt sein.
Vorzugsweise befindet sich das optische Filter 23 direkt auf einer Seite des dünnen Objektträgers 5. Die Filterschichten werden vorzugsweise direkt auf dem Objektträger 5 abgeschieden. In einer weiteren bevorzugten Anordnung werden die Filterschichten direkt auf dem optischen Detektor 6 abgeschieden.
Als optische Detektoren 6 können beispielsweise kommerziell erhältliche CCD-Chips eingesetzt werden. Diese sind üblicherweise mit einer Vielzahl
mikroskopisch kleiner Linsen (Mikrolinsen) versehen. Daraus resultiert eine sehr unebene Oberfläche des CCD- Chips. Werden die optischen Filterschichten direkt auf den Mikrolinsen abgeschieden, so trifft ein senkrecht zum CCD-Chip einfallender Lichtstrahl aufgrund der gekrümmten Oberflächen der Mikrolinsen an verschiedenen Orten unter einem unterschiedlichen Winkel auf die Filterschichten. Dadurch ist die effektiv in den
Filterschichten durchlaufene optische Weglänge
ebenfalls von Ort zu Ort verschieden. Dies resultiert in einer von Ort zu Ort verschiedenen Filterwirkung. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems wird daher auf die Mikrolinsen des CCD-Chips zunächst eine dünne optisch transparente
Schicht 24 aufgebracht, die einen einebnenden Effekt hat. Daraus resultiert eine relativ ebene Oberfläche. Die Dicke dieser Einebnungsschicht 24 soll vorzugsweise im Bereich weniger Mikrometer liegen. In einer
bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Mikroskopiesystems werden die Filterschichten 23 auf die Einebnungsschicht 24 aufgebracht. Vorzugsweise besteht die Einebnungsschicht 24 aus einem relativ weichen Polymermaterial, das sich beim Andrücken des Objektträgers 5 an diesen anschmiegt. Auf diese Weise wird verhindert, dass sich zwischen der Einebnungsschicht 24 und dem Objektträger 5 kleine Hohlräume befinden, die sich mit einem Medium füllen, das einen anderen optischen Brechungsindex hat als das einebnende Material selbst. Alternativ können diese Hohlräume mit einem Material, z.B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material oder wie der verwendete
Objektträger 5 (z.B. Siliziumnitridschicht). In der
Optik sind solche Flüssigkeiten als „ Immersionsöl" bekannt. Falls auf die Einebnungsschicht 24 verzichtet wird, so sollten die sich zwischen den Mikrolinsen und dem dünnen Objektträger 5 (z.B. Siliziumnitridschicht) bildenden kleinen Hohlräume mit einem Material wie z.B. einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das Material der
Mikrolinsen oder wie der verwendete Objektträger 5. In einer weiteren möglichen Ausgestaltung besteht das optische Filter 23 aus einer eigenständigen dünnen Folie (Polymer oder Glas) und wird zwischen Objektträger 5 und CCD-Chip bzw. zwischen Objektträger 5 und Einebnungsschicht 24 eingebracht, z.B. eingelegt, eingeklemmt oder eingeklebt. Auch in diesem Fall können sich die zwischen dem Filter 23 und der Einebnungsschicht 24 bzw. zwischen dem Filter 23 und den
Mikrolinsen bildenden Hohlräume mit einem Material, z.B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material bzw. wie die Mikrolinsen.
Die Verwendung der beschriebenen optischen Filter 23 kann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn zusätzlich oder alternativ zum Bild der Zellen weitere optische Effekte, wie z.B. eine Lumineszenz, detektiert werden soll. Beispielsweise können zumindest einige der Zellen im Bioreaktor mit sogenannten Fluoreszenzmarkern versehen sein, die entweder von vorn herein vorhanden sind, oder erst beim Eintreten einer bestimmten
Situation in der Zelle gebildet werden. Die
Fluoreszenzraarker leuchten nicht von sich aus, sondern werden üblicherweise mit Photonen zum Leuchten angeregt (Photolumineszenz) . In diesem Fall können die oben beschriebenen optischen Filter 23 dazu verwendet werden, um das Anregungslicht, das von einer Lichtquelle 1 des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems oder auch von einer davon unabhängigen Lichtquelle stammen kann, herauszufiltern und nur die entstandene
Lumineszenz zu dem optischen Detektor 6 durchzulassen. Falls eine Lichtquelle 1 des Mikroskopiesystems
verwendet werden soll, so sind alle oben genannten Konfigurationen (Licht fällt senkrecht auf den Objekt- träger 5, Licht fällt streifend auf den Objektträger 5, Objektträger fungiert als Lichtwellenleiter, in den das Anregungslicht eingekoppelt wird) verwendbar.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mikroskopie- System zur Detektion einer Chemolumineszenz oder einer in den Zellen auftretenden Biolumineszenz verwendet werden. In diesen letzteren Fällen ist kein Anregungslicht zum Anregen der Lumineszenz nötig. Ein
erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem zum Detektieren einer Chemo- oder Biolumineszenz kann also ohne eigene Lichtquelle 1 bzw. Beleuchtungseinheit aufgebaut sein. Selbstverständlich kann bei Nutzung einer Beleuchtungs- einheit neben der Chemo- oder Biolumineszenz auch ein Bild der Zellen detektiert werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung gemäß Fig. 5 ist der Objektträger 5 mit einer dünnen Schicht eines Indikatormoleküls versehen, dessen
Lumineszenzverhalten von der Anwesenheit bestimmter Stoffe oder von dem pH-Wert oder der Temperatur der unmittelbaren Umgebung abhängt. Vorzugsweise sind die Indikatormoleküle in eine Polymermatrix eingebettet, um ein ortsfestes Verbleiben der Indikatormoleküle auf der Objektträgeroberfläche auch über einen längeren
Zeitraum zu gewährleisten. Zum Aufbringen als dünne Schicht, wird beispielsweise das Polymermaterial zusammen mit den Indikatormolekülen in einem Lösemittel gelöst und die resultierende Flüssigkeit mit Methoden wie Aufschleudern, Aufsprühen, Drucken oder einer anderen dem Fachmann bekannten Methode auf die
Oberfläche des Objektträgers 5 aufgebracht. Nach dem Verdunsten des Lösemittels bildet sich ein fester
Polymerfilm, in den die Indikatormoleküle eingebettet sind. Eine solche Methode ist z.B. in M. Staal, E.I. Prest, J.S. Vrouwenvelder, L.F. Rickelt, M. Kühl: „A simple optode based method for imaging 02 distribution and dynamics in tap water biofilms", waterresearch 45 (2011) pp. 5027-5037 für den Fall Sauerstoff -sensitiver Indikatormoleküle beschrieben. Bei der dort
beschriebenen Methode wurde Ruthenium (II) -tris-4 , 7- diphenyl-1 , 10-phenanthroline (Ru-dpp) in einer
Polystyrolmatrix immobilisiert. Als Lösemittel kam Chloroform zum Einsatz.
Ein so hergestellter Indikatorfilm 25 hat
vorzugsweise eine Schichtdicke von unter 10 μπι, vorzugsweise unter 5 μπι, um die ortsaufgelöste
Detektion des Stoffes, für den das verwendete
Indikatormolekül sensitiv ist, mit einer hohen
räumlichen Auflösung zu ermöglichen. Es soll hier noch einmal darauf hingewiesen werden, dass die Anwendung nicht auf die Detektion von Sauerstoff beschränkt ist. Bei Verwendung eines entsprechenden Indikatormoleküls können auch Indikatorschichten 25 hergestellt werden, die zur Detektion anderer Stoffe, wie z.B. Glukose, Laktat oder weitere Stoffe, geeignet sind. Weiterhin muss die Indikatorschicht nicht als notwendigerweise als homogene Schicht, sondern kann auch als struktu- rierte Schicht auf den Objektträger 5 aufgebracht werden. Dazu können beispielsweise fotolithografische Methoden eingesetzt werden, wie sie aus der Mikro- systemtechnik bekannt sind. Bei Verwendung einer
Drucktechnik zum Aufbringen der Indikatorschicht, kann die Indikatorschicht schon beim Drucken als strukturierte Schicht realisiert werden. Drucktechniken, die unter diese Erfindung fallen beinhalten z.B. Tiefdruck, Hochdruck, Offsetdruck, Tampondruck sowie das
sogenannte „micro contact printing", welches speziell für die Realisierung von Mikrostrukturen entwickelt wurde. Die Erfindung ist jedoch nicht nur auf die genannten Drucktechniken beschränkt. Sehr vorteilhaft können beispielsweise Strukturen in Form eines
Streifenmusters eingesetzt werden, wobei die Struktur im einfachsten Fall aus einem einzigen beschichteten Streifen und einem benachbarten nicht beschichteten Streifen besteht. Weiterhin bevorzugt besteht die
Struktur aus einzelnen Kreisen oder Rechtecken.
Vorzugsweise haben die Kreise oder Rechtecke etwa die Größe eines einzelnen lichtsensitiven Pixels des optischen Detektors 6 (z.B. CCD-Chip) oder ein
ganzzahliges Vielfaches dieser Größe. Die nicht
beschichteten Stellen können beispielsweise als
Referenz dienen, d.h. die Intensität der von den beschichteten Stellen kommenden Lumineszenz und die von den unbeschichteten Stellen kommende Lumineszenz können getrennt detektiert werden. Das eigentliche Messsignal kann dann aus den beiden getrennt voneinander
gemessenen Einzelwerten berechnet werden. Bei der Berechnung kann es vorteilhaft sein, das Verhältnis zwischen den im beschichteten Bereich und dem
Referenzbereich gemessenen Lumineszenzintensitäten zu bilden.
Zum gleichzeitigen Messen mehrerer Stoffe oder
Größen (z.B. Temperatur, pH-Wert) kann die Indikatorschicht 25 aus Bereichen verschiedener Indikatorstoffe bestehen. Auch hier können, neben den für die
verschiedenen Stoffe sensitiven Bereichen, weitere Bereiche angeordnet werden, die keine Indikatormoleküle enthalten und somit als Referenz diesen können.
Bei den bisherigen Ausführungen wurde davon ausgegangen, dass die Konzentration des nachzuweisenden Stoffes ortsaufgelöst detektiert werden soll. Mittels einer alternativen Detektionsmethode kann auch ein über den gesamten Objektträger 5 gemittelter Wert der
Stoffkonzentration detektiert werden. Dabei wird über alle mit dem jeweiligen Indikatormolekül beschichteten Bereiche gemittelt und außerdem über alle Referenz - bereiche gemittelt. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Referenzbereiche und die Messbereiche ineinander zu verschachteln. Bei Verwendung eines Indikatormoleküls für den Stoff A, eines Indikatormoleküls für den Stoff B und eines Referenzbereichs (R) sollten bei Verwendung eines Streifenmusters die Streifen in der sich immer fortlaufenden Reihenfolge ABRABRABR usw. auf dem
Objektträger 5 angeordnet sein. Auf diese Art der
Anordnung lassen sich Einflüsse von Inhomogenitäten der Stoffkonzentration oder der Temperaturverteilung auf die Mittelwerte der Stoffkonzentrationen reduzieren.
Zum optischen Anregen einer Lumineszenz sind alle in den Figuren 1, 2 und 3 beschriebenen Konfigurationen der Lichtquelle verwendbar. Außerdem können die in den Figuren 4 und 5 gezeigten optischen Filter 23 zum Abblocken des Anregungslichts vorteilhaft eingesetzt werden .
Zur drahtlosen Übertragung der von dem optischen Detektor 6 als Bilderfassungseinheit aufgenommenen Bilddaten sind prinzipiell alle heute bekannten
Datenübertragungsmethoden verwendbar. Dazu gehört z.B. die Verwendung von Funk oder auch optische Methoden. Entsprechende standardisierte Übertragungsmodule und - Protokolle sind in großer Anzahl vorhanden. Bei der Übertragung per Funk können beispielsweise ZigBee, Bluetooth, WLA oder MICS Standard verwendet werden. Bei einer optischen Übertragung kann beispielsweise das IrDA (Infrared Data Association) Protokoll verwendet werden. Die kommerziell erhältlichen Datenübertragungs- module sind üblicherweise mit einem Mikrocontroller ausgestattet. Dieser kann zur Steuerung des Ablaufs einer Bilderfassungs- und Übertragungssequenz
eingesetzt werden.
Zum Schutz des Mikroskopiesystems vor Flüssigkeiten und Feuchte muss dieses sowie die Datenübertragungseinheit 7 in geeigneter Weise gekapselt werden. Geeignete Verfahren, Gehäusetechniken und -materialien sind beispielsweise aus dem Bereich der aktiven
medizinischen Implantate (z.B. Herzschrittmacher) bekannt. Das Gehäuse 8 ist vorzugsweise aus Metall, vorzugsweise einem Metall, das die Forderung, nach
Biokompatibilität (z.B. gemäß ISO 10993 1-20) erfüllt. Vorzugsweise sollten alle mit den Zellen im Bioreaktor in Kontakt kommenden Materialien eine Biokompatibilität gemäß ISO 10993 1-20 aufweisen. Ein geeignetes Metall ist z.B. Titan. Da der Objektträger 5 unmittelbar mit Zellen in Kontakt kommen und somit einen Teil des Gehäuses bilden muss, ist der Objektträger 5 bzw. das Substrat 4, auf dem der dünne Objektträger 5 abgeschieden ist, in geeigneter Weise mit dem restlichen Gehäuse 8 zu verbinden. Dazu können Methoden wie
Schweißen (z.B. Laserschweißen), Löten oder Kleben eingesetzt werden. Zur Gewährleistung der Biokompatibilität kann beispielsweise das komplette System mit einer dünnen Schicht eines optisch transparenten und biokompatiblen Materials beschichtet werden. Ein geeignetes Material ist beispielsweise Parylene C. Eine geeignete Dicke der Schutzschicht kann beispielsweise 1-5 μπι betragen.
Bei Verwendung einer optischen Datenübertragungs- methode ist das Gehäuse 8 vorzugsweise mit einem optischen Fenster versehen. Hierzu kann beispielsweise Glas eingesetzt werden, das mittels einer der oben beschriebenen Verfahren mit dem restlichen Gehäuse verbunden wird. Im Falle einer Datenübertragung mittels elektromagnetischer Wellen wird üblicherweise eine
Antenne eingesetzt. Diese sollte vorzugsweise außerhalb des Gehäuses angeordnet sein, da sich vor allem im Falle eines Metallgehäuses eine starke Dämpfung der elektromagnetischen Wellen ergeben würde. Die
elektrische Verbindung zwischen Elektronik (innerhalb des Gehäuses) und Antenne (außerhalb des Gehäuses) kann beispielsweise mittels sogenannter Glas- oder
Keramikdurchführungen realisiert werden. Diese sind meist so ausgeführt, dass sie direkt in ein
Metallgehäuse eingeschweißt werden können. Alternativ können auch hier die oben bereits genannten Verfahren Löten und Kleben eingesetzt werden. Die Antenne selbst kann beispielsweise mittels einer dünnen Parylene C - Schicht überzogen werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Antenne in biokompatibles Silikon eingebettet werden .
Die Energieversorgung des erfindungsgemäßen
Systems kann mittels einer Batterie erfolgen.
Beispielsweise kann eine Batterie verwendet werden, wie sie auch bei aktiven medizinischen Implantaten, bspw. Herzschrittmacher, eingesetzt wird. Die Erfindung ist nicht auf die offenbarten
Ausführungsbeispiele eingeschränkt. Auch andere
Variationen können vom Fachmann hieraus abgeleitet werden, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu
verlassen. So muss beispielsweise die Beleuchtungs- einheit nicht zwangsläufig mit der Bilderzeugungs- einheit bzw. dessen Gehäuse oder Umhüllung verbunden sein, sondern kann auch eine separate Einheit mit eigener Stromversorgung bilden. Die Ausgestaltungen der einzelnen Ausführungsbeispiele können auch miteinander kombiniert werden.
Bezugszeichenliste
1 Lichtquelle
2 Kollimator
3 Befestigungsvorrichtung
4 Substrat
5 Obj ektträger
6 optischer Sensor
7 Datenübertragungseinheit
8 Gehäuse
9 externe Empfangseinheit
10 Energieversorgungseinheit
20 Beleuchtungseinheit
21 streifend einfallender Lichtstrahl
22 Einkoppelvorrichtung
23 optisches Filter
24 Einebnungsschicht
25 Indikatorfilm

Claims

Patentansprüche
Mikrosko ieSystem zur Bestimmung des Zustands von Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor (6) und eine optionale
Beleuchtungseinheit (20) aufweist,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Bilderfassungseinheit von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung (8)
umschlossen ist, die über einer Sensorfläche des optischen Sensors (6) oder zumindest einem Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht (5) gebildet ist, wobei eine von der
Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht (5) einen Abstand zur
Sensorfläche aufweist, bei dem eine Schattenprojektion von auf der Oberfläche aufliegenden Zellen auf die Sensorfläche eine optische Auflösung ermöglicht, die durch die Pixelgröße von Pixeln des optischen Sensors (6) bestimmt wird.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optisch transparente Schicht (5) direkt oder über eine oder mehrere optisch transparente Zwischenschichten auf der Sensorfläche aufliegt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 2 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass die eine oder mehreren Zwischenschichten einen oder mehrere optische Filter (23) bilden oder umfassen.
4. Mikroskopiesystem nach Anspruch 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine der einen oder mehreren Zwischenschichten eine Einebnungschicht (24) für eine Oberflächenstruktur der Sensorfläche bildet.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet,
dass eine drahtlose Datenübertragungseinheit (7) innerhalb der Umhüllung (8) angeordnet ist, mit de von der Bilderfassungseinheit generierte Bilddaten an eine externe Empfangseinheit (9) übermittelt werden können.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet,
dass eine Energieversorgungseinheit (10) für die optische Bilderfassungseinheit und die
Beleuchtungseinheit (20) sowie gegebenenfalls die drahtlose Datenübertragungseinheit (7) innerhalb der Umhüllung (8) angeordnet ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit (20) so angeordnet ist, dass eine Schattenprojektion von auf der optisch transparenten Schicht (5) aufliegenden Zellen auf die Sensorfläche erfolgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit (20) so angeordnet ist, dass ein streifender Lichteinfall auf die optisch transparente Schicht (5) erfolgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet.
dass die optisch transparente Schicht (5) als
Lichtwellenleiter ausgebildet ist und die
Beleuchtungseinheit (20) so angeordnet und
ausgebildet ist, dass sie Licht in den
Lichtwellenleiter einkoppelt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
dass eine Schicht mit Indikatormolekülen (25) zumindest abschnittsweise auf der optisch
transparenten Schicht (5) aufgebracht ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
dass die Umhüllung (8) aus biokompatiblen
Materialien gebildet oder mit einer Schicht aus einem biokompatiblen Material beschichtet ist.
Verfahren zur Erfassung des Zustands von Zellen in einer von Zellen besiedelten Umgebung, insbesondere in einem Bioreaktor, bei dem eines oder mehrere der Mikroskopiesysteme gemäß eines oder mehrerer der vorangehenden Patentansprüche innerhalb der
Umgebung angeordnet und von den Mikroskopiesystemen erzeugte Bilddaten ausgewertet werden.
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