DE102011117228A1

DE102011117228A1 - Mikroskopiesystem zur Zustandsbestimmung von Zellen

Info

Publication number: DE102011117228A1
Application number: DE201110117228
Authority: DE
Inventors: Dr. Velten Thomas
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-05-02
Also published as: WO2013060478A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor und eine optionale Beleuchtungseinheit aufweist. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung umschlossen, die über einer Sensorfläche des optischen Sensors oder zumindest einem Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht gebildet ist. Durch die Übertragung der aufgenommenen Bilddaten von Zellen, die an der optisch transparenten Schicht anhaften, an eine externe Empfangseinheit lässt das Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von Zellen direkt in einen Bioreaktor einsetzen.

Description

Technisches Anwendungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor und eine optionale Beleuchtungseinheit aufweist. Die Erfindung betrifft auch eine Verwendung eines derartigen Mikroskopiesystems in einer von Zellen besiedelten abgeschlossenen Umgebung, beispielsweise in einem Bioreaktor.
Bioreaktoren können nur dann für bakterielles Wachstum und/oder Metaboliten-Synthese effizient genutzt werden, wenn überall im Bioreaktor optimale Bedingungen für die Zellen vorliegen. Vor allem in großen Bioreaktoren herrschen allerdings nicht überall die gleichen Bedingungen (z. B. Temperatur, Nährstoffkonzentrationen, etc.). Es wäre daher erstrebenswert, den Zustand der Zellen an verschiedenen Orten innerhalb des Bioreaktors erfassen zu können. Bisher ist jedoch keine Technik bekannt, mit der der Zustand von Zellen im Bioreaktor quasi-kontinuierlich und on-line erfasst werden kann.
Stand der Technik
Heutzutage wird die Effizienz der im Bioreaktor ablaufenden Prozesse anhand der entstehenden Produkte beurteilt. Wenn die gewünschten Produkte in ausreichender Menge produziert wurden, dann wird davon ausgegangen, dass die von außen eingestellten und konstant gehaltenen Parameter (wie z. B. Temperatur) einen optimalen Zustand der Zellen ermöglichten. Der Zustand der Zellen selbst wird nicht überwacht.
Eine heutige etablierte Methode um den Zustand der Zellen selbst zu messen ist die Beobachtung von Zellen mit Hilfe eines Mikroskops. Man kann z. B. aus der Teilungsrate auf die Vitalität der Zellen schließen. Außerdem kann die Zellmorphologie oder das Anhaftverhalten der Zellen als Kriterium herangezogen werden. Diese Untersuchungen sind jedoch nur außerhalb eines Bioreaktors möglich, da man nicht ein komplettes Mikroskop in einen Bioreaktor einbringen kann. Noch unmöglicher ist es mehrere Mikroskope in einen Bioreaktor zu bringen, um so den Zustand von Zellen an verschiedenen Orten des Bioreaktors zu erfassen.
Ein Konzept zur Realisierung eines sehr kompakten Mikroskopiesystems wurde von Li et al. (Wei Li; Knoll, T.; Thielecke, H.; „On-chip integrated lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells", Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2010 Annual International Conference of the IEEE, Aug. 31 2010-Sept. 4 2010, Pages 1012–1015) beschrieben. Das Mikroskopiesystem umfasst einen optischen Sensorchip und eine Beleuchtungseinheit. Zur Bestimmung des Zustands von Zellen wird ein stark miniaturisierter Bioreaktor bzw. Inkubator auf den Sensorchip aufgesetzt. Das Mikroskopiesystem befindet sich also außerhalb des Bioreaktors/Inkubators. Durch eine optisch transparente dünne Siliziumnitridmembran hindurch, die die Bodenfläche des Bioreaktors/Inkubators bildet, kann man in den Bioreaktor/Inkubator hinein schauen und auf der Siliziumnitrid-Membran anhaftende Zellen beobachten. Für den Einsatz in einem Bioreaktor ist das beschriebene System jedoch nicht geeignet.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen anzugeben, das auch in einem Bioreaktor einsetzbar ist.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe wird mit dem Mikroskopiesystem gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Mikroskopiesystems sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche oder lassen sich der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ausführungsbeispielen entnehmen.
Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das auch als Zellmikroskop angesehen werden kann, weist eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor oder Detektor sowie eine optionale Beleuchtungseinheit auf. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung umschlossen, die über der Sensorfläche des optischen Sensors oder zumindest einem für die Zustandsbestimmung genutzten Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht gebildet ist.
Bei diesem Mikroskopiesystem erfolgt die Zustandsbestimmung durch Auswertung eines mit der Bilderfassungseinheit aufgezeichneten Bildes, das durch Wechselwirkung des von der Beleuchtungseinheit abgestrahlten Lichts mit Zellen erhalten wird, die auf der optisch transparenten Schicht über der Sensorfläche aufliegen oder an dieser Schicht anhaften. In Abhängigkeit von der Lichteinstrahlung durch die Beleuchtungseinheit kann das erzeugte Bild durch Reflexion des Lichtes an den Zellen oder in Form einer Schattenprojektion der Zellen erhalten werden. Auch sekundäre Strahlung kann für die Bildaufzeichnung genutzt werden, beispielsweise von den Zellen oder mit diesen verbundenen Stoffen ausgestrahltes Lumineszenzlicht.
Aufgrund der wasser- und feuchtedichten Umhüllung bzw. Verkapselung kann das Mikroskopiesystem über mehrere Tage in der von Zellen besiedelten Umgebung, insbesondere in einem Bioreaktor, verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten an eine außerhalb dieser Umgebung befindliche Empfangseinheit übermitteln. Die Bilder können dann dargestellt und/oder geeignet ausgewertet werden, um den Zustand der Zellen beispielsweise über deren Größe oder Form zu bestimmen. vorzugsweise ist das Mikroskopiesystem hierzu mit einer drahtlosen Übertragungseinheit ausgestattet, die sich ebenfalls innerhalb der Umhüllung befindet und die mit der Bilderzeugungseinheit aufgezeichneten Bilddaten drahtlos an die externe Empfangseinheit übermitteln kann. Auch eine Energieversorgung für die einzelnen Komponenten des Mikroskopiesystems, insbesondere für die Elektronik der Bilderfassungseinheit, die Beleuchtungseinheit und die Übertragungseinheit, ist vorzugsweise ebenfalls innerhalb der Umhüllung angeordnet. Die Energieversorgungseinheit kann wiederaufladbar ausgebildet und so ausgestaltet sein, dass die Wiederaufladung durch induktives Einkoppeln von Energie von außerhalb der Umhüllung ermöglicht wird. Das Aufladen kann dann kontinuierlich während des Betriebs des Mikroskopiesystems oder jeweils nach einem Einsatz erfolgen. In einer anderen Ausgestaltung einer wiederaufladbaren Energieversorgungseinheit sind elektrische Kontakte nach außen geführt, die mit einer Ladeelektronik verbunden werden können. Die Energieversorgungseinheit lässt sich dann nach jedem Einsatz über diese Kontakte aufladen. Die Sensorfläche des optischen Sensors setzt sich in bekannter Weise aus einem zweidimensionalen Raster bzw. Array von einzelnen Detektorelementen zusammen, auch als Pixel bezeichnet.
Die optisch transparente Schicht über der Sensorfläche muss in geringem Abstand zur Sensorfläche angeordnet und ausreichend dünn ausgebildet sein, um eine Auswertung des Zustands wie bspw. der Zellmorphologie, des Teilungsverhaltens oder des Anhaftverhaltens der aufliegenden Zellen aus dem erzeugten Bild zu ermöglichen. Vorzugsweise weist hierzu die nach außen gerichtete, d. h. von der Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht einen Abstand zur Sensorfläche auf, bei dem die optische Auflösung der auf dieser Oberfläche aufliegenden Zellen bei einer Schattenprojektion durch die Größe der Pixel der Sensorfläche und nicht durch Beugungseffekte begrenzt ist. So ist bspw. die optische Auflösung R_C eines Kamerachips, wie er als optischer Sensor bei dem vorliegenden Mikroskopiesystem eingesetzt werden kann, durch die zweifache Pixelgröße S_P gegeben, d. h. R_C = 2S_P. Die Auflösung bei einer Schattenprojektion R_S ist gegeben durch
Hierbei bezeichnen d_S die Dicke der optisch transparenten Schicht, n_S den Brechungsindex dieser Schicht, d_Luft die Dicke des Luftspalts zwischen der optisch transparenten Schicht und der Sensorfläche und λ die Wellenlänge des einfallenden Lichts. Die Dicke der optisch transparenten Schicht sowie des Luftspalts sollen dabei so gewählt werden, dass bei dem gewählten Kamerachip die Auflösung durch die Pixel des Chips und nicht durch die Beugungseffekte bei der Schattenprojektion bestimmt werden. Es soll somit gelten: R_S ≤ R_C. Damit ergibt sich folgende Bedingung:
Die optisch transparente Schicht kann dabei selbstverständlich auch direkt oder über eine oder mehrere Zwischenschichten auf der Sensorfläche aufliegen, wobei sich eine ähnliche Beziehung ergibt, bei der lediglich der Term d_Luft wegfällt oder durch Terme d_ZSi/n_ZSi für die einzelnen Zwischenschichten i mit Dicken d_ZSi und Brechungsindizes n_ZSi ersetzt wird. Unter der optischen Transparenz ist in der vorliegenden Patentanmeldung zu verstehen, dass die Schicht in einem optischen Wellenlängenbereich transparent ist. Dies muss nicht der gesamte Wellenlängenbereich der optischen Wellenlängen sein, sondern kann einen kleineren Bereich daraus betreffen. Unter dem Wellenlängenbereich der optischen Wellenlängen ist hierbei der Bereich vom Infraroten über die sichtbaren Wellenlängen bis ins Ultraviolette zu verstehen.
Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem weist vorzugsweise keine zusätzlichen Linsen zwischen der Sensorfläche und der optisch transparenten Schicht auf, so dass das Bild der Zellen vorzugsweise als reine Schattenprojektion auf die Sensorfläche abgebildet wird. Dadurch wird das Mikroskopiesystem sehr kompakt.
Die optisch transparente Schicht kann über eine oder mehrere Zwischenschichten direkt auf der Sensorfläche aufliegen. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können wiederum einen optischen Filter bilden oder umfassen, der unerwünschte Wellenlängenbereiche für die Bilderzeugung ausfiltert. Unterschiedliche Anwendungsbeispiele eines derartigen Filters sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen zu finden. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können auch eine Einebnungsschicht umfassen, falls die Sensoroberfläche nicht plan ausgebildet ist. Dies kann bei einem Sensorchip mit integrierten Mikrolinsen der Fall sein, bei dem die Oberfläche durch die äußere Form der Mikrolinsen strukturiert ist. Durch eine Einebnungsschicht aus einem geeigneten Material, das die Unebenheiten ausgleicht, stören diese Unebenheiten nicht die Planität der optisch transparenten Schicht und ggf. einer zwischenliegenden Filterschicht oder Filterschichtfolge.
Die wasser- und feuchtedichte Umhüllung ist vorzugsweise aus einem oder mehreren biokompatiblen Materialien ausgebildet oder mit einer dünnen Schicht aus biokompatiblem Material beschichtet. Durch diese biokompatible Kapselung bzw. Umhüllung ist der Einsatz innerhalb eines Bioreaktors oder einer anderen Umgebung, bspw. innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers, problemlos möglich, um dort den Zustand von Zellen, bspw. das Zellwachstum, beobachten zu können. Die Umhüllung kann auch so ausgebildet sein, dass sie sich mehrmals öffnen und wieder verschließen lässt, um beispielsweise einen Batteriewechsel zu ermöglichen. In einer Ausgestaltung kann die Umhüllung hierzu aus zwei miteinander verschraubbaren Hälften mit zwischenliegender Dichtung gebildet sein.
Bei dem vorgeschlagenen Verfahren zur Erfassung des Zustands von Zellen in einer von Zellen besiedelten Umgebung werden mehrere der vorgeschlagenen miniaturisierten Mikroskopiesysteme innerhalb der Umgebung angeordnet und von den optischen Sensoren erzeugte Bilddaten ausgewertet. Durch die geringe Baugröße und in sich geschlossene Ausführung der Mikroskopiesysteme lassen sich diese problemlos in einem Bioreaktor einsetzen. Vorzugsweise wird hierzu eine Ausgestaltung mit integrierter drahtloser Datenübertragungseinheit und integrierter Energieversorgung genutzt, damit keine Kabel von den Mikroskopiesystemen aus durch den Bioreaktor verlaufen, da diese eine potentielle Leckstelle sowohl für die Mikroskopiesysteme als auch für die Wand des Bioreaktors darstellen würden. Mit dem vorgeschlagenen Mikroskopiesystem sowie dem vorgeschlagenen Verfahren lassen sich Zellen in einem Bioreaktor über einen langen Zeitraum quasi-kontinuierlich beobachten bzw. mikroskopieren. Das Verfahren ermöglicht somit eine on-line Überwachung des Zustands von Zellen in einem Bioreaktor oder einer anderen offenen oder geschlossenen Umgebung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das vorgeschlagene Verfahren und das zugehörige miniaturisierte und in sich gekapselte Mikroskopiesystem werden nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels in Verbindung mit den Zeichnungen nochmals kurz erläutert. Hierbei zeigen:
1 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die Abbildung der Zellen auf den optischen Sensor mittels Schattenprojektion erfolgt;
2 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem das Licht der Beleuchtungseinheit streifend auf die optisch transparente Schicht einfällt;
3 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die optisch transparente Schicht gleichzeitig als Lichtwellenleiter fungiert;
4 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bei dem zwischen der optisch transparenten Schicht und optischem Sensor ein optisches Filter verwendet wird; und
5 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem auf der optisch transparenten Schicht eine Indikatorschicht immobilisiert ist, die zur ortsaufgelösten Detektion der Konzentration eines oder mehrerer Stoffe verwendet werden kann.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Bei den im Folgenden beschriebenen Ausführungsbeispielen wird ein extrem stark miniaturisiertes Mikroskop bestehend aus einer Beleuchtungseinheit 20, einem optischen Detektor bzw. Sensor 6, einer drahtlosen Datenübertragungseinheit 7 und einer Energieversorgungseinheit 10 aufgebaut und in ein geeignetes wasser- und feuchtedichtes sowie sterilisierbares Gehäuse 8 eingebracht. Ein solches System kann über mehrere Tage in einem Bioreaktor verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten drahtlos an eine außerhalb des Bioreaktors befindliche Empfangseinheit 9 übermitteln. Die externe Empfangseinheit 9 kann die Bilder entweder selbst auf einem Bildschirm darstellen und/oder die Bilddaten können an einen Computer weitergeleitet werden. Das erfindungsgemäße Mikroskopiesystem in diesem Beispiel besteht somit aus einem extrem stark miniaturisierten Mikroskop, einer drahtlosen Datenübertragungseinheit, einer Energieversorgungseinheit, einem geeigneten wasser- und feuchtedichten und sterilisierbaren Gehäuse und einer außerhalb des Bioreaktors befindlichen Empfangseinheit, welche die drahtlos übermittelten Bilddaten empfängt. Die Kompaktheit des Systems wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass das Mikroskop linsenfrei aufgebaut wird. Das Bild der Zellen wird also nicht mittels Linsen auf den optischen Detektor abgebildet. Stattdessen befindet sich unmittelbar auf dem Detektor, z. B. einem CCD-Chip, eine sehr dünne optisch transparente Schicht, auf der sich die Zellen anhaften.
In einer ersten Ausgestaltung besteht das erfindungsgemäße System aus den in 1 gezeigten Grundkomponenten: Einer Beleuchtungseinheit 20, bestehend aus Lichtquelle 1 und einem Kollimator 2, einer optisch transparenten dünnen Schicht als Objektträger 5, einem optischen Detektor 6, einer Datenübertragungseinheit 7, einer Energieversorgungseinheit 10, einem Gehäuse 8, das wenigstens die Komponenten 5, 6, 7 und 10 umschließt, einer Befestigungsvorrichtung 3, die die Beleuchtungseinheit 20 mit dem Gehäuse 8 verbindet und einer externen Empfangseinheit 9. Die elektrischen Teile der Beleuchtungseinrichtung 20 können zusammen mit der Befestigungseinrichtung ebenfalls vom Gehäuse 8 umschlossen oder auch in einer separaten wasser- und feuchtedichten Umhüllung untergebracht sein, wobei dann die elektrische Verbindung mit der Energieversorgungseinheit 10 ebenfalls geeignet abgedichtet sein muss.
Nach Einbringen dieses Systems in einen Bioreaktor setzen sich im Bioreaktor befindliche Zellen auf dem System, vor allem aber auf dem Objektträger 5 ab. Das Bild der Zellen auf dem optischen Detektor 6 entsteht vorzugsweise durch Schattenprojektion. Dazu wird das Licht einer nahezu punktförmigen Lichtquelle 1 (z. B. LED) mittels einer geeigneten Vorrichtung, eines sogenannten Kollimators 2, der beispielsweise als wenige Zentimeter langes dünnes Röhrchen mit geschwärzter Innenwand ausgeführt sein kann, parallelisiert und auf die auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen geleitet. Der Lichteinfall erfolgt vorzugsweise senkrecht zur Fläche des Objektträgers 5, d. h. vorzugsweise parallel zur Normalen auf dem Objektträger 5. Die Schatten der Zellen werden von dem unmittelbar unter dem Objektträger 5 befindlichen optischen Detektor 6 detektiert. Um den Einfluss von Beugungseffekten auf die Bildqualität zu minimieren, wird der Abstand zwischen Zellen und optischem Detektor 6 sehr gering gehalten. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass der Objektträger 5 sehr dünn ist.
Der Objektträger 5 kann z. B. als ca. 1 μm dünne Siliziumnitridschicht ausgeführt sein. Diese kann beispielsweise realisiert werden, indem mittels PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition) Siliziumnitrid mit der gewünschten Dicke (z. B. ca. 1 μm) auf einem Substrat, z. B. auf einem Siliziumwafer, abgeschieden wird. In dem Bereich in dem sich später der optische Detektor 6 befinden soll, wird das Substrat mittels eines Ätzprozesses (im Falle eines Siliziumsubstrats z. B. durch nasschemisches Ätzen mit Kaliumhydroxidlauge) selektiv entfernt. Es resultiert eine Siliziumnitridmembran der gewünschten Größe, welche von einem Siliziumrahmen oder einem Rahmen eines anderen Materials umgeben ist. Dieser Rahmen ist in 1 als Substrat 4 bezeichnet. Die lateralen Abmessungen des Substrats 4 (z. B. eines Siliziumrahmens) können mittels einer geeigneten Vorrichtung, z. B. mittels einer Wafersäge, auf die gewünschte Größe gebracht werden. Das Substrat 4 erleichtert das Handhaben des extrem dünnen Objektträgers 5 und kann verwendet werden, um den Objektträger 5 mit dem Gehäuse 8 des Gesamtsystems zu verbinden. Ein weiteres bevorzugtes Substratmaterial ist Metall. Vorzugsweise besteht das Metallsubstrat aus dem gleichen Material wie das Gehäuse 8 des miniaturisierten Mikroskopiesystems.
In einer weiteren erfindungsgemäßen und in 2 skizzierten Ausgestaltung erfolgt der Lichteinfall nicht senkrecht zum Objektträger 5. Stattdessen ist die Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit so angeordnet, dass der Lichtstrahl 21 streifend auf den Objektträger 5 fällt. Der Lichtstrahl 21 kann weiterhin durch eine geeignet geformte Blende, die beispielsweise spaltförmig ausgeführt ist (nicht dargestellt), begrenzt werden. Bei streifendem Einfall hat die Reflektivität des Objektträgers 5 nahezu den Wert 1, d. h. das direkt von der Lichtquelle kommende Licht kann praktisch nicht durch den Objektträger 5 hindurchtreten und kann daher den optischen Detektor 6 nicht erreichen. Lediglich das Licht, das an den auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen reflektiert oder gestreut wird, ist in der Lage, den optischen Detektor 6 zu erreichen. Das vom optischen Detektor 6 aufgenommene Bild enthält also Informationen über die auf dem Objektträger 5 anhaftenden Zellen. Durch eine räumliche Begrenzung des Lichtstrahls werden nur die unmittelbar auf dem Objektträger 5 sitzenden Zellen bestrahlt, so dass nur von diesen Licht in Richtung des optischen Detektors 6 gestreut oder reflektiert werden kann.
Diese Methode der streifenden Beleuchtung hat den Vorteil, dass das Gesamtsystem noch kompakter aufgebaut werden kann als das in 1 gezeigte System.
In einer weiteren erfindungsgemäßen und in 3 dargestellten Ausgestaltung wird das Licht der Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit in geeigneter Weise in den sehr dünnen Objektträger 5 eingekoppelt. Der Objektträger 5 erfüllt den Zweck eines optischen Lichtwellenleiters und leitet das Licht. Die Lichteinkopplung, welche mit Hilfe einer Einkoppelvorrichtung 22 vorgenommen wird, kann mit bekannten Methoden erfolgen. Dazu zählt beispielsweise das Einkoppeln mittels Prismen oder mittels geeigneter Gitterstrukturen, sogenannter Gitterkoppler. Es ist bekannt, dass sich das elektromagnetische Feld des in einem Wellenleiter geführten Lichts nicht vollständig im Wellenleiter befindet. Ein Teil des elektromagnetischen Felds ragt auch aus dem Wellenleiter heraus, z. B. in den Bioreaktor. Dies ist bekannt als das sogenannte „evaneszente Wellenfeld”. Dieses evaneszente Wellenfeld klingt exponentiell mit dem Abstand ab und ragt typischerweise nur Bruchteile eines Mikrometers aus dem Wellenleiter heraus. Im Bioreaktor trifft es entweder auf an dem Objektträger 5 anhaftende Teile einer Zelle oder auf Flüssigkeit. Ein Teil dieses Lichts wird an den Zellen gestreut oder reflektiert und Teile des gestreuten oder reflektierten Lichts erreichen den optischen Detektor 6 und ergeben dort ein Bild, das eine Aussage über das Anhaftverhalten der Zellen auf dem Objektträger 5 ermöglicht. Eine Beobachtung des Anhaftverhaltens über einen längeren Zeitraum gibt weiterhin Informationen über die Bewegung der Zellen auf dem Objektträger 5. Anhand des Anhaftmusters ist weiterhin eine Zellteilung erkennbar. Man kann so also auch eine Aussage über das Proliferationsverhalten der Zellen gewinnen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems gemäß 4 befindet sich zwischen den zu beobachtenden Zellen und dem optischen Detektor 6 ein optisches Filter 23, um Licht bestimmter Wellenlängen herauszufiltern oder durchzulassen. Beispielsweise können solche Filter aus mehreren übereinanderliegenden dünnen dielektrischen Schichten bestehen (Interferenzfilter) und mittels geeigneter Dünnschichttechnik hergestellt sein. Vorzugsweise befindet sich das optische Filter 23 direkt auf einer Seite des dünnen Objektträgers 5. Die Filterschichten werden vorzugsweise direkt auf dem Objektträger 5 abgeschieden. In einer weiteren bevorzugten Anordnung werden die Filterschichten direkt auf dem optischen Detektor 6 abgeschieden.
Als optische Detektoren 6 können beispielsweise kommerziell erhältliche CCD-Chips eingesetzt werden. Diese sind üblicherweise mit einer Vielzahl mikroskopisch kleiner Linsen (Mikrolinsen) versehen. Daraus resultiert eine sehr unebene Oberfläche des CCD-Chips. Werden die optischen Filterschichten direkt auf den Mikrolinsen abgeschieden, so trifft ein senkrecht zum CCD-Chip einfallender Lichtstrahl aufgrund der gekrümmten Oberflächen der Mikrolinsen an verschiedenen Orten unter einem unterschiedlichen Winkel auf die Filterschichten. Dadurch ist die effektiv in den Filterschichten durchlaufene optische Weglänge ebenfalls von Ort zu Ort verschieden. Dies resultiert in einer von Ort zu Ort verschiedenen Filterwirkung. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems wird daher auf die Mikrolinsen des CCD-Chips zunächst eine dünne optisch transparente Schicht 24 aufgebracht, die einen einebnenden Effekt hat. Daraus resultiert eine relativ ebene Oberfläche. Die Dicke dieser Einebnungsschicht 24 soll vorzugsweise im Bereich weniger Mikrometer liegen. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems werden die Filterschichten 23 auf die Einebnungsschicht 24 aufgebracht. Vorzugsweise besteht die Einebnungsschicht 24 aus einem relativ weichen Polymermaterial, das sich beim Andrücken des Objektträgers 5 an diesen anschmiegt. Auf diese Weise wird verhindert, dass sich zwischen der Einebnungsschicht 24 und dem Objektträger 5 kleine Hohlräume befinden, die sich mit einem Medium füllen, das einen anderen optischen Brechungsindex hat als das einebnende Material selbst. Alternativ können diese Hohlräume mit einem Material, z. B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material oder wie der verwendete Objektträger 5 (z. B. Siliziumnitridschicht). In der Optik sind solche Flüssigkeiten als „Immersionsöl” bekannt. Falls auf die Einebnungsschicht 24 verzichtet wird, so sollten die sich zwischen den Mikrolinsen und dem dünnen Objektträger 5 (z. B. Siliziumnitridschicht) bildenden kleinen Hohlräume mit einem Material wie z. B. einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das Material der Mikrolinsen oder wie der verwendete Objektträger 5.
In einer weiteren möglichen Ausgestaltung besteht das optische Filter 23 aus einer eigenständigen dünnen Folie (Polymer oder Glas) und wird zwischen Objektträger 5 und CCD-Chip bzw. zwischen Objektträger 5 und Einebnungsschicht 24 eingebracht, z. B. eingelegt, eingeklemmt oder eingeklebt. Auch in diesem Fall können sich die zwischen dem Filter 23 und der Einebnungsschicht 24 bzw. zwischen dem Filter 23 und den Mikrolinsen bildenden Hohlräume mit einem Material, z. B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material bzw. wie die Mikrolinsen.
Die Verwendung der beschriebenen optischen Filter 23 kann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn zusätzlich oder alternativ zum Bild der Zellen weitere optische Effekte, wie z. B. eine Lumineszenz, detektiert werden soll. Beispielsweise können zumindest einige der Zellen im Bioreaktor mit sogenannten Fluoreszenzmarkern versehen sein, die entweder von vorn herein vorhanden sind, oder erst beim Eintreten einer bestimmten Situation in der Zelle gebildet werden. Die Fluoreszenzmarker leuchten nicht von sich aus, sondern werden üblicherweise mit Photonen zum Leuchten angeregt (Photolumineszenz). In diesem Fall können die oben beschriebenen optischen Filter 23 dazu verwendet werden, um das Anregungslicht, das von einer Lichtquelle 1 des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems oder auch von einer davon unabhängigen Lichtquelle stammen kann, herauszufiltern und nur die entstandene Lumineszenz zu dem optischen Detektor 6 durchzulassen. Falls eine Lichtquelle 1 des Mikroskopiesystems verwendet werden soll, so sind alle oben genannten Konfigurationen (Licht fällt senkrecht auf den Objektträger 5, Licht fällt streifend auf den Objektträger 5, Objektträger fungiert als Lichtwellenleiter, in den das Anregungslicht eingekoppelt wird) verwendbar.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mikroskopiesystem zur Detektion einer Chemolumineszenz oder einer in den Zellen auftretenden Biolumineszenz verwendet werden. In diesen letzteren Fällen ist kein Anregungslicht zum Anregen der Lumineszenz nötig. Ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem zum Detektieren einer Chemo- oder Biolumineszenz kann also ohne eigene Lichtquelle 1 bzw. Beleuchtungseinheit aufgebaut sein. Selbstverständlich kann bei Nutzung einer Beleuchtungseinheit neben der Chemo- oder Biolumineszenz auch ein Bild der Zellen detektiert werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung gemäß 5 ist der Objektträger 5 mit einer dünnen Schicht eines Indikatormoleküls versehen, dessen Lumineszenzverhalten von der Anwesenheit bestimmter Stoffe oder von dem pH-Wert oder der Temperatur der unmittelbaren Umgebung abhängt. Vorzugsweise sind die Indikatormoleküle in eine Polymermatrix eingebettet, um ein ortsfestes Verbleiben der Indikatormoleküle auf der Objektträgeroberfläche auch über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten. Zum Aufbringen als dünne Schicht, wird beispielsweise das Polymermaterial zusammen mit den Indikatormolekülen in einem Lösemittel gelöst und die resultierende Flüssigkeit mit Methoden wie Aufschleudern, Aufsprühen, Drucken oder einer anderen dem Fachmann bekannten Methode auf die Oberfläche des Objektträgers 5 aufgebracht. Nach dem Verdunsten des Lösemittels bildet sich ein fester Polymerfilm, in den die Indikatormoleküle eingebettet sind. Eine solche Methode ist z. B. in M. Staal, E. I. Prest, J. S. Vrouwenvelder, L. F. Rickelt, M. Kühl: „A simple optode based method for imaging O2 distribution and dynamics in tap water biofilms", waterresearch 45 (2011) pp. 5027–5037 für den Fall sauerstoff-sensitiver Indikatormoleküle beschrieben. Bei der dort beschriebenen Methode wurde Ruthenium(II)-tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline (Ru-dpp) in einer Polystyrolmatrix immobilisiert. Als Lösemittel kam Chloroform zum Einsatz.
Ein so hergestellter Indikatorfilm 25 hat vorzugsweise eine Schichtdicke von unter 10 μm, vorzugsweise unter 5 μm, um die ortsaufgelöste Detektion des Stoffes, für den das verwendete Indikatormolekül sensitiv ist, mit einer hohen räumlichen Auflösung zu ermöglichen. Es soll hier noch einmal darauf hingewiesen werden, dass die Anwendung nicht auf die Detektion von Sauerstoff beschränkt ist. Bei Verwendung eines entsprechenden Indikatormoleküls können auch Indikatorschichten 25 hergestellt werden, die zur Detektion anderer Stoffe, wie z. B. Glukose, Laktat oder weitere Stoffe, geeignet sind. Weiterhin muss die Indikatorschicht nicht als notwendigerweise als homogene Schicht, sondern kann auch als strukturierte Schicht auf den Objektträger 5 aufgebracht werden. Dazu können beispielsweise fotolithografische Methoden eingesetzt werden, wie sie aus der Mikrosystemtechnik bekannt sind. Bei Verwendung einer Drucktechnik zum Aufbringen der Indikatorschicht, kann die Indikatorschicht schon beim Drucken als strukturierte Schicht realisiert werden. Drucktechniken, die unter diese Erfindung fallen beinhalten z. B. Tiefdruck, Hochdruck, Offsetdruck, Tampondruck sowie das sogenannte „micro contact printing”, welches speziell für die Realisierung von Mikrostrukturen entwickelt wurde. Die Erfindung ist jedoch nicht nur auf die genannten Drucktechniken beschränkt. Sehr vorteilhaft können beispielsweise Strukturen in Form eines Streifenmusters eingesetzt werden, wobei die Struktur im einfachsten Fall aus einem einzigen beschichteten Streifen und einem benachbarten nicht beschichteten Streifen besteht. Weiterhin bevorzugt besteht die Struktur aus einzelnen Kreisen oder Rechtecken. Vorzugsweise haben die Kreise oder Rechtecke etwa die Größe eines einzelnen lichtsensitiven Pixels des optischen Detektors 6 (z. B. CCD-Chip) oder ein ganzzahliges Vielfaches dieser Größe. Die nicht beschichteten Stellen können beispielsweise als Referenz dienen, d. h. die Intensität der von den beschichteten Stellen kommenden Lumineszenz und die von den unbeschichteten Stellen kommende Lumineszenz können getrennt detektiert werden. Das eigentliche Messsignal kann dann aus den beiden getrennt voneinander gemessenen Einzelwerten berechnet werden. Bei der Berechnung kann es vorteilhaft sein, das Verhältnis zwischen den im beschichteten Bereich und dem Referenzbereich gemessenen Lumineszenzintensitäten zu bilden.
Zum gleichzeitigen Messen mehrerer Stoffe oder Größen (z. B. Temperatur, pH-Wert) kann die Indikatorschicht 25 aus Bereichen verschiedener Indikatorstoffe bestehen. Auch hier können, neben den für die verschiedenen Stoffe sensitiven Bereichen, weitere Bereiche angeordnet werden, die keine Indikatormoleküle enthalten und somit als Referenz diesen können.
Bei den bisherigen Ausführungen wurde davon ausgegangen, dass die Konzentration des nachzuweisenden Stoffes ortsaufgelöst detektiert werden soll. Mittels einer alternativen Detektionsmethode kann auch ein über den gesamten Objektträger 5 gemittelter Wert der Stoffkonzentration detektiert werden. Dabei wird über alle mit dem jeweiligen Indikatormolekül beschichteten Bereiche gemittelt und außerdem über alle Referenzbereiche gemittelt. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Referenzbereiche und die Messbereiche ineinander zu verschachteln. Bei Verwendung eines Indikatormoleküls für den Stoff A, eines Indikatormoleküls für den Stoff B und eines Referenzbereichs (R) sollten bei Verwendung eines Streifenmusters die Streifen in der sich immer fortlaufenden Reihenfolge ABRABRABR usw. auf dem Objektträger 5 angeordnet sein. Auf diese Art der Anordnung lassen sich Einflüsse von Inhomogenitäten der Stoffkonzentration oder der Temperaturverteilung auf die Mittelwerte der Stoffkonzentrationen reduzieren.
Zum optischen Anregen einer Lumineszenz sind alle in den 1, 2 und 3 beschriebenen Konfigurationen der Lichtquelle verwendbar. Außerdem können die in den 4 und 5 gezeigten optischen Filter 23 zum Abblocken des Anregungslichts vorteilhaft eingesetzt werden.
Zur drahtlosen Übertragung der von dem optischen Detektor 6 als Bilderfassungseinheit aufgenommenen Bilddaten sind prinzipiell alle heute bekannten Datenübertragungsmethoden verwendbar. Dazu gehört z. B. die Verwendung von Funk oder auch optische Methoden. Entsprechende standardisierte Übertragungsmodule und -protokolle sind in großer Anzahl vorhanden. Bei der Übertragung per Funk können beispielsweise ZigBee, Bluetooth, WLAN oder MICS Standard verwendet werden. Bei einer optischen Übertragung kann beispielsweise das IrDA (Infrared Data Association) Protokoll verwendet werden. Die kommerziell erhältlichen Datenübertragungsmodule sind üblicherweise mit einem Mikrocontroller ausgestattet. Dieser kann zur Steuerung des Ablaufs einer Bilderfassungs- und übertragungssequenz eingesetzt werden.
Zum Schutz des Mikroskopiesystems vor Flüssigkeiten und Feuchte muss dieses sowie die Datenübertragungseinheit 7 in geeigneter Weise gekapselt werden. Geeignete Verfahren, Gehäusetechniken und -materialien sind beispielsweise aus dem Bereich der aktiven medizinischen Implantate (z. B. Herzschrittmacher) bekannt. Das Gehäuse 8 ist vorzugsweise aus Metall, vorzugsweise einem Metall, das die Forderung nach Biokompatibilität (z. B. gemäß ISO 10993 1–20) erfüllt. Vorzugsweise sollten alle mit den Zellen im Bioreaktor in Kontakt kommenden Materialien eine Biokompatibilität gemäß ISO 10993 1–20 aufweisen. Ein geeignetes Metall ist z. B. Titan. Da der Objektträger 5 unmittelbar mit Zellen in Kontakt kommen und somit einen Teil des Gehäuses bilden muss, ist der Objektträger 5 bzw. das Substrat 4, auf dem der dünne Objektträger 5 abgeschieden ist, in geeigneter Weise mit dem restlichen Gehäuse 8 zu verbinden. Dazu können Methoden wie Schweißen (z. B. Laserschweißen), Löten oder Kleben eingesetzt werden. Zur Gewährleistung der Biokompatibilität kann beispielsweise das komplette System mit einer dünnen Schicht eines optisch transparenten und biokompatiblen Materials beschichtet werden. Ein geeignetes Material ist beispielsweise Parylene C. Eine geeignete Dicke der Schutzschicht kann beispielsweise 1–5 μPm betragen.
Bei Verwendung einer optischen Datenübertragungsmethode ist das Gehäuse 8 vorzugsweise mit einem optischen Fenster versehen. Hierzu kann beispielsweise Glas eingesetzt werden, das mittels einer der oben beschriebenen Verfahren mit dem restlichen Gehäuse verbunden wird. Im Falle einer Datenübertragung mittels elektromagnetischer Wellen wird üblicherweise eine Antenne eingesetzt. Diese sollte vorzugsweise außerhalb des Gehäuses angeordnet sein, da sich vor allem im Falle eines Metallgehäuses eine starke Dämpfung der elektromagnetischen Wellen ergeben würde. Die elektrische Verbindung zwischen Elektronik (innerhalb des Gehäuses) und Antenne (außerhalb des Gehäuses) kann beispielsweise mittels sogenannter Glas- oder Keramikdurchführungen realisiert werden. Diese sind meist so ausgeführt, dass sie direkt in ein Metallgehäuse eingeschweißt werden können. Alternativ können auch hier die oben bereits genannten Verfahren Löten und Kleben eingesetzt werden. Die Antenne selbst kann beispielsweise mittels einer dünnen Parylene C-Schicht überzogen werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Antenne in biokompatibles Silikon eingebettet werden.
Die Energieversorgung des erfindungsgemäßen Systems kann mittels einer Batterie erfolgen. Beispielsweise kann eine Batterie verwendet werden, wie sie auch bei aktiven medizinischen Implantaten, bspsw. Herzschrittmacher, eingesetzt wird.
Die Erfindung ist nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele eingeschränkt. Auch andere Variationen können vom Fachmann hieraus abgeleitet werden, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. So muss beispielsweise die Beleuchtungseinheit nicht zwangsläufig mit der Bilderzeugungseinheit bzw. dessen Gehäuse oder Umhüllung verbunden sein, sondern kann auch eine separate Einheit mit eigener Stromversorgung bilden. Die Ausgestaltungen der einzelnen Ausführungsbeispiele können auch miteinander kombiniert werden.
Bezugszeichenliste

1: Lichtquelle
2: Kollimator
3: Befestigungsvorrichtung
4: Substrat
5: Objektträger
6: optischer Sensor
7: Datenübertragungseinheit
8: Gehäuse
9: externe Empfangseinheit
10: Energieversorgungseinheit
20: Beleuchtungseinheit
21: streifend einfallender Lichtstrahl
22: Einkoppelvorrichtung
23: optisches Filter
24: Einebnungsschicht
25: Indikatorfilm

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Li et al. (Wei Li; Knoll, T.; Thielecke, H.; „On-chip integrated lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells”, Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2010 Annual International Conference of the IEEE, Aug. 31 2010-Sept. 4 2010, Pages 1012–1015) [0005]
M. Staal, E. I. Prest, J. S. Vrouwenvelder, L. F. Rickelt, M. Kühl: „A simple optode based method for imaging O2 distribution and dynamics in tap water biofilms”, waterresearch 45 (2011) pp. 5027–5037 [0035]
ISO 10993 1–20 [0041]
ISO 10993 1–20 [0041]

Claims

Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor (6) und eine optionale Beleuchtungseinheit (20) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Bilderfassungseinheit von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung (8) umschlossen ist, die über einer Sensorfläche des optischen Sensors (6) oder zumindest einem Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht (5) gebildet ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine von der Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht (5) einen Abstand zur Sensorfläche aufweist, bei dem eine Schattenprojektion von auf der Oberfläche aufliegenden Zellen auf die Sensorfläche eine optische Auflösung ermöglicht, die durch eine Pixelgröße von Pixeln des optischen Sensors (6) bestimmt wird.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (5) direkt oder über eine oder mehrere optisch transparente Zwischenschichten auf der Sensorfläche aufliegt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder mehreren Zwischenschichten einen oder mehrere optische Filter (23) bilden oder umfassen.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine der einen oder mehreren Zwischenschichten eine Einebnungschicht (24) für eine Oberflächenstruktur der Sensorfläche bildet.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine drahtlose Datenübertragungseinheit (7) in der Umhüllung (8) angeordnet ist, mit der von der Bilderfassungseinheit generierte Bilddaten an eine externe Empfangseinheit (9) übermittelt werden können.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Energieversorgungseinheit (10) für die optische Bilderfassungseinheit und die Beleuchtungseinheit (20) sowie gegebenenfalls die drahtlose Datenübertragungseinheit (7) in der Umhüllung (8) angeordnet ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit so angeordnet ist, dass eine Schattenprojektion von auf der optisch transparenten Schicht (5) aufliegenden Zellen auf die Sensorfläche erfolgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (20) so angeordnet ist, dass ein streifender Lichteinfall auf die optisch transparente Schicht (5) erfolgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (5) als Lichtwellenleiter ausgebildet ist und die Beleuchtungseinheit (20) so angeordnet und ausgebildet ist, dass sie Licht in den Lichtwellenleiter einkoppelt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Schicht mit Indikatormolekülen (25) zumindest abschnittsweise auf der optisch transparenten Schicht (5) aufgebracht ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Umhüllung (8) aus biokompatiblen Materialien gebildet oder mit einer Schicht aus einem biokompatiblen Material beschichtet ist.
Verfahren zur Erfassung des Zustands von Zellen in einer von Zellen besiedelten Umgebung, insbesondere in einem Bioreaktor, bei dem eines oder mehrere der Mikroskopiesysteme gemäß eines oder mehrerer der vorangehenden Patentansprüche innerhalb der Umgebung angeordnet und von den Mikroskopiesystemen erzeugte Bilddaten ausgewertet werden.