WO2012105706A1

WO2012105706A1 - ケロイド治療剤

Info

Publication number: WO2012105706A1
Application number: PCT/JP2012/052559
Authority: WO
Inventors: 佳奈枝池田; 俊彦鳥越; 佳隆松本; 龍哉藤田; 高敏四ツ柳; 昇志佐藤
Original assignee: Sapporo Medical University
Current assignee: Sapporo Medical University
Priority date: 2011-02-04
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-08-09
Anticipated expiration: 2013-08-04

Abstract

　本発明は、式（Ｉ）に記載のポリフェノールを含んでなる、ケロイド線維芽細胞の増殖抑制用組成物に関する。

Description

ケロイド治療剤

関連出願

　本特許出願は、２０１１年２月４日に出願された米国仮出願６１／４３９,６００号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

　本発明は、新規なケロイド治療剤およびそれを用いた治療方法に関する。

　ケロイドは、創傷治癒過程に生じる線維芽細胞の増殖およびＩ型コラーゲンを主とする細胞外基質の真皮での過剰蓄積を特徴とする皮膚の線維化疾患である［１］。ケロイドは、外傷、炎症、外科手術、熱傷後に生じ、時には自然に生じる。ケロイドは、赤色で硬い醜状を呈する瘢痕で、痒みおよび疼痛を伴う。肥厚性瘢痕は、元の創傷を超えないが、ケロイドは元の創傷の境界を越えて増殖し、自然には退縮せず、切除後に再発する傾向がある。耳、三角筋領域、前胸部、および胸骨前部領域（presternal area）は、身体におけるケロイドの好発部分である。ケロイドの一般的な治療は、単独または他の方法と併用した病変内コルチコステロイド注射、又は、放射線療法と併用したケロイド内切除である。ケロイド発生に関与する基本的な機序は依然として判明しておらず、ほとんどの治療は失敗し、治療後の再発率は高い。

　過去十年間にわたる多くの研究により、種々の視点からケロイドの病因が研究されている。皮膚の色調の濃い人種においてケロイドが発生しやすいことから、ケロイドの遺伝的関与が示唆されている。［２、３］。ケロイド発生を促進する他の因子は、外傷の形態、創傷張力、感染、異物反応、および内分泌因子である［４］。ケロイドは、辺縁部ケロイドと中央部ケロイドとでは、増殖およびアポトーシスを含む生物学的な違いを示し、ケロイド病変から得られた培養線維芽細胞は、細胞培養中に、ケロイド特有な特徴を喪失することも示唆されている［５、６］。ケロイドの特徴は一般的に既知であるが、ケロイド形成の機序は、未だ明らかになっていない。ケロイドはヒトにのみ発生して動物では生じないため、理想的な動物実験モデルは存在せず、ケロイドの病因解明および治療法の開発は妨げられている［７］。

　肝硬変、肺線維症、心血管疾患、進行性腎臓病、および全身性硬化症を含む他の線維増殖性疾患は、ヒトの健康を脅かすものである。しかしながら、現在のところ有効な治療法は存在しない。

　ケロイドの有効な治療法を見出すために、本発明者らは、ブドウ、ピーナッツ、および赤ワインに存在し、虎杖根 (Ｋｏｊｏ－ｋｏｎ)等の薬用植物の活性成分として同定もされている天然フィトアレキシンであるレスベラトロール（３，５，４’－ｔｒａｎｓ－トリヒドロキシスチルベン）を検討した。
　レスベラトロールは、ＳＩＲＴ１活性（サーチュイン、サイレント交配型情報調節因子２相同体（silent mating type information regulation 2 homolog））１の低分子誘導因子であり［８］、広く研究されている腫瘍予防物質である。レスベラトロールの生物活性は広く研究されており、多くの研究により、レスベラトロールが、虚血性心疾患、動脈硬化症、および癌を含む幾つかの疾患に治療可能性を有することが示されている［９、１０］。これまでの研究結果により、レスベラトロールは、肝臓線維芽細胞の細胞増殖、コラーゲン産生、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現、およびマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ－２）の分泌に強い抑制効果を示すことが実証されている［１１］。また、ラットの肝硬変ＣＣｌ４モデルにおいて、レスベラトロール（resveratrol）は、ＮＦ－ｋｂ活性の抑制および形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）の産生抑制による強い抗線維化効果を有することが示されている［１２］。しかしながら、レスベラトロールが、ケロイド（keloid）において同様の効果を有することを示す報告はこれまでなされていない。本発明者らは、ケロイドに対するレスベラトロールの効果を鋭意研究し、レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することを見出した。本発明者らのデータは、レスベラトロールがケロイド治療に応用可能であることを示唆する。

　また、本発明者らは、今般、さらに鋭意研究した結果、レスベラトロールをはじめとする特定のポリフェノール骨格を有する化合物が、真性ケロイドの線維芽細胞に対して顕著な増殖抑制効果を奏することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。

　したがって、本発明は、真性ケロイドの線維芽細胞を顕著に抑制しうる新規ケロイド治療剤およびそれを用いた治療方法の提供をその目的としている。

　本発明によれば、式（Ｉ）に記載のポリフェノールを含んでなる、ケロイド治療剤が提供される：

　（式中、
　　Ｒ_１は、ＣＨまたは酸素原子であり、
　　Ｒ_２は、水素原子、ＣＨまたはＣ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_３は、水素原子、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_４は、水素原子または水酸基であり、ここで、
　　　Ｒ_１がＣＨ基である場合、Ｒ_１と＊で表される炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は存在せず、かつＲ_２およびＲ_３は水素原子であり、
　　　Ｒ_１が酸素原子である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は単結合であり、かつＲ_２はＣＨ基またはＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）である）。

　また、本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）に記載のポリフェノールの有効量をケロイド病変部位に投与することを含んでなる、ケロイドの治療方法が提供される。

　本発明によれば、とりわけ真性ケロイドの線維芽細胞の増殖を顕著に抑制することができる。

ケロイド線維芽細胞に対するレスベラトロールの効果を示す図である。（ａ）レスベラトロールで４８時間処理したケロイド線維芽細胞を、ＲＴ－ＰＣＲによりＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７の発現について評価した。Ｇ３ＰＤＨは、内部対照として用いられた。ケロイド線維芽細胞に対するレスベラトロールの効果を示す図である。（ｂ）レスベラトロールを４８時間添加した後の、ケロイド線維芽細胞培養上清におけるＴＧＦ－β１のレベル。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。ケロイド線維芽細胞に対するレスベラトロールの効果を示す図である。（ｃ）レスベラトロールで４８時間処理したケロイド線維芽細胞を、ＲＴ－ＰＣＲによりＩ型コラーゲン、α-SMAおよびＨＳＰ４７の発現について評価している。細胞増殖に対するレスベラトロールの効果を示す図である。ＷＳＴ－１アッセイは、４８時間まで実施した。各ポイントは、５つのウエルから収集したデータの平均±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。レスベラトロールで処理したケロイド線維芽細胞の写真である。ケロイド中央部線維芽細胞（ａ、ｂ）およびケロイド辺縁部線維芽細胞（ｃ、ｄ）を、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で４８時間培養した。（ａ、ｃ）未処理の対照ケロイド線維芽細胞；（ｂ、ｄ）レスベラトロール（１００μＭ）で処理したケロイド線維芽細胞。元の倍率、×２００。より具体的には、(a)未処理のケロイド中央部線維芽細胞、（ｂ）レスベラトロール（100μM、48時間）で処理したケロイド中央部線維芽細胞、（ｃ）未処理のケロイド辺縁部線維芽細胞、（ｄ）レスベラトロール（100μM、48時間）で処理したケロイド辺縁部線維芽細胞。レスベラトロール誘導性によるケロイド線維芽細胞のアポトーシスを示す。アネキシンおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色した後のアポトーシス細胞のＦＡＣＳ分析。レスベラトロール（１００μＭ）で４８時間処理したまたは処理しなかったケロイド中央部線維芽細胞（ａ、ｂ）および辺縁ケロイドケロイド辺縁部線維芽細胞（ｃ、ｄ）。（ａ、ｃ）対照；（ｂ、ｄ）レスベラトロール処理細胞。クラスターＲ２＝後期アポトーシス、Ｒ３＝初期アポトーシス、およびＲ４＝ネクローシス。より具体的には、(ａ)未処理のケロイド中央部線維芽細胞、（ｂ）レスベラトロール（１００μＭ、４８時間）で処理したケロイド中央部線維芽細胞、（ｃ）未処理のケロイド辺縁部線維芽細胞、（ｄ）レスベラトロール（１００μＭ、４８時間）で処理したケロイド辺縁部線維芽細胞である。レスベラトロール誘導性によるケロイド線維芽細胞のアポトーシスを示す。アネキシンおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色した後のアポトーシス細胞のＦＡＣＳ分析。細胞周期におけるアポトーシス細胞の数が、レスベラトロール処理により増加する。フローサイトメトリーによる細胞周期分析。レスベラトロール（１００μＭ）で４８時間処理したまたは処理しなかったケロイド中央部線維芽細胞（ａ、ｂ）およびケロイド辺縁部線維芽細胞（ｃ、ｄ）。（ａ、ｃ）対照；（ｂ、ｄ）レスベラトロール処理細胞。　より具体的には、図５は、レスベラトロールのケロイド線維芽細胞の細胞周期に及ぼす影響を示す。 (ａ)未処理のケロイド中央部線維芽細胞、（ｂ）レスベラトロール（１００μＭ、４８時間）で処理したケロイド中央部線維芽細胞、（ｃ）未処理のケロイド辺縁部線維芽細胞、（ｄ）レスベラトロール（１００μＭ、４８時間）で処理したケロイド辺縁部線維芽細胞である。レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞においてカスパーゼ－３を活性化したことを示す。レスベラトロールで８時間処理した後、細胞を溶解してカスパーゼ－３活性を分析した。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。レスベラトロールの抗線維化効果に関するｉｎ　ｖｉｖｏ研究のスキームを示す図である。ケロイド線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル（５×１０^５細胞／ｍｌ）をヌードマウスの皮膚下に移植した。その後、レスベラトロール（１００ｍＭ、１００μｌ）を、移植したゲルに注射した。レスベラトロールの抗線維化効果に関するｉｎ　ｖｉｖｏ研究の結果である。レスベラトロールを注射すると、移植したケロイド線維芽細胞包埋コラーゲンゲルはかなり退縮した。ケルセチンおよびニコチンアミドに関し、ケロイド中央部線線維芽細胞のＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βのｍＲＮＡ発現に対する抑制効果をＲＴ－ＰＣＲにより評価した結果を示す写真である。Ｑ１０、Ｑ１００はそれぞれ、ケルセチン１０、１００μＭで処理した場合を意味する。また、Ｎ１０、Ｎ１００はそれぞれ、ニコチンアミド１０、１００μＭで処理した場合を意味する。ケルセチンおよびニコチンアミドに関し、ケロイド辺縁部線線維芽細胞のＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βのｍＲＮＡ発現に対する抑制効果をＲＴ－ＰＣＲにより評価した結果を示す写真である。Ｑ１０、Ｑ１００はそれぞれ、ケルセチン１０、１００μＭで処理した場合を意味する。また、Ｎ１０、Ｎ１００はそれぞれ、ニコチンアミド１０、１００μＭで処理した場合を意味する。ケルセチンによるケロイド中央部線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を、ＷＳＴ－１アッセイにより検討した結果を示す。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。ケルセチンによるケロイド辺縁部線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を、ＷＳＴ－１アッセイにより検討した結果を示す。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。ニコチンアミドによるケロイド中央部線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を、ＷＳＴ－１アッセイにより検討した結果を示す。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。ニコチンアミドによるケロイド辺縁部線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を、ＷＳＴ－１アッセイにより検討した結果を示す。データは、各群の三重反復実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。

　本明細書において、「ケロイド」とは、瘢痕組織が過剰に増殖した病変であり、良性皮膚線維増殖性病変に分類され、真性ケロイドともいう。したがって、本発明の「ケロイド」は、類縁病変である肥厚性瘢痕とは区別される。

　式（Ｉ）のポリフェノール／治療剤
　本発明のケロイド治療剤は、式（Ｉ）のポリフェノールを有効成分として含んでなることを一つの特徴としている。かかる式（Ｉ）のポリフェノールが、真性ケロイド線維芽細胞に対する顕著な増殖抑制活性を有することは意外な事実である。

　本発明の好ましい態様によれば、Ｒ_２は水素原子またはＣ（ＯＨ）であり、Ｒ_３が水素原子またはＣ（＝Ｏ）である。

　また、本発明の別の態様によれば、Ｒ_１がＣＨ基であり、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は存在せず、かつＲ_２およびＲ_３は水素原子である。また、より好ましい別の態様によれば、Ｒ_４は水素原子であり、式（Ｉ）のポリフェノールはレスベラトロールである。式（Ｉ）のポリフェノールがレスベラトロールである場合、ケロイド線維芽細胞のアポトーシスを誘導する上で特に有利である。

　また、本発明の別の態様によれば、Ｒ_１は酸素原子であり、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は単結合であり、かつＲ_２はＣＨ基またはＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）である。また、より好ましい別の態様によれば、Ｒ_２はＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）である。さらに好ましい別の態様によれば、Ｒ_４は水酸基であり、式（Ｉ）のポリフェノールはケルセチンである。

　上記の他、本発明のポリフェノールは、式（Ｉ）に包含される限り特に限定されず、スチルベノイド（Kai Xiao et al. Stilbenoids: Chemistry and bioactivities. Studies in Natural Products Chemistry Volume 34, 2008, Pages 453-646に示されているもの等）を含んでいてよい。本発明に包含されるスチルベノイドおよびポリフェノールのケロイド治療活性は、例えば、本出願で開示された方法（実施例１～７）を用いて確認することができる。

　本発明のポリフェノールは、天然物であってもよく、合成品または市販品であってもよい。本発明のポリフェノールが、例えば、レスベラトロールまたはケルセチン等をはじめとする公知のポリフェノールである場合、当業者は、公知の柑橘類、植物成分から容易に単離精製して取得することができる。

　本発明のケロイド治療剤は、式（Ｉ）のポリフェノールをそのまま治療剤として用いてもよく、後述する他の成分とともに組成物として用いてもよい。本発明のケロイド治療剤におけるポリフェノールの含有量は、特に限定されず、例えば、０．０００２～２０重量％であり、好ましくは０．０２～２重量％である。

　また、製剤中のポリフェノールの濃度は、特に限定されず、通常は１ｍＭ～１Ｍの範囲とすることができる。しかしながら、注射剤の場合には、例えば、その濃度範囲は、２００μＭ～５００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ～１００ｍＭとしてもよい。

　また、本発明のケロイド治療剤の形態は、特に限定されず、経皮的投与の場合、軟膏剤、ゲル製剤、クリーム剤、液剤、スプレー剤、貼付剤、およびローション剤等の医薬製剤の形態で好適に使用することができる。これら製剤は、式（Ｉ）のポリフェノール、その薬理学的に許容される塩、エステル、アミド、プロドラッグ、それらの類似体（米国特許第６，７９０，８６９号、米国特許出願第１０／０７１，１２４号、および他所で開示されている）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される有効成分を、薬学的に許容可能な他の成分と共に使用して従来方法により調製することができる。かかる他の成分としては、特に限定されないが、例えば、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤、例えば、炭化水素（例えば、ペトロラタム、スクアラン、流動パラフィン等）、高級アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール等）、高級脂肪酸低級アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル等）、動物脂（例えば、ラノリン等）、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール等）、ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール４００、マクロゴール４０００等）、グリセリンの脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸グリセリン等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノステアラート、ポリオキシエチレンアルキルエーテルホスファート（商標名、ＮＩＫＫＯＬ　ＤＤＰ－２、日本サーファクタント工業により製造）等）、ろう、樹脂、水、および随意に保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等）が挙げられる。

　また、ケロイド治療剤は、経口または非経口投与用に提供することもできる。その場合、上記に示されるような他の成分を含んでいてもよく、経口または非経口薬物投与に特に好適な薬学的に許容される担体、媒体、添加剤等を選択して含有させてもよい。かかる製剤は、例えば、ポリフェノール含有マイクロエマルジョンとして提供することができる。

　用途
　本発明によれば、ケロイド線維芽細胞の増殖抑制を有する式（Ｉ）のポリフェノールを患者のケロイド病変部位に投与することにより、効果的にケロイド治療を行うことができる。したがって、一つの態様によれば、ケロイド治療剤の製造における、式（Ｉ）のポリフェノールの使用が提供される。また、好ましい態様によれば、式（Ｉ）のポリフェノールは、ケロイド線維芽細胞の増殖抑制に用いられる。

　また、本発明のポリフェノールは、ケロイド線維芽細胞のアポトーシス誘導において好適に用いることができる。ケロイド線維芽細胞のアポトーシス誘導に適用する場合、本発明のポリフェノールはレスベラトロールが好ましい。

　また、本発明のポリフェノールは、真性ケロイド線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７またはＴＧＦ－β１の発現を効果的に抑制することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）のポリフェノールを含んでなる、真性ケロイド線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７またはＴＧＦ－β１の発現抑制剤が提供される。

　本発明のケロイド治療剤の有効量、用量および用法は、式（Ｉ）のポリフェノールのケロイド線維芽細胞の増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性レベル、ポリフェノール含有量、ケロイドの重症度および状態、ケロイドの継続年数、および患者の年齢および体重等に応じて当業者が適宜決定することができる。

　一つの態様によれば、本発明のケロイド治療剤は、局所塗布により投与することができる。局所塗布の場合、ケロイド治療剤は、特に限定されないが、好ましくは１塗布当たり約０．１～約５０ｍｇ／ｃｍ^２（皮膚面積）で、ケロイド領域またはその周辺領域に投与される。

　また、別の態様によれば、本発明のケロイド治療剤は、好ましくはケロイド病変部位への病変内注射により投与される。注射は、局所塗布よりも低い有効濃度しか必要としないことは当技術分野で周知である。注射の場合、ケロイド治療剤は、特に限定されないが、例えば、約０．００４～約１０ｍｇ／ｃｍ^２、好ましくは約０．０２～約２ｍｇ／ｃｍ^２（皮膚面積）で投与される。

　また、本発明のケロイド治療剤は、特に限定されないが、例えば、１日当たり１回～数回投与することができる。

　本発明のケロイド治療剤が適用される患者は、通常はヒトであるが、哺乳動物であってもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
　また、本発明におけるケロイド病変部位は、特に限定されないが、好適な例としては、耳、肩、胸または恥骨部(public region)が挙げられるが、好ましくは肩、胸または恥骨部である。

　また、本発明の特定の態様によれば、ケロイド線維芽細胞の治療方法であって、ケロイド線維芽細胞の増殖を抑制するのにおよび／またはケロイド線維芽細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な量の組成物を、ケロイド線維芽細胞に提供することを含み、上記組成物がレスベラトロールから本質的になる方法が提供される。また、より好ましい態様によれば、上記ケロイド線維芽細胞の治療方法において、レスベラトロールは、病変内注射により前記ケロイド線維芽細胞に提供される。また、上記より好ましい態様において、レスベラトロールは、皮膚１ｃｍ^２当たり約０．０２～約２ｍｇの量で提供されることが好ましい。また、別の好ましい態様によれば、上記ケロイド線維芽細胞の治療方法において、レスベラトロールは、局所塗布によりケロイド線維芽細胞に提供される。また、上記別の好ましい態様において、レスベラトロールは、皮膚１ｃｍ^２当たり約０．１～約５０ｍｇの量で提供されることが好ましい。

　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

材料および手順
　実施例１～７は、特に記載する以外、以下の１～１３に記載の材料および手順に準じて実施した。

１．培地および化学薬品
　ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、東京、日本から購入した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．０２％）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナ州、米国から購入した。レスベラトロールは、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社、（アンアーバー、ミシガン州、米国から購入した。

２．細胞培養
　ケロイド組織は、札幌医科大学医学部の倫理指針にしたがって説明と同意を得た後で、外科的切除により５人の異なる日本人患者から取得した。ケロイド組織試料は全て、病理学的に検査して診断を確認した。それらの詳細情報は、表１に列挙されている。

　ケロイド病変を切除した後、各ケロイド病変の盛り上がった赤色の領域（辺縁部分）および退縮した柔らかい領域（中央部分）から、全層生検材料を得た。explant法による繊維芽細胞の細胞培養物を用意した。少量の組織を切って脂肪を取り除き、直径１ｍｍ未満の小片に切り刻んだ。組織片を、５％ＣＯ_２湿潤大気中３７℃にて、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で培養した。２～３日毎に培地を交換した。初代培養の７～１４日後に、培養した組織の辺縁部から増殖した細胞を継代した。２～５継代のケロイド線維芽細胞を、全ての実験で使用した。中央部のケロイド領域から採取した線維芽細胞を、ケロイド中央部線維芽細胞と称し、辺縁領域に由来するものをケロイド辺縁部線維芽細胞と称した。

　より具体的培養方法としては、例えば、ケロイド線維芽細胞（２×１０³cell/cm²）を100mmディッシュまたは75cm²フラスコに播種するか、ケロイド線維芽細胞（1×10³～10⁴cell/cm²）を96ウェルプレートに播種し、その後１０％ＦＣＳ添加DMEMで24時間培養する手法が用いられた。また、特に記載しない限り、後続するレスベラトロールによる処理では無血清培地を用いた。

３．刺激物質
刺激物質がレスベラトロールの場合
　細胞を、組織培養プレートに１×１０^４／ｍｌの濃度で播種した。１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションした後、細胞を、無血清培地中で、レスベラトロール（０、２５、５０、または１００μＭ）により表示の期間処理した。

刺激物質がケルセチンまたはニコチンアミドの場合
　細胞を、無血清培地中で、ケルセチンまたはニコチンアミドを各種濃度（０、　１０、１００μＭ）により表示の期間処理する以外、レスベラトロールの場合と同様に実験を行った。

４．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
刺激物質がレスベラトロールの場合１
　Ｉ型コラーゲンおよびＨＳＰ４７　ｍＲＮＡの発現に対するレスベラトロールの効果を決定するために、ケロイド線維芽細胞を無血清培地中で、レスベラトロール（０、２５、５０、または１００μＭ）により４８時間処理した。前処理した細胞の全ＲＮＡを、製造業者の説明書にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、東京、日本）を使用して抽出した。逆転写（ＲＴ）は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、東京、日本）を用いて、２μｇの全ＲＮＡをテンプレートとして使用し、製造業者の説明書にしたがって実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製、東京、日本）および特異的プライマー（表２－１）を使用して実施した。

　試料を、ＰＣＲサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｊａｐａｎ社製、東京、日本）でインキュベートした。温度プロフィールは、９４℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長、３０サイクルで構成されていた。増幅された産物（１５μｌ）を、ＴＡＥ緩衝液中２％アガロースゲルに負荷し、分離バンドを、臭化エチジウム染色により視覚化した。バンドの相対密度を、Ｄｏｌｐｈｉｎ－Ｖｉｅｗ（倉敷紡績株式会社製、大阪、日本）を使用して定量化した。

刺激物質がケルセチンまたはニコチンアミドの場合
　ケルセチンまたはニコチンアミドの処理濃度を０、１０、または１００μＭとし、特異的プライマーとして表２－１に記載のものを用い、Ｉ型コラーゲンおよびＨＳＰ４７　ｍＲＮＡに加え、ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡを対象とする以外、レスベラトロールの場合と同様に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行った。

刺激物質がレスベラトロールの場合２
　上記４．の１）の場合と同様の手法により、Ｉ型コラーゲン、α-SMAおよびＨＳＰ４７ｍＲＮＡの発現に対するレスベラトロールの効果を確認した。

５．ＷＳＴ－１アッセイ
刺激物質がレスベラトロールの場合
　細胞懸濁液を、９６ウエル平底マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、処理前に２４時間インキュベートした。その後、レスベラトロール溶液を、０、２５、５０、または１００μＭの濃度で各ウエルに添加した。レスベラトロールに曝して１２、２４、３６、および４８時間後、１０μｌのＷＳＴ－１溶液（同仁化学研究所製、熊本、日本）を各ウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。４５０ｎｍの光学密度を、マイクロタイタープレートリーダー（ＡＲＶＯ　ＳＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、マサチューセッツ州、米国）で測定した。

刺激物質がケルセチンまたはニコチンアミドの場合
　ケルセチンまたはニコチンアミドを、０、１０、または１００μＭの濃度で各ウエルに添加し、１～５日接触させる以外、レスベラトロールの場合と同様に実験を行った。

６．酵素結合抗体免疫吸着アッセイ
　ケロイド線維芽細胞を０、２５、５０、または１００μＭの濃度のレスベラトロールにより４８時間処理した。処理した細胞培養上清を、滅菌試験管に収集した。ＴＧＦ－β１濃度を、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ミネソタ州、米国）で決定した。総ＴＧＦ－β１レベルを、製造業者の説明書（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ミネソタ州、米国）にしたがって、市販のＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。

７．カスパーゼ－３活性アッセイ
　無血清培地中でレスベラトロール（１００μＭ）により４８時間処理した。処理したケロイド線維芽細胞のカスパーゼ活性レベルを、製造業者の説明書にしたがって、市販の蛍光アッセイキット（カスパーゼ比色定量プロテアーゼアッセイキット；ＭＢＬ社製、名古屋、日本）を使用して決定した［１３］。この蛍光アッセイでは、カスパーゼ－３活性を、蛍光基質ＤＥＶＤ－ｐＮＡの切断により測定した。分離細胞を含む細胞を収集および溶解した。その後、溶解産物を遠心分離し、清澄上清を収集した。上清をＤＥＶＥ－ｐＮＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。各試料の光学密度を、プレートリーダー（ＡＲＶＯ　ＳＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、マサチューセッツ州、米国）を使用して、４０５ｎｍで決定した。

８．アネキシン－Ｖアッセイ
　ケロイド線維芽細胞を無血清培地中でレスベラトロール（１００μＭ）により４８時間処理した。インキュベーションを終了し、細胞を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を使用して回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、アポトーシス細胞を、製造業者の説明書にしたがって、アネキシン－Ｖ－Ｆｌｕｏｓおよび染色（アネキシン－Ｖ－ＦＬＵＯＳ染色キット、ロシュダイアグノスティックス社製、東京、日本）を使用することにより決定した。その後、標識細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ニュージャージー州、米国）で計数した。

９．細胞周期分析
　レスベラトロールで処理した線維芽細胞の細胞周期分布パターンを調査するために、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して細胞周期分布を観察した。ケロイド線維芽細胞を無血清培地中でレスベラトロール（１００μＭ）により４８時間処理した。その後、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液で回収し、洗浄し、収集した。線維芽細胞を、７５％（容積／容積）の冷却エタノールで少なくとも１時間－２０℃にて固定した。固定した細胞を遠心分離により収集し、ＲＮａｓｅ染色緩衝液（Ｐｈｏｅｎｉｘ　Ｆｌｏｗ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カリフォルニア州、米国）に再懸濁してＤＮＡを染色し、最終的にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ニュージャージー州、米国）で分析した。ケロイド由来の線維芽細胞の細胞周期分布を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。細胞周期分布は、Ｃｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔソフトウェアプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ニュージャージー州、米国）を使用して計算した。細胞周期のＧ０／Ｇ１、Ｇ２／Ｍ、Ｓ、およびサブＧ１期の細胞のパーセントは、付属のＭｏｄＦｉｔ　ＬＴソフトウェアプログラム（Ｖｅｒｉｔｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｈｏｕｓｅ社製、メーン州、米国）を使用して自動分析した。データは、Ｇ０／Ｇ１、Ｇ２／Ｍ、Ｓ、およびサブＧ１期の細胞のパーセントとして表されている。

１０．統計分析
　全ての実験において、データは、少なくとも三重反復実験による各群の平均±ＳＤ（標準偏差）で表した。統計分析は、スチューデントｔ検定を使用して実施し、０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。

１１．ケロイド線維芽細胞培養
　本研究で使用したヒトケロイド線維芽細胞は、手術中に患者から切除されたケロイド組織をexplant法により培養して得た。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＤＭＥＭ中で維持し、５％ＣＯ_２大気中３７℃で増殖させた。

１２．コラーゲンゲルの調製
　コラーゲン溶液を、Ｉ型アテロコラーゲン（ａｔｅｒｏ－ｃｌｌａｇｅｎ）溶液、１０倍濃縮最少必須培地（１０×ＭＥＭ））、およびＦＣＳと混合することにより調製し、８：１：１（容積／容積／容積）の比率で混合した。線維芽細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで分散し、５×１０^５細胞／ｍｌの密度でコラーゲンゲル溶液に懸濁した。細胞懸濁液を、２ｍｌ／皿で６ウエル組織培養プレートに分散し、５％ＣＯ_２大気下３７℃でインキュベートした。その後、２４時間後に、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ２ｍｌをゲルに注ぎ、一週間培養した。

１３．ヌードマウスへのコラーゲンゲルの移植
　培養したコラーゲンゲルを、体重が２０～２５ｇのヌードマウスの背部に移植した。移植後７日目にマウスを無作為にグループ化し、１ゲル当たり２mgのレスベラトロールまたは媒体（ＰＢＳ）を７日間にわたって移植領域内に注射した。各移植ゲルの長軸および短軸を測定し、表面積を計算した。移植ゲルのサイズは、レスベラトロール注射前の状態の表面積を１００％としたパーセントで表した。各実験群（ｎ＝３）につき、３つのゲルを使用した。

実施例１：レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞のＩ型コラーゲンおよびＨＳＰ４７のｍＲＮＡ発現抑制
　ケロイド線維芽細胞のＩ型コラーゲンおよびα―SMAのｍＲＮＡ発現に対するレスベラトロールの効果を、まず研究した。ケロイド線維芽細胞を、レスベラトロールで４８時間処理した。前処理した細胞の全ＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲにより抽出し、分析した。Ｉ型コラーゲンおよびα-SMAのｍＲＮＡ発現は、ケロイド線維芽細胞において用量依存的に減少した（図１ＡおよびＣ）。

　ＨＳＰ４７は、折り畳み、構築、および小胞体からの輸送プロセス中にプロコラーゲンと相互作用するコラーゲン特異的分子シャペロンである［１４］。ＨＳＰ４７の発現は、ケロイドを含む線維化疾患におけるコラーゲンの発現と緊密に関連している［１５］。
　レスベラトロール処理は、ＨＳＰ４７　ｍＲＮＡ発現に対して、Ｉ型コラーゲンと同様の抑制効果を示した（図１Ａ）。抑制は、レスベラトロール処理後の２日目で明らかだった。この結果は、レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞のコラーゲン産生を抑制することを示唆した。

　実施例２：レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞のＴＧＦ－β１産生低減
　ＴＧＦ－β１は、線維形成の重要なメディエーターの１つである。ＴＧＦ－β１は、ケロイド組織で過剰発現しており、線維芽細胞の増殖を刺激することが知られている。また、ＴＧＦ－β１は、Ｉ型コラーゲン合成を促進し、コラゲナーゼの転写を抑制する［１６］。したがって、次に、本発明者らは、ＴＧＦ－β１　ＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイを実施し、培養液上清に存在するＴＧＦ－β１タンパク質の量を定量化した。ケロイド線維芽細胞を、レスベラトロールで４８時間処理した。細胞培養上清を収集し、ＴＧＦ－β１濃度を決定した。レスベラトロール（１００μＭ）は、ケロイド辺縁部線維芽細胞のＴＧＦ－β１産生を有意に抑制し（Ｐ＜０．０５）、それは線維化抑制と一致していた（図１Ｂ）。

実施例３：レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞の増殖抑制
　本発明者らは、ケロイド線維芽細胞増殖に対するレスベラトロールの効果を研究した。細胞を、０、２５、５０、または１００μＭの濃度のレスベラトロールで処理し、４８時間まで培養した（図２）。レスベラトロール処理によって、ケロイド線維芽細胞の増殖が濃度依存的に抑制されることが示された。

実施例４：レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞のアポトーシス誘導
　本発明者らは、レスベラトロールで処理した細胞が、丸くなり、退縮し、浮遊するという、未処理対照では見られなかったアポトーシス細胞の特徴を観察した（図３）。

　レスベラトロールの増殖抑制機序を調査するため、アネキシン－ＶおよびＰＩによる２色染色を使用して、初期アポトーシスおよびその後に細胞死を起こす細胞の割合を検出した。本発明者らは、レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞の増殖抑制の経時的経過に関する本発明者らの初期観察に基づいて、４８時間のみで細胞アポトーシスを評価した。

　図４Ａに示されているように、レスベラトロール（１００μＭ）は、ケロイド線維芽細胞において細胞アポトーシスを誘導した。ケロイド中央部線維芽細胞では、全細胞の９．５８％が初期アポトーシスを起こし、後期アポトーシスは２４．５１％、ネクローシスは６．５７％だった。ケロイド辺縁部線維芽細胞では、全細胞の３．１４％が初期アポトーシスを起こし、後期アポトーシスは１８．４９％、ネクローシスは０．９８％だった。

　また、上記と同様の試験を繰り返した結果、結果は、図４Ｂおよび表３－２に示される通りであった。レスベラトロール（１００μＭ）は、ケロイド線維芽細胞において細胞アポトーシスを誘導した。ケロイド中央部線維芽細胞では、全細胞の１８．７％が初期アポトーシスを起こし、後期アポトーシスは７３．２％、ネクローシスは７．９％だった。ケロイド辺縁部線維芽細胞では、全細胞の４９．７％が初期アポトーシスを起こし、後期アポトーシスは１９．８％、ネクローシスは７．１％だった。

　次に、細胞周期に対するレスベラトロールの効果を理解するために、ケロイド線維芽細胞をレスベラトロール（１００μＭ）で処理し、細胞周期をフローサイトメトリーにより分析した。データは、Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ２／Ｍ期、Ｓ期、およびサブＧ１期（アポトーシス）の細胞のパーセントとして表されている。中央および辺縁ケロイド線維芽細胞は両方とも、４８時間のレスベラトロールによる処理後に、アポトーシス細胞数の著しい増加を示した（図５）。この効果の程度は、ケロイド辺縁部線維芽細胞において、ケロイド中央部線維芽細胞より大きかった。したがって、ケロイド辺縁部線維芽細胞は、ケロイド中央部線維芽細胞よりもアポトーシスに感受性である可能性がある。

　カスパーゼ－３は、アポトーシス刺激を行う重要なエフェクター分子であることが知られているため［１７、１８］、本発明者らは、レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞においてカスパーゼ－３を活性化したか否かを調査した。カスパーゼ－３活性を測定するために、ＤＥＶＤ－ｐＮＡを基質として使用して、レスベラトロールで処理したケロイド線維芽細胞に由来する溶解産物を、カスパーゼ－３活性について分析した。本発明者らは、カスパーゼ－３が、処理後８時間で、レスベラトロールで処理したケロイド線維芽細胞において活性化されたことを観察した（図６）。これらの結果は、カスパーゼ－３が、アポトーシスの初期段階においてレスベラトロールにより活性化される可能性を示唆した。この効果の程度は、ケロイド中央部線維芽細胞よりもケロイド辺縁部線維芽細胞でより大きく、それは、細胞周期分析の結果と一致した。

実施例５.レスベラトロールの抗繊維症効果に関するｉｎ　ｖｉｖｏ研究
　ケロイド線維芽細胞を埋込んだコラーゲンゲル1個（５×１０^５細胞／ｍｌ）をヌードマウスの皮膚下に移植した。次に、ゲル移植領域内に、レスベラトロール（１００ｍＭ、１００μｌ）またはコントロールの媒体（ＰＢＳ、１００μｌ）を注射した（図７参照）。
　その結果、図８に示される通りであった。ここで、データは、各群（ｎ＝３）の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（^＊ｐ＜０．０５）。レスベラトロールを注射すると、埋込んだケロイド線維芽細胞は有意に減少した。

実施例１～５の総括
　今日、細胞外マトリックスの大量蓄積を特徴とし、異常な創傷治癒中に生じる良性のコラーゲン性腫瘍であるケロイドの効果的な薬理学的治療法は存在しない。Ｉ型コラーゲンは、ケロイドにおける最も重要な要素である。実際に、本発明者らの予備実験では、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡの発現は、同じ患者に由来する正常な皮膚線維芽細胞と比較して、ケロイド線維芽細胞では過剰発現していることがわかった（データ非表示）。アフリカ系アメリカ人、ラテンアメリカ人、および東アジア人を含む、皮膚の色調の濃い人種は、ケロイド形成に罹患し易いため［１９］、遺伝的要因が、それに重要な役割を果たしていると考えられている。最近、フォークヘッド転写因子Ｌ２（ＦＯＸＬ２）および神経前駆細胞発現／発生的下方制御４（ＮＥＤＤ４、neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4）が、ケロイドの予防および治療に寄与する可能性があるケロイド関連遺伝子であることが特定された。しかしながら、ケロイドにおけるこれら遺伝子の関連性を証明するためには、更なる研究が必要である［２０］。ケロイド線維芽細胞の増殖能力は、正常な皮膚線維芽細胞より高く、ケロイド線維芽細胞は、抗Ｆａｓ抗体、スタウロスポリン、およびＣ２セラミド等の幾つかの刺激により誘導されるアポトーシスに抵抗性であることが報告されている［２１、２２］。アポトーシスは、創傷治癒プロセスにおいて、肉芽期から正常な瘢痕への移行を媒介する場合がある。これらの知見から、ケロイドは、細胞増殖が遷延しアポトーシスに抵抗性であり、コラーゲン蓄積を生じる異常な創傷治癒過程の結果、成り立つものであると示唆される。レスベラトロールは、様々な機序により抗線維化効果を示すことが報告されているが［２３、２４］、ケロイドに対するその影響は全く知られていない。本発明者らは、レスベラトロールが、コラーゲン産生、細胞増殖、およびアポトーシスに関してケロイド線維芽細胞に有効であるか否かを研究した。

　本発明者らは、まず始めに、細胞外マトリックスの主成分であるＩ型コラーゲンの発現に対するレスベラトロールの効果を研究した。その過剰発現は、ケロイド形成の病態生理学的特徴の１つである。本発明者らによる結果は、レスベラトロールが、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡの発現を用量依存的に抑制することを示した。また、α-SMAは、筋線維芽細胞のマーカーであることが知られている。本発明者らによる結果は、レスベラトロールが、α-SMAのｍＲＮＡの発現を用量依存的もまた抑制することを示した。次に、本発明者らは、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－β１の効果を含む、ケロイドの線維形成特性を調査した。ＨＳＰ４７は、線維化疾患におけるコラーゲン発現と共に上昇するコラーゲン特異的分子シャペロンである［１４、２５］。本発明者らの予備実験では、ケロイド組織は、免疫組織化学的分析では正常皮膚組織より抗ＨＳＰ４７抗体でより強く染色され、それは、文献［１５］の報告と一致した。ＨＳＰ４７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＨＳＰ４７特異的ｓｉＲＮＡの形質移入を使用した幾つかの実験では、ＨＳＰ４７発現を抑制することで、コラーゲンの蓄積を抑制することができることが明らかにされた［２６、２７］。また、本発明者らは、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡ発現が、レスベラトロールで処理したケロイド線維芽細胞において著しく減少したことを見出し、それがコラーゲン蓄積を抑制する場合があることを示唆する。ＴＧＦ－β１は、最も顕著な線維形成特性を示し［２８］、ケロイド線維芽細胞におけるＴＧＦ－β１の主な役割は、Ｉ型コラーゲン蓄積の正の調節であると考えられる［１６］。レスベラトロール１００μＭで処理した後、ケロイド辺縁部線維芽細胞の総ＴＧＦ－β１産生は、著しく抑制されていたことが当該ケロイド線維芽細胞のＥＬＩＳＡによって示された。一方、RT-PCRでは、レスベラトロール処理によりケロイド線維芽細胞のTGF-β1ｍRNA発現は抑制されず（データ非表示）、レスベラトロールが、転写レベルにおいて、線維芽細胞のＴＧＦ－β１発現に影響を及ぼさない場合があることを示唆した。しかしながら、レスベラトロールの抗線維化効果の詳細な機序は、依然として明らかではない。ラット肝線維症モデルにおいて、レスベラトロールは、肝性星細胞のＴＧＦ－β１　ｍＲＮＡ発現および増殖を抑制し、これにより、その抗線維化機序が説明される［１２、２３］。しかしながら、Ｉ型コラーゲンに対するＴＧＦ－β１活性化効果は、複雑であると考えられる。ＥＬＩＳＡの結果に基づき、本発明者らは、レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞に直接作用し、ＴＧＦ－β１の内因的合成を抑制することができ、その結果としてＩ型コラーゲン発現の抑制がもたらされると推測した。加えてSasakiら［２９］は、ＴＧＦ－β１がＨＳＦ１を活性化し、したがってＨＳＰ４７　ｍＲＮＡの転写を刺激し、その結果としてヒト線維芽細胞におけるＨＳＰ４７タンパク質の発現増加をもたらすことを示した。これらの観察は、本研究における知見と合わせると、レスベラトロールが、少なくとも部分的に、ＴＧＦ－β１産生の抑制によりまたはＨＳＰ４７発現の抑制により、コラーゲン蓄積を抑制することができることを示唆する。

　次に、本発明者らは、ケロイドの病態的特徴であると考えられるケロイド線維芽細胞の細胞増殖およびアポトーシスに対するレスベラトロールの効果を研究した。本研究では、レスベラトロールは、ケロイド線維芽細胞増殖を用量依存的に減少させた。細胞増殖に対するその抑制効果の機序は、依然として判明していない。しかしながら、レスベラトロールによる増殖抑制は、レスベラトロールが、癌細胞を含む多数のタイプの細胞の増殖を抑制するため、一般的な知見である可能性があった［３０～３３］。レスベラトロールの別の効果は、アポトーシスを誘導する能力である。アポトーシスは、ケロイド組織の退縮の主要な要因であり、レスベラトロールによるケロイド線維芽細胞のアポトーシス増加は、レスベラトロールの抗線維化活性の分子機序に関与する可能性がある。本研究では、細胞周期分析およびアネキシン－Ｖアッセイの結果は、ケロイド線維芽細胞のレスベラトロール誘導性アポトーシスを示した。加えて、レスベラトロールは、カスパーゼ－３活性化を刺激した。レスベラトロールは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の抑制、ｐ５３のリン酸化の促進、およびミトコンドリアアポトーシス経路による等の様々な機序により、白血病細胞系、乳房細胞系、骨髄腫細胞系、皮膚細胞系、胎児性横紋筋肉腫細胞系、および神経膠芽腫細胞系においてアポトーシスを引き起こすことが示されている［９、３４～３７］。ケロイド線維芽細胞では、様々なシグナル経路により機能する複数のアポトーシス誘因が示唆されているものの、レスベラトロールは、カスパーゼ－３依存的機序によりアポトーシスを誘導すると仮定することが可能である。ＴＧＦ－β１は、ケロイド線維芽細胞において抗アポトーシス効果を示すため［２１］、またはそれはＮＦｋｂ活性の抑制によりアポトーシスを誘導する可能性があるため［３８］、ケロイド線維芽細胞におけるレスベラトロールによるアポトーシスの別の機序は、ＴＧＦ－β１の抑制によるものである可能性がある。そのｉｎ　ｖｉｖｏ効果を更に調査する必要がある。Luら［３９］は、ケロイド中央部線維芽細胞およびケロイド辺縁部線維芽細胞間の細胞周期分布に有意差があったことを報告した。ほとんどのケロイド辺縁部線維芽細胞は、増殖期（Ｇ２／ＭおよびＳ）にあり、それらの高い増殖能力は、ケロイドの辺縁領域の過形成性増殖特徴を説明することができる。本発明者らは、レスベラトロールが、ケロイド中央部線維芽細胞よりもケロイド辺縁部線維芽細胞で、アポトーシスの誘導因子としてより有効であることを見出した。

　結論として、本発明者らは、レスベラトロールが、ケロイドに対して抗線維症効果を示すか否かを決定するために、患者のケロイドに由来する培養ケロイド線維芽細胞を研究した。本発明者らは、レスベラトロールが、ケロイド線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン蓄積の抑制に有効であることを実証した。加えて、レスベラトロールは、ケロイド線維芽細胞増殖を抑制し、ケロイド線維芽細胞のアポトーシス細胞死を誘導した。これらの知見は、レスベラトロールの抗線維化効果が、ケロイド線維芽細胞活性化の抑制およびアポトーシス促進効果（proapoptptic effect）に起因する可能性があることを示唆する。本発明者らの研究は、レスベラトロールによる患者の治療可能性を示唆し、したがってケロイド治療の治療戦略に対する新しい洞察を提供することができる。

実施例６.ケルセチンによる、ケロイド線維芽細胞のＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βのｍＲＮＡ発現抑制
　ケルセチンを用いてケロイド線維芽細胞のＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βのｍＲＮＡ発現に対する抑制効果を、上記手順に従い検討した結果、ケロイド辺縁部線維芽細胞において、ケルセチンはＩ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βの発現を用量依存的に抑制した（図９Ｂ、Ｑ１０およびＱ１００）。
　一方、比較例としてＳｉｒｔ１阻害剤として知られるニコチンアミドを用いた結果、Ｉ型コラーゲン、ＨＳＰ４７およびＴＧＦ－βの発現に影響はなかった（図９ＡおよびＢ、Ｎ１０およびＮ１００）。

実施例７：ケルセチンによるケロイド線維芽細胞の増殖抑制
　ケルセチンを用いてケロイド中央部およびケロイド辺縁部線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を、上記ＷＳＴ－１アッセイの手順に従い検討した。
　ケロイド中央部線維芽細胞における結果を図１１に示し、ケロイド辺縁部線維芽細胞における結果を図１２に示す。ケロイド中央部およびケロイド辺縁部線維芽細胞のいずれにおいても、ケルセチンは有意な細胞増殖の抑制効果を示した。
　一方、比較例としてニコチンアミドを用いて同様の実験を行った。ケロイド中央部線維芽細胞における結果を図１３に示し、ケロイド辺縁部線維芽細胞における結果を図１４に示す。ケロイド中央部およびケロイド辺縁部線維芽細胞のいずれにおいても、ニコチンアミドは有意な細胞増殖抑制効果を示さなかった。

参考文献
　上記[1]～[39]は、以下に示す参考文献に当たる。これら参考文献の全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
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Claims

　式（Ｉ）に記載のポリフェノールを含んでなる、ケロイド治療剤：

　（式中、
　　Ｒ_１は、ＣＨまたは酸素原子であり、
　　Ｒ_２は、水素原子、ＣＨまたはＣ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_３は、水素原子、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_４は、水素原子または水酸基であり、ここで、
　　　Ｒ_１がＣＨ基である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は存在せず、かつＲ_２およびＲ_３は水素原子であり、
　　　Ｒ_１が酸素原子である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は単結合であり、かつＲ_２はＣＨ基またはＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）である）。
　前記ケロイドが真性ケロイドである、請求項１に記載の治療剤。
　Ｒ_２が水素原子またはＣ（ＯＨ）であり、Ｒ_３が水素原子またはＣ（＝Ｏ）である、請求項１または２に記載の治療剤。
　前記ポリフェノールがレスベラトロールである、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療剤。
　ケロイド線維芽細胞の増殖抑制に用いられる、請求項１～４のいずれか一項に記載の治療剤。
　ケロイド線維芽細胞のアポトーシス誘導に用いられる、請求項４または５に記載の治療剤。
　前記ポリフェノールが、局所塗布または病変内注射により投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療剤。
　前記ポリフェノールが、皮膚１ｃｍ^２当たり約０．０２～約２ｍｇの量で投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の治療剤。
　前記ポリフェノールが、皮膚１ｃｍ^２当たり約０．１～約５０ｍｇの量で投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療剤。
　前記ケロイドが、肩、胸または恥骨部由来のものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療剤。
　式（Ｉ）に記載のポリフェノールの有効量をケロイド病変部位に投与することを含んでなる、ケロイドの治療方法：

　（式中、
　　Ｒ_１は、ＣＨまたは酸素原子であり、
　　Ｒ_２は、水素原子、ＣＨまたはＣ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_３は、水素原子、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_４は、水素原子または水酸基であり、ここで、
　　　Ｒ_１がＣＨ基である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は存在せず、かつＲ_２およびＲ_３は水素原子であり、
Ｒ_１が酸素原子である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は単結合であり、かつＲ_２はＣＨ基またはＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）である）。
　前記ポリフェノールがレスベラトロールである、請求項１１に記載の方法。
　ケロイド治療剤の製造における、式（Ｉ）に記載のポリフェノールの使用：

　（式中、
　　Ｒ_１は、ＣＨまたは酸素原子であり、
　　Ｒ_２は、水素原子、ＣＨまたはＣ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_３は、水素原子、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）であり、
　　Ｒ_４は、水素原子または水酸基であり、ここで、
　　　Ｒ_１がＣＨ基である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２と＊の＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は存在せず、かつＲ_２およびＲ_３は水素原子であり、
　　　Ｒ_１が酸素原子である場合、Ｒ_１と＊の炭素との間の結合は単結合であり、Ｒ_２と＊の炭素との間の結合は二重結合であり、Ｒ_２とＲ_３との間の結合は単結合であり、かつＲ_２はＣＨ基またはＣ（ＯＨ）基であり、Ｒ_３はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＨ）、ＣＨ_２またはＣＨ（ＯＨ）である）。
　前記ポリフェノールがレスベラトロールである、請求項１３に記載の使用。