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WO2012105182A1 - 検出方法、および該検出方法に用いられる磁性体含有誘電体粒子 - Google Patents

検出方法、および該検出方法に用いられる磁性体含有誘電体粒子 Download PDF

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Publication number
WO2012105182A1
WO2012105182A1 PCT/JP2012/000427 JP2012000427W WO2012105182A1 WO 2012105182 A1 WO2012105182 A1 WO 2012105182A1 JP 2012000427 W JP2012000427 W JP 2012000427W WO 2012105182 A1 WO2012105182 A1 WO 2012105182A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
magnetic
substance
particles
containing dielectric
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/000427
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English (en)
French (fr)
Inventor
大塚　尚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Publication of WO2012105182A1 publication Critical patent/WO2012105182A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Definitions

  • the present invention relates to a detection method for detecting a substance to be detected in a sample and a magnetic substance-containing dielectric particle used in the detection method.
  • biomeasurement for example, in order to detect an antigen that is a detected substance contained in a sample, a primary antibody that specifically binds to the detected substance is fixed on the substrate, and the sample is supplied onto the substrate. By specifically binding the detected substance to the primary antibody, and then adding a secondary antibody to which a fluorescent label is attached that specifically binds to the detected substance and binding the detected substance to the primary antibody.
  • assay methods such as a sandwich method in which a so-called sandwich of a primary antibody, a substance to be detected and a secondary antibody is formed to detect fluorescence from a fluorescent label attached to the secondary antibody, and a competitive method. ing.
  • excitation light that is totally reflected on the substrate surface is incident from the back surface of the substrate, and the fluorescence is excited by an evanescent wave that oozes out to the substrate surface (evanescent fluorescence). Law) is known.
  • Patent Document 2 In order to improve sensitivity in the evanescent fluorescence method, a method using the effect of electric field enhancement by plasmon resonance has been proposed in Patent Document 2, Non-Patent Document 1, and the like.
  • the surface plasmon enhanced fluorescence method in order to generate plasmon resonance, a metal layer is provided on the substrate, and excitation light is incident on the interface between the substrate and the metal layer from the back surface of the substrate at an angle greater than the total reflection angle. The surface plasmon is generated in the metal layer by the irradiation of the excitation light, and the S / N is improved by increasing the fluorescence signal by the electric field enhancing action.
  • Non-Patent Document 2 a method using the electric field enhancement effect by the waveguide mode is proposed in Non-Patent Document 2 as having the effect of enhancing the electric field of the sensor unit.
  • This optical waveguide mode-enhanced fluorescence spectroscopy (OWF: Optical waveguide mode / enhanced fluorescence / spectroscopy) sequentially forms a metal layer and an optical waveguide layer made of a dielectric material on the substrate, and has an angle greater than the total reflection angle from the back of the substrate. Excitation light is incident on the optical waveguide layer, an optical waveguide mode is generated in the optical waveguide layer by irradiation of the excitation light, and the fluorescence signal is enhanced by the electric field enhancement effect.
  • OPF optical waveguide mode-enhanced fluorescence spectroscopy
  • Patent Document 3 instead of detecting fluorescence from a fluorescent label excited in an electric field enhanced by surface plasmon, the fluorescence newly induces surface plasmon in the metal layer.
  • a method has been proposed in which the emitted radiation (SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission) is extracted from the prism side.
  • the reaction between the substance to be detected and the primary antibody is a reaction between the solid phase surface to which the primary antibody is bound and the solution (liquid phase) containing the substance to be detected. Yes.
  • Patent Document 4 does not require a washing step, can quantitate a substance to be detected, and solves the delay problem of the reaction based on the solid phase and the liquid phase, thereby realizing high speed.
  • the primary antibody is labeled with a magnetic particle
  • the secondary antibody is labeled with a fluorescent dye
  • the primary antibody is detected in the liquid phase without immobilizing the primary antibody on the substrate.
  • An antibody conjugate is formed, and this conjugate is localized using a magnet to separate it from an unreacted secondary antibody, and evanescent light is applied to the localized conjugate without a washing step.
  • a method for measuring the fluorescence signal by irradiating the light is disclosed.
  • Patent Document 4 in the paragraph [0030] of the specification, from the viewpoint of dispersibility in a liquid sample, that is, from the viewpoint of preventing particles from self-aggregating, the size of the magnetic particles is 100 nm (0 .1 ⁇ m) or less is preferred.
  • Patent Document 5 a sensing method using magnetic particles is proposed, and an example in which fine particles having a particle diameter of 100 nm or less are used as the magnetic particles.
  • Patent Document 6 uses magnetic particles of several tens of nanometers, and due to the difference in response to magnets between a magnetic particle alone and a complex in which the magnetic particle includes a substance to be detected, that is, a difference in concentration rate, A method is described in which both are separated and signal measurement from the complex is performed.
  • JP 2005-77338 A JP-A-10-307141 US Patent Application Publication No. 2005/0053974 JP 2005-77338 A Japanese Patent Laid-Open No. 5-264547 JP-A-1-272970
  • the detection method using localization by magnetic particles is a bioassay method because it can react in the liquid phase and does not require a washing step for separating the binding substance from the unreacted secondary antibody. Although it is extremely attractive, it has not been put into practice as an idea.
  • the present inventors have found the following problems in putting the localization of a conjugate using magnetic particles into practical use.
  • an object of the present invention is to solve the above problems and to provide a detection method that can withstand practical use by utilizing localization of a conjugate by magnetic particles.
  • magnetic substance-containing dielectric particles in which a magnetic substance is included in a first binding substance that specifically binds to a substance to be detected and a functional group that exhibits polarity in a liquid sample is surface-modified.
  • a magnetically imparted binding substance provided, a second binding substance that specifically binds to the substance to be detected, and a third bond that specifically binds to the first binding substance in competition with the substance to be detected.
  • a detection method for detecting the optical signal and determining the amount of the substance to be detected in the liquid sample based on the detected amount of the optical signal A dielectric material of the magnetic substance-containing dielectric particles is transparent to the excitation light, and a volume content of the magnetic particles in the magnetic substance-containing dielectric particles is 50% or less.
  • the dielectric material SiO 2 or light transmissive resin is preferable.
  • the light-transmitting resin polymethyl methacrylate resin (PMMA) and cycloalleffin-based resin, which are excellent in light transmittance, are particularly preferable.
  • the volume content is 25% or less.
  • an amino group, a quaternary ammonium group or the like may be used as a basic functional group, or an acidic functional group such as a carboxyl group, A sulfonic acid group, a phosphoric acid group, or the like may be used.
  • the maximum length of the sandwich structure is 200 nm or more.
  • the maximum length of a conjugate (so-called competitive conjugate) of the magnetism-binding substance and the labeled binding substance obtained by adding a photoresponsive label to the third binding substance Is preferably 200 nm or more.
  • the maximum length is the major axis of the combined body, and is basically the total length obtained by connecting a plurality of elements constituting the combined body.
  • the particle diameter of the magnetic substance-containing dielectric particles is 100 nm or more, preferably 150 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • the magnetic particles included in the dielectric particles may be singular or plural, and may be any magnetic substance that is attracted to the local region by a magnetic field generated by a magnet or the like. Or what consists of a platinum-type magnetic material is preferable.
  • the photoresponsive label may be one that generates fluorescence as an optical signal when irradiated with excitation light, or one that generates scattered light as an optical signal when irradiated with excitation light.
  • a localized plasmon may be generated as an optical signal by irradiation with excitation light.
  • Specific examples include fluorescent dye molecules, fluorescent fine particles encapsulating fluorescent dye molecules with a dielectric material, or metal fine particles.
  • the metal fine particles generate scattered light when irradiated with excitation light, and may generate localized plasmons on the surface thereof. In this case, the scattered light may be detected as an optical signal, or the emitted light resulting from the localized plasmon may be detected using the localized plasmon as an optical signal.
  • a part of a wall having a sample contact surface that comes into contact with the liquid sample is formed of a transparent dielectric plate, a region near the sample contact surface is set as the local region, and the dielectric Evanescent light generated on the sample contact surface side by irradiating light on the sample contact surface of the dielectric plate under total reflection conditions from the outside of the wall made of a body plate can be used as the excitation light. it can.
  • sample cell a cell in which a metal film is formed on the sample contact surface of the dielectric plate may be used, or a cell having an optical waveguide layer on the metal film may be used.
  • the optical signal may be detected directly, or the optical signal may be detected indirectly.
  • the sample cell As a method for indirectly detecting an optical signal, when the sample cell was provided with a dielectric plate with a metal film formed, it was generated from the photoresponsive label by irradiation with the excitation light.
  • a method in which the optical signal is indirectly detected by exciting a surface plasmon on the metal film and detecting radiation emitted by the excitation of the surface plasmon is preferable.
  • the sample cell When the sample cell is provided with a dielectric plate having an optical waveguide layer on a metal film, an optical signal generated from the photoresponsive label by irradiation of the excitation light is transmitted to the optical waveguide layer.
  • the optical signal is indirectly detected by exciting the optical waveguide mode and detecting the emitted light emitted due to the excitation of the optical waveguide mode.
  • the photoresponsive label When the photoresponsive label generates fluorescence, the fluorescence excites surface plasmons on the metal film or an optical waveguide mode of the optical waveguide layer as an optical signal.
  • the photoresponsive label when the photoresponsive label is a metal fine particle, the localized plasmon generated on the surface of the metal fine particle by the excitation light is used as an optical signal to excite the surface plasmon on the metal film or the optical waveguide mode of the optical waveguide layer.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles of the present invention contain magnetic particles, have a functional group exhibiting polarity in a liquid sample, surface-modified, the dielectric material is transparent to the excitation light, and The magnetic particles have a volume content of 50% or less.
  • the dielectric material is preferably SiO 2 or a light transmissive resin.
  • the light transmissive resin is preferably a polymethyl methacrylate resin (PMMA) or a cycloallephine-based resin having excellent light transmittance.
  • the volume content of the magnetic particles is preferably 25% or less
  • the functional group is a carboxyl group.
  • the particle diameter is preferably 100 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • the magnetic particles are preferably made of an iron-based magnetic material or a platinum-based magnetic material.
  • the magnetic particles containing the magnetic particles are included in the dielectric body, and the magnetic material-containing dielectric particles whose surface is functionally modified with a functional group that generates polarity in the liquid sample are used. Even if the magnetic particles in the particles are magnetized and the dielectric particles adhere to each other, in the liquid sample, the repulsion can be improved by repulsion due to the polarity of the functional group on the surface.
  • the magnetic particles since the magnetic particles are encapsulated in the dielectric, the magnetic particles themselves can be separated from the photoresponsive label to some extent, thereby suppressing metal quenching that occurs when a metal material is used for the magnetic particles. Thus, a decrease in signal strength and a variation in signal amount can be suppressed.
  • the surface modification of the organic substance or the like to the dielectric particle can be easily performed, so the surface modification of the functional group and the application of the first binding substance are magnetic. This can be done easily regardless of the body material.
  • the dielectric of the magnetic substance-containing dielectric particles is transparent to the excitation light, the dielectric material portion of the dielectric particles is prevented from being attenuated by absorption or the like. Can do. Furthermore, since the content of the magnetic substance in the magnetic substance-containing dielectric particles is 50% or less, the refraction index of the magnetic substance on the local region when the magnetism-imparting binding substance is attracted to the local region in the sample cell. While suppressing a change and coloring, the scattered light by a magnetic particle can be suppressed and S / N of an optical signal can be improved.
  • the concentration is improved and the measurement is performed.
  • Time can be set to a practical level (about several minutes).
  • the particle diameter of the magnetic substance-containing dielectric particles is set to 100 nm or more, the size of the combined body can be easily set to 200 nm or more. Therefore, the concentration is improved and the measurement time is at a practical level (about several minutes). ).
  • the concentration rate is slow because concentration due to Brownian motion is greatly affected, and sufficient concentration for measurement is obtained. There was a problem that it took too long to be done.
  • the particle diameter is preferably 100 nm or less from the viewpoint of dispersibility, there is a problem that dispersibility is lowered when it exceeds 100 nm. That is, it has been extremely difficult to achieve both dispersion and concentration of magnetic particles (to obtain a force that can overcome the Brownian motion).
  • the present invention by using magnetic substance-containing dielectric particles having a functional group having a polarity on the surface in a liquid sample, while ensuring dispersibility in the liquid sample, Concentration can be improved by setting the maximum length to 200 nm or more and the particle size of the magnetic substance-containing dielectric particles to about 100 nm or more and 1 ⁇ m or less, and improve the practicality by achieving both dispersibility and concentration. Can do.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles P used in the detection method of the present invention will be described. As shown in FIG. 1, the magnetic substance-containing dielectric particles P include one or more magnetic particles M, and have a functional group that exhibits polarity in a liquid sample.
  • the shape of the magnetic particle M is not particularly limited, and may be spherical or rod-like.
  • the particle diameter is preferably 100 nm or less, and when a plurality of particles are encapsulated, a particle having a size of about 15 to 40 nm is preferable.
  • the material of the magnetic particles is not particularly limited, and is a magnetic body made of iron tetroxide, iron sesquioxide, various ferrites, metals such as iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, platinum (Pt), and alloys thereof. Is mentioned.
  • an iron-based magnetic material such as iron oxide and a platinum-based magnetic material such as an alloy containing platinum are preferable.
  • the dielectric material may be any material that is transparent to the excitation light described later, and SiO 2 and a light-transmitting resin are particularly preferable.
  • the light transmissive resin material include polymethyl methacrylate resin (PMMA) and cycloolefin resin.
  • PMMA polymethyl methacrylate resin
  • cycloolefin resin polymethyl methacrylate resin
  • transparent to excitation light means that the transmittance is 85% or more with respect to the excitation light peak wavelength.
  • a carboxyl group which is an acidic functional group is used so as to be negatively charged, but any other functional group may be used as long as it exhibits polarity in a liquid sample.
  • An amino group, a quaternary ammonium group or the like may be used as the functional group, and a sulfonic acid group or a phosphoric acid group may be used as the acidic functional group.
  • the shape of the magnetic substance-containing dielectric particle P is not particularly limited, and examples thereof include a spherical shape and a rod shape.
  • the particle diameter is preferably 100 nm or more, more preferably 150 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • the particle diameter refers to the maximum diameter of the particles.
  • the preferable particle diameter of the magnetic substance-containing dielectric particles P is derived from the following experiment. As shown in FIG. 2, in the experiment, after the magnetic substance-containing dielectric particles P were dispersed in the solution 5, a magnet 7 was placed below the bottom surface of the sample container 6 to perform magnetic separation (concentration) treatment. . The bottom surface thickness of the sample container 6 was about 1 mm, and the magnetic flux density at the bottom surface by the magnet 7 was 144.1 mT. Before and after the magnetic separation treatment, the supernatant of the sample solution 5 was sucked with a pipette 8 and the absorbance (transparency) at a wavelength of 500 nm was measured for the supernatant.
  • FIG. 3 shows the particle size dependence of the concentration ability (magnetic concentration index) of the magnetic substance-containing dielectric particles P.
  • the vertical axis represents the magnetic concentration index, and the larger the value, the higher the concentration capability (that is, the higher the transparency after the concentration treatment).
  • the concentration index gradually increases.
  • the particle size is about 150 nm and the concentration index is about 50%
  • the magnetic separation index is almost 100% in one minute of the magnetic separation treatment, and the concentration is quick. It has become clear that this has been done.
  • the particle diameter is not 200 nm or more, it is difficult to localize the particles at a practical level (assuming 1 minute here). In addition, if it is 200 nm or more, it is thought that it is a practical level enough to about 1 micrometer, However, When too large, there exists a problem that a dispersibility falls. From the viewpoint of dispersibility, the smaller the particle size, the better. Therefore, the optimum particle size is about 200 nm.
  • the same result was obtained even with magnetic particles not contained in the dielectric.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles having the respective particle sizes those having a volume content of the magnetic substance of about 30% or more are used.
  • the magnetic particles have a volume content of 100%. Similar results were obtained regardless of the volume content of the magnetic material. Concentration can be said to be sufficient even if the content of the magnetic material is about 30%, and at the same time, the particle size It is clear that size is an important factor.
  • the concentration ability is measured only with the magnetic substance-containing dielectric particles.
  • the concentration (maximum length) of the whole conjugate such as the sandwich conjugate or the competitive conjugate is 200 nm or more. It is thought that there should be.
  • the particle diameter of the magnetic substance-containing dielectric particles is smaller than 200 nm, a practical concentration level can be achieved, and the size as a conjugate with a labeled binding substance or the like according to the assay method or the like. It is sufficient that the particle diameter is such that is 200 nm or more.
  • the antibody constituting the sandwich conjugate is about 15 nm and the size of the antibody is about several nm ( ⁇ 10 nm).
  • the maximum length of the conjugate can be easily realized to be 200 nm or more by using fluorescent beads of about 100 nm as the label of the label-binding substance used at this time.
  • the maximum length is 200 nm even when a fluorescent dye ( ⁇ 1 nm) such as cy-3 or cy-5 is used as a label for the label-binding substance. It will be about.
  • FIG. 3B shows the results of measuring the absorbance of the dispersion containing the magnetic substance-containing dielectric particles having a particle diameter of 900 nm before and after the magnetic separation treatment. Absorbance was measured by the same method as described above. As shown in FIG. 3B, it can be seen that the magnetic substance-containing dielectric particles having a particle diameter of 900 nm are rapidly concentrated, and the supernatant becomes transparent after concentration. On the other hand, it was revealed that the absorbance before the magnetic separation treatment has wavelength dependency. Although this experiment was performed using an iron-based magnetic material, almost the same wavelength dependence is observed when a platinum-based magnetic material is used.
  • infrared light As excitation light because the absorbance becomes small at an infrared light wavelength of 700 nm or more. This is because, when the optical signal is detected, the supernatant liquid becomes transparent because it is concentrated.
  • the sensor unit since there are a large number of attracted magnetic substance-containing dielectrics, a wavelength with a small absorption by the magnetic substance is suitable.
  • FIGS. 4A to 4C show a case where the magnetic substance-containing dielectric particles having a particle diameter of 150 nm used in the present invention are dispersed in a solution (FIG. 4A), a magnetic concentration by applying a magnetic field (FIG. 4B), and then the application of a magnetic field is excluded. It is the dark-field microscope picture about the state of the particle
  • FIGS. 5A to 5C show magnetic particles having the same particle diameter as the magnetic substance-containing dielectric particles when dispersed in a solution (FIG. 5A), when magnetically concentrated by applying a magnetic field (FIG. 5B), and then magnetic fields.
  • FIGS. 5A to 5C show magnetic particles having the same particle diameter as the magnetic substance-containing dielectric particles when dispersed in a solution (FIG. 5A), when magnetically concentrated by applying a magnetic field (FIG. 5B), and then magnetic fields.
  • a dark-field micrograph of the state of particles at the time of re-dispersion excluding the application of (Fig. 5C) is shown.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles and the magnetic particles are surface-modified by a method that is suitable for each and widely known in known literatures. That is, the magnetic substance-containing dielectric particles are disclosed in paragraph [0003] of JP 2007-45882, Gang Xie et al., J. Appl. Polm. Sci.
  • the magnetic particles are partially aggregated even at the initial dispersion, while the magnetic substance-containing dielectric particles are uniformly dispersed with little aggregation at the initial dispersion. Yes.
  • both the magnetic substance-containing dielectric particles and the magnetic particles are concentrated and localized along the lines of magnetic force.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles are localized more linearly along the lines of magnetic force than the magnetic particles.
  • FIG. 5C it can be seen that when the magnetic field is released, the magnetic particles are stuck to each other.
  • FIG. 4C is generally bright and difficult to recognize as individual particles, it can be seen that the magnetic substance-containing dielectric particles start to redisperse and become cloudy without sticking to each other. .
  • the dispersibility of the magnetic particles is low because the dispersibility of the magnetic substance-containing dielectric particles is such that even when the functional groups are modified by a surface modification method suitable for each, the absolute number of functional groups modified on the surface of the magnetic particles is It is considered that the attractive force due to magnetization is larger than the repulsion between particles due to the polarity of the functional group because it is much less than that of the magnetic substance-containing dielectric particles.
  • the magnetic substance-containing dielectric particles are extremely dispersible compared to the magnetic particles, and even if they are once magnetized in a storage environment, they are dispersed without aggregation in the sample liquid. It is thought that it can be made.
  • FIG. 6A conceptually shows the relationship between the number of magnetic particles M and fluorescent dyes (or fluorescent dye-containing particles) O on the substrate 9 in the case of using antibodies provided with magnetic particles. .
  • an antibody is added at least 1000 times, generally about 100,000 times the number of samples to be detected at the lower limit.
  • the number of optical signal responsive labels is one for 100,000 magnetic particles, and the light scattered from the magnetic particles of excitation light is the optical signal from the label (for example, the amount of fluorescence from the fluorescent dye). Will be bigger than.
  • the sensor part is colored (brown for magnetite, black for platinum-based magnetic materials) to increase the refractive index, and evanescent light is generated when irradiated with totally reflected light. It may disappear.
  • the concentrating ability by a magnet to overcome the Brownian motion is as follows: magnetic particles having a magnetic substance with a volume content of 100% and magnetic substance-containing dielectric particles having a magnetic substance with a volume content of 30%. There is almost no difference and it depends greatly on the particle size. In order to avoid the problem of scattered light and coloring caused by the magnetic particles, it is preferable to reduce the volume content of the magnetic material in the magnetic material-containing dielectric particles.
  • FIG. 6B shows the relationship between the magnetic substance-containing dielectric particles P and the fluorescent dye (or fluorescent dye-containing particles) O on the substrate 9 when the magnetic substance-containing dielectric particles of the present invention are applied to an antibody. It is a conceptual representation of the relationship between numbers. Compared to the case of FIG. 6A, the amount of magnetic material is reduced, and thus it is considered that scattered light and coloring are suppressed.
  • the volume content of the magnetic substance in the magnetic substance-containing dielectric particles is preferably 50% or less, and more preferably 25% or less.
  • the present inventor has clarified a preferable volume content for suppressing the influence of scattered light and coloring by the following simulation.
  • FIG. 8 is an overall view showing a schematic configuration of the detection apparatus 1 for carrying out this detection method
  • FIGS. 9A and 9B are diagrams for explaining the procedure of the detection method.
  • the sample cell 10 used in this detection method is constituted by a dielectric plate 11 having a transparent bottom surface, which is a part of a wall having a sample contact surface that contacts the liquid sample S.
  • a metal film 12 is formed by vapor deposition or the like.
  • the region where the metal film 12 is provided constitutes the sensor unit 14.
  • the thickness of the metal film 12 is desirably determined as appropriate so that the surface plasmon is strongly excited by the material of the metal film 12 and the wavelength of the excitation light.
  • the thickness of the metal film is preferably 50 nm ⁇ 20 nm. More preferably, it is 47 nm ⁇ 10 nm.
  • the metal film is preferably composed mainly of at least one metal selected from the group consisting of Au, Ag, Cu, Al, Pt, Ni, Ti, and alloys thereof.
  • the detection apparatus 1 shown in FIG. 8 includes an excitation light irradiation optical system 20 for irradiating only a predetermined region of the sample cell 10 with excitation light, a photodetector 30 that is disposed above the sample cell 10 and detects fluorescence.
  • a magnetic field applying means 35 for applying a magnetic field is provided in a local region in the vicinity of the metal film 12 of the sample cell 10 in order to draw (concentrate) the sandwich combination formed in the sample cell 10.
  • the excitation light irradiation optical system 20 makes the laser beam L 0 incident from the back surface of the dielectric plate 11 of the sample cell 10 at an incident angle that totally reflects the laser beam L 0 at the interface between the dielectric plate 11 and the metal film 12. By doing so, evanescent light as excitation light is generated on the metal film 12.
  • the evanescent light oozing area E is about the wavelength from the interface of the laser light L 0 , and this oozing area corresponds to a predetermined area irradiated with excitation light.
  • the excitation light irradiation optical system 20 includes a light source 21 made of a semiconductor laser (LD) or the like that outputs laser light L 0 , and a prism 22 that is arranged so that one surface is in contact with the dielectric plate 11.
  • the prism 22 guides the laser light L 0 into the dielectric plate 11 so that the laser light L 0 is totally reflected at the interface between the dielectric plate 11 and the metal film 12.
  • the prism 22 and the dielectric plate 11 may be integrally formed or may be in contact with each other via a refractive index matching oil.
  • the light source 21 causes the laser light L 0 to enter the interface between the dielectric plate and the metal film through the prism 22 at a specific angle that is greater than the total reflection angle and causes surface plasmon resonance in the metal film.
  • the laser beam L 0 may be incident as a fan beam including the specific angle described above.
  • a light guide member may be further disposed between the light source 21 and the prism 22 as necessary.
  • the laser beam L 0 is incident on the interface as p-polarized light so as to induce surface plasmons.
  • a CCD, PD (photodiode), photomultiplier, c-MOS, or the like can be used as appropriate.
  • the magnetic field applying means 35 may be an electromagnet or a permanent magnet. If an electromagnet is used, when it is desired to attract magnetic particles, a current can be passed through the coil as necessary to generate a magnetic field. When a permanent magnet is used, the magnet is arranged at a position below the sensor unit 14 shown in FIG. 8 when attracting magnetic particles, and when a magnetic field is not desired, a magnetic field is not generated in the vicinity of the sensor unit. What is necessary is just to separate a magnet. Examples of permanent magnets include, but are not limited to, alnico magnets, ferrite magnets, MK steel, KS steel, samarium cobalt magnets, and neodymium magnets.
  • 9A and 9B are schematic diagrams showing before and after application of a magnetic field to the sample cell.
  • the first binding substance B 1 that specifically binds to the substance A to be detected is surface-modified with the above-described functional group that includes the magnetic particles M and exhibits polarity in the liquid sample.
  • the substance Bo is prepared.
  • the first binding substance B 1 and the second binding substance B 2 are a primary antibody and a secondary antibody that bind to different sites (epitopes) with respect to the antigen that is the substance A to be detected.
  • an amine coupling method using a surface-modified carboxyl group can be used.
  • Fluorescent dye molecules are used as the photoresponsive label O.
  • the photoresponsive label O is not limited to a fluorescent dye molecule as long as it generates an optical signal when irradiated with excitation light, but a fluorescent fine particle in which the fluorescent dye molecule is encapsulated with a transparent material.
  • those that generate fluorescence when irradiated with excitation light such as quantum dots
  • those that generate scattered light or localized plasmons when irradiated with excitation light such as metal fine particles may be used.
  • the liquid sample S to be tested, the magnetism-binding substance Bm, and the label-binding substance Bo are mixed and subjected to a binding reaction.
  • the timing of mixing the magnetism-binding substance Bm and the label-binding substance Bo into the liquid sample S is not particularly limited, and may be simultaneous or sequential.
  • antigen A is present in the liquid sample, a sandwich conjugate of magnetism-binding binder Bm (primary antibody B 1 ) -antigen A-labeled binding substance Bo (secondary antibody B 1 ) is formed.
  • a magnetic field is generated in the sample cell 10 holding the liquid sample S in which the magnetism-binding substance Bm and the label-binding substance Bo are mixed, and this is a local region in the sample cell 10.
  • the optical signal is detected in a state in which the magnetism-binding substance Bm is attracted to the surface of the metal film 12 and the magnetism-binding substance Bm is attracted to the surface of the metal film 12.
  • the magnetically imparted binding substance Bm When the magnetically imparted binding substance Bm is attracted to the local region, as a result, the antigen A and the label binding substance Bo constituting the sandwich conjugate with the magnetically imparted binding substance Bm are attracted to a predetermined region including the local region. Become.
  • the unreacted label-binding substance Bo is suspended in the liquid sample without being attracted to the predetermined region. That is, only the label binding substance Bo that has reacted with the antigen A is localized in a predetermined region of the mixed label binding substance.
  • the unreacted label-binding substance Bo floating in the liquid sample is preferably unwashed from the viewpoint of shortening the measurement time, but may be washed away depending on the application.
  • a signal from only the label bound to the antigen can be obtained. it can.
  • the excitation light irradiation optical system 20 causes the laser light L 0 to enter the interface between the dielectric plate 11 and the metal film 12 under total reflection conditions.
  • evanescent light oozes out on the surface of the metal film 12 and surface plasmons are generated.
  • the surface plasmon enhances the vanescent light, and the enhanced evanescent light excites the fluorescent dye molecule, which is the photoresponsive label O, to generate fluorescence Lf. That is, in this embodiment, evanescent light is excitation light that excites fluorescent dye molecules that are photoresponsive labels, and the evanescent light exudation region E including the surface of the metal film 12 corresponds to a predetermined region.
  • Fluorescence Lf is detected by the photodetector 30. Since the intensity of the fluorescent light Lf is enhanced by the effect of the electric field enhancement by surface plasmon resonance, a signal having a good S / N can be acquired.
  • the amount of the substance to be detected is obtained based on the detected amount of the fluorescence Lf.
  • the amount (concentration) of the substance to be detected can be obtained based on a calibration curve prepared beforehand for the detected amount and concentration of fluorescence.
  • obtaining the amount of the substance to be detected includes obtaining the presence or absence of the substance to be detected.
  • the detection method of the present embodiment performs the binding reaction in the liquid phase, and thus has a higher reaction rate than that in the case of performing the binding reaction including the binding to the solid phase. Further, since the dispersibility of the particles is good, an effect of further improving the reaction rate can be obtained.
  • the sandwich-bound body is effectively attracted to the sensor unit, so that the label-bound substance that has reacted with the antigen that is the target substance and the unreacted label-bound substance can be easily obtained. Can be separated.
  • the concentration rate at the time of applying a magnetic field can be brought to a practical level.
  • concentration rate concentration rate at the time of applying a magnetic field
  • the photoresponsive label is excited during optical signal detection, if the photoresponsive label is close to the metal material, metal quenching occurs due to energy transfer.
  • the metal quenching can be suppressed, the S / N improvement effect of the optical signal, the signal The effect of suppressing the amount variation is also obtained.
  • the metal film 12 is provided on the dielectric plate 11 to improve the S / N so as to produce an electric field enhancement effect by surface plasmon resonance.
  • the metal film 12 is not provided, Even in a simple evanescent fluorescence method, the detection method of the present invention can be applied, and the above-described effects can be obtained in the same manner when magnetic substance-containing dielectric particles are used.
  • Detection Method of Second Embodiment A detection method of the second embodiment and a detection device 2 for carrying out the detection method will be described with reference to FIG.
  • the same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
  • the detection apparatus 2 shown in FIG. 10 differs from the apparatus 1 of the first embodiment in the arrangement of the photodetectors 30 and differs in the detection method of the optical signal.
  • the photodetector 30 is newly induced such that the fluorescence is emitted from the surface opposite to the metal film forming surface of the dielectric plate 11 by newly inducing surface plasmon in the metal layer. It arrange
  • the sensing procedure by the detection method of this embodiment is the same as that of the first embodiment. Instead of directly detecting fluorescence, which is an optical signal from the photoresponsive label O, indirectly detecting the emitted light Lp generated by exciting the surface plasmon on the surface of the metal film 12 with the fluorescence.
  • the difference from the first embodiment is that an optical signal is detected.
  • the liquid sample S, the magnetically imparted binding substance Bm, and the label binding substance Bo are mixed to form a sandwich bound body by a binding reaction, and then the magnet 35 is attached to the dielectric plate 11.
  • the sandwich assembly is drawn to the sensor part 14.
  • the laser beam L 0 is irradiated by the excitation light irradiation optical system 20 in the state where the sandwich combined body is attracted to the sensor unit 14 as in the first embodiment.
  • the excitation light irradiation optical system 20 causes the laser light L 0 to enter the interface between the dielectric plate 11 and the metal film 12 under total reflection conditions.
  • evanescent light oozes out on the surface of the metal film 12 and surface plasmons are generated.
  • the surface plasmon enhances the vanescent light, and the enhanced evanescent light excites the fluorescent dye molecule, which is the photoresponsive label O, to generate fluorescence Lf.
  • the fluorescence Lf is enhanced by the surface plasmon. Due to the enhanced fluorescence Lf, a new surface plasmon is generated on the surface of the metal film 12, and the emitted light Lp resulting from the surface plasmon is emitted.
  • the emitted light Lp is emitted from the lower surface side of the dielectric plate 11 at a specific angle, and is detected by the photodetector 30 to detect the presence and / or amount of the detection target substance bound to the label binding substance. be able to.
  • the emitted light Lp is generated when the fluorescence is combined with surface plasmons having a specific wave number of the metal film.
  • the wave number to be combined is determined according to the wavelength of the fluorescence, and the emission angle of the emitted light is determined according to the wave number. .
  • surface plasmons excited by fluorescence become of a different wave number and surface plasmon caused by the laser beam L 0, the incident angle of the laser beam L 0
  • the emitted light Lp is emitted at an angle different from.
  • an assay using a magnetic substance-providing binding substance Bm composed of the magnetic substance-containing dielectric particles P and the first binding substance B 1 is performed, and the magnetic substance-containing dielectric particles P are applied to a magnetic field applying means such as a magnet.
  • a magnetic field applying means such as a magnet.
  • the distance that the fluorescence Lf passes through the solvent having a large light absorption can be reduced to about several tens of nm. Therefore, for example, light absorption in blood can be almost ignored, and measurement can be performed without pretreatment of centrifuging blood to remove colored components such as erythrocytes, or making it serum or plasma through a blood cell filter It becomes.
  • Detection Method of Third Embodiment A detection method of the third embodiment and a detection device 3 for carrying out the detection method will be described with reference to FIG.
  • the configuration of the detection device 3 of the third embodiment shown in FIG. 11 is the same as the configuration of the detection device 1 of the first embodiment, but the sample cell 10 ′ used in this embodiment is made of a metal film 12.
  • the sample cell 10 is different from the sample cell 10 used in the first and second embodiments in that the sensor unit 14 including the optical waveguide layer 13 is further provided on the surface.
  • the sensing procedure by the detection method of the present embodiment is the same as that of the first and second embodiments, and only the principle of electric field enhancement on the sensor unit 14 is different.
  • the laser light L 0 when the laser light L 0 is incident on the interface between the dielectric plate and the metal film by the excitation light irradiation optical system 20 under the total reflection condition, similarly to the case of the first and second embodiments.
  • Evanescent light is generated on the sensor unit 14 as excitation light.
  • the evanescent light excites the optical waveguide mode of the optical waveguide layer 13 to enhance the evanescent light that oozes out on the surface of the optical waveguide layer 13.
  • the present embodiment is different from the first embodiment in that evanescent light is enhanced by excitation of the optical waveguide mode.
  • the thickness of the optical waveguide layer 13 is not particularly limited, and is determined in consideration of the wavelength of the laser light L 0 , the incident angle, the refractive index of the optical waveguide layer 15 and the like so that the optical waveguide mode is induced. Just do it. For example, when a laser beam having a center wavelength of 780 nm is used as the laser beam L 0 and a layer made of a single silicon oxide film is used as the optical waveguide layer 15, a thickness of about 500 to 600 nm is preferable.
  • the optical waveguide layer 15 may have a laminated structure including an internal optical waveguide layer made of an optical waveguide material such as one or more dielectrics.
  • the laminated structure includes an internal optical waveguide layer and an optical waveguide layer in order from the metal layer side. It is preferable to have an alternately laminated structure of internal metal layers.
  • the fluorescence generated from the fluorescent dye molecules is also enhanced by the effect of the electric field enhancement by the optical waveguide mode.
  • the photodetector 30 By detecting the fluorescence Lf by the photodetector 30, it is possible to detect the presence and / or amount of the target substance bound to the label binding substance.
  • an assay using a magnetism-providing binding material Bm composed of the magnetic material-containing dielectric particles P and the first binding material B 1 is performed, and the magnetic material-containing dielectric particles P are applied to a magnetic field application means such as a magnet.
  • a magnetic field application means such as a magnet.
  • the sample cell 10 ′ having the optical waveguide layer 13 used in the detection method of the third embodiment is used, and the radiated light from below the sensor unit 14 is used as in the detection method of the second embodiment. It can also be configured to detect. In that case, fluorescence, which is an optical signal from a fluorescent dye molecule that is a photoresponsive label, newly excites the optical waveguide mode of the optical waveguide layer 13, and detects emitted light accompanying excitation of this optical waveguide mode. An optical signal is indirectly detected.
  • the detection method of the present invention detects an optical signal generated by excitation of a photoresponsive label in a predetermined region.
  • the optical signal (fluorescence in the above embodiment) generated from the label may be detected directly or indirectly.
  • the sensing method using an assay by the sandwich method which is a non-competitive method
  • the detection method of the present invention is not limited to the sandwich method, but a sensing method using an assay by the competitive method It can also be applied to.
  • a photoresponsive label is attached to the third binding substance (competitive antigen) that competes with the antigen A as the detection target substance and binds to the first binding substance (primary antibody).
  • a given label-binding substance may be used.
  • a fluorescent dye molecule is used as the photoresponsive label, but another preferred example is metal fine particles.
  • the fine metal particles used as the label may be fine particles having at least a surface covered with a metal film and having a particle size that produces localized plasmons on the surface by light irradiation.
  • the shape of the metal fine particles is not particularly limited, and examples thereof include a spherical shape and a rod shape. Since the metal fine particles scatter the evanescent light to generate scattered light, this may be detected as an optical signal.
  • the material of the metal fine particles or the metal film on the surface
  • gold (Au) silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), nickel (Ni), titanium
  • the main component is at least one metal selected from the group consisting of (Ti) and the like and alloys thereof
  • localized plasmons are generated on the surface of the metal fine particles by irradiation with excitation light.
  • the local plasmon may be used as an optical signal to excite a surface plasmon in the metal film or an optical waveguide mode in the optical waveguide layer, and detect radiation emitted by the excitation.
  • the particle diameter of the metal fine particles is preferably smaller than the wavelength of the excitation light because it effectively excites the localized plasmons.
  • the excitation light irradiation optical system that irradiates excitation light only to a predetermined region the optical system that generates evanescent light described in the above embodiment is common.
  • two-photon absorption excitation does not occur unless light of very high energy is irradiated.
  • an excitation light irradiation optical system configured to converge to a predetermined region that is localized and function as excitation light that causes two-photon absorption only in that region may be used.

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Abstract

【課題】磁性粒子による結合物の局在化を利用した検出方法の実用性を高める。 【解決手段】被検出物質(A)と特異的に結合する第1の結合物質(B1)に、磁性粒子(M)を内包すると共に液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾された磁性体含有誘電体粒子(P)が付与されてなる磁性付与結合物質(Bm)と、被検出物質(A)と特異的に結合する第2の結合物質(B2)に光応答性標識(O)が付与されてなる標識結合物質(Bo)とを、被検対象である液体試料(S)と混合して結合反応させ、試料セル(10)内に磁界を発生させて、局所領域に磁性付与結合物質(Bm)を引き寄せ、磁性付与結合物質(Bm)を引き寄せた状態で局所領域を含む所定領域(E)のみに励起光を照射し、所定領域に存在する光応答性標識(O)から光信号を生じさせて光信号を検出する。ここで、磁性体含有誘電体粒子(P)における磁性粒子(M)の体積含有率は50％以下とし、誘電体材料として励起光に対し透明な材料を用いる。

Description

検出方法、および該検出方法に用いられる磁性体含有誘電体粒子
　本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法および該検出方法に用いられる磁性体含有誘電体粒子に関するものである。
　バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、競合法などのアッセイ方法がよく知られている。
　また、蛍光標識からの蛍光検出の方法としては、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出する方法（エバネッセント蛍光法）が知られている。
　一方、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献２、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
　同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
　また、特許文献３および非特許文献３には、表面プラズモンによる増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
　このように、バイオ測定等においては、蛍光標識された被検出物質を検出するための種々の検出方法が提案されている。
　一方、上記のような基板に固定された１次抗体とサンドイッチ形成させて蛍光検出を行う場合、サンドイッチ結合体と未反応の二次抗体とを分離する必要があることから、一般的には、測定に際して未反応の二次抗体を洗浄する洗浄工程を要する。洗浄工程は手間であると共に測定に時間がかかる原因となっている。また、洗浄工程において被検出物質の一部は廃棄される上清とともに除去されることもあるため、被検出物質が微量成分の場合には、検出感度の低下をもたらす場合がある。また、被検出物質と一次抗体の反応は、一次抗体を結合した固相表面と被検出物質を含む溶液（液相）との反応であるために反応効率が悪く、高速化の妨げとなっている。
　これに対し特許文献４では、洗浄工程を要せず、被検出物質を定量することができ、しかも固相と液相に基づく反応の遅延問題を解決して、高速化を実現するための方法が提案されている。詳細には、１次抗体を磁性粒子、２次抗体を蛍光色素にて標識し、基板上に１次抗体を固定することなく、液相中にて、１次抗体－被検出物質－１次抗体結合体を形成させ、この結合体を磁石を用いて局在化させることにより未反応の２次抗体と分離し、洗浄工程を経ることなく、局在化させた結合体に対してエバネッセント光を照射して蛍光信号を測定する方法が開示されている。
　なお、この特許文献４においては、明細書段落[0030]に、液体試料中における分散性の点から、つまり粒子同士が自己凝集しないようにするという観点から、磁性粒子の大きさが１００ｎｍ（０．１μｍ）以下が好ましいと記載されている。
　また同様に、特許文献５においても、磁性粒子を用いたセンシング方法が提案されており、磁性粒子として、粒子径が１００ｎｍ以下の微粒子を用いる例が挙げられている。
　しかしながら本発明者の実験によれば１００ｎｍ以下の磁性粒子では、結合体の速やかな局在化（濃縮）、すなわち実用レベルの数分程度での濃縮を再現することができなかった。
　一方、特許文献６には、数十ｎｍの磁性粒子を用い、磁性粒子単体と、該磁性粒子が被検出物質とを含む複合体との磁石に対する応答性の違い、すなわち濃縮速度の違いにより、両者を分離して、複合体からの信号測定を行う方法が記されている。
特開２００５－７７３３８号公報 特開平１０－３０７１４１号公報 米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書 特開２００５－７７３３８号公報 特開平５－２６４５４７号公報 特開平１－２７２９７０号公報
W.Knoll他、Analytical Chemistry77(2005), p.2426-2431 2007年春季　応用物理学会　予稿集　Ｎo.３,P.1378 Thorsten Liebermann WolfgangKnoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" ColＬ0idsand Surfaces A 171(2000)115-130
　しかし、磁性粒子による局在化を用いた検出方法は、液相での反応が可能、かつ結合物質と未反応の二次抗体との分離のための洗浄工程を不要な点で、バイオ測定法として極めて魅力的でありながら、アイディアのまま実用化されてこなかった。
　この原因を鋭意研究した結果、本発明者らは、磁性粒子を用いた結合体の局在化を実用化するにあたり次のような問題点を見出した。
１）磁性粒子の保存環境等により、検出方法に使用する前に磁性粒子が磁化されて磁性粒子同士がくっついてしまい、使用時に分散性が低下してしまう恐れがある。
２）磁性粒子が金属材料を含む場合、磁性粒子が光応答性標識と近接すると、光信号を吸収してしまう現象、所謂金属消光が生じ、検出される光信号量を低下させてしまう場合があり、信号の定量性の低下（バラツキ）に繋がる。
３）磁性粒子が鉄酸化物を主材料とする場合、有機物等を表面修飾させるのが困難である。
　本発明は上記事情を鑑みて、上記問題を解決し、磁性粒子による結合体の局在化を利用した、実用化に耐えうる検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の検出方法は、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質に、磁性粒子を内包すると共に液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾された磁性体含有誘電体粒子が付与されてなる磁性付与結合物質と、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質および前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に光応答性標識が付与されてなる標識結合物質とを用意し、
　被検対象である液体試料、前記磁性付与結合物質および前記標識結合物質を混合して結合反応させ、
　前記磁性付与結合物質と前記標識結合物質とが混合された前記液体試料を保持する試料セル内に磁界を発生させて、該試料セル内の局所領域に、前記磁性付与結合物質を引き寄せ、
　該局所領域に該磁性付与結合物質を引き寄せた状態で、該局所領域を含む所定領域のみに励起光を照射して、該所定領域に存在する前記光応答性標識から光信号を生じさせ、
　該光信号を検出し、該光信号の検出量に基づいて前記液体試料中の前記被検出物質の量を求める検出方法であって、
　前記磁性体含有誘電体粒子の誘電材料が前記励起光に対して透明であり、かつ、前記磁性体含有誘電体粒子における前記磁性粒子の体積含有率が５０％以下であることを特徴とする。
　前記誘電材料としては、ＳｉＯ2あるいは、光透過性樹脂が好ましい。
　光透過性樹脂としては、光透過性に優れるポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、シクロアレフィン系樹脂が特に好ましい。
　前記体積含有率が２５％以下であることがより好ましい。
　前記磁性体含有誘電体粒子における前記官能基としては、塩基性官能基としてアミノ基、第四級アンモニウム基等を用いてもよいし、マイナス電荷に帯電するように酸性官能基、例えばカルボキシル基、スルホン酸基やリン酸基等を用いてもよい。
　ここで、サンドイッチ法によるアッセイの場合、前記磁性付与結合物質と、前記被検出物質と、前記第２の結合物質に光応答性標識が付与されてなる前記標識結合物質との結合体（所謂、サンドイッチ結合体）の最大長が２００ｎｍ以上であることが好ましい。また、競合法によるアッセイの場合、前記磁性付与結合物質と、前記第３の結合物質に光応答性標識が付与されてなる前記標識結合物質との結合体（所謂、競合結合体）の最大長が２００ｎｍ以上であるが好ましい。ここで、最大長とは、結合体の長径であり、基本的に該結合体を構成する複数要素をつなぎあわせた合計の長さとする。
　前記磁性体含有誘電体粒子の粒子径は、１００ｎｍ以上、好ましくは１５０ｎｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。
　誘電体粒子に内包される磁性粒子は、単数であっても複数であってもよく、磁石等により生じる磁界により前記局所領域に引き寄せられる磁性体であればよいが、特には、鉄系磁性材料または白金系磁性材料からなるものが好ましい。
　前記励起光として、赤外光を用いることが望ましい。
　前記光応答性標識としては、励起光の照射により光信号として蛍光を生じるものであってもよいし、励起光の照射により光信号として散乱光を生じるものであってもよい。さらには、励起光の照射により光信号として局在プラズモンを生じるものであってもよい。具体的には、蛍光色素分子、蛍光色素分子を誘電体材料により内包する蛍光微粒子、または金属微粒子等が挙げられる。金属微粒子は、励起光の照射を受けて散乱光を生じ、また、その表面に局在プラズモンを生じうる。この場合、散乱光を光信号として検出するようにしてもよいし、局在プラズモンを光信号として、該局在プラズモンに起因する放射光を検出するようにしてもよい。
　前記試料セルとして、前記液体試料と接触する試料接触面を有する壁の一部が透明な誘電体プレートにより構成されてなるものを用い、該試料接触面近傍領域を、前記局所領域とし、前記誘電体プレートからなる壁の外側から、該誘電体プレートの前記試料接触面に対して全反射条件で光を照射することにより、該試料接触面側に生じるエバネッセント光を、前記励起光として用いることができる。
　前記試料セルとして、前記誘電体プレートの前記試料接触面に金属膜が成膜されてなるものを用いてもよし、さらに該金属膜上に光導波層を備えてなるものを用いてもよい。
　前記光信号を検出する方法としては、該光信号を直接検出してもよいし、該光信号を間接的に検出してもよい。
　光信号を間接的に検出する方法としては、前記試料セルとして、金属膜が成膜された誘電体プレートを備えたものを用いた場合、前記励起光の照射により前記光応答性標識から生じた光信号が前記金属膜に表面プラズモンを励起し、該表面プラズモンの励起に起因して放射される放射光を検出することにより間接的に前記光信号を検出する方法が好適である。また、前記試料セルとして、金属膜上に光導波層を備えた誘電体プレートを備えたものを用いた場合、前記励起光の照射により前記光応答性標識から生じた光信号が前記光導波層の光導波モードを励起し、該光導波モードの励起に起因して放射される放射光を検出することにより間接的に前記光信号を検出する方法が好適である。
　光応答性標識が蛍光を生じるものである場合、蛍光が光信号として金属膜に表面プラズモンを、あるいは光導波層の光導波モードを励起する。一方、光応答性標識が金属微粒子である場合、励起光により金属微粒子の表面に生じる局在プラズモンが光信号として、金属膜に表面プラズモンを、あるいは光導波層の光導波モードを励起する。
　本発明の磁性体含有誘電体粒子は、磁性粒子を内包すると共に、液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾されており、誘電体材料が前記励起光に対して透明であり、かつ、前記磁性粒子の体積含有率が５０％以下であることを特徴とするものである。
　前記誘電体材料はＳｉＯ2あるいは、光透過性樹脂が好ましい。
　光透過性樹脂としては、光透過性に優れるポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、シクロアレフィン系樹脂であることが好ましい。
　前記磁性粒子の体積含有率は２５％以下であることが好ましい
　前記官能基がカルボキシル基であることが特に好ましい。粒子径は１００ｎｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。また、前記磁性粒子が、鉄系磁性体材料または白金系磁性体材料からなるものであることが好ましい。
　本発明の検出方法によれば、磁性粒子を誘電体内に内包すると共に、液体試料中で極性を生じる官能基が表面修飾された磁性体含有誘電体粒子を用いており、保存環境により、誘電体粒子中の磁性粒子が磁化されて、誘電体粒子同士がくっついたとしても、液体試料中では、表面の官能基の極性により反発して分散性を向上させることができる。また、磁性粒子が誘電体内に内包されているため、磁性粒子自体と光応答性標識とをある程度離間させることができるので磁性粒子に金属材料が用いられている際に生じる金属消光を抑制することができ、信号強度の低下および信号量のバラツキを抑制することができる。さらに、磁性粒子の表面に表面修飾させる場合と比較して、誘電体粒子への有機物等の表面修飾は容易に行うことができるため、官能基の表面修飾および第１の結合物質の付与を磁性体材料に関わらず容易に行うことができる。
　また、磁性体含有誘電体粒子の誘電体として励起光に対して透明なものを用いているので、誘電体粒子の誘電体材料部分においては励起光が吸収等により減衰されるのを抑制することができる。さらに、磁性体含有誘電体粒子における磁性体の含有率を５０％以下であるので、試料セル内の局所領域に、磁性付与結合物質を引き寄せた際に、磁性体による局所領域上における屈折率の変化や着色を抑制すると共に、磁性体粒子による散乱光を抑制することができ、光信号のＳ／Ｎを向上させることができる。
　特に、サンドイッチ法によるアッセイの場合、サンドイッチ結合体の最大長を２００ｎｍ以上とすれば、また、競合法によるアッセイの場合、競合結合体の最大長を２００ｎｍ以上とすれば、濃縮性を高め、測定時間を実用レベル（数分程度）にすることができる。
　さらに、磁性体含有誘電体粒子の粒子径を１００ｎｍ以上とすれば、結合体としての大きさを容易に２００ｎｍ以上とすることができるため、濃縮性を高め、測定時間を実用レベル（数分程度）にすることができる。
　[背景技術]の項に述べた通り、本発明者らの実験によれば、１００ｎｍ以下の微粒子を用いた場合、ブラウン運動による擾乱を大きく受けるために、濃縮速度が遅く測定に十分な濃縮が行われるまでに時間がかかりすぎるという問題があった。他方、特許文献１に、分散性の点から粒子径は１００ｎｍ以下が望ましい、と記載されている通り、１００ｎｍを超えると分散性が低下するという問題がある。すなわち、磁性粒子の分散と濃縮（ブラウン運動に勝つ力を得る）とを両立することが極めて困難であった。これに対し、本発明においては、液体試料中で極性を有する官能基を表面に備えた磁性体含有誘電体粒子を用いたことにより、液体試料中での分散性を担保しつつ、結合体の最大長を２００ｎｍ以上とし、磁性体含有誘電体粒子の粒子径を１００ｎｍ以上、１μｍ以下程度とすることにより濃縮性を高めることができ、分散性と濃縮性を両立させて実用性を向上することができる。
磁性体含有誘電体粒子の構成を示す模式図 磁気濃縮指数の測定方法を説明するための図 磁気濃縮指数の粒子径依存性を示す図 磁性体含有微粒子の吸光スペクトルを示す図 磁性体含有誘電体粒子の磁気濃縮前の分散状態を示す暗視野顕微鏡写真 磁性体含有誘電体粒子の磁気濃縮時の状態を示す暗視野顕微鏡写真 磁性体含有誘電体粒子の磁気濃縮後の再分散状態を示す暗視野顕微鏡写真 磁性粒子の磁気濃縮前の分散状態を示す暗視野顕微鏡写真（比較例） 磁性粒子の磁気濃縮時の状態を示す暗視野顕微鏡写真（比較例） 磁性粒子の磁気濃縮後の再分散状態を示す暗視野顕微鏡写真（比較例） 濃縮時のセンサ部における磁性粒子と蛍光色素の数を示す概念図（比較例） 濃縮時のセンサ部における磁性体含有微粒子と蛍光色素の数を示す概念図 局所領域上の屈折率と全反射との関係についてのシミュレーション結果を示す図 本発明の第１実施形態の検出方法を実施するための検出装置を示す概略構成図 本発明の第１実施形態による検出方法の手順を示す図（磁界印加前） 本発明の第１実施形態による検出方法の手順を示す図（磁界印加後） 本発明の第２実施形態の検出方法を実施するための検出装置を示す概略構成図 本発明の第３実施形態の検出方法を実施するための検出装置を示す概略構成図
　以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
　「磁性体含有誘電体粒子」
　まず、本発明の検出方法で用いられる磁性体含有誘電体粒子Ｐについて説明する。図１に示すように、磁性体含有誘電体粒子Ｐは、１または複数の磁性粒子Ｍを内包すると共に、液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾されている。
　磁性粒子Ｍの形状は特に制限なく、球状、ロッド状等が挙げられるが、粒子径は１００ｎｍ以下であるものが好ましく、複数内包させる場合には１５～４０ｎｍ程度の大きさのものが好適である。磁性粒子の材質は、特に制限されず、四三酸化鉄、三二酸化鉄、各種フェライト、または、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム、白金(Ｐｔ)などの金属およびこれらの合金からなる磁性体が挙げられる。特には、酸化鉄などの鉄系磁性体材料、白金を含む合金などの白金系磁性体材料が好ましい。
　誘電体材料としては、後述する励起光に対して透明な材料であればよく、ＳｉＯ2や光透過性樹脂が特に好ましい。光透過性樹脂材料としてはポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィン系樹脂などが挙げられる。ここで、励起光に対し透明とは、励起光ピーク波長に対し、透過率が８５％以上であることをいうこととする。
　官能基としては、図１に示すように、マイナス電荷に帯電するように酸性官能基であるカルボキシル基を用いるものとしたが、その他、液体試料中で極性を示すものであればよく、塩基性官能基としてアミノ基、第四級アンモニウム基等を用いてもよく、酸性官能基として、スルホン酸基やリン酸基等を用いても良い。
　磁性体含有誘電体粒子Ｐの形状は特に制限なく、球状、ロッド状などが挙げられる。また粒子径は、１００ｎｍ以上、さらには１５０ｎｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。なお、ここで粒子径とは粒子の最大径をいうものとする。
　磁性体含有誘電体粒子Ｐの好ましい粒子径は以下の実験から導き出したものである。
　図２に示すように、実験では、溶液５中に、磁性体含有誘電体粒子Ｐを分散させた後、サンプル容器６の底面下方に磁石７を配置して磁気分離（濃縮）処理を行った。サンプル容器６の底面厚さは１ｍｍ程度であり、磁石７による底面での磁束密度は１４４．１ｍＴであった。その磁気分離処理前後において、サンプル溶液５の上澄み液をピペット８で吸引し、その上澄み液について、波長５００ｎｍでの吸光度（透明度）を測定した。
　磁気分離処理前後の吸光度としては、磁石を配置してから１分後のサンプル溶液についての吸光度Ａと、磁石を配置する前のサンプル溶液についての吸光度Ｂとを測定した。測定値から磁気濃縮指数＝１００×（Ｂ－Ａ）／Ｂ（％）を求めた。
　磁性体含有誘電体粒子Ｐの濃縮能力（磁気濃縮指数）の粒子径依存性を図３に示す。図３において、縦軸は磁気濃縮指数であり、数値が大きいほど濃縮能力が高い（すなわち濃縮処理後の透明度が高い）ことを示している。
　なお、同様に誘電体に含有されていない磁性体粒子についても同様の測定を行った。その結果を図３に併せて示している。
　図３に示すように、粒子径１００ｎｍ以下の場合、磁気分離処理１分では誘電体粒子Ｐはほとんど濃縮（局在化）されず、一方、粒子径１００ｎｍを超えると徐々に濃縮指数が大きくなり、粒子径が１５０ｎｍ程度で濃縮指数が約５０％、粒子径２００ｎｍで８０％、３００ｎｍ以上の場合、磁気分離処理１分でほぼ透明度磁気濃縮指数がほぼ１００％となっており、濃縮が速やかになされていることが明らかになった。
　すなわち、上記実験から粒子径は２００ｎｍ以上でないと、実用的なレベル（ここでは１分と想定した。）での粒子の局在化が困難であると考えられる。なお、２００ｎｍ以上であれば、１μｍ程度までは十分に実用レベルと考えられるが、大きくなりすぎると、分散性が低下するという問題がある。分散性の観点からは、粒子径は小さいほどよい。したがって、粒子径は２００ｎｍ程度が最適である。
　上記濃縮能力については、誘電体に含有されていない磁性体粒子であっても同様の結果が得られた。
　本実験においては、各粒子径の磁性体含有誘電体粒子としては、いずれも磁性体の体積含有率が３０数％程度のものを用いている。また、磁性体粒子は体積含有率が１００％に相当する。磁性体の体積含有率に関わらず同様の結果が得られており、濃縮においては、磁性体の含有率が３０数％程度であっても十分に濃縮可能であるといえると同時に、粒子径のサイズが重要なファクターであることが明らかである。
　但し、上記測定は磁性体含有誘電体粒子のみで濃縮能力を測定している。現実には、抗原抗体反応によるサンドイッチ結合体あるいは競合結合体を形成した状態で、濃縮させることから、このサンドイッチ結合体あるいは競合結合体などの結合体全体でのサイズ（最大長）が２００ｎｍ以上であればよいと考えられる。すなわち、磁性体含有誘電体粒子の粒子径は、２００ｎｍより小さいものであっても、実用レベルの濃縮速度を達成可能であり、アッセイ法等に応じて標識結合物質等との結合体としてのサイズが２００ｎｍ以上となる粒子径であればよい。
　被検出物質がＴ４抗体である場合、サンドイッチ結合体を構成する抗体は１５ｎｍ程度、抗体のサイズは数ｎｍ(～１０ｎｍ)程度となる。例えば、磁性体含有誘電体粒子が１００ｎｍの場合、このときに用いる標識結合物質の標識として、１００ｎｍ程度の蛍光ビーズを用いることで、結合体の最大長が、２００ｎｍ以上が容易に実現できる。また、好ましくは磁性体含有誘電体粒子が１６０ｎｍ程度であれば、標識結合物質の標識として、ｃｙ－３、ｃｙ－５のような、蛍光色素（～１ｎｍ）を用いても、最大長が２００ｎｍ程度となる。
　また、粒子径９００ｎｍの磁性体含有誘電体粒子について、磁気分離処理前後の分散液における吸光度を測定した結果を図３Ｂに示す。吸光度の測定は上記と同様の方法で行った。
　図３Ｂに示すように、粒子径９００ｎｍの磁性体含有誘電体粒子は速やかに濃縮され、上澄みは濃縮後透明化することが分かる。一方、磁気分離処理前の吸光度には波長依存性があることが明らかになった。なお、本実験は、鉄系の磁性体材料を用いて行ったが、白金系磁性材料を用いた場合にも、ほぼ同様の波長依存性が観測される。
　波長７００ｎｍ以上の赤外光波長において吸光度が小さくなることから、本発明の検出方法においては、励起光として赤外光を用いることが好ましい。光信号検出時には、濃縮されるため上澄み液は透明化するが、センサ部においては、引き寄せられた磁性体含有誘電体が多数存在するため、磁性体による吸収度の小さい波長が適するからである。
　磁性体含有誘電体粒子の分散性について説明する。
　図４Ａ～４Ｃは、本発明に用いられる粒子径１５０ｎｍの磁性体含有誘電体粒子の溶液中への分散時（図４Ａ）、磁界印加による磁気濃縮時（図４Ｂ）、その後磁界の印加を排除した再分散時（図４Ｃ）の粒子の状態についての暗視野顕微鏡写真である。
　比較のため、図５Ａ～図５Ｃに、磁性体含有誘電体粒子と同一粒子径の磁性粒子について、溶液中への分散時（図５Ａ）、磁界印加による磁気濃縮時（図５Ｂ）、その後磁界の印加を排除した再分散時（図５Ｃ）の粒子の状態についての暗視野顕微鏡写真を示す。なお、磁性体含有誘電体粒子と磁性粒子とは、それぞれに好適かつ公知の文献等にて広く知られた方法で、表面修飾されている。すなわち、磁性体含有誘電体粒子は特開２００７－４５９８２号公報の段落[0003]、Gang Xie　他、J. Appl. Polm. Sci. 87, (2003) pp.1733-1738、日方幹雄、エアロゾル研究　22（2007）,pp.282-288のpp.283「3.1　粒子の合成」の章に記されている「スチレンのような荷電を有しないモノマーを、アクリル酸のようなカルボキシル基を有するモノマーと共重合することでカルボキシル基を有する磁性ポリマー粒子が合成する」方法を用い、磁性粒子の場合は、「成田麻子他,高分子論文集　65（2008）, pp.321-333 pp.325 」の「3.1分散性の制御」の章、およびその参照文献59)である「D. Maity, D.C. Agrawal ,Jxournal of Magnetism and Magnetic Materials 308 (2007) 46-55」に記載された方法を用いて、それぞれ官能基であるカルボキシル基を表面修飾させている。
　図４Ａ～４Ｃおよび図５Ａ～５Ｃにおいて、明るく（白く）表示されているのが粒子である。
　図５Ａから、磁性粒子は、最初の分散時においても部分的な凝集が生じており、一方、磁性体含有誘電体粒子は、最初の分散時は、ほとんど凝集することなく、均一に分散されている。
　図４Ｂおよび図５Ｂから、磁界が印加されると、磁性体含有誘電体粒子も磁性粒子も磁力線に沿って濃縮され局在化していることがわかる。なお、磁性体含有誘電体粒子は、磁性粒子と比較して磁力線に沿ってより線状に局在化している。
　図５Ｃから、磁界が解除されたとき、磁性粒子は互いにくっつき合った状態となっているのが認められる。一方、図４Ｃは全体的に明るく１粒ずつの粒子としては認識しがたいが、磁性体含有誘電体粒子は、互いにくっつき合うことなく、再分散が開始され雲状になっていることがわかる。
　磁性粒子の分散性が磁性体含有誘電体粒子の分散性が低いのは、それぞれに好適な表面修飾方で官能基を修飾した場合でも、磁性粒子に表面に修飾される官能基の絶対数が磁性体含有誘電体粒子のそれに較べ格段に少ないために、官能基の極性による粒子同士の反発よりも磁化による引力が大きいことに起因すると考えられる。
　このように、磁性体含有誘電体粒子は、磁性粒子と比較して非常に分散性が高く、保存環境等により一旦磁化される場合があったとしても、試料液中においては凝集することなく分散させることができると考えられる。
　以下に説明する本発明の検出方法においては、上述の磁性体含有誘電体粒子を用いていることから、表面修飾が容易であり、高い分散性を得ることができる。また、光信号検出の際に光応答性標識が励起された際、光応答性標識が金属材料に近接している場合、エネルギー移動に伴う金属消光が生じるが、磁性体含有誘電体粒子においては、磁性粒子が誘電体に内包されているため、光応答性標識からある程度の距離をおくことができ、金属消光を抑制することができる。
　さらに、抗原抗体反応等の免疫測定においては、抗原（被検体）に対し、反応を充分に行われるために、抗体（磁性付与結合物質）を過剰に添加するのが一般的である。図６Ａは、基板９上における、抗体に磁性粒子を付与したものを用いた場合の磁性粒子Ｍと蛍光色素（あるいは蛍光色素含有粒子）Ｏとの数の関係を概念的に示したものである。単純に、ダイナミックレンジを３桁確保しようとするとき、その下限で検出されるべき検体数に対して、少なくとも１０００倍以上、一般には１０万倍程度の抗体を添加する。このとき、１０万個の磁性粒子に対し光信号応答性標識の数は１個であり、励起光の磁性粒子による散乱光の方が標識からの光信号（例えば、蛍光色素からの蛍光量）よりも大きくなってしまう。また、磁性粒子が密に並ぶことによって、センサ部において着色（マグネタイトの場合茶色、白金系磁性体の場合黒色）して屈折率が上昇し、全反射光を照射した場合にエバネッセント光が発生しなくなる場合がある。
　図３に示した通り、ブラウン運動に勝つための磁石による濃縮能力は、磁性体の体積含有率１００％の磁性粒子と磁性体の体積含有率が３０数％の磁性体含有誘電体粒子とでほとんど差がなく、その粒径に大きく依存している。上述の磁性粒子による散乱光や着色の問題を回避するためには、磁性体含有誘電体粒子における磁性体の体積含有率を小さくすることが好ましい。
　図６Ｂは、本発明の磁性体含有誘電体粒子を抗体に付与したものを用いた場合の、基板９上における、磁性体含有誘電体粒子Ｐと蛍光色素（あるいは蛍光色素含有粒子）Ｏとの数の関係を概念的に示したものである。図６Ａの場合と比較すると磁性体の量が少なくなるため、散乱光や着色が抑制されると考えられる。
　特には、磁性体含有誘電体粒子における磁性体の体積含有率は５０％以下、さらには、２５％以下であることが好ましい。
　本発明者は、以下のシミュレーションによって、散乱光や着色の影響を抑制するための、好ましい体積含有率を明らかにした。
　基板上に磁性体含有誘電体粒子が密に配置（具体的には、φ２００ｎｍの粒子を最密充填に近い、７０％（基板表面に対する面積比）で配置）された状態で励起光の全反射角を求めるシミュレーションを行った。結果を図７に示す。
　シミュレーションは、基板として比較的高屈折率な材料であるＳＦ２（ｎ＝１．６５）を用いた場合、および一般的な材料であるＢＫ７（ｎ＝１．５２）を用いた場合について行った。
　また、磁性体として四三酸化鉄（ｎ＝２．４２）を用い、誘電体材料としてＳｉＯ２（ｎ＝１．４４）を用いるものとし、励起光として波長６３３ｎｍのレーザ光を用いるものとした。
　図７に示すように、基板としてＳＦ２を用いたとき、磁性体の体積含有率が５０％を超えると、いかなる入射角に対しても全反射をしなくなることが明らかになった。さらに、基板としてＢＫ７を用いたとき、磁性体の体積含有率が２５％を超えると、いかなる入射角に対しても全反射しなくなることが明らかになった。
　上述の結果から、屈折率が比較的高い材料を基板として用いれば、体積含有率が５０％程度までは許容できることがわかった。また、実用的には、一般的な材料を基板として用いることが好ましいことから、体積含有率２５％以下が望ましいと考えられる。励起光波長、基板材料、磁性体材料は、上記に限るものではないが、実用上想定される材料については、各材料の組み合わせ等を検討すると、５０％以下、好ましくは２５％以下の体積含有率の磁性体を含有する磁性体含有誘電体粒子を用いればよいと考えられる。
　「第１実施形態の検出方法」
　本発明の第１の実施形態にかかる検出方法は、被検出物質である抗原が検査対象である生体試料（尿、血液、鼻水）などに含まれているか否か、および／またはその量（濃度）を検出するバイオセンシング方法である。図８は、本検出方法を実施するための検出装置１の概略構成を示す全体図であり、図９Ａ、図９Ｂは、検出方法の手順を説明するための図である。
　本検出方法において用いられる試料セル１０は、液体試料Ｓと接触する試料接触面を有する壁の一部である、底面が透明な誘電体プレート１１により構成されてなり、その誘電体プレート１１の試料接触面側には、金属膜１２が蒸着等により成膜形成されている。なお、この金属膜１２が設けられた領域はセンサ部１４を構成する。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
　図８に示す検出装置１は、試料セル１０の所定領域のみに励起光を照射するための励起光照射光学系２０と、試料セル１０の上方に配置され、蛍光を検出する光検出器３０と、試料セル１０の金属膜１２近傍の局所領域に、試料セル１０内で形成されたサンドイッチ結合体を、引き寄せる（濃縮する）ために、磁界を印加する磁界印加手段３５とを備えている。
　励起光照射光学系２０は、試料セル１０の誘電体プレート１１の裏面から、レーザ光Ｌ0を誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射する入射角度で、レーザ光Ｌ0を入射させることにより、金属膜１２上に励起光としてのエバネッセント光を生じさせるものである。エバネッセント光の滲み出し領域Ｅはレーザ光Ｌ0の界面から波長程度であり、この滲み出し領域が、励起光が照射される所定領域に相当する。励起光照射光学系２０は、レーザ光Ｌ0を出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面でレーザ光Ｌ0が全反射するように誘電体プレート１１内にレーザ光Ｌ0を導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、一体的に構成されていてもよいし、屈折率マッチングオイルを介して接触されていてもよい。光源２１は、レーザ光Ｌ0が、プリズム２２を介して、誘電体プレートと金属膜との界面に、全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴を生じさせる特定の角度で入射するように配置構成されている。レーザ光Ｌ0は、前述の特定の角度を含むファンビームとして入射させるようにしてもよい。光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材をさらに配置してもよい。なお、レーザ光Ｌ0は、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射される。
　光検出器３０としては、具体的には、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ－ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
　磁界印加手段３５は、電磁石であってもよいし、永久磁石であってもよい。電磁石を用いれば、磁性粒子を引き寄せたいときに必要に応じてコイルに電流を流し磁界を生じさせることができる。永久磁石を用いる場合には、磁性粒子を引き寄せたいときに、図８に示すセンサ部１４下方の位置に磁石を配置し、磁界を印加したくないときには、センサ部近傍に磁界が生じない程度に磁石を離間させればよい。永久磁石としては、アルニコ磁石、フェライト磁石、ＭＫ鋼、ＫＳ鋼、サマリウムコバルト磁石、ネオジム磁石などが挙げられるが、これらに限るものではない。
　本実施形態の検出方法によるバイオセンシング方法の手順を説明する。図９Ａおよび図９Ｂは、試料セルへの磁界印加前後を示す模式図である。
　本検出方法においては、まず、被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ1に、上述した、磁性粒子Ｍを内包すると共に液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾された磁性体含有誘電体粒子Ｐが付与されてなる磁性付与結合物質Ｂｍと、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ2に光応答性標識Ｏが付与されてなる標識結合物質Ｂｏとを用意する。ここで、第１の結合物質Ｂ1および第２の結合物質Ｂ2は、被検出物質Ａである抗原に対し、互いに別の部位（エピトープ）に結合する１次抗体および２次抗体である。抗体を磁性体含有誘電体粒子Ｐに固定するには、表面修飾されているカルボキシル基を利用したアミンカップリング法を用いることができる。
　光応答性標識Ｏとしては、蛍光色素分子を用いる。なお、本発明において、光応答性標識Ｏは、励起光の照射を受けて光信号を生じるものであれば蛍光色素分子に限るものではなく、蛍光色素分子が透明材料で内包されてなる蛍光微粒子、量子ドットなど、励起光の照射により蛍光を生じるものの他、金属微粒子のような励起光の照射により散乱光や局在プラズモンを生じるものを用いてもよい。
　次に、図９Ａに示すように、被検対象である液体試料Ｓ、磁性付与結合物質Ｂｍおよび標識結合物質Ｂｏを混合して結合反応させる。なお、液体試料Ｓへの磁性付与結合物質Ｂｍ、標識結合物質Ｂｏの混合のタイミングは特に制限されず、同時であってもよいし、逐次であってもよい。液体試料中に抗原Ａが存在する場合、磁性付与結合物質Ｂｍ（１次抗体Ｂ1）－抗原Ａ－標識結合物質Ｂｏ（２次抗体Ｂ1）のサンドイッチ結合体が形成される。
　その後、図９Ｂに示すように、磁性付与結合物質Ｂｍと標識結合物質Ｂｏとが混合された液体試料Ｓを保持する試料セル１０内に磁界を発生させて、試料セル１０内の局所領域である金属膜１２表面に、磁性付与結合物質Ｂｍを引き寄せ、金属膜１２表面に磁性付与結合物質Ｂｍを引き寄せた状態で、光信号の検出を行う。
　磁性付与結合物質Ｂｍを局所領域に引き寄せると、結果としてその磁性付与結合物質Ｂｍとサンドイッチ結合体を構成している抗原Ａおよび標識結合物質Ｂｏがその局所領域を含む所定領域内に引き寄せられることとなる。一方、未反応の標識結合物質Ｂｏは、所定領域へ引き寄せられることなく、液体試料中を浮遊している。すなわち、混合された標識結合物質のうち、所定領域には抗原Ａと反応した標識結合物質Ｂｏのみが局在化されている。なお、液体試料中を浮遊している未反応の標識結合物質Ｂｏは、測定時間短縮の観点から未洗浄の方が好ましいが、用途によっては洗い流しても構わない。
　そこで、局所領域を含む所定領域のみに励起光を照射して、所定領域に存在する光応答性標識Ｏから光信号を生じさせれば、抗原と結合した標識のみからの信号を取得することができる。
　励起光照射光学系２０により、レーザ光Ｌ0を、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に全反射条件で入射させる。レーザ光Ｌ0が界面で全反射する際、金属膜１２表面にはエバネッセント光が滲み出すと共に、表面プラズモンが生じる。表面プラズモンによりバネッセント光が増強され、この増強されたエバネッセント光により、光応答性標識Ｏである蛍光色素分子が励起されて蛍光Ｌｆが生じる。すなわち、本実施形態において、エバネッセント光が光応答性標識である蛍光色素分子を励起する励起光であり、金属膜１２表面を含むエバネッセント光の滲み出し領域Ｅが所定領域に相当する。
　光検出器３０により蛍光Ｌｆを検出する。蛍光Ｌｆも表面プラズモン共鳴による電場増強の効果を受け強度が強められるため、Ｓ／Ｎのよい信号を取得することができる。
　この蛍光Ｌｆの検出量に基づいて、被検出物質の量を求める。被検出物質の量（濃度）は、予め用意されている、蛍光の検出量と濃度との検量線に基づいて求めることができる。なお、ここでの被検出物質の量を求めることには、被検出物質の存在の有無を求めることも含む。
　本実施形態の検出方法は、液相において結合反応を行うため、固相との結合を含む結合反応を行う場合と比較して反応速度が速い。また、粒子の分散性がよいので、反応速度のさらなる向上効果が得られる。既述の磁性体含有誘電体粒子を用いて、サンドイッチ結合体をセンサ部へ効果的に引き寄せることにより、被検出物質である抗原と反応した標識結合物質と、未反応の標識結合物質とを容易に分離することができる。１００ｎｍ以上の粒子径の磁性体含有誘電体粒子を用い、サンドイッチ結合体を２００ｎｍ以上とすれば、磁界印加時の濃縮速度（局所領域への局在化の速度）を実用レベルとすることができる。さらに、光信号検出の際に光応答性標識が励起された際、光応答性標識が金属材料に近接している場合、エネルギー移動に伴う金属消光が生じるが、本発明の磁性体含有誘電体粒子においては、磁性粒子が誘電体に内包されているため、光応答性標識からある程度の距離をおくことができ、金属消光を抑制することができ、光信号のＳ／Ｎの向上効果、信号量のバラツキ抑制効果も得られる。
　なお、本実施形態においては、誘電体プレート１１上に金属膜１２を備え、表面プラズモン共鳴による電場増強の効果が生じるようにしてＳ／Ｎの向上を図っているが、金属膜１２がなく、単なるエバネッセント蛍光法においても、本発明の検出方法は適用でき、磁性体含有誘電体粒子を用いた場合の上記効果を同様に得ることができる。
　「第２実施形態の検出方法」
　第２の実施形態の検出方法およびその検出方法を実施するための検出装置２を図１０を参照して説明する。以下の図面において、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付し、詳細な説明を省略する。図１０に示す検出装置２は、光検出器３０の配置が、第１の実施形態の装置１と異なり、光信号の検出方法が異なる。
　本実施形態においては、光検出器３０が、蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって誘電体プレート１１の金属膜形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起された表面プラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように、試料セル１０のセンサ部１４下方に配置されている。
　本実施形態の検出方法によるセンシングの手順は第１の実施形態と同様である。光応答性標識Ｏからの光信号である蛍光を直接検出するのではなく、該蛍光が金属膜１２表面に新たに表面プラズモンを励起することにより生じる放射光Ｌｐを検出することにより、間接的に光信号を検出する点で第１の実施形態と異なる。
　本実施形態の方法では、試料セル１０において、液体試料Ｓと磁性付与結合物質Ｂｍと標識結合物質Ｂｏを混合し、結合反応によりサンドイッチ結合体を形成させた後、磁石３５を誘電体プレート１１の下方に配置することにより、サンドイッチ結合体をセンサ部１４に引き寄せる。サンドイッチ結合体をセンサ部１４に引き寄せた状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０によりレーザ光Ｌ0を照射する。
　励起光照射光学系２０により、レーザ光Ｌ0を、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に全反射条件で入射させる。レーザ光Ｌ0が界面で全反射する際、金属膜１２表面にはエバネッセント光が滲み出すと共に、表面プラズモンが生じる。表面プラズモンによりバネッセント光が増強され、この増強されたエバネッセント光により、光応答性標識Ｏである蛍光色素分子が励起されて蛍光Ｌｆが生じる。この蛍光Ｌｆは表面プラズモンにより増強されており、この増強された蛍光Ｌｆにより、金属膜１２の表面に新たな表面プラズモンが生じ、該表面プラズモンに起因する放射光Ｌｐが放射される。この放射光Ｌｐを誘電体プレート１１の下面側から特定の角度で射出され、これを光検出器３０により検出することにより、標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
　放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常レーザ光Ｌ0の波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、レーザ光Ｌ0により生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、レーザ光Ｌ0の入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
　本実施形態においても、磁性体含有誘電体粒子Ｐと第１の結合物質Ｂ１とからなる磁性付与結合物質Ｂｍを用いたアッセイを行い、磁性体含有誘電体粒子Ｐを磁石等の磁界印加手段によりセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を生じさせ、この増強された蛍光に起因する放射光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
　さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
　「第３実施形態の検出方法」
　第３の実施形態の検出方法およびその検出方法を実施するための検出装置３を図１１を参照して説明する。図１１に示す第３の実施形態の検出装置３の構成は、第１の実施形態の検出装置１の構成と同じであるが、本実施形態で用いられる試料セル１０’は、金属膜１２の表面にさらに光導波層１３を備えたセンサ部１４を有している点で、第１および第２の実施形態で用いられている試料セル１０と異なる。
　本実施形態の検出方法によるセンシングの手順は第１および第２の実施形態と同様であり、センサ部１４上における電場増強の原理が異なるのみである。
　本実施形態においては、励起光照射光学系２０により、誘電体プレートと金属膜との界面に全反射条件でレーザ光Ｌ0を入射した際、第１および第２の実施形態の場合と同様にセンサ部１４上に励起光としてエバネッセント光を生じる。また、このエバネッセント光が光導波層１３の光導波モードを励起することにより、光導波層１３表面に滲み出してしるエバネッセント光が増強される。本実施形態においては、エバネッセント光が、この光導波モードの励起により増強される点で第１の実施形態と異なる。
　光導波層１３の層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、レーザ光Ｌ0の波長、入射角度および光導波層１５の屈折率等を考慮して定めればよい。例えば、レーザ光Ｌ0として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１５として１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００～６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１５は、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
　なお、光導波モードによる電場増強の効果により、蛍光色素分子から生じる蛍光も増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
　本実施形態においても、磁性体含有誘電体粒子Ｐと第１の結合物質Ｂ1とからなる磁性付与結合物質Ｂｍを用いたアッセイを行い、磁性体含有誘電体粒子Ｐを磁石等の磁界印加手段によりセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
　なお、第３の実施形態の検出方法で用いた、光導波層１３を備えた試料セル１０’を用い、第２の実施形態の検出方法のように、センサ部１４の下方からの放射光を検出するよう構成することもできる。その場合、光応答性標識である蛍光色素分子からの光信号である蛍光が、光導波層１３の光導波モードを新たに励起し、この光導波モードの励起に伴う放射光を検出することにより光信号を間接的に検出することとなる。
　各実施形態で例示したように、本発明の検出方法は、所定領域内の光応答性標識が励起されることによって生じる光信号を検出するものであるが、光信号の検出は、光応答性標識から生じる光信号（上記実施形態では蛍光）を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。
　上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイを用いたセンシング方法を例として説明したが、本発明の検出方法はサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイを用いたセンシング方法にも適用することができる。競合法によるアッセイの場合には、被検出物質である抗原Ａと競合して、第１の結合物質（１次抗体）と結合する第３の結合物質（競合抗原）に、光応答性標識を付与した標識結合物質を用いればよい。
　また、上記各実施形態においては、光応答性標識として蛍光色素分子を用いたが、他の好ましい例としては、金属微粒子が挙げられる。標識として利用される金属微粒子は、少なくとも表面が金属膜で覆われた微粒子であって、光の照射により表面に局在プラズモンを生じる粒子径のものであればよい。金属微粒子の形状は特に制限なく、球状およびロッド状等が挙げられる。金属微粒子は、エバネッセント光を散乱して散乱光を生じるので、これを光信号として検出すればよい。また、あるいは、金属微粒子（または、その表面の金属膜）の材料として、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタン（Ｔｉ）等およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものを用いた場合、励起光の照射により金属微粒子の表面に局在プラズモンが生じる。この局在プラズモンを光信号として、金属膜に表面プラズモンを、あるいは光導波層に光導波モードを励起させ、該励起に伴う放射光を検出するよう構成してもよい。なお、この場合、金属微粒子の粒子径は、局在プラズモンを効果的に励起することから、励起光の波長より小さいことが好ましい。
　なお、所定領域にのみ励起光を照射する励起光照射光学系としては、上記実施形態において説明した、エバネッセント光を生じさせる光学系が一般的であるが、光応答性標識として、例えば蛍光、特に２光子吸収で励起されて蛍光を発する高分子を用いる場合、非常に高いエネルギーの光が照射されなければ２光子吸収励起が生じないため、ＮＡの大きな対物レンズ等によりレーザ光を、サンドイッチ結合体を局在化させた所定領域に収束させ、その領域でのみ２光子吸収を生じさせる励起光として機能させるよう構成された励起光照射光学系を用いてもよい。

Claims (13)

  1. 　被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質に、磁性粒子を内包すると共に液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾された磁性体含有誘電体粒子が付与されてなる磁性付与結合物質と、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質および前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に光応答性標識が付与されてなる標識結合物質とを用意し、
    　被検対象である液体試料、前記磁性付与結合物質および前記標識結合物質を混合して結合反応させ、
    　前記磁性付与結合物質と前記標識結合物質とが混合された前記液体試料を保持する試料セル内に磁界を発生させて、該試料セル内の局所領域に、前記磁性付与結合物質を引き寄せ、
    　該局所領域に該磁性付与結合物質を引き寄せた状態で、該局所領域を含む所定領域のみに励起光を照射して、該所定領域に存在する前記光応答性標識から光信号を生じさせ、
    　該光信号を検出する検出方法であって、
    　前記磁性体含有誘電体粒子の誘電材料が前記励起光に対して透明であり、かつ、前記磁性体含有誘電体粒子における前記磁性粒子の体積含有率が５０％以下であることを特徴とする検出方法。
  2. 　前記誘電材料がＳｉＯ2であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
  3. 　前記誘電材料が光透過性樹脂であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
  4. 　前記体積含有率が２５％以下であることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の検出方法。
  5. 　前記磁性体含有誘電体粒子の粒子径が１００ｎｍ以上、１μｍ以下であることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の検出方法。
  6. 　前記励起光として、赤外光を用いることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の検出方法。
  7. 　請求項１から６いずれか１項記載の検出方法において用いられる磁性体含有誘電体粒子であって、
    　磁性粒子を内包すると共に、液体試料中で極性を示す官能基が表面修飾されており、
    　誘電体材料が前記励起光に対して透明であり、かつ、前記磁性粒子の体積含有率が５０％以下であることを特徴とする磁性体含有誘電体粒子。
  8. 　前記誘電体材料がＳｉＯ2であることを特徴とする請求項７記載の磁性体含有誘電体粒子。
  9. 　前記誘電材料が光透過性樹脂であることを特徴とする請求項７記載の磁性体含有誘電体粒子。
  10. 　前記磁性粒子の体積含有率が２５％以下であることを特徴とする請求項７から９いずれか１項載の磁性体含有誘電体粒子。
  11. 　前記官能基がカルボキシル基であることを特徴とする請求項７から１０いずれか１項記載の磁性体含有誘電体粒子。
  12. 　粒子径が１００ｎｍ以上、１μｍ以下であることを特徴とする請求項７から１１いずれか１項記載の磁性体含有誘電体粒子。
  13. 　前記磁性粒子が、鉄系磁性体材料または白金系磁性体材料からなるものであることを特徴とする請求項７から１２いずれか１項記載の磁性体含有誘電体粒子。
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