JP5315381B2 - 蛍光検出装置、蛍光検出用の試料セルおよび蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光検出装置、蛍光検出用の試料セルおよび蛍光検出方法、特に詳細には近接場光を利用した蛍光検出に関するものである。

バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。

また、蛍光標識からの蛍光検出の方法としては、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出する方法（エバネッセント蛍光法）が知られている。

さらに、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。

特許文献２において、蛍光信号のさらなる増加を図るために、標識として、蛍光を透過する材料で複数の蛍光色素を内包してなる蛍光粒子を用いることを提案している。このような蛍光粒子を標識として用いれば、蛍光色素分子を単体で用いるのに比較して、大幅に蛍光量を増やすことができ、Ｓ／Ｎを向上させることができる。

このような表面プラズモン増強蛍光センサは数ｆmol（フェムト・モル）程度の微量な物質を検出可能であって、高感度化の要求にも応えられるものであるが、その半面、プリズム等の全反射光学系を必要とするので、装置が複雑化してコストが高くつくものとなっている。

一方、径が２００ｎｍ程度の微小開口を有する微小開口薄膜を利用し、プリズム光学系を使わない簡易な光学系により簡易的に近接場を発生させ、蛍光測定を可能にするセンサを特許文献３において提案されている。またさらに、そのＳ／Ｎ向上を図ったセンサが特許文献４に提案されている。

特開平１０−３０７１４１号公報 特開２０１０−１９０８８号公報 特開２００８−５１５１２号公報 特開２００９−９８００９号公報

特許文献４では、微小開口を有する微小開口薄膜を金属により構成することにより、近接場光により金属薄膜において表面プラズモン共鳴を生じさせ、表面プラズモン共鳴による電場増強効果により増強した蛍光を生じさせることにより、Ｓ／Ｎ向上を図っている。また、蛍光色素が金属に接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得ることから、金属からなる微小開口薄膜上にポリマーやSiO₂からなる不撓性膜を備え、蛍光色素が金属に近接するのを防止して、金属消光を抑制する構成についても提案されている。

しかしながら、不撓性膜の金属膜上への成膜には手間がかかり、また、不撓性膜と金属薄膜が形成される基板との熱膨張係数が大きいことから、不撓性膜はひび割れ等が起きやすく、耐久性が低いという問題があり、実用化が困難であった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、作製が容易で、かつ耐久性が高く、実用化可能な蛍光検出装置を提供することを目的とするものである。
また、本発明は蛍光検出装置に用いられる蛍光検出用の試料セル、さらには、実用性に富んだ蛍光検出方法を提供することを目的とするものである。

本発明の蛍光検出装置は、励起光を発する光源と、
該励起光を受ける位置に配された、入射面から入射した該励起光を透過させる材料からなる基板、該基板の前記入射面とは異なる一面に形成された、開口径が前記励起光の波長以下である微小開口を有する微小開口金属薄膜と、該微小開口金属薄膜に蛍光標識を含む試料液を接触させるように該試料液を保持する試料保持部と、
前記入射面から前記基板を透過して前記微小開口金属薄膜に前記励起光が入射されたとき前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する光検出器とを備え、
前記蛍光標識が、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性明誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であることを特徴とするものである。

前記蛍光粒子の粒子径φが、φ≦２００ｎｍであることが好ましい。また、粒子径φは２０ｎｍ以上、さらには、５０ｎｍ以上であることが好ましい。

なお本発明において微小開口金属薄膜に設けられている「微小開口」は、開口径が使用する励起光の波長以下である開口をいい、励起光の照射により近接場光を生じるものである。開口の形状は、円、楕円、多角形いずれであってもよく、微小開口の「径」とは、開口面積と等価な面積を有する円の直径を意味するものとする。

また、蛍光粒子の粒子径φは、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。

蛍光粒子は、透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子が存在するものであるが、複数の蛍光色素分子のうち、一部が透光性誘電体材料の外部に露出していてもよい。また、透光性誘電体材料中における蛍光色素分子の分布状態はどのようであってもよく、均一に分布していてもよいし、不均一であってもよい。さらに、蛍光粒子の中心部においては、蛍光色素分子が存在しない領域があってもよい。

本発明の蛍光検出用の試料セルは、本発明の蛍光検出装置の試料セルであって、前記基板と前記試料保持部により、試料液が流下される流路が構成されてなり、
前記微小開口金属薄膜上に、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部が設けられており、
前記流路の前記検出部より上流側に、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加された標識結合物質付加部が設けられており、
前記蛍光標識が、該蛍光標識の蛍光および該蛍光を励起する励起光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であることを特徴とするものである。

なお、本発明の試料セルは、第２の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加されている場合にはサンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加されている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。

本発明の蛍光検出方法は、基板と、該基板の一面に形成された、微小開口を有する微小開口金属薄膜と、該微小開口金属薄膜に試料液を接触させるように該試料液を保持する試料保持部とからなる試料セルを用い、
前記試料セルの前記微小開口金属薄膜に、蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、
前記微小開口の開口径より大きい波長の励起光を、前記基板の前記一面とは異なる入射面から入射させ、
該励起光の入射により前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
前記蛍光標識として前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子を用いることを特徴とする。

本発明による蛍光検出装置および蛍光検出方法によれば、微小開口金属薄膜を用いているため、プリズム光学系を使わずとも基板透過させて微小開口金属薄膜に向けて励起光が照射されれば、微小開口の基板とは反対側に近接場光を生じさせることが可能である。よって、全反射光学系を要していた従来の表面プラズモン共鳴蛍光測定装置と比べて光学系を簡素化することができる。

また、上記のように生じた近接場光および近接場光により微小開口金属薄膜に誘起される表面プラズモンによって、その電場増強効果により蛍光強度が増幅されることに加え、蛍光標識として励起光および蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子を用いているので、標識として蛍光色素分子を単体で用いる場合と比較して、格段に蛍光量を増加させることができる。

本発明の蛍光検出装置および検出方法は、蛍光標識として、励起光および蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子を用いているので、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。蛍光色素分子が金属薄膜に近接した場合に生じる金属消光を抑制できるように蛍光粒子内に包含されているので、特許文献４に記載のような、金属消光防止のためのポリマーやSiO₂からなる不撓性膜を金属薄膜上に形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができ、実用性が高い。

第１の実施形態における蛍光検出装置を概略的に示す部分断面図 微小開口付近の光電場を示す模式図 微小開口内の光電場強度｜Ｅx｜²の分布シミュレーション図 微小開口金属薄膜と蛍光粒子との関係を説明するための説明図 第２の実施形態における蛍光検出装置を概略的に示す部分断面図 図３の蛍光検出装置に備えられている試料セルを示す平面図 図４Ａに示す試料セルの側断面図 本発明の第２実施形態による蛍光検出装置におけるアッセイ手順を示す図

以下、本発明による実施形態について図面を用いて説明する。
図１は、被検出物質としての抗原Ａを含む試料液Ｓから、抗原抗体反応を利用して抗原Ａを検出する場合に用いる、本実施形態による蛍光検出装置１を示す概略側面図である。図示の通り、この蛍光検出装置１は、所定波長の励起光Ｌ₀を発する光源３２と、この励起光Ｌ₀を片面（入射面）から入射させるように配された、励起光Ｌ₀を透過させる材料からなる平板状の基板１１、この基板１１の他面に成膜された、径が励起光Ｌ₀の波長以下である微小開口１２ａを有する微小開口金属薄膜１２および微小開口金属薄膜１２に試料液Ｓが接するように試料液Ｓを保持する試料保持部１３からなる試料セル１０と、試料保持部１３の外側から試料液中の蛍光標識からの蛍光Ｌ_ｆを検出可能な位置に配された光検出器３０とを備えてなるものである。ここで、蛍光標識は、励起光Ｌ０および蛍光Ｌｆを透過する透光性誘電体材料１６中に複数の蛍光色素分子１５を内包してなる蛍光粒子Ｆである。

また、微小開口金属薄膜１２上には、被検出物質である抗原Ａと特異体に結合する第１の結合物質としての一次抗体Ｂ₁が固定されてなる検出部１４が設けられている。
また、試料液Ｓ中には、蛍光標識である蛍光粒子Ｆと、この蛍光粒子Ｆに標識され抗原Ａに対する特異的結合性を有する二次抗体Ｂ₂からなる標識結合物質２０が含まれている。

一次抗体Ｂ₁は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原ＡがＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原Ａと特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、金属薄膜上に固定することができる。これにより、抗原抗体反応を用いて、抗原Ａを特異的に結合し検出部に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。

（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）一次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、一次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。
（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。

励起光Ｌ₀は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。

光源３２は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源３２は、励起光Ｌ₀を微小開口金属薄膜１２に向けて、任意の方向から基板１１を通して照射するために、光源３２の可動手段、および励起光Ｌ₀を導光するための簡易的なミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。

基板１１は、少なくとも励起光Ｌ₀に対して透明な材料からなるものであればよい。例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。基板１１は樹脂から形成することが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。

微小開口金属薄膜１２は、近接場光により表面プラズモン共鳴が励起されうる金属であれば特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点からＡｕ、Ａｇ、Ｐｔが特に望ましい。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることが望ましい。微小開口金属薄膜１２の作製方法は、特に制限はなく検出条件や使用する材料に応じて適宜選択することができ、たとえば、特開２００８−５１５１２号公報、特開２００９−９８００９号公報等に記載の微小開口金属薄膜の作製方法を用いることが望ましい。

微小開口１２ａの径は、５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にあることが望ましい。
蛍光強度を稼ぐ観点からでは、微小開口金属薄膜１２の開口率はある程度大きい方が望ましい。しかしながら、開口率５０％を超える微小開口金属薄膜１２は、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開口の作製との両立が困難となる場合があるため、微小開口金属薄膜１２の開口率の上限を５０％にするのが望ましい。

なお、蛍光粒子（蛍光標識）Ｆの透光性誘電体材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ₂などの誘電体が挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、蛍光色素分子１５からの蛍光を透過させて外部に放出でき、この蛍光色素分子１５を励起するための励起光を透過させることができるものであれば特に制限されない。

さて蛍光色素分子は、金属に接近しすぎると、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、蛍光色素分子１５と金属薄膜１２との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。

一方、蛍光色素分子１５は、表面プラズモンによって増強された電場によって励起される。表面プラズモンにより電場増強の効果があるのは励起光の波長λ程度であり、その電場強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。蛍光の効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光色素分子との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。

本実施形態の蛍光粒子Ｆを用いれば、この蛍光粒子Ｆ中には複数の蛍光色素分子１５が内包されていることから、金属薄膜１２から１０〜１００ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができる。そのため、金属薄膜上に金属消光防止のための膜を形成する必要がなく、そのような膜形成のための手間を省くことができ、また、膜のひび割れによる試料セルの不良が生じる恐れがない。

また、本実施形態では、蛍光粒子Ｆは複数の蛍光色素分子１５を内包するものであり、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加させることができる。

光検出器３０は、蛍光粒子Ｆが発する特定波長の蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。

以下、上記蛍光検出装置を用いた蛍光検出方法について説明する。
金属薄膜１２上には、抗原Ａと特異的に結合する一次抗体Ｂ_１が固定化されている。そして試料保持部１３の中に試料液Ｓが注入され、試料液中の抗原Ａは一次抗体Ｂ_１に結合し固定される。次いで同様に、抗原Ａと特異的に結合し一次抗体Ｂ_１とは少なくともエピトープが異なる二次抗体Ｂ_２と蛍光粒子Ｆとからなる標識結合物質２０が流され、一次抗体Ｂ_１に固定された抗原Ａに結合し固定され、所謂サンドイッチを形成する。

なお、このとき、試料液と標識結合物質２０とは試料セル外部にて混合された状態で試料セルに注入するようにしてもよい。この場合、抗原Ａと二次抗体Ｂ_２とが予め結合させた状態で試料セルに注入され、予め二次抗体Ｂ_２と結合した抗原Ａが試料セル中において一次抗体と結合することによりサンドイッチを形成することとなる。

その後、光源３２から励起光Ｌ₀を射出させ、微小開口金属薄膜１２に対して基板１１を介して垂直方向から励起光Ｌ₀が照射される。この励起光Ｌ₀の照射により、微小開口金属薄膜１２の微小開口１２ａに近接場光が染み出す。この近接場光により、検出部１４に二次抗体Ｂ_２を介して固定されている蛍光粒子Ｆが起される。さらに、この近接場光に誘起されて、微小開口１２ａ付近の微小開口金属薄膜１２の表面にはプラズモンが発生するため、このプラズモンによる電場増強効果により周囲の電場が増強される。この増強電場によっても蛍光粒子Ｆはさらに励起されることとなる。励起された蛍光粒子Ｆは所定波長の蛍光を発し、この蛍光を検出することによって、抗原Ａの検出を行うことができる。

上記のように本発明による蛍光検出装置１は、微小開口金属薄膜１２を使用することで、微小開口１２ａで生じた近接場光によってその表面にプラズモンを誘起し、このプラズモンの電場増強効果により蛍光粒子Ｆから発せられる蛍光の強度を増強することが可能となる。この電場増強効果により増強された蛍光強度は、金属材料を用いない微小開口薄膜すなわち近接場光のみを利用した場合に比べ、およそ２桁増強する。

さらに、基板１１中の不純物等で散乱した光（通常の伝搬光）は、微小開口１２ａを通過することができないので、微小開口金属薄膜１２で遮断され、光検出器３０に到達することがない。以上により、本発明による蛍光検出装置１は、蛍光強度を大幅に増幅して光ノイズを殆ど皆無にまで低減することができるため、極めて高い感度による蛍光検出を可能とする。

また、従来の開口を有していない金属膜に対して表面プラズモンを生じさせる場合と異なり、励起光Ｌ₀を全反射させる必要がないため、全反射光学系が不要であることから、光学系の簡素化も可能となり、蛍光検出装置を安価に提供することを可能とする。

蛍光標識として、励起光Ｌ₀および蛍光Ｌ_fを透過する透光性誘電体材料１６中に複数の蛍光色素分子１５を内包してなる蛍光粒子Ｆを用いているので、１つの蛍光粒子Ｆから複数の蛍光色素分子１５からの蛍光が同時に発せられるので、蛍光標識として１つの蛍光色素分子が用いられる場合と比較して、大幅に蛍光量を増加させることができる。

なお、上記実施形態において、励起光Ｌ₀の照射方向を微小開口金属薄膜１２に対して垂直方向からと設定したが、これに限られるものではない。本発明による蛍光検出装置は、微小開口金属薄膜１２を用いているため、基板１１を透過して微小開口金属薄膜１２に励起光が照射されれば、いずれの方向から入射されても、微小開口１２ａに近接場光を発生させることができるからである。また、抗原抗体反応を用いて説明してきたが、本発明はこれに限られるものではなく、他の特異的結合性を利用した反応を用いても本発明の課題を解決することができる。

一方、本発明者によるさらなる検討により、微小開口金属薄膜の微小開口近傍に蛍光粒子の非特異吸着が発生し、その結果ノイズが上がり、Ｓ／Ｎの低下を招くことがあることが明らかになった。

そこで、蛍光顕微鏡を用いて、蛍光粒子のサイズと非特異吸着の頻度との相関を調べた。すると、１μｍ程度の粒子だとほぼすべての開口に非特異吸着が生じるのに対し、サイズの低下と共に吸着量が大幅に減少し、励起光の波長以下の波長サイズ（５００ｎｍ程度）であれば無視できる程度となり、さらには開口サイズより小さい粒子サイズであれば、開口部への非特異吸着がなくなることが判った。

図２Ａは、微小開口付近のｘｚ面におけるエバネッセント光による光電場を示す模式図である。図２Ａにおいては、|Ｅ｜²＝一定（const.）の線（等高線）で光電場を表わしている。ここで、励起光はx方向に偏光しているものとしている。図２Ａに示すように開口から浸み出すように広がる様子が観察される。このときの、微小開口の開口径aを100ｎｍとして、微小開口からの浸み出すエバネッセント光による、開口が形成されている面の極近傍（ｚ＝５ｎｍ）における光電場強度のｘ方向成分（|Ｅｘ|^２）の分布（シミュレーション）を図２Ｂに示す。図２Ｂの強度分布図においては、明るいほど電場強度が大きいことを示している。特に開口のエッジ部で強く生じている、金属面に平行なx方向成分の光電場Ｅｘが表面プラズモンと共鳴し、光電場の増強が得られる。

図２Ｃは、本発明の装置において励起光が照射されている時の微小開口金属薄膜の表面の増強された光電場強度を模式的に示した図である。図２Ａ、図２Ｂは、単純に微小開口からのエバネッセント光による光電場を模式的に示したものであるが、この図２Ｃは、このエバネッセント光が金属薄膜のプラズモンと共鳴することに伴う、増強された光電場を示すものである。

図２Ｃに示すように、表面プラズモンによる増強効果により、金属薄膜上で光電場は高く、微小開口１２ａ付近では光電場が弱くなっている。開口１２ａとその周りの金属薄膜との境界は、光電場強度が急激に変化する領域となっている。良く知られているように、「光ピンセット」の生じる力Ｆは、下の式で表される（α:分極率）。
この式から判るように、光電場強度の急激な変化部分に、「光ピンセット」と呼ばれる効果が生じ、図２Ｃに示すように、この開口部近傍に蛍光粒子の非特異吸着が生じていると考えられる。

ある程度以上の粒子径を有する蛍光粒子は、光電場の大きさが急激に変化する部分で光ピンセット効果により開口部にトラップされてしまうと考えられる。そこで、光ピンセット効果によりトラップされないように、蛍光粒子のブラウン運動による擾乱の効果が光ピンセットによる力Ｆによる捕捉力に勝る程度に粒子径が小さいことが望ましいと考えられる。本発明のように、蛍光粒子の材質が誘電体（屈折率が、１.５程度）である場合、光ピンセットで捕捉出来る粒子径は、サブμｍからｍｍ程度の領域であることが知られている。

以上の知見から、本発明の蛍光検出装置および検出方法においては、蛍光粒子の粒子径φはφ≦２００ｎｍであることが好ましい。粒子径が２００ｎｍ以下であれば、蛍光粒子のブラウン運動により光ピンセット効果をほとんど受けないと考えられる。なお、粒子径としては、蛍光粒子内の蛍光色素に対して金属消光の影響を防止することができる程度の粒径が必要であることから、２０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上であることが好ましい。なお、５０ｎｍ程度以上であれば、市販の蛍光粒子を用いることができるというメリットもある。

第２の実施形態の蛍光検出装置を図３から図５を参照して説明する。ここでは、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図３に示す蛍光検出装置２は、本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌ₀を照射させる光源３２と、蛍光Ｌ_ｆを検出する光検出器３０とを備えている。

図４Ａは、試料セル５０の構成を示す平面図、図４Ｂは試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基板５１と、該基板５１上に試料液Ｓを保持し、試料液Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料液Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料液Ｓを排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。

さらに、試料セル５０は基板５１の一部領域に微小開口を有する微小開口金属薄膜１２、１２’を流路上流側から順に備えている。この微小開口金属薄膜１２上に、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質である１次抗体Ｂ_１が固定された検出部５８が設けられ、検出部５８の下流側の微小開口金属薄膜１２’上には、被検出物質である抗原とは結合せず後述の２次抗体Ｂ_２と特異的に結合する１次抗体Ｂ_０が固定された参照部５９が設けられている。

微小開口金属薄膜１２、１２’は第１の実施形態の蛍光検出装置の試料セル１０に備えられているものと同一である。なお、図３−５においては、微小開口が省略された図が示されている。

試料セル５０の基板５１の検出部５８の上流側には、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ_２が表面修飾された蛍光粒子Ｆを物理吸着させてある標識結合物質吸着エリア５７が設けられている。

なお、図３中においては、試料液が注入されて抗体が標識２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために標識結合物質吸着エリア５７はもはや存在していない。

本例では、基板５１上に検出部と参照部を設けた例を挙げているが、検出部のみであってもよい。なお、参照部を備えることにより、この参照部からの蛍光検出により、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と光源３２、微小開口金属薄膜１２、１２’、液体試料など表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。

試料セル５０は、励起光源３２および検出器３０に対して相対的にＸ方向に移動可能とされており、検出部５８からの蛍光検出の後、参照部５９を光信号検出位置に移動させて参照部からの光信号検出を行うように構成されている。

上記構成の蛍光検出２を用いた蛍光検出方法の原理は第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても第１の実施形態の場合と同様の蛍光粒子を蛍光標識として用いているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。

さらに、本実施形態の試料セルを利用したセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図５を参照して説明する。

ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図４中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図５中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ_２が修飾された蛍光粒子Ｆとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Ａが２次抗体Ｂ_２と結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、２次抗体Ｂ_２と結合した抗原Ａが、検出部５８上に固定されている１次抗体Ｂ_１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ_１と２次抗体Ｂ_２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった２次抗体Ｂ_２の一部は参照部５９上に固定されている１次抗体Ｂ_０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ_０と結合しなかった２次抗体が修飾されている蛍光粒子Ｆが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着しているものを洗い流す。

このように、血液を注入口から注入し、検出部５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ_１と２次抗体Ｂ_２で挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、検出部５８からの蛍光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、参照部５９からの蛍光信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、参照部５９からの蛍光信号を検出する。２次抗体Ｂ_２と結合する１次抗体Ｂ_０を固定している参照部５９からの蛍光信号は２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、検出部からの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。なお、蛍光の検出は、試料液の注入口開始時から所定時間経過後まで蛍光強度に時間変化を測定するようにしてもよい。この場合、一定時間毎に検出部５８および参照部５９から蛍光検出を行うようにして両部について蛍光の時間変化を測定すればよい。

以上説明した実施形態の蛍光検装置および検出方法は、いわゆるサンドイッチ形式と呼ばれる検出方式で蛍光検出するものであるが、例えば図１の構成において、抗原と特異的に結合する第２の結合物質（２次抗体）Ｂ_２に替えて第１の結合物質（１次抗体）Ｂ_１と特異的に結合する第３の結合物質を蛍光粒子Ｆに修飾した標識結合物質を用い試料液Ｓ中に混合させれば、いわゆる競合方式で蛍光検出する蛍光検出装置が得られる。すなわちその場合は、第３の結合物質と抗原Ａとが１次抗体Ｂ_１への結合において競合するので、抗原Ａの量が多いほど検出部に結合される増強蛍光粒子が少なくなり、検出される蛍光Ｌ_fの光量が少なくなる。そこでこの場合も、この検出蛍光量に基づいて抗原Ａを定量分析することができる。

１、２ 蛍光検出装置
１０ 試料セル
１１ 基板
１２ 微小開口金属薄膜
１２ａ 微小開口
１３ 試料保持部
１４ 検出部
１５ 蛍光色素分子
１６ 透光性誘電体材料
２０ 標識結合物質
３０ 光検出器
３２ 光源
４２ 検出部
５０ 試料セル
５１ 基板
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５４ａ 注入口
５４ｂ 空気孔
５５ メンブレンフィルター
５７ 標識結合物質吸着エリア
５８ 検出部
５９ 参照部
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ₁ 一次抗体（第１の結合物質）
Ｂ₂ 二次抗体（第２の結合物質）
Ｆ 蛍光粒子

Claims (4)

1. 励起光を発する光源と、
   該励起光を受ける位置に配された、入射面から入射した該励起光を透過させる材料からなる基板、該基板の前記入射面とは異なる一面に形成された、開口径が前記励起光の波長以下である微小開口を有する微小開口金属薄膜、および該微小開口金属薄膜に蛍光標識を含む試料液を接触させるように該試料を保持する試料保持部を備えてなる試料セルと、
   前記入射面から前記基板を透過して前記微小開口金属薄膜に前記励起光が入射されたとき前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する光検出器とを備え、
   前記蛍光標識が、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であり、該蛍光粒子の粒子径が前記励起光の波長よりも小さいことを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記蛍光粒子の粒子径φが、φ≦２００ｎｍ
   であることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
3. 請求項１または２記載の蛍光検出装置の試料セルであって、
   前記基板と前記試料保持部により、前記試料液が流下される流路が構成されてなり、
   前記微小開口金属薄膜上に、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部が設けられており、
   前記流路の前記検出部より上流側に、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加された標識結合物質付加部が設けられており、
   前記蛍光標識が、該蛍光標識の蛍光および該蛍光を励起する励起光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であり、該蛍光粒子の粒子径が前記励起光の波長よりも小さいことを特徴とする試料セル。
4. 基板と、該基板の一面に形成された、微小開口を有する微小開口金属薄膜と、該微小開口金属薄膜に、試料液を接触させるように該試料液を保持する試料保持部とからなる試料セルを用い、
   前記試料セルの前記微小開口金属薄膜に、蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、
   前記微小開口の開口径より大きい波長の励起光を、前記基板の前記一面とは異なる入射面から入射させ、
   該励起光の入射により前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
   前記蛍光標識として前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であって、粒子径が前記励起光の波長よりも小さい蛍光粒子を用いることを特徴とする蛍光検出方法。